CN116218682A - 一种酶解柑橘果汁苦味物质的酶制剂的制备方法及其应用 - Google Patents

一种酶解柑橘果汁苦味物质的酶制剂的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酶解柑橘果汁苦味物质的酶制剂的制备方法及其应用。以实验室前期分离并经等离子体（ARTP）诱变获得的塔宾曲霉UA13为出发菌株，采用柠檬皮粉中的柠檬苦素作为诱导物对其进行产酶诱导，并对菌株的发酵产酶工艺和酶的底物亲和性进行研究。结果表明：在1 L发酵罐培养基中，柠檬苦素添加量4.0 mg/L、接种量10%（v/v）、初始pH值5.0、搅拌转速250 rpm、30℃的最适条件下发酵，柠檬苦素脱苦酶活力最高可达48.52 U/mL。酶对柠檬苦素的底物亲和性研究结果表明，柠檬苦素脱苦酶对柠檬苦素的底物亲和性Km值为0.622 mmol/L，具有很强的亲和性，同时该酶仍能高效水解柚皮苷和橙皮苷等其他苦味物质，具有较好的耐热性和耐酸性，在柑橘果汁加工业中具有非常好的应用效果。

Description

一种酶解柑橘果汁苦味物质的酶制剂的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于酶制剂技术领域，具体的说涉及一种酶解柑橘果汁苦味物质的酶制剂的制备方法及其应用。
背景技术
柑橘中的苦味物质主要包括两大类，一类是类黄酮物质，包括柚皮苷、新橙皮苷、枳属苷、橘皮素、川陈皮苷、槲皮素等，其中柚皮苷含量最高，是最主要的黄烷酮糖苷类苦味物质。另一类为高度氧化的三萜化合物——柠檬苦素类似物，其中柠檬苦素是主要致苦物质。柑橘类果实中主要的苦味物质，柚皮苷和柠檬苦素，在柚类中含量最高，然后依次为葡萄柚、柑类或杂柑类、橘类、脐橙类和普通甜橙类。柑橘类水果中存在的这些天然苦味物质在加工过程中，出现的“延迟苦味”或“后苦味”严重制约了其加工业的发展，是目前柑橘加工业所面临的巨大挑战之一。因此，工业上，必须对柑橘类水果进行脱苦，提高其加工制品的质量。
柠檬苦素(limonin)，是柑橘类水果出现苦味和“后苦味”的主要物质，极大地影响了柑橘汁的口感。柠檬苦素又称柠碱，是一种三萜化合物，在水溶液中的苦味阈值为1.0mg/kg，在果汁中的苦味阈值为3.4mg/L，约为柚皮苷的20倍。柠檬苦素在鲜果或鲜榨果汁中含量较低，多以无苦味的柠檬苦素A-环内酯存在于细胞质内，但长时间放置或热处理等会使其苦味加剧。这种“后苦味”现象是由于在酸性条件(pH<6.5)下，柠檬苦素A-环内酯在柠檬苦素D-环内酯水解酶催化下转化为有苦味的柠檬苦素。果肉组织在冰冻、机械损伤或热处理等条件下，其酸度均会增强，进而促进了加工或贮藏过程中柠檬苦素的生成。
Figure SMS_1
柚皮苷的酶解原理如下：
Figure SMS_2
水解柚皮苷主要分两步完成，柚皮苷(4'-5,7'-三羟基二氢黄酮-7-鼠李糖葡萄糖苷)被鼠李糖苷酶水解为鼠李糖和普鲁宁，普鲁宁的苦味约为柚皮苷的三分之一；普鲁宁又在β-D-葡萄糖苷酶的作用下被水解为无苦味的柚皮素和葡萄糖。
由上述可知，对于柠檬苦素和柚皮苷的酶解原理是完全不同的。
目前报道的用于果汁脱苦的方法有β-环糊精法、超临界CO2法、膜分离法、添加苦味抑制剂、生物酶法等。相较于其他脱苦法，生物酶法不仅具有效果好、无污染、工艺简单、反应条件温和等特点，而且其酶解产物一定程度上还能增强果汁风味，保留果汁营养成分，更适用于工业化生产。生物酶法在柑橘加工业中之所以未得到广泛应用，其主要原因是缺乏高活性的酶制剂产品，因此制备出性能稳定、活性高的酶制剂至关重要。目前市场上销售的柚苷酶粉剂，其作用底物仅为柚皮苷，对柠檬苦素和诺米林苦味物几乎无作用，且活力仅为0.1-0.4U/mL。纯的柚苷酶以前可以从国外进口，但是近几年，国外几大酶制剂公司也没有现货，需要提前半年以上的订制，且价格昂贵，非常受限。
中国专利CN104404016B公布了一种生产柚苷酶的方法，采用传统的液体发酵方法，得到的柚苷酶活力不高，且热稳定性仅为45℃。中国专利CN101914451A公布了一种从链格孢菌生产α-L-鼠李糖苷酶的方法，链格孢菌所产的α-L-鼠李糖苷酶为胞内酶，需要从细胞中分离提取，后续分离纯化困难，直接导致了使用成本较高。中国专利CN105441410A公布了一种来源于细丽毛壳菌种的鼠李糖苷酶的生产方法，得到的酶活力为500U/mL，但是并未对底物特异性进行研究。这些研究成果体现了近年来α-L-鼠李糖苷酶或柚苷酶的研究深受人们的关注，但是对于具有复合脱苦酶特性的酶制剂的研究却很少涉及。
发明内容
本发明提出一种酶解柑橘果汁苦味物质的酶制剂的制备方法及其应用，能够同时酶解柑橘果汁苦味物质——柠檬苦素和柚皮苷的酶制剂的方法。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案为：
一种塔宾曲霉，所述塔宾曲霉名称为塔宾曲霉UA13，Aspergillus tubingensisUA13，于2022年06月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M20222989，保藏地址为湖北，武汉，武汉大学。
优选地，塔宾曲霉应用于发酵法制备柠檬苦素脱苦酶。
进一步优选地，所述应用为在塔宾曲霉的发酵培养基中加入柠檬苦素或含有柠檬苦素的柠檬皮粉，柠檬苦素加入量为4.0-6.0mg/L。
柠檬皮粉的制备：新鲜柠檬皮去掉白色囊衣层，切片后烘干，再磨粉至100目备用。
进一步优选地，所述培养基包括发酵培养基，发酵培养基中：MgSO4·7H2O 0.40-0.60g/L，KH2PO4 1.20-1.80g/L，K2HPO4 1.20-1.80g/L，(NH4)2SO4 3.50-4.50g/L，ZnSO4·7H2O 0.05-0.15g/L，CaCl2 0.05-0.15g/L，酵母提取物0.80-1.20g/L，豆粉1.50-2.50g/L，蛋白胨1.50-2.50g/L，柠檬苦素4.00-5.00mg/L，自然pH。
再进一步优选地，发酵培养基中：
MgSO4·7H2O 0.50g/L，KH2PO4 1.50g/L，K2HPO4 1.50g/L，(NH4)2SO4 4.00g/L，ZnSO4·7H2O 0.10g/L，CaCl2 0.10g/L，酵母提取物1.00g/L，豆粉2.00g/L，蛋白胨2.00g/L，柠檬苦素4.00mg/L。
所述的塔宾曲霉在酶解苦味物质主要为柠檬苦素的复合酶制剂的制备中的应用，
所述应用包括：
固体平板培养基：MgSO4·7H2O 0.80-1.20g/L，KH2PO4 0.80-1.20g/L，(NH4)2SO41.30-1.70g/L，KCl 0.30-0.80g/L，KNO3 1.20-1.70g/L，CaCl2 0.05-0.15g/L，酵母提取物1.50-2.50g/L，柠檬苦素0.50-1.50mg/L，琼脂粉8.00-12.00g/L，自然pH；
种子培养基：柠檬苦素3.50-4.50mg/L，MgSO4·7H2O 4.00-6.00g/L，K2HPO4 4.00-7.00g/L，KCl 4.00-6.00g/L，FeSO4·5H2O 0.05-0.15g/L，自然pH；
发酵培养基中：MgSO4·7H2O 0.40-0.60g/L，KH2PO4 1.20-1.80g/L，K2HPO4 1.20-1.80g/L，(NH4)2SO4 3.50-4.50g/L，ZnSO4·7H2O 0.05-0.15g/L，CaCl2 0.05-0.15g/L，酵母提取物0.80-1.20g/L，豆粉1.50-2.50g/L，蛋白胨1.50-2.50g/L，柠檬苦素4.00-5.00mg/L；
固体平板培养基、种子培养基和发酵培养基，依次扩大培养。
所述的塔宾曲霉在酶解苦味物质主要为柚皮苷的复合酶制剂的制备中的应用，其所述应用包括：
在固体平板培养基中加入柚皮粉8.00-12.00g/L或柚皮苷4.00-6.00g/L，种子培养基组分中加入柚皮粉8.00-12.00g/L，发酵培养基中加入柚皮粉8.00-12.00g/L或柚皮苷4.00-6.00g/L；培养基其他组分分别为：
固体平板培养基：MgSO4·7H2O 0.80-1.20g/L，KH2PO4 0.80-1.20g/L，(NH4)2SO41.30-1.70g/L，KCl 0.30-0.80g/L，KNO3 1.20-1.70g/L，CaCl2 0.05-0.15g/L，酵母提取物1.50-2.50g/L，琼脂粉8.00-12.00g/L，自然pH；
种子培养基：MgSO4·7H2O 4.00-6.00g/L，K2HPO4 4.00-7.00g/L，KCl 4.00-6.00g/L，FeSO4·5H2O 0.05-0.15g/L，自然pH；
发酵培养基中：MgSO4·7H2O 0.40-0.60g/L，KH2PO4 1.20-1.80g/L，K2HPO4 1.20-1.80g/L，(NH4)2SO4 3.50-4.5 0g/L，ZnSO4·7H2O 0.05-0.15g/L，CaCl2 0.05-0.15g/L，酵母提取物0.80-1.20g/L，豆粉1.50-2.50g/L，蛋白胨1.50-2.50g/L。
固体平板培养基、种子培养基和发酵培养基，依次扩大培养。
柚皮粉的制备：新鲜柚子皮去掉白色囊衣层，切片后烘干，再磨粉至100目备用。
培养条件：在初始pH值5.0-6.0下进行液体发酵，培养温度30-35℃，通气量1.3-2.5min/L，搅拌转速250-300rpm下发酵70-77h，可获得最大酶活力的复合酶发酵液。
所述的塔宾曲霉在酶解苦味物质主要为柠檬苦素类的复合酶制剂的制备中的应用，其所述应用包括：
在固体平板培养基中加入柠檬皮粉8.00-12.00g/L或柠檬苦素4.00-6.00g/L，种子培养基组分中加入柠檬皮粉8.00-12.00g/L，发酵培养基中加入柠檬皮粉8.00-12.00g/L或柠檬苦素4.00-6.00g/L；
培养基其他组分分别为：
固体平板培养基：MgSO4·7H2O 0.80-1.20g/L，KH2PO4 0.80-1.20g/L，(NH4)2SO41.30-1.70g/L，KCl 0.30-0.80g/L，KNO3 1.20-1.70g/L，CaCl2 0.05-0.15g/L，酵母提取物1.50-2.50g/L，琼脂粉8.00-12.00g/L，自然pH；
种子培养基：MgSO4·7H2O 4.00-6.00g/L，K2HPO4 4.00-7.00g/L，KCl 4.00-6.00g/L，FeSO4·5H2O 0.05-0.15g/L，自然pH；
发酵培养基中：MgSO4·7H2O 0.40-0.60g/L，KH2PO4 1.20-1.80g/L，K2HPO4 1.20-1.80g/L，(NH4)2SO4 3.50-4.50g/L，ZnSO4·7H2O 0.05-0.15g/L，CaCl2 0.05-0.15g/L，酵母提取物0.80-1.20g/L，豆粉1.50-2.50g/L，蛋白胨1.50-2.50g/L。
固体平板培养基、种子培养基和发酵培养基，依次扩大培养。
柠檬皮粉的制备：新鲜的柠檬皮切片后烘干，再磨粉至100目备用；
培养条件：在初始pH值5.0-6.0下进行液体发酵，培养温度31-34℃，通气量1.3-1.8min/L，搅拌转速250-280rpm下发酵70-76h，可获得最大酶活力的复合酶发酵液。
所述的塔宾曲霉在酶解苦味物质主要为柚皮苷和柠檬苦素的复合酶制剂的制备中的应用，所述应用包括：
在固体平板培养基中加入柚皮粉8.00-12.00g/L或柚皮苷4.00-6.00g/L，种子培养基组分中加入柠檬皮粉8.00-12.00g/L，发酵培养基中加入柠檬皮粉8.00-12.00g/L；
培养基其他组分分别为：
固体平板培养基：MgSO4·7H2O 0.80-1.20g/L，KH2PO4 0.80-1.20g/L，(NH4)2SO41.30-1.70g/L，KCl 0.30-0.80g/L，KNO3 1.20-1.70g/L，CaCl2 0.05-0.15g/L，酵母提取物1.50-2.50g/L，琼脂粉8.00-12.00g/L，自然pH；
种子培养基：MgSO4·7H2O 4.00-6.00g/L，K2HPO4 4.00-7.00g/L，KCl 4.00-6.00g/L，FeSO4·5H2O 0.05-0.15g/L，自然pH；
发酵培养基中：MgSO4·7H2O 0.40-0.60g/L，KH2PO4 1.20-1.80g/L，K2HPO4 1.20-1.80g/L，(NH4)2SO4 3.50-4.50g/L，ZnSO4·7H2O 0.05-0.15g/L，CaCl2 0.05-0.15g/L，酵母提取物0.80-1.20g/L，豆粉1.50-2.50g/L，蛋白胨1.50-2.50g/L。
固体平板培养基、种子培养基和发酵培养基，依次扩大培养。
培养条件：培养条件：在初始pH值5.0-6.0下进行液体发酵，培养温度30-35℃，通气量1.3-1.8min/L，搅拌转速250-300rpm下发酵65-75h，可获得最大酶活力的复合酶发酵液。
本发明有益效果：
1、菌株UA13所产酶对柠檬苦素的亲和力强。同时研究结果显示，柠檬苦素脱苦酶仍能高效水解柚皮苷，即本发明的菌株UA13可以同时酶解柠檬苦素、柚皮苷和橙皮苷，那么该酶在柑橘果汁加工业中就具有了非常好的应用前景。
2、柠檬苦素脱苦酶具有良好的耐热性、耐酸性，方便酶制剂的广泛使用，针对不同种类的柑橘类、不同成熟期的柑橘类或者不同的加工条件都可以运用。
3、菌株UA13所产酶的底物不管是柠檬苦素类还是柚皮苷，均具有酶解能力，酶解能力根据底物的不同略有不同。
4、菌株培养产酶过程中，可根据作用的底物的不同需求，以相应的诱导物诱导酶的生产，从而获得特应性的酶类物质。
附图说明
图1未优化发酵条件下菌株UA13于1L发酵罐中的发酵曲线；
图2搅拌转速对菌株UA13产酶的影响；
图3发酵温度对菌株UA13产酶的影响；
图4发酵液初始pH值对菌株UA13产酶的影响；
图5柠檬苦素脱苦酶催化不同底物的Linewear-Burk曲线。
具体实施方式:
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。对本发明做进一步详细的说明，但不限于这些实施例。
实施例1
一种塔宾曲霉，所述塔宾曲霉名称为塔宾曲霉UA13，Aspergillus tubingensisUA13，于2022年06月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M20222989，保藏地址为湖北，武汉，武汉大学。
实施例2
采用实施例1菌株，制备柠檬苦素脱苦酶。对发酵条件进行摸索，具体过程如下：
固体培养基：MgSO4·7H2O 1.00g/L，KH2PO4 1.00g/L，(NH4)2SO4 1.50g/L，KCl0.50g/L，KNO3 1.50g/L，CaCl2 0.10g/L，酵母提取物2.00g/L，柠檬苦素1.00mg/L，琼脂粉10.00g/L，自然pH。
种子培养基：柠檬苦素4.00mg/L，MgSO4·7H2O 5.00g/L，K2HPO4 5.00g/L，KCl5.00g/L，FeSO4·5H2O 0.10g/L，自然pH，接种量10％。
发酵培养基中：MgSO4·7H2O 0.50g/L，KH2PO4 1.50g/L，K2HPO4 1.50g/L，(NH4)2SO44.00g/L，ZnSO4·7H2O 0.10g/L，CaCl2 0.10g/L，酵母提取物1.00g/L，豆粉2.00g/L，蛋白胨2.00g/L，柠檬苦素4.00mg/L。
1实验方法
1.1发酵培养
孢子悬浮液：将实验室贮藏的斜面菌株塔宾曲霉UA13接种于固体平板培养基上，30℃培养3～4d至孢子成熟。用0.85％的无菌生理盐水洗下孢子并打散，得到菌悬液。对孢子悬液进行镜检计数，将浓度调整为107个/mL左右即可。
种子液：将调整好浓度的孢子悬浮液按10％(v/v)的接种量接入种子培养基中，于30℃、180r/min的恒温摇床中培养。
菌种发酵：将调整好的孢子悬浮液用无菌枪头吸取5mL(接种量10％，v/v)接入已灭菌的装液量50mL/250mL的发酵培养基中(5颗玻璃珠)。于30℃、180r/min的恒温摇床中培养72h。
1.2酶活测定
(1)粗酶液的制备：取摇瓶发酵培养72h的发酵液于离心管中，5000r/min离心20min。
(2)柠檬苦素含量的测定：分别取0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8mL的200μg/mL的柠檬苦素标准溶液置于25mL具塞试管中，无水乙醇补足至2mL，再各加入5mL显色液，充分摇匀后静置显色30min，在500nm波长下测定吸光度。以柠檬苦素含量为横坐标，吸光度为纵坐标得标准曲线方程为A＝0.0038C+0.0379，R2＝0.9997。
显色液的配制(现配现用)：精确称取125mg的对二氨基苯甲醛溶解于100mL的硫酸-无水乙醇混合液(V:V＝65:35，冷却后使用)，再加入0.5mL，0.9％的FeCl，混匀即可。
(3)柠檬苦素脱苦酶酶活测定：于具塞试管中加0.5mL、200μg/mL底物柠檬苦素，再加入0.1mL的一定浓度的酶液，用无水乙醇补足到2mL。将其置于60℃的恒温振荡器(150rpm)中酶解30min，取出酶解液立即置于100℃的沸水浴中灭酶活5min；于酶解液中添加5mL的显色液，混匀后静置显色30min。取出注入1cm比色皿内，用分光光度计在500nm处测定吸光值。
所有样品平行测定三次，取平均值进行分析(以下同)。
酶活力定义：在60℃，pH 4.0的条件下，每分钟消耗1μg柠檬苦素所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
Figure SMS_3
相对酶活力定义：同组实验中最高酶活定义为100％，其他条件下酶活值与最高值之比×100定义为相对酶活(％)。
1.3产酶条件优化
1.3.1摇瓶发酵优化
以柠檬苦素脱苦酶活力为评价指标，采用单因素试验探究菌株的最佳产酶条件。在初始培养条件下，接种一定种龄的种子液，改变发酵培养基的接种量(4％～16％，v/v)、发酵温度(25～40℃)、发酵液初始pH值(4.0～9.0)，确定菌株最佳的发酵环境。
1.3.2 1L发酵罐优化试验
1L发酵罐四联罐同步连续发酵，将种子液同步培养后接种至600mL的已灭菌发酵液中(接种量10％，v/v)。在通气量0.4L/min，搅拌转速300rpm，初始pH值为5.0的初始条件下进行放大培养。在摇瓶优化结果的基础上，分别对搅拌转速(200～350rpm)、发酵温度(25～40℃)、发酵初始pH值(4.0～7.0)进行优化，通过对发酵过程中菌株生长与产酶情况确定最适产酶条件。
酶活力提高倍数的分析以摇瓶发酵优化后的酶活力为基础进行比较研究。
2结果
2.1产酶条件优化
2.1.1菌株接种量对产酶的影响
种子液的浓度以及菌种的生理状态会直接影响发酵效果。种子培养基培养的时间一定程度上决定了种子活力的强弱，特别是丝状真菌，其菌体的形态和养分传质都会受到影响。在前期研究的基础上，以不同接种量接种48h的种子培养基到摇瓶中发酵培养，菌株产酶活力如表1所示。
表1不同接种量对菌株UA13产酶的影响
Figure SMS_4
Figure SMS_5
由上表1可知，接种量对菌株发酵产酶的活力影响较小。接种量在4％～10％(v/v)范围内时，菌株产酶能力均维持在一个相对较高的水平。综合考虑产酶活力与发酵时间，本研究确定接种量10％(v/v)作为后续研究的基础(以下同)。
2.1.2发酵温度对产酶的影响
改变发酵温度，探究菌株产柠檬苦素脱苦酶的最适培养温度，结果如表2所示。
表2发酵温度对菌株UA13产酶的影响
温度/℃ 相对酶活力/(％)
20 59.56
25 68.29
30 83.94
35 100.00
40 74.33
由上表2可知，菌株在25～40℃范围内发酵培养时，菌株产酶活力随培养温度的增加呈现先增加后下降的趋势，酶活在35℃时达到最大。因此，本研究采用发酵温度35℃进行后续实验。
2.1.3初始pH值对产酶的影响
培养基的初始pH值会对酶的结构和功能、细胞的结构、细胞膜的电荷状况等造成影响。微生物在生长过程中产生的代谢产物也会造成培养基的pH值发生变化。霉菌的生长与产酶的pH范围大致在3.0～8.5。
表3发酵初始pH值对菌株UA13产酶的影响
初始pH值 相对酶活力/(％)
4 55.34
5 100.00
5.5 78.02
6 76.31
7 73.96
8 69.98
9 28.39
不同菌株生长代谢及产酶的适宜pH值范围不同。由上表3可知，发酵初始pH值在5.0～6.0范围时，菌株发酵产酶能力较强，初始pH 5.0时，酶活力达到最高。因此，本研究采用初始pH 5.0进行后续实验。
在单因素试验基础上，以4.0mg/L的柠檬苦素为碳源兼诱导物，接种10％(v/v)发酵48h的种子培养基，在初始培养基pH 5.0，发酵温度35℃条件下发酵72h，菌株UA13产柠檬苦素脱苦酶可达到最高活力。
2.2发酵罐优化实验
1L发酵罐四联罐同步连续发酵，将种子液同步培养后接种至600mL的已灭菌发酵液中(接种量10％，v/v)。在通气量0.4L/min，搅拌转速300rpm，初始pH值为5.0的初始条件下进行放大培养。发酵过程中溶氧的变化能够反映菌株生长状态。如图1所示，发酵开始24h菌体处于迟滞期，溶氧急剧下降，培养基中的氧气被充分利用。随后，溶氧开始逐渐上升，酶的生物合成开始，菌体进入生长指数期，酶活力开始持续增加，发酵72h酶活达到最高为25.48U/mL。培养基的pH值是动态变化的，其值从发酵开始迅速下降，随后逐渐上升，最后在4.3～4.8范围内波动。
2.2.1搅拌转速对产酶的影响
在摇瓶培养时通过摇床转动以及添加适量的玻璃珠来促进各物质的融合，避免菌丝体结团而影响发酵产酶。从摇瓶放大至发酵罐中，搅拌参数的控制很大程度上决定着罐体内物质混合和发酵产酶的效率。若搅拌速度过快，过大的剪切力会影响细胞的生成和组成，对菌体发酵产酶造成不利影响；若搅拌转速过低，菌丝体缠绕成团，不利于发酵生产。
如图2所示，搅拌转速为200rpm时，由于搅拌转速较低，菌丝体生长较慢，迟滞期较长，36h进入生长对数期。菌体产酶能力在48h时达到最大为34.04U/mL，随后持续下降。而摇瓶实验可知菌株通常在72h时产酶活力达到最高，造成差异的原因可能是发酵罐的转速过低，菌丝体在后续未继续断裂繁殖，而是大量缠绕成球在罐内挡板上影响产酶；搅拌转速为350rpm时，发酵罐中的溶氧增加，但过高的剪切力会加速菌丝体的衰亡，发酵60h时酶活达到最高33.78U/mL；转速为250rpm和300rpm时的发酵变化趋势相差不大：菌株在250rpm转速下，于48h时酶活达到最高42.61U/mL，提高了67.23％。菌株在300rpm转速下，于60h时酶活达到最高43.23U/mL，提高了69.66％。考虑到实际发酵中节省能源，且两种转速下的酶活相差不大，选择250rpm为最优转速更为适宜。
2.2.2发酵温度对产酶的影响
如图3所示，不同温度下的菌株发酵曲线趋势基本一致：当发酵温度控制在25℃和40℃时，酶活均在48h达到最高，分别为28.80U/mL和30.46U/mL，酶活相对较低，与摇瓶发酵情况一致；在30℃、35℃时，菌株产酶活力在36h分别达到40.10U/mL、35.61U/mL，在发酵60h时两者均出现二次生长。综上所述，菌株在30℃～35℃均有良好的产酶能力，在30℃的培养温度下，菌株提前在36h酶活就达到最高40.10U/mL，相较于优化前提高了57.38％，缩短了发酵周期。因此，选择培养温度30℃进行后续发酵罐优化实验。
2.2.3发酵液初始pH值对产酶的影响
如图4所示，在初始pH 5.0条件下，发酵前12h，溶氧迅速下降。在12h～48h，发酵罐的溶氧趋近于零，基本维持10％以下，说明初始pH 5.0条件下菌株代谢旺盛，更适宜生长，与摇瓶实验结果一致。在48h时，柠檬苦素脱苦酶活力已达到48.52U/mL，相较于优化前提高了90.42％；在发酵初始pH 6.0条件下，菌株在48h～72h都维持着较好的产酶能力，酶活最高可达40.16U/mL；发酵液初始pH 4.0时，酶在96h时达到最高活力为38.82U/mL。综上所述，发酵液的最适初始pH值为5.0，且塔宾曲霉UA13在初始pH 4.0～6.0范围内的生长和产酶能力较强，此菌株更适宜在偏酸环境中生存，与摇瓶实验结果一致。
对菌株进行了1L发酵罐优化试验确定菌株，在1L发酵罐培养基中，柠檬苦素添加量4.0mg/L、接种量10％(v/v)、初始pH值5.0、搅拌转速250rpm、30℃的最适条件下发酵，柠檬苦素脱苦酶活力最高可达48.52U/mL，相较于优化前提高90.42％。
其中培养基为：
固体培养基：MgSO4·7H2O 1.00g/L，KH2PO4 1.00g/L，(NH4)2SO4 1.50g/L，KCl0.50g/L，KNO3 1.50g/L，CaCl2 0.10g/L，酵母提取物2.00g/L，柠檬苦素1.00mg/L，琼脂粉10.00g/L，自然pH。
种子培养基：柠檬苦素4.00mg/L，MgSO4·7H2O 5.00g/L，K2HPO4 5.00g/L，KCl5.00g/L，FeSO4·5H2O 0.10g/L，自然pH，接种量10％。
发酵培养基中：MgSO4·7H2O 0.50g/L，KH2PO4 1.50g/L，K2HPO4 1.50g/L，(NH4)2SO44.00g/L，ZnSO4·7H2O 0.10g/L，CaCl2 0.10g/L，酵母提取物1.00g/L，豆粉2.00g/L，蛋白胨2.00g/L，柠檬苦素4.00mg/L。
实施例3
采用实施例2最优条件制备得到柠檬苦素脱苦酶。
条件为：在1L发酵罐培养基中，柠檬苦素添加量4.00mg/L、接种量10％(v/v)、初始pH值5.0、搅拌转速250rpm、30℃的最适条件下发酵，柠檬苦素脱苦酶活力最高可达48.52U/mL。
其中培养基为：
固体培养基：MgSO4·7H2O 1.00g/L，KH2PO4 1.00g/L，(NH4)2SO4 1.50g/L，KCl0.50g/L，KNO3 1.50g/L，CaCl2 0.10g/L，酵母提取物2.00g/L，柠檬苦素1.00mg/L，琼脂粉10.00g/L，自然pH。
种子培养基：柠檬苦素4.00mg/L，MgSO4·7H2O 5.00g/L，K2HPO4 5.00g/L，KCl5.00g/L，FeSO4·5H2O 0.10g/L，自然pH，接种量10％。
发酵培养基中：MgSO4·7H2O 0.50g/L，KH2PO4 1.50g/L，K2HPO4 1.50g/L，(NH4)2SO44.00g/L，ZnSO4·7H2O 0.10g/L，CaCl2 0.10g/L，酵母提取物1.00g/L，豆粉2.00g/L，蛋白胨2.00g/L，柠檬苦素4.00mg/L。
发酵液离心后的上清液即为粗酶液。探究粗酶液在不同酶解温度(30～70℃)和pH值(2.0～8.0)下的酶活变化。以同组实验中测定最高酶活为100％，计算其他条件下的相对酶活力。
酶的底物亲和性：测定酶催化不同底物(柠檬苦素、柚皮苷、橙皮苷)的米氏常数Km值，探究酶对底物的亲和性，采用双倒数法(Linewear-Burk)求得Km。
1、柠檬苦素脱苦酶性质研究
1.1柠檬苦素脱苦酶最适酶解温度的研究
温度是影响底物转化效率的重要因素。温度过低时，许多酶分子未被激活，酶解效果极低。温度过高超过酶热稳定性范围时，酶蛋白失活。适宜的酶解温度可以使底物的转化效率达到最大。
表4酶解温度对柠檬苦素脱苦酶活力的影响
Figure SMS_6
Figure SMS_7
由表4可知，酶解温度在30～70℃范围内时，柠檬苦素脱苦酶的活力随温度升高呈先增加后下降的趋势，在60℃时酶活力达到最高；当酶解温度为70℃时，柠檬苦素脱苦酶活力仍有59.5％。因此，本研究的柠檬苦素脱苦酶具有良好的耐热性，且采用酶解温度60℃进行后续实验。
1.2柠檬苦素脱苦酶最适酶解pH值的研究
一般情况下，真菌产柚苷酶的最适pH值在3.0～6.0范围内。不适宜的pH值会对酶蛋白的构象造成影响，从而使酶活降低。
表5不同酶解pH值对柠檬苦素脱苦酶活力的影响
酶解pH值 相对酶活/(％)
2 67.51
3 90.58
4 98.36
5 100.00
6 94.66
7 81.11
8 54.52
由表5可知，菌株UA13在酶解pH 2.0～8.0的酶解环境下，酶活呈现先增加后下降的趋势。在酶解pH 5.0时，酶活达到最高；pH 3.0时相对酶活力有90.58％；pH 7.0时相对酶活力有81.11％。因此，此酶具有良好的耐酸性，且最适酶解pH为5.0。
2、底物亲和性研究
测定柠檬苦素脱苦酶在不同底物浓度下的反应速率，利用Linewear-Burk曲线得出相应的动力学参数。本研究发现经柠檬苦素诱导后的菌株发酵产酶催化三种不同底物(柠檬苦素、橙皮苷、柚皮苷)的反应皆符合米氏动力学规律(图5)。
实验可知，底物为柠檬苦素时，Km＝0.622mmol/L，Vmax＝0.017mmol/(L·min)；底物为橙皮苷时，Km＝0.967mmol/L，Vmax＝0.010mmol/(L·min)；底物为柚皮苷时，Km＝0.999mmol/L，Vmax＝0.018mmol/(L·min)。此酶具有水解柠檬苦素、橙皮苷、柚皮苷的能力，30min内对柠檬苦素、橙皮苷、柚皮苷水解率分别达48％、38％、33％。此酶水解的动态规律符合酶促反应动力学，由Km值可知此酶对底物亲和性大小为：柠檬苦素>橙皮苷>柚皮苷。因此，此酶对柠檬苦素的亲和性优于柚皮苷，这可能是由于柠檬苦素在菌株生长中作为诱导物兼碳源导致的结果。
以柚皮苷为诱导物对菌株进行发酵培养，即将本实施例中的培养基中的柠檬苦素改为柚皮苷，探究酶对底物亲和性的大小，发现柚皮苷诱导后的酶对柚皮苷亲和性更高(Km＝0.480mmol/L)，对柠檬苦素的底物亲和性较差(Km＝91.920mmol/L)，且在30min内对柠檬苦素、橙皮苷、柚皮苷水解率分别达37％、47％、52％。因此，可以推断诱导物的不同对菌株生长产酶有着很大的影响，经长期诱导和优化后的菌株对相应的诱导物的底物亲和性会更好，酶解相应的苦味物质能力更强。
实施例4
基于实施例3的研究结果，开发了三种复合酶的制备方法。
所述酶的制备均采用塔宾曲霉UA13，Aspergillus tubingensis UA13，于2022年06月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20222989，保藏地址为湖北，武汉，武汉大学。
1、酶解苦味物质主要为柚皮苷的复合酶制剂的制备方法，所述方法包括：
在固体平板培养基中加入柚皮粉10.00g/L，种子培养基组分中加入柚皮粉10.00g/L，发酵培养基中加入柚皮粉10.00g/L；培养基其他组分分别为：
培养基其他组分分别为：
固体培养基：MgSO4·7H2O 1.00g/L，KH2PO4 1.00g/L，(NH4)2SO4 1.50g/L，KCl0.50g/L，KNO3 1.50g/L，CaCl2 0.10g/L，酵母提取物2.00g/L，琼脂粉10.00g/L，自然pH。
种子培养基：MgSO4·7H2O 5.00g/L，K2HPO4 5.00g/L，KCl 5.00g/L，FeSO4·5H2O0.10g/L，自然pH，接种量10％。
发酵培养基中：MgSO4·7H2O 0.50g/L，KH2PO4 1.50g/L，K2HPO4 1.50g/L，(NH4)2SO44.00g/L，ZnSO4·7H2O 0.10g/L，CaCl2 0.10g/L，酵母提取物1.00g/L，豆粉2.00g/L，蛋白胨2.00g/L。
柚皮粉的制备：新鲜柚子皮去掉白色囊衣层，切片后烘干，再磨粉至100目备用；
培养条件：在初始pH值6.0下进行液体发酵，培养温度35℃，通气量1.6min/L，搅拌转速300rpm发酵75h，可获得最大酶活力的复合酶发酵液49.70U/mL。
制备得到的复合酶在30min内对柠檬苦素、橙皮苷、柚皮苷水解率分别达32％、50％、57％。
2、所述的塔宾曲霉在酶解苦味物质主要为柠檬苦素类的复合酶制剂的制备方法，柠檬苦素类化合物包括柠檬苦素、诺米林、脱乙酰诺米林、黄柏酮、米林酸，都是具有呋喃环的三萜类化合物。
所述方法包括：
在固体平板培养基中加入柠檬皮粉10.00g/L，种子培养基组分中加入柠檬皮粉10.00g/L，发酵培养基中加入柠檬皮粉10.00g/L；
培养基其他组分分别为：
固体培养基：MgSO4·7H2O 1.00g/L，KH2PO4 1.00g/L，(NH4)2SO4 1.50g/L，KCl0.50g/L，KNO3 1.50g/L，CaCl2 0.10g/L，酵母提取物2.00g/L，琼脂粉10.00g/L，自然pH。
种子培养基：MgSO4·7H2O 5.00g/L，K2HPO4 5.00g/L，KCl 5.00g/L，FeSO4·5H2O0.10g/L，自然pH，接种量10％。
发酵培养基中：MgSO4·7H2O 0.50g/L，KH2PO4 1.50g/L，K2HPO4 1.50g/L，(NH4)2SO44.00g/L，ZnSO4·7H2O 0.10g/L，CaCl2 0.10g/L，酵母提取物1.00g/L，豆粉2.00g/L，蛋白胨2.00g/L。
柠檬皮粉的制备：新鲜的柠檬皮切片后烘干，再磨粉至100目备用；
培养条件：在初始pH值5.0下进行液体发酵，培养温度33℃，通气量1.6min/L，搅拌转速250rpm下发酵70h，可获得最大酶活力的复合酶发酵液40.16U/mL。
制备得到的复合酶在30min内对柠檬苦素、橙皮苷、柚皮苷水解率分别达60％、49％、41％。
3、所述的塔宾曲霉在酶解苦味物质主要为柚皮苷和柠檬苦素的复合酶制剂的制备中的制备方法，所述方法包括：
在固体平板培养基中加入柚皮粉10.00g/L，种子培养基组分中加入柠檬皮粉10.00g/L，发酵培养基中加入柠檬皮粉10.00g/L；
培养基其他组分分别为：
固体培养基：MgSO4·7H2O 1.00g/L，KH2PO4 1.00g/L，(NH4)2SO4 1.50g/L，KCl0.50g/L，KNO3 1.50g/L，CaCl2 0.10g/L，酵母提取物2.00g/L，琼脂粉10.00g/L，自然pH。
种子培养基：MgSO4·7H2O 5.00g/L，K2HPO4 5.00g/L，KCl 5.00g/L，FeSO4·5H2O0.10g/L，自然pH，接种量10％。
发酵培养基中：MgSO4·7H2O 0.50g/L，KH2PO4 1.50g/L，K2HPO4 1.50g/L，(NH4)2SO44.00g/L，ZnSO4·7H2O 0.10g/L，CaCl2 0.10g/L，酵母提取物1.00g/L，豆粉2.00g/L，蛋白胨2.00g/L。
培养条件：在初始pH值5.0下进行液体发酵，培养温度34℃，通气量2.0min/L，搅拌转速250rpm，发酵至72h，可获得最大酶活力的复合酶发酵液40.10U/mL。
制备得到的复合酶在30min内对柠檬苦素、橙皮苷、柚皮苷水解率分别达49％、41％、52％。
将发酵液置于冷冻离心机中离心(15000rpm)30min,收集上清液，通过膜分离设备对酶液进行浓缩，直接制备成液体酶制剂，或者置于冷冻干燥机中制备成酶制剂冻干粉。
上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种塔宾曲霉，其特征在于：所述塔宾曲霉名称为塔宾曲霉UA13，Aspergillustubingensis UA13，于2022年06月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20222989，保藏地址为湖北，武汉，武汉大学。
2.一种如权利要求1所述的塔宾曲霉的应用，其特征在于：塔宾曲霉应用于发酵法制备柠檬苦素脱苦酶。
3.根据权利要求2所述的塔宾曲霉的应用，其特征在于：所述应用为在塔宾曲霉的发酵培养基中加入柠檬苦素或含有柠檬苦素的柠檬皮粉，柠檬苦素加入量为4.0-6.0mg/L；
柠檬皮粉的制备：新鲜柠檬皮去掉白色囊衣层，切片后烘干，再磨粉备用。
4.根据权利要求3所述的塔宾曲霉的应用，其特征在于：所述培养基包括发酵培养基，发酵培养基中：MgSO4·7H2O 0.40-0.60 g/L，KH2PO4 1.20-1.80 g/L，K2HPO4 1.20-1.80 g/L，(NH4)2SO4 3.50-4.50 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05-0.15 g/L，CaCl2 0.05-0.15 g/L，酵母提取物0.80-1.20g/L，豆粉1.50-2.50 g/L，蛋白胨 1.50-2.50 g/L，柠檬苦素4.00-5.00 mg/L，自然pH。
5.根据权利要求2所述的柠檬苦素用于诱导塔宾曲霉高产柠檬苦素脱苦酶，其特征在于：发酵培养基中：
MgSO4·7H2O 0.50 g/L，KH2PO4 1.50 g/L，K2HPO4 1.50 g/L，(NH4)2SO4 4.00 g/L，ZnSO4·7H2O 0.10 g/L，CaCl2 0.10 g/L，酵母提取物 1.00 g/L，豆粉 2.00 g/L，蛋白胨2.00 g/L，柠檬苦素4.00 mg/L。
6.权利要求1所述的塔宾曲霉在酶解苦味物质主要为柠檬苦素的复合酶制剂的制备中的应用，其特征在于，所述应用包括：
固体平板培养基：MgSO4·7H2O 0.80-1.20 g/L，KH2PO4 0.80-1.20 g/L，(NH4)2SO4 1.30-1.70 g/L，KCl 0.30-0.80 g/L，KNO3 1.20-1.70 g/L，CaCl2 0.05-0.15 g/L，酵母提取物 1.50-2.50 g/L，柠檬苦素0.50-1.50 mg/L，琼脂粉8.00-12.00 g/L，自然pH；
种子培养基：柠檬苦素3.50-4.50 mg/L，MgSO4·7H2O 4.00-6.00 g/L，K2HPO4 4.00-7.00 g/L，KCl 4.00-6.00 g/L，FeSO4·5H2O 0.05-0.15 g/L，自然pH；
发酵培养基中：MgSO4·7H2O 0.40-0.60 g/L，KH2PO4 1.20-1.80 g/L，K2HPO4 1.20-1.80g/L，(NH4)2SO4 3.50-4.50 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05-0.15 g/L，CaCl2 0.05-0.15 g/L，酵母提取物 0.80-1.20 g/L，豆粉 1.50-2.50 g/L，蛋白胨 1.50-2.50 g/L，柠檬苦素4.00-5.00 mg/L；
固体平板培养基、种子培养基和发酵培养基，依次扩大培养。
7.权利要求1所述的塔宾曲霉在酶解苦味物质主要为柚皮苷的复合酶制剂的制备中的应用，其特征在于，所述应用包括：
在固体平板培养基中加入柚皮粉8.00-12.00 g/L或柚皮苷4.00-6.00 g/L，种子培养基组分中加入柚皮粉8.00-12.00 g/L，发酵培养基中加入柚皮粉8.00-12.00 g/L或柚皮苷4.00-6.00 g/L；培养基其他组分分别为：
固体平板培养基：MgSO4·7H2O 0.80-1.20 g/L，KH2PO4 0.80-1.20 g/L，(NH4)2SO4 1.30-1.70 g/L，KCl 0.30-0.80 g/L，KNO3 1.20-1.70 g/L，CaCl2 0.05-0.15 g/L，酵母提取物 1.50-2.50 g/L，琼脂粉8.00-12.00 g/L，自然pH；
种子培养基： MgSO4·7H2O 4.00-6.00 g/L，K2HPO4 4.00-7.00 g/L，KCl 4.00-6.00 g/L，FeSO4·5H2O 0.05-0.15 g/L，自然pH；
发酵培养基中：MgSO4·7H2O 0.40-0.60 g/L，KH2PO4 1.20-1.80 g/L，K2HPO4 1.20-1.80g/L，(NH4)2SO4 3.50-4.5 0 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05-0.15 g/L，CaCl2 0.05-0.15 g/L，酵母提取物 0.80-1.20 g/L，豆粉 1.50-2.50 g/L，蛋白胨 1.50-2.50 g/L；
固体平板培养基、种子培养基和发酵培养基，依次扩大培养；
柚皮粉的制备：新鲜柚子皮去掉白色囊衣层，切片后烘干，再磨粉备用；
培养条件：在初始pH值5.0-6.0下进行液体发酵，培养温度30-35℃，通气量1.3-2.5min/L，搅拌转速250-300 rpm下发酵70-77 h，可获得最大酶活力的复合酶发酵液。
8.权利要求1所述的塔宾曲霉在酶解苦味物质主要为柠檬苦素类的复合酶制剂的制备中的应用，其特征在于，所述应用包括：
在固体平板培养基中加入柠檬皮粉8.00-12.00g/L或柠檬苦素4.00-6.00 g/L，种子培养基组分中加入柠檬皮粉8.00-12.00 g/L，发酵培养基中加入柠檬皮粉8.00-12.00 g/L或柠檬苦素4.00-6.00 g/L；
培养基其他组分分别为：
固体平板培养基：MgSO4·7H2O 0.80-1.20 g/L，KH2PO4 0.80-1.20 g/L，(NH4)2SO4 1.30-1.70 g/L，KCl 0.30-0.80 g/L，KNO3 1.20-1.70 g/L，CaCl2 0.05-0.15 g/L，酵母提取物 1.50-2.50 g/L，琼脂粉8.00-12.00 g/L，自然pH；
种子培养基： MgSO4·7H2O 4.00-6.00 g/L，K2HPO4 4.00-7.00 g/L，KCl 4.00-6.00 g/L，FeSO4·5H2O 0.05-0.15 g/L，自然pH；
发酵培养基中：MgSO4·7H2O 0.40-0.60 g/L，KH2PO4 1.20-1.80 g/L，K2HPO4 1.20-1.80g/L，(NH4)2SO4 3.50-4.50 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05-0.15 g/L，CaCl2 0.05-0.15 g/L，酵母提取物 0.80-1.20 g/L，豆粉 1.50-2.50 g/L，蛋白胨 1.50-2.50 g/L；
固体平板培养基、种子培养基和发酵培养基，依次扩大培养；
柠檬皮粉的制备：新鲜的柠檬皮切片后烘干，再磨粉备用；
培养条件：在初始pH值5.0-6.0下进行液体发酵，培养温度31-34℃，通气量1.3-1.8min/L，搅拌转速250-280 rpm下发酵70-76 h，可获得最大酶活力的复合酶发酵液。
9.权利要求1所述的塔宾曲霉在酶解苦味物质主要为柚皮苷和柠檬苦素的复合酶制剂的制备中的应用，其特征在于，所述应用包括：
在固体平板培养基中加入柚皮粉8.00-12.00 g/L或柚皮苷4.00-6.00 g/L，种子培养基组分中加入柠檬皮粉8.00-12.00 g/L，发酵培养基中加入柠檬皮粉8.00-12.00 g/L；
培养基其他组分分别为：
固体平板培养基：MgSO4·7H2O 0.80-1.20 g/L，KH2PO4 0.80-1.20 g/L，(NH4)2SO4 1.30-1.70 g/L，KCl 0.30-0.80 g/L，KNO3 1.20-1.70 g/L，CaCl2 0.05-0.15 g/L，酵母提取物 1.50-2.50 g/L，琼脂粉8.00-12.00 g/L，自然pH；
种子培养基： MgSO4·7H2O 4.00-6.00 g/L，K2HPO4 4.00-7.00 g/L，KCl 4.00-6.00 g/L，FeSO4·5H2O 0.05-0.15 g/L，自然pH；
发酵培养基中：MgSO4·7H2O 0.40-0.60 g/L，KH2PO4 1.20-1.80 g/L，K2HPO4 1.20-1.80g/L，(NH4)2SO4 3.50-4.50 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05-0.15 g/L，CaCl2 0.05-0.15 g/L，酵母提取物 0.80-1.20 g/L，豆粉 1.50-2.50 g/L，蛋白胨 1.50-2.50 g/L；
固体平板培养基、种子培养基和发酵培养基，依次扩大培养；
培养条件：培养条件：在初始pH值5.0-6.0下进行液体发酵，培养温度30-35 ℃，通气量1.3-1.8 min/L，搅拌转速250-300 rpm下发酵65-75 h，可获得最大酶活力的复合酶发酵液。
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