CN112980743A - 一种枯草芽孢杆菌及其在提高酱油中4-乙基愈创木酚含量中的应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌及其在提高酱油中4-乙基愈创木酚含量中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌及其在提高酱油中4‑乙基愈创木酚含量中的应用，属于发酵工程技术领域。上述利用微生物发酵提高酱油中4‑乙基愈创木酚含量的方法，包括如下步骤：(1)小麦麸皮预处理得到小麦麸皮粉末；(2)霉菌酶液的制备；(3)酶解反应制备阿魏酸粗提液；(4)微生物发酵转化阿魏酸粗提液产生含有4‑乙基愈创木酚的发酵液；(5)将含有4‑乙基愈创木酚的发酵液加入到酱油发酵后期的酱醪中，即可提高酱油中4‑乙基愈创木酚含量。本发明以麸皮为原料，通过黑曲霉和/或米曲霉酶解和枯草芽孢杆菌转化等工艺提高酱油中的4‑乙基愈创木酚含量，该工艺以生物酶液代替了商业酶的使用，节约了成本。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其在提高酱油中4-乙基愈创木酚含量中 的应用
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌及其在提高酱油中4-乙基愈创木酚含量中的应用。
背景技术
酱油是我国的一种传统发酵调味品，它与人们的生活息息相关。酱油发酵是一个多种微生物共同作用的发酵过程，经过微生物及其酶系的长期作用，赋予了酱油良好的风味。
4-乙基愈创木酚(4-ethyl guaiacol，4-EG)又名2-甲氧基-4-乙基苯酚，分子式为C9H12O2，分子量为152.19，为无色至淡黄色液体，微带酚的气息，通常被描述为一种酱香味、烟熏味和丁香味的物质，是一种天然的呈香化合物，气味浓郁悠长，在日本酱油和中国传统高盐稀态酱油中很受欢迎。4-EG的风味阈值极低，其含量相差0.5mg/L就很容易被感官所识别，1～2mg/L的4-EG便可以明显改善酱油的风味品质。因此，4-EG的含量与酱油的品质密切相关。
4-EG可以化学合成，也可以从天然植物中提取，或者通过生物转化法制备。随着人们对绿色产品要求的逐步提高，同时由于人造食品的潜在危害，社会对天然食品的需求一直在持续增长，但是从天然植物中提取4-EG的量非常有限，不能满足日益增长的消费需求，目前工业化生产主要是通过合成途径进行的。
化学合成法是常用的生产4-EG的方法，如申请号为200310122614.9的中国专利申请：4-乙基愈创木酚的合成方法公开了一种合成4-乙基愈创木酚的方法，主要以愈创木酚和乙烯为原料，以固体酸作为催化剂，在加热加酸条件下合成4-乙基愈创木酚，采用该方法，愈创木酚的转化率可达到72％，经提取精馏后得到的产物4-EG的纯度可达99％。然而化学合成法普遍存在环保问题，且生产工艺复杂，反应条件较剧烈，对生产设备要求较高，而且产品中含有原料、副产物、溶剂等物质的残留物，因此由该方法制得的4-EG不能直接应用到食品中。
生物转化法是通过培养含有阿魏酸酯酶、阿魏酸脱羧酶的微生物细胞进行发酵或者酶解催化产生4-EG。与化学合成法和植物提取法相比，生物转化法具有绿色天然、安全可靠、反应条件温和、底物专一性好、工艺环境友好等优点，近年来发展迅速。如申请号为201310685675.X的中国专利公开了一种利用微生物发酵生产4-乙基愈创木酚的方法，主要以小麦麸皮为原料，利用阿魏酸酯酶和木聚糖酶进行酶解反应制备阿魏酸(ferulic acid，FA)粗提液，并通过培养环状芽孢杆菌和酒香酵母进行生物发酵得到含有4-EG的发酵液，最终以乙酸丁酯为萃取剂萃取得到4-EG。然而利用商业酶对小麦麸皮进行酶解反应将产生高昂的成本，这意味着该项生物技术不适合应用于工业化生产。因此，目前亟需研发一种能够应用于食品中的适于工业化生产的4-乙基愈创木酚生产方法。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种枯草芽孢杆菌。
本发明的另一目的在于提供上述枯草芽孢杆菌在提高酱油中4-乙基愈创木酚含量中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种枯草芽孢杆菌G2021，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G2021，于2021年3月31日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61591。
所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G2021是从高盐稀态酱油制曲车间的成曲中筛选分离得到，经广州艾基生物技术有限公司鉴定为枯草芽孢杆菌。该菌能够通过发酵将阿魏酸转化为4-乙基愈创木酚。
所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G2021的微生物学特性为：菌落幼期为乳白色，成熟期为淡黄色，不透明，形状规则为圆形，中央隆起，表面粘稠，边缘整齐，菌体形态为短杆状，革兰氏染色呈紫色，为阳性，产芽孢；可氧化发酵蔗糖、麦芽糖、葡萄糖，发酵过程中产酸但不产气，不能够利用木糖；在氨基酸脱羧酶试验中只有精氨酸为阳性，鸟氨酸和赖氨酸都为阴性；淀粉水解、酪素水解、明胶水解试验结果皆为阳性；过氧化氢酶试验、柠檬酸盐试验、硝酸盐还原试验、V-P试验结果为阳性；脲酶试验、甲基红试验、丙酸盐试验、吲哚试验为阴性；最适生长温度为35℃，能够在NaCl浓度为9％(m/v)的条件下正常生长代谢，可发酵米糠、小麦、小麦麸皮、豆粕等农副产品制成的培养基，能够产生丰富的香气。
所述的枯草芽孢杆菌G2021在提高酱油中4-乙基愈创木酚含量中的应用。
一种利用微生物发酵提高酱油中4-乙基愈创木酚含量的方法，包括如下步骤：
(1)小麦麸皮预处理：将小麦麸皮在高温高压条件下蒸煮，然后烘干，粉碎过筛，得到小麦麸皮粉末；
(2)霉菌酶液的制备：将霉菌以孢子液的形式接种至小麦麸皮培养基，恒温培养至霉菌成熟，加水振荡浸提，过滤离心，制得霉菌酶液；
(3)酶解反应制备FA粗提液：向小麦麸皮粉末中加入步骤(2)得到的霉菌酶液，充分混匀进行酶解反应，灭酶，过滤，浓缩，制得FA粗提液；
(4)微生物发酵转化FA粗提液产生4-EG：以步骤(3)的FA粗提液为液体发酵培养基，用LB液体培养基培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G2021制成种子液，将种子液接种到液体发酵培养基中，恒温振荡发酵，即得含有4-EG的发酵液。
(5)将含有4-EG的发酵液以体积比1∶10～20的比例加入到酱油发酵后期的酱醪中，即可提高酱油中4-乙基愈创木酚含量。
步骤(1)中所述的高温高压优选为121～130℃，0.1～0.3MPa蒸煮15～30min；更优选为130℃，0.2MPa蒸煮20min。
步骤(1)中所述的烘干的条件优选为：100～110℃烘干2～4h；更优选为：105℃烘干4h。
步骤(1)中所述的烘干优选为用电热鼓风干燥箱烘干。
步骤(1)中所述的粉碎优选为用高速粉碎机粉碎。
步骤(1)中所述的过筛优选为过20～60目筛；更优选为过60目筛。
步骤(2)中所述的霉菌优选为黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)中的至少一种。
所述的黑曲霉优选为黑曲霉菌ATCC 16404，该菌株的遗传背景清晰，经多年的生产实践验证，其安全性已经得到食品发酵行业的公认。除分泌阿魏酸酯酶以外，该菌株还能分泌淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、木聚糖酶等其他酶系，并具有较强的分泌能力。
所述的米曲霉优选为CICC2339(沪酿3.042)米曲霉菌株。
步骤(2)中所述的小麦麸皮培养基的制备方法优选为：小麦麸皮10g，KH2PO40.06g，MgSO4·7H2O 0.06g，NaNO3 0.06g，去离子水15～25mL，121℃灭菌20min，即得。
步骤(2)中，当霉菌为黑曲霉时，所述的恒温培养的条件优选为：30～35℃恒温培养3～6d；更优选为：35℃恒温培养3～6d。
当霉菌为米曲霉时，所述的恒温培养的条件优选为：25～30℃恒温培养2～3d；更优选为28℃恒温培养3d。
步骤(2)中所述的水优选为去离子水；所述的水的加入量优选以使培养基的料液比(g/mL)为1∶8～15为准；进一步优选为以使培养基的料液比为1∶10～15为准；更优选为以使培养基的料液比为1∶10为准。
步骤(2)中所述的振荡浸提的条件优选为30～40℃，150～170r/min振荡浸提1～3h；更优选为35℃，160r/min振荡浸提2～3h。
步骤(2)中所述的过滤优选为用纱布过滤。
步骤(2)中所述的离心的条件优选为7000～9000r/min离心8～12min；更优选为8000r/min离心10min。
步骤(3)中所述的小麦麸皮粉末与霉菌酶液优选按料液比(g/mL)1∶5～25计算；更优选按料液比(g/mL)1∶10～20计算。
步骤(3)中所述的酶解反应的条件优选为35～45℃，120～200r/min酶解1～4h；更优选为35～40℃，120r/min酶解2～3h。
步骤(3)中所述的灭酶的方法优选为高温灭酶；更优选为95℃灭酶5min。
步骤(3)中所述的浓缩优选为通过旋转蒸发仪浓缩；所述的浓缩的条件优选为于60℃旋转蒸发浓缩10倍。
步骤(4)中，还可以包括向FA粗提液中加入NaCl的操作；所述的NaCl的含量优选为发酵体系的1％(w/v)；所述的发酵体系由种子液和液体发酵培养基组成。
步骤(4)中所述的种子液的制备方法优选为：挑取一环保存于LB斜面培养基的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G2021接种到100mL LB液体培养基，在35～37℃，120～160r/min恒温摇床培养18～24h，即得种子液。
所述的一环优选为1～10μL。
步骤(4)中所述的种子液优选以3％～7％(v/v)的比例接种到液体发酵培养基中；更优选为以5％(v/v)的比例接种到液体发酵培养基中。
步骤(4)中所述的恒温振荡发酵的条件为：30～37℃，120～200r/min振荡发酵6～12d；更优选为35℃，120r/min振荡发酵12d。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明以小麦麸皮为发酵原料，小麦麸皮中含有丰富的阿魏酸，但大多以阿魏酸酯类的形式存在，黑曲霉和/或米曲霉的混合酶系可促使阿魏酸酯类裂解释放阿魏酸，枯草芽孢杆菌发酵又能够通过脱羧和还原反应将阿魏酸进一步转化为4-EG，最终实现提高酱油中的4-EG含量的目标。且工艺简便，生产成本低，极具生产应用前景。
(2)本发明利用生物发酵技术，以麸皮为原料，通过黑曲霉和/或米曲霉酶解和枯草芽孢杆菌转化等工艺提高酱油中的4-EG含量，该工艺以生物酶液代替了商业酶的使用，节约了成本，同时节省了FA纯化的步骤，操作流程简便，且减少了废水的排放，极具应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
黑曲霉为黑曲霉菌ATCC 16404，该菌株的遗传背景清晰，经多年的生产实践验证，其安全性已经得到食品发酵行业的公认。除分泌阿魏酸酯酶以外，该菌株还能分泌淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、木聚糖酶等其他酶系，并具有较强的分泌能力。
米曲霉为CICC2339(沪酿3.042)米曲霉菌株。
枯草芽孢杆菌G2021，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G2021，于2021年3月31日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61591。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G2021是从高盐稀态酱油制曲车间的成曲中筛选分离得到，经广州艾基生物技术有限公司鉴定为枯草芽孢杆菌。该菌能够通过发酵将阿魏酸转化为4-乙基愈创木酚。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G2021的微生物学特性为：菌落幼期为乳白色，成熟期为淡黄色，不透明，形状规则为圆形，中央隆起，表面粘稠，边缘整齐，菌体形态为短杆状，革兰氏染色呈紫色，为阳性，产芽孢；可氧化发酵蔗糖、麦芽糖、葡萄糖，发酵过程中产酸但不产气，不能够利用木糖；在氨基酸脱羧酶试验中只有精氨酸为阳性，鸟氨酸和赖氨酸都为阴性；淀粉水解、酪素水解、明胶水解试验结果皆为阳性；过氧化氢酶试验、柠檬酸盐试验、硝酸盐还原试验、V-P试验结果为阳性；脲酶试验、甲基红试验、丙酸盐试验、吲哚试验为阴性；最适生长温度为35℃，能够在NaCl浓度为9％(m/v)的条件下正常生长代谢，可发酵米糠、小麦、小麦麸皮、豆粕等农副产品制成的培养基，能够产生丰富的香气。
本发明中阿魏酸含量和4-乙基愈创木酚含量的测定步骤如下：
称取阿魏酸标准品溶于色谱纯甲醇，制得1g/L的标准母液，用色谱纯甲醇进行梯度稀释，制得质量体积浓度依次为200、400、600、800、1000mg/L的阿魏酸标准溶液。将上述标准溶液分别用0.22μm的有机滤膜过滤，滤液分别用高效液相色谱(简称HPLC)检测，以浓度值(mg/L)和色谱峰面积(mAU)分别为横纵坐标，制定阿魏酸标准溶液的标准曲线。根据标准曲线获得线性回归方程：y＝0.9528x-2.9221(R2＝0.9966)，其中y为峰面积，x为FA标准溶液的质量浓度，R2为拟合系数。
将浓缩后FA粗提液用0.22μm的水性滤膜过滤，用HPLC测定滤液中FA的含量，得到粗提液样品的峰面积，根据线性回归方程计算出FA的浓度。
HPLC测定条件：色谱柱为Waters
Figure BDA0003033890340000051
T3反相C18色谱柱(5μm，4.6×250mm)，流动相A为甲醇(色谱级)，流动相B为1％甲酸水溶液；洗脱程序：0～15min，100％～48％B；15～20min，48％B；流速为1mL/min；进样量10μL；柱温30℃；检测波长为325nm。
称取4-EG标准品溶于色谱纯甲醇，制得100mg/L的标准母液，用色谱纯甲醇进行梯度稀释，制得质量体积浓度分别为20、40、60、80、100mg/L的4-EG标准溶液。将上述标准溶液用0.22μm的有机滤膜过滤，滤液用HPLC检测，以浓度(mg/L)和色谱峰面积(mAU)分别为横纵坐标，制定4-EG标准溶液的标准曲线。根据标准曲线获得线性回归方程：y＝0.2502x-0.4635(R2＝0.9986)，其中：y为峰面积，x为4-EG标准溶液的质量浓度，R2为拟合系数。
将含有4-EG的发酵液在8000r/min离心10min，经0.22μm的水性滤膜过滤，用HPLC测定滤液中4-EG的含量，得到发酵液样品的峰面积，根据线性回归方程计算出4-EG的浓度。
HPLC测定条件：色谱柱为Waters
Figure BDA0003033890340000061
T3反相C18色谱柱(5μm，4.6×250mm)，流动相A为甲醇(色谱级)，流动相B为1％甲酸水溶液；洗脱程序：0～15min，100％～48％B；15～20min，48％B；20～30min，48％～30％B；30～35min，30％B；流速为1mL/min；进样量10μL；柱温30℃；检测波长为0～18min 325nm，18～35min 280nm。
小麦麸皮购于淘宝平台店铺，晨曦有机饲料经营部。
实施例1
一种利用微生物发酵提高酱油中4-乙基愈创木酚含量的方法，包括如下步骤：
(1)小麦麸皮预处理：将小麦麸皮在130℃，0.2MPa条件下蒸煮20min，然后置于电热鼓风干燥箱中105℃烘干4h，再用高速粉碎机粉碎过60目筛，得到小麦麸皮粉末，制得的小麦麸皮粉末保存于干燥器中；
(2)黑曲霉酶液的制备：将黑曲霉划线接种至PDA斜面，35℃恒温培养4d，往试管斜面中加入5mL生理盐水，用接种环刮取斜面上的孢子，制备孢子液；
将1mL孢子液接种至小麦麸皮培养基(小麦麸皮10g，KH2PO4 0.06g，MgSO4·7H2O0.06g，NaNO3 0.06g，去离子水15mL，置于250mL锥形瓶，121℃灭菌20min，即得)，35℃培养黑曲霉3d至成熟，以1∶10(g/mL)的料液比向培养基中加入去离子水，在35℃，160r/min下振荡浸提2h，用4层纱布过滤除去麸皮，8000r/min离心10min除去黑曲霉菌丝，制得黑曲霉酶液(所述的霉菌酶液中阿魏酸酯酶的酶活为2.5U/mL)，置于4℃冰箱保存备用。
(3)酶解反应制备阿魏酸
粗提液：称取100g小麦麸皮粉末置于酶解反应器，以1∶10(g/mL)的料液比加入适量黑曲霉酶液，充分混匀在40℃，120r/min下进行2h酶解反应，然后在95℃，5min灭酶终止反应，过滤除去反应底物，60℃旋转蒸发浓缩10倍，制备FA粗提液。
用HPLC测定粗提液中的FA，根据峰面积值和FA标准曲线线性回归方程计算可得粗提液中FA的含量为757.73mg/L；
(4)微生物发酵转化FA粗提液产生4-EG：以FA粗提液为液体发酵培养基，用LB液体培养基培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G2021制成种子液(种子液的制备方法具体为：挑取一环(约1～10μL)保存于LB斜面的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G2021接种到100mL LB液体培养基，在35℃，160r/min恒温摇床培养24h，即得种子液)，将种子液以5％(v/v)的比例接种到液体发酵培养基，在35℃，120r/min振荡发酵12d，即得含有4-EG的发酵液；
用HPLC测定发酵液中的4-EG，根据峰面积值和4-EG标准曲线线性回归方程计算可得发酵液中4-EG的含量为45.59mg/L。
(5)将含有4-EG的发酵液以体积比1∶20的比例加入到酱油发酵后期的酱醪中，即可提高酱油中4-乙基愈创木酚含量。
实施例2
如实施例1中所述的利用微生物发酵提高酱油中4-乙基愈创木酚含量的方法，不同之处在于，步骤(2)中用米曲霉代替黑曲霉，培养温度为28℃，培养时间为3d，即：将米曲霉划线接种至PDA斜面，28℃恒温培养3d，往试管斜面中加入5mL生理盐水，用接种环刮取斜面上的孢子，制备孢子液；
将1mL孢子液接种至小麦麸皮培养基(小麦麸皮10g，KH2PO4 0.06g，MgSO4·7H2O0.06g，NaNO3 0.06g，去离子水15mL，置于250mL锥形瓶，121℃灭菌20min，即得)，28℃培养米曲霉3d至成熟，以1∶10(g/mL)的料液比向培养基中加入去离子水，在35℃，160r/min下振荡浸提2h，用4层纱布过滤除去麸皮，8000r/min离心10min除去黑曲霉菌丝，制得米曲霉酶液(所述的米曲霉酶液中阿魏酸酯酶的酶活为1.2U/mL)，置于4℃冰箱保存备用。
用HPLC测定粗提液中的FA，根据峰面积值和FA标准曲线线性回归方程计算可得粗提液中FA的含量为372.98mg/L。
用HPLC测定发酵液中的4-EG，根据峰面积值和4-EG标准曲线线性回归方程计算可得发酵液中4-EG的含量为25.52mg/L。
实施例3
一种利用微生物发酵提高酱油中4-乙基愈创木酚含量的方法，包括如下步骤：
(1)小麦麸皮预处理：将小麦麸皮在130℃，0.2MPa条件下蒸煮20min，然后置于电热鼓风干燥箱中105℃烘干4h，再用高速粉碎机粉碎过60目筛，得到小麦麸皮粉末，制得的小麦麸皮粉末保存于干燥器中；
(2)霉菌酶液的制备：分别将米曲霉和黑曲霉划线接种至PDA斜面，米曲霉的培养温度为28℃，培养时间为3d；黑曲霉的培养温度为35℃，培养时间为4d；分别往试管斜面中加入5mL生理盐水，用接种环刮取斜面上的孢子，制备米曲霉孢子液和黑曲霉孢子液；
将1mL黑曲霉孢子液接种至小麦麸皮培养基(小麦麸皮10g，KH2PO4 0.06g，MgSO4·7H2O 0.06g，NaNO3 0.06g，去离子水15mL，置于250mL锥形瓶，121℃灭菌20min，即得)，35℃培养黑曲霉3d至成熟；以1∶10(g/mL)的料液比向培养基中加入离子水，在35℃，160r/min下振荡浸提2h，用4层纱布过滤除去麸皮，8000r/min离心10min除去黑曲霉菌丝，制得黑曲霉酶液(所述的黑曲霉酶液中阿魏酸酯酶的酶活为2.5U/mL)，置于4℃冰箱保存备用；
将1mL米曲霉孢子液接种至小麦麸皮培养基(小麦麸皮10g，KH2PO4 0.06g，MgSO4·7H2O 0.06g，NaNO3 0.06g，去离子水15mL，置于250mL锥形瓶，121℃灭菌20min，即得)，28℃培养米曲霉2d至成熟；以1∶10(g/mL)的料液比向培养基中加入离子水，在35℃160r/min下振荡浸提2h，用4层纱布过滤除去麸皮，8000r/min离心10min除去米曲霉菌丝，制得米曲霉酶液(所述的米曲霉酶液中阿魏酸酯酶的酶活为1.2U/mL)，置于4℃冰箱保存备用；
(3)酶解反应制备阿魏酸粗提液：称取100g小麦麸皮粉末置于酶解反应器，以1∶10的料液比(g/mL)加入适量黑曲霉酶液和米曲霉酶液(黑曲霉酶液∶米曲霉酶液按体积比1∶1混合)，充分混匀在40℃，120r/min下进行2h酶解反应，然后在95℃，5min灭酶终止反应，过滤除去反应底物，60℃旋转蒸发浓缩10倍，制备FA粗提液；
用HPLC测定粗提液中的FA，根据峰面积值和FA标准曲线线性回归方程计算可得粗提液中FA的含量为659.23mg/L；
(4)微生物发酵转化FA粗提液产生4-EG：以FA粗提液为液体发酵培养基，用LB液体培养基培养枯草芽孢杆菌G2021制成种子液(种子液的制备方法具体为：挑取一环(1～10μL)保存于LB斜面的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G2021接种到100mL LB液体培养基，在35℃，160r/min恒温摇床培养24h，即得种子液，将种子液以5％(v/v)的比例接种到液体发酵培养基，在35℃，120r/min振荡发酵12d，即得含有4-EG的发酵液；
用HPLC测定发酵液中的4-EG，根据峰面积值和4-EG标准曲线线性回归方程计算可得发酵液中4-EG的含量为42.72mg/L。
(5)将含有4-EG的发酵液以体积比1∶20的比例加入到酱油发酵后期的酱醪中，即可提高酱油中4-乙基愈创木酚含量。
实施例4：
一种利用微生物发酵提高酱油中4-乙基愈创木酚含量的方法，包括如下步骤：
(1)小麦麸皮预处理：将小麦麸皮在130℃，0.2MPa条件下蒸煮20min，然后置于电热鼓风干燥箱中105℃烘干4h，再用高速粉碎机粉碎过60目筛，得到小麦麸皮粉末，制得小麦麸皮粉末保存于干燥器中；
(2)黑曲霉酶液的制备：将黑曲霉划线接种至PDA斜面，35℃恒温培养4d，往试管斜面中加入5mL生理盐水，用接种环刮取斜面上的孢子，制备孢子液；
将1mL孢子液接种至小麦麸皮培养基(小麦麸皮10g，KH2PO4 0.06g，MgSO4·7H2O0.06g，NaNO3 0.06g，去离子水15mL，置于250mL锥形瓶，121℃灭菌20min，即得)，35℃培养黑曲霉4d至成熟，以1∶10(g/mL)的料液比向培养基中加入离子水，在35℃，160r/min下振荡浸提3h，用4层纱布过滤除去麸皮，8000r/min离心10min除去黑曲霉菌丝，制得黑曲霉酶液(所述的霉菌酶液中阿魏酸酯酶的酶活为2.5U/mL)，置于4℃冰箱保存备用；
(3)酶解反应制备阿魏酸粗提液：称取100g小麦麸皮粉末置于酶解反应器，以1∶20(g/mL)的料液比加入适量黑曲霉酶液，充分混匀在35℃，120r/min下进行2h酶解反应，然后在95℃，5min灭酶终止反应，过滤除去反应底物，60℃旋转蒸发浓缩10倍，制备FA粗提液；
用HPLC测定粗提液中的FA，根据峰面积值和FA标准曲线线性回归方程计算可得粗提液中FA的含量为911.85mg/L；
(4)微生物发酵转化FA粗提液产生4-EG：在用于发酵的FA粗提液中加入NaCl，使得发酵体系(由种子液和液体发酵培养基组成)中NaCl的含量为1％(w/v)，以加入NaCl后的FA粗提液为液体发酵培养基，用LB液体培养基培养枯草芽孢杆菌G2021制成种子液(种子液的制备方法具体为：挑取一环(1～10μL)保存于LB斜面的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G2021接种到100mL LB液体培养基，在35℃，160r/min恒温摇床培养24h，即得种子液)，将种子液以5％(v/v)的比例接种到液体发酵培养基，在35℃，120r/min振荡发酵12d，即得含有4-EG的发酵液；
用HPLC测定发酵液中的4-EG，根据峰面积值和4-EG标准曲线线性回归方程计算可得发酵液中4-EG的含量为66.79mg/L。
(5)将含有4-EG的发酵液以体积比1∶20的比例加入到酱油发酵后期的酱醪中，即可提高酱油中4-乙基愈创木酚含量。
对比例1：
一种利用微生物发酵提高酱油中4-乙基愈创木酚含量的方法，包括如下步骤：
(1)小麦麸皮预处理：将小麦麸皮置于电热鼓风干燥箱中105℃烘干4h，再用高速粉碎机粉碎过60目筛，得到小麦麸皮粉末，制得小麦麸皮粉末保存于干燥器中；
(2)黑曲霉酶液的制备：将黑曲霉划线接种至PDA斜面培养基，35℃恒温培养4d，往试管斜面中加入5mL生理盐水，用接种环刮取斜面上的孢子，制备孢子液；
将1mL孢子液接种至小麦麸皮培养基(小麦麸皮10g，KH2PO4 0.06g，MgSO4·7H2O0.06g，NaNO3 0.06g，去离子水15mL，置于250mL锥形瓶，121℃灭菌20min，即得)，35℃培养黑曲霉6d至成熟，以1∶10(g/mL)的料液比向培养基中加入离子水，在35℃，160r/min下振荡浸提3h，用4层纱布过滤除去麸皮，8000r/min离心10min除去黑曲霉菌丝，制得黑曲霉酶液(所述的黑曲霉酶液中阿魏酸酯酶的酶活为2.5U/mL)，置于4℃冰箱保存备用；
(3)酶解反应制备阿魏酸粗提液：称取100g小麦麸皮粉末置于酶解反应器，以1∶20(g/mL)的料液比加入适量黑曲霉酶液，充分混匀在45℃，120r/min下进行2h酶解反应，然后在95℃，5min灭酶终止反应，过滤除去反应底物，60℃旋转蒸发浓缩10倍，制备FA粗提液；
用HPLC测定粗提液中的FA，根据峰面积值和FA标准曲线线性回归方程计算可得粗提液中FA的含量为586.35mg/L；
(4)微生物发酵转化FA粗提液产生4-EG：在用于发酵的FA粗提液中加入NaCl，使得发酵体系(由种子液和液体发酵培养基组成)中NaCl的含量为1％(w/v)，以加入NaCl后的FA粗提液为液体发酵培养基，用LB液体培养基培养枯草芽孢杆菌G2021制成种子液(种子液的制备方法具体为：挑取一环(1～10μL)保存于LB斜面的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G2021接种到100mL LB液体培养基，在35℃，160r/min恒温摇床培养24h，即得种子液)，将种子液以5％(v/v)的比例接种到液体发酵培养基，在35℃，120r/min振荡发酵12d，即得含有4-EG的发酵液；
用HPLC测定发酵液中的4-EG，根据峰面积值和4-EG标准曲线线性回归方程计算可得发酵液中4-EG的含量为42.95mg/L。
(5)将含有4-EG的发酵液以体积比1∶10的比例加入到酱油发酵后期的酱醪中，即可提高酱油中4-乙基愈创木酚含量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌G2021，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G2021，于2021年3月31日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61591。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌G2021在提高酱油中4-乙基愈创木酚含量中的应用。
3.一种利用微生物发酵提高酱油中4-乙基愈创木酚含量的方法，包括如下步骤：
(1)小麦麸皮预处理：将小麦麸皮在高温高压条件下蒸煮，然后烘干，粉碎过筛，得到小麦麸皮粉末；
(2)霉菌混合酶液的制备：将霉菌以孢子液的形式接种至小麦麸皮培养基，恒温培养至霉菌成熟，加水振荡浸提，过滤离心，制得霉菌酶液；
(3)酶解反应制备阿魏酸粗提液：向小麦麸皮粉末中加入步骤(2)得到的霉菌酶液，充分混匀进行酶解反应，灭酶，过滤，浓缩，制得FA粗提液；
(4)微生物发酵转化阿魏酸粗提液产生4-乙基愈创木酚：以步骤(3)的FA粗提液为液体发酵培养基，用LB液体培养基培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G2021制成种子液，将种子液接种到液体发酵培养基中，恒温振荡发酵，即得含有4-乙基愈创木酚的发酵液；
(5)将发酵液以体积比1∶10～20的比例加入到酱油发酵后期的酱醪中，即可提高酱油中4-乙基愈创木酚含量。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
步骤(1)中所述的高温高压为121～130℃，0.1～0.3MPa蒸煮15～30min。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
步骤(2)中所述的霉菌为黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillusoryzae)中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
所述的黑曲霉为黑曲霉菌ATCC 16404；
所述的米曲霉为CICC2339(沪酿3.042)米曲霉菌株。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
当霉菌为黑曲霉时，所述的恒温培养的条件为：30～35℃恒温培养3～6d；
当霉菌为米曲霉时，所述的恒温培养的条件为：25～30℃恒温培养2～3d。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
步骤(3)中所述的小麦麸皮粉末与霉菌酶液按料液比g/mL 1∶5～25计算；
步骤(3)中所述的酶解反应的条件为35～45℃，120～200r/min酶解1～4h；
步骤(4)中，还包括向阿魏酸粗提液中加入NaCl的操作；
步骤(4)中所述的种子液的制备方法为：挑取一环保存于LB斜面的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G2021接种到100mL LB液体培养基，在35～37℃，120～160r/min恒温摇床培养18～24h，即得种子液；
步骤(4)中所述的种子液以3％～7％v/v的比例接种到液体发酵培养基中。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
步骤(1)中所述的烘干的条件为：100～110℃烘干2～4h；
步骤(2)中所述的小麦麸皮培养基的制备方法为：小麦麸皮10g，KH2PO4 0.06g，MgSO4·7H2O 0.06g，NaNO3 0.06g，去离子水15～25mL，121℃灭菌20min，即得。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
步骤(2)中所述的水为去离子水；所述的水的加入量以使培养基的料液比g/mL为1∶8～15为准；
步骤(2)中所述的振荡浸提的条件为30～40℃，150～170r/min振荡浸提1～3h；
步骤(2)中所述的离心的条件为7000～9000r/min离心8～12min；
步骤(4)中所述的恒温振荡发酵的条件为：30～37℃，120～200r/min振荡发酵6～12d。
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