KR20220016814A - 여과를 사용한 발효 브로쓰로부터 올리고당의 정제 - Google Patents

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스테판 제네바인
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마커스 헬프리히
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크리스찬 한센 에이치엠오 게엠베하
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Abstract

발효 브로쓰로부터 올리고당, 바람직하게는 중성 모유 올리고당(HMO) 또는 시알화된 HMO를 정제하는 방법으로서, 상기 방법은 - 상기 관심 올리고당, 바이오매스, 미생물 세포 및 상기 관심 올리고당 이외의 탄수화물을 함유하는 발효 브로쓰를 제공하고; - 상기 발효 브로쓰로부터 상기 미생물 세포를 제거하고, 이에 의해 공정 스트림을 제공하며; - 상기 공정 스트림에 나노여과 멤브레인을 사용하는 제1 여과 단계를 수행하고, 이에 의해 상기 관심 올리고당을 함유하는 여액을 제공하고; - 상기 여액에 나노여과 멤브레인을 사용하는 제2 여과 단계를 수행하고, 이에 의해 상기 관심 올리고당을 함유하는 잔류물을 제공하고; - 전기투석을 사용하여 상기 공정 스트림으로부터 염을 제거하고, 이에 의해 상기 관심 올리고당의 정제된 제제를 제공함을 포함한다.

Description

여과를 사용한 발효 브로쓰로부터 올리고당의 정제
본 발명은 산업 규모의 미생물 발효에 의한 올리고당의 생산에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 여과 방법을 사용한 발효 브로쓰(fermentation broth)로부터 관심 올리고당의 정제에 관한 것이다.
모유는 탄수화물, 지방, 단백질, 비타민, 미네랄 및 미량 원소의 복잡한 혼합물이다. 탄수화물 분획은 가장 풍부한 고형 분획이며 이는 락토스 및 더 복잡한 올리고당, 소위 모유 올리고당(HMO)으로 추가로 나뉘어질 수 있다.
락토스는 에너지원으로 사용되는 반면, 복합 올리고당은 유아나 성인에 의해 대사되지 않는다. 복합 올리고당의 분획은 전체 탄수화물 분획의 최대 10%를 차지하며, 아마도 150개가 넘는 다른 올리고당으로 이루어질 것이다. 이러한 복합 올리고당의 존재 및 농도는 인간에게만 국한되며, 따라서 낙농 가축과 같은 다른 포유동물의 젖에서는 다량으로 발견되지 않는다. HMO는 전체 모유의 극히 일부에 불과하지만 모유 수유아의 발달에 대한 HMO의 매우 유익한 효과는 지난 수십 년 동안 명백해졌다.
가장 두드러진 HMO는 2'-푸코실락토스이다. 더욱 두드러진 HMO는 3-푸코실락토스, 디푸코실락토스, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스 및 락토-N-푸코펜타오스이다. 이러한 중성 올리고당뿐만 아니라, 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스 및 시알릴락토-N-테트라오스, 예를 들어 LST-a, LST-b 및 LST-c를 포함한 산성 HMO도 또한 모유에서 발견될 수 있다(표 1). 모유의 총 HMO 함량의 최대 20%는 적어도 하나의 시알산 부분의 존재로 인해 산성이다. 이러한 구조는 상피 세포 표면 당접합체(루이스 조직혈액 그룹 항원)의 에피토프와 밀접하게 관련되어 있으며 HMO와 상피 에피토프 간의 구조적 상동성은 HMO가 세균성 병원체를 방어하는 능력을 설명한다(Weichert et al. 2013, Nutr. Res. 33:831; Weichert et al. 2016, J. Virol. 90:4843).
모유 내 복합 올리고당의 존재는 오랫동안 알려져 왔으며 HMO의 생리적 기능은 수십 년 동안 의학 연구의 주제였다(Gura 2014, Science 345:747; Kunz & Egge 2017, In McGuire, McGuire & Bode (eds) Prebiotics and Probiotics in Human Milk, Elsevier, London, pp. 3-16). 보다 풍부한 HMO 중 일부에 대해서 특정한 기능이 이미 확인되었다(Bode 2012, Glycobiology 22:147; Bode & Jantscher-Krenn 2012, Adv. Nutr. 3S:383; Morrow et al. 2004, J. Pediatr. 145: 297). 감염원(세균, 바이러스 및 세균 독소)을 억제하는 생리학적 능력, 뇌 발달에 대한 긍정적인 효과 및 프리바이오틱 기능으로 인해, 식품, 특히 유아용 영양 제품에 HMO를 포함시키는 것에 대한 수요가 많다. 표 1은 본원에 개시된 방법에 의해 발효 브로쓰로부터 정제될 수 있는 HMO의 개요를 제공한다.
[표 1]
본원에 개시된 방법에 의해 정제될 수 있는 모유 올리고당의 목록
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
개별적인 HMO의 제한된 공급과 이러한 분자의 충분한 양을 공급할 수 없기 때문에 이를 생산하기 위한 화학적 합성을 기반으로 하는 공정이 개발되었다. 그러나 HMO의 화학적 합성, 특히 식품 응용 분야에 충분한 품질을 갖는 HMO의 대규모 생산은 대단히 어려운 것으로 입증되었다. 특히, 2'-FL(WO 2010/115935 A)과 같은 HMO의 화학적 합성에는 최종 제품을 오염시킬 수 있는 여러 유해 화학물질이 요구된다.
화학적 합성의 단점은 다수의 효소 및 발효-기반 방법의 개발을 도출하였다(Miyazaki et al. 2010, Methods Enzymol. 480:511; Murata et al. 1999, Glycoconj. J. 16:189; Baumgartner et al. 2013, Microb. Cell Fact. 12:40; Lee et al. 2012, Microb. Cell Fact. 1:48; Albermann et al. 2001, Carbohydr. Res. 334:97; US 7,521,212 B1; Fierfort & Samain, J. Biotechnol. 134:216). 그러나 이들 공정은 올리고당의 복잡한 혼합물을 생성시키며, 따라서 목적하는 생성물이 락토스와 같은 출발 물질뿐만 아니라 중간체, 원치 않는 부산물(예를 들어 몇몇 글리코실트랜스퍼라제의 부 활성으로부터 기원하는 부산물), 및 단백질, 폴리펩티드, 유기산 및 염과 같은 발효 공정으로부터의 기질로 오염된다.
혼합물로부터 개별적인 올리고당을 정제하는 현재의 많은 방법은 기술적으로 복잡하고 규모 확장이 어려우며 식품 응용 분야에 비경제적이다. 유청과 당밀에서 각각 이당류인 락토스와 슈크로스를 정제하기 위해 산업적 규모의 공정이 개발되었지만 이러한 방법에는 다수의 결정화 단계가 수반되며, 이들 단계는 정교하고 단지 낮은 수율만을 달성한다. 그러나 유청과 당밀은 재조합 세균 또는 효모가 포함된 발효 브로쓰로 출발하며 그 만큼 전혀 복잡하지 않고 까다롭지 않은(조절 요건에 관하여) "식품 등급" 제품이다. 젤-여과 크로마토그래피는 미생물 발효에 의해 생성된 HMO와 같은 복합 올리고당의 정제에 가장 좋은 방법이지만, 이 방법의 단점은 확장성이 부족하고 연속 공정과 양립할 수 없다는 것이다. 따라서 젤-여과 크로마토그래피는 비경제적이며 산업적 규모로 HMO를 생산하는 데 사용될 수 없다.
이론적으로, 젤-여과 크로마토그래피는 미생물 발효에 의해 생산된 HMO와 같은 복합 올리고당의 정제에 가장 적합한 방법이지만, 젤-여과 크로마토그래피의 단점은 확장성이 부족하고 연속 공정과 양립할 수 없다는 것이다. 따라서 젤-여과 크로마토그래피는 비경제적이며 산업적 규모로 HMO를 생산하는 데 사용될 수 없다.
미생물 발효에 의한 HMO 생산에 효율적인 방법 및 공정의 개발에 이어서, 다음의 논리적 단계는 배양 브로쓰에서 HMO를 단리하기 위한 효율적인 하류 공정의 개발이었다.
WO2015/049331 A는 중성 HMO의 정제 방법을 개시하고 있다. 이 공정은 이온 교환, 전기투석 및 시뮬레이션된 이동층(SMB) 크로마토그래피를 사용하여 대량의 HMO를 지속적이고 효율적으로 정제한다. 중성 HMO의 생산 및 후속 정제를 위한 화학적 합성 경로와 달리, 기재된 발효 및 정제 공정은 미량의 중금속 및 유기 용매와 같은 유해 화학물질이 없는 HMO를 제공할 수 있게 한다. 상기 정제 방법은 고도로 정제된 HMO 제품을, 식품 응용 분야에 사용될 수 있는 고체 형태(분무 건조에 의해)로 또는 농축 시럽으로서 생성시킨다.
WO 2015/106943 A는 미생물 발효에 의해 생산된 중성 HMO의 정제를 위한 간단한 공정을 기재하고 있다. 이 공정은 양이온 교환, 음이온 교환 및 나노여과 및/또는 전기투석의 조합을 사용하여 다량의 중성 HMO를 효율적으로 정제할 수 있게 한다. 미생물 발효에 의해 생산된 중성 HMO에 대한 이전의 정제-양이온 방법과 달리, 이 공정에는 크로마토그래피 분리 단계가 수반되지 않는다. 이 공정은 분무 건조된 물질, 결정성 물질 또는 필터 살균 농축물로서 고체 형태의 HMO를 생성시킨다. 생성된 HMO는 생산에 사용된 재조합 미생물 균주로부터 기원하는 단백질 및 물질이 없으므로 식품, 의료 식품 및 사료(예를 들어 반려동물 사료) 응용 분야에 이상적이다.
WO 2016/095924 A는 결정화에 의해 2'-FL을 정제하는 방법을 기재하고 있다. HMO를 미생물 발효에 의해 생산하고, 바이오매스(biomass)를 제거한 후 나노여과 및 전기투석에 의해 농축시켰다. 최종적으로, 상기 2'-FL을 아세트산을 사용하여 2',3-디-O-푸코실락토스(DFL)를 또한 함유하는 수용액으로부터 선택적으로 결정화시켰다.
LNT와 LNnT는 활성탄에 선택적으로 결합시킨 다음 유기 용매로 용출하고 젤-여과 크로마토그래피로 분리함으로써 탄수화물 부산물로부터 분리될 수 있다(Priem et al. 2002, Glycobiology 12:235; Gebus et al. 2012, Carbohydr. Res. 361:83; Baumgartner et al. 2014, ChemBioChem 15:1896). 상기에서 언급한 바와 같이, 젤-여과 크로마토그래피는 실험실 규모의 편리한 방법이지만 산업적 생산을 위해 효율적으로 확장될 수 없다.
WO 2015/049331 A는 투명하고, 입자가 없는 용액을 제공하기 위해 세균 발효에 의해 생산된 LNT를 정제하기 위한 하기 순서의 작업을 개시하였다:
전기투석, 나노여과, 강한 양이온 교환 수지를 사용하는 시뮬레이션된 이동층 크로마토그래피(SMB), 전기투석, 한외여과 및 두 번째 SMB 크로마토그래피 단계.
산성 HMO, 특히 시알릴화된 락토스 또는 시알릴화된 올리고당을 단리하기 위한 다양한 방법이 또한 기재되었다.
US 2007/0020736 A는 에스케리키아 콜라이 세균의 유전자 변형된 균주의 부산물로서 디시알릴화 및 트리시알릴화된 락토스에 의한 3'-SL의 생산을 개시한다. 상기 3'-SL은 배양 브로쓰에서 ∼0.8 mM의 농도로 축적되었다. 상기 3'-SL을 하기의 단계를 사용하여 정제하였다: 원심분리, 목탄상에 상등액을 통과시키고 수용성 염을 증류수로 씻어냄에 의한 흡착, 수성 에탄올 중에서 구배 용출, 및 최종적으로 바이오젤 컬럼상에서 분리 및 탈염. 1 L의 브로쓰로부터의 수율은 49 ㎎의 3'-SL이었다.
또 다른 개시된 방법은 유전자 변형된 이 콜라이 균주를 사용하는 3'-SL의 생산 및 세포의 열 투과화에 이은 원심분리에 의한 후속 단리를 포함한다(Priem et al. 2002, Glycobiology 12:235). 상등액 중의 물질을 목탄상에 흡착시키고 수용성 염을 증류수로 씻어내었다. 수성 에탄올에서의 구배 용출 후에, 3'-SL을 HCO3 -(비카보네이트 이온) 형태의 강한 음이온 교환기에 흡착시키고 나트륨 비카보네이트(NaHCO3)의 선형 구배로 용출시켰다. 후자를 양이온 교환(산성 형태의 수지 사용)에 의해 제거하여 49%의 3'-SL 회수 효율을 생성시켰다.
발효 브로쓰로부터 출발하는 다른 과정은 열 투과화, 원심분리, 산 형태의 강한 양이온 교환 수지 첨가에 의한 pH의 3.0으로의 조절, 및 원심분리에 의한 침전된 단백질 제거의 단계들로 구성되었다(Fierfort et al. 2008, J. Biotechnol 134:261). 이어서 상기 상등액의 pH를 염기성 형태의 약한 음이온 교환기의 추가에 의해 6.0으로 조정하고 3'-SL을 HCO3 - 형태의 음이온 교환기에 결합시켰다. 증류수로 세척한 다음 연속적인 NaHCO3 구배로 용출시킨 후에, 상기 NaHCO3를 pH가 3.0으로 떨어질 때까지 양이온 교환(산성 형태의 수지 사용)에 의해 제거하였다. 최종적으로, 상기 pH를 NaOH로 6.0으로 조정하였다. 이 정제 전략은 59%의 3'-SL 회수 효율을 달성하였다.
효소에 의해 생산된 3'-SL은 또한 나노여과에 의해 유당으로부터 분리되기도 하였다(Nordvang et al. 2014, Separ. Purif. Technol. 138:77). 저자는 2개의 상이한 나노여과 멤브레인, 즉 분자량 컷-오프(MWCO)가 600 내지 800 Da인 것(설폰화된 폴리에테르설폰(SPES) 멤브레인)과, MWCO가 1000 내지 1400 Da인 것(SPES 멤브레인)이 정용여과 후 락토스로부터 대부분의 3'-SL을 분리시킬 수 있음을 보였다. 그러나, 이러한 공정 동안 3'-SL이 상당히 손실되었으며, 순도가 낮아, 추가적인 이온 교환 정제 단계가 필요하였다.
WO 2010/106320 A2는 유청으로부터 3'-SL을 농축시키는 방법을 기재하고 있다. 먼저 한외여과로 단백질을 제거한 다음 정제된 유청 투과물을 이온 교환 수지와 함께 배양하여 3'-SL을 포획한다. 이온 교환 물질로부터 용출 후에, 농축된 3'-SL 분획을 나노-여과에 의해 농축시켜 상기 농축물을 탈염시킨다. 탈염 후 3'-SL을 농축 및 건조시켜, 3'-SL 함량이 20중량%인 최종 건조 생성물을 생성시킨다.
WO 2018/020473 A는 액체 공급원으로부터 3'-SL 및 6'-SL의 농축을 위한 추가적인 공정을 기재하고 있다. 두 HMO는 모두 용액의 가열, 효소 처리 및 추가적인 한외여과 및 나노여과 단계에 의해 락토스 결정화의 모액으로부터 단리되었다. 농축 후에 3'-SL 및 6'-SL의 함량은 건조 질량 기준으로 10 내지 30 중량%였다.
이러한 종래 기술로부터 출발하여, 미생물 발효에 의해 생산된 관심 올리고당, 특히 중성 HMO 또는 시알릴화된 HMO의 정제-양이온 공정을 제공하는 것이 목적이었으며, 여기에서 상기 공정은 규모 확장이 용이하고, 상기 관심 올리고당의 상업적 또는 산업적 규모의 제조에 적합하며, 이는 제품을 인간 소비에 적합하게 만드는 순도를 갖는 제품으로 이어지게 할 수 있다.
미생물 발효 브로쓰, 특히 재조합 미생물(세균 또는 진핵 미생물, 예를 들어 빵 효모)을 함유하는 상기 발효 브로쓰는 유제품에서 파생된 제품 스트림보다 훨씬 더 복잡하다는 것이 강조되어야 한다. 유청의 조성은 예를 들어 ~94%의 물, 4 내지 5%의 락토스, 0.5 내지 1%의 단백질, 및 일부 비타민 외에 칼슘, 칼륨 및 인과 같은 단지 약간의 한정된 미네랄, 유제품 스트림 중에서 단지 농축되고 탈염되는 단순 기질이다. 대조적으로, 재조합 미생물 발효 공정에서 얻은 당 용액의 기질은, 먼저 정부 규정에 따라 재조합 바이오매스를 분리하고 이를 불활성화하는 법적 요구 사항부터 시작하여 매우 복잡하다. 상기 수득되는 정제된 브로쓰는 중금속과 미량 원소를 또한 함유하는, 다양한 염과 이온의 정의되지 않은 기질이다. 상기와 같은 액체의 과제는 또한 세포 찌꺼기, 지질과 같은 막 단편, 단백질, 미생물 세포 대사에서 기원하는 분자, 및 특히 DNA를 제거하는 것이다. 따라서 유전자 변형 세균과 같은 재조합 가공 보조제를 통해 생산된 올리고당을 회수하는 것은, 브로쓰 내부의 다양한 오염 물질이 분자량, 하전된 분자(단일 하전된 및 다중 하전된) 및 착색 분자와 관련하여 매우 높기 때문에, 유청 및 유제품 스트림에 비해 훨씬 더 어려운 일이다.
본 발명은 재조합 발효 균주를 사용하는 미생물 발효에 의해 수득된 발효 브로쓰 또는 배양 브로쓰로부터 배치 방식으로 또는 연속 방식으로 발효에 의해 생산된 관심 올리고당을 정제하는 방법을 제공한다. 앞서 기재된 정제 전략은 종종 값비싼 이온 교환 단계(양이온 및 음이온 교환기를 모두 요구함)를 사용하였다. 이온 교환기는 재생을 필요로 하기 때문에 연속적으로 작동될 수 없다. 배양 브로쓰는 관심 올리고당, 바이오매스, 배지 성분, 염, 및 기타 산 및 안료와 같은 오염물질을 함유한다.
정제 공정 동안, 배양 브로쓰는 표적 올리고당을 수득하기 위해서 하기의 정제 단계를 겪을 수 있다:
1) 미세여과(microfiltration)에 의한 배양 브로쓰로부터 미생물 세포의 분리
2) 한외여과에 의한 정제된(clarified) 배양 브로쓰(=공정 스트림(process stream))로부터 단백질의 분리
3) 펩티드 및 고분자량(HMW) 불순물을 제거하기 위한 제1 나노여과(nanofiltration) 단계
4) 수(water) 및 염을 제거하기 위한 제2 나노여과 단계
5) 안료 및 다른 불순물을 제거하기 위한 활성탄 처리
6) 오염성 염(contaminating salt)의 완전한 제거를 위해 나노여과 멤브레인(membrane)을 사용하는 전기투석 또는 정용여과(diafiltration)
7) 역삼투에 의한 수의 제거
추가로, 또 다른 전기투석 단계를 오염성 이온의 양을 감소시키기 위해 활성탄 처리 전에 도입시킬 수 있다. 수용액 중에서 정제 후 고체 형태의 관심 올리고당을 제조하기 위해서, 상기 물질을 분무-건조시키거나 과립화시킬 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 방법의 예시적인 구현예의 공정도를 도시한다.
도 2는 본 발명에 따른 방법의 또 다른 예시적인 구현예의 공정도를 도시한다.
도 3은 본 발명에 따른 방법의 또 다른 예시적인 구현예의 공정도를 도시한다.
도 4는 본 발명에 따른 방법의 또 다른 예시적인 구현예의 공정도를 도시한다.
도 5는 본 발명에 따른 방법의 또 다른 예시적인 구현예의 공정도를 도시한다.
도 6은 3-푸코실락토스를 함유하는 정제된 발효 브로쓰의 HPLC 크로마토그램을 도시한다.
도 7은 본 발명에 따른 방법의 예시적인 구현예에 의한 발효 브로쓰로부터 정제 후의 3-푸코실락토스의 HPLC 크로마토그램을 도시한다.
본 발명에 따라, "순도"란 용어는 화학적 순도를 지칭하며 물질, 예를 들어 2'-FL, 3-FL, DFL, LNT, 3'-SL, 6'-SL 또는 임의의 다른 관심 올리고당(표 1)이 희석되지 않거나 관련없는 물질과 혼합되지 않은 정도를 명시한다. 따라서, 화학적 순도는 단일 물질과 임의의 부산물/불순물간의 관계에 대한 지표이다. 화학적 순도를 백분율(%)로서 나타내며 하기의 식을 사용하여 계산한다:
순도 퍼센트 = (목적하는 생성물의 질량/샘플의 총 질량) x 100
관심 올리고당을 포함하는 조성물에서, 상기 화합물의 순도를 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 측정할 수 있다. 적합한 검출기는 전기화학 검출기, 굴절률(RI) 검출기, 질량 분광계(MS), 다이오드-배열 검출기(DAD), 및 핵자기 공명(NMR) 검출기로 이루어지는 그룹 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어 HPLC에서, 순도를 모든 피크(동일한 크로마토그램 중의 관심 올리고당 및 상기 물질과 상이한 화합물의 양을 모두 나타내는) 바로 아래의 면적의 합에 대한 표적 피크(관심 올리고당의 양을 나타내는) 바로 아래의 면적의 비를 계산함으로써 측정할 수 있다. 그러나, 이는 모든 불순물이 선택된 HPLC 방법에 의해 분석될 수 있음을 암시한다. 그렇지 않으면, 질량-균형 접근법, 즉 목적하는 생성물의 절대 정량화가 필요하다. 상기 접근법에서, 순수한 물질이 순도를 정량화하기 위한 참조로서 사용되며, 이때 상기 순도는 생성물(목적하는 생성물 + 모든 불순물)로부터 수득된 건조 물질에 대해 판단된다. 상기 질량-균형 접근법을 또한 본 발명에 따른 순도 측정에 사용할 수 있다.
본 발명에 따라, "배양 브로쓰" 또는 "발효 브로쓰"는 2'-FL, 3-FL, DFL, LNT, 3'-SL, 6'-SL 또는 정제하고자 하는 임의의 다른 올리고당을 함유하는 발효 후 임의의 액체를 지칭한다. "배양 브로쓰", "발효 브로쓰" 및 "배양 배지"란 용어는 본원에서 동의어로 사용된다. 배양 브로쓰는 정제하고자 하는 관심 올리고당뿐만 아니라, 바이오매스(예를 들어 생물학적 세포 및 세포 찌꺼기), 배지 성분, 염 및 기타 산 및 안료와 같은 추가의 오염물질을 포함한다. 배양 브로쓰 중에 함유된 생물학적 세포는 관심 올리고당을 세포내에 생성시키고 상기 화합물을 액체 배양 배지에 분비하는 생물학적 세포이다. 상기 생물학적 세포는 유전자 변형된 생물학적 세포, 예를 들어 유전자 변형된 이 콜라이 세포를 포함하거나 상기 세포로 이루어질 수 있다. 유전자 변형은, 특히 상기 생물학적 세포의 증식기 동안, 관심 올리고당을 생산하도록 하는 변형을 포함하거나 또는 상기 변형으로 이루어질 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "바이오매스"란 용어는 발효 단계의 끝에서 발효 브로쓰 중에 존재하는 생물학적 세포 전체를 지칭한다. 상기 바이오매스는 관심 올리고당을 생산하는 미생물 세포, 발효 단계 중 관심 올리고당을 생산하는 능력을 상실했을 수도 있는 상기 미생물의 자손인 세포뿐만 아니라, 발효 단계의 끝에서 발효 브로쓰 중에 의도치 않게 존재하는 임의의 다른 세포를 포함한다. 따라서, 발효 단계의 끝에서 발효 브로쓰 중에 존재하는 필수적으로 모든 생물학적 세포는, "공정 스트림"(정제하고자 하는 관심 올리고당을 포함하거나 함유하는 임의의 용액)으로서 공지된 정제된 발효 브로쓰에 세포가 실질적으로 또는 전적으로 없도록 상기 발효 브로쓰로부터 분리된다.
바이오매스는 바람직하게는 관심 올리고당을 생산하는 생물학적 세포, 바람직하게는 관심 올리고당을 생산하는 세균 세포, 및 보다 바람직하게는 관심 올리고당을 생산하는 재조합 세균 세포, 가장 바람직하게는 관심 올리고당을 생산하는 재조합 이 콜라이 세포를 포함한다.
바이오매스 및/또는 미생물 세포를 원심분리 및/또는 여과에 의해 발효 브로쓰로부터 제거할 수 있다.
배양 브로쓰로부터 바이오매스의 제거에 적합한 원심분리 방법에서, 상기 바이오매스를 펠릿으로서 수득하고 상등액을 추가의 처리가 가해지는 정제된 공정 스트림으로서 수득한다. 배양 브로쓰로부터 바이오매스의 제거에 적합한 여과 방법에서, 여액은 정제된 공정 스트림으로 된다. 바이오매스 제거에 바람직한 여과 방법은 미세여과 및/또는 한외여과이며, 후자는 미세여과보다 훨씬 더 작은 입자 및 또한 큰 분자를 제거하는 능력을 부여한다. 미세여과 및 한외여과를 막다른 여과 방식(공정 스트림이 필터에 수직으로 흐른다) 또는 직교류 여과 방식(공정 스트림이 필터에 평행하게 흐른다)으로 작동시킬 수 있다.
미세여과는 입자-함유 유체가 매질을 관통하는 물리적 분리 공정으로, 상기 매질은 입자를 유지하기 위한 구불구불한 채널을 포함하는 다공성 물질(깊이 여과) 및/또는 특정 기공 크기보다 작은 입자/분자의 통과를 허용하는 상기 기공 크기를 갖는 멤브레인(멤브레인 여과)을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "미세여과"란 용어는 생물학적 세포(및 세포 찌꺼기)가 발효 브로쓰로부터 제거되어 (정제된) 공정 스트림을 남기는 물리적 분리 공정을 지칭한다.
미세여과에 의한 바이오매스 제거에 적합한 멤브레인은 적어도 0.2 ㎛의 기공 크기(pore size)를 가질 수 있으며 중공-섬유(hollow-fiber) 또는 나선형으로 감긴 멤브레인일 수 있다. 대안으로, 바이오매스의 제거는 바이오매스, 추가적인 세포 찌꺼기 및 더 큰 단백질을 제거하기 위해 100-1000 kDa, 바람직하게는 150-500 kDa의 MWCO를 갖는 멤브레인을 사용하는 미세여과에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 컴팩트한 디자인과 더 양호한 성능을 제공하기 위해 나선형으로 감긴 TRISEP® DS MVP20(기공 크기 0.2 ㎛)(Microdyn-Nadir GmbH, Wiesbaden, Germany)과 같은 멤브레인을 사용하여 배양 브로쓰로부터 세포를 분리시킬 수 있다. 또한, PES 멤브레인 및 0.05㎛의 공칭 기공 크기를 포함하는 모듈인 TRISEP® DS MP005와 같은, 기공 크기가 0.05-0.1㎛인 나선형으로 감긴 멤브레인을 바이오매스와 단백질 분리에 사용할 수 있다.
추가로, MWCO가 150kDa인 PES 멤브레인(5 ㎡)을 사용하는 중공-섬유 여과 모듈인 FS10-FC FUS1582(Microdyn-Nadir GmbH)와 같은 중공-섬유 모듈을 대안으로 사용할 수 있다.
요약하면, 하기의 발효 브로쓰로부터의 바이오매스의 제거 가능성을 본 발명에 적용할 수 있다:
i) 원심분리에 의한 수확(harvest). 불용성 성분을 하나의 단계로 배양 브로쓰로부터 제거한다. 장점: 불용성 성분의 빠른 제거.
ii) 미세여과에 의한 수확. 불용성 성분 및 일정 크기를 초과하는 큰 분자를 하나의 단계로 배양 브로쓰로부터 제거한다. MWCO ≥500 kDa을 갖는 나선형으로 감긴 멤브레인 또는 중공-섬유 직교류 필터가 미세여과에 사용될 수 있다. 장점: 불용성 성분 및 일정 크기를 초과하는 큰 용해성 분자의 빠른 제거.
iii) 미세여과와 병용된 원심분리에 의한 수확. 불용성 성분 및 일정 크기를 초과하는 큰 분자를 2개의 단계로 배양 브로쓰로부터 제거한다. MWCO ≥500 kDa을 갖는 나선형으로 감긴 멤브레인 또는 중공-섬유 직교류 필터가 미세여과에 사용될 수 있다. 장점: 미세여과 멤브레인의 막힘 없이 불용성 성분 및 일정 크기를 초과하는 큰 분자의 빠른 제거.
한외여과는 미세여과와 근본적으로 다르지 않은 멤브레인 여과의 한 형태이다. 한외여과에서, 압력 및 농도 구배에 의해 생성된 힘은 입자 및 큰 용해성 분자를 함유하는 액체를 반투과성 멤브레인에 통과시킴으로써 상기와 같은 입자 및 큰 용해성 분자의 제거를 유도한다. 이로 인해 상기 입자와 큰 용해성 분자가 소위 잔류물 중에 유지되는 반면, 물과, 상기 생성된 중성 및 산성 올리고당과 같은 저분자량(LMW) 용질은 막을 통과하여 투과물(여액)로 들어간다. 한외여과용 멤브레인은 상기 멤브레인을 통과하여 투과물로 들어갈 수 있는 용해성 분자의 최대 분자량을 나타내는 MWCO에 의해 한정된다. MWCO보다 큰 분자뿐만 아니라 모든 입자는 멤브레인을 통과할 수 없고 잔류물에 남아 있는다. 한외여과는 액체의 흐름이 멤브레인 표면과 평행한 직교류 방식, 또는 액체의 흐름이 멤브레인 표면에 수직인 막다른 방식으로 적용될 수 있다.
생성된 관심 올리고당을 포함하는 정제된 공정 스트림은 대개 1가 이온, 2가 이온, 아미노산, 폴리펩티드, 단백질, 유기산, 핵산, 단당류 및/또는 올리고당을 비롯하여(이들로 제한되지 않음) 상당한 양의 원하지 않는 불순물을 함유한다.
한외여과에 의한 대부분의 단백질의 제거에 적합한 멤브레인은 MWCO가 적어도 50 kDa, 바람직하게는 적어도 30 kDa, 더욱 바람직하게는 10 kDa이고 중공-섬유 또는 나선형으로 감긴 멤브레인일 수 있다. 예를 들어, Microdyn-Nadir GmbH에서 판매하는 SPIRA-CEL® DS UP010(MWCO = 10 kDa) 또는 SPIRA-CEL DS UP005(MWCO = 5 kDa)와 같은 멤브레인은 컴팩트한 디자인과 더 양호한 성능을 제공하기 위해 나선형으로 감겨 있으며, 이들을 사용하여 무세포 배양 브로쓰로부터 남아있는 단백질을 분리시킬 수 있다.
추가로, 최대 12 ㎡의 면적과 10 kDa의 MWCO를 갖는 PES 멤브레인인 ROMICON® HF UF 카트리지 PM10(Koch Membranes Systems, Wilmington, USA)과 같은 중공-섬유 모듈을 대안으로 사용할 수 있다.
나노여과는 멤브레인이 나노미터-크기의 기공(1 내지 10 ㎚)을 함유하는 멤브레인 여과 방법이다. 나노여과 멤브레인의 기공 크기는 미세여과 및 한외여과 멤브레인의 기공 크기보다 작지만, 역삼투에 사용되는 멤브레인의 기공 크기보다 크다. 나노여과 멤브레인은 우세하게는, ㎠당 1 내지 106 기공의 기공 밀도를 갖는, 폴리에틸렌 테레프탈레이트와 같은 중합체 또는 알루미늄과 같은 금속의 박막으로 제조된다.
나노여과는 펩티드 및 염과 같은 LMW 불순물을 제거하고, 정제된 공정 스트림 또는 용출물 중의 관심 올리고당의 농도를 증가시키기 위해서 상기 올리고당의 정제 방법에 사용된다.
대부분의 HMO의 분자량은 400 내지 1,200 Da의 범위이다. 공정 스트림으로부터 펩티드 및 안료와 같은 HMW 불순물(>1200 Da)뿐만 아니라 염과 같은 LMW 불순물(<400 Da)을 제거하기 위해서, 적어도 2개의 나노여과 단계가 필요하다.
한외여과 후에, >5 kDa 또는 >10 kDa(사용되는 멤브레인에 따라)의 모든 분자가 공정 스트림으로부터 제거되었어야 한다. 상기 한계 아래에 있지만 여전히 표적 올리고당보다 큰 펩티드 및 안료와 같은 불순물을 제거하기 위해서, 제1 나노여과 단계를, HMW 불순물은 잔류물 중에 남아있는 반면 올리고당은 투과물로 통과되게 하는 MWCO를 사용하여 수행할 수 있다.
HMW 불순물로부터 목적하는 올리고당의 대부분을 분리시키고 목적하는 올리고당의 수율을 증가시키기 위해서, 공정은 생성물의 >70%, 바람직하게는 >80%, 보다 바람직하게는 >90%가 멤브레인을 통과할 때까지 실행되어야 한다. 추가로, 정용여과 단계를 포함시켜, 정제된 공정 스트림 중의 올리고당의 수율을 증가시킬 수 있다.
상기 제1 나노여과 단계 후에, 관심 올리고당을 함유하는 공정 스트림 중의 유일한 불순물은 상기 올리고당과 동일하거나 더 낮은 분자량을 가져야 하며, 1가 이온, 2가 이온, 아미노산, 유기산, 단당류 및/또는 올리고당을 포함할 수 있다.
제1 나노여과 단계에 적합한 멤브레인은 400 내지 1,200 Da 범위의 크기 배제를 성취하는 폴리아미드 또는 폴리피페라진 박막 복합 멤브레인 물질을 포함한다. 예로는 HYDRACoRe70(MWCO = 720 Da) 또는 HYDRACoRe50(MWCO = 1,000 Da) 멤브레인(둘 다 Hydranautics(Oceanside, USA)로부터), NADIR® NP01OP(MWCO = 1,000-1,500 Da) 또는 NADIR® NP030P(MWCO = 500-1,000 Da) 멤브레인(Microdyn-Nadir GmbH)이 있다. 상기와 같은 멤브레인은 높은 플럭스를 허용한다. 나노여과에 적합한 멤브레인의 추가적인 예는 Trisep® SBNF(MWCO = 2000 Da), 셀룰로스 아세테이트 나노여과 멤브레인(Microdyn-Nadir GmbH) 및 GE-시리즈 멤브레인(MWCO = 1000 Da)(Suez Water Technologies & Solutions(Ratingen, Germany)로부터)을 포함한다.
추가의 및/또는 대안의 구현예에서, 제1 나노여과 단계는 하기의 매개변수를 달성한다:
i) 관심 올리고당의 여과-후 회수율은 >70%, 바람직하게는 >80%, 보다 바람직하게는 >90%이어야 한다.
ii) 공정 스트림 중 관심 올리고당의 농도는 <50%(w/v), 바람직하게는 <40%(w/v), 보다 바람직하게는 <30%(w/v), 바람직하게는 <20%(w/v), 보다 바람직하게는 <10%(w/v)이어야 한다.
iii) 상기 단계를 <80℃, 바람직하게는 <50℃, 보다 바람직하게는 4-40℃(나노여과에 특히 적합하다)의 온도에서 수행해야 한다.
iv) 상기 단계를 5-50 bar의 압력, 바람직하게는 10-40 bar의 압력, 보다 바람직하게는 15-30 bar의 압력에서 수행해야 한다.
상기 방법의 바람직한 구현예에서, 관심 올리고당을 함유하는 공정 스트림을 제2 나노여과 단계를 적용함으로써, 상기 제1 나노여과 단계 후에 농축시키고 탈염시킨다. 관심 올리고당을 또한 진공 증발(예를 들어 강하막 증발기 또는 플레이트 증발기 사용) 또는 역삼투에 의해 농축시킬 수 있다. 상기 두 기법 모두의 단점은 공정 스트림을 농축시키지만 탈염시키지는 않는다는 것이다. 따라서 나노여과가, 예를 들어 <2 ㎚의 크기 배제 한계로 멤브레인을 사용하여 농축과 탈염을 동시에 달성할 수 있으므로 바람직한 방법이다.
관심 올리고당의 정제 방법은 제1 나노여과 단계의 정제된 공정 스트림에 적어도 하나의 추가적인 나노여과 단계를 수행하여 염, 보다 작은 분자 및 수를 제거하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 상기 제1 나노여과로부터의 용출물(=여액 또는 투과물)에 직접 제2 나노여과 단계를 수행하여 상기 정제된 공정 스트림으로부터 염 및 보다 작은 분자를 제거한다.
상기 제1 나노여과 단계에 적합한 멤브레인은 150-300 Da 범위의 크기 배제를 달성하는 폴리아미드 또는 폴리피페라진 박막 복합 멤브레인 물질, 예를 들어 FilmtecTM NF270(Dow Chemical Company, Midland, USA) 및 Trisep® XN45 또는 TS40 멤브레인(Microdyn Nadir GmbH)을 포함한다. 상기와 같은 멤브레인은 높은 플럭스를 허용한다. 추가적인 예는 Trisep® 4040-XN45-TSF(Microdyn-Nadir GmbH) 또는 GE4040F30 및 GH4040F50 멤브레인(Suez Water Techno logies & Solutions)을 포함한다.
나노여과는 전기투석에 앞서 관심 올리고당을 함유하는 공정 스트림으로부터 상당량의 염 및 LMW 불순물을 효율적으로 제거한다. 나노여과는 또한 한외여과 단계 후에 LMW 오염물질을 효율적으로 제거하며, 여기에서 상기와 같은 오염물질의 제거는 관심 올리고당의 용액의 농축 및 탈염에 이롭다. 관심 올리고당을 농축시키기 위한 나노여과의 사용으로, 보다 제한된 열 노출로 인한 보다 낮은 에너지와 공정 비용, 및 보다 양호한 제품 품질이 생성된다.
상기 방법은 관심 올리고당을 수용액으로부터 농축시키며, 여기에서 상기 수용액 중의 관심 올리고당의 농도는 농축전에 ≤20%, ≤10% 또는 ≤5%이다.
추가의 및/또는 대안의 구현예에서, 나노여과에 의한 농축은 하기의 매개변수를 달성해야 한다:
i) >100 g/L, 바람직하게는 >200 g/L, 보다 바람직하게는 >300 g/L, 가장 바람직하게는 >400 g/L의 올리고당 농도;
ii) 정제된 용액 중의 염의 양은 <10 중량%, 바람직하게는 <5%, 보다 바람직하게는 <2%이어야 하고/하거나; 전도도는 0.5-10.0 mS/㎠, 바람직하게는 1-8 mS/㎠, 보다 바람직하게는 1.5-4.0 mS/㎠이어야 한다.
iii) 상기 단계를 <80℃, 바람직하게는 <50℃, 보다 바람직하게는 4-40℃(나노여과에 특히 적합하다)의 온도에서 수행해야 한다.
iv) 상기 단계를 5-50 bar의 압력, 바람직하게는 10-40 bar의 압력, 보다 바람직하게는 15-30 bar의 압력에서 수행해야 한다.
정제된 용액 및/또는 정화된 용액 중의 안료를 활성탄 처리에 의해 제거할 수 있다. 활성탄을 사용하는 안료 제거의 장점은 전기적으로 하전된 및 전기적으로 하전되지 않은(중성) 안료를 모두 제거할 수 있다는 것이다.
활성탄(또한 활성화된 목탄이라고도 함)은 흡착에 이용가능한 표면적을 증가시키는, 크기가 작고, 부피가 낮은 기공을 생성시키도록 가공된 탄소의 한 형태이다. 전형적으로, 단지 1 g의 활성탄은 그의 고도의 미세-다공도로 인해, 기체 흡착에 의해 측정시 30,00 ㎡ 초과의 표면적을 갖는다.
마이야르 생성물(Maillard product)과 같은 색상-제공 불순물, 리보플라빈 및 다른 LMW 불순물은 목탄 입자의 표면에 흡착되는 경향이 있다. 상기 생성된 올리고당과 대조적으로, 색상-제공 물질의 양은 훨씬 낮고/낮거나 대부분의 경우에 소수성 양상을 나타낸다. 이 사실로 인해, 착색된 오염물질은 공정 스트림으로부터 높은 제거율을 보인다. 올리고당과 같은 수용성 물질은 더 약하게 결합하며 물로 세정함으로써 용출되고, 안료는 표면에 흡착된 채로 남게 될 수 있다.
추가의 및/또는 대안의 구현예에서, 관심 올리고당의 정제 방법은, 선행의 정제 단계로부터 정제된 공정 스트림 또는 용출물을 활성탄으로 처리하여 안료를 제거하는 적어도 하나의 단계를 추가로 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 활성탄 처리를
i) 제2 나노여과 단계에서 수 및 염의 제거 후에; 및/또는
ii) 한외여과에 의한 단백질 제거 후 또는 전기투석에 의한 남아있는 염의 제거 후에(대안으로, 정용여과 단계를 도입시킬 수 있다)
수행해야 한다.
중성 올리고당, 안료 및 다른 오염물질의 제거에 적합한 활성탄은 (비제한적으로) Norit GAC830EN(Cabot Corporation, Boston, USA) 및 Epibon Y 12 x 40 spezial(Donau Carbon, Frankfurt, Germany)과 같은 과립 활성탄 또는 Norit DX1, Norit SA2(Cabot Corporation) 및 Carbopal MB 4(Donau Carbon)와 같은 분말 활성탄이다.
전기투석은 투석과 전기분해를 결합한 것으로 반투과성 멤브레인을 통한 선택적 전기이동에 기반하여 용액 내 이온의 분리 및 농축에 사용될 수 있다. 산업용 전기투석 응용 분야는, 이 방법이 유아용 조제유에 포함시키기 위해 치즈 유청의 탈염에 사용되었던 1960년대 초로 거슬러 올라간다. 추가적인 응용 분야에는 와인, 포도 머스트, 사과 주스 및 오렌지 주스와 같은 음료의 pH 조정이 포함된다.
식수 생산을 위한 기수(brackish water)의 담수화 및 유아용 식품 생산을 위한 우유 유청의 탈염은 오늘날 전기투석의 가장 광범위한 응용 분야이다. 전기투석의 기본 원리는 직류 발생기에 연결된, 이온 전도를 위해 전해질에 잠긴 한 쌍의 전극으로 구성된 전해 전지를 포함한다. 직류 발전기의 양극에 연결된 전극이 양극이고 음극에 연결된 전극이 음극이다. 이어서 전해질 용액은 각각 양극과 음극을 향하는 음이온과 양이온의 이동으로 인해 발생하는 전류 흐름을 지원한다. 전기투석에 사용되는 멤브레인은 본질적으로 음전하 또는 양전하 기를 갖는 다공성 이온 교환 수지의 시트이므로 각각 양이온 또는 음이온 멤브레인으로서 기술된다. 이온 교환 멤브레인은 대개 디비닐벤젠과 가교결합된 적합한 작용기(양이온 멤브레인의 경우 설폰산 또는 음이온 멤브레인의 경우 4차 암모늄기)를 운반하는 폴리스티렌 기질로 이루어진다.
전해질은 예를 들어 염화나트륨, 나트륨 아세테이트, 나트륨 프로피오네이트 및/또는 설팜산을 포함하는 수용액일 수 있다. 전해질은 음극과 양극을 둘러싸고 있으며 전류가 전지 내에서 흐르도록 한다. 이어서 전기투석 스택이, 음이온 및 양이온 멤브레인이 두 전극 블록 사이의 필터 프레스에서와 같이 평행하도록 하는 방식으로 조립되며, 따라서 이온 고갈을 겪는 스트림이 이온 농축을 겪는 스트림과 잘 분리된다. 상기 두 용액은 또한 희석물(이온 고갈을 겪는다) 및 농축물(이온 농축을 겪는다)로서 지칭된다.
전기투석 공정의 심장은 2개의 전극 사이에 설치된 이격자에 의해 분리되는 다수의 음이온 교환 및 양이온 교환 멤브레인으로 이루어지는 멤브레인 스택이다. 직류를 적용함으로써, 음이온 및 양이온이 상기 막을 가로질러 전극을 향해 이동하여 (탈염된) 희석물 스트림과 농축물 스트림을 생성시킬 것이다.
전기투석에 사용되는 이온 교환 멤브레인의 기공 크기는 희석물 스트림으로부터 농축물 스트림으로의, 이들 스트림간의 높은 농도 차이에 의해 구동되는 생성물 확산을 방지하기에 충분히 작다.
전기투석을 사용하여 수용액으로부터 이온을 제거하는 반면, 중성 및 산성 올리고당은 공정 스트림 중에 남아있는다. 전기투석의 중요한 장점은 재조합 DNA 분자가 관심 올리고당을 포함하는 용액으로부터 완전히 제거될 수 있다는 것이다. 더욱이, 공정 스트림 중의 염의 양이 전기투석에 의해 현저하게 감소될 수 있다. 실제로, 염화 나트륨이 생성물 스트림으로부터 완전히 제거될 수 있다. 이는 염화 나트륨과 같은 염이 없는 관심 올리고당을 함유하는 용액을 제공하여, 최종 제품, 예를 들어 유아식에서의 상기 염의 임의의 부정적인 영향을 방지할 수 있다는 장점을 갖는다.
나노여과 및 활성탄 처리 후에, 상기 염 및 유기산과 같은 보다 작은 유기 불순물의 대부분을 공정 스트림으로부터 제거해야 한다. 남아있는 염 및 작은, 하전된 유기 물질의 유효한 제거를 보장하기 위해서, 전기투석 단계를 수행한다.
공정 스트림이 0.05-1.0 mS/㎠, 바람직하게는 0.1-0.5 mS/㎠, 보다 바람직하게는 0.5-0.4 mS/㎠의 안정한 전도도에 도달할 때까지 전기투석을 수행할 수 있다. 더욱이, 염 농도가 <10.0 g/L, 바람직하게는 <5.0 g/L, 보다 바람직하게는 <1.0 g/L, 가장 바람직하게는 <0.2 g/L로 떨어질 때까지 전기투석을 수행할 수 있다.
중성 올리고당의 경우, 전기투석 단계를 산성 또는 중성 pH 조건, 바람직하게는 pH 3-8, 보다 바람직하게는 pH 4-7 하에서 실행해야 한다. 산성 올리고당의 경우, 전기투석 단계를, 산성 조건하에서의 산성 올리고당의 불안정성으로 인해, 중성 pH 조건, 바람직하게는 pH 6-8, 보다 바람직하게는 pH 6.5-7.5 하에서 실행해야 한다. 산성 올리고당 용액의 pH를 전기투석 동안 조절해야 하며 필요한 경우 NaOH로 조정해야 한다.
역삼투 단계를 관심 올리고당의 농축을 위해 나노여과 대신에 사용할 수 있다. 역삼투는 물을 제거하면서 공정 스트림 잔류물 중의 0.1 ㎚를 초과하는 입자를 농축시키는 멤브레인 여과 방법이다. 따라서 역삼투는 공정 스트림을 농축시키지만 탈염을 달성하지는 않는다.
상기 방법은 관심 올리고당을 수성 또는 유기 용매 중에 농축시킬 수 있으며, 여기에서 상기 관심 올리고당의 농도는 농축에 앞서 ≤20%(w/v), ≤10%(w/v) 또는 ≤5%(w/v)이다.
추가의 및/또는 대안의 구현예에서, 농축 단계는 하기의 매개변수를 달성해야 한다:
i) >300 g/L, 바람직하게는 >400 g/L, 보다 바람직하게는 >500 g/L, 가장 바람직하게는 >600 g/L의 올리고당 농도;
ii) 상기 단계를 <80℃, 바람직하게는 <50℃, 보다 바람직하게는 4-40℃(역삼투에 특히 적합하다)의 온도에서 수행해야 한다.
iii) 상기 단계를 5-50 bar의 압력, 바람직하게는 10-40 bar의 압력, 보다 바람직하게는 15-30 bar의 압력에서 수행해야 한다.
상기 공정의 추가의 및/또는 대안의 구현예에서, 중성 및 산성 HMO를 함유하는 용액을 진공 증발(예를 들어 회전 증발기 또는 플레이트 증발기를 사용하여)에 의해 농축시키며 하기의 매개변수를 달성해야 한다:
i) >300 g/L, 바람직하게는 >400 g/L, 보다 바람직하게는 >500 g/L, 가장 바람직하게는 >600 g/L의 올리고당 농도;
ii) 상기 단계를 <80℃, 바람직하게는 <50℃, 보다 바람직하게는 20-50℃, 훨씬 더 바람직하게는 30-45℃, 가장 바람직하게는 35-45℃(진공 증발에 특히 적합하다)의 온도에서 수행해야 한다.
임의의 잠재적인 미생물 오염물질 및 내독소를 제거하기 위해서, 상기 농축된 관심 올리고당을 한외여과 멤브레인 통과에 의해 필터 살균한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 정제된 올리고당 용액을 ≤10 kDa 필터 모듈, 예를 들어 5 kDa 또는 3 kDa MWCO 필터에 통과시킨다. 내독소 제거에 적합한 한외여과 멤브레인은 적어도 10 kDa, 바람직하게는 적어도 5 kDa의 MWCO를 가지며, 나선형으로 감긴 또는 중공-섬유 한외여과 멤브레인일 수 있다. 나선형으로 감긴 멤브레인의 예는 SPIRA-CEL® DS UP010(MWCO = 10 kDa) 또는 DS UP005(MWCO = 5 kDa) 멤브레인(Microdyn-Nadir GmbH) 및 Dairy-Pro® HpHT UF-5K(MWCO = 5 kDa)(Koch Membranes Systems로부터)를 포함한다. 중공-섬유 모듈의 예는 ROMICON® HF UF 카트리지 PM5(MWCO = 5 kDa)(Koch Membranes Systems로부터) 또는 MicrozoaTM 시리즈 멤브레인(MWCO = 3 또는 6)(Pall Cooperation(Port Washington, USA)으로부터)을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 정제된 올리고당 용액을 필터 살균 후에 분무 건조시킨다. 상기 용액을 고온 공기를 사용하여 분무-건조시켜, 바람직하게는 적어도 85 중량%, 또는 보다 바람직하게는 적어도 90 중량%의 물을 제거할 수 있다. 상기 용액을 임의의 통상적인 분무-건조 시스템, 바람직하게는 유동층 건조기가 부착된 시스템을 사용하여 분무-건조시킬 수 있다.
상기 정제된 용액을 5-60 중량%, 바람직하게는 10-50 중량%, 보다 바람직하게는 15-45 중량%의 관심 올리고당 농도를 달성하도록 분무 건조시킬 수 있다. 유입 온도(inlet temperature)를 110-150℃, 바람직하게는 120-140℃, 보다 바람직하게는 125-135℃의 범위내에서 유지시킬 수 있다. 유출 온도(outlet temperature)는 60-80℃, 바람직하게는 65-70℃의 범위내에서 유지시킬 수 있다.
분무 건조 후에, 상기 정제된 관심 올리고당은 하기의 성질을 가질 수 있다:
i) 고체 과립 형태; 및/또는
ii) 차동 주사 열량측정에 의해 측정시 60-90℃, 바람직하게는 62-88℃, 보다 바람직하게는 64-86℃의 유리전이 온도; 및/또는
iii) 레이저 회절에 의해 측정된, 5-500 ㎛, 바람직하게는 10-300 ㎛의 입자 크기; 및/또는
iv) 레이저 회절에 의해 측정된, 10-100 ㎛, 바람직하게는 20-90 ㎛, 보다 바람직하게는 30-80 ㎛, 가장 바람직하게는 40-70 ㎛의 평균 입자 크기; 및/또는
v) 비결정성 상태, 바람직하게는 X-선 분말 회절에 의해 관찰된 결정성 물질의 특징적인 피크가 없는 비결정성 상태; 및/또는
vi) ≤10 중량%, 바람직하게는 ≤8 중량%, 보다 바람직하게는 ≤5 중량%의 수분 함량.
상기 정제된 관심 올리고당을 영양 응용 분야, 바람직하게는 의료 또는 유제품 영양(예를 들어 시리얼 제품), 더욱 바람직하게는 유아 영양 또는 약물, 바람직하게는 위장 장애의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다.
하나의 구현예에서, 관심 올리고당은 중성 올리고당 또는 시알화된 올리고당, 바람직하게는 모유 올리고당이다. 상기 관심 올리고당은 중성 HMO 또는 시알화된 HMO일 수 있다. 추가의 및/또는 대안의 구현예에서, 상기 관심 올리고당은 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 2',3-디푸코실락토스, 락토-N-트리오스 II, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I, 락토-N-네오푸코펜타오스, 락토-N-푸코펜타오스 II, 락토-N-푸코펜타오스 III, 락토-N-푸코펜타오스 V, 락토-N-네오푸코펜타오스 V, 락토-N-디푸코헥사오스 I, 락토-N-디푸코헥사오스 II, 6'-갈락토실락토스, 3'-갈락토실락토스, 락토-N-헥사오스 및 락토-N-네오헥사오스 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스, 시알릴락토-N-테트라오스, 시알릴락토-N-테트라오스, 시알릴락토-N-테트라오스 c, 3-푸코실-시알릴락토스, 디시알릴-락토-N-테트라오스 및 푸코실-LST b로 이루어지는 모유 올리고당의 그룹 중에서 선택된다.
본 발명을 특정 구현예에 관하여, 도면을 참조하여 기재할 것이나, 본 발명은 이들에 제한되지 않고 단지 청구항에 의해서만 제한된다. 더욱이, 상세한 설명 및 청구항에서 제1, 제2 등의 용어는 유사한 요소를 구별하기 위해 사용되며 반드시 시간적으로, 공간적으로, 순위로 또는 임의의 다른 방식으로 순서를 기재하기 위해 사용되는 것은 아니다. 그렇게 사용된 용어는 적합한 상황에서 호환가능하며, 본원에 기재된 본 발명의 구현예는 본원에 기재되거나 예시되는 것과 다른 순서로 실행될 수 있음을 이해해야 한다.
청구항에 사용된 "포함하는"이라는 용어는 이후에 나열된 수단으로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되며; 다른 요소나 단계를 제외하지 않음을 알아야 한다. 따라서 언급된 특징, 정수, 단계 또는 성분의 존재를 명시하는 것으로 해석되어야 하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계 또는 성분, 또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 따라서, "수단 A 및 B를 포함하는 장치"라는 표현의 범위는 성분 A 및 B만으로 이루어지는 장치로 제한되어서는 안 된다. 이는 본 발명에 관하여, 상기 장치의 유일한 관련 성분이 A 및 B임을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸체 "하나의 구현예" 또는 "구현예"란 언급은 상기 구현예와 관련하여 기재된 특정한 특징, 구조 또는 특성이 적어도 하나의 본 발명의 구현예 중에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체를 통해 다양한 곳에서 "하나의 구현예에서" 또는 "구현예에서"란 어구의 출현이 반드시 모두 동일한 구현예를 지칭하는 것은 아니지만, 그럴 수도 있다. 더욱이, 특정한 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 구현예에서 본 개시내용으로부터 당업자에게 명백한 바와 같이 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
유사하게, 본 발명의 예시적인 구현예의 기재에서, 본 발명의 다양한 특징은 때때로 본 개시내용을 간소화하고 발명적 측면 중 하나 이상의 이해를 돕기 위해서 단일 구현예, 도면 또는 그의 설명으로 함께 그룹화된다는 것을 이해해야 한다. 그러나 이러한 개시 방법은 청구된 발명이 각 청구항에 명시적으로 인용된 것보다 더 많은 특징을 필요로 한다는 의도를 반영하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 오히려, 하기의 청구항이 반영하는 바와 같이, 발명적 측면은 단일의 상기 개시된 구현예의 모든 특징보다 적은데 있다. 따라서, 상세한 설명에 이어지는 청구항은 이에 의해 상기 상세한 설명에 명시적으로 포함되며, 이때 각 청구항은 그 자체로 본 발명의 별도의 구현예로서 독립적이다.
더욱이, 본 명세서에 기재된 일부 구현예는 다른 구현예에 포함된 다른 특징이 아닌 일부를 포함하지만, 상이한 구현예의 특징의 조합은 본 발명의 범위 내에 있을 수 있으며, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 상이한 구현예를 형성할 수 있다. 예를 들어, 하기의 청구항에서, 청구된 구현예 중 어느 하나가 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
더욱이, 일부 구현예는 본원에서, 컴퓨터 시스템의 프로세서에 의해 또는 그 기능을 수행하는 다른 수단에 의해 구현될 수 있는 방법으로서 또는 방법의 요소들의 조합으로서 기재된다. 따라서, 상기와 같은 방법 또는 방법의 요소를 수행하는데 필요한 명령이 있는 프로세서는 상기 방법 또는 방법의 요소를 수행하기 위한 수단을 형성한다. 더욱이, 본원에 기재된 장치 구현예의 요소는 본 발명을 수행할 목적으로 상기 요소에 의해 수행되는 기능을 수행하기 위한 수단의 일례이다.
본 명세서에 제공된 설명 및 도면에서, 다수의 특정한 세부사항이 제시된다. 그러나, 본 발명의 구현예는 이러한 특정한 세부사항 없이 실시될 수 있음이 이해된다. 다른 경우들은, 주지된 방법, 구조 및 기법이 상기 설명에 대한 이해를 방해하지 않도록 상세히 나타내지 않았다.
이제 본 발명을 본 발명의 다수의 구현예의 상세한 설명에 의해 기재할 것이다. 본 발명의 다른 구현예는 본 발명의 진의 또는 기술적 교시로부터 이탈됨 없이 당업자의 지식에 따라 구성될 수 있음이 분명하며, 본 발명은 단지 첨부된 청구항에 의해서만 제한된다.
실시예 1: 세균 발효로부터 3-푸코실락토스의 정제
HMO 3-푸코실락토스를 세균 발효에 의해 생성시키고 세균을 여과에 의해 상기 발효 브로쓰로부터 제거하였다. 상기 세균 세포의 제거를 위해서, 상기 발효 브로쓰를 0.05 ㎛의 공칭 기공 크기를 갖는 폴레에테르설폰 멤브레인(NADIR® MP005; Microdyn-Nadir, Wiesbaden)을 사용하는 미세여과, 및 중공 섬유 모듈(ULTRADYN FS-10-FS FUS-1582, 150 kDa MWCO; Microdyn-Nadir, Wesbaden, Germany)을 사용하는 후속적인 한외여과에 의해 여과하였다.
이어서 무-세포 브로쓰(cell-free broth)를 나노여과 단계와 함께 정용여과에 의해 처리하여 염 및 보다 작은 분자를 제거하여, 상기 3-FL의 순도를 증가시켰다. 역삼투 시스템 유형 R040404(Aqmos GmbH, Rodgau, Germany)에 FilmtecTM NF270 나노여과 모듈을 장착시켰다. 출발 부피를 양분함으로써 농도를 증가시키기 위해서 유입 압력을 8 bar로 설정하고 용액을 동일 부피의 역삼투 수로 3회 처리하였다. 이어서 상기 3-FL 용액을 FS-10-FS FUS018110 kDa 중공-섬유 나노여과 모듈(Microdyn-Nadir)에 통과시켜 단백질 및 펩티드를 제거하였다.
3-FL과 크기가 유사한 이온을, CEM:PCSK 양이온 교환 멤브레인 및 CEM:PcAcid60 음이온 교환 멤브레인(크기 배제 한계는 60 Da이다)을 포함하는 PCCell ED 1000A 멤브레인 스택이 장착된 PCCell P15 시스템(PCCell GmbH, Heusweiler, Germany)을 사용하여 전기투석에 의해 공정 스트림으로부터 제거하였다. 상기 출발 용액의 전도도는 8 내지 11 mS/㎠이었으며 전기투석을 전도도가 0.5 mS/㎠로 떨어질 때까지 계속하였다.
이어서 상기 3-FL 용액을 활성탄 분말로 처리하여 안료를 제거하였다. 상기 용액을 Norit DX1 활성탄으로 2h 동안 교반하고, 이어서 후자를 여과에 의해 제거하였다.
또 다른 라운드(round)의 전기투석을 상술한 바와 동일한 셋업을 사용하여 수행하였다. 출발 용액의 전도도는 1.0-1.5 mS/㎠이었으며 전기투석을 전도도가 0.3 mS/㎠로 떨어질 때까지 계속하였다.
전기투석 후에, 상기 3-FL 용액을 CSM RE8040BE 역삼투 모듈이 장착된 Emrich EMRO 1.8 역삼투 시스템(Emrich Edelstahlbau, Polch, Germany)을 사용하여 역삼투에 의해 농축시켰다. 상기 용액을 여과 시스템의 유량이 50 L/h 아래로 떨어질 때까지 농축시켰다. 농축 후 건조 물질은 20 내지 25 중량%였다. 분무 건조를 위해서(실시예 2 참조), 상기 3-FL 용액을 Hei-VAP 산업용 증발기(Heidolph Instruments GmbH, Schwabach, Germany)를 사용하여 45 중량% 건조 물질로 추가로 농축시켰다. 고도로-농축된 3-FL 용액을 5 kDa Spira-Cell WY UP005 2440 C 한외여과 멤브레인(Microdyn-Nadir)에 통과시킴으로써 필터-살균하여 내독소를 제거하였다.
상기 방법에 의한 정제된 발효 브로쓰로부터의 3-푸코실락토스의 정제를 예시하는 HPLC 크로마토그램을 도 6 및 도 7에 나타낸다. 도 6은 정제된 발효 브로쓰의 HPLC 크로마토그램을 도시하는 반면, 도 7은 도 6에 도시된 HPLC 크로마토그램으로 이어지는 정제된 발효 브로쓰로부터 수득된 멸균 여과된 공정 스트림의 HPLC 크로마토그램을 도시한다. 이들 크로마토그램의 비교는 정제된 발효 브로쓰의 HPLC 크로마토그램 중의 피크의 대부분(각각의 피크는 적어도 하나의 화합물을 나타낸다)이 멸균 여과된 공정 스트림의 HPLC 크로마토그램에는 존재하지 않음을 드러낸다.
실시예 2: 분무 건조에 의한 고체 형태의 3-푸코실락토스의 수득
여과 및 전기투석에 의해 수득된 3-FL 용액을 45 중량%로 농축시키고 필터 살균하여 실시예 1에 기재된 바와 같은 임의의 생물부담(bioburden) 및 내독소를 제거하였다. 이어서 고도로-농축되고 살균된 3-FL 용액을 LTC-GMP 분무 건조기(Nubilosa, Konstanz, Germany)를 사용하여 분무 건조시켰다. 상기 45 중량%의 3-FL 용액을 130℃ 및 3.5 bar에서 분무 건조기 노즐에 통과시키고, 66-67℃의 배기 온도가 유지되도록 흐름을 조정하였다. 이러한 셋팅을 사용하여, 5% 미만의 수분을 함유하는 분무 건조된 분말을 수득하였다. 상기 수분 함량을 Karl-Fischer 적정에 의해 측정하였다.

Claims (17)

  1. 발효 브로쓰(fermentation broth)로부터 관심 올리고당(oliggosaccharide of interest)을 정제하는 방법으로서,
    - 상기 관심 올리고당, 바이오매스(biomsass), 미생물 세포 및, 상기 관심 올리고당 이외의 탄수화물을 함유하는 발효 브로쓰를 제공하고;
    - 상기 발효 브로쓰로부터 상기 미생물 세포를 제거하고, 이에 의해 공정 스트림(process stream)을 제공하며;
    - 상기 공정 스트림에 나노여과 멤브레인(nanofiltration membrane)을 사용하는 제1 여과 단계를 수행하고, 이에 의해 상기 관심 올리고당을 함유하는 여액(filtrate)을 제공하고;
    - 상기 여액에 나노여과 멤브레인을 사용하는 제2 여과 단계를 수행하고, 이에 의해 상기 관심 올리고당을 함유하는 잔류물(retentate)을 제공하고;
    - 전기투석을 사용하여 상기 공정 스트림으로부터 염을 제거하고, 이에 의해 상기 관심 올리고당의 정제된 제제를 제공함
    을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    미생물 세포를, 발효 브로쓰에 적어도 하나의 원심분리 단계 및/또는 적어도 하나의 여과 단계를 수행하여 발효 브로쓰로부터 제거하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    적어도 하나의 여과 단계가 미세여과, 바람직하게는 약 500 kDa의 분자량 컷-오프, 보다 바람직하게는 약 150 kDa의 분자량 컷-오프(molecular weight cut-off)를 갖는 멤브레인을 사용하는 미세여과인 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    공정 스트림에, 약 50 kDa의 분자량 컷-오프, 바람직하게는 약 30 kDa의 분자량 컷-오프, 보다 바람직하게는 10 kDa의 분자량 컷-오프를 갖는 멤브레인을 사용하는 적어도 하나의 한외여과(ultrafiltration)의 단계를 수행하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 여과 단계에 사용된 나노여과 멤브레인이 약 700 달톤 내지 약 3,000 달톤의 분자량 컷-오프, 바람직하게는 약 1,000 내지 약 2,000 달톤의 분자량 컷-오프를 갖는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 여과 단계에 사용된 나노여과 멤브레인이 100 달톤 내지 1,000 달톤의 분자량 컷-오프, 바람직하게는 약 150 달톤 내지 약 500 달톤의 분자량 컷-오프, 보다 바람직하게는 약 200 내지 약 300 달톤의 분자량 컷-오프를 갖는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    관심 올리고당이 중성 올리고당 또는 시알화된 올리고당, 바람직하게는 중성 HMO 또는 시알화된 HMO, 보다 바람직하게는 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 2',3-디푸코실락토스, 락토-N-트리오스 II, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I, 락토-N-네오푸코펜타오스, 락토-N-푸코펜타오스 II, 락토-N-푸코펜타오스 III, 락토-N-푸코펜타오스 V, 락토-N-네오푸코펜타오스 V, 락토-N-디푸코헥사오스 I, 락토-N-디푸코헥사오스 II, 6'-갈락토실락토스, 3'-갈락토실락토스, 락토-N-헥사오스 및 락토-N-네오헥사오스 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스, 시알릴락토-N-테트라오스, 시알릴락토-N-테트라오스, 시알릴락토-N-테트라오스 c, 3-푸코실-시알릴락토스, 디시알릴-락토-N-테트라오스 및 푸코실-LST b로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 HMO, 또는 표 1에 나열된 바와 같은 임의의 다른 HMO인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    공정 스트림에,
    i) 잔류물 중의 염의 양이 <10 중량%, 바람직하게는 <5 중량%, 보다 바람직하게는 ≤2 중량%이고/이거나,
    ii) 전도도가 0.5 내지 10.0 mS/㎠, 바람직하게는 1 내지 8 mS/㎠, 보다 바람직하게는 1.5 내지 4.0 mS/㎠이도록
    제2 여과 단계를 수행하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    공정 스트림에 농축 단계, 바람직하게는 역삼투 및/또는 추가적인 나노여과 단계에 의한 농축, 바람직하게는 200 내지 300 Da 범위의 분자량 컷-오프를 갖는 나노여과 멤브레인을 사용하는 나노여과 단계에 의한 농축을 수행하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    농축 단계를
    - <80℃, 바람직하게는 <50℃, 보다 바람직하게는 4℃ 내지 45℃, 보다 바람직하게는 10℃ 내지 40℃, 훨씬 더 바람직하게는 15 내지 30℃, 가장 바람직하게는 15 내지 20℃의 온도에서 나노여과에 의해; 및/또는
    - 20℃ 내지 50℃, 보다 바람직하게는 30℃ 내지 45℃, 가장 바람직하게는 35℃ 내지 45℃의 온도에서 역삼투에 의해; 및/또는
    - >5 bar 내지 <50 bar의 압력, 바람직하게는 >10 bar 내지 <40 bar의 압력, 보다 바람직하게는 >15 내지 <30 bar의 압력에서
    수행하는 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    공정 스트림에, 관심 올리고당의 농도가 ≥100 g/L, 바람직하게는 ≥150 g/L, 보다 바람직하게는 ≥200 g/L이도록 농축 단계를 수행하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    공정 스트림에, 바람직하게는 상기 공정 스트림을 활성탄으로 처리함으로써 착색제fmf 제거하는 단계를 수행하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    착색제를 제거하는 단계를
    i) 정용여과 단계 전 또는 후에;
    ii) 공정 스트림의 농축 단계 전 또는 후에; 및/또는
    iii) 전기투석 단계 전 또는 후에
    수행하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    전기투석이 중성 조건하에서의 전기투석 또는 산성 조건하에서의 전기투석인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    함유된 염의 제거 후의 공정 스트림이
    i) <1 중량%, 바람직하게는 <0.5 중량%, 보다 바람직하게는 <0.2 중량%인 염의 양을 포함하고; 및/또는
    ii) 0.05 내지 1.0 mS/㎠, 바람직하게는 0.1 내지 0.5 mS/㎠, 보다 바람직하게는 0.2 내지 0.4 mS/㎠의 전도도를 갖는
    방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    공정 스트림을 분무 건조시키는, 바람직하게는
    i) 110-150℃, 바람직하게는 120-140℃, 보다 바람직하게는 125-135℃ 범위의 유입 온도(inlet temperature)에서; 60-80℃, 65-70℃ 범위의 배출 온도(outlet temperature)에서; 및/또는
    ii) 5-60 중량%, 바람직하게는 10-50 중량%, 보다 바람직하게는 15-45 중량%의 공정 스트림 중의 관심 올리고당의 농도에서
    분무 건조시키는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    정제된 제제 중의 관심 올리고당의 순도가 상기 정제된 제제의 건조 물질(dry matter)에 대해서, ≥80 중량%, 바람직하게는 ≥85 중량%, 보다 바람직하게는 ≥90 중량%인 방법.
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