JP2022533240A - ろ過の使用による発酵ブロスからのオリゴ糖の精製 - Google Patents

Abstract

オリゴ糖、好ましくは中性ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）又はシアル化ＨＭＯを発酵ブロスから精製するための方法であって、前記方法は、－ 目的オリゴ糖、バイオマス、微生物細胞、及び目的オリゴ糖以外の糖質を含有する発酵ブロスを用意し；－ 前記発酵ブロスから微生物細胞を除去することによってプロセスストリームを提供し；－ 前記プロセスストリームをナノろ過膜を用いる第一のろ過工程に付すことによって目的オリゴ糖を含有するろ液を提供し；－ 前記ろ液をナノろ過膜を用いる第二のろ過工程に付すことによって目的オリゴ糖を含有する保持液を提供し；そして、－ 前記プロセスストリームから電気透析を用いて塩を除去することにより、目的オリゴ糖の精製調製物を提供することを含む。【選択図】図１

Description

本発明は、工業規模での微生物発酵によるオリゴ糖の製造に関する。さらに詳しくは、本発明は、ろ過法の使用による発酵ブロスからの目的オリゴ糖の精製に関する。

ヒトミルクは、糖質（炭水化物）、脂肪、タンパク質、ビタミン、ミネラル及び微量元素の複合混合物である。糖質画分は最も豊富な固体画分で、さらにラクトースとより複雑なオリゴ糖、いわゆるヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）に分けることができる。

ラクトースはエネルギー源として使用されるが、複合オリゴ糖は乳児にも又は成人にも代謝されない。複合オリゴ糖の画分は全糖質画分の最大１０％を占め、おそらく１５０を超える異なるオリゴ糖からなる。これらの複合オリゴ糖の存在及び濃度はヒトに特有であるので、飼育されている乳畜のような他の哺乳動物の乳中には大量には見出されない。ＨＭＯは全ヒトミルクの少量画分に過ぎないが、母乳で育てられた乳児の発育に及ぼすそれらの非常に有益な効果が過去数十年の間に明らかになっている。

最も際立ったＨＭＯは２’－フコシルラクトースである。その他の顕著なＨＭＯは、３－フコシルラクトース、ジフコシルラクトース、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース及びラクト－Ｎ－フコペンタオースである。これらの中性オリゴ糖のほか、酸性ＨＭＯもヒトミルク中に見出される。例えば、３’－シアリルラクトース、６’－シアリルラクトース及びシアリルラクト－Ｎ－テトラオース、例えばＬＳＴ－ａ、ＬＳＴ－ｂ及びＬＳＴ－ｃなどである（表１）。ヒトミルクの全ＨＭＯ含量の最大２０％は、少なくとも一つのシアル酸部分の存在のために酸性である。これらの構造は、上皮細胞表面複合糖質のエピトープ（ルイス式血液型抗原）に密接に関連しており、ＨＭＯと上皮エピトープとの間の構造的相同性は、ＨＭＯの細菌性病原体に対する保護能力を説明する（Ｗｅｉｃｈｅｒｔら ２０１３，Ｎｕｔｒ．Ｒｅｓ．３３：８３１；Ｗｅｉｃｈｅｒｔら ２０１６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９０：４８４３）。

ヒトミルク中における複合オリゴ糖の存在は古くから知られており、ＨＭＯの生理学的機能は何十年もの間、医学研究の主題であった（Ｇｕｒａ ２０１４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４５：７４７；Ｋｕｎｚ ＆ Ｅｇｇｅ ２０１７，Ｉｎ ＭｃＧｕｉｒｅ，ＭｃＧｕｉｒｅ ＆ Ｂｏｄｅ（編） Ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｉｌｋ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．３－１６）。より豊富な一部のＨＭＯについては特定機能が既に同定されている（Ｂｏｄｅ ２０１２，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２２：１４７；Ｂｏｄｅ ＆ Ｊａｎｔｓｃｈｅｒ－Ｋｒｅｎｎ ２０１２，Ａｄｖ．Ｎｕｔｒ．３Ｓ：３８３；Ｍｏｒｒｏｗら ２００４，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１４５：２９７）。感染性因子（細菌、ウイルス及び細菌毒素）を阻害するそれらの生理学的能力、脳の発達に対するそれらのプラス効果及びそれらのプレバイオテック機能のために、ＨＭＯを食品、特に乳児用栄養製品に含めることへの大きな需要がある。表１に、本明細書中に開示された方法によって発酵ブロスから精製できるＨＭＯの概要を提供する。

表１．本明細書中に開示された方法によって精製できるヒトミルクオリゴ糖のリスト
個々のＨＭＯの供給が限られており、これらの分子を十分な量で調達できないことが、化学合成に基づいてそれらを生成する方法の開発につながった。しかしながら、ＨＭＯの化学合成、特にＨＭＯを食品用途に十分な量で大規模生産することは、極めて課題が多いことが判明した。特に、２’－ＦＬのようなＨＭＯの化学合成（ＷＯ２０１０／１１５９３５ Ａ）は、数種類の有害化学物質を必要とするので、最終製品が汚染されかねない。

化学合成の弱点により、酵素及び発酵に基づく幾つかの方法が開発された（Ｍｉｙａｚａｋｉら ２０１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４８０：５１１；Ｍｕｒａｔａら １９９９，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１６：１８９；Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒら ２０１３，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．１２：４０；Ｌｅｅら ２０１２，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．１：４８；Ａｌｂｅｒｍａｎｎら ２００１，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３３４：９７；ＵＳ ７，５２１，２１２ Ｂ１；Ｆｉｅｒｆｏｒｔ ＆ Ｓａｍａｉｎ ２００８，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３４：２１６）。しかしながら、これらの方法からは、オリゴ糖の複合混合物が得られるので、所望生成物は、ラクトースなどの出発物質のほか、中間体、望まざる副産物（例えばある種のグリコシルトランスフェラーゼの副活性に由来する副産物）及び発酵法に由来する基質、例えばタンパク質、ポリペプチド、有機酸、及び塩で汚染されている。

個別のオリゴ糖を混合物から精製するための多くの現行法は、技術的に複雑、規模拡大困難、及び食品用途には非経済的である。二糖類のラクトース及びスクロースをそれぞれ乳清及び糖蜜から精製するための工業規模の方法は開発されているが、これらの方法は、手のかかる多数の結晶化工程を必要とする上に低収率しか達成しない。しかしながら、乳清も糖蜜も“食品グレード”の出発物質であり、組換え細菌又は酵母を含有する発酵ブロスほどの複雑さ及び要求の厳しさ（規制上の要件に関して）からはかけ離れている。ゲルろ過クロマトグラフィーは、微生物発酵によって製造されたＨＭＯなどの複合オリゴ糖の精製に最良の方法であるが、この方法のデメリットは、その拡張性の欠如と、連続処理との不適合性などである。従って、ゲルろ過クロマトグラフィーは非経済的であり、工業規模でＨＭＯを生産するために使用することはできない。

理論的には、ゲルろ過クロマトグラフィーが微生物発酵によって製造されたＨＭＯなどの複合オリゴ糖の精製に最良の方法であるが、ゲルろ過クロマトグラフィーのデメリットは、その拡張性の欠如と、連続処理との不適合性などである。従って、ゲルろ過クロマトグラフィーは非経済的であり、工業規模でＨＭＯを生産するために使用することはできない。

微生物発酵によるＨＭＯの効率的な製造法の開発に続いて、その次の論理的手順は培養ブロスからＨＭＯを単離するための効率的な下流工程の開発であった。
ＷＯ２０１５／０４９３３１ Ａに、中性ＨＭＯの精製法が開示されている。該方法は、大量のＨＭＯの連続的で効率的な精製を達成するために、イオン交換、電気透析及び擬似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィーを利用している。中性ＨＭＯを製造するための化学合成経路及びその後のそれらの精製とは異なり、記載された発酵及び精製法は、微量重金属及び有機溶媒などの有害化学物質を含まないＨＭＯの提供を可能にしている。該精製法により、食品用途に使用できる高純度のＨＭＯ製品が固形（噴霧乾燥により）又は濃縮シロップとして得られる。

ＷＯ２０１５／１０６９４３ Ａに、微生物発酵によって製造された中性ＨＭＯを精製するための簡素な方法が記載されている。該方法は、カチオン交換、アニオン交換及びナノろ過及び／又は電気透析の組合せを使用することにより、大量の中性ＨＭＯの効率的な精製を可能にしている。微生物発酵によって製造された中性ＨＭＯの初期の精製法とは異なり、該方法はクロマトグラフィー分離工程を含んでいない。該方法により、固形のＨＭＯが噴霧乾燥物質として、結晶性物質として、又はろ過滅菌濃縮物として得られる。得られたＨＭＯは、製造に使用された組換え微生物株に由来するタンパク質及び材料を含まないので、食品、医療用食品及び飼料（例えばペットフード）用途に理想的である。

ＷＯ２０１６／０９５９２４ Ａに、結晶化による２’－ＦＬの精製法が記載されている。ＨＭＯは微生物発酵によって製造され、バイオマスの除去後、ナノろ過及び電気透析によって濃縮された。最後に、２’－ＦＬは、２’，３－ジ－Ｏ－フコシルラクトース（ＤＦＬ）も含有する水溶液から酢酸を用いて選択的に結晶化された。

ＬＮＴとＬＮｎＴは、活性炭への選択的結合とその後の有機溶媒による溶離及びゲルろ過クロマトグラフィーによる分離によって、糖質副産物から分離することができる（Ｐｒｉｅｍら ２００２，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：２３５；Ｇｅｂｕｓら ２０１２，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３６１：８３；Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒら ２０１４，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １５：１８９６）。前述のように、ゲルろ過クロマトグラフィーは便利な実験室規模での方法であるが、工業生産用に効率的に規模拡大することはできない。

ＷＯ２０１５／０４９３３１ Ａには、細菌発酵によって製造されたＬＮＴを精製して透明な無粒子溶液を提供するための下記一連の操作、すなわち、電気透析、ナノろ過、強カチオン交換樹脂を使用する擬似移動床クロマトグラフィー（ＳＭＢ）、電気透析、限外ろ過及び２回目のＳＭＢクロマトグラフィー工程が開示されている。

酸性ＨＭＯ、特にシアル化ラクトース又はシアル化オリゴ糖の単離についても様々な方法が記載されている。
ＵＳ２００７／００２０７３６ Ａには、遺伝子組換え大腸菌株の副産物としてジシアル化及びトリシアル化ラクトースを伴う３’－ＳＬの製造が開示されている。３’－ＳＬは、培養ブロス中に～０．８ｍＭの濃度まで蓄積した。３’－ＳＬは下記工程を用いて精製された。すなわち、遠心分離、上清を活性炭に通すことによる吸着と蒸留水による水溶性塩の洗い流し、水性エタノールでの勾配溶離、そして最後にＢｉｏｇｅｌカラムでの分離と脱塩。１Ｌのブロスからの収量は４９ｍｇの３’－ＳＬであった。

別の開示法は、遺伝子組換え大腸菌株を用いた３’－ＳＬの製造とその後の細胞の熱透過化(heat permeabilization)とそれに続く遠心分離による単離を含むものである（Ｐｒｉｅｍら ２００２，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：２３５）。上清中の物質を活性炭に吸着させ、水溶性塩を蒸留水で洗い流した。水性エタノールでの勾配溶離後、３’－ＳＬをＨＣＯ_３ ^－（炭酸水素イオン）形の強アニオン交換体に吸着させ、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）の直線的勾配で溶離した。後者をカチオン交換によって除去し（酸性形の樹脂を用いて）、３’－ＳＬを４９％の回収効率で得た。

発酵ブロスから出発する代替手順は、熱透過化、遠心分離、酸性形の強カチオン交換樹脂の添加によりｐＨを３．０に調整、及び遠心分離による沈殿タンパク質の除去の工程を含むものであった（Ｆｉｅｒｆｏｒｔら ２００８，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３４：２６１）。次に、上清のｐＨを塩基性形の弱アニオン交換体の添加により６．０に調整し、３’－ＳＬをＨＣＯ_３ ^－形のアニオン交換体に結合させた。蒸留水による洗浄とそれに続く連続的ＮａＨＣＯ_３勾配での溶離後、ｐＨが３．０に低下するまでＮａＨＣＯ_３をカチオン交換（酸性形の樹脂を用いて）により除去した。最後に、ｐＨをＮａＯＨで６．０に調整した。この精製法により、３’－ＳＬの回収効率５９％を達成した。

酵素的に製造された３’－ＳＬもナノろ過によってラクトースから分離されている（Ｎｏｒｄｖａｎｇら ２０１４，Ｓｅｐａｒ．Ｐｕｒｉｆ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３８：７７）。著者は、２種類の異なるナノろ過膜、すなわち一つは分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）が６００～８００Ｄａの膜（スルホン化ポリエーテルスルホン（ＳＰＥＳ）膜）、他方はＭＷＣＯが１０００～１４００Ｄａの膜（ＳＰＥＳ膜）によって、大部分の３’－ＳＬが透析ろ過後にラクトースから分離できることを示した。しかしながら、この工程中に相当の３’－ＳＬの損失があり、純度も低く、追加のイオン交換精製工程が必要であった。

ＷＯ２０１０／１０６３２０ Ａ２には乳清から３’－ＳＬを濃縮する方法が記載されている。最初に、タンパク質を限外ろ過によって除去し、次いで清澄化乳清透過液（ホエイパーミエート）をイオン交換樹脂とインキュベートして３’－ＳＬを捕捉する。イオン交換材料からの溶離後、濃縮３’－ＳＬ画分をナノろ過によって濃縮し、濃縮液を脱塩する。脱塩後、３’－ＳＬを濃縮及び乾燥させ、３’－ＳＬ含量２０ｗｔ％の最終乾燥生成物を得る。

ＷＯ２０１８／０２０４７３ Ａには、３’－ＳＬと６’－ＳＬを液体原料から濃縮するための追加の方法が記載されている。二つのＨＭＯをラクトース結晶化の母液から該溶液の加熱、酵素処理及び追加の限外ろ過とナノろ過工程によって単離した。濃縮後、３’－ＳＬと６’－ＳＬの含量は乾燥質量の１０～３０ｗｔ％であった。

この先行技術から出発して、微生物発酵によって製造された目的オリゴ糖、特に中性ＨＭＯ又はシアル化ＨＭＯを精製するための方法、この場合、規模拡大が容易で、前記目的オリゴ糖の商業規模又は工業規模での製造に適しており、そしてヒトの食用に適切な製品にできる純度を備えた生成物をもたらしうる精製法を提供することが目的であった。

微生物発酵ブロス、特に組換え微生物（細菌又はパン酵母のような真核微生物）を含有するものは、乳製品由来のプロダクトストリームよりもはるかに複雑であることは強調されねばならない。例えば、乳清の組成は、～９４％の水、４～５％のラクトース、０．５～１％のタンパク質と、いくつかのビタミンのほかにカルシウム、カリウム及びリンなどのごくわずかな明確に定義されたミネラルであり、乳製品の工程流（ストリーム）でただ濃縮及び脱塩されるだけの単純なマトリックスである。これに対し、組換え微生物発酵法から得られた糖溶液のマトリックスは高度に複雑で、まず法律による要件を手始めに組換えバイオマスを分離し、政府規制に従ってそれを不活化する。得られた清澄化ブロスは、様々な塩及びイオンと重金属及び微量元素も含有する定義不明確なマトリックスである。その上、そのような液体の課題は、細胞残屑、膜フラグメント、例えば脂質、タンパク質、微生物細胞代謝に由来する分子、及び特にＤＮＡの除去である。遺伝子組換え細菌のような組換え処理の助けを借りて製造されたオリゴ糖の回収は、ゆえに、乳清や乳製品のストリームと比べてなお一層困難である。なぜならば、ブロス内の夾雑物質は、分子量、荷電分子（単荷電及び多荷電）及び着色分子に関して非常に多種多様であるからである。

国際特許出願公開第２０１０／１１５９３５号 Ａ 米国特許第７，５２１，２１２号 Ｂ１ 国際特許出願公開第２０１５／０４９３３１号 Ａ 国際特許出願公開第２０１５／１０６９４３号 Ａ 国際特許出願公開第２０１６／０９５９２４号 Ａ 国際特許出願公開第２０１５／０４９３３１号 Ａ 米国特許出願公開第２００７／００２０７３６号 Ａ 国際特許出願公開第２０１０／１０６３２０号 Ａ２ 国際特許出願公開第２０１８／０２０４７３号 Ａ

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本発明は、組換え発酵株を用いる微生物発酵によって得られた培養ブロス又は発酵ブロスから、発酵によってバッチ式又は連続式に製造された目的オリゴ糖を精製するための方法を提供する。前述した精製法は、高価なイオン交換工程を使用することが多い（カチオン交換体及びアニオン交換体の両方を必要とする）。イオン交換体は、再生を必要とするので連続的に運転できない。培養ブロスは、目的オリゴ糖、バイオマス、培地成分、塩、及びその他の酸や色素などの夾雑物質を含有している。

精製法の間に、培養ブロスは目的オリゴ糖を得るために下記の精製工程を受けることができる。
１）精密ろ過による培養ブロスからの微生物細胞の分離
２）限外ろ過による清澄化培養ブロス（＝プロセスストリーム）からのタンパク質の分離
３）ペプチド及び高分子量（ＨＭＷ）不純物を除去するための第一のナノろ過工程
４）水及び塩を除去するための第二のナノろ過工程
５）色素及びその他の不純物を除去するための活性炭処理
６）夾雑塩の完全除去のためのナノろ過膜を用いる電気透析又は透析ろ過
７）逆浸透による水の除去
さらに、活性炭処理の前に別の電気透析工程を導入して、夾雑イオンの量を減少させることもできる。水溶液中での精製後、固形の目的オリゴ糖を用意するために、該材料は噴霧乾燥又は顆粒化できる。

図１は、本発明による方法の例示的態様のプロセススキームを示す。 図２は、本発明による方法の別の例示的態様のプロセススキームを示す。 図３は、本発明による方法の別の例示的態様のプロセススキームを示す。 図４は、本発明による方法の別の例示的態様のプロセススキームを示す。 図５は、本発明による方法の別の例示的態様のプロセススキームを示す。 図６は、３－フコシルラクトースを含有する清澄化発酵ブロスのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 図７は、本発明による方法の例示的態様によって発酵ブロスから精製された後の３－フコシルラクトースのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

本発明によれば、用語“純度”は化学的純度を指し、２’－ＦＬ、３－ＦＬ、ＤＦＬ、ＬＮＴ、３’－ＳＬ、６’－ＳＬ又は任意のその他の目的オリゴ糖（表１）のような物質が外来物質で希釈されていない又は外来物質と混合されていない程度を規定する。従って、化学的純度は、単一物質と任意の副産物／不純物との間の関係の指標である。化学的純度はパーセンテージ（％）で表され、下記式を用いて計算される。

パーセント純度＝［所望生成物の質量／サンプルの全質量］×１００
目的オリゴ糖を含む組成物における当該化合物の純度は当業者に公知の任意の適切な方法、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定できる。適切な検出器は、電気化学検出器、屈折率（ＲＩ）検出器、質量分析計（ＭＳ）、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）、及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出器からなる群から選ぶことができる。例えば、ＨＰＬＣでは、純度は、標的ピーク下の面積（目的オリゴ糖の量を表す）の、全ピーク下面積の合計（目的オリゴ糖及び同じクロマトグラムでこの物質とは異なる化合物の量の両方を表す）に対する比率を計算することによって決定できる。しかしながら、これは、選択されたＨＰＬＣ法によって全不純物が分析できることを意味する。それ以外の場合、物質収支法、すなわち所望生成物の絶対定量が必要である。前記手法では、純物質を純度の定量のための基準として使用し、それに照らして生成物（所望生成物＋全不純物）から得られた乾燥物質を判定する。前記物質収支法は、本発明による純度の決定にも使用できる。

本発明によれば、“培養ブロス”又は“発酵ブロス”は、精製される２’－ＦＬ、３－ＦＬ、ＤＦＬ、ＬＮＴ、３’－ＳＬ、６’－ＳＬ又は任意のその他の目的オリゴ糖（表１）を含有する発酵後の任意の液体を指す。用語“培養ブロス”、“発酵ブロス”及び“培地”は本明細書においては同義語として使用される。培養ブロスは、精製されるべき目的オリゴ糖のほか、バイオマス（例えば生物細胞及び細胞残屑）、培地成分、塩、及びその他の酸や色素などの更なる夾雑物質を含む。培養ブロスに含有される生物細胞は、目的オリゴ糖を細胞内に産生し、この化合物を液体培地に分泌する生物細胞である。生物細胞は、遺伝子組み換えされた生物細胞、例えば遺伝子組換え大腸菌細胞を含む又はそれからなることができる。遺伝子組換えは、目的オリゴ糖を特に前記生物細胞の増殖期に産生するための改変を含む又はそれからなることができる。

本明細書中で使用されている用語“バイオマス”は、発酵工程の終了時に発酵ブロス中に存在する生物細胞の全体を指す。バイオマスは、目的オリゴ糖を産生した微生物細胞、この微生物の子孫で発酵工程中に目的オリゴ糖の産生能力を失ってしまったかもしれない細胞、ならびに発酵工程の終了時に発酵ブロス中に意図せずに存在する任意のその他の細胞を含む。そこで、発酵工程の終了時に発酵ブロス中に存在する本質的にすべての生物細胞は、“プロセスストリーム”（精製されるべき目的オリゴ糖を含む又は含有する任意の溶液）として知られる清澄化発酵ブロスが実質的に又は完全に細胞を含まないように発酵ブロスから分離される。

バイオマスは、好ましくは、目的オリゴ糖を産生する生物細胞、好ましくは目的オリゴ糖を産生する細菌細胞、さらに好ましくは目的オリゴ糖を産生する組換え細菌細胞、最も好ましくは目的オリゴ糖を産生する組換え大腸菌細胞を含む。

バイオマス及び／又は微生物細胞は発酵ブロスから遠心分離及び／又はろ過によって除去できる。
培養ブロスからのバイオマスの除去に適切な遠心分離法では、バイオマスはペレットとして、上清は清澄化プロセスストリームとして得られ、それが更なる処理に付される。培養ブロスからバイオマスを除去するための適切なろ過法では、ろ液が清澄化プロセスストリームとなる。バイオマス除去のための好適なろ過法は、精密ろ過及び／又は限外ろ過で、後者の方が精密ろ過よりさらに小粒子も、そして大型分子も除去する能力がある。精密ろ過及び限外ろ過は、デッドエンドろ過方式（プロセスストリームはフィルターに垂直に流れる）又はクロスフローろ過方式（プロセスストリームはフィルターに平行に流れる）で操作できる。

精密ろ過は、粒子含有液を媒体に通過させる物理的分離法で、前記媒体は、粒子を保持するための蛇行チャンネルを含有する多孔性物質（デプスろ過）及び／又は特定の孔径を有し、前記孔径よりも小さい粒子／分子を通過させる膜（膜ろ過）のいずれかを含む。本明細書中で使用されている用語“精密ろ過”は、生物細胞（及び細胞残屑）が発酵ブロスから除去されて（清澄化）プロセスストリームを残す物理的分離法のことを言う。

精密ろ過によるバイオマスの除去に適切な膜は、少なくとも０．２μｍの孔径を有しうる中空糸膜又はスパイラル膜(spiral-wound membrane)でありうる。あるいは、バイオマスの除去は、ＭＷＣＯが１００～１０００ｋＤａ、好ましくは１５０～５００ｋＤａの膜を用いて、バイオマス、追加の細胞残屑及び大型タンパク質を除去する精密ろ過によって達成することもできる。例えば、コンパクトな設計とより良い性能を提供するためにスパイラル巻きにされているＴＲＩＳＥＰ（登録商標）ＤＳ ＭＶＰ２０（孔径０．２μｍ）（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ－Ｎａｄｉｒ ＧｍｂＨ社、ドイツ・ヴィースバーデン）のような膜を使用して、培養ブロスから細胞を除去することができる。また、ＰＥＳ膜と公称孔径０．０５μｍを含むモジュールであるＴＲＩＳＥＰ（登録商標）ＤＳ ＭＰ００５のような孔径０．０５～０．１μｍのスパイラル膜もバイオマス及びタンパク質の分離に使用することができる。

さらに、ＭＷＣＯが１５０ｋＤａのＰＥＳ膜（５ｍ^２）を用いる中空糸ろ過モジュールであるＦＳ１０－ＦＣ ＦＵＳ１５８２（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ－Ｎａｄｉｒ ＧｍｂＨ社）のような中空糸モジュールも代わりに使用することができる。

要約すると、発酵ブロスからバイオマスを除去するために下記の可能性が本発明に適用できる。
ｉ）遠心分離による回収．不溶性成分が培養ブロスから一段階（ワンステップ）で除去される。利点：不溶性成分の迅速除去。

ii）精密ろ過による回収．不溶性成分と一定サイズを超える大型分子が培養ブロスから一段階で除去される。スパイラル膜又は中空糸クロスフローフィルターがＭＷＣＯ≧５００ｋＤａの精密ろ過に使用できる。利点：不溶性成分と一定サイズを超える大型可溶性分子の迅速除去。

iii）遠心分離と精密ろ過の組合せによる回収．不溶性成分と一定サイズを超える大型分子が培養ブロスから二段階で除去される。スパイラル膜又は中空糸クロスフローフィルターがＭＷＣＯ≧５００ｋＤａの精密ろ過に使用できる。利点：精密ろ過膜の目詰りなく不溶性成分と一定サイズを超える大型分子の迅速除去。

限外ろ過は、精密ろ過と基本的に異ならない膜ろ過の形態である。限外ろ過では、圧力及び濃度勾配によって生じた力で、粒子及び大型可溶性分子を含有する液体を半透膜に通すことによってそのような粒子及び大型可溶性分子を除去する。これによって、粒子及び大型可溶性分子はいわゆる保持液中に留まるが、水及び低分子量（ＬＭＷ）溶質、例えば産生された中性及び酸性オリゴ糖は膜を通過して透過液（ろ液）に入る。限外ろ過用の膜はそれらのＭＷＣＯによって規定される。ＭＷＣＯは、膜を通過して透過液に入ることができる可溶性分子の最大分子量を表す。ＭＷＣＯより大きい分子と同様の任意の粒子も膜を通過できず、保持液中に留まる。限外ろ過は、液体の流れが膜表面に平行なクロスフローモード、又は液体の流れが膜表面に垂直なデッドエンドモードで適用できる。

産生された目的オリゴ糖を含む清澄化プロセスストリームは通常、相当量の望まざる不純物を含有する。例えば、一価イオン、二価イオン、アミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、有機酸、核酸、単糖及び／又はオリゴ糖などであるが、これらに限定されない。

限外ろ過による大部分のタンパク質の除去に適切な膜は、少なくとも５０ｋＤａ、好ましくは少なくとも３０ｋＤａ、さらに好ましくは１０ｋＤａのＭＷＣＯを有し、中空糸膜又はスパイラル膜でありうる。例えば、ＳＰＩＲＡ－ＣＥＬ（登録商標）ＤＳ ＵＰ０１０（ＭＷＣＯ＝１０ｋＤａ）又はＳＰＩＲＡ－ＣＥＬ ＤＳ ＵＰ００５（ＭＷＣＯ＝５ ｋＤａ）（どちらもＭｉｃｒｏｄｙｎ－Ｎａｄｉｒ ＧｍｂＨ社により販売）のような膜は、コンパクトな設計とより良い性能を提供するためにスパイラル巻きであり、これらを用いて無細胞培養ブロスから残存タンパク質を分離することができる。

さらに、ＲＯＭＩＣＯＮ（登録商標）ＨＦ ＵＦ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ＰＭ１０（Ｋｏｃｈ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国ウィルミントン；最大１２ｍ^２の面積と１０ｋＤａのＭＷＣＯを有するＰＥＳ膜）のような中空糸モジュールを代わりに使用することもできる。

ナノろ過は、膜がナノメートルサイズの細孔（１～１０ｎｍ）を含有する膜ろ過法である。ナノろ過膜の孔径は精密ろ過膜及び限外ろ過膜のそれよりも小さいが、逆浸透に使用される膜のそれよりも大きい。ナノろ過膜は、主に、ポリエチレンテレフタレートのようなポリマー又はアルミニウムのような金属の薄膜から製造され、細孔密度は１ｃｍ^２あたり１～１０^６孔である。

ナノろ過が目的オリゴ糖の精製法に使用されるのは、ペプチド及び塩のようなＬＭＷ不純物を除去するため、及び清澄化プロセスストリーム又は溶出液中のオリゴ糖の濃度を増大させるためである。

大部分のＨＭＯの分子量は４００から１，２００Ｄａの範囲である。プロセスストリームからペプチド及び色素のようなＨＭＷ不純物（＞１２００Ｄａ）ならびに塩のようなＬＭＷ不純物（＜４００Ｄａ）を除去するために、少なくとも二つのナノろ過工程が必要である。

限外ろ過後、＞５ｋＤａ又は＞１０ｋＤａ（使用される膜による）のすべての分子は、プロセスストリームから除去されているはずである。ペプチド及び色素のような、この閾値未満であるが目的オリゴ糖よりまだ大きい不純物を除去するために、第一のナノろ過工程は、オリゴ糖を透過液に通過させるがＨＭＷ不純物は保持液中に留まらせるＭＷＣＯを用いて実施することができる。

所望オリゴ糖の大部分をＨＭＷ不純物から分離し、所望オリゴ糖の収量を増大させるには、生成物の＞７０％、好ましくは＞８０％、さらに好ましくは＞９０％が膜を通過するまで方法を実行すべきである。さらに、清澄化プロセスストリーム中のオリゴ糖の収量を増大させるために、透析ろ過工程を含めることもできる。

この第一のナノろ過工程後、目的オリゴ糖を含有するプロセスストリーム中の唯一の不純物は、オリゴ糖と同じか又はそれより低い分子量のはずで、一価イオン、二価イオン、アミノ酸、有機酸、単糖及び／又はオリゴ糖を含みうる。

第一のナノろ過工程に適切な膜は、４００～１，２００Ｄａの範囲のサイズ排除を達成するポリアミド又はポリピペラジン薄膜複合膜材料などである。例えば、ＨＹＤＲＡＣｏＲｅ７０（ＭＷＣＯ＝７２０Ｄａ）又はＨＹＤＲＡＣｏＲｅ５０（ＭＷＣＯ＝１，０００Ｄａ）膜（どちらもＨｙｄｒａｎａｕｔｉｃｓ社、米国オーシャンサイド）、ＮＡＤＩＲ（登録商標）ＮＰ０１０Ｐ（ＭＷＣＯ＝１，０００～１，５００Ｄａ）又はＮＡＤＩＲ（登録商標）ＮＰ０３０Ｐ（ＭＷＣＯ＝５００～１，０００Ｄａ）膜（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ－Ｎａｄｉｒ ＧｍｂＨ社）などが挙げられる。そのような膜は高流量を可能にする。ナノろ過用に適切な膜の追加例は、Ｔｒｉｓｅｐ（登録商標）ＳＢＮＦ（ＭＷＣＯ＝２０００Ｄａ）酢酸セルロースナノろ過膜（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ－Ｎａｄｉｒ ＧｍｂＨ社）及びＳｕｅｚ Ｗａｔｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＆ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社（ドイツ・ラーティンゲン）のＧＥ－シリーズ膜（ＭＷＣＯ＝１０００Ｄａ）などである。

追加及び／又は代替の態様において、第一のナノろ過工程は下記パラメーターを達成する。
ｉ）目的オリゴ糖のろ過後回収率は、＞７０％、好ましくは＞８０％、さらに好ましくは＞９０％であるべきである。

ii）プロセスストリーム中の目的オリゴ糖の濃度は、＜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは＜４０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは＜３０％（ｗ／ｖ）、好ましくは＜２０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは＜１０％（ｗ／ｖ）であるべきである。

iii）該工程は、＜８０℃、好ましくは＜５０℃、さらに好ましくは４～４０℃（特にナノろ過に適切）の温度で実施されるべきである。
iv）該工程は、５～５０ｂａｒの圧力、好ましくは１０～４０ｂａｒの圧力、さらに好ましくは１５～３０ｂａｒの圧力で実施されるべきである。

方法の好適な態様において、目的オリゴ糖を含有するプロセスストリームは、第一のナノろ過工程後に第二のナノろ過工程を適用することによって濃縮及び脱塩される。目的オリゴ糖は、真空蒸発（例えば流下膜式蒸発器又はプレート蒸発器を用いて）又は逆浸透によって濃縮することもできる。これら二つの技術のデメリットは、プロセスストリームは濃縮されるが脱塩されないことである。従って、ナノろ過は、例えばサイズ排除限界＜２ｎｍの膜を用いることによって、濃縮と脱塩を同時に達成できるので好適な方法である。

目的オリゴ糖の精製法は、第一のナノろ過工程からの清澄化プロセスストリームを少なくとも一つの追加ナノろ過工程に付して、塩、より小さい分子、及び水を除去する工程を含む。好ましくは、第一のナノろ過からの溶出液（＝ろ液又は透過液）を直接第二のナノろ過工程に付して、清澄化プロセスストリームから塩及びより小さい分子を除去する。

第一のナノろ過工程に適切な膜は、Ｆｉｌｍｔｅｃ^ＴＭ ＮＦ２７０（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ社、米国ミッドランド）及びＴｒｉｓｅｐ（登録商標）ＸＮ４５又はＴＳ４０膜（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ Ｎａｄｉｒ ＧｍｂＨ社）のような、１５０～３００Ｄａの範囲のサイズ排除を達成するポリアミド又はポリピペラジン薄膜複合膜材料などである。そのような膜は高流量を可能にする。追加例は、Ｔｒｉｓｅｐ（登録商標）４０４０－ＸＮ４５－ＴＳＦ（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ－Ｎａｄｉｒ ＧｍｂＨ社）又はＧＥ４０４０Ｆ３０及びＧＨ４０４０Ｆ５０膜（Ｓｕｅｚ Ｗａｔｅｒ Ｔｅｃｈｎｏ-ｌｏｇｉｅｓ ＆ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）などである。

ナノろ過は、電気透析の前に、目的オリゴ糖を含有するプロセスストリームから相当量の塩及びＬＭＷ不純物を効率的に除去する。また、ナノろ過は、限外ろ過工程後に、ＬＭＷ夾雑物質を効率的に除去する。そのような夾雑物質の除去は目的オリゴ糖の溶液を濃縮及び脱塩するために有益である。目的オリゴ糖を濃縮するためにナノろ過を使用することで、エネルギーコスト及び加工コストは低減し、製品品質は熱暴露がより制限されるために良好となる。

本方法は水溶液から目的オリゴ糖を濃縮する。水溶液中の目的オリゴ糖の濃度は、濃縮前に≦２０％、≦１０％又は≦５％である。
追加及び／又は代替の態様において、ナノろ過による濃縮は下記パラメーターを達成すべきである。

ｉ）オリゴ糖濃度は、＞１００ｇ／Ｌ、好ましくは＞２００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは＞３００ｇ／Ｌ、最も好ましくは＞４００ｇ／Ｌ；
ii）精製溶液中の塩の量は、＜１０ｗｔ％、好ましくは＜５％、さらに好ましくは＜２％であるべきであり；及び／又は導電率は、０．５～１０．０ｍＳ／ｃｍ^２、好ましくは１～８ｍＳ／ｃｍ^２、さらに好ましくは１．５～４．０ｍＳ／ｃｍ^２であるべきである。

iii）該工程は、＜８０℃、好ましくは＜５０℃、さらに好ましくは４～４０℃（特にナノろ過に適切）の温度で実施されるべきである。
iv）該工程は、５～５０ｂａｒの圧力、好ましくは１０～４０ｂａｒの圧力、さらに好ましくは１５～３０ｂａｒの圧力で実施されるべきである。

清澄化溶液及び／又は精製溶液中の色素は、活性炭での処理によって除去できる。活性炭を用いて色素を除去することの利点は、荷電色素も非荷電（中性）色素も除去できることである。

活性炭(Activated carbon)（activated charcoalとも呼ばれる）は、吸着に利用できる表面積を増大する低容量の小細孔を生成させるために加工された炭素の形態である。典型的には、わずか１ｇの活性炭が、その高度な微孔構造のために、ガス吸着による測定で３０，００ｍ^２を超える表面積を有する。

メイラード生成物、リボフラビン及びその他のＬＭＷ不純物のような着色不純物は、活性炭粒子の表面に吸着する傾向がある。産生されたオリゴ糖とは対照的に、着色物質の量はかなり少なく、及び／又は、ほとんどの場合、疎水性挙動を示す。この事実により、着色夾雑物質はプロセスストリームからの高い除去率を有する。オリゴ糖のような水溶性物質は結合が弱いので、水で濯ぐことによって溶出し、色素を表面に吸着させたまま残すことができる。

追加及び／又は代替の態様において、目的オリゴ糖の精製法はさらに、前の精製工程からの清澄化プロセスストリーム又は溶出液を活性炭で処理して色素を除去する少なくとも一つの工程を含む。

好適な態様において、活性炭処理は、
ｉ）第二のナノろ過工程で水及び塩を除去した後に；及び／又は
ii）限外ろ過によってタンパク質を除去した後に、又は電気透析（あるいは透析ろ過工程を導入することもできる）によって残留塩を除去した後に
実施されるべきである。

中性オリゴ糖、色素及びその他の夾雑物質の除去に適切な活性炭は、（これらに限定されないが）Ｎｏｒｉｔ ＧＡＣ８３０ＥＮ（Ｃａｂｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、米国ボストン）及びＥｐｉｂｏｎ Ｙ １２×４０ ｓｐｅｚｉａｌ（Ｄｏｎａｕ Ｃａｒｂｏｎ社、ドイツ・フランクフルト）のような粒状活性炭、又はＮｏｒｉｔ ＤＸ１、Ｎｏｒｉｔ ＳＡ２（Ｃａｂｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）及びＣａｒｂｏｐａｌ ＭＢ ４（Ｄｏｎａｕ Ｃａｒｂｏｎ社）のような粉末活性炭である。

電気透析は、透析と電気分解を組み合わせたもので、溶液中のイオンを、半透膜を通り抜けるそれらの選択的エレクトロマイグレーションに基づいて分離及び濃縮するために使用できる。工業的電気透析の応用は、乳児用調製粉乳に含めるためにチーズホエイの脱ミネラル化にこの方法が使用された１９６０年代初期に遡る。更なる用途としては、ワイン、ブドウマスト（未発酵ブドウ液）、リンゴジュース及びオレンジジュースなどの飲料のｐＨ調整などである。

飲料水製造のための半塩水の脱塩及び乳児用食品製造のための乳清の脱ミネラル化が、今日では電気透析の最も普及した用途である。電気透析の基本原理は、イオン伝導のために電解質に浸漬され、直流発電機に接続された１対の電極を含む電解槽を含む。直流発電機の陽極に接続された電極はアノードで、陰極に接続された電極はカソードである。電解質溶液は、陰イオン及び陽イオンがそれぞれアノード及びカソードに移動することで発生する電流の流れを支持する。電気透析に使用される膜は本質的に、負電荷基又は正電荷基を有する多孔性イオン交換樹脂のシートであり、それぞれカチオン膜又はアニオン膜と呼ばれる。イオン交換膜は通常、ジビニルベンゼンで架橋された適切な官能基（例えば、カチオン膜のスルホン酸又はアニオン膜の第四アンモニウム基）を担持するポリスチレンマトリックスからなる。

電解質は、例えば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム及び／又はスルファミン酸を含む水溶液でありうる。電解質はカソードとアノードを取り囲み、電解槽内に電流が流れるようにしている。次に、電気透析スタックを、二つの電極ブロック間に、アニオン膜とカチオン膜がフィルタープレスでのように平行になるように組み立てる。その結果、イオン枯渇を受けるストリームとイオン濃縮を受けるストリームはよく分離される。この二つの溶液は希釈液（イオン枯渇を受ける）及び濃縮液（イオン濃縮を受ける）とも呼ばれる。

電気透析法の中心は膜スタックで、二つの電極間に設置され、スペーサーによって分離されたいくつかのアニオン交換膜とカチオン交換膜からなる。直流の印加により、アニオンとカチオンは膜を越えて電極の方向に移動し、（脱塩された）希釈液ストリームと濃縮液ストリームを生成する。

電気透析に使用されるイオン交換膜の孔径は、生成物が希釈液ストリームから濃縮液ストリームに拡散する（二つのストリーム間の高い濃度差によって推進される）のを防止するのに十分小さい。

電気透析は、中性及び酸性オリゴ糖はプロセスストリーム中に残しつつ、水溶液からイオンを除去するために使用される。電気透析の重要な利点は、目的オリゴ糖を含む溶液から組換えＤＮＡ分子を完全に除去できることである。さらに、プロセスストリーム中の塩の量は電気透析によって著しく削減できる。実際、塩化ナトリウムはプロダクトストリームから完全に除去できる。これは、目的オリゴ糖を含有する溶液を塩化ナトリウムのような塩を含まない状態で提供でき、最終製品、例えば乳児用食品中におけるその塩の悪影響を防止するという利点を有する。

ナノろ過及び活性炭処理の後、塩と有機酸のようなより小さい有機不純物の大部分はプロセスストリームから除去されているはずである。残りの塩及び小さい荷電有機物質の効果的な除去を確実にするために電気透析工程が実施される。

電気透析は、プロセスストリームが安定した導電率０．０５～１．０ｍＳ／ｃｍ^２、好ましくは０．１～０．５ｍＳ／ｃｍ^２、さらに好ましくは０．２～０．４ｍＳ／ｃｍ^２に達するまで実施できる。さらに、電気透析は、塩の濃度が＜１０．０ｇ／Ｌ、好ましくは＜５．０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは＜１．０ｇ／Ｌ、最も好ましくは＜０．２ｇ／Ｌに低下するまで実施できる。

中性オリゴ糖の場合、電気透析工程は、酸性又は中性のｐＨ条件下、好ましくはｐＨ３～８、さらに好ましくはｐＨ４～７で実施されるべきである。酸性オリゴ糖の場合、電気透析工程は、酸性オリゴ糖が酸性条件下で不安定なため、中性ｐＨ条件下、好ましくはｐＨ６～８、さらに好ましくはｐＨ６．５～７．５で実施されるべきである。酸性オリゴ糖溶液のｐＨは電気透析中も制御され、必要に応じてＮａＯＨで調整されねばならない。

目的オリゴ糖の濃縮に、ナノろ過の代わりに逆浸透工程を使用することもできる。逆浸透は、水を除去しながら、プロセスストリームの保持液中に０．１ｎｍより大きい粒子を濃縮する膜ろ過法である。従って、逆浸透は、プロセスストリームを濃縮するが脱塩は達成しない。

本方法は水性又は有機溶媒中の目的オリゴ糖を濃縮でき、目的オリゴ糖の濃度は、濃縮前に≦２０％（ｗ／ｖ）、≦１０％（ｗ／ｖ）又は≦５％（ｗ／ｖ）である。
追加及び／又は代替の態様において、濃縮工程は下記パラメーターを達成すべきである。

ｉ）オリゴ糖濃度 ＞３００ｇ／Ｌ、好ましくは＞４００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは＞５００ｇ／Ｌ、最も好ましくは＞６００ｇ／Ｌ。
ii）該工程は、＜８０℃、好ましくは＜５０℃、さらに好ましくは４～４０℃（特に逆浸透に適切）の温度で実施されるべきである。

iii）該工程は、５～５０ｂａｒの圧力、好ましくは１０～４０ｂａｒの圧力、さらに好ましくは１５～３０ｂａｒの圧力で実施されるべきである。
方法の追加及び／又は代替の態様において、中性及び酸性ＨＭＯを含有する溶液は真空蒸発によって濃縮され（例えば、回転蒸発器又はプレート蒸発器を用いて）、下記パラメーターを達成すべきである。

ｉ）オリゴ糖濃度 ＞３００ｇ／Ｌ、好ましくは＞４００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは＞５００ｇ／Ｌ、最も好ましくは＞６００ｇ／Ｌ。
ii）該工程は、＜８０℃、好ましくは＜５０℃、さらに好ましくは２０～５０℃、なおさらに好ましくは３０～４５℃、最も好ましくは３５～４５℃（特に真空蒸発に適切）の温度で実施されるべきである。

あらゆる可能性ある微生物汚染及びエンドトキシンを除去するために、濃縮された目的オリゴ糖は、限外ろ過膜に通すことによってろ過滅菌される。
本発明の好適な態様において、精製オリゴ糖溶液は、≦１０ｋＤａフィルターモジュール、例えば５ｋＤａ又は３ｋＤａのＭＷＣＯフィルターに通される。エンドトキシン除去に適切な限外ろ過膜は、少なくとも１０ｋＤａ、好ましくは少なくとも５ｋＤａのＭＷＣＯを有し、スパイラル型又は中空糸型の限外ろ過膜でありうる。スパイラル膜の例は、ＳＰＩＲＡ－ＣＥＬ（登録商標）ＤＳ ＵＰ０１０（ＭＷＣＯ＝１０ｋＤａ）又はＤＳ ＵＰ００５（ＭＷＣＯ＝５ｋＤａ）膜（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ－Ｎａｄｉｒ ＧｍｂＨ社）及びＤａｉｒｙ－Ｐｒｏ（登録商標）ＨｐＨＴ ＵＦ－５Ｋ（ＭＷＣＯ＝５ｋＤａ）（ Ｋｏｃｈ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）などである。中空糸モジュールの例は、ＲＯＭＩＣＯＮ（登録商標）ＨＦ ＵＦ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ＰＭ５（ＭＷＣＯ＝５ｋＤａ）（Ｋｏｃｈ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）又はＭｉｃｒｏｚｏａ^ＴＭシリーズ膜（ＭＷＣＯ＝３又は６）（Ｐａｌｌ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ社、米国ポートワシントン）などである。

好適な態様において、精製オリゴ糖溶液はろ過滅菌後に噴霧乾燥される。溶液は熱風を用いて噴霧乾燥され、好ましくは少なくとも８５ｗｔ％、又はさらに好ましくは少なくとも９０ｗｔ％の水分を除去できる。溶液は、好ましくは流動床乾燥機アタッチメント付きの任意の従来型噴霧乾燥システムを用いて噴霧乾燥できる。

精製溶液は噴霧乾燥されて、目的オリゴ糖濃度５～６０ｗｔ％、好ましくは１０～５０ｗｔ％、さらに好ましくは１５～４５ｗｔ％を達成しうる。入口温度は１１０～１５０℃、好ましくは１２０～１４０℃、さらに好ましくは１２５～１３５℃の範囲内に維持できる。出口温度は６０～８０℃、好ましくは６５～７０℃の範囲内に維持できる。

噴霧乾燥後、精製された目的オリゴ糖は下記の特性を有することができる。
ｉ）固体顆粒形；及び／又は
ii）示差走査熱量測定法による測定で、ガラス転移温度が６０～９０℃、好ましくは６２～８８℃、さらに好ましくは６４～８６℃；及び／又は
iii）レーザー回折による測定で、粒径が５～５００μｍ、好ましくは１０～３００μｍ；及び／又は
iv）レーザー回折による測定で、平均粒径が１０～１００μｍ、好ましくは２０～９０μｍ、さらに好ましくは３０～８０μｍ、最も好ましくは４０～７０μｍ；及び／又は
ｖ）Ｘ線粉末回折による観察で、アモルファス状態、好ましくは結晶性物質の特徴的ピークがないアモルファス状態；及び／又は
vi）水分含量が≦１０ｗｔ％、好ましくは≦８ｗｔ％、さらに好ましくは５ｗｔ％。

精製された目的オリゴ糖は、栄養学的用途、好ましくは医学的栄養又は乳製品栄養（例えばシリアル製品）、さらに好ましくは乳児栄養に、又は医薬、好ましくは胃腸障害の予防又は治療のための医薬に使用できる。

態様において、目的オリゴ糖は、中性オリゴ糖又はシアル化オリゴ糖、好ましくはヒトミルクオリゴ糖である。目的オリゴ糖は中性ＨＭＯ又はシアル化ＨＭＯでありうる。追加及び／又は代替の態様において、目的オリゴ糖は、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース、２’，３－ジフコシルラクトース、ラクト－Ｎ－トリオース II、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、ラクト－Ｎ－フコペンタオース Ｉ、ラクト－Ｎ－ネオフコペンタオース、ラクト－Ｎ－フコペンタオース II、ラクト－Ｎ－フコペンタオース III、ラクト－Ｎ－フコペンタオース Ｖ、ラクト－Ｎ－ネオフコペンタオース Ｖ、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオース Ｉ、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオース II、６’－ガラクトシルラクトース、３’－ガラクトシルラクトース、ラクト－Ｎ－ヘキサオース及びラクト－Ｎ－ネオヘキサオース、３’－シアリルラクトース、６’－シアリルラクトース、シアリルラクト－Ｎ－テトラオース ａ、シアリルラクト－Ｎ－テトラオース、シアリルラクト－Ｎ－テトラオース ｃ、３－フコシル－シアリルラクトース、ジシアリル－ラクト－Ｎ－テトラオース及びフコシル－ＬＳＴ ｂからなるヒトミルクオリゴ糖の群から選ばれる。

本発明を、特定の態様に関し、図面も参照しながら説明するが、本発明はそれらに限定されるのではなく、特許請求の範囲によってのみ制限される。さらに、説明文及び特許請求の範囲における第一、第二などの用語は、類似の要素を区別するために使用されているのであって、必ずしも、時間的、空間的、ランキング又は任意のその他の様式における順序を記述しているのではない。そのように使用された用語は、適切な状況下で交換可能であること、そして本明細書中に記載された発明の態様は本明細書中に記載又は例示されている以外の他の順序で操作可能であることは理解されるはずである。

特許請求の範囲において使用されている“含む(comprising)”という用語は、その後に掲載されている手段に限定されないと解釈されるべきで；他の要素又は工程を除外しないことに注意する。従って、参照された規定の特徴、整数、工程又は要素の存在を具体化していると解釈されるべきではあるが、一つ又は複数のその他の特徴、整数、工程又は要素、又はそれらのグループの存在又は追加を排除しない。従って、“手段Ａ及びＢを含む装置”という表現の範囲は、要素Ａ及びＢのみからなる装置に限定されるべきではない。それは、本発明に関しては、装置の単なる関連要素がＡ及びＢであることを意味する。

本明細書全体を通じて、“一つの態様”又は“態様”への参照は、その態様に関連して記載されている特定の特徴(feature)、構造又は特徴(characteristic)が、本発明の少なくとも一つの態様に含まれることを意味する。従って、本明細書全体の様々な場所で、“一つの態様において”又は“態様において”という語句の出現は、必ずしもすべて同じ態様を参照しているとは限らないが、参照しているかもしれない。さらに、特定の特徴(feature)、構造又は特徴(characteristic)は、本開示から当業者には明らかなように、一つ又は複数の態様において任意の適切な様式で組み合わせることができる。

同様に、本発明の例示的態様の記載において、本発明の様々な特徴は、開示内容を簡素化するため及び様々な発明的側面の一つ又は複数の理解を助けるために、単一の態様、図面又はその説明にまとめられることもあることは理解されるべきである。しかしながら、この開示の方法は、特許請求されている発明は各請求項に明示されているよりも多くの特徴を必要とするという意図を表していると解釈されるべきでない。むしろ、以下の特許請求の範囲に表されている通り、発明的側面は、前述の開示された単一の態様のすべての特徴よりも少ない特徴にある。従って、詳細な説明に続く特許請求の範囲は、これによって明示的にこの詳細な説明に取り込まれ、各請求項は、本発明の別の態様として独立している。

さらに、本明細書中に記載されている一部の態様は、他の態様に含まれる一部の特徴（他の特徴ではない）を含むが、異なる態様の特徴の組合せは、当業者には分かる通り、本発明の範囲内であることを意味し、異なる態様を形成する。例えば、以下の特許請求の範囲において、特許請求されている態様のいずれもが任意の組合せで使用できる。

さらに、実施態様のいくつかは、コンピュータシステムのプロセッサによって又はその機能を実施するその他の手段によって実施できる方法又は方法の要素の組合せとして本明細書に記載されている。従って、そのような方法又は方法の要素を実施するために必要な指示を備えたプロセッサは、方法又は方法の要素を実施するための手段を形成する。さらに、装置態様の本明細書中に記載されている要素は、本発明を実施するために、該要素によって実施される機能を実行するための手段の例である。

本明細書中に提供されている説明及び図面には、多数の具体的な詳細が示されている。しかしながら、本発明の態様は、これらの具体的詳細がなくても実施できることは理解されるはずである。他の場合において、周知の方法、構造及び技術は、本説明の理解を曖昧にしないために詳細には示されていない。

次に、本発明を、本発明のいくつかの態様を詳細に記載することによって説明する。本発明の他の態様は、本発明の真の精神又は技術的教示から逸脱することなく、当業者の知識に従って構成することができ、本発明は添付の特許請求の範囲の条項によってのみ限定されることは明白である。

実施例１：細菌発酵からの３－フコシルラクトースの精製
ＨＭＯの３－フコシルラクトースを細菌発酵によって製造し、細菌を発酵ブロスからろ過により除去した。細菌細胞を除去するため、発酵ブロスを、公称孔径０．０５μｍを有するポリエーテルスルホン膜（ＮＡＤＩＲ（登録商標）ＭＰ００５；Ｍｉｃｒｏｄｙｎ－Ｎａｄｉｒ社、ヴィースバーデン）を用いる精密ろ過と、その後の中空糸モジュール（ＵＬＴＲＡＤＹＮ ＦＳ－１０－ＦＳ ＦＵＳ－１５８２，１５０ｋＤａ ＭＷＣＯ；Ｍｉｃｒｏｄｙｎ－Ｎａｄｉｒ社、ドイツ・ヴィースバーデン）を用いる限外ろ過によってろ過した。

次に、細胞除去ブロスを、ナノろ過工程を用いる透析ろ過によって処理し、塩及び小分子を除去して３－ＦＬの純度を上げた。逆浸透システムタイプＲＯ４０４０４（Ａｑｍｏｓ ＧｍｂＨ社、ドイツ・ロートガウ）にＦｉｌｍｔｅｃ^ＴＭ ＮＦ２７０ナノろ過モジュールを備え付けた。入口圧力を８ｂａｒに設定し、溶液を等量の逆浸透水で３回処理し、当初容量の半分にすることによって濃度を上げた。次に、３－ＦＬ溶液を、ＦＳ－１０－ＦＳ ＦＵＳ０１８１１０ｋＤａ 中空糸ナノろ過モジュール（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ－Ｎａｄｉｒ社）に通してタンパク質及びペプチドを除去した。

３－ＦＬと同様の大きさのイオンは、プロセスストリームから、ＰＣＣｅｌｌ Ｐ１５システム（ＰＣＣｅｌｌ ＧｍｂＨ社、ドイツ・ホイスヴァイラー）を用いる電気透析によって除去された。このシステムは、ＣＥＭ：ＰＣＳＫカチオン交換膜とサイズ排除限界６０Ｄａを有するＣＥＭ：ＰｃＡｃｉｄ６０アニオン交換膜を含むＰＣＣｅｌｌ ＥＤ １０００Ａ膜スタックを備えていた。出発溶液の導電率は８～１１ｍＳ／ｃｍ^２で、導電率が０．５ｍＳ／ｃｍ^２に低下するまで電気透析を続けた。

次に、３－ＦＬ溶液を活性炭粉末で処理し、色素を除去した。この溶液をＮｏｒｉｔ ＤＸ１活性炭と２時間撹拌し、その後、活性炭をろ過により除去した。
電気透析をもう１回、上記と同じ構成を用いて実施した。出発溶液の導電率は１．０～１．５ｍＳ／ｃｍ^２で、導電率が０．３ｍＳ／ｃｍ^２に低下するまで電気透析を続けた。

電気透析後、３－ＦＬ溶液を、ＣＳＭ ＲＥ８０４０ＢＥ逆浸透モジュールを備えたＥｍｒｉｃｈ ＥＭＲＯ １．８逆浸透システム（Ｅｍｒｉｃｈ Ｅｄｅｌｓｔａｈｌｂａｕ社、ドイツ・ポルヒ）を用いて逆浸透により濃縮した。溶液はろ過システムの流量が５０Ｌ／ｈ未満に降下するまで濃縮された。濃縮後の乾燥物質は２０～２５ｗｔ％であった。噴霧乾燥のため（実施例２参照）、３－ＦＬ溶液をさらに、Ｈｅｉ－ＶＡＰ工業用蒸発器（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＧｍｂＨ社、ドイツ・シュヴァーバッハ）を用いて４５ｗｔ％の乾燥物質になるまで濃縮した。高濃縮された３－ＦＬ溶液を、５ｋＤａ Ｓｐｉｒａ－Ｃｅｌｌ ＷＹ ＵＰ００５ ２４４０ Ｃ限外ろ過膜（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ－Ｎａｄｉｒ社）に通すことによってろ過滅菌し、エンドトキシンを除去した。

本方法による清澄化発酵ブロスからの３－フコシルラクトースの精製を示すＨＰＬＣクロマトグラムを図６及び図７に示す。図６は、清澄化発酵ブロスのＨＰＬＣクロマトグラムを示すが、図７は、図６に示されたＨＰＬＣクロマトグラムをもたらす清澄化発酵ブロスから得られた滅菌ろ過されたプロセスストリームのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。これらのクロマトグラムを比較すると、清澄化発酵ブロスのＨＰＬＣクロマトグラムのピークの大部分（各ピークは少なくとも一つの化合物を表す）が滅菌ろ過プロセスストリームのＨＰＬＣクロマトグラムにはないことが明らかである。

実施例２：噴霧乾燥による固形の３－フコシルラクトースの獲得
実施例１に記載されているように、ろ過及び電気透析によって得られた３－ＦＬ溶液は４５ｗｔ％に濃縮され、ろ過滅菌されてあらゆるバイオバーデン及びエンドトキシンが除去された。次に、この高濃縮で無菌の３－ＦＬ溶液を、ＬＴＣ－ＧＭＰ噴霧乾燥機（Ｎｕｂｉｌｏｓａ社、ドイツ・コンスタンツ）を用いて噴霧乾燥した。４５ｗｔ％の３－ＦＬ溶液を１３０℃及び３．５ｂａｒで噴霧乾燥機ノズルに通し、流量は排気温６６～６７℃を維持するように調整された。これらの設定を用いて、水分含有率５％未満の噴霧乾燥粉末が得られた。水分含量はカール－フィッシャー滴定によって測定された。

Claims (17)

1. 発酵ブロスからの目的オリゴ糖の精製法であって、該方法は、
   － 目的オリゴ糖、バイオマス、微生物細胞、及び目的オリゴ糖以外の糖質を含有する発酵ブロスを用意し；
   － 前記発酵ブロスから微生物細胞を除去することによってプロセスストリームを提供し；
   － 前記プロセスストリームをナノろ過膜を用いる第一のろ過工程に付すことによって目的オリゴ糖を含有するろ液を提供し；
   － 前記ろ液をナノろ過膜を用いる第二のろ過工程に付すことによって目的オリゴ糖を含有する保持液を提供し；
   － 前記プロセスストリームから電気透析を用いて塩を除去することによって目的オリゴ糖の精製調製物を提供する
   ことを含む方法。
2. 前記微生物細胞が、前記発酵ブロスを少なくとも一つの遠心分離工程及び／又は少なくとも一つのろ過工程に付すことによって発酵ブロスから除去される、請求項１に記載の方法。
3. 前記少なくとも一つのろ過工程が、精密ろ過、好ましくは約５００ｋＤａの分子量カットオフ、さらに好ましくは約１５０ｋＤａの分子量カットオフを有する膜を用いる精密ろ過である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記プロセスストリームが、約５０ｋＤａの分子量カットオフ、好ましくは約３０ｋＤａの分子量カットオフ、さらに好ましくは１０ｋＤａの分子量カットオフを有する膜を用いる少なくとも一つの限外ろ過工程に付される、請求項３に記載の方法。
5. 前記第一のろ過工程で使用されるナノろ過膜が、約７００ダルトン～約３，０００ダルトンの分子量カットオフ、好ましくは約１，０００～約２，０００ダルトンの分子量カットオフを有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記第二のろ過工程で使用されるナノろ過膜が、１００ダルトン～１，０００ダルトンの分子量カットオフ、好ましくは約１５０ダルトン～約５００ダルトンの分子量カットオフ、さらに好ましくは約２００～約３００ダルトンの分子量カットオフを有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 目的オリゴ糖が、中性オリゴ糖又はシアル化オリゴ糖、好ましくは中性ＨＭＯ又はシアル化ＨＭＯ、さらに好ましくは、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース、２’，３－ジフコシルラクトース、ラクト－Ｎ－トリオース II、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、ラクト－Ｎ－フコペンタオース Ｉ、ラクト－Ｎ－ネオフコペンタオース、ラクト－Ｎ－フコペンタオース II、ラクト－Ｎ－フコペンタオース III、ラクト－Ｎ－フコペンタオース Ｖ、ラクト－Ｎ－ネオフコペンタオース Ｖ、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオース Ｉ、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオース II、６’－ガラクトシルラクトース、３’－ガラクトシルラクトース、ラクト－Ｎ－ヘキサオース及びラクト－Ｎ－ネオヘキサオース、３’－シアリルラクトース、６’－シアリルラクトース、シアリルラクト－Ｎ－テトラオース ａ、シアリルラクト－Ｎ－テトラオース、シアリルラクト－Ｎ－テトラオース ｃ、３－フコシル－シアリルラクトース、ジシアリル－ラクト－Ｎ－テトラオース及びフコシル－ＬＳＴ ｂ、又は表１に掲載されている任意のその他のＨＭＯからなる群から選ばれるＨＭＯである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記プロセスストリームが、
   ｉ）保持液中の塩の量が＜１０ｗｔ％、好ましくは＜５ｗｔ％、さらに好ましくは≦２ｗｔ％、及び／又は
   ii）導電率が０．５～１０．０ｍＳ／ｃｍ^２、好ましくは１～８ｍＳ／ｃｍ^２、さらに好ましくは１．５～４．０ｍＳ／ｃｍ^２
   になるように第二のろ過工程に付される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記プロセスストリームが、濃縮工程、好ましくは逆浸透及び／又は追加のナノろ過工程による濃縮、好ましくは２００～３００Ｄａの範囲の分子量カットオフを有するナノろ過膜を用いるナノろ過工程による濃縮に付される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記濃縮工程が、
    － ナノろ過により、＜８０℃、好ましくは＜５０℃、さらに好ましくは４℃～４５℃、さらに好ましくは１０℃～４０℃、なおさらに好ましくは１５～３０℃、最も好ましくは１５～２０℃の温度で；及び／又は
    － 逆浸透により、２０℃～５０℃、さらに好ましくは３０℃～４５℃、最も好ましくは３５℃～４５℃の温度で；及び／又は
    － ＞５ｂａｒ～＜５０ｂａｒの圧力、好ましくは＞１０ｂａｒ～＜４０ｂａｒの圧力、さらに好ましくは＞１５～＜３０ｂａｒの圧力で
    実施される、請求項９に記載の方法。
11. 前記プロセスストリームが、目的オリゴ糖の濃度が≧１００ｇ／Ｌ、好ましくは≧１５０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは≧２００ｇ／Ｌになるように濃縮工程に付される、請求項９又は１０に記載の方法。
12. 前記プロセスストリームが、好ましくは活性炭でプロセスストリームを処理することによる色素除去工程に付される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記色素除去工程が、
    ｉ）透析ろ過工程の前又は後；
    ii）プロセスストリームの濃縮工程の前又は後；及び／又は
    iii）電気透析工程の前又は後
    に実施される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記電気透析が、中性条件下での電気透析又は酸性条件下での電気透析である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記プロセスストリームが、その中に含有される塩の除去後に、
    ｉ）＜１ｗｔ％、好ましくは＜０．５ｗｔ％、さらに好ましくは＜０．２ｗｔ％の量の塩を含み；及び／又は
    ii）０．０５～１．０ｍＳ／ｃｍ^２、好ましくは０．１～０．５ｍＳ／ｃｍ^２、さらに好ましくは０．２～０．４ｍＳ／ｃｍ^２の導電率を有する、
    請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記プロセスストリームが噴霧乾燥され、好ましくは
    ｉ）１１０～１５０℃、好ましくは１２０～１４０℃、さらに好ましくは１２５～１３５℃の範囲の入口温度で（出口温度は６０～８０℃、好ましくは６５～７０℃の範囲でありうる）；及び／又は
    ii）プロセスストリーム中の目的オリゴ糖の濃度が５～６０ｗｔ％、好ましくは１０～５０ｗｔ％、さらに好ましくは１５～４５ｗｔ％で
    噴霧乾燥される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 精製調製物中の目的オリゴ糖の純度が、精製調製物の乾燥物質に関して、≧８０ｗｔ％、好ましくは≧８５ｗｔ％、さらに好ましくは≧９０ｗｔ％である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。

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