CN113811537A - 使用过滤法从发酵液中纯化寡糖 - Google Patents
使用过滤法从发酵液中纯化寡糖 Download PDFInfo
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Abstract
一种从发酵液中纯化寡糖，优选中性人乳寡糖(HMO)或唾液酸化HMO的方法，该方法包括：‑提供一种发酵液，该发酵液含有目标寡糖、生物质、微生物细胞以及除目标寡糖以外的其他碳水化合物；‑从发酵液中除去微生物细胞，从而提供工艺流；‑使用纳滤膜对工艺流进行第一个过滤步骤，从而提供含有目标寡糖的滤液；‑使用纳滤膜对滤液进行第二个过滤步骤，从而提供含有目标寡糖的截留物；–使用电渗析从工艺流中除去盐，从而提供目标寡糖的纯化制剂。
Description
本发明涉及通过微生物发酵以工业规模生产寡糖。更具体而言，本发明涉及通过使用过滤方法从发酵液中纯化目标寡糖。
背景技术
人乳是碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质和微量元素的复杂混合物。碳水化合物级分是最丰富的固体级分，且其可进一步分为乳糖和更复杂的寡糖，即所谓的人乳寡糖(HMO)。
虽然乳糖被用作能量来源，但是复杂的寡糖不会被婴儿或成人代谢。复杂寡糖的级分占总碳水化合物级分的最高达10％，并且可能由超过150种不同的寡糖组成。这些复杂寡糖的存在和浓度是人类所特有的，因此不会大量地存在于其他哺乳动物(例如驯养的产奶动物)的乳汁中。尽管HMO仅占人乳总量的一小部分，但是在过去几十年中，其对母乳喂养的婴儿的发育所具有的非常有益的影响变得日益明显。
最重要的HMO是2’-岩藻糖基乳糖。其他重要的HMO是3-岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖和乳-N-岩藻戊糖。除了这些中性寡糖之外，酸性HMO也存在于人乳中，酸性HMO包括3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖和唾液酸乳糖-N-四糖(例如LST-a、LST-b和LST-c(表1))。由于HMO存在至少一个唾液酸部分，因此人乳中最高达20％的总HMO含量是酸性的。这些结构与上皮细胞表面糖缀合物的抗原决定部位(Lewis组织血型抗原)是密切相关的，并且HMO和上皮抗原决定部位之间的结构同源性解释了HMO抵御细菌病原体的能力(Weichert等人2013年,Nutr.Res.33:831；Weichert等人2016年,J.Virol.90:4843)。
人乳中存在复杂的寡糖早已为人所知，几十年来，HMO的生理功能一直是医学研究的主题(Gura 2014年,Science 345:747；Kunz&Egge 2017年,In McGuire,McGuire&Bode(编辑)Prebiotics and Probiotics in Human Milk,Elsevier,London,第3-16页)。对于一些更丰富的HMO，已经确定了特定的功能(Bode 2012年,Glycobiology 22:147；Bode&Jantscher-Krenn 2012年,Adv.Nutr.3S:383；Morrow等人2004年,J.Pediatr.145:297)。由于HMO在抑制传染性物质(细菌、病毒和细菌毒素)方面的生理能力、其在大脑发育方面产生的积极影响及其具有的益生元功能，因此非常需要在食品中，尤其是婴儿营养产品中包括HMO。表1提供了可通过本文公开的方法从发酵液中纯化出的HMO的概览。
表1：可通过本文公开的方法纯化的人乳寡糖的列表。
单个HMO的有限供应并且没有找寻到能够获得足够数量的这些分子的资源促进了以生成它们的化学合成为基础的工艺的发展。然而，HMO的化学合成，尤其是大规模生产应用于食品中的足够质量的HMO，已被证明是极具挑战性的。特别地，HMO的化学合成如2’-FL(WO 2010/115935 A)需要几种有害化学品，这可能会污染最终产品。
化学合成的缺陷促进了几种基于酶促和发酵的方法的发展(Miyazaki等人2010年,Methods Enzymol.480:511；Murata等人1999年,Glycoconj.J.16:189；Baumgartner等人2013年,Microb.Cell Fact.12:40；Lee等人2012年,Microb.Cell Fact.1:48；Albermann等人2001年,Carbohydr.Res.334:97；US 7,521,212 B1；Fierfort&Samain2008年,J.Biotechnol.134:216)。然而，这些方法产生了寡糖的复杂混合物，因此所需的产物被原材料(如乳糖)以及中间体、不需要的副产物(例如源自某些糖基转移酶的副活性的副产物)和来自发酵方法的底物(如蛋白质、多肽、有机酸和盐)污染。
目前从混合物中纯化单个寡糖的许多方法在技术上很复杂，难以扩大规模，而且对于食品应用来说是不经济的。现已开发出工业规模工艺用于分别从乳清和糖蜜中纯化二糖乳糖和蔗糖，但这些方法包括多个复杂且以低产率获得产品的结晶步骤。然而，乳清和糖蜜是以“食品级”产品使用，远不及含有重组细菌或酵母的发酵液那么复杂和苛刻(就监管要求而言)。凝胶过滤色谱法是纯化复杂的寡糖(如通过微生物发酵生产的HMO)的最佳方法，但这种方法的缺点包括缺乏可放大性且不适合连续加工。因此凝胶过滤色谱法是不经济的，不能用于工业规模化生产HMO。
理论上，凝胶过滤色谱法是纯化复杂的寡糖(如通过微生物发酵生产的HMO)的最佳方法，但凝胶过滤色谱法的缺点包括缺乏可放大性和不适合连续加工。因此凝胶过滤色谱法是不经济的，不能用于工业规模化生产HMO。
在开发出通过微生物发酵生产HMO的有效方法和工艺之后，下一个合乎逻辑的步骤是开发有效的下游工艺以从培养液中分离HMO。
WO2015/049331A公开了一种纯化中性HMO的工艺。该工艺采用离子交换、电渗析和模拟移动床(SMB)色谱法，以实现对大量HMO的连续和高效纯化。与用于生产中性HMO的化学合成路线及其后续纯化不同，所记载的发酵和纯化方法允许提供不含有害化学品(例如痕量重金属和有机溶剂)的HMO。该纯化方法得到了固体形式(通过喷雾干燥)或作为浓缩糖浆的高度纯化的HMO产品，这可以用于食品应用中。
WO 2015/106943 A记载了一种用于纯化通过微生物发酵产生的中性HMO的简单工艺。该工艺使用阳离子交换、阴离子交换和纳滤和/或电渗析的组合方法，其可有效纯化大量中性HMO。与早期的用于将微生物发酵产生的中性HMO进行纯化的方法不同，该工艺不包括色谱分离步骤。该工艺产生固体形式的HMO，为喷雾干燥材料、结晶材料或过滤除菌浓缩物。所得的HMO不包含蛋白质和用于生产的重组微生物菌株所产生的材料，因此是食品、医疗食品和饲料(例如宠物食品)应用的理想选择。
WO 2016/095924 A记载了一种通过结晶纯化2’-FL的方法。HMO由微生物发酵产生，除去生物质后，通过纳滤和电渗析对其进行浓缩。最后，使用乙酸从还含有2’,3-二-O-岩藻糖基乳糖(DFL)的水溶液中选择性结晶2’-FL。
LNT和LNnT可通过与活性炭选择性结合而与碳水化合物副产物分离，然后用有机溶剂洗脱并通过凝胶过滤色谱法进行分离(Priem等人2002年,Glycobiology 12:235；Gebus等人2012年,Carbohydr.Res.361:83；Baumgartner等人2014年,ChemBioChem 15:1896)。如上所述，凝胶过滤色谱法是一种方便的实验室规模方法，但其不能有效地按比例放大用于工业生产中。
WO 2015/049331 A公开了，将通过细菌发酵产生的LNT进行纯化以提供澄清、无颗粒的溶液的操作顺序如下：电渗析、纳滤、使用强阳离子交换树脂的模拟移动床(SMB)色谱法、电渗析、超滤和第二个SMB色谱法。
还记载了用于分离酸性HMO，尤其是唾液酸化乳糖或唾液酸化寡糖的各种方法。
US 2007/0020736 A公开了3’-SL的制备，其中二唾液酸化和三唾液酸化的乳糖作为细菌大肠杆菌(Escherichia coli)的遗传修饰菌株的副产物。3’-SL在培养液中积累至～0.8mM的浓度。使用以下步骤纯化3’-SL：离心，将上清液流经炭进行吸附并用蒸馏水洗掉水溶性盐，用含水乙醇梯度洗脱，最后在Biogel柱上分离并脱盐。从1L培养液得到49mg 3’-SL。
另一种公开的方法包括使用遗传修饰的大肠杆菌(E.coli)菌株制备3’-SL，且随后通过细胞的热透化(heat permeabilization)以及之后的离心进行分离(Priem等人2002年,Glycobiology 12:235)。使上清液中的物质吸附到炭上，并用蒸馏水洗掉水溶性盐。在用含水的乙醇梯度洗脱后，3’-SL被吸附到HCO3 -(碳酸氢根离子)形式的强阴离子交换剂上，并用碳酸氢钠(NaHCO3)的线性梯度洗脱。后者通过阳离子交换(使用酸性形式的树脂)除去，导致49％的3’-SL回收效率。
另一以发酵液开始的过程包含热透化、离心、通过添加酸性形式的强阳离子交换树脂将pH值调节至3.0以及通过离心除去沉淀的蛋白质的步骤(Fierfort等人2008年,J.Biotechnol.134:261)。然后通过添加碱性形式的弱阴离子交换剂将上清液的pH值调节至6.0，并且使3’-SL键合至HCO3-形式的阴离子交换剂。用蒸馏水洗涤，然后用NaHCO3连续梯度洗脱后，通过阳离子交换(使用酸性形式的树脂)除去NaHCO3，直到pH值降至3.0。最后，用NaOH将pH值调至6.0。这种纯化策略实现了59％的3’-SL回收效率。
酶促产生的3’-SL也已通过纳滤与乳糖分离(Nordvang等人2014年,Separ.Purif.Technol.138:77)。作者表明，两种不同的纳滤膜可在渗滤(diafiltration)后将大部分3’-SL从乳糖中分离出来，这两种不同的纳滤膜其中一种具有600-800Da的截留分子量(MWCO)(磺化聚醚砜(SPES)膜)，另一种具有1000-1400Da的截留分子量(MWCO)(SPES膜)。然而，在该工艺中3’-SL的损失显著且纯度低，需要额外的离子交换纯化步骤。
WO 2010/106320 A2记载了一种从乳清中富集3’-SL的方法。首先，通过超滤除去蛋白质，然后将澄清的乳清渗透液与离子交换树脂一起孵育以捕获3’-SL。从离子交换材料中洗脱后，通过纳滤浓缩富集的3’-SL部分，使浓缩物脱矿质。脱矿质后，将3’-SL浓缩并干燥，得到3’-SL含量为20重量％的最终干燥产品。
WO 2018/020473 A记载了一种从液体源中富集3’-SL和6’-SL的其他工艺。通过加热溶液、酶处理和额外的超滤和纳滤步骤，从乳糖结晶的母液中分离出这两种HMO。富集后，3’-SL和6’-SL的含量为10-30重量％(干质量)。
从现有技术出发，本发明的目的是提供一种用于纯化由微生物发酵生产的目标寡糖，特别是中性HMO或唾液酸化HMO的方法，其中所述工艺易于放大生产并适用于商业化或工业化规模来制造所述目标寡糖，并且这可产生具有使产品适合人类食用的纯度的产品。
必须强调的是，微生物发酵液，特别是含有重组微生物(细菌或真核微生物，如巴氏酵母)的发酵液比乳源产品流复杂得多。例如，乳清的组成为～94％的水、4-5％的乳糖、0.5-1％的蛋白质和仅有的很少的已经确定的矿物质(如钙、钾和磷)，还有一些维生素，仅在乳品流中浓缩和脱矿质的简单的基质。相比之下，从重组微生物发酵工艺中获得的糖溶液的基质非常复杂，首先是根据政府规定，按照法律要求分离重组生物质并使其失活。获得的澄清肉汤(broth)是包含不同盐类和离子的不确定基质，还含有重金属和微量元素。此外，此类液体的挑战是除去细胞碎片、膜碎片如脂类、蛋白质、源自微生物细胞代谢的分子且尤其是DNA。因此，与乳清和乳品流相比，通过重组加工助剂(如基因修饰细菌)生产的寡糖的回收更具挑战性，因为肉汤内的污染物在分子量、带电分子(单电荷和多电荷)和着色分子方面差异性都非常高。
发明内容
本发明提供了一种由通过使用重组发酵菌株的微生物发酵而获得的培养液或发酵液中，将通过发酵生产的目标寡糖，以分批方式或以连续方式进行纯化的方法。先前描述的纯化策略通常采用昂贵的离子交换步骤(需要阳离子和阴离子交换剂)。离子交换剂不能连续使用，因为它们需要再生。培养液含有目标寡糖、生物质、培养基成分、盐和污染物如其他酸和色素。
在纯化工艺中，培养液可以进行以下的纯化步骤来获得目标寡糖：
1)通过微滤从培养液中分离微生物细胞
2)通过超滤从澄清的培养液(＝工艺流)中分离蛋白质
3)第一个纳滤步骤除去肽和高分子量(HMW)杂质
4)第二个纳滤步骤除去水和盐
5)活性炭处理除去色素和其他杂质
6)使用纳滤膜的电渗析或渗滤以完全除去污染盐
7)通过反渗透除去水
此外，可在活性炭处理之前引入另一个电渗析步骤，以减少污染离子的量。为了在水溶液中纯化后，得到固体形式的目标寡糖，可将材料喷雾干燥或造粒。
附图说明
图1示出了根据本发明方法的示例性实施方案的工艺方案。
图2示出了根据本发明方法的另一个示例性实施方案的工艺方案。
图3示出了根据本发明方法的另一个示例性实施方案的工艺方案。
图4示出了根据本发明方法的另一个示例性实施方案的工艺方案。
图5示出了根据本发明方法的另一个示例性实施方案的工艺方案。
图6示出了含有3-岩藻糖基乳糖的澄清发酵液的HPLC色谱图。
图7示出了通过本发明方法的示例性实施方案，对发酵液进行纯化后的3-岩藻糖基乳糖的HPLC色谱图。
详细说明
根据本发明，术语“纯度”是指化学纯度且规定物质(例如2’-FL、3-FL、DFL、LNT、3’-SL、6’-SL或任何其他目标寡糖(表1))为未被与外来物质稀释或未与外来物质混合的程度。因此，化学纯度是单一物质与任何副产物/杂质之间关系的指标。化学纯度以百分比(％)表示，并使用以下公式计算：
在包含目标寡糖的组合物中，该化合物的纯度可通过本领域技术人员已知的任何合适的方法确定，例如高效液相色谱法(HPLC)。合适的检测器可选自电化学检测器、折光率(RI)检测器、质谱仪(MS)、二极管阵列检测器(DAD)和核磁共振(NMR)检测器。例如，在HPLC中，纯度可通过计算目标峰下方的面积(代表目标寡糖的量)与所有峰下方的面积总和(代表在同一色谱图中目标寡糖和与该物质不同的化合物的量)之比来确定。然而，这意味着所有杂质都可通过所选的HPLC方法来分析。否则，质量平衡方法是必须的，即所需产品的绝对量化。在所述方法中，使用纯物质作为参比来量化纯度，然后根据从产品(所需产品加上所有杂质)中获得的干物质来判断纯度。根据本发明，所述质量平衡方法也可用于确定纯度。
根据本发明，“培养液”或“发酵液”是指发酵后含有2’-FL、3-FL、DFL、LNT、3’-SL、6’-SL或任何其他待纯化的目标寡糖(表1)的任何液体。术语“培养液”、“发酵液”和“培养基”在本文中用作同义词。培养液包含待纯化的目标寡糖以及生物质(例如生物细胞和细胞碎片)、培养基成分、盐和其他污染物(如其他酸和色素)。培养液中含有的生物细胞是在细胞内产生目标寡糖并将该化合物分泌到液体培养基中的生物细胞。生物细胞可以包括基因修饰的生物细胞，例如基因修饰的大肠杆菌细胞，或可以由其组成。基因修饰可以包含为产生目标寡糖而进行的修饰(尤其是在所述生物细胞的生长期)，或可以由其组成。
如本文使用的，术语“生物质”是指在发酵步骤结束时存在于发酵液中的全部生物细胞。生物质包括产生目标寡糖的微生物细胞、在发酵步骤中可能已经失去产生目标寡糖能力的该微生物的后代细胞，以及在发酵步骤结束时偶然存在于发酵液中的任何其他细胞。因此，在发酵步骤结束时存在于发酵液中的所有生物细胞基本上都与发酵液分离，使得澄清的发酵液——称为“工艺流”(包含或含有待纯化的目标寡糖的任何溶液)——基本上或完全不含细胞。
生物质优选包含产生目标寡糖的生物细胞，优选产生目标寡糖的细菌细胞，更优选产生目标寡糖的重组细菌细胞，最优选产生目标寡糖的重组大肠杆菌(E.coil)细胞。
可通过离心和/或过滤从发酵液中除去生物质和/或微生物细胞。
在适用于从培养液中除去生物质的离心方法中，生物质以颗粒形式获得，且上清液作为要进一步处理的澄清工艺流。在适用于从培养液中除去生物质的过滤方法中，滤液变成澄清的工艺流。优选的除去生物质的过滤方法是微滤和/或超滤，后者赋予除去比微滤更小的颗粒和大分子的能力。微滤和超滤可在死端过滤模式(工艺流垂直于过滤器流动)或错流过滤模式(工艺流平行于过滤器流动)下运行。
微滤是一种物理分离过程，其中含有颗粒的流体通过介质，所述介质包括含有曲折(torturous)通道以保留颗粒的多孔物质(深度过滤)和/或具有允许比特定孔径更小的颗粒/分子通过的所述孔径的膜(膜过滤)。如本文使用的，术语“微滤”是指物理分离过程，其中从发酵液中除去生物细胞(和细胞碎片)，留下(澄清的)工艺流。
用于通过微滤除去生物质的合适膜可具有至少0.2μm的孔径并且可以是中空纤维或螺旋卷式膜。或者，使用具有100-1000kDa，优选150-500kDa的MWCO的膜进行微滤以除去生物质、额外的细胞碎片和更大的蛋白质，可通过此方法来实现除去生物质。例如，诸如
DS MVP20(孔径0.2μm)(Microdyn-Nadir GmbH,Wiesbaden,Germany)之类的膜螺旋卷绕以提供紧凑的结构设计和更好的性能，其可用于将细胞与培养液分离。此外，孔径为0.05-0.1μm的螺旋卷式膜，如
DS MP005，其为一种包含PES膜且标称孔径为0.05μm的组件，可用于分离生物质和蛋白质。
此外，中空纤维组件，如FS10-FC FUS1582(Microdyn-Nadir GmbH)，一种使用MWCO为150kDa的PES膜(5m2)的中空纤维过滤组件，可用作替代方案。
总之，以下从发酵液中除去生物质的可能的方法可以用于本发明：
i)通过离心进行收获。一步除去培养液中的不溶性成分。优点：快速除去不溶性成分。
ii)通过微滤进行收获。一步除去培养液中的不溶性成分和超过一定尺寸的大分子。螺旋卷式膜或中空纤维错流过滤器可用于MWCO≥500kDa的微滤，优点：快速除去超过一定尺寸的不溶性成分和大的可溶性分子。
iii)通过离心与微滤的结合进行收获：分两步从培养液中除去不溶性成分和超过一定尺寸的大分子。螺旋卷式膜或中空纤维错流过滤器可用于MWCO≥500kDa的微滤，优点：快速除去不溶性成分和超过一定尺寸的大分子，而不会堵塞微滤膜。
超滤是一种膜过滤形式，与微滤没有根本区别。在超滤中，压强产生的力和浓度梯度可使含有颗粒和可溶性大分子的液体通过半透膜而除去此类颗粒和大的可溶性分子。这导致颗粒和大的可溶性分子被保留在所谓的截留物中，而水和低分子量(LMW)溶质(如产生的中性和酸性寡糖)穿过膜进入渗透液(滤液)。用于超滤的膜由其MWCO定义，其描述了可穿过膜进入渗透液的可溶性分子的最大分子量。任何颗粒以及大于MWCO的分子都无法穿过膜并保留在截留物中。超滤可以错流模式应用，其中液体的流动平行于膜表面，或以死端模式应用，其中液体的流动垂直于膜表面。
包含产生的目标寡糖的澄清工艺流通常含有大量不需要的杂质，该杂质包括(但不限于)单价离子、二价离子、氨基酸、多肽、蛋白质、有机酸、核酸、单糖和/或寡糖。
用于通过超滤除去大多数蛋白质的合适膜的MWCO为至少50kDa、优选至少30kDa、更优选10kDa，并且其可为中空纤维或螺旋卷式膜。例如，诸如
DS UP010(MWCO＝10kDa)或SPIRA-CEL DS UP005(MWCO＝5kDa)(均由Microdyn-Nadir GmbH销售)的膜螺旋卷绕，以提供紧凑的结构设计和更好的性能，并且这些膜可用于从无细胞培养液中分离剩余的蛋白质。
此外，还可使用中空纤维组件，例如
HF UF Cartridge PM10(KochMembranes Systems,Wilmington,USA)，其为面积最高达12m2和MWCO为10kDa的PES膜，可用作替代方案。
纳滤是一种膜过滤方法，其中膜含有纳米级的孔(1-10nm)。纳滤膜的孔径比微滤膜和超滤膜的孔径更小，但比用于反渗透的膜的孔径更大。纳滤膜主要由聚合物(如聚对苯二甲酸乙二醇酯)或金属(如铝)的薄膜制成，孔隙密度为1-106孔/cm2。
纳滤用于目标寡糖的纯化方法，以除去LMW杂质如肽和盐，并增加澄清工艺流或洗脱液中寡糖的浓度。
大多数HMO的分子量范围为400至1,200Da。为了从工艺流中除去HMW杂质(>1200Da)(如肽和色素)以及LMW杂质(<400Da)(如盐)，需要至少两个纳滤步骤。
超滤后，所有>5kDa或>10kDa的分子(取决于所用的膜)都应该从工艺流中除去。为了除去低于该阈值但仍大于目标寡糖的杂质(例如肽和色素)，可使用允许寡糖进入渗透液而HMW杂质保留在截留物中的MWCO进行第一个纳滤步骤。
为了将HMW杂质与大部分所需寡糖分离并提高所需寡糖的产率，该工艺应运行至使产物的>70％，优选>80％，更优选>90％通过膜。此外，可包括渗滤步骤以增加澄清的工艺流中寡糖的产率。
在该第一个纳滤步骤之后，含有目标寡糖的工艺流中仅有的杂质的分子量应与寡糖相同或低于该寡糖，并且可包含单价离子、二价离子、氨基酸、有机酸、单糖和/或寡糖。
适用于第一个纳滤步骤的膜包括聚酰胺或聚哌嗪薄膜复合膜材料，其达到的尺寸排阻在400-1,200Da范围内。实例包括HYDRACoRe70(MWCO＝720Da)或HYDRACoRe50(MWCO＝1,000Da)膜，均来自Hydranautics(Oceanside,USA)，
NP010P(MWCO＝1,000-1,500Da)或
NP030P(MWCO＝500-1,000Da)膜(Microdyn-Nadir GmbH)。此类膜允许高通量。用于纳滤的合适膜的其他实例包括
SBNF(MWCO＝2000Da)、醋酸纤维素纳滤膜(Microdyn-Nadir GmbH)和来自Suez Water Technologies&Solutions(Ratingen,Germany)的GE系列膜(MWCO＝1000Da)。
在额外的和/或替代的实施方案中，第一个纳滤步骤达到以下参数：
i)过滤后的目标寡糖回收率应当>70％，优选>80％，更优选>90％。
ii)工艺流中目标寡糖的浓度应当<50％(w/v)，优选<40％(w/v)，更优选<30％(w/v)，优选<20％(w/v)，更优选<10％(w/v)。
iii)该步骤应当在<80℃，优选<50℃，更优选4-40℃的温度下进行(特别适用于纳滤)。
iv)该步骤应在5-50巴的压力下，优选在10-40巴的压力下，更优选在15-30巴的压力下进行。
在该方法的优选实施方案中，在第一个纳滤步骤之后，通过应用第二个纳滤步骤将含有目标寡糖的工艺流浓缩和脱盐。目标寡糖也可通过真空蒸发(例如使用降膜蒸发器或板式蒸发器)或反渗透来浓缩。这两种技术的缺点是工艺流被浓缩但没有脱盐。因此，纳滤是优选方法，因为其可以同时实现浓缩和脱盐，例如通过使用尺寸排阻极限<2nm的膜。
纯化目标寡糖的方法包含这样一个步骤，其中将来自第一个纳滤步骤的澄清工艺流进行至少一个额外的纳滤步骤以除去盐、较小的分子和水。优选地，将来自第一个纳滤的洗脱液(＝滤液或渗透液)直接进行第二个纳滤步骤以从澄清的工艺流中除去盐和较小的分子。
适用于第一个纳滤步骤的膜包括聚酰胺或聚哌嗪薄膜复合膜材料，其达到的尺寸排阻在150-300Da范围内，例如FilmtecTM NF270(Dow Chemical Company,Midland,USA)和
XN45或TS40膜(Microdyn Nadir GmbH)。此类膜允许高通量。其他实例包括
4040-XN45-TSF(Microdyn-Nadir GmbH)或GE4040F30和GH4040F50膜(SuezWater Technologies&Solutions)。
在电渗析之前，纳滤步骤有效地从含有目标寡糖的工艺流中除去大量的盐和LMW杂质。在超滤步骤之后，纳滤还可以有效地除去LMW污染物，其中此类污染物的去除有利于目标寡糖溶液的浓缩和脱矿质。由于更加有限的热接触，使用纳滤浓缩目标寡糖可降低能源和加工成本，并且提供更好的产品质量。
该方法从水溶液中浓缩目标寡糖，其中在水溶液中，目标寡糖的浓度为≤20％、≤10％或≤5％(浓缩前)。
在额外的和/或替代的实施方案中，通过纳滤浓缩应达到以下参数：
i)寡糖浓度为>100g/L，优选>200g/L，更优选>300g/L，最优选>400g/L；
ii)纯化溶液中盐的含量应当为<10重量％，优选<5重量％，更优选<2重量％；和/或电导率应当为0.5-10.0mS/cm2，优选1-8mS/cm2，更优选1.5-4.0mS/cm2。
iii)该步骤应当在温度为<80℃，优选<50℃，更优选4-40℃下进行(特别适用于纳滤)。
iv)该步骤应在5-50巴的压力下，优选在10-40巴的压力下，更优选在15-30巴的压力下进行。
澄清溶液和/或经纯化溶液中的色素可通过用活性炭处理除去。使用活性炭除去色素的优点是可除去带电荷和不带电荷(中性)的色素。
活性炭(activated carbon)，也称为活性炭(activated charcoal)，是碳的一种形式，其经过处理后可产生小体积的小孔，从而增加可用于吸附的表面积。通常，由于其具有高度的微孔性，仅1g活性炭的表面积就大于30,00m2(通过气体吸附测定)。
具有颜色(colour-given)的杂质，如美拉德(Maillard)产物、核黄素和其他LMW杂质，往往会吸附到炭颗粒的表面。与产生的寡糖相比，具有颜色的物质的量要低得多和/或在大多数情况下显示出疏水行为。由于这一事实，色素污染物从工艺流中的除去率高。水溶性材料(如寡糖)的结合力更弱，并且其可通过用水冲洗来洗脱，从而留下吸附在表面上的色素。
在额外的和/或替代的实施方案中，用于纯化目标寡糖的方法还包含至少一个这样的步骤，在该步骤中用活性炭处理来自先前纯化步骤的澄清工艺流或洗脱液以除去色素。
在一个优选的实施方案中，应在以下步骤后进行活性炭处理：
i)在第二个纳滤步骤中除去水和盐之后；和/或
ii)通过超滤除去蛋白质之后或通过电渗析(或者，可引入渗滤步骤)除去剩余的盐之后。
适用于除去中性寡糖、色素和其他污染物的活性炭为(但不限于)颗粒活性炭(如Norit GAC830EN(Cabot Corporation,波士顿,USA)和Epibon Y 12x 40spezial(DonauCarbon,Frankfurt,Germany))或粉末活性炭(如Norit DX1、Norit SA2(CabotCorporation)和Carbopal MB4(Donau Carbon))。
电渗析将透析和电解相结合，且可以基于溶液中的离子通过半透膜的选择性电迁移用于分离和浓缩溶液中的离子。工业电渗析的应用可以追溯到1960年代初，当时该方法用于对奶酪乳清进行脱矿质以添加至婴儿配方中。其他应用包括调节葡萄酒、葡萄汁、苹果汁和橙汁等饮料的pH值。
用于生产饮用水中的半咸水的脱盐和用于婴儿食品生产中的奶乳清的脱矿质是当今电渗析最广泛的应用。电渗析的基本原理涉及一个电解池，该电解池包括一对电极，该电极浸入用于传导离子的电解液中，并与直流发生器相连。与直流发生器正极相连的电极为阳极，与负极相连的电极为阴极。然后电解质溶液支持电流流动，电流是由负离子和正离子分别向阳极和阴极移动产生的。本质上，用于电渗析的膜是带有负或正电荷基团的多孔离子交换树脂片，因此其分别被描述为阳离子或阴离子膜。离子交换膜通常由带有与二乙烯基苯交联的合适官能团(例如用于阳离子膜的磺酸或用于阴离子膜的季铵基团)的聚苯乙烯基质组成。
电解液可以是包含例如氯化钠、乙酸钠、丙酸钠和/或氨基磺酸的水溶液。电解液围绕阴极和阳极并允许电流在电池内流动。然后电渗析堆以这样的方式进行组装：阴离子膜和阳离子膜在两个电极块之间如同在压滤机中一样平行，使得经历离子消耗的流与经历离子富集的流很好地分离。这两种溶液也被称为稀释液(正在进行离子消耗)和浓缩液(正在进行离子富集)。
电渗析过程的核心是膜堆，其由安装在两个电极之间的多个阴离子交换膜和阳离子交换膜组成，这些膜由间隔件隔开。通过施加直流电，阴离子和阳离子将穿过膜向电极迁移，产生(脱盐)稀释流和浓缩流。
用于电渗析的离子交换膜的孔径需足够小，以防止产品从稀释流扩散到浓缩流中，这是由两种流之间的高的浓度差驱动的。
电渗析用于除去水溶液中的离子，而中性和酸性寡糖保留在工艺流中。电渗析的一个重要优点是重组DNA分子可从包含目标寡糖的溶液中完全除去。此外，通过电渗析可显著减少工艺流中的盐量。的确，氯化钠可从工艺流中完全除去。这具有以下优点，即可提供不含盐(如氯化钠)的含有目标寡糖的溶液，从而防止该盐对最终产品(例如婴儿食品)的任何负面影响。
在纳滤和活性炭处理后，应当从工艺流中除去大部分盐和较小的有机杂质(如有机酸)。为了确保有效除去残留的盐和带电的小的有机物质，进行了电渗析步骤。
可进行电渗析步骤直到工艺流达到0.05-1.0mS/cm2，优选0.1-0.5mS/cm2，更优选0.2-0.4mS/cm2的稳定电导率。此外，可进行电渗析步骤直到盐的浓度降至<10.0g/L，优选<5.0g/L，更优选<1.0g/L，最优选<0.2g/L。
对于中性寡糖，电渗析步骤应在酸性或中性pH条件下进行，优选pH 3-8，更优选pH4-7。对于酸性寡糖，由于酸性寡糖在酸性条件下不稳定，电渗析步骤应在中性pH条件下进行，优选pH 6-8，更优选pH6.5-7.5。在电渗析过程中必须控制酸性寡糖溶液的pH值，必要时用NaOH进行调节。
可使用反渗透步骤代替纳滤来浓缩目标寡糖。反渗透是一种膜过滤方法，可在除去水的同时浓缩工艺流截留物中大于0.1nm的颗粒。因此，反渗透可浓缩工艺流，但不能实现脱盐。
该方法可浓缩水性或有机溶剂中的目标寡糖，其中目标寡糖的浓度为≤20％(w/v)、≤10％(w/v)或≤5％(w/v)(浓缩前)。
在额外的和/或替代的实施方案中，浓缩步骤应当达到以下参数：
i)寡糖浓度为>300g/L，优选>400g/L，更优选>500g/L，最优选600g/L。
ii)该步骤应当在温度为<80℃，优选<50℃，更优选4-40℃下进行(特别适用于反渗透)。
iii)该步骤应在5-50巴的压力下，优选在10-40巴的压力下，更优选在15-30巴的压力下进行。
在该工艺的额外的和/或替代的实施方案中，通过真空蒸发(例如使用旋转蒸发器或板式蒸发器)浓缩含有中性和酸性HMO的溶液并且应当达到以下参数：
i)寡糖浓度为>300g/L，优选>400g/L，更优选>500g/L，最优选>600g/L。
ii)该步骤应当在温度为<80℃，优选<50℃，更优选20-50℃，甚至更优选30-45℃，最优选35-45℃的温度下进行(特别适用于真空蒸发)。
为了除去任何潜在的微生物污染物和内毒素，将浓缩的目标寡糖通过超滤膜进行过滤灭菌。
在本发明的一个优选实施方案中，将纯化的寡糖溶液通过≤10kDa的过滤器组件，例如5kDa或3kDa MWCO的过滤器。用于除去内毒素的合适超滤膜的MWCO至少为10kDa，优选至少5kDa，并且可以是螺旋卷式或中空纤维超滤膜。螺旋卷式膜的实例包括
DS UP010(MWCO＝10kDa)或DS UP005(MWCO＝5kDa)膜(Microdyn-NadirGmbH)和来自Koch Membranes Systems的
HpHT UF-5K(MWCO＝5kDa)。中空纤维组件的实例包括来自Koch Membranes Systems的
HF UF CartridgePM5(MWCO＝5kDa)或来自Pall Cooperation(Port Washington,USA)的MicrozoaTM系列膜(MWCO＝3或6)。
在一个优选的实施方案中，在过滤除菌后，将纯化的寡糖溶液进行喷雾干燥。该溶液可使用热空气喷雾干燥以除去优选至少85重量％，或更优选至少90重量％的水。该溶液可使用任何常规的喷雾干燥系统(优选带有流化床干燥器配件)进行喷雾干燥。
可以将纯化的溶液进行喷雾干燥，以使目标寡糖的浓度为5-60重量％，优选10-50重量％，更优选15-45重量％。入口温度可保持在110-150℃，优选120-140℃，更优选125-135℃的范围内。出口温度可保持在60-80℃，优选65-70℃的范围内。
喷雾干燥后，经纯化的目标寡糖可具有以下特性：
i)固体颗粒形式；和/或
ii)通过差示扫描量热法测定的玻璃化转变温度为60-90℃，优选62-88℃，更优选64-86℃；和/或
iii)通过激光衍射测定的粒径为5-500μm，优选10-300μm；和/或
iv)通过激光衍射测定的平均粒径为10-100μm，优选20-90μm，更优选30-80μm，最优选40-70μm；和/或
v)通过X射线粉末衍射观察到无定形状态，优选无结晶物质特征峰的无定形状态；和/或
vi)水分含量为≤10重量％，优选≤8重量％，更优选≤5重量％。
纯化的目标寡糖可用于营养应用，优选医学或乳品营养(例如谷类产品)，更优选婴儿营养或医学，优选预防或治疗胃肠道疾病。
在一个实施方案中，目标寡糖是中性寡糖或唾液酸化寡糖，优选人乳寡糖。目标寡糖可为中性HMO或唾液酸化HMO。在额外的和/或替代的实施方案中，目标寡糖选自以下人乳寡糖：2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2’,3-二岩藻糖基乳糖、乳-N-三糖II、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻戊糖I、乳-N-新岩藻戊糖、乳-N-岩藻戊糖II、乳-N-岩藻戊糖III、乳-N-岩藻戊糖V、乳-N-新岩藻戊糖V，乳-N-二岩藻己糖I、乳-N-二岩藻己糖II、6’-半乳糖基乳糖、3’-半乳糖基乳糖、乳-N-己糖和乳-N-新己糖、3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖、唾液酸乳糖-N-四糖a、唾液酸乳糖-N-四糖、唾液酸乳糖-N-四糖c、3-岩藻糖基-唾液酸乳糖、二唾液酸-乳-N-四糖和岩藻糖基-LST b。
本发明将结合具体实施方案并参考附图进行描述，但本发明不限于此，而仅受权利要求的限制。此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二等用于区分相似要素，并且并不一定是用于在时间上、空间上、按等级或以任何其他方式描述顺序。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施方案能够以不同于本文描述或举例说明的其他顺序进行操作。
应当注意的是，在权利要求中使用的术语“包含(comprising)”不应被解释为限于其后列出的方式；它不排除其他要素或步骤。因此，它被解释为指定所提及的特征、整数、步骤或组件的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤或组件，或其群组。因此，表述“包含装置A和B的设备”的范围不应限于仅由组件A和B组成的设备。这意味着，就本发明而言，该装置的唯一相关组件是A和B。
在本说明书通篇中，提及“一个(one)实施方案”或“一种(an)实施方案”是指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在本说明书通篇中各处出现的短语“在一个实施方案中”或“在一种实施方案中”并不必然都指代同一实施方案，而是可能指代同一实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，可以任何合适的方式组合特定特征、结构或特性，基于本内容的公开，这对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。
类似地，应当理解，在本发明的示例性实施方案的描述中，为了简化本公开内容并有助于理解本发明各种创造性的一个或多个方面，本发明的各种特征有时在单个实施方案、图或其描述中被组合在一起。然而，这种公开方法不应被解释为反映了所要求保护的发明需要比每个权利要求中明确记载的特征更多的特征的意图。相反，正如以下权利要求所反映的，创造性方面在于少于前述公开的单个实施方案的所有特征。因此，详细说明之后的权利要求特此明确地并入该详细说明中，每一项权利要求本身作为本发明的单独实施方案。
此外，虽然本文描述的一些实施方案包括其他实施方案中的一些特征但不包括其他特征，但不同实施方案的特征的组合也在本发明的范围内，并形成不同的实施方案，正如本领域技术人员所理解的那样。例如，在以下权利要求中，可以任何组合使用任何要求保护的实施方案。
此外，一些实施方案在本文中被描述为可以由计算机系统的处理器或通过执行该功能的其他手段来实现的方法或方法要素的组合。因此，具有执行这样的方法或方法要素的必要指令的处理器构成了用于执行该方法或方法要素的手段。此外，本文描述的设备实施方案的要素是为了实施本发明的目的而用于执行由该要素行使的功能的手段的实例。
本文提供的说明书和附图中，阐述了许多具体的细节。然而，应当理解，可在没有这些具体细节的情况下实践本发明的实施方案。在其他情况下，为了不混淆对本说明书的理解，没有详细示出众所周知的方法、结构和技术。
现在将通过对本发明的几个实施方案的具体说明来描述本发明。显然，在不偏离本发明的真正主旨或技术教导的情况下，可根据本领域技术人员的知识配置本发明的其他实施方案，本发明仅受所附权利要求的条款限制。
实施例1：从细菌发酵中纯化3-岩藻糖基乳糖
HMO 3-岩藻糖基乳糖是通过细菌发酵产生的，并且通过过滤从发酵液中除去细菌。为了除去细菌细胞，发酵液通过使用标称孔径为0.05μm的聚醚砜膜(
MP005；Microdyn-Nadir,Wiesbaden)进行微滤，随后使用中空纤维组件(ULTRADYN FS-10-FS FUS-1582,150kDa MWCO；Microdyn-Nadir,Wiesbaden,Germany)进行超滤。
然后通过渗滤和纳滤步骤对无细胞液体进行处理，以除去盐和较小的分子，从而提高3-FL的纯度。RO40404型反渗透系统(Aqmos GmbH,Rodgau,Germany)配备有FilmtecTMNF270纳滤组件。入口压力设置为8巴，溶液以等体积的反渗透水处理3次，以通过将起始体积减半来增加浓度。然后将3-FL溶液通过FS-10-FS FUS018110kDa中空纤维纳滤组件(Microdyn-Nadir)，以除去蛋白质和肽。
通过使用配备PCCell ED 1000A膜堆的PCCell P15系统(PCCell GmbH,Heusweiler,Germany)的电渗析从工艺流中除去与3-FL大小相似的离子，该膜堆包含CEM:PCSK阳离子交换膜和尺寸排阻极限为60Da的CEM:PcAcid60阴离子交换膜。起始溶液的电导率为8至11mS/cm2，电渗析持续进行直到电导率降至0.5mS/cm2。
然后用活性炭粉末处理3-FL溶液以除去色素。将溶液与Norit DX1活性炭一起搅拌2小时，然后过滤除去活性炭。
使用与上述相同的设置进行另一轮电渗析。起始溶液的电导率为1.0-1.5mS/cm2，电渗析持续进行直到电导率降至0.3mS/cm2。
电渗析后，通过使用配备有CSM RE8040BE反渗透组件的Emrich EMRO 1.8反渗透系统(Emrich Edelstahlbau,Polch,Germany)进行反渗透来浓缩3-FL溶液。将溶液浓缩直至过滤系统的流速降至低于50L/h。浓缩后的干物质为20-25重量％。对于喷雾干燥(参见实施例2)，使用Hei-VAP工业蒸发器(Heidolph Instruments GmbH,Schwabach,Germany)将3-FL溶液进一步浓缩至干物质为45重量％。将该高浓度3-FL溶液通过5kDa Spira-Cell WYUP005 2440 C超滤膜(Microdyn-Nadir)进行过滤灭菌以除去内毒素。
图6和图7示出通过该方法从澄清的发酵液中纯化的3-岩藻糖基乳糖的HPLC色谱图。图6示出了澄清发酵液的HPLC色谱图，而图7示出了，从得到图6所示HPLC色谱图的澄清发酵液中获得的无菌过滤工艺流的HPLC色谱图。这些色谱图的比较表明，澄清发酵液的HPLC色谱图中的大多数峰(每个峰代表至少一种化合物)在无菌过滤的工艺流的HPLC色谱图中是不存在的。
实施例2：通过喷雾干燥获得固体形式的3-岩藻糖基乳糖。
如实施例1所述，将通过过滤和电渗析获得的3-FL溶液浓缩至45重量％，且过滤灭菌以除去任何生物负载和内毒素。然后使用LTC-GMP喷雾干燥器(Nubilosa,Konstanz,Germany)将高度浓缩且无菌的3-FL溶液喷雾干燥。在130℃和3.5巴下，使45重量％的3-FL溶液通过喷雾干燥器喷嘴，并调节流量以保持排气温度为66-67℃。使用这些设置，获得水分含量低于5％的喷雾干燥粉末。水分含量通过卡尔费休(Karl-Fischer)滴定法测定。
Claims (17)
1.一种从发酵液中纯化目标寡糖的方法，该方法包括：
-提供一种发酵液，该发酵液含有目标寡糖、生物质、微生物细胞以及除目标寡糖以外的其他碳水化合物；
-从发酵液中除去微生物细胞，从而提供工艺流；
-使用纳滤膜对工艺流进行第一个过滤步骤，从而提供含有目标寡糖的滤液；
-使用纳滤膜对滤液进行第二个过滤步骤，从而提供含有目标寡糖的截留物；和
-使用电渗析从工艺流中除去盐，从而提供目标寡糖的纯化制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过使发酵液经历至少一个离心步骤和/或至少一个过滤步骤，以从发酵液中除去微生物细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一个过滤步骤是微滤，优选使用具有约500kDa的截留分子量、更优选约150kDa的截留分子量的膜进行微滤。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述工艺流经历至少一个超滤步骤，使用具有约50kDa的截留分子量，优选约30kDa的截留分子量，更优选10kDa的截留分子量的膜。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在第一个过滤步骤中使用的所述纳滤膜具有约700道尔顿至约3,000道尔顿的截留分子量，优选约1,000和约2,000道尔顿的截留分子量。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在第二个过滤步骤中使用的所述纳滤膜具有100道尔顿至1,000道尔顿的截留分子量，优选约150道尔顿和约500道尔顿的截留分子量，更优选约200和约300道尔顿的截留分子量。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述目标寡糖是中性寡糖或唾液酸化寡糖，优选中性HMO或唾液酸化HMO，更优选HMO选自2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2’,3-二岩藻糖基乳糖、乳-N-三糖II、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻戊糖I、乳-N-新岩藻戊糖、乳-N-岩藻戊糖II、乳-N-岩藻戊糖III、乳-N-岩藻戊糖V、乳-N-新岩藻戊糖V，乳-N-二岩藻己糖I、乳-N-二岩藻己糖II、6’-半乳糖基乳糖、3’-半乳糖基乳糖、乳-N-己糖和乳-N-新己糖、3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖、唾液酸乳糖-N-四糖a、唾液酸乳糖-N-四糖、唾液酸乳糖-N-四糖c、3-岩藻糖基-唾液酸乳糖、二唾液酸-乳-N-四糖和岩藻糖基-LSTb，或表1中列出的任何其他HMO。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中对所述工艺流进行第二个过滤步骤，使得
i)截留物中盐的量为<10重量％，优选<5重量％，更优选≤2重量％，和/或
ii)电导率为0.5至10.0mS/cm2，优选1至8mS/cm2，更优选1.5至4.0mS/cm2。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中对所述工艺流进行浓缩步骤，优选通过反渗透和/或额外的纳滤步骤进行浓缩，优选通过使用截留分子量在200至300Da范围内的纳滤膜进行纳滤步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其中在以下条件下进行浓缩步骤
-进行纳滤的温度为<80℃，优选<50℃，更优选4℃至45℃，更优选10℃至40℃，甚至更优选15至30℃，最优选15至20℃；和/或
-进行反渗透的温度为20℃至50℃，更优选30℃至45℃，最优选35℃至45℃；和/或
-在>5巴至<50巴压力下，优选在>10巴至<40巴压力下，更优选在>15至<30巴压力下。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中对所述工艺流进行浓缩步骤，使得目标寡糖的浓度为≥100g/L，优选≥150g/L，更优选≥200g/L。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中对所述工艺流进行除去着色剂的步骤，优选通过用活性炭处理所述工艺流。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述除去着色剂的步骤的进行如下：
i)在渗滤步骤之前或之后；
ii)在浓缩工艺流的步骤之前或之后；和/或
iii)在电渗析步骤之前或之后。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述电渗析是中性条件下的电渗析或酸性条件下的电渗析。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中在除去其中包含的盐之后的工艺流
i)包含盐的量为<1重量％，优选<0.5重量％，更优选<0.2重量％；和/或
ii)所具有的电导率为0.05至1.0mS/cm2，优选0.1至0.5mS/cm2，更优选0.2至0.4mS/cm2。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述工艺流被喷雾干燥，优选在以下条件下喷雾干燥：
i)入口温度范围为110-150℃，优选120-140℃，更优选125-135℃，出口温度范围可为60-80℃，优选65-70℃；和/或
ii)在工艺流中目标寡糖的浓度为5-60重量％，优选10-50重量％，更优选15-45重量％。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在纯化制剂中的目标寡糖的纯度为≥80重量％，优选≥85重量％，更优选≥90重量％，基于纯化制剂的干物质计。
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