ES2942586T3 - Procedimiento de purificación eficiente de oligosacáridos neutros de leche humana (HMO) a partir de fermentación microbiana - Google Patents

Procedimiento de purificación eficiente de oligosacáridos neutros de leche humana (HMO) a partir de fermentación microbiana Download PDF

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Abstract

La presente solicitud divulga un proceso simple para la purificación de oligosacáridos neutros de leche humana (HMO) producidos por fermentación microbiana. El proceso utiliza una combinación de un tratamiento de intercambio iónico catiónico, un tratamiento de intercambio iónico aniónico y un paso de nanofiltración y/o electrodiálisis. lo que permite una purificación eficiente de grandes cantidades de HMO neutros de alta pureza. A diferencia de la purificación utilizada actualmente en la producción fermentativa de HMO neutros, el proceso presentado permite la provisión de HMO sin necesidad de una separación cromatográfica. Los HMO así purificados pueden obtenerse en forma sólida mediante secado por aspersión, como material cristalino o como concentrado filtrado estéril. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento de purificación eficiente de oligosacáridos neutros de leche humana (HMO) a partir de fermentación microbiana
La presente solicitud divulga un procedimiento simple de purificación de oligosacáridos neutros de leche humana (HMO) producidos por fermentación microbiana. El procedimiento usa una combinación de un tratamiento con intercambiador de iones catiónicos, un tratamiento con intercambiador de iones aniónicos y una etapa de nanofiltración y/o electrodiálisis, lo que permite la purificación eficiente de grandes cantidades de HMO neutros con alta pureza. A diferencia de la purificación usada actualmente en la producción fermentativa de HMO neutros, el procedimiento presentado permite la provisión de HMO sin necesidad de una separación cromatográfica. Los HMO así purificados pueden obtenerse en forma sólida mediante secado por pulverización, como material cristalino o como concentrado filtrado estéril. Los HMO proporcionados no contienen proteínas ni material recombinante procedente de las cepas microbianas recombinantes usadas y, de este modo, son muy apropiados para su uso en aplicaciones de alimentos, alimentos médicos y piensos (por ejemplo, alimentos para mascotas).
La leche humana representa una mezcla compleja de carbohidratos, grasas, proteínas, vitaminas, minerales y oligoelementos. La fracción más predominante, con diferencia, está representada por los carbohidratos, que pueden dividirse a su vez en lactosa y oligosacáridos más complejos. Mientras que la lactosa se usa como fuente de energía, los oligosacáridos complejos no son metabolizados por el lactante. La fracción de oligosacáridos complejos representa hasta 1/10 de la fracción total de carbohidratos y consiste probablemente en más de 150 oligosacáridos diferentes. La aparición y concentración de estos oligosacáridos complejos son específicos de los seres humanos y, de este modo, no se pueden encontrar en grandes cantidades en la leche de otros mamíferos, como por ejemplo animales lecheros domésticos.
La existencia de estos oligosacáridos complejos en la leche humana ya se conoce desde hace mucho tiempo y las funciones fisiológicas de estos oligosacáridos fueron objeto de investigación médica durante muchas décadas (Gura, T. (2014) Nature's first functional food. Science 345(6198) 747-749). Para algunos de los oligosacáridos de la leche humana más abundantes, ya se han identificado funciones específicas (Bode, L. (2012) Human milk oligosaccharides: every baby needs a sugar mama. Glycobiology 22(9), 1147-1162.; Bode L, Jantscher-Krenn E (2012) Structurefunction relationships of human milk oligosaccharides. Adv Nutr 3(3) 383S-391S; Morrow AL, Ruiz-Palacios GM, Altaye M, Jiang X, Guerrero ML, Meinzen-Derr JK, Farkas T, Chaturvedi P, Pickering LK, Newburg DS (2004) Human milk oligosaccharides are associated with protection against diarrhea in breast-fed infants. J Pediatr 145(3) 297-303).
El suministro limitado y las dificultades para obtener fracciones puras de oligosacáridos de leche humana individuales conducen al desarrollo de rutas químicas para algunas de estas moléculas complejas. Sin embargo, la síntesis de oligosacáridos de la leche humana mediante síntesis química, síntesis enzimática o fermentación demostró ser un desafío. Hasta hoy no es posible suministrar cantidades a gran escala ni calidades suficientes para aplicaciones alimentarias. En este sentido, particularmente las rutas químicas de síntesis de los oligosacáridos de la leche humana (por ejemplo, 2'-fucosillactosa; véase el documento WO 2010/115935 A1) implican varios productos químicos nocivos, que imponen el riesgo de contaminar el producto final.
Debido a los desafíos implicados en la síntesis química de los oligosacáridos de la leche humana, se desarrollaron varios métodos enzimáticos y enfoques (Miyazaki et al., (2010) Methods in Enzymol. 480, 511-524; Murata et al., (1999) Glycoconj. J. 16, 189-195; Baumgartner, F. et al., (2013) Microb. Cell Fact. 12, 40; Lee et al., (2012) Microb. Cell Fact. 11,48; US 7,521,212 B1 or Albermann et al., (2001) Carbohydr. Res. 334(2) p 97-103). Sin embargo, estos métodos producen mezclas complejas de oligosacáridos, es decir, el producto deseado está contaminado con material de partida tal como lactosa, productos intermedios biosintéticos y sustratos tales como monosacáridos y polipéptidos individuales, etc.
Los procedimientos del estado de la técnica para purificar productos de oligosacáridos individuales a partir de estas mezclas complejas son técnicamente complejos y también antieconómicos para aplicaciones alimentarias. Para la purificación de los disacáridos lactosa o sacarosa a partir de mezclas complejas tales como suero o melaza, se han desarrollado procedimientos a escala industrial que implican múltiples cristalizaciones. La desventaja de dichos métodos es que son elaborados y solo conducen a bajos rendimientos.
Para la purificación de oligosacáridos complejos de la fermentación microbiana, tal como determinados oligosacáridos de la leche humana, la cromatografía de filtración en gel es el método elegido hasta ahora. La desventaja de la cromatografía de filtración en gel es que no se puede ampliar de manera eficiente y no es apropiada para la operación continua. De este modo, la cromatografía de filtración en gel no es económica y hace que sea imposible proporcionar determinados oligosacáridos de la leche humana, como 2'-fucosillactosa o lactosa-A/-tetraosa: en cantidades y calidad razonables para usarlas en alimentos humanos u otras aplicaciones, tales como alimentos para animales (por ejemplo, alimentos para mascotas). La aplicación como pienso para animales o alimento para mascotas es interesante porque también otros mamíferos contienen oligosacáridos complejos neutros iguales o similares en su leche como humanos (por ejemplo, la 2'-fucosillactosa también se encuentra en la leche de perros, cerdos, chimpancés) (Castanys-Munzo, E., Martin, J.M & Prieto, P.A. (2013) 2'-fucosyllactose: an abundant, genetically determined soluble glycan present in human milk. Nutr. Rev. 71(12) 773-789).
Otro problema lo presenta el uso de cepas recombinantes (cepas bacterianas o de levadura recombinantes) en la fermentación microbiana, lo que da como resultado la contaminación del producto de fermentación con material recombinante. Sin embargo, los reguladores y los consumidores no aceptan la contaminación con ADN o proteínas recombinantes en la actualidad. Los límites de detección en particular para las moléculas de ADN recombinante son muy bajos. En el caso de que se use la detección basada en qPCR, que actualmente se considera el estándar de oro para la detección, se puede detectar incluso una única molécula de ADN. Además, las proteínas plantean el riesgo de reacciones alérgicas y, por lo tanto, deben eliminarse eficazmente del producto de oligosacárido deseado.
La electrodiálisis (ED) representa una técnica que combina diálisis y electrólisis y puede usarse para la separación o concentración de iones en soluciones en función de su electromigración selectiva a través de membranas semipermeables. Las primeras aplicaciones industriales de la electrodiálisis se remontan a principios de 1960 con la desmineralización del suero de queso para su uso en fórmulas infantiles. Aplicaciones desarrolladas adicionales de la electrodiálisis incluyen el ajuste del pH de bebidas tales como vinos, mosto de uva, jugo de manzana y jugo de naranja.
La desalinización de agua salobre para la producción de agua potable y la desmineralización del suero de leche para la producción de alimentos infantiles representan la mayor área de aplicación en la actualidad.
El principio básico de la electrodiálisis consiste en una celda electrolítica compuesta por un par de electrodos sumergidos en un electrolito para la conducción de iones conectados a un generador de corriente continua. El electrodo conectado al polo positivo del generador de corriente continua es el ánodo, y el electrodo conectado al polo negativo se llama cátodo. Luego la solución de electrolito apoya el flujo de corriente, que resulta del movimiento de iones de carga negativa y positiva hacia el ánodo y el cátodo, respectivamente. Las membranas empleadas en la electrodiálisis son esencialmente láminas de resinas de intercambio iónico porosas, que poseen grupos de carga negativa o positiva y, por lo tanto, se denominan membrana catiónica o aniónica, respectivamente. Las membranas del intercambiador de iones suelen estar hechas de poliestireno que lleva un grupo funcional apropiado (tal como ácido sulfónico o un grupo de amonio cuaternario para membranas catiónicas o aniónicas, respectivamente) reticulado con divinilbenceno. Como electrolito, se puede emplear cloruro de sodio o acetato de sodio, propionato de sodio, etc. Luego, la pila de electrodiálisis se ensambla de tal manera que las membranas aniónica y catiónica estén paralelas, como en un filtro prensa entre dos bloques de electrodos, de modo que la corriente que experimenta el agotamiento de iones esté bien separada de la corriente que experimenta el enriquecimiento de iones (las dos soluciones también se denominan como diluido (sufriendo de agotamiento de iones) y concentrado (sufriendo de enriquecimiento de iones). El corazón del procedimiento de electrodiálisis es la pila de membranas, que consta de varias membranas de intercambio de aniones y cationes separadas por espaciadores e instaladas entre dos electrodos. Al aplicar una corriente eléctrica directa, los aniones y cationes migrarán a través de las membranas hacia los electrodos generando una corriente diluida (desalada) y concentrada.
Generalmente, el tamaño de poro de las membranas empleadas es bastante pequeño para evitar la difusión del producto del diluido a la corriente concentrada, impulsada por las diferencias de concentración a menudo altas entre las dos corrientes. Después de la separación de la biomasa, las proteínas y, en particular, las moléculas de ADN recombinante (en el tamaño de genomas completos) deben eliminarse cuantitativamente del producto deseado. Si fuera posible, la electrodiálisis de moléculas tan grandes (en comparación con el tamaño molecular de los HMO) sería bastante larga y seguramente iría acompañada de pérdidas significativas del producto deseado del diluido al concentrado.
La diafiltración es un procedimiento que implica la adición de agua dulce a una solución para "lavar" o eliminar los componentes permeables de la membrana. De este modo, la diafiltración puede usarse para separar componentes sobre la base de su tamaño molecular usando membranas apropiadas, en las que una o más especies se retienen eficazmente y otras especies son permeables a la membrana. En particular, la diafiltración mediante el uso de una membrana de nanofiltración es eficaz para la separación de compuestos de bajo peso molecular de las sales. En general, las membranas de nanofiltración poseen un límite de peso molecular en el intervalo de 150 a 300 Dalton. Hoy en día, la nanofiltración (NF) se usa ampliamente en la industria láctea para la concentración y desmineralización del suero. La nanofiltración ya se ha empleado para el enriquecimiento de una fracción de oligosacáridos de leche humana a partir de leche humana. En este enfoque, la nanofiltración se ha usado en combinación con la degradación enzimática de la lactosa para separar la fracción HMO de la lactosa de la leche (Sarney D.B, Hale, C., Frankel, G & Vulfson, E.N. (2000) A novel approach to the recovery of biological active oligosaccharides from milk using a combination of enzymatic treatment and nanofiltration. Biotechnol. Bioeng 69, 461-467.
En el procedimiento desarrollado para la purificación eficiente de oligosacáridos de leche humana de calidad alimentaria a partir de la fermentación microbiana, se emplea la nanofiltración para concentrar el producto deseado y también para eliminar las sales permeables a la membrana.
El documento EP 2 479 263 A1 divulga un método de producción de 2'-fucosillactosa usando una alfa-1,2-fucosiltransferasa de E. coli.
El documento WO 2012/112777 A2 divulga un procedimiento de purificación de 2'-fucosillactosa en el que el sobrenadante de un caldo de fermentación se aplica a un tratamiento con carbón grueso, una etapa de evaporación para eliminar los disolventes orgánicos, una etapa de cromatografía ultrarrápida y una etapa de evaporación del disolvente por liofilización, en el que en un caso en el que el caldo de fermentación se origina a partir de ciclos de fermentación más largos de lo normal, se realizan adicionalmente en el procedimiento una etapa de tratamiento con intercambiador de iones catiónicos y una etapa de tratamiento de intercambio aniónico.
A partir de la técnica anterior, el problema técnico es la provisión de un procedimiento novedoso para proporcionar h Mo neutros en altas cantidades, alta pureza y excelentes rendimientos.
El problema técnico se resuelve mediante el procedimiento según la reivindicación 1. Las reivindicaciones dependientes muestran realizaciones ventajosas. El problema técnico también se resuelve mediante el procedimiento según el aspecto 1, el oligosacárido de la leche humana (HMO) según el aspecto 15 y el uso del HMO según el aspecto 19. Los aspectos dependientes muestran realizaciones ventajosas.
La presente invención proporciona un procedimiento de purificación de oligosacáridos neutros de leche humana (HMO) en forma discontinua o en forma continua a partir de un caldo de fermentación obtenido por fermentación microbiana en el que se proporciona una solución purificada que comprende un HMO neutro con una pureza de > 80 %. El caldo de fermentación contiene HMO neutro, biomasa, componentes del medio y contaminantes. La pureza del HMO neutro en el caldo de fermentación es < 80 %.
Durante el procedimiento, el caldo de fermentación se aplica a las siguientes etapas de purificación:
i) Separación de la biomasa del caldo de fermentación,
ii) Tratamiento con intercambiador de iones catiónicos para la eliminación de material con carga positiva,
iii) Tratamiento con intercambiador de iones aniónicos para la eliminación de material con carga negativa,
iv) Etapa de nanofiltración (que comprende o consiste en concentración y/o diafiltración del HMO neutro) y/o etapa de electrodiálisis (especialmente para la eliminación de sales y otros compuestos de bajo peso molecular).
Los contaminantes presentes en el caldo de fermentación libre de células son, por ejemplo, otros oligosacáridos además del HMO neutro deseado, como sales monovalentes y divalentes, aminoácidos, polipéptidos, proteínas, ácidos orgánicos, ácidos nucleicos, etc. El HMO neutro deseado se puede obtener a una pureza de > 80 % en la solución purificada.
El solicitante ha descubierto que con el procedimiento de purificación inventivo, se puede lograr una purificación eficiente de HMO neutrales a partir de la fermentación microbiana, lo que entrega el HMO con una pureza apropiada para aplicaciones de alimentos y piensos. Adicionalmente, el procedimiento es muy rentable porque no se necesita ninguna etapa de separación cromatográfica. Adicionalmente, se ha descubierto que la pureza de > 80 % se logra tanto si se realiza una etapa de electrodiálisis o una etapa de nanofiltración en la etapa iv) como si ambos pasos se realizan en sucesión.
Una ventaja del procedimiento según el presente es que los HMO neutros deseados se obtienen libres de ADN y proteínas de la cepa de fermentación microbiana recombinante usada. Especialmente, la implementación de un tratamiento con intercambiador de iones catiónicos (etapa ii) permite la eliminación de material con carga positiva como por ejemplo, proteínas con carga positiva. En consecuencia, el método de la invención proporciona un HMO que comprende menos material contaminante con carga positiva en comparación con los esquemas de purificación convencionales conocidos en la técnica anterior que no implementan un tratamiento de intercambio catiónico. Se descubrió además que después de pasar el caldo de fermentación separado de la biomasa (preferiblemente por ultrafiltración) sobre un intercambiador de iones catiónicos (en forma de protones), la solución obtenida era estable y podía almacenarse a temperatura ambiente o en refrigeración durante varias semanas. Adicionalmente, el HMO neutro obtenido está libre de material recombinante, a juzgar por PCR cuantitativa con hasta 50 ciclos de amplificación. Además, el producto obtenido del procedimiento según la invención se caracteriza por bajas cantidades o ausencia de proteínas.
Adicionalmente, la purificación de HMO neutro según la invención es muy eficaz con rendimientos aún desconocidos de >70 % (opcionalmente > 75 %) del HMO purificado (determinado a partir del medio de fermentación libre de células para el concentrado de HMO).
De este modo, se proporciona un procedimiento híbrido que comprende las etapas de separación de biomasa, intercambiador de iones y una etapa de nanofiltración y/o electrodiálisis, y preferiblemente que además comprende un tratamiento con carbón activado, para la provisión eficiente de HMO neutros de alta pureza libres de material genético recombinante, las endotoxinas y las proteínas forman procedimientos de fermentación usando cepas de fermentación recombinantes. Con el procedimiento según la invención, se pueden proporcionar grandes cantidades de oligosacáridos de leche humana de alta calidad de una manera muy conveniente y económica.
El HMO neutro se puede purificar a partir de un caldo de fermentación obtenido por fermentación microbiana usando un microorganismo recombinante, preferiblemente bacterias o levaduras, más preferiblemente un microorganismo recombinante cultivado en un medio químicamente definido. Opcionalmente, la biomasa separada en la etapa i) se recicla a la fermentación microbiana.
En otra realización preferida del procedimiento según la invención, la pureza del HMO neutro en el caldo de fermentación es <70 %, <60 %, <50 %, <40 %, <30 %, <20 %, <10 % o <5 % y/o la solución purificada contiene el HMO neutro con una pureza de >85 %, preferiblemente de >90 %.
En otra realización preferida del procedimiento según la invención, el rendimiento del HMO neutro es > 70 % (opcionalmente > 75 %) y/o la solución purificada está libre de ADN, proteínas y/o material genético recombinante.
En otra realización preferida del procedimiento según la invención, el HMO neutro se selecciona del grupo que consiste en 2'-fucosillactosa, 3-fucosillactosa, 2',3-difucosillactosa, lacto-W-triosa II, lacto-W-tetraosa, lacto-W-neotetraosa, lacto-W-fucopentaosa I, lacto-W-neofucopentaosa, lacto-W-fucopentaosa II, lacto-W-fucopentaosa III, lacto-W-fucopentaosa V, lacto-W-neofucopentaosa V, lacto-W-difucohexaosa I, lacto-W-difucohexaosa II, 6 '-galactosillactosa, 3'-galactosillactosa, lacto-W-hexaosa y lacto-W-neohexosa.
En una realización especialmente preferida del procedimiento según la invención, el HMO neutro es 2'-fucosillactosa.
En otra realización preferida del procedimiento según la invención, la separación de la biomasa del caldo de fermentación se logra mediante
a) ultrafiltración, preferiblemente por separación de biomasa y materiales > 500 kDa, más preferiblemente > 150 kDa; y/o
b) filtración a través de un filtro de flujo cruzado, preferiblemente con un corte < 100 kDa, más preferiblemente con un corte < 10 kDa, aún más preferiblemente con un corte < 5 kDa;
en el que la etapa a) se implementa preferiblemente antes de la etapa b).
En otra realización preferida del procedimiento según la invención, al menos una de las etapas de purificación ii) a v) del procedimiento de la invención se repite al menos una vez durante el procedimiento.
En otra realización preferida del procedimiento según la invención, el caldo de fermentación se aplica al menos una vez a un tratamiento con carbón activado después de al menos una de las etapas de purificación i) a iv) para la adsorción de material colorante y oligosacáridos más grandes que el carbón activado. Al aplicar el caldo de fermentación a esta etapa de purificación adicional, el material colorante y los oligosacáridos más grandes pueden eliminarse del caldo de fermentación.
El procedimiento de la invención puede caracterizarse porque
a) después de al menos una de las etapas de purificación i) a iv); o
b) después de al menos un tratamiento con carbón activado para la adsorción del material colorante y oligosacáridos más grandes que el carbón activado; o
c) antes de una etapa de concentración que se implementa después de al menos una de las etapas de purificación i) a iv);
la solución que comprende el oligosacárido neutro de la leche humana se diafiltra y/o concentra. Preferiblemente, dicha solución se diafiltra y/o concentra con una membrana de nanofiltración, más preferiblemente con una membrana de nanofiltración que tiene un límite de exclusión de tamaño de < 20 A. Lo más preferiblemente, la solución se diafiltra hasta que se alcanza una conductividad de <15 mS/cm, preferiblemente <10 mS/cm, más preferiblemente <5 mS/cm.
Se encontró que la diafiltración usando nanofiltración era eficiente como pretratamiento para eliminar cantidades significativas de contaminantes antes de un tratamiento de electrodiálisis de la solución que contenía HMO. Además, también se descubrió que la nanofiltración es eficaz en la eliminación de contaminantes de bajo peso molecular después de una etapa de ultrafiltración, en la que dicha eliminación es beneficiosa para concentrar y desmineralizar la solución de HMO antes del tratamiento con intercambiador de iones. El uso de membranas de nanofiltración para concentración y diafiltración en la purificación de oligosacáridos de la leche humana da como resultado un menor coste de energía y procesamiento, así como una mejor calidad del producto, debido a la reducción de la exposición térmica, lo que conduce a reacciones de Maillard y reacciones aldólicas reducidas.
En una etapa antes de la etapa i), se puede realizar un tratamiento con glucosidasa, preferiblemente un tratamiento con p-glucosidasa, con el caldo de fermentación, en la que dicho tratamiento se realiza preferiblemente al
a) agregar una cepa de microorganismos capaz de expresar una o más enzimas glicosidasas que son apropiadas para la degradación de productos intermedios, sustratos y/o productos secundarios de oligosacáridos no deseados; y/o
b) usar una cepa de fermentación que exprese una o más enzima(s) glicosidasa(s), preferiblemente agregando un inductor al caldo de fermentación y/o cambiando la temperatura del caldo de fermentación; y/o
c) agregar una o más glicosidasa(s), preferiblemente al menos una p-glucosidasa, al caldo de fermentación como enzima cruda o como enzima purificada.
En otra realización preferida del procedimiento según la invención, el caldo de fermentación se concentra después de al menos una de las etapas de purificación i) a iv), preferiblemente después de la etapa de purificación iv), usando evaporación al vacío u ósmosis inversa o nanofiltración (por ejemplo, nanofiltración con una membrana de nanofiltración que tiene un límite de exclusión de tamaño de <20 A)
a) a una concentración de > 100 g/L, preferiblemente > 200 g/L, más preferiblemente > 300 g/L; y/o
b) a una temperatura de < 80 °C, preferiblemente < 50 °C, más preferiblemente de 20 °C a 50 °C, aún más preferiblemente de 30 °C a 45 °C, lo más preferiblemente de 35 °C a 45 °C (específicamente relevante para evaporación al vacío u ósmosis inversa); y/o
c) a una temperatura de < 80 °C, preferiblemente < 50 °C, más preferiblemente de 4 °C a 40 °C (específicamente relevante para la nanofiltración).
En otra realización preferida del procedimiento según la invención, la solución purificada se esteriliza por filtración y/o se somete a eliminación de endotoxinas, preferiblemente por filtración de la solución purificada a través de un filtro de 3 kDa.
En otra realización preferida del procedimiento según la invención, la solución que contiene HMO neutro se somete a electrodiálisis para eliminar más materiales cargados tales como sales monovalentes y divalentes.
En otra realización preferida del procedimiento según la invención, la solución purificada se concentra a una concentración > 1.5 M y se enfría a una temperatura < 25°, más preferiblemente < 8 °C, para obtener material cristalino del HMO neutro.
En otra realización preferida del procedimiento según la invención, la solución purificada se seca por pulverización, particularmente se seca por pulverización a una concentración del HMO neutro de 20-60 (p/v), preferiblemente 30-50 (p/v) , más preferiblemente 35-45 (p/v), una temperatura de boquilla de 110-150 °C, preferiblemente 120-140 °C, más preferiblemente 125-135 °C y/o una temperatura de salida de 60-80 °C, preferiblemente 65-70 °C.
Adicionalmente, la presente invención incluye un oligosacárido neutro de leche humana (HMO) que se puede producir con el procedimiento según la invención.
En una realización preferida, el HMO está presente en un concentrado filtrado estéril, por ejemplo, un concentrado estéril que contiene un producto HMO neutro con una concentración de > 30 % (p/v), más preferiblemente > 40 % (p/v).
En otra realización preferida, el HMO se seca por pulverización o se cristaliza.
En otra realización preferida, el HMO se selecciona del grupo que consiste en 2'-fucosillactosa, 3-fucosillactosa, 2',3-difucosillactosa, lacto-N-triosa II, lacto-N-tetraosa, lacto-N-neotetraosa, lacto-N-fucopentaosa I, lacto-N-neofucopentaosa, lacto-N-fucopentaosa II, lacto-N-fucopentaosa III, lacto-N-fucopentaosa V, lacto-N-neofucopentaosa V, lacto-N-difucohexaosa I, lacto-N-difucohexaosa II, 6 '-galactosillactosa, 3'-galactosillactosa, lacto-N-hexaosa y lacto-N-neohexaosa.
En una realización particularmente preferida, el HMO es 2'-fucosillactosa.
En otra realización preferida, la HMO tiene
a) una conductividad inferior a 1 mSi/cm en una solución de 300 g/l;
b) está libre de material de ADN recombinante, opcionalmente libre de cualquier ADN; y/o
c) está libre de proteínas derivadas del microorganismo recombinante, opcionalmente libre de cualquier proteína. Otra realización preferida está dirigida a un HMO para su uso en medicina, preferiblemente para su uso en profilaxis o terapia de un trastorno gastrointestinal.
Adicionalmente, la presente invención incluye el uso de un HMO según la invención como aditivo en alimentos, preferiblemente como aditivo en alimentos para humanos y/o alimentos para mascotas, más preferiblemente como aditivo en alimentos para bebés humanos.
El objeto según la solicitud se pretende explicar con más detalle con referencia a las siguientes figuras y ejemplos sin pretender restringir dicho objeto a las realizaciones especiales.
La figura 1 muestra un esquema de una realización preferente del procedimiento según la presente invención para la purificación de 2 '-fucosillactosa a partir de un caldo de fermentación que comprende las etapas: ultrafiltración, tratamiento con intercambiador de iones catiónicos y aniónicos, tratamiento con carbón activado, nanofiltración, electrodiálisis y concentración
La figura 2 muestra un esquema de otra realización preferida del procedimiento según la presente invención para la purificación de 2 '-fucosillactosa a partir de un caldo de fermentación que comprende las etapas: ultrafiltración, nanofiltración, tratamiento con intercambiador de iones catiónicos y aniónicos, tratamiento con carbón activado, electrodiálisis y concentración
La figura 3 muestra un esquema de otra realización preferida del procedimiento según la presente invención para la purificación de 2 '-fucosillactosa a partir de un caldo de fermentación que comprende las etapas: ultrafiltración, tratamiento con intercambiador de iones catiónicos y aniónicos, nanofiltración, tratamiento con carbón activado, electrodiálisis y concentración
Ejemplo 1: Purificación de 2'-fucosillactosa a partir de la fermentación usando una cepa de producción microbiana recombinante I.
Una fermentación discontinua de alimentación de 2'-fucosillactosa que emplea una cepa de E. coli que sintetiza 2'-fucosillactosa recombinante (E. coli BL21(DE3) AlacZ), que contiene una 2'-fuosiltransferasa de integración genómica, codificada por el gen wbgL (véase el documento EP 11 1151 571.4), y tener una copia adicional de E. coli lacY, manB, manC, gmd y fcl todo bajo el control de un fuerte promotor de tetraciclina constitutivo, que contiene un operón gal funcional que comprende los genes galM, galK, galT y galE, se cultivó en un medio salino definido. El medio salino definido comprendía 7 g de I-1 NH4H3 PO4, 7 g de I-1 K2 HPO4, 2 g de I-1 KOH, 0.37g I-1 de ácido cítrico, 1 ml I-1 de antiespumante (Struktol J673, Schill Seilacher), CaCh 1 mM, MgSO44 mM, oligoelementos y 2 % de glicerol como fuente de carbono.
Los oligoelementos consistieron en 0.101 g I-1 de ácido nitrilotriacético, pH 6.5, 0.056 g I-1 de citrato férrico de amonio, 0.01 g I-1 de MnCh * 4 H2O, 0.002 g I-1 de CoCh * 6 H2O, 0.001 g I-1 de CuCh * 2 H2O, 0.002 g I-1 de ácido bórico, 0.009 g I-1 de ZnSO4 * 7 H2O, 0.001 g I-1 de Na2MoO4 * 2 H2O, 0.002 g I-1 de Na2SeO3 , 0.002 g l-1 NiSO4 * 6 H2o
El glicerol alimentado consistió en 800 g I-1 de glicerol, 2.64 g I-1 de MgSO4 y solución de 4 ml I-1 de oligoelementos. Para la formación de 2'-fucosillactosa, se empleó una alimentación de lactosa de 216 g I-1. El pH se controló usando una solución de amoníaco (25 % v/v). La fermentación discontinua de alimentación se cultivó a 30 °C bajo aireación y agitación constantes durante 90 horas. A las 90 horas del inicio de la fermentación, la mayor parte de la lactosa agregada se convirtió en 2'-fucosillactosa. Para eliminar la lactosa todavía presente en el sobrenadante de la fermentación, se agregó una segunda cepa bacteriana al recipiente de fermentación 90 horas después del inicio de la fermentación.
La segunda cepa bacteriana agregada era genéticamente idéntica a la primera cepa bacteriana empleada, difiriendo, sin embargo, únicamente en la expresión de una beta-galactosidasa integrada en el genoma. La incubación de la cepa bacteriana secundaria agregada dio como resultado la desaparición de la lactosa residual en 5 horas. Se agregaron aproximadamente 10 ml de cultivo iniciador de la segunda cepa bacteriana que expresa beta-galactosidasa por 1 litro de caldo de fermentación.
A continuación, la biomasa se separó del medio de fermentación mediante ultrafiltración, usando un filtro de flujo cruzado con un corte de 10 kDa (Microdyn Nardir).
Se obtuvo aproximadamente 1 m3 de medio de fermentación libre de células que contenía 42 g/l de 2'-fucosillactosa. A continuación, el medio de fermentación libre de células se pasó por un intercambiador de iones catiónicos fuerte (Lewatit 56368 A (Lanxess) en forma de H+ , el tamaño del volumen del lecho del intercambiador de iones fue de 100 l), con el fin de eliminar los contaminantes cargados positivamente. A continuación, la solución obtenida se ajustó a pH 7 mediante la adición de una solución de hidróxido de sodio 2 M.
A continuación, la solución se pasó (sin demora) por una columna de intercambiador de iones aniónicos (el volumen del lecho del intercambiador de iones era de 100 l). El intercambiador de iones aniónicos fuerte usado Lewatit 52568 (Lanxess) estaba en forma de cloruro (Cl- ). La solución obtenida se neutralizó nuevamente a pH 7. A continuación, la solución obtenida de este modo se diafiltró usando una membrana de nanofiltración Alfa-Laval NF99HF y seis volúmenes de agua desionizada estéril. La solución se concentró aún más usando la membrana de nanofiltración en la que se obtuvo una solución de 2'-fucosillactosa de 200 g/l y una conductividad de 7 mS/cm.
A continuación, la solución concentrada de 2'-fucosillactosa se trató con carbón activado para eliminar el material que daba color, tal como los productos de la reacción de Maillard y los productos de la reacción aldólica. Como carbón activado se usaron 20 g de Norit GAC EN por litro de solución concentrada de 2'-fucosillactosa, dando una solución significativamente decolorada.
A continuación, la solución concentrada de 2'-fucosillactosa obtenida de este modo se electrodializó a 0.3 mS/cm usando un aparato de electrodiálisis PC-Cell BED 1-3 (PC-Cell, Heusweiler, Alemania) equipado con una pila de membranas PC-Cell E200.
Dicha pila contenía las siguientes membranas: membrana de intercambio catiónico CEM: PC SK y la membrana de intercambio aniónico AEM:PcAcid60 que tiene un límite de exclusión de tamaño de 60 Da. Se usó una solución de ácido sulfámico (ácido amidosulfónico) 0.025 M como electrolito en el procedimiento de ED.
A continuación, la solución obtenida se concentró al vacío a 40 °C para obtener una solución de 2'-fucosillactosa al 45 %. Luego, la solución concentrada se trató nuevamente con intercambiadores de iones, Lewatit 56368 A (Lanxess) en forma de Na+ (el volumen del lecho del intercambiador de iones usado fue de 10 l) y después de la neutralización con el intercambiador de iones aniónicos Lewatit 5 2568 (Lanxess) en forma de Cl- (el volumen del lecho del intercambiador de iones empleado fue de 10 l).
A continuación, la solución de 2'-fucosillactosa obtenida se trató con carbón activado (Norit DX1 Ultra). Para 1 l de una solución de 2'-fucosillactosa al 45 % se emplearon 30 g de carbón activo.
A continuación, la solución se sometió de nuevo a electrodiálisis hasta obtener una conductividad inferior a 0.3 mSi/cm. Posteriormente, la solución se sometió a filtración estéril pasando la solución a través de un filtro de 3 kDa (módulo de fibra hueca de ultrafiltración Pall Microza SEP-2013, Pall Corporation, Dreieich).
A continuación, parte de la solución de 2'-fucosillactosa obtenida se secó por pulverización para su análisis.
Para el registro de espectros de RMN, el producto secado por pulverización se disolvió en sulfóxido de hexadeuterodimetilo (DMSO-d6). Para el análisis de protones y 13C se observaron los siguientes desplazamientos químicos característicos:
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 86.63 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 6.28 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.19 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.01 (d, J = 2.2, 2H), 4.92 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.89 (dd, J = 4.6, 1.3 Hz, 2H), 4.78 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 4.74 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 4.63 (m, 6H), 4.53 (t, d, J = 5.5, 1H), 4.46 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 4.44 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.38 -4.26 (m, 5H), 4.23 (d, J = 0.9, 1H), 4.05 (d, J = 0.9, 1H), 4.00 (quin, J = 3.3, 1H), 3.68 - 3.60 (m, 7H), 3.59 - 3.50 (m, 13H), 3.50 -3.37 (m, 6H), 3.24 (dt, J = 8.8, 2.2 Hz, 1H), 3.14 (m, 2H), 2.96 (td, J = 8.4, 4.7 Hz, 1H), 1.04 (d, J = 6.1 Hz, 3H), 1.03 (d, J = 6.1 Hz, 3H).
13C RMN (126 MHz, DMSO-d6) 8 100.99, 100.85, 100.35, 100.25, 96.59, 92.02, 78.13, 77.78, 77.16, 77.01, 75.27 75.05, 74.67, 73.70, 72.33, 71.62, 71.56, 70.91,69.90, 69.64, 68.75, 68.16,66.33, 60.17, 59.82, 59.67, 16.37, 16.36. Se encontró que los desplazamientos químicos eran consistentes con la estructura de 2'-fucosillactosa.
Con este protocolo se pudo obtener un concentrado de 2'-fucosillactosa al 45 % con una pureza del 94.5 % (determinada por análisis HPLC). Los principales contaminantes fueron 3'-fucosillactosa (1.8 %), difucosillactosa (2.9 %) y lactosa (0.3 %).
El rendimiento de la purificación fue aproximadamente del 70 %.
Es importante destacar que no se pudo determinar ningún material recombinante en 10 g de material congelado usando 50 ciclos de qPCR. La cantidad de proteína del material obtenido se determinó como < 50 pg/g de material liofilizado usando un ensayo nano-Bradford (Roth, Karlsruhe, Alemania). La cantidad total de ceniza se determinó con 0.19 %. La concentración de metales pesados (arsénico, cadmio, plomo y mercurio) estuvo por debajo de 0.1 pg/g de material. Se determinó que los niveles de endotoxina eran < 0.005 EU/ml de concentrado de 2'-fucosillactosa.
Ejemplo 2: Purificación de 2'-fucosillactosa a partir de la fermentación usando una cepa de producción microbiana recombinante II.
Un m3 de la fermentación microbiana que comprende 2'-fucosillactosa a una concentración de 47 g/L se filtró a través de un filtro de flujo cruzado con un corte de 100 kDa (Microdyn Nadir) para obtener un medio de fermentación libre de células.
Como medio de fermentación se empleó el siguiente medio: Componentes principales del medio: 30 g/l de glicerol, 7 g/l de NH4H2 PO4, 7 g/l de K2 HPO4, 0.3 g/l de citrato, 2 g/l de KOH, 2 g/l de MgSO4-7H2O; oligoelementos: 20 mg/l de CaCl2 -6H2O, 101 mg/l de ácido nitrilotriacético, 56 mg/l de citrato férrico amónico, 9.8 mg/l de MnCh ^ ^ O, 1.6 mg/l de CoCl2 -6H2O, 1 mg/l de CuCh ^ ^ O, 1.6 mg/l de H3 BO3 , 9 mg/l de ZnSO4-7H2O, 1.2 mg/l de Na2MoO4 -2H2O, 1.2 mg/l de Na2SeO3 ; sustancias alimenticias: glicerol y lactosa.
A continuación, el medio de fermentación libre de células se pasó por un intercambiador de iones catiónicos (Lewatit 5 6368 A (Lanxess) en forma de H+ (el volumen del lecho del intercambiador de iones era de 100 l) para eliminar los contaminantes cargados positivamente. A continuación, la solución obtenida se ajustó a pH 7 mediante la adición de una solución de hidróxido de sodio 2 M. A continuación, la solución se pasó sin demora por una columna de intercambiador de iones aniónicos (el volumen del lecho del intercambiador de iones usado fue de 100 l) que comprendía el intercambiador de iones aniónicos fuerte Lewatit S 2568 (Lanxess) en forma de cloruro (Cl-). La solución obtenida se neutralizó nuevamente a pH 7. A continuación, la solución así obtenida se diafiltró (usando 10 volúmenes de agua desionizada estéril) y se concentró usando una membrana de nanofiltración (Alfa-Laval NF99HF) para obtener una solución de 2'-fucosillactosa de 200 g/l y una conductividad de aprox. 7 mSi/cm.
A continuación, la solución concentrada de 2'-fucosillactosa se trató con carbón activado, usando 20 g de Norit GAC EN por litro de solución concentrada de 2'-fucosillactosa. A la solución de 2'-fucosillactosa filtrada se le agregaron 40 g/l de carbón activado Norit DX1 Ultra. A continuación, la solución se expuso al carbón activado a 4 °C, durante aproximadamente 18 h. Después de 18 h, el carbón activado se eliminó de la solución de 2'-fucosillactosa por filtración.
A continuación, la solución se electrodializó hasta una conductividad de < 0.3 mS/cm usando un aparato de electrodiálisis PC-Cell BED 1-3 (PC-Cell, Heusweiler, Alemania) equipado con una pila de membranas PC-Cell E200. Dicha pila contenía las siguientes membranas: membrana de intercambio catiónico CEM: PC SK y la membrana de intercambio aniónico AEM:PcAcid60 que tiene un límite de exclusión de tamaño de 60 Da. Se usó una solución de ácido sulfámico (ácido amidosulfónico) 0.025 M como electrolito en el procedimiento de ED.
A continuación, la solución obtenida se concentró para obtener una solución de 2'-fucosillactosa al 40 %. A continuación, la solución de 2'-fucosillactosa obtenida se pasó por un Lewatit 5 2568 (Lanxess) en forma de Cl-(volumen del lecho 10 l) y se trató con carbón activado (Norit DX1 Ultra) a 8 °C, durante 18h. A continuación, la solución se sometió a filtración estéril pasándola a través de un filtro de 3 kDa (módulo de fibra hueca de ultrafiltración Pall Microza SEP-2013, Pall Corporation, Dreieich) y se secó por pulverización usando un secador por pulverización NUBILOSA LTC-GMP (NUBILOSA, Konstanz, Alemania).
Usando este protocolo, se pudo obtener 2'-fucosillactosa con una pureza del 94 % (determinada por análisis HPLC). Los principales contaminantes fueron 3'-fucosillactosa (1.8 %), difucosillactosa (3.2 %) y lactosa (0.2 %). El rendimiento de la purificación fue aproximadamente del 70 %.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de purificación de un oligosacárido neutro de leche humana (HMO) en forma discontinua o en forma continua a partir de un caldo de fermentación obtenido por fermentación microbiana usando un microorganismo recombinante,
seleccionándose el oligosacárido neutro de leche humana del grupo que consiste en 2'-fucosillactosa, 3-fucosillactosa, 2',3-difucosillactosa, lacto-W-triosa II, lacto-W-tetraosa, lacto-W-neotetraosa, lacto-W-fucopentaosa I, lacto-W-neofucopentaosa, lacto-W-fucopentaosa II, lacto-W-fucopentaosa III, lacto-W-fucopentaosa V, lacto-W-neofucopentaosa V, lacto-W-difucohexaosa I, lacto-W-difucohexaosa II, 6 '-galactosillactosa, 3'-galactosillactosa, lacto-W-hexaosa y lacto-W-neohexaosa,
conteniendo dicho caldo de fermentación el HMO neutro con una pureza de < 80 %, biomasa, componentes del medio y contaminantes seleccionados del grupo que consiste en sales monovalentes, sales divalentes, aminoácidos, polipéptidos, proteínas, ácidos orgánicos y ácidos nucleicos, en el que el caldo de fermentación se aplica a las siguientes etapas de purificación:
i) separación de la biomasa del caldo de fermentación,
ii) tratamiento con intercambiador de iones catiónicos para la eliminación de material con carga positiva con un intercambiador de cationes en forma de protones,
iii) tratamiento con intercambiador de iones aniónicos para la eliminación de material con carga negativa, y iv) etapa de nanofiltración y/o etapa de electrodiálisis,
en el que se proporciona una solución purificada que contiene el HMO neutro con una pureza de > 80 % y está libre de ADN y proteínas de la cepa de fermentación microbiana.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el rendimiento del HMO purificado es > 70 % determinado a partir del medio de fermentación libre de células para el concentrado de HMO.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que la separación de la biomasa del caldo de fermentación se logra mediante
a) ultrafiltración, preferiblemente por separación de biomasa y materiales > 500 kDa, más preferiblemente > 150 kDa; y/o
b) filtración a través de un filtro de flujo cruzado, preferiblemente con un corte < 100 kDa, más preferiblemente con un corte < 10 kDa, aún más preferiblemente con un corte < 5 kDa;
en el que la etapa a) se implementa preferiblemente antes de la etapa b).
4. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que al menos una de las etapas de purificación ii) a iv) se repite al menos una vez durante el procedimiento.
5. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el caldo de fermentación se aplica al menos una vez a un tratamiento de carbón activado después de al menos una de las etapas de purificación i) a iv) para la adsorción del material colorante y oligosacáridos más grandes que el carbón activado.
6. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que
a) después de al menos una de las etapas de purificación i) a iv); o
b) después de al menos un tratamiento con carbón activado para la adsorción del material colorante y oligosacáridos más grandes que el carbón activado; o
c) antes de una etapa de concentración que se implementa después de al menos una de las etapas de purificación i) a iv);
la solución que comprende el oligosacárido neutro de la leche humana se diafiltra y/o concentra, preferiblemente con una membrana de nanofiltración, más preferiblemente con una membrana de nanofiltración que tiene un límite de exclusión de tamaño de <20 A, en el que lo más preferiblemente la solución se diafiltra hasta que se alcanza una conductividad de <15 mS/cm, preferiblemente < 10 mS/cm, más preferiblemente < 5 mS/cm.
7. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6 , en el que se realiza un tratamiento con glucosidasa, preferiblemente un tratamiento con p-glucosidasa, con el caldo de fermentación antes de separar la biomasa del caldo de fermentación, donde dicho tratamiento se realiza preferiblemente al
a) agregar una cepa de microorganismos capaz de expresar una o más enzima(s) glicosidasa(s) que son apropiadas para la degradación de productos intermedios, sustratos y/o productos secundarios de oligosacáridos no deseados; y/o
b) usar una cepa de fermentación que exprese una o más enzima(s) glicosidasa(s), preferiblemente agregando un inductor al caldo de fermentación y/o cambiando la temperatura del caldo de fermentación; y/o
c) agregar una o más glicosidasa(s), preferiblemente al menos una p-glucosidasa, al caldo de fermentación como enzima cruda o como enzima purificada.
8. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el caldo de fermentación se concentra después de al menos una de las etapas de purificación i) a iv) usando evaporación al vacío u ósmosis inversa o nanofiltración
a) a una concentración de > 100 g/L, preferiblemente > 200 g/L, más preferiblemente > 300 g/L; y/o
b) a una temperatura de < 80 °C, preferiblemente < 50 °C, más preferiblemente de 20 °C a 50 °C, incluso más preferiblemente de 30 °C a 45 °C, durante la evaporación al vacío o la ósmosis inversa; y/o
c) a una temperatura de < 80 °C, preferiblemente < 50 °C, más preferiblemente de 20 °C a 50 °C.
9. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la solución purificada se filtra en condiciones estériles y/o se somete a eliminación de endotoxinas, preferiblemente mediante filtración de la solución purificada a través de un filtro de 3 kDa.
10. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la solución purificada se concentra a una concentración de > 1.5 M y se enfría a una temperatura de < 25°, preferiblemente a una temperatura de < 8 °C, para obtener material cristalino del HMO neutro.
11. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la solución purificada se seca por pulverización a una concentración del HMO neutro de 20-60 % (p/v), preferiblemente 30-50 % (p/v), más preferiblemente 35-45 % (p/v), una temperatura de la boquilla de 110-150 °C, preferiblemente 120-140 °C, más preferiblemente 125-135 °C y/o una temperatura de salida de 60-80 °C, preferiblemente 65 -70 °C.
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