TW202221136A - 藉由細胞培養或微生物發酵產生之不同寡糖的純化混合物的製造方法 - Google Patents

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加斯帕德 勒克斯
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Abstract

本發明屬於用於寡醣生產的細胞培養或發酵技術領域。本案揭露了一種藉由細胞培養或微生物發酵產生之不同寡糖的純化混合物的製造方法。

Description

藉由細胞培養或微生物發酵產生之不同寡糖的純化混合物的製造方法
本發明屬於寡醣生產的細胞培養或發酵的技術領域。本申請揭露了一種藉由細胞培養或微生物發酵產生之不同寡糖的純化混合物的製造方法。
寡醣通常與蛋白質和脂質醣結合，以醣接合物型態(glyco-conjugated forms)存在，參與許多重要現象，例如與受精、胚胎發生、炎症、轉移和宿主病原體附著(host pathogen adhesion)的發育和過程相關的分化、發育和生物識別過程。寡醣也可以作為未結合的聚醣存在於體液和母乳中，其中它們還調節重要的發育和免疫過程。(Bode, Early Hum. Dev. 1-4 (2015); Reily et al., Nat. Rev. Nephrol. 15, 346-366 (2019); Varki, Glycobiology 27, 3-49 (2017)) 例如，幾種寡醣已被證明可作為誘餌(decoys)，通過與哺乳動物細胞表面醣蛋白結合，從而降低細菌和病毒的病原體附著在哺乳動物細胞的風險。如今，寡醣通過化學、化學酶合成或通過(代謝工程)細胞或微生物的培養或發酵以工業規模生產。在生產之後，較佳將寡醣純化以添加到相應的應用中。
為了利用特定寡醣的有利功效，將單獨的寡醣添加到營養組成物、化妝品、藥物組成物和植物保護產品中。在某些情況下，補充不同寡醣的組合更為方便，因為這樣的組成物，例如如果寡醣混合物是哺乳動物乳寡醣的混合物，則其更接近於寡醣的天然來源。在其他情況下，通過在一次培養或發酵中生產寡醣混合物，並將寡醣混合物一起從生物質、培養基組分和污染物中純化，以更簡單的方式更有效地生產特定寡醣的混合物，而不將不同的寡醣從彼此分開。
因此，需要一種方法，其提供純化的不同寡醣的混合物，佳較呈固體形式，其中此方法適用於工業規模生產，並且不涉及在不同寡醣的純化過程中的分離，隨後將不同的寡糖混合到最終溶液或粉末中。
該目的已通過一種藉由細胞培養或微生物發酵產生之不同寡糖的純化混合物的製造方法實現。
在第一態樣，本發明實施例提供了一種生產純化的不同寡醣的混合物的方法，其係由至少一細胞，較佳微生物的細胞，合成不同寡醣的混合物而生產。
在第二態樣，本發明實施例提供了一種生產噴霧乾燥的粉末的方法，所述粉末大抵由結構不同的寡醣的混合物組成或包括結構不同的寡醣的混合物。
在第三態樣，本發明實施例提供了一種生產不同寡醣的混合物的糖漿的方法，所述糖漿具有8%-75%之間的白利甜度。
在第四態樣，本發明實施例提供了一種噴霧乾燥的粉末，大抵由結構不同的寡醣的混合物組成或包括結構不同的寡醣的混合物，較佳用於營養組成物、膳食補充劑、藥物成分及／或化妝品成分的生產。
在第五態樣，本發明實施例提供了一種營養組成物，包含大抵由結構不同的寡醣的混合物組成的乾燥粉末或含有結構不同的寡醣的混合物的乾燥粉末。 [定義]
本說明書中用於描述本發明及其各種實施例的詞語不僅應理解為它們通常定義的含義，但在本規範中通過特殊的定義，將超出通常定義的含義範圍的結構、材料或行為包括在內。因此，如果在本說明書的上下文中一個元素可以被理解為包括不止一個含義，那麼它在申請專利範圍的使用必須被理解為對說明書和該詞本身支持的所有可能含義是通用的。
在此公開的本發明的各個實施例及實施例的態樣不僅應當按照本說明書中具體描述的順序和上下文來理解，而且應當包括任何順序及其任何組合。當上下文需要時，所有以單數形式使用的詞語均應視為包括複數形式，反之亦然。除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語通常具有與本發明所屬領域具有通常知識者一般理解的相同含義。通常，本文所用的命名法以及本文描述的細胞培養、分子遺傳學、有機化學和核酸化學以及雜交中的實驗室程序是本領域熟知和常用的那些。標準技術用於核酸和胜肽合成。通常，純化步驟根據製造商的規格進行。
在說明書中，已經公開了本發明的實施例，並且儘管使用了特定術語，但是這些術語僅用於描述意義而不是為了限制的目的，本發明的範圍在申請專利範圍中闡述。必須理解的是，所說明的實施例僅出於示例的目的而被闡述並且不應將其視為對本發明的限制。對本發明所屬技術領域中具有通常知識者顯而易見的是，可以做出與本文的本發明的文字和精神一致並且在本發明的範圍內的改變、其他實施例、改進、細節和使用，本發明僅由申請專利範圍限定，並且根據專利法解釋，包括等效原則。在隨後的申請專利範圍中，用於指定申請專利範圍步驟的參考字元只是為了方便描述，並不意味著執行這些步驟的任何特定順序。
在本文件及其申請專利範圍中，動詞「包括」及其變體以其非限制性意義使用以表示包括該詞之後的項目，但不排除未特別提及的項目。在本案中，動詞「包括」可以替換為「包含」或「大抵包括」，反之亦然。此外，動詞「包含」可以替換為「大抵由…組成」，意思是如本文所定義的組成物可以包含除具體確定的組分之外的附加組分，所述附加組分不改變的獨特特徵本發明。此外，不定冠詞「一」或「1」對元素的引用並不排除存在多個元素的可能性，除非上下文明確要求存在一個且僅一個元素。因此，不定冠詞「一」或「1」通常表示「至少一個」。在整個申請中，除非另有明確說明，否則冠詞「一」或「1」較佳地被「至少兩個」替代，更佳被「至少三個」替代，又更佳被「至少四個」替代，又更佳被「至少五個」替代，又更佳被地「至少六個」替代，最佳地被「至少七個」替代。
除非另有說明，否則本文中確定的每個實施例都可以組合在一起。本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請均以引用方式併入本文，其程度就如同每個單獨的出版物、專利或專利申請被具體地和單獨地指示為以引用方式併入一樣。優先權申請EP20190209的全部內容也以引用方式併入，如同所述優先權申請被具體且單獨地指示以引用方式併入一樣。
如本文所用的關於細胞或宿主細胞的術語「重組的」或「轉基因的」或「代謝工程化的」或「基因改造的」可互換使用，並表示細胞複製異源核酸，或表達由異源核酸編碼的胜肽或蛋白質(即「所述細胞外的」序列或「所述細胞中的所述位置或環境外」的序列)。此類細胞被描述為用至少一種異源或外源基因轉化，或描述為通過引入至少一種異源或外源基因而轉化。代謝工程或重組或轉基因細胞可以包含在細胞的天然(非重組)形式中找不到的基因。重組細胞還可以包含在細胞的天然形式中發現的基因，其中此基因被修飾並通過人工手段重新引入細胞中。該術語還包括含有細胞內源性核酸的細胞，該核酸已被修飾或其表達或活性已被修飾而不從細胞中去除核酸；此類修飾包括通過基因置換、啟動子置換、定點突變(site-specific mutation)和相關技術獲得的修飾。因此，「重組多肽」是由重組細胞生產的多肽。如本文所用，「異源序列」或「異源核酸」是源自對特定細胞而言外來的來源(例如，來自不同物種)，或者如果來自相同來源，則是從其原始形式或基因組中的位置進行修改。因此，與啟動子可操作連接的異源核酸來自與啟動子不同的來源，或者如果來自相同來源，則其從原始形式或基因組中的位置進行修飾。可以穩定地引入異源序列，例如通過轉染(transfection)、轉化(transformation)、接合(conjugation)或轉導(transduction)到宿主微生物細胞的基因組中，其中可採用的技術將取決於要引入的細胞和序列。各種技術是本領域具有通常知識者習知的並且在例如Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)中公開。在本發明的上下文中使用的術語「突變的」細胞或微生物是指經基因改造的細胞或微生物。
在本發明的上下文中，術語「內源的」是指細胞的天然部分並出現在其在細胞染色體中的天然位置的任何多核苷酸、多肽或蛋白質序列，並且與作用於其表達的自然控制機制相比，其表達的控制沒有改變。術語「外源的」是指起源於所研究的細胞外部而不是細胞的天然部分，或者不存在於細胞染色體或質體中的天然位置的任何多核苷酸、多肽或蛋白質序列。
術語「異源的」當用於多核苷酸、基因、核酸、多肽或酶時，是指來自或源自自宿主以外的來源生物物種的多核苷酸、基因、核酸、多肽或酶。相反，「同源」多核苷酸、基因、核酸、多肽或酶在本文中用於表示源自宿主生物物種的多核苷酸、基因、核酸、多肽或酶。當提及用於維持或操縱基因序列的基因調控序列或的輔助核酸序列(例如啟動子、5'非轉譯區、3'非轉譯區、polyA添加序列、內含子序列、剪接位、核醣體結合位、內部核醣體進入序列、基因組同源區、重組位等)，「異源」是指調控序列或輔助序列與該調控或輔助核酸序列在構建體、基因組、染色體或游離基因組中並列的基因沒有天然聯繫。因此，與在天然狀態下(即在非遺傳工程生物體的基因組中)未與其可操作連接的基因可操作地連接的啟動子在本文中被稱為「異源啟動子」，即使啟動子可能來自與其連接的基因相同的物種(或在某些情況下，相同的生物體)。
術語「野生型」是指自然界中常見的遺傳或表現型情況。
如本文所用，術語「單醣」是指不能通過水解分解成更簡單醣的糖，被歸類為醛糖或酮糖，並且每個分子含有一個或多個羥基。單醣是僅含有一種單醣的醣類。單醣的例子包括己醣、D-哌喃葡萄糖(Glucopyranose)、D-呋喃半乳糖(Galactofuranose)、D-哌喃半乳糖(Galactopyranose)、L-哌喃半乳糖(Galactopyranose)、D-哌喃甘露糖(Mannopyranose)、D-哌喃別糖(Allopyranose)、L-哌喃阿卓糖(Altropyranose)、D-哌喃古洛糖(Gulopyranose)、L-哌喃碘糖(Idopyranose)、D-哌喃塔羅糖(Talopyranose)、D-呋喃核糖(Ribofuranose)、D-哌喃核糖(Ribopyranose)、D-阿拉伯呋喃糖(Arabinofuranose)、D-阿拉伯哌喃糖(Arabinopyranos)、L-阿拉伯呋喃糖、L-阿拉伯哌喃糖、D-哌喃木糖(Xylopyranose)、D-來蘇糖(Lyxopyranose)、D-赤呋喃糖(Erythrofuranose)、D-呋喃蘇糖(Threofuranose)、庚糖、L-甘油-D-甘露糖-哌喃庚糖(L-glycero-D-manno-Heptopyranose,LDmanHep)、D-甘油-D-甘露糖-哌喃庚糖(DDmanHep)、6-去氧-L-哌喃阿卓糖、6-去氧-D-哌喃古洛糖、6-去氧-D-哌喃塔羅糖、6-去氧-D-哌喃半乳糖、6-去氧-L-哌喃半乳糖、6-去氧-D-哌喃甘露糖、6-去氧-L-哌喃甘露糖、6-去氧-D-哌喃葡萄糖、2-去氧-D-阿拉伯-己醣、2-去氧-D-赤型-戊糖、2,6-雙去氧-D-阿拉伯-哌喃己醣、3,6-雙去氧-D-阿拉伯-哌喃己醣、3,6-雙去氧-L-阿拉伯-哌喃己醣、3,6-雙去氧-D-木-哌喃己醣、3,6-雙去氧-D-核糖-哌喃己醣、2,6-雙去氧-D-核糖-哌喃己醣、3,6-二去氧-L-木-哌喃己醣、2-胺基-2-去氧-D-哌喃葡萄糖、2-胺基-2-去氧-D-哌喃半乳糖、2-胺基-2-去氧-D-哌喃甘露糖、2-胺基-2-去氧-D-哌喃別糖、2-胺基-2-去氧-L-哌喃阿卓糖、2-胺基-2-去氧-D-哌喃古洛糖，2-胺基-2-去氧-L-哌喃碘糖、2-胺基-2-去氧-D-哌喃塔羅糖，2-乙醯胺基-2-去氧-D-葡萄糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-半乳糖，2-乙醯胺基-2-去氧-D-甘露糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-哌喃別糖、2-乙醯胺基-2-去氧-L-哌喃阿卓糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-哌喃古洛糖、2-乙醯胺基-2-去氧-L-哌喃碘糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-哌喃塔羅糖、2-乙醯胺基-2,6-去氧-D-半乳糖、2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-半乳糖、2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-甘露糖，2-乙醯胺基-2,6-二去氧-D-葡萄糖、2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-哌喃阿卓糖、2-乙醯胺基-2,6-二去氧-D-哌喃古洛糖、D-哌喃葡萄糖醛酸(Glucopyranuronic acid)、D-哌喃半乳醣醛酸(Galactopyranuronic acid)、D-哌喃甘露醣醛酸(Mannopyranuronic acid)、D-哌喃別醣醛酸(Altropyranuronic acid)、L-哌喃阿卓糖醛酸(Altropyranuronic acid)、D-哌喃古洛醣醛酸(ulopyranuronic acid)、L-哌喃古洛醣醛酸、L-哌喃碘醛糖(Idopyranuronic acid)、D-哌喃塔羅糖醛酸(Talopyranuronic acid)、唾液酸、5-胺基-3,5-二脱氧-D-甘油-D-半乳糖-壬-2-酮醣酸(5-Amino-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-non-2- ulosonic acid)、5-乙醯胺基-3,5-二脱氧-D-甘油-D-半乳糖-壬-2-酮醣酸、赤蘚糖醇(Erythritol)、阿拉伯糖醇(Arabinitol)、木糖醇(Xylitol)、核糖醇(Ribitol)、葡萄糖醇(Glucitol)、半乳糖醇(Galactitol)、甘露醇(Mannitol)、D-核糖-己-2-哌喃酮糖(D-arabino-Hex-2-ulopyranose)、D-阿拉伯-己-2-呋喃酮糖(D-arabino-Hex-2-ulofuranose (D-fructofuranose))、D-阿拉伯-己-2-哌喃酮糖(D-arabino-Hex-2-ulopyranose)、L-木-己-2-哌喃酮糖(L-xylo-Hex-2-ulopyranose)、D-來蘇糖-己-2-哌喃酮糖(D-lyxo-Hex-2-ulopyranose)、D-蘇糖-戊-2-哌喃酮糖(D-threo-Pent-2-ulopyranose)、D-阿卓糖-庚-2-哌喃酮糖(D-altro-Hept-2-ulopyranose)、3-C-(羥甲基)-D-赤呋喃糖(3-C-(Hydroxymethyl)-D-erythofuranose、2,4,6-三去氧-2,4-二胺基-D-哌喃葡萄糖、6-去氧-3-O-甲基-D-葡萄糖、3-O-甲基-D-鼠李糖(3-O-Methyl-D-rhamnose)、2,6-二去氧-3-甲基-D-核-己醣、2-胺基-3-O-[(R)-1-羧基乙基]-2-去氧-D-哌喃葡萄糖、2-乙醯胺基-3-O-[(R)-羧基乙基]-2-脱氧-D-哌喃葡萄糖、2-糖基醯胺基-3-O-[(R)-1-羧基乙基]-2-脱氧-D-哌喃葡萄糖、3-去氧-D-來蘇糖-庚-2-哌喃酮糖(3-Deoxy-D-lyxo-hept-2-ulopyranosaric acid)、3-去氧-D-甘露-辛-2-哌喃酮糖(3-Deoxy-D-manno- oct-2-ulopyranosonic acid)、3-去氧-D-甘油-D-半乳糖基-壬-2-哌喃酮糖(3-Deoxy-D-manno-oct-2- ulopyranosonic acid)、5,7-二胺基-3,5,7,9-四去氧-L-甘油-L-甘露-壬-2-哌喃酮糖、5,7-二胺基-3,5,7,9-四去氧-L-甘油-L-阿卓糖-壬-2-哌喃酮糖、5,7-二胺基-3,5,7,9-四去氧-D-甘油-D-半乳糖基-壬-2-哌喃酮糖、5,7-二胺基-3,5,7,9-四去氧-D-甘油-D-塔羅糖-壬-2-哌喃酮糖、葡萄糖、半乳糖、N-乙醯葡萄糖胺、葡萄糖胺、甘露糖、木糖、N-乙醯甘露糖胺、N-乙醯神經胺酸、N-羥乙醯神經胺酸、唾液酸、N-乙醯半乳糖胺、半乳糖胺、岩藻糖、鼠李糖、葡萄醣醛酸、葡萄糖酸、果糖和多元醇。
術語多元醇是指含有多個羥基的醇。例如，甘油、山梨糖醇或甘露糖醇。
如本文所用，術語「雙醣」是指由兩個單醣單元組成的醣。雙醣的例子包括乳糖(Gal-b1,4-Glc)、乳糖-N-雙醣(Gal-b1,3-GlcNAc)、N-乙醯乳糖胺(Gal-b1,4-GlcNAc)、LacDiNAc(GalNAc-b1,4 -GlcNAc)、N-乙醯半乳糖胺基葡萄糖 (GalNAc-b1,4-Glc)、Neu5Ac-a2,3-Gal、Neu5Ac-a2,6-Gal和哌喃岩藻糖基-(1-4)-N-羥乙醯神經胺酸 (fucopyranosyl- (1-4)-N-glycolylneuraminic acid, Fuc-(1)-4)-Neu5Gc)。
「寡醣」是由三個或更多個單醣次單元組成的聚醣結構，這些次單元通過糖苷鍵以線性或支鏈結構相互連接。在此使用的術語「寡醣」是指含有少量，通常為三至二十個簡單醣類，即單醣。較佳地，如本文所述的寡醣包含選自如上文所使用的列表的單醣。寡醣的實例包括但不限於路易斯型抗原寡醣、唾液酸化寡醣、岩藻糖基化寡醣、殼聚醣(chitosan)、殼聚醣寡醣、硫酸化殼聚醣、乙醯化殼聚醣、肝素原(heparosan)、硫酸軟骨素(chondroitin sulphate)、醣胺聚醣寡糖(glycosaminoglycan oligosaccharide)、肝素(heparin)、硫酸乙醯肝素(heparan sulphate)、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素(dermatan sulphate)、玻尿酸或透明質酸、硫酸角質素(keratan sulphate)、哺乳動物乳寡醣和人乳寡醣。
如本文所用，「哺乳動物乳寡醣」(mammalian milk oligosaccharide, MMO)是指寡醣例如但不限於乳糖基-N-丙糖II、3-岩藻糖基乳糖、2'-岩藻糖基乳糖、6-岩藻糖基乳糖、2',3-二岩藻糖基乳糖、2',2-二岩藻糖基乳糖、3,4-二岩藻糖基乳糖、6'-唾液酸乳糖、3'-唾液酸乳糖、3,6-二唾液酸乳糖、6,6'-二唾液酸乳糖、8,3-二唾液酸乳糖、3,6-二唾液酸乳糖-N-四糖、乳二岩藻糖四糖(lactodifucotetraose)、乳糖基-N-四糖、乳糖基-N-新四糖、乳糖基-N-岩藻五糖II、乳糖基-N-岩藻糖五糖I、乳糖基-N-岩藻糖五糖III、乳糖基-N-岩藻糖五糖V、乳糖基-N-岩藻糖五糖VI、唾液酸乳糖基-N-新四糖d、唾液酸乳糖基-N-新四糖c、唾液酸乳糖基-N-四糖b、唾液酸乳糖基-N-四糖a、乳糖基-N-二岩藻糖六糖I、乳糖基-N-二岩藻糖六糖II、乳糖基-N-六糖、乳糖基-N-新六糖、對-乳糖基-N-六糖、單岩藻糖基單唾液酸乳糖基-N-新四糖c (monofucosylmonosialyllacto)、單岩藻糖基對-乳糖基-N-六糖、單岩藻糖基乳糖基-N-六糖III、異構岩藻糖基乳糖基-N-六糖III、異構岩藻糖基乳糖基-N-六糖I、唾液酸乳糖基-N-六糖、唾液酸乳糖基-N-新六糖II、二岩藻糖基-對-乳糖基-N-六糖、二岩藻糖基乳糖基-N-六糖、二岩藻糖基乳糖基-N-六糖a、二岩藻糖基乳糖基-N-己醣c、半乳糖基化殼聚醣、岩藻糖基化寡醣、中性寡醣及／或唾液酸化寡醣。哺乳動物乳寡醣(MMO)包含存在於哺乳期間任何階段的乳汁中的寡醣，包括來自人類的初乳(colostrum milk)(即人乳寡醣或HMOs(human milk oligosaccharides))和哺乳動物的初乳，哺乳類包括但不限於奶牛( Bos Taurus)、綿羊( Ovis aries)、山羊( Capra aegagrus hircus)、雙峰駝( Camelus bactrianus)、馬( Equus ferus caballus)、豬( Sus scropha)、狗( Canis lupus familiaris)、棕熊( Ursus arctos yesoensis)、北極熊( Ursus maritimus)、日本黑熊( Ursus thibetanus japonicus)、條紋臭鼬( Mephitis mephitis)、海豹( Cystophora cristata)、亞洲象( Elephas Africa maximus)、非洲象( Loxodonta Africana)、巨型食蟻獸( Myrmecophaga tridactyla)、寬吻海豚( Tursiops truncates)、北方小鬚鯨( Balaenoptera acutorostrata)、尤金袋鼠( Macropus eugenii)、紅袋鼠( Macropus rufus)、刷尾負鼠( Trichosurus Vulpecula)、無尾熊( Phascolarctos cinereus)、東袋鼬( Dasyurus viverrinus)、鴨嘴獸( Ornithorhynchus anatinus)。人乳寡醣(HMOs)也稱為人乳相同寡醣(human identical milk oligosaccharides)，其化學性質與人乳中發現的人乳寡醣相同，但通過生物技術生產(例如使用無細胞系統或細胞和生物體，包括細菌、真菌、酵母、植物、動物或原生動物細胞，優選基因工程細胞和生物體)。人類相同乳寡醣以HiMO的名稱銷售。
如本文所用，「基於乳糖的哺乳動物乳寡糖(MMO)」是指如本文所定義的MMO，其在其還原端含有乳糖。
如本文所用，術語「路易斯型抗原」包括以下寡醣：H1抗原，即Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc，或簡稱為2'FLNB；Lewisa，即三糖Galβ1-3[Fucα1-4]GlcNAc，或簡稱4-FLNB； Lewisb，即四糖Fucα1-2Galβ1-3[Fucα1-4]GlcNAc，或簡稱DiF-LNB；sialyl Lewisa，即5-乙醯神經氨醯-(2-3)-半乳糖基-(1-3)-(哌喃岩藻糖基-(1-4))-N-乙醯葡萄糖胺，或簡寫為 Neu5Acα2-3Galβ1-3[Fucα1-4]GlcNAc;H2抗原，即Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc，或稱為2'岩藻糖基-N-乙醯-乳糖胺，簡稱2'FLacNAc；Lewisx，即三糖Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc，或稱為3-岩藻糖基-N-乙醯-乳糖胺，簡稱3-FLacNAc；Lewisy，即四糖Fucα1-2Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc和sialyl Lewisx，即5-乙醯神經氨醯-(2-3)-半乳糖基-(1-4)-(哌喃岩藻糖基-(1-3))-N-乙醯葡萄糖胺，或簡寫為Neu5Acα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc。
如本文所用，「唾液酸化寡醣」應理解為含有帶電的唾液酸的寡醣，即具有唾液酸殘基的寡醣。它具有酸性。唾液酸化寡醣包含至少一個唾液酸單醣次單元，例如但不限於Neu5Ac和Neu5Gc。所述唾液酸化寡醣是包含至少三個通過糖苷鍵相互連接的單醣次單元的醣結構，其中所述單醣次單元中的至少一個是唾液酸。所述唾液酸化寡醣可包含多於一個唾液酸殘基，例如兩個、三個或更多的唾液酸殘基。所述唾液酸可通過包含α-2,3、α-2,6鍵的α-糖苷鍵連接至包含半乳糖、GlcNAc、唾液酸的其他單醣次單元。一些例子是3-SL(3'-唾液酸乳糖或3'-SL或 Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,4-Glc)、3'-唾液酸乳糖胺、6-SL(6'-唾液酸乳糖或6'-SL或Neu5Ac-a2,6-Gal-b1,4-Glc)、6'-唾液酸乳糖胺、包含6'-唾液酸乳糖、3,6-二唾液酸乳糖的寡醣(Neu5Ac-a2,3-(Neu5Ac-a2,6)-Gal-b1,4-Glc)、6,6'-二唾液酸乳糖(Neu5Ac-a2,6-Gal-b1,4-(Neu5Ac-a2,6)-Glc)、8,3-二唾液酸乳糖(Neu5Ac-a2,8-Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,4-Glc)、SGG六糖(Neu5Acα-2,3Galβ-1,3GalNacβ-1,3Galα-1,4Galβ-1,4Gal)、唾液酸化四糖(Neu5Acα-2,3Galβ-1,4GlcNacβ -14GlcNAc)、五糖LSTD(Neu5Acα-2,3Galβ-1,4GlcNacβ-1,3Galβ-1,4Glc)、唾液酸化乳糖-N-丙糖、唾液酸化乳糖-N-四糖、唾液酸乳糖基-N-新四糖、單唾液酸乳糖基-N-六糖、二唾液酸乳糖基-N-六糖I、單唾液酸乳糖基-N-新六糖I、單唾液酸乳糖基-N-新六糖II、二唾液酸乳糖基-N-新六糖、二唾液酸乳糖基-N-四糖、二唾液酸乳糖基-N-六糖II、唾液酸乳糖基-N-四糖a、二唾液酸乳糖基-N-六糖I、唾液酸乳糖基-N-四糖b、唾液酸乳糖基-N-新四糖c、唾液酸乳糖基-N-新四糖d、3'-唾液酸-3-岩藻糖基乳糖、二唾液酸單岩藻糖基乳糖基-N-新六糖、單岩藻糖基單唾液酸乳糖基-N-八糖(sialyl Lea)、唾液酸乳糖基-N-岩藻糖六糖II、二唾液酸乳糖基-N-岩藻糖五糖II、單岩藻糖基二唾液酸乳糖基-N-四糖、和帶有一個或多個唾液酸殘基的寡醣，包括但不限於：選自GM3(3'唾液酸乳糖,Neu5Acα-2,3Galβ-4Glc)的神經節苷脂的寡醣部分和包含以下的寡糖：GM3基序、GD3 Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,3Galβ-1,4Glc GT3 (Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,3Galβ-1,4Glc); GM2 GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,3)Galβ-1,4Glc, GM1 Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,3)Galβ-1,4Glc, GD1a Neu5Acα-2,3Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,3)Galβ-1,4Glc, GT1a Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,3Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,3)Galβ-1,4Glc, GD2 GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc, GT2 GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc, GD1b, Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc, GT1b Neu5Acα-2,3Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc, GQ1b Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,3Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc, GT1c Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc, GQ1c Neu5Acα-2,3Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc, GP1c Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,3Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc, GD1a Neu5Acα-2,3Galβ-1,3(Neu5Acα-2,6)GalNAcβ-1,4Galβ-1,4Glc, Fucosyl-GM1 Fucα-1,2Galβ-1,3GalNAcβ -1,4(Neu5Acα-2,3)Gal β -1,4Glc；所有這些都可以通過將上述寡醣部分與神經醯胺反應或在神經醯胺上合成上述寡醣而延伸到相應神經節苷脂的生產。
本發明中使用的術語「alpha-2,3-唾液酸轉移酶」、「alpha 2,3 唾液酸轉移酶」、「3-唾液酸轉移酶」、「α-2,3-唾液酸轉移酶」、「α 2,3 唾液酸轉移酶」、「3 唾液酸轉移酶」、「3-ST」或「3ST」可互換使用，並且指代催化唾液酸從供體CMP-Neu5Ac以α-2,3 鍵結轉移到的受體分子中的糖基轉移酶。本發明中使用的術語「3'唾液酸乳糖」、「3'-唾液酸乳糖」、「alpha-2,3-唾液酸乳糖」、「alpha 2,3唾液酸乳糖」、「α-2,3-唾液酸乳糖」、「α 2,3唾液酸乳糖」、「3SL」或「3'SL」可互換使用，並且指代通過α-2,3-岩藻糖基轉移酶催化將唾液酸基團從CMP-Neu5Ac以α-2,3-鍵結轉移到乳糖中獲得的產物。本發明中使用的術語「alpha-2,6-唾液酸轉移酶」、「alpha 2,6-唾液酸轉移酶」、「6-唾液酸轉移酶」、「α-2,6-唾液酸轉移酶」、「α 2,6-唾液酸轉移酶」、「6-唾液酸轉移酶」、「6-唾液酸轉移酶」、「6-ST」或「6ST」可互換使用，並且指代催化唾液酸從供體CMP-Neu5Ac以α-2,6-鍵結轉移到受體分子中的糖基轉移酶。本發明中使用的術語「6'唾液酸乳糖」、「6'-唾液酸乳糖」、「alpha-2,6-唾液酸乳糖」、「alpha 2,6唾液酸乳糖」、「α-2,6-唾液酸乳糖」、「α2,6唾液酸乳糖」、「6SL」或「6'SL」可互換使用，是指通過α-2,6-岩藻糖基轉移酶催化將唾液酸基團從CMP-Neu5Ac以alpha-2,6-連結轉移到乳糖而獲得的產物。本發明中使用的術語「alpha-2,8-唾液酸轉移酶」、「alpha 2,8 唾液酸轉移酶」、「8-唾液酸轉移酶」、「α-2,8-唾液酸轉移酶」、「α 2,8-唾液酸轉移酶」、「8-唾液酸轉移酶」、「8-唾液酸轉移酶」「8-ST」或「8ST」可互換使用，是指催化唾液酸從供體CMP-Neu5Ac以α-2,8-鍵結轉移到受體中的糖基轉移酶。
如本文所用且如本領域中通常理解的，「岩藻糖基化寡糖」是攜帶岩藻糖殘基的寡糖。此類岩藻糖基化寡糖是包含至少三個通過糖苷鍵彼此連接的單醣次單元的醣結構，其中所述單醣次單元中的至少一個是岩藻糖。岩藻糖基化寡糖可含有多於一個岩藻糖殘基，例如兩個、三個或更多。岩藻糖基化寡糖可以是中性寡糖或帶電寡糖，例如還包含唾液酸結構。岩藻糖可以通過包含alpha-1,2、alpha-1,3、alpha-1,4、alpha-1,6鍵的alpha-糖苷鍵連接到其他包括葡萄糖、半乳糖、GlcNA的c單醣次單元。
例示包括2'-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyllactose,2'FL)、3-岩藻糖基乳糖(3FL)、4-岩藻糖基乳糖(4FL)、6-岩藻糖基乳糖(6FL)、二岩藻糖基乳糖(diFL)、乳二岩藻糖四糖(lactodifucotetraose, LDFT)、乳糖基-N-岩藻糖五糖I (LNFP I)、乳糖基-N-岩藻五糖II (LNFP II)、乳糖基-N-岩藻五糖III (LNFP III)、乳糖基-N-岩藻五糖V(LNFP V)、乳糖基-N-岩藻五糖VI (LNFP VI)、乳糖基-N-新岩藻糖五糖I、乳糖基-N-二岩藻糖六糖I(LDFH I)、乳糖基-N-二岩藻糖六糖II(LDFH II)、單岩藻糖基乳糖-N-六糖III (Monofucosyllacto-N-hexaose III, MFLNH III)、二岩藻糖基乳糖基-N-六糖(DFLNHa)、二岩藻糖基-乳糖基-N-新六糖、3'-唾液酸-3-岩藻糖基乳糖、二唾液酸單岩藻糖基乳糖基-N-新六糖、單岩藻糖基單唾液酸乳糖基-N-八糖(sialyl Lea)、唾液酸乳糖基-N-岩藻糖六糖II、二唾液酸乳糖基-N-岩藻糖五糖、單岩藻糖基二唾液酸乳糖基-N-四糖。
本發明中使用的術語「alpha-1,2-岩藻糖基轉移酶」、「alpha 1,2 岩藻糖基轉移酶」、「2-岩藻糖基轉移酶」、「α-1,2-岩藻糖基轉移酶」、「α 1,2 岩藻糖基轉移酶」、「2岩藻糖基轉移酶」、「2-FT」或「2FT」可互換使用，指代催化岩藻糖從供體GDP-L-岩藻糖以α-1,2-鍵結轉移到受體分子中的糖基轉移酶。本發明中使用的術語「2'岩藻糖基乳糖」、「2'-岩藻糖基乳糖」、「alpha-1,2-岩藻糖基乳糖」、「alpha 1,2岩藻糖基乳糖」、「α-1,2-岩藻糖基乳糖」、「α 1,2岩藻糖基乳糖」、「Galβ-4(Fucα1-2)Glc」、「2FL」或「2'FL」可互換使用，是指通過alpha-1,2-岩藻糖基轉移酶的催化，從GDP-L-岩藻糖中將岩藻糖殘基以α-1,2-鍵結轉移至乳糖獲得的產物。本發明中使用的術語「二岩藻糖基乳糖」、「二-岩藻糖基乳糖」、「乳二岩藻糖四糖」、「2',3-二岩藻糖基乳糖」、「2',3 二岩藻糖基乳糖」、「α-2',3-岩藻糖基乳糖」、「α 2',3岩藻糖基乳糖」、「Fucα1-2Galβ 1-4(Fucα1-3)Glc」、「DFLac」、「2',3diFL」、「DFL」、「DiFL」或「diFL」可互換使用。
本發明中使用的術語「alpha-1,3-岩藻糖基轉移酶」、「alpha 1,3 岩藻糖基轉移酶」、「3-岩藻糖基轉移酶」、「α-1,3-岩藻糖基轉移酶」、「α 1,3 岩藻糖基轉移酶」、「3 岩藻糖基轉移酶」、「FT」或「3FT」可互換使用，是指催化岩藻糖從供體GDP-L-岩藻糖以α-1，3-鍵結轉移到受體分子的糖基轉移酶。本發明中使用的術語「3-岩藻糖基乳糖」、「alpha-1,3-岩藻糖基乳糖」、「alpha 1,3 岩藻糖基乳糖」、「α-1,3-岩藻糖基乳糖」、「α 1,3 岩藻糖基乳糖」、「Galβ-4(Fucα1-3)Glc」、「3FL」或「3-FL」可互換使用，是指經alpha-1,3-岩藻糖基轉移酶催化，將岩藻糖殘基從GDP-L岩藻糖以α-1,3-鍵結轉移至乳糖而獲得的產物。
如本文所用且如本領域狀態中通常理解的，「中性寡醣」是不具有源自羧酸基團的負電的寡醣。這種中性寡醣的例示是2'-岩藻糖基乳糖(2'FL)、3-岩藻糖基乳糖(3FL)、2',3-二岩藻糖基乳糖(diFL)、乳糖基-N-丙糖II、乳糖基-N-四糖、乳糖基-N-新四糖、乳糖基-N-岩藻糖五糖I、乳糖基-N-新岩藻糖五糖I、乳糖基-N-岩藻糖五糖II、乳糖基-N-岩藻糖五糖III、乳糖基-N-岩藻糖五糖V、乳糖基-N-岩藻糖五糖VI、乳糖基-N-新岩藻糖五糖V、乳糖基-N-二岩藻糖六糖I、乳糖基-N-二岩藻糖六糖II、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳糖基-N-六糖、乳糖基-N-新六糖、對-乳糖基-N-六糖、對-乳糖基-N-新六糖、二岩藻糖基-乳糖基-N-六糖和二岩藻糖基-乳糖基-N-新六糖。
術語「LNB」和「乳糖基-N-雙醣」可互換使用，且指代雙醣Gal-b1,3-GlcNAc。
術語「LacNAc」和「N-乙醯乳糖胺」可互換使用，且指代雙醣Gal-b1,4-GlcNAc。
本發明中使用的術語「LNT II」、「LNT-II」、「LN3」、「乳糖基-N-丙糖II」、「乳糖基- N-丙糖II」、「乳糖基-N-丙糖」、「乳糖基- N-丙糖」或「GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互換使用。
本發明中使用的術語「LNT」、「乳糖基-N-四糖」、「乳糖基- N-四糖」或「Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互換使用。
本發明中使用的術語「LNnT」、「乳糖基-N-新四糖」、「乳糖基- N-新四糖」、「neo-LNT」或「Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互換使用。
本發明中使用的術語「LSTa」、「LS-四糖a」、「唾液酸-乳糖基-N-四糖a」、「唾液酸乳酸-N-四糖a」或「Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc」可互換使用。
本發明中使用的術語「LSTb」、「LS-四糖b」、「唾液酸-乳糖基-N-四糖b」、「唾液酸乳糖基-N-四糖b」或「Gal-b1,3-(Neu5Ac-a2,6)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc」可互換使用。
本發明中使用的術語「LSTc」、「LS-四糖c」、「唾液酸-乳糖基-N-四糖c」、「唾液酸乳糖-N-四糖c」、「唾液酸乳糖基-N-新四糖c」或「Neu5Ac-a2,6-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc」可互換使用。
本發明中使用的術語「LSTd」、「LS-四糖d」、「唾液酸-乳糖基-N-四糖d」、「唾液酸乳糖基-N-四糖d」、「唾液酸乳糖基-N-新四糖d」或「Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc」可互換使用。
術語「DSLNnT」和「二唾液酸乳糖基-N-新四糖」可互換使用，且指代Neu5Ac-a2,6-[Neu5Ac-a2,6-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3]-Gal-b1,4-Glc。
術語「DSLNT」和「二唾液酸乳糖基-N-四糖」可互換使用，且指代Neu5Ac-a2,6-[Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3]-Gal-b1,4-Glc。術語「LNFP-I」、「乳糖基-N-岩藻糖五糖I」、「LNFP I」、「LNF I OH I型決定子(LNF I OH type I determinant)」、「LNF I」、「LNF1」、「LNF 1」和「H血型抗原戊醣1型(Blood group H antigen pentaose type 1)」可互換使用，且指代Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc。
術語「GalNAc-LNFP-I」和「A血型抗原六醣I型」可互換使用，且指代GalNAc-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc。
術語「LNFP-II」和「乳糖基-N-岩藻糖五醣II」可互換使用，且指代Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc。
術語「LNFP-III」和「乳糖基-N-岩藻糖五醣III」可互換使用，且指代Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc。
術語「LNFP-V」和「乳糖基-N-岩藻糖五醣V」可互換使用，且指代Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc。
術語「LNFP-VI」、「LNnFP V」和「乳糖基-N-新岩藻五醣V」可互換使用，且指代Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc。
術語「LNnFP I」和「乳糖基-N-新岩藻糖五醣I」可互換使用，且指代Fuc-a1,2-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc。
術語「LNDFH I」、「乳糖基-N-二岩藻糖六醣I」、「LNDFH-I」、「LDFH I」、「Le b-乳糖」和「Lewis-b六醣」可互換使用，且指代Fuc-a1,2-Gal-b1,3-[Fuc-a1,4]-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc。
術語「LNDFH II」、「乳糖基-N-二岩藻糖六醣II」、「Lewis a-Lewis x」和「LDFH II」可互換使用，且指代Fuc-a1,4-(Gal-b1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc。
術語「LNnDFH」、「乳糖基-N-新二岩藻糖六糖」和「Lewis x 六糖」可互換使用，且指代Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc。
術語「alpha-四糖」和「A-四糖」可互換使用，且指代GalNAc-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,4-Glc。
「帶電寡醣」是包含一個或多個帶負電的單醣次單元的寡醣結構，包括N-乙醯神經胺酸(Neu5Ac)，通常稱為唾液酸、N-羥乙醯神經胺酸(Neu5Gc)、葡萄糖醛酸酯(glucuronate)和半乳醣醛酸酯(galacturonate)。帶電寡醣也稱為酸性寡醣。唾液酸屬於神經胺酸(5-胺基-3,5-二去氧-D-甘油-D-半乳糖-壬-2-酮糖酸)衍生物的家族。Neu5Gc是唾液酸的衍生物，由Neu5Ac的C5處的N-乙醯基羥基化形成。相反，中性寡醣是非唾液酸化寡醣，因此不包含酸性單醣次單元。中性寡醣包括在其聚醣結構中含有一個或多個岩藻糖次單元的不帶電的岩藻糖基化寡醣，以及缺乏任何岩藻糖次單元的不帶電的非岩藻糖基化寡醣。帶電寡醣的其他例子是硫酸化殼聚醣和去乙醯殼聚醣。
如本文所用，人類ABO血型系統的抗原是寡醣。人類ABO血型系統的此類抗原不限於人類結構。所述結構涉及A決定子(determinant)GalNAc-alpha1,3(Fuc-alpha1,2)-Gal-、B決定子Gal-alpha1,3(Fuc-alpha1,2)-Gal-和H決定子Fuc-alpha1,2-Gal-，存在於包含Gal-beta1,3-GlcNAc、Gal-beta1,4-GlcNAc、Gal-beta1,3-GalNAc及Gal-beta1,4-Glc的雙醣核心結構上。
如本文所用，「岩藻糖基化途徑(fucosylation pathway)」是由酶及其各自的基因、甘露糖-6-磷酸糖異構酶、磷酸甘露糖變位酶、甘露糖-1-磷酸鳥苷轉移酶、GDP 甘露糖4,6-脫水酶、GDP-L-岩藻醣合成途徑及／或再利用路徑L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶(GDP-L-fucose synthase and/or the salvage pathway L-fucokinase/GDP-fucose pyrophosphorylase)，結合導致α1,2、α1,3、α1,4及／或α1,6岩藻糖基化寡醣的岩藻糖基轉移酶。
「唾液酸化途徑(sialylation pathway)」是由酶及其各自的基因組成的生化途徑，L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、磷酸葡糖胺變位酶、N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶、N-乙醯葡萄糖胺差向異構酶、UDP-N-乙醯葡萄糖胺2-差向異構酶、N-乙醯葡萄糖胺-6P 2-差向異構酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶，N-乙醯甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙醯甘露糖胺激酶，磷酸乙醯葡萄糖胺變位酶、N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯轉移酶(N-acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase)、葡萄糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶、唾液酸合酶、N-乙醯神經胺酸解離酶、N-醯基神經胺酸-9-磷酸合酶、N-醯基神經胺酸-9-磷酸磷酸酶、及／或CMP-唾液酸合酶，與導致2,3、α 2,6及／或α 2,8唾液酸化寡醣的唾液酸轉移酶結合。
如本文所用，「半乳糖基化途徑(galactosylation pathway)」是由酶及其各自的基因組成的生化途徑，半乳糖-1-差向異構酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷醯轉移酶、UDP-葡萄糖4-差向異構酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷醯轉移酶及／或葡糖磷酸變位酶，與導致寡醣的2、3、4及／或6羥基上形成alpha或bata結合的半乳糖的半乳糖基轉移酶結合。
如本文所用，「N-乙醯葡萄糖胺碳水化合物途徑(N-acetylglucosamine carbohydrate pathway)」是由酶及其各自的基因組成的生化途徑，L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、磷酸葡萄糖胺變位酶、N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯轉移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶及／或葡萄糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶，與導致寡醣的3、4 及／或6羥基上形成alpha或beta結合的N-乙醯葡萄糖胺的醣基轉移酶結合。
如本文所用，「N-乙醯半乳糖胺化(N-acetylgalactosaminylation)途徑」是包含選自包括L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、磷酸葡萄糖胺變位酶、N-乙醯葡萄糖胺1-磷酸尿苷醯轉移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶、UDP-N-乙醯葡萄糖胺4-差向異構酶、UDP-葡萄糖4-差向異構酶、N-乙醯半乳糖胺激酶及／或UDP-N-乙醯半乳糖胺焦磷酸化酶的列表中的至少一種酶及其各自基因的生化途徑，且與導致GalNAc修飾化合物的糖基轉移酶結合，其中GalNAc修飾化合物包含在所述單醣、雙醣或寡醣上具有alpha或beta結合的N-乙醯半乳糖胺的單醣、雙醣或寡醣。
如本文所用，「甘露糖基化(mannosylation)途徑」是包含甘露糖-6-磷酸異構酶、磷酸甘露糖變位酶及／或甘露糖-1-磷酸鳥苷酸轉移酶的列表中的至少一種酶及其各自基因的生化途徑，且與導致甘露糖基化化合物的糖基轉移酶組合，所述甘露糖基化化合物包括在所述單醣、雙醣或寡醣上具有alpha或beta結合甘露糖的單醣、雙醣或寡醣。
如本文所用，「N-乙醯甘露糖胺化(N-acetylmannosaminylation)途徑」是包含選自包括L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、葡糖胺-6-磷酸脫胺酶、磷酸葡萄糖胺變位酶、N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯轉移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶、UDP-GlcNAc 2-差向異構酶及／或ManNAc激酶的列表中的至少一種酶及其各自基因的生化途徑，且與導致ManNAc修飾的化合物的糖基轉移酶結合，該化合物包含在所述單醣、雙醣或寡醣上具有alpha或beta結合的N-乙醯甘露糖胺的單醣、雙醣或寡醣。
如本文所用和本領域所使用的術語「大抵上由……組成」是指由在所述術語之後指定的化合物和-任選地-不可避免的副產物組成的組成物。所述不可避免的副產物包括——例如——在用於生產寡醣混合物的培養或微生物發酵過程中生產的化合物以及從回收寡醣混合物引入到步驟流程中但不能被移除的化合物。
關於噴霧乾燥粉末的術語「大抵上由……組成」，包括具有相對於噴霧乾燥粉末的乾燥物質至少80%-wt.、至少85%-wt、至少90%-wt.、至少 93%-wt.、至少 95%-wt.或至少98%-wt的寡醣混合物的噴霧乾燥粉末。術語「大抵上由……組成」同樣用於噴霧乾燥的粉末、步驟流程和含有寡醣混合物的溶液。
此外，在本文中，術語「污染物」和「雜質」較佳意指可存在於來自培養或發酵製程的水基質(aqueous medium)中的微粒、細胞、細胞組分、代謝物、細胞碎片、蛋白質、胜肽、胺基酸、核酸、醣脂和內毒素。
本文使用的術語「澄清」是指處理水基質或培養或發酵液以從培養或發酵製程中去除懸浮顆粒和污染物，特別是細胞、細胞成分、不溶性代謝物和碎片，這些可能干擾寡醣混合物的最終純化。此類處理可以通過離心、絮凝、任選有超音波處理的絮凝、重力過濾、微濾、泡沫分離或真空過濾(例如，通過可包括Celite™助濾劑的陶瓷過濾器)以常規方式進行。如本文所用，術語「不含蛋白質的寡醣混合物」是指來自水基質或培養或發酵製程的培養液(broth)的寡醣混合物，該基質已被處理以從過程中大抵上去除可能會在過程中干擾最終純化寡醣混合物的所有蛋白質以及任何相關雜質，例如胺基酸、胜肽、內毒素、醣脂、RNA和DNA。可以通過離子交換層析、親和層析、超濾和粒徑篩析層析以常規方式完成蛋白質，較佳大抵上所有蛋白質的這種去除。較佳地，不含蛋白質的寡醣混合物是澄清的寡醣混合物。
根據本發明，術語「從培養或發酵液中純化寡醣混合物」是指從細胞及／或其生長基質中收穫、收集或回收(retrieving)寡醣混合體(oligosaccharide mix)。術語「培養物(cultivation)」是指其中栽培(cultivated)或培養(cultured)或發酵(fermented)細胞的培養基質、細胞本身以及由細胞在全培養液(whole broth)中，即細胞的內部(細胞內)和細胞的外部(細胞外)生產的寡醣。
如果寡醣混合體仍然存在或部分存在於生產寡醣混合體的細胞中，可以使用常規方式從細胞中釋放或提取寡醣混合體，例如使用高pH值破壞細胞、熱休克、音波處理、法式壓碎(French press)、均質、酶水解、化學水解、溶劑水解、界面活性劑、水解……然後可以一起及／或單獨地將培養基質及／或細胞提取物進一步用於從培養或發酵液中純化寡醣混合物。
術語「純化的」是指基本上或大抵上不含干擾生物分子活性的成分的材料。對於細胞、醣類、核酸和多肽，術語「純化的」是指基本上或大抵上不含在天然狀態下發現的通常伴隨材料的組分的材料。通常，本發明的純化的醣類、寡醣、蛋白質或核酸通過銀染凝膠(silver stained gel)上的條帶強度或其他確定純度的方法測量的純度至少約為50.0%、55.0%、60.0%、65.0%、70.0%、75.0%、80.0%或85.0%，通常至少約為90%、91.0%、92.0%、93.0%、94.0%、95.0%、96.0%、97.0%、98.0%或99.0%。純度或均質性(homogeneity)可以通過本領域習知的多種方式來指示，例如蛋白質或核酸樣品的聚丙烯醯胺凝膠電泳，並接續染色後可視化。出於某些目的，需要高解析度並使用HPLC或類似的純化方法。對於寡醣，純度可以使用例如但不限於薄層層析、氣相層析、NMR、HPLC、毛細管電泳或質譜的方法確定。
「包含所述純化的寡醣混合物的溶液」包含溶解在水基質中的寡醣混合物。水基質是包含水的溶劑。在一些實施例中，水基質是純水。在其他實施例中，基質包括水和痕量(trace amount)的一種或多種有機溶劑。在一些這樣的實施例中，基質包含小於1%-wt的有機溶劑。在一些實施例中，基質包含小於0.1%-wt的有機溶劑。在一些實施例中，基質包含小於0.01%-wt的有機溶劑。在一些實施例中，基質包含小於0.001%-wt的有機溶劑。在一些實施例中，基質包含小於0.0001%-wt的有機溶劑。
在一些實施例中，寡醣混合物溶液包含痕量的一種或多種有機溶劑。在一些這樣的實施例中，寡醣混合物溶液包含小於1%-wt的有機溶劑。在一些實施例中，寡醣混合物溶液包含小於0.1%-wt的有機溶劑。在一些實施例中，寡醣混合物溶液包含小於0.01%-wt(重量百分比)的有機溶劑。在一些實施例中，寡醣混合物溶液包含小於0.001%-wt的有機溶劑。在一些實施例中，寡醣混合物溶液包含小於0.0001%-wt的有機溶劑。
如本文所用，「白利糖度值(Brix value)」表示水溶液的糖含量。白利糖度值可以表示為百分比(白利糖百分比percent Brix)或「白利糖度」(degrees Brix)。嚴格地說，白利糖度值是純水溶液中蔗糖的重量百分比，因此不適用於包含其他溶質及／或溶劑的溶液。然而，白利糖度值易於測量，因此在本領域中通常用作除純蔗糖溶液之外的糖溶液的總糖含量的近似值。如本文所用，「白利糖度值」表示水溶液的總糖含量。
測量白利糖度值的技術是本領域習知的。糖在水溶液中的溶解會改變溶液的折射率。因此，可以使用適當校準的折射計來測量溶液的白利糖度值。
或者，可以測量溶液的密度並將其轉換為白利糖度值。電子式密度計可以自動執行這種測量和轉換，或者可以使用比重計或比重瓶。
如本文所用，術語「體積密度(bulk density)」是給定體積中顆粒固體(例如粉末)的顆粒的重量，並以克/升(g/L)表示。顆粒固體的顆粒佔據的總體積取決於顆粒本身的尺寸和顆粒之間空間的體積。顆粒之間和內部的夾帶空氣也會影響體積密度。因此，由具有大顆粒間空間的多孔大顆粒組成的顆粒固體將具有比由緊密壓實在一起的無孔小顆粒組成的顆粒固體更低的體積密度。體積密度可以用兩種形式表示：「鬆散體積密度(loose bulk density)」和「振實體積密度(Tapped bulk density)」。鬆散體積密度(在本領域中也稱為「自由沉降(freely settled)」或「傾倒(poured)」體積密度)是顆粒固體的重量除以其體積，其中使得顆粒固體自行沉降到該體積(例如倒入容器的粉末)。
可以通過振實容器來更緊密地壓實容器內的固體顆粒，讓顆粒更緊密地聚集在一起，從而在重量保持不變的情況下減小體積。因此振實增加了體積密度。振實體積密度(在本領域中也稱為「裝填(tamped)」體積密度)是顆粒固體的重量除以它的體積，其中將顆粒固體輕敲並使其沉澱到體積中精確的次數。顆粒固體被振實的次數在陳述振實體積密度時是慣有的。例如，「100x振實體積密度」是指顆粒固體在振實100次後的體積密度。
測量體積密度的技術是本領域習知的。鬆散體積密度可用量筒和秤測量：將固體顆粒倒入量筒中，測量固體顆粒的重量和體積；重量除以體積得出鬆散體積密度。振實體積密度可以使用相同的技術進行測量，並在測量重量和體積之前額外振實量筒一定的次數。振實的自動化可確保各個振實的數量、時間和壓力準確且一致。自動振實裝置很容易獲得，一個例子是 J. Englesmann AG 的 Jolting Stampfvolumeter (STAV 203)。
如本文所用，術語「不同的寡醣」是指結構不同的寡醣。
如本文所用，術語「乾燥固體」和「乾燥物質」可互換使用並在實施例1中進一步描述。
在整個申請中，除非另有明確說明，「基因改造微生物」或「代謝工程微生物」或「基因改造細胞」或「代謝工程細胞」分別較佳地是指分別經過基因改造的或代謝工程的微生物或細胞，用於生產包含根據本發明的不同寡醣的所述混合物。在本發明的上下文中，本文公開的所述混合物的不同寡醣較佳分別不存在於所述代謝工程微生物或細胞的野生型祖先(wild type progenitor)中。
在整個申請中，除非另有明確說明，否則部件的「合成(synthesize)」、「合成的(synthesized)」和「合成(synthesis)」分別與部件的「生產(produce)」、「生產的(produced)」和「生產(production)」可互換使用。
根據第一個態樣，本案提供了一種生產純化的不同寡醣混合物的方法，藉由合成所述不同寡醣的混合物的至少一細胞，較佳單一細胞，較佳微生物的細胞生產。此方法包括在合適的培養或發酵基質(medium)中培養合成不同寡醣的混合物的細胞，較佳微生物，以形成培養或發酵液，接著從培養或發酵液中純化所述寡醣混合物。純化包括培養或發酵液的澄清與從澄清的培養或發酵液中去除鹽類及／或基質成分及／或濃縮所述澄清的培養或發酵液中的寡醣混合物的組合，從而提供包含所述純化的寡醣混合物的溶液。在一實施例中，澄清與鹽類及／或基質成分的去除相結合。在一實施例中，澄清與在澄清的培養或發酵液中濃縮寡醣混合物的步驟相結合。在一實施例中，澄清與鹽類及／或基質成分的去除相結合，並且進一步與由鹽類及／或培養基成分的去除步驟生產的寡醣混合物的濃縮步驟相結合。在一實施例中，澄清與濃縮寡醣混合物的步驟相結合，並且進一步與由濃縮步驟生產的寡醣混合物的鹽類及／或基質成分的去除相結合。
本發明的方法允許以高純度有效純化大量的寡醣混合物。
目前用於細胞培養或發酵生產寡醣的純化提供單一寡醣的分離，與此相反，本方法允許提供純化的不同寡醣混合物。如此純化的寡醣混合物溶液可以通過乾燥、較佳噴霧乾燥、凍乾或濃縮成至少40％乾燥物質的糖漿而以固體形式獲得。所提供的寡醣不含源自所用重組細胞培養或微生物菌株的蛋白質和重組材料，因此非常適用於食品、醫療食品和飼料(例如寵物食品)應用。
在一實施例中，純化包括澄清含有寡醣混合體的培養或發酵液以去除懸浮顆粒和污染物，特別是通過培養基因改造細胞生產的細胞、細胞成分、不溶性代謝物和碎片。在此步驟中，可以以常規方式澄清含有所生產的寡醣混合物的培養或發酵液。較佳地，含有寡醣混合體的混合物通過離心、絮凝、傾析(decantation)、超濾及／或過濾來澄清。從培養或發酵液中純化寡醣混合物的第二步較佳包括從澄清後的含有寡醣混合物的培養或發酵基質中去除鹽及／或基質成分，包括蛋白質以及胜肽、胺基酸、RNA和DNA以及可能影響純度的任何內毒素和醣脂。在此步驟中，通過超濾、奈米過濾、逆滲透、微濾、活性炭或碳處理、切向流高性能過濾、切向流超濾、親和層析、離子交換(例如但不限於陽離子交換、陰離子交換、混合床離子交換)、疏水性交互作用層析及／或凝膠過濾(即粒徑篩析層析)，特別是通過層析，更特別是通過離子交換層析或疏水性交互作用層析或配位基交換層析從含有寡醣混合體的混合物中去除蛋白質、鹽類、副產物、顏色和其他相關雜質。除了粒徑篩析層析，蛋白質和相關雜質被層析介質(chromatography medium)或選定的濾膜保留，而寡醣混合物保留在含有寡醣混合體的混合物中。從培養或發酵液中純化寡醣混合物的第三步驟較佳包括濃縮含有寡醣混合物的培養或發酵液。在一實施例中，第三步驟在第二步驟之前。在一實施例中，濃縮步驟在第二步驟之前並且在如上所述的第二步驟之後再次執行。
在一實施例中，寡醣混合物包含至少兩種不同的寡醣，較佳至少三種不同的寡醣，更較佳至少四種不同的寡醣，又更較佳至少五種不同的寡醣，最較佳至少六種不同的寡醣。
這種包含不同寡醣的寡醣混合物可以例如包含五種結構不同的寡醣，例如2'-FL、3-FL、LNT、3'-SL和6'-SL；另一個例子包括七種結構不同的寡醣，例如2'-FL、3-FL、LNT、LNnT、LNFPI、3'-SL和6'-SL。
在另一個較佳的實施例中，所述寡醣混合物包含聚合度(degree of polymerisation, DP)不同的至少兩種不同的寡醣，較佳地所述寡醣混合物包含聚合度(DP)不同的至少三種不同的寡醣，更較佳地所述寡醣混合物包含至少聚合度不同的至少四種不同的寡醣。寡醣的聚合度是指寡醣結構中存在的單醣單元的數量。如本文所用，寡醣的聚合度為3(DP3)或更高，後者包括4(DP4)、5(DP5)、6(DP6)或更長中的任一個。如本文所述的寡醣混合物較佳包含至少三種不同的寡醣，其中混合物中存在的所有寡醣彼此具有不同的聚合度。例如，所述寡醣混合物可以由三種寡醣組成，其中第一種寡醣為聚合度為3(DP3)的三糖，第兩種寡醣為聚合度為4(DP4)的四糖且第三種寡醣是聚合度為5(DP5)的五糖。
在一實施例中，包含聚合度不同的兩種不同寡醣的寡醣混合物是2'FL和LNT的混合物、2'FL和DiFL的混合或2'FL和LNFPI的混合。在一實施例中，包含聚合度不同的三種不同寡醣的寡醣混合物是2’FL、DiFL和LNFPI的混合物。
在一實施例中，至少一個細胞生產包含四種不同寡醣或多於四種不同寡醣的混合物。這種混合物可包含至少四種不同的寡醣，其中三種寡醣具有不同的聚合度。或者，混合物中的所有所述寡醣可具有不同的聚合度，如本文所述。
替代地或較佳地，寡醣混合物包含至少一種中性寡醣和至少一種帶電寡醣。
用於生產寡醣混合物的至少一細胞可以是真菌、酵母、細菌、昆蟲、動物和植物以及原生動物的細胞。較佳地，所使用的細胞是微生物的細胞。
較佳地，合成不同寡糖的混合物的至少一細胞包含至少一代謝工程細胞，其被代謝工程以生產所述混合物。
更較佳地，僅使用一生產所述混合物的細胞。
更較佳地，僅使用一細胞，其代謝工程化以生產所述混合物。
根據本發明的一實施例，培養或發酵液中的寡醣混合物是通過培養至少一種能夠生產所述寡醣混合物的基因改造細胞，所述寡醣混合物較佳地來自內化碳水化合物前驅物(internalized carbohydrate precursor)。
在一實施例中，所述細胞中的至少一個已經被基因改造以生產至少一種寡醣，較佳地所述至少一個細胞已經被基因改造以生產至少兩種不同的寡醣。
根據本發明的一實施例，培養或發酵液中的寡醣混合物通過培養至少一種能夠生產所述寡醣混合物的基因改造細胞獲得，所述寡醣混合物較佳來自內化碳水化合物前驅物。
根據本發明的一實施例，培養或發酵液中的寡醣混合物通過培養至少一種能夠生產所述寡醣混合物的基因修飾細胞或微生物獲得，所述寡醣混合物較佳來自內化碳水化合物前驅物。
在一實施例中，所述細胞中的至少一個已經被基因改造以生產至少一種寡醣，較佳地所述至少一個細胞已經被基因改造以生產至少兩種不同的寡醣。
在一實施例中，所述微生物中的至少一個已經被基因改造以生產至少一種寡醣，較佳地所述至少一個微生物已經被基因改造以生產至少兩種不同的寡醣。
在一實施例中，培養或發酵液包含寡醣、生物質、基質組分和污染物的混合物。
根據本發明的一實施例，在具有碳源的基礎鹽培養基中(minimal salt medium)培養至少一種細胞，較佳微生物細胞，所述至少一種微生物在該碳源上生長。較佳地，基礎鹽培養基含有硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物、銨、鈣離子、鎂離子、鈉離子、鉀離子、鐵離子、銅離子、鋅離子、錳離子、鈷離子及／或硒離子。
本文所用的所述至少一細胞，較佳微生物的細胞，以單醣、雙醣、寡醣、多醣、多元醇、複合基質或其混合物為主要碳源生長。主要碳源是指相關的生物產品、生物質形成、二氧化碳及／或副產品形成(例如酸及／或醇，例如乙酸鹽、乳酸鹽及／或乙醇)的最重要的碳源，即20.0%、25.0%、30.0%、35.0%、40.0%、45.0%、50.0%、55.0%、60.0%、65.0%、70.0%、75.0%、80.0%、81.0%、82.0%、83.0%、84.0%、85.0%、86.0%、87.0%、88.0%、89.0%、90.0%、91.0%、92.0%、93.0%、94.0%、95.0%、95.5%、96.0%、96.5%、97.0%、97.5%、98.0%、98.5%、99.0%、99.5%、100%的所有所需碳來自上述碳源。在本發明的一實施例中，所述碳源是所述生物體的唯一碳源，即所有所需碳的100%源自上述碳源。常見的主要碳源包括但不限於葡萄糖、甘油、果糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、麥芽寡醣(malto-oligosaccharides)、麥芽三糖、山梨糖醇、木糖、鼠李糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、甲醇、乙醇、海藻糖(trehalose)、澱粉、纖維素、半纖維素、玉米浸液(corn-steep liquor)、高果糖糖漿、醋酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽和丙酮酸鹽。術語複合基質是指其確切構成未確定的基質。例如糖蜜、玉米浸液、蛋白腖(peptone)、胰腖(tryptone)或酵母提取物。
替代地或較佳地，碳源包括葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、玉米浸液、乳糖、半乳糖、高果糖糖漿、澱粉、纖維素、半纖維素、麥芽寡醣、海藻糖、甘油、醋酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽和丙酮酸鹽。
根據本發明的一個較佳實施例，培養或發酵液中的寡醣混合物的總純度小於總乾燥固體的80%，及／或溶液中的所述純化的寡醣混合物的總純度等於或大於總乾燥固體的80%。
如本文所用，「寡醣混合物的總純度」是指分別在純化步驟之前或之後，含有寡醣混合物的總培養或發酵液或純化溶液中的寡醣部分。
較佳地，在培養或發酵液中的寡醣混合物的總純度在純化前以總乾燥固體計＜70%、＜60%、＜50%、＜40%、＜30%、＜20%、＜10%，及／或所述純化的寡醣混合物的總純度在純化後以總乾燥固體計，＞80%，較佳＞85%，更加＞90%，又更加＞95%，最佳＞97%。
在一實施例中，包含純化的寡醣混合物的溶液相對於溶液中乾燥物質／溶質的重量，具有至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%或至少98%的總純度。
在一實施例中，寡醣溶液的純化產率為＞60%，較佳＞65%，更佳＞70%，最佳＞75%。根據最終糖漿或粉末中寡醣的總質量除以澄清後培養液中寡醣的總質量以百分比計算產率。
根據本發明的一態樣，澄清培養或發酵液的步驟i)包括澄清(clarification)、清潔(clearing)、過濾、微濾、離心、傾析和超濾中的一種或多種，較佳地，所述步驟i)更包括使用助濾劑及／或絮凝劑。可選地或較佳地，步驟i)包括對該培養或發酵液進行使用不同濾膜的兩道膜過濾步驟。進一步可選地或較佳地，澄清培養或發酵液的步驟i)還包括使用助濾劑，較佳吸附劑，更佳活性碳。
在本發明的一態樣，從該澄清的培養或發酵液中去除鹽類及／或基質成分的步驟ii)包括奈米過濾、透析、電滲析、活性炭或碳的使用、溶劑的使用、醇的使用以及含水酒精混合物的使用、木炭的使用、切向流高效過濾、切向流超濾、親和層析、離子交換、離子交換層析、疏水性交互作用層析、凝膠過濾、配位基交換層析、管柱層析、陽離子交換吸附樹脂和離子交換樹脂的使用中的至少一者或多者。較佳地，通過離子交換從澄清的培養或發酵液中去除鹽類及／或基質成分的步驟ii)是陽離子交換、陰離子交換、混合床離子交換、模擬移動床層析中的任何一種或多種。
在一實施例中，從該澄清的培養或發酵液中去除鹽類及／或基質成分的步驟ii)包括陰離子交換，其中所述陰離子交換的樹脂具有30-48%的水分含量，且較佳為凝膠型陰離子交換劑。此陰離子交換劑較佳選自包含Dowex 1-X8、XA4023、XA3112、DIAION SA20A、DIAION SA10A的群組，較佳為OH-形式。這種陰離子交換處理對於寡醣混合物溶液的純化非常有效，其中寡醣混合物包含帶電的寡醣，尤其是唾液酸化寡醣，例如唾液酸乳糖。因此，這種陰離子交換樹脂可用於與陽離子交換步驟組合的純陰離子交換步驟中或用於混合床離子交換的設置。
在一實施例中，步驟ii)包括陽離子交換步驟結合陰離子交換步驟，其中所述陰離子交換的樹脂具有30-48%的水分含量，且較佳為凝膠型陰離子交換劑，較佳如本文所述。在一實施例中，陽離子交換步驟先於陰離子交換步驟。
陰離子交換的樹脂的特徵在於具有30-48%的水分含量，且較佳為凝膠型陰離子交換劑，可對澄清的培養或發酵液進行脫鹽，但不會因此結合帶電的，例如含唾液酸基團的寡醣，特別是唾液酸乳糖，這些寡醣也以鹽的形式存在。換句話說，這涉及一種陰離子交換樹脂，它對帶負電的礦物質有選擇性，但對唾液酸乳糖沒有選擇性。如本領域所述，參見例如WO2009/113861，需要水分含量，即含水量不大於48%，較佳不大於45%。當水分含量低於35%時，尤其是在水分含量低於30%時，脫鹽能力開始變得太低而無法產生有效製程。陰離子交換劑中的水分含量按以下方式確定：在測量樹脂的水分含量之前，去除附著的水，例如將樹脂包裹在布中，然後將其離心(離心機：30cm直徑；3,000 轉/分)；然後稱量樹脂，例如在稱量瓶中；之後將樹脂在105°C的恆溫下乾燥4小時；然後將樹脂在乾燥器(exicator)中冷卻30分鐘；之後確定乾樹脂的重量；水分百分比(重量百分比)=[(乾燥後的重量損失(g))/(濕樹脂的重量)]*100%。通過這種脫鹽，帶負電的離子的重大部分(an important part of)被去除，而大量唾液酸乳糖(儘管帶負電)不會因此被去除。
所提及的陰離子交換樹脂較佳且通常為游離鹼形式(氫氧化物形式)，因為這會導致最大可能的脫鹽能力。合適的陰離子交換樹脂是強交聯的聚苯乙烯-二乙烯基苯凝膠，如Diaion SA20A、Diaion WA20A。
在一實施例中，步驟ii)包括使用混合床離子交換樹脂的處理。在一些實施例中，此混合床離子交換樹脂為Diaion SA20A和Amberlite FPC 22H以1.1:1至 1.9:1的比例混合的混合床管柱。在一實施例中，此混合床離子交換樹脂包含水量30-48%的陰離子交換樹脂，且較佳為微孔或凝膠型陰離子交換劑。如上文所解釋的，此陰離子交換類型在包含帶電寡醣的溶液的純化中非常有用。
在另一態樣，濃縮的步驟iii)包括奈米過濾、透析過濾(diafiltration)、逆滲透、蒸發、刮膜蒸發(wiped film evaporation)和降膜蒸發(falling film evaporation)中的一者或多者。
在一實施例中，寡醣混合物包括岩藻糖基化寡醣、唾液酸化寡醣、路易斯型抗原、含有N-乙醯葡萄糖胺的中性寡醣、含有N-乙醯基乳糖胺的寡醣、含有乳糖-N-雙醣的寡醣、非岩藻糖基化中性寡醣、殼聚醣、殼聚醣寡醣、肝素原、硫酸軟骨素、醣胺聚醣寡糖、肝素、硫酸乙醯肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、玻尿酸或透明質酸及／或硫酸角質素中的至少一種者。替代或較佳地，寡醣混合物包含至少一種哺乳動物乳寡醣，較佳至少一種人乳寡醣，更較佳混合物中的所有寡醣都是哺乳動物乳寡醣，最較佳混合物中的所有寡醣都是人乳寡醣。
在一些實施例中，步驟i)包括微濾澄清的第一步驟。或者，i)包括離心澄清的第一步驟、絮凝澄清的第一步驟或超濾澄清的第一步驟。
在一些實施例中，步驟i)包括超濾。
較佳地，步驟i)中的超濾具有等於或大於1 kDa、2 kDa、3 kDa、4 kDa、5 kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10 kda、11 kDa、12kDa、13 kDa、14 kDa、15 kDa的載留分子量(molecular weight cut off)。可替代或較佳地，步驟i)包括連續的兩次超濾，且其中第一次超濾的濾膜載留分子量大於第二次超濾的濾膜載留分子量。
在一較佳的實施例中，步驟步驟ii)包括奈米過濾及／或電滲析。較佳地，所述奈米過濾及／或電滲析執行兩次。更佳地，所述奈米過濾及／或電滲析的步驟連續執行。
在一些實施例中，步驟i)中的超濾滲透物在步驟ii)中奈米過濾及／或電滲析。
在一實施例中，陽離子交換劑處理為強酸性陽離子交換劑處理，較佳為使用H+形式、K+或Na+形式強陽離子交換樹脂的處理。
在一些實施例中，步驟i)為超濾，步驟ii)為奈米過濾及／或電滲析的處理結合使用離子交換樹脂及／或層析的處理。較佳地，離子交換樹脂為強酸性陽離子交換樹脂及／或弱鹼性陰離子交換樹脂。更佳地，離子交換樹脂為強酸性陽離子交換樹脂及弱鹼性陰離子交換樹脂。
在本發明方法的又一較佳實施例中，步驟ii)包括使用H+形式或Na+形式的強陽離子交換樹脂以及游離鹼形式，較佳Cl-形式，或者較佳OH-形式的弱陰離子交換樹脂的處理。較佳地，使用H+形式的陽離子交換樹脂的處理後直接接續使用游離鹼形式的弱陰離子交換樹脂的處理。
在本發明方法的一較佳實施例中，方法中不包括電滲析。在一些實施例，方法包括電滲析。
在本發明地一實施例中，所述步驟i)為超濾，所述步驟ii)為奈米過濾及／或電滲析的處理結合使用離子交換樹脂為強酸性陽離子交換樹脂及／或弱鹼性陰離子交換樹脂的處。使用強酸性陽離子交換樹脂及／或弱鹼性陰離子交換樹脂的處理之前，先進行超濾，然後進行奈米過濾及／或電滲析。
在本發明的一特定實施例中，步驟i)至iii)中的一者或多者執行不止一次。
在一些步驟i)中使用超濾且步驟ii)中使用奈米過濾的實施例中，較佳奈米過濾膜的載留分子量低於步驟i)中超濾膜的載留分子量。
如本文所用，步驟ii)中奈米過濾膜的載留分子量較佳等於或高於200 Da。例如200 Da、300 Da、400 Da、500 Da、600 Da、700Da、800 Da、900 Da或1000 Da。較佳在300與500 Da之間及／或600與800之間。
如本文所用，當步驟ii)包括離子交換樹脂處理及／或層析時，所述離子交換樹脂或層析較佳在中性固相上。
本發明的方法提供了較佳包含所述寡醣混合物且白利糖度值為約8至約75%的溶液，較佳包括所述純化的寡醣混合物的所述溶液具有約30至65%的白利糖度值。
在一實施例中，包括所述寡醣混合物的溶液至少包括總糖量為至少20.0% (w/v)、30.0% (w/v)、35.0% (w/v)且至多45.0% (w/v) v), 50.0 % (w/v), 60.0 % (w/v)的量的寡醣混合物。
本發明的另一態樣提供了一種方法，其中至少一細胞為真菌、酵母、細菌、昆蟲、動物、植物和原生動物的細胞。較佳，所用細胞為微生物的細胞。本發明的另一態樣提供了一種方法，其中至少一微生物為本文所述的真菌、酵母或細菌的細胞。至少一微生物選自包含細菌、酵母或真菌的列表。後一種細菌較佳屬於變形菌門(Proteobacteria)或厚壁菌門(Firmicutes)或藍藻門(Cyanobacteria)或奇異球菌-棲熱菌門(Deinococcus- Thermus)。屬於變形菌門的後一種細菌較佳屬於腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，較佳屬於大腸桿菌種(Escherichia coli)。後一種細菌較佳涉及屬於大腸桿菌種的任何菌株，例如但不限於大腸桿菌B、大腸桿菌C、大腸桿菌W、大腸桿菌K12、大腸桿菌Nissle。更具體地說，後一個術語涉及培養的大腸桿菌菌株──命名為大腸桿菌K12菌株，它們非常適應實驗室環境，並且與野生型菌株不同，它們已經失去了在腸道中茁壯成長的能力。大腸桿菌K12菌株的眾所周知的例子是K12野生型、W3110、MG1655、M182、MC1000、MC1060、MC1061、MC4100、JM101、NZN111和AA200。因此，本發明具體涉及如上所述的突變及／或轉化的大腸桿菌細胞或菌株，其中所述大腸桿菌菌株是K12菌株。更較佳地，大腸桿菌K12菌株是大腸桿菌MG1655。後一種屬於厚壁菌門的細菌較佳屬於芽孢桿菌綱(Bacilli)，較佳乳桿菌目(Lactobacilliales)，其成員例如乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis)、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)或芽孢桿菌目(Bacillales)，其成員例如來自芽孢桿菌屬(genus Bacillus)，例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或液化澱粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)。後一種細菌屬於放線菌門(Actinobacteria)，較佳屬於棒狀桿菌科(Corynebacteriaceae)，其成員例如麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)或非發酵棒桿菌(C. afermentans)，或屬於鏈絲菌科(Streptomycetaceae)，其成員例如灰色鏈黴菌(Streptomyces griseus)或弗氏鏈黴菌(S. fradiae)。後一種酵母較佳屬於子囊菌門(Ascomycota)或擔子菌門(Basidiomycota)或半知菌門(Deuteromycota)或接合菌門(Zygomycetes)。後一種酵母較佳屬於酵母屬(Saccharomyces)、念珠菌屬(Candida)、漢遜氏酵母菌屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母菌屬(Pichia)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、許旺酵母屬(Schwanniomyces)、有孢圓酵母屬(Torulaspora)、耶氏酵母屬(Yarrowia)和接合酵母屬(Zygosaccharomyces)；較佳地選自包含：釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)、乳酸克魯維酵母菌(Kluyveromyces lactis)、馬克斯克魯維酵母菌(Kluyveromyces marxianus)、巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、甲醇畢赤酵母菌(Pichia methanolica)、樹幹畢赤酵母菌(Pichia stipites)、博伊丁假絲酵母菌(Candida boidinii)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、德爾布有孢圓酵母(Torulaspora delbrueckii)、解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)的群組。後一種真菌較佳屬於根黴菌屬(Rhizopus)、網柱黏菌屬(Dictyostelium)、青黴屬(Penicillium)、毛黴屬(Mucor)或麴菌屬(Aspergillus)。
在一實施例中，至少一種微生物是乳糖滲透酶陽性表型的大腸桿菌或酵母，其中所述乳糖滲透酶分別由基因LacY或LAC12編碼。
進一步根據本發明的一較佳實施例，步驟i)之前為酶處理。較佳酶處理包括使用一種或多種的酶培育(incubation)培養或發酵液，所述酶選自包括以下的群組：醣苷酶、乳糖酶、b-半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、唾液酸酶、麥芽糖酶、澱粉酶、己醣胺酶(hexaminidase)、葡醣醛酸酶、海藻糖酶和轉化酶。替代或較佳地，酶處理將乳糖及／或蔗糖轉化為單醣。
根據一較佳實施例，方法更包括脫色。
在一實施例中，方法更包括無菌過濾及／或內毒素去除，較佳通過3kDa過濾器過濾純化的寡醣混合物。
在一實施例中，純化的寡醣混合物溶液具有(以總乾燥固體計)小於1%的灰含量，較佳(以總乾燥固體計)小於0.5%的灰含量。在一實施例中，純化的寡醣混合物溶液具有小於0.1 mg/kg、較佳小於0.05 mg/kg、又更佳低於0.02 mg/kg乾燥固體的鉛含量；小於0.2 mg/kg、較佳小於0.1 mg/kg、又更佳低於0.05 mg/kg乾燥固體的砷含量；小於0.1 mg/kg、較佳小於0.05 mg/kg、又更佳低於0.02 mg/kg乾燥固體的鎘含量；及／或小於0.5 mg/kg、較佳小於0.2 mg/kg、又更佳低於0.1 mg/kg乾燥固體的汞含量。
在一實施例中，純化的寡醣混合物溶液具有小於100 mg/kg乾燥固體的蛋白質含量、小於10 ng/g乾燥固體的DNA含量及／或小於10000EU/g乾燥固體的內毒素含量。小於100 mg/kg乾燥固體的蛋白質含量為較佳小於100 mg、小於90 mg、小於80 mg、小於70 mg、小於60 mg、小於50 mg、小於40 mg、小於30 mg、小於20 mg、小於10 mg、小於5 mg每kg乾燥固體。小於10 ng/g乾燥固體的DNA含量為較佳小於10 ng、小於9 ng、小於8 ng、小於7 ng、小於6 ng、小於5ng、小於4 ng、小於3 ng、小於2 ng、小於1 ng每g乾燥固體。小於10000EU/g乾燥固體的內毒素含量為較佳小於7500 EU、小於5000 EU、小於2500 EU、小於1000 EU、小於750 EU、小於500 EU、小於250 EU、小於100 EU、小於50 EU每g乾燥固體。
在本發明的一些實施例中，將純化的寡醣混合物溶液進一步濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿，或將所述寡醣混合溶液乾燥為粉末。較佳地，將純化的寡醣混合物溶液乾燥。這種乾燥步驟可以包括噴霧乾燥、冷凍乾燥、蒸發、沉澱、噴霧冷凍乾燥、冷凍噴霧乾燥、帶式乾燥(band drying)、帶式乾燥(belt drying)、真空帶式乾燥(vacuum band drying)、真空帶式乾燥(vacuum belt drying)、轉筒乾燥(drum drying)、真空轉筒乾燥、滾筒乾燥(roller drying)、真空滾筒乾燥和其他類型的乾燥中的任何一種或多種。
在一些實施例中，寡醣混合物的溶液在乾燥前，例如噴霧乾燥或冷凍乾燥前具有約8至約75的白利糖度百分比(percent Brix)的白利糖度值。在一些實施例中，寡醣混合物的溶液在乾燥前具有約30至約65的白利糖度百分比的白利糖度值。在一些實施例中，寡醣混合物的溶液在乾燥前，較佳噴霧乾燥前，具50至60的白利糖度百分比的白利糖度值。在一些實施例中，寡醣混合物的溶液在乾燥前具有約50的白利糖度百分比的白利糖度值。較佳地，噴霧乾燥純化的寡醣混合物溶液。替代或較佳地，乾燥步驟為噴霧乾燥或冷凍乾燥所述純化的寡醣混合物的溶液，且較佳溶液的pH小於5.0。在一些實施例中，噴霧乾燥純化的寡醣混合物。
在一些實施例中，進料到噴霧乾燥器中的純化的寡醣混合物具有為約8至約75的白利糖度百分比的白利糖度值。在一些實施例中，進料到噴霧乾燥器中的純化的寡醣混合物具有約30至約65的白利糖度百分比的白利糖度值。在一些實施例中，進料到噴霧乾燥器中的純化的寡醣混合物具有約50至約60的白利糖度百分比的白利糖度值。
在一些實施例中，進入噴霧乾燥器的進料在即將在噴霧乾燥器中分散成液滴之前處於約2至約70攝氏度的溫度。在一些實施例中，進入噴霧乾燥器的進料在即將在噴霧乾燥器中分散成液滴之前處於約30至約60攝氏度的溫度。在一些實施例中，進入噴霧乾燥器的進料在即將在噴霧乾燥器中分散成液滴之前處於約2至約30攝氏度的溫度。在一些實施例中，噴霧乾燥使用進氣溫度為120至280攝氏度的空氣。在一些實施例中，進氣溫度為120至210攝氏度。在一些實施例中，進氣溫度為約130至約190攝氏度。在一些實施例中，進氣溫度為約135至約160攝氏度。在一些實施例中，噴霧乾燥使用進氣溫度為約80至110攝氏度的空氣。在一些實施例中，進氣溫度為約100至約110攝氏度。在一些實施例中，噴霧乾燥在約20至約90攝氏度的溫度下進行。在一些實施例中，噴霧乾燥器是並流噴霧乾燥器(co-current spray dryer)。在一些實施例中，噴霧乾燥器附接到外部流體床(fluid bed)。在一些實施例中，噴霧乾燥器包括轉盤、高壓噴嘴或雙流體噴嘴(two-fluid nozzle)。在一些實施例中，噴霧乾燥器包括霧化輪(atomizer wheel)。在一些實施例中，噴霧乾燥是寡醣混合物的最終純化步驟。
在一實施例中，冷凍乾燥是寡醣混合物的最終純化步驟。
在一實施例中，糖漿是寡醣混合物的最終純化產物。
寡醣混合物的粉末
本說明書提供了通過本說明書中公開的方法製備的寡醣混合物的粉末。
在一些實施例中，寡醣混合物的粉末包含如本文所述的寡醣混合物。
在一實施例中，提供了一種大抵上由結構不同的寡醣的混合物組成或包含結構不同的寡醣的混合物的噴霧乾燥粉末，較佳用於生產營養組成物、膳食補充劑、藥物成分及／或化妝品成分。
在一實施例中，乾燥的粉末含水量低。
測量材料含水量的技術是本領域習知的。例子包括卡耳費雪滴定法(Karl -Fischer titration)，其中樣品吸收的卡耳費雪溶液的量表示樣品中的水量，以及重量法，其中乾燥樣品並每隔一段時間測量由於溶劑蒸發造成的重量損失。
在一實施例中，本發明提供一種乾燥為粉末的生產的寡醣混合體，其中乾燥粉末具有≤ 15%-wt.的水，較佳≤ 10%-wt.的水，更佳≤ 7%-wt.的水，最佳≤ 5%-wt.的水。在另外及／或替代的實施例中，乾燥粉末不具基因改造微生物且不具源自基因改造微生物的核酸分子。
在一特定的實施例中，本發明提供一種噴霧乾燥為粉末的生產的寡醣混合體，其中噴霧乾燥的粉末具有≤ 15%-wt.的水，較佳≤ 10%-wt.的水，更佳≤ 7%-wt.的水，最佳≤ 5%-wt.的水。在一些實施例中，操作噴霧乾燥器以達到約3.0至5.0%-wt.的水的含水量。在一些實施例中，寡醣混合物的粉末具有低於5.0%-wt.的水的含水量。在一些實施例中，寡醣混合物的粉末具有低於(以重量計)2.3%的水的含水量。
本案提供一種粉末狀的寡醣混合物，其中粉末通過雷射繞射測定具有50至250µm的平均粒徑，較佳粉末過雷射繞射測定具有95至120µm的平均粒徑，更佳粉末具有110至120µm的平均粒徑。此類粒徑取決於乾燥機的規格、配置、性能和設計。可用的商用乾燥機包括Büchi迷你噴霧乾燥機、Procept噴霧乾燥機、Gea噴霧乾燥機，可選配旋轉霧化器、雙流體噴嘴、壓力噴嘴、組合噴嘴，可選開放式設計、多級乾燥設計，閉合循環設計。使用Buchi噴霧乾燥器(Buchi Mini Spray Dryer B-290)(Büchi，Essen，Germany)，應用以下參數獲得上述粒徑：入口溫度：130°C，出口溫度67°C - 71°C，氣流670 L/h，抽氣器(aspirator)100%。
在一實施例中，當粉末以10%(質量/體積濃度)的濃度重新溶解在水中時，提供了pH在4至7之間，較佳4至6之間的溶液。
本案亦提供一種粉末狀的寡醣混合物，其中寡醣混合物的粉末具有約500至700g/L的鬆散體積密度，約600至約850g/L的100x振實體積密度，約600至約900g/L的625x振實體積密度，及／或約650至約900g/L的1250x振實體積密度。
在一些實施例中，寡醣混合物的粉末具有約600至700g/L的鬆散體積密度。在一些實施例中，寡醣混合物的粉末具有約500至600g/L的鬆散體積密度。
在一些實施例中，寡醣混合物的粉末具有約750至約850g/L的100x振實體積密度。在一些實施例中，寡醣混合物的粉末具有約600至約700g/L的100x振實體積密度。
在一些實施例中，寡醣混合物的粉末具有約750至約900g/L的625x振實體積密度。在一些實施例中，寡醣混合物的粉末具有約700至約800g/L的625x振實體積密度。
在一些實施例中，寡醣混合物的粉末具有約850至約900g/L的1250x振實體積密度。在一些實施例中，寡醣混合物的粉末具有約750至約800g/L的1250x振實體積密度。
在一些實施例中，寡醣混合物的粉末具有約600至700g/L的鬆散體積密度，約750至約850g/L的100x振實體積密度，約750至約850g/L的625x振實體積密度，及／或約850至約900g/L的1250x振實體積密度。在一些實施例中，寡醣混合物的粉末具有約500至600g/L的鬆散體積密度，約600至約700g/L的100x振實體積密度，約700至約800g/L的625x振實體積密度，及／或約750至約800g/L的1250x振實體積密度。
寡醣混合體的組成物
在一實施例中，寡醣混合物包含2’FL、3FL及LDFT，其中2'FL對2'FL、3FL和LDFT質量總和的相對百分比介於65%和79%之間，3FL對2'FL、3FL和LDFT質量總和的相對百分比介於17%和21%，LDFT對2'FL、3FL和LDFT質量總和的相對百分比介於9%和10%之間。
在一實施例中，寡醣混合物包含2’FL、3FL及LDFT，其中2'FL對2'FL、3FL和LDFT質量總和的相對百分比介於10%和12%之間，3FL對2'FL、3FL和LDFT質量總和的相對百分比介於79%和96%，LDFT對2'FL、3FL和LDFT質量總和的相對百分比介於1%和2%之間。
在一實施例中，寡醣混合物包含2’FL、3FL、LDFT、3’SL及6’SL，其中2'FL對2'FL、3FL、LDFT、3'SL和6'SL的質量總和的相對百分比介於53%到64%之間，3FL對2'FL、3FL、LDFT、3'SL和6'SL的質量總和的相對百分比介於14%和17%之間，LDFT對2'FL、3FL、LDFT、3'SL和6'SL質量總和的相對百分比為介於7%和8%之間，3'SL對2'FL、3FL、LDFT、3'SL和6'SL的質量總和的相對百分比介於5%和6%之間，並且6'SL對2'FL、3FL、LDFT、3'SL和6'SL的質量總和的相對百分比介於12%和15% 之間。
在一實施例中，寡醣混合物包含LNT、LNnT、3’SL及6’SL，其中LNT對LNT、LNnT、3’SL及6’SL的質量總和的相對百分比介於48%到59%之間，LNnT對LNT、LNnT、3’SL及6’SL的質量總和的相對百分比介於13%和16%之間，3’SL對LNT、LNnT、3’SL及6’SL質量總和的相對百分比為介於8%和10%之間，且6’SL對LNT、LNnT、3’SL及6’SL的質量總和的相對百分比介於20%和25%之間。
在一實施例中，寡醣混合物包含3’SL及6’SL，其中3’SL對3’SL及6’SL的質量總和的相對百分比介於26%到32%之間，6’SL對3’SL及6’SL的質量總和的相對百分比介於64%和78%之間。
在一實施例中，寡醣混合物包含3’SL及6’SL，其中6’SL對3’SL及6’SL的質量總和的相對百分比介於26%到32%之間，3’SL對3’SL及6’SL的質量總和的相對百分比介於64%和78%之間。
在一實施例中，寡醣混合物包含2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V，其中2’FL對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的質量總和的相對百分比介於38%到46%之間，3FL對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的質量總和的相對百分比介於10%和12%之間，LDFT對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的質量總和的相對百分比介於5%和6%之間，LNFP I對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的質量總和的相對百分比介於21%和25%之間，LNFP II對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的質量總和的相對百分比介於10%和13%之間，LNFP III對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的質量總和的相對百分比介於5%和6%之間，且LNFP V對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的質量總和的相對百分比介於1%和2%之間。
在一實施例中，寡醣混合物包含2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V，其中2’FL對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的質量總和的相對百分比介於6%到8%之間，3FL對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的質量總和的相對百分比介於51%和63%之間，LDFT對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的質量總和的相對百分比介於0.5%到2%之間， LNFP I對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的質量總和的相對百分比介於3%和5%之間，LNFP II對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的質量總和的相對百分比介於17%和21%之間，LNFP III對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的質量總和的相對百分比介於8%和10%之間，且LNFP V對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的質量總和的相對百分比介於2%和3%之間。
在一實施例中，寡醣混合物包含LSTa、LSTb及LSTc，其中LSTa對LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於15%到18%之間，LSTb對LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於13%到16%之間，且LSTc對LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於62%到75%之間。
在一實施例中，寡醣混合物包含3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc，其中3’SL對3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於14%到17%之間，6’SL對3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於35%到43%之間，LSTa對3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於7%到9%之間，LSTb對3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於6%到8%之間，且LSTc對3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於28%到34%之間。
在一實施例中，寡醣混合物包含2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc，其中2’FL對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於20%到30%之間，3FL對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於5%到10%之間，LDFT對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於3%到6%之間，3’SL對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於2%到4%之間，6’SL對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於5%到10%之間，LNT對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於11%到20%之間，LNnT對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於2%到4%之間，LNFP I對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於12%到20%之間，LNFP II對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於5%到10%之間，LNFP III對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於3%到6%之間，LNFP V對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於0.5%到2%之間，LSTa對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於0.5%到2%之間，LSTb對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於0.5%到2%之間，LSTc對2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的質量總和的相對百分比介於4%到8%之間，
在一實施例中，寡醣混合物包含2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT，其中2’FL對2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的質量總和的相對百分比介於37%到46%之間，3FL對2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的質量總和的相對百分比介於10%到12%之間，LDFT對2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的質量總和的相對百分比介於4%到8%之間，3’SL對2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的質量總和的相對百分比介於2%到5%之間，6’SL對2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的質量總和的相對百分比介於8%到10%之間，LNT對2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的質量總和的相對百分比介於20%到25%之間，且LNnT對2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的質量總和的相對百分比介於5%到10%之間。
在一實施例中，寡醣混合物包含2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT，其中2’FL對2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的質量總和的相對百分比介於3%到6%之間，3FL對2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的質量總和的相對百分比介於35%到46%之間，LDFT對2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的質量總和的相對百分比介於0.5%到2%之間，3’SL對2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的質量總和的相對百分比介於2%到5%之間，6’SL對2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的質量總和的相對百分比介於8%到15%之間，LNT對2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的質量總和的相對百分比介於25%到31%之間，且LNnT對2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的質量總和的相對百分比介於5%到10%之間。
寡醣混合物包含LNT及LNnT，其中LNT對LNT及LNnT的質量總和的相對百分比介於70%到90%之間，且LNnT對LNT及LNnT的質量總和的相對百分比介於10%到30%之間。
寡醣混合物包含LNT及LNnT，其中LNT對LNT及LNnT的質量總和的相對百分比介於10%到30%之間，且LNnT對LNT及LNnT的質量總和的相對百分比介於70%到90%之間
包括寡醣混合物的產品
在一些實施例中，通過本說明書的方法純化的寡醣混合物被摻入營養配方(如食品、飲料或飼料)、食品補充劑、膳食補充劑、消化健康功能食品或其他消費品(consumable products)中，供嬰兒、兒童、成人或老年人使用。其他應用包括通過本說明書的方法純化的寡醣混合物併入藥物成分、化妝品成分或藥物中。在一些實施例中，寡醣混合物與一種或多種適用於食品、飼料、膳食補充劑、藥物成分、化妝品成分或藥物的成分混合。
在一些實施例中，膳食補充劑包含至少一種益生元(prebiotic)成分及／或至少一種益生菌(probiotic)成分。
「益生元」是一種促進有益於宿主的微生物，特別是胃腸道微生物生長的物質。在一些實施例中，膳食補充劑提供多種益生元，包括通過本說明書中公開的方法純化的寡醣混合物，以促進一種或多種有益微生物的生長。用於膳食補充劑的益生元成分的例子包括其他益生元分子(如HMOs)和植物多醣(如菊糖、果膠、b-葡聚醣和木質寡醣)。「益生菌」產品通常含有活的微生物，它們替代或添加到胃腸道微生物群中，以造福接受者。此類微生物的實例包括乳桿菌種(Lactobacillus species)(例如嗜酸乳桿菌(L. acidophilus)和保加利亞乳桿菌(L. bulgaricus))、雙歧桿菌種(Bifidobacterium species)(例如動物雙歧桿菌(B. animalis)(例如 BB12)、長雙歧桿菌(B. longum)和嬰兒雙歧桿菌(B. infantis)(例如 Bi-26、Bi-07、Bb-02、EVC001-ActiBif))、鏈球菌種(Streptococcis species)(嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)(例如TH-4)和布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii))。在一些實施例中，通過本說明書的方法純化的寡醣混合物與此類微生物組合口服施用。
膳食補充劑的其他成分的例子包括雙醣(如乳糖)、單醣(如葡萄糖和半乳糖)、增稠劑(如阿拉伯膠)、酸度調節劑(如檸檬酸三鈉、磷酸、硫酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸(tartric acid)、蘋果酸、琥珀酸、延胡索酸或其鹽)、水、脫脂牛奶和調味劑。
在一些實施例中，寡醣混合物摻入人類嬰兒食品(例如嬰兒配方產品(infant formula))中。嬰兒配方產品通常是一種用於餵養嬰兒的人造食品，作為人類母乳的完全或部分替代品。在一些實施例中，嬰兒配方產品作為粉末出售並通過與水混合製備用於給嬰兒用奶瓶或杯子餵養。嬰兒配方產品的組成通常被設計為大致模仿人類母乳。在一些實施例中，通過本說明書中的方法純化的寡醣混合物包含在嬰兒配方產品中以提供與人母乳中的寡醣相似的營養價值。在一些實施例中，寡醣混合物與嬰兒配方產品的一種或多種成分混合。嬰兒配方產品成分的示例包括脫脂牛奶、碳水化合物來源(例如乳糖)、蛋白質來源(例如乳清蛋白濃縮物和酪蛋白)、脂肪來源(例如植物油──例如棕櫚油、高油酸紅花籽油、菜籽油、椰子油及／或葵花籽油；和魚油)、維生素(例如維生素A、Bb、Bi2、C和D)、礦物質(例如檸檬酸鉀、檸檬酸鈣、氯化鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和磷酸鈣)和可能HMOs。此類HMOs可包括，例如，DiFL、乳糖基-N-丙糖II、LNT、LNnT、乳糖基-N-岩藻五糖I、乳糖基-N-新岩藻五糖、乳糖基-N-岩藻五糖II、乳糖基-N-岩藻五糖III、乳糖基-N-岩藻五糖V、乳糖基-N-新岩藻五糖V、乳糖基-N-二岩藻糖六糖I、乳糖基-N-二岩藻糖六糖II、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳糖基-N-六糖和乳糖基-N-新六糖。
在一些實施例中，一種或多種嬰兒配方產品成分包括脫脂牛奶、碳水化合物來源、蛋白質來源、脂肪來源及／或維生素和礦物質。
在一些實施例中，一種或多種嬰兒配方產品包含乳糖、乳清蛋白濃縮物及／或高油酸紅花籽油。
在一些實施例中，嬰兒配方產品中寡醣混合物的濃度與人類母乳中通常存在的寡醣的濃度大致相同。在一些實施例中，嬰兒配方產品的寡醣混合物中的每種單一寡醣的濃度與通常存在於人類母乳中的此寡醣的濃度大致相同。
在一些實施例中，將寡醣混合物摻入飼料調製中，其中所述飼料選自包括寵物食品、動物代乳品、獸醫產品、斷奶後飼料(post weaning feed)或教槽飼料(creep feed)的列表。
通過本說明書的方法純化的寡醣混合物可以加入藥學上可接受的載體，例如常規的添加劑、佐劑、賦形劑和稀釋劑(水、明膠、滑石、糖、澱粉、阿拉伯膠、植物膠、植物油、聚烯烴基二醇(polyalkylene glycols)、調味劑、防腐劑、穩定劑、乳化劑、潤滑劑、著色劑、填充劑、潤濕劑等)。合適的載體在Remington's Pharmaceutical Sciences的最新版本中有所描述，這是該領域的標準參考文本。當將通過本說明書方法純化的寡醣混合物加入藥學上可接受的載體中時，劑量形式可以製成例如但不限於片劑、粉劑、顆粒劑、混懸劑、乳劑、浸劑(infusions)、膠囊劑、注射劑、液體劑、酏劑(elixirs)、提取物和酊劑(tincture)。對於上述配方，如果需要，也可以進一步添加益生菌，例如乳酸菌(lacto bacteria)、雙歧桿菌種、益生元例如果寡醣和半乳寡醣、來自酪蛋白、大豆、乳清或脫脂牛奶的蛋白質、碳水化合物如乳糖、蔗糖、麥芽糊精、澱粉或其混合物、脂類(如軟質棕櫚油(palm olein)、葵花籽油、紅花籽油)以及日常飲食中必不可少的維生素和礦物質。
包含通過本說明書的方法純化的寡醣混合物的藥物組成　物可以通過本領域已知的任何常用方式製造，例如Remington's Pharmaceutical Sciences的最新版本中對此進行了描述，這是該領域的標準參考文本。
在一個例示性的實施例中，從培養或發酵液中生產的寡醣混合物的純化，包括以任何順序的以下步驟： a)澄清本文所述的培養或發酵液 b)將澄清的培養或發酵液與具有600-3500 Da載留分子量(molecular weight cut-off, MWCO)的奈米過濾膜接觸，確保生產的寡醣保留，並允許至少一部分的蛋白質、鹽類、副產物、顏色和其他相關雜質通過 c) 對來自步驟b)的滲餘物進行透析過濾(diafiltration)製程，使用所述膜和無機電解質的水溶液，然後任選地用純水透析過濾以除去過量的電解質， d)並從所述電解質的陽離子中以鹽類的形式收集富含寡醣混合物的滲餘物 e)任選乾燥，較佳噴霧乾燥。
在替代的例示性實施例中，所生產的寡醣混合物的純化可以在包括任何順序的以下步驟的製程中進行：對該培養或發酵液進行使用不同濾膜的兩道膜過濾步驟，其中一濾膜具有介於300至500Da之間的載留分子量，且另一濾膜具有介於600至800Da之間的載留分子量。
在一替代的例示性實施例中，寡醣混合物的純化可以在包括任何順序的以下步驟的製程中進行，其中包括使用H+形式的強陽離子交換樹脂和游離鹼形式的弱陰離子交換樹脂處理澄清的培養或發酵液的步驟。
在一替代的例示性的實施例中，所生產的寡醣混合物的純化可以在包括以下步驟的製程中進行：包含所生產的寡醣、生物質、基質組分和污染物的混合物，並且較佳其中發酵液或培養物中生產的寡醣混合物的純度＜80%的發酵液或培養物， 其特徵在於發酵液或培養物應用於以下的純化步驟： i)從發酵液或培養物中分離生物質 ii)陽離子交換劑處理以去除帶正電的材料， iii)陰離子交換劑處理以去除帶負電的材料， iv)奈米過濾步驟及／或電滲析步驟， 其中提供了一種包含所生產的寡醣混合物的純化溶液，其總純度(combined purity)大於或等於80%。任選地，將純化的溶液噴霧乾燥。或者，將純化的溶液濃縮成較佳至少40%乾燥物質的糖漿。
在一個替代的例示性實施例中，所生產的寡醣混合物的純化可以在包括任何順序的以下步驟的製程中進行：培養物的酶處理；從培養物中去除生物質；超濾；奈米過濾；和管柱層析步驟。較佳地，此種管柱層析是單管柱或多管柱。更較佳地，管柱層析步驟是模擬移動床層析。此種模擬移動床層析較佳包括i)至少四個管柱，其中至少一個管柱包含弱或強陽離子交換樹脂；及／或ii)具有不同流速的四個區域I、II、III和IV；及／或iii)包含水的沖提液；及／或iv)15至60攝氏度的操作溫度。
生產純化的帶電寡醣的方法
在一實施例中，本說明書提供了一種生產純化的帶電寡醣的方法。在一實施例中，此種帶電寡醣是一起純化的寡醣混合物的一部分。在一實施例中，帶電寡醣從培養或發酵液中純化。
在一實施例中，提供了一種生產純化的帶電寡醣的方法，所述方法包括： 培養至少一細胞，較佳微生物的細胞，在合適的培養或發酵基質中合成帶電寡醣以形培養或發酵液， 從所述培養或發酵液中純化所述帶電寡醣，藉由 i) 澄清培養或發酵液，以及 ii)從所述澄清的培養或發酵液中去除鹽類及／或基質成分，及／或 iii)濃縮所述澄清的培養或發酵液中的所述寡醣混合物， 特徵在於步驟ii)包括使用a)混合床離子交換樹脂或b)陽離子和陰離子交換樹脂的處理，從而提供包含所述純化的帶電寡醣的溶液。
在一實施例中，在a)或b)中任一者所使用的陰離子交換樹脂具有30-48%的含水量，並且較佳為凝膠型陰離子交換劑，較佳選自包括Dowex 1-X8、XA4023、XA3112、DIAION SA20A、DIAION SA10A的群組。
在一實施例中，陰離子交換的樹脂為OH-形式。
在一實施例中，混合床離子交換樹脂為Diaion SA20A和Amberlite FPC 22H以1.1:1至1.9:1的比例混合的混合床管柱。
在一實施例中，混合床離子交換樹脂為Dowex 1-X8和Amberlite FPC 22H以1.1:1至1.9:1的比例混合的混合床管柱。
在一實施例中，混合床離子交換樹脂為XA4023和Amberlite FPC 22H以1.1:1至1.9:1的比例混合的混合床管柱。
在一實施例中，混合床離子交換樹脂為XA3112和Amberlite FPC 22H以1.1:1至1.9:1的比例混合的混合床管柱。
在一實施例中，混合床離子交換樹脂為Diaion SA10A和Amberlite FPC 22H以1.1:1至1.9:1的比例混合的混合床管柱。
在一實施例中，帶電寡醣選自包含唾液酸化寡醣、硫酸化殼聚醣、脫乙醯殼聚醣的列表。
在一實施例中，步驟i)是如本文所述的步驟。
在一實施例中，步驟ii)進一步包括如本文所述的步驟ii)中的任一項。
在一實施例中，步驟ii)是如本文所述的步驟。
在一實施例中，如本文所述，乾燥包含所述純化的帶電寡醣的溶液。在一實施例中，乾燥的步驟包括噴霧乾燥、冷凍乾燥、蒸發、沉澱和乾燥中的任何一者或多者。在一實施例中，如本文所述，液噴霧乾燥包含所述純化的帶電寡醣的所述溶液。
在一實施例中，將包含所述純化的帶電寡醣的溶液進一步濃縮成至少40%乾燥物質的糖漿。
除非另有定義，本文中使用的所有技術和科學術語通常具有與本發明所屬領域具有通常知識者通常理解的相同含義。通常，本文所用的命名法和上文和下文所述的細胞培養、分子遺傳學、有機化學和核酸化學以及雜交中的實驗室程序是本領域熟知和常用的那些。標準技術用於核酸和胜肽合成。通常，純化步驟根據製造商的規格進行。
從具體的實施態樣和實施例可以看出進一步的優點。無庸置疑，在不脫離本發明的範圍的情況下，上述特徵和下面將要解釋的特徵不僅可以以分別指定的組合使用，而且可以以其他組合或單獨使用。
本發明涉及以下具體實施態樣： 1.  一種生產不同寡糖的純化混合物的方法，包括： 培養至少一細胞，較佳為一微生物的細胞，其在合適的一培養或發酵基質中合成一不同寡醣的混合物以形成一培養或發酵液， 從該培養或發酵液中純化該寡醣混合物，藉由 i)澄清該培養或發酵液，以及 ii)從澄清的該培養或發酵液中去除鹽類及／或基質成分，及／或 iii)濃縮澄清的該培養或發酵液中的該寡醣混合物， 從而提供一溶液，包含純化的該寡醣混合物。 2.  如實施態樣1之方法，其中步驟iii)在步驟ii)前進行。 3.   如實施態樣1或2之方法，其中該寡醣混合物包括至少兩種不同的寡醣，較佳至少三種不同的寡醣，更佳至少四種不同的寡醣，又更加至少五種不同的寡醣，最佳至少六種不同的寡醣。 4.  如實施態樣1~3中任一項之方法，其中該寡醣混合物包括聚合度不同的至少兩種不同的寡醣，較佳該寡醣混合物包括聚合度不同的至少三種不同的寡醣，更佳該寡醣混合物包括聚合度不同的至少四種不同的寡醣。 5.  如實施態樣1~4中任一項之方法，其中該寡醣混合物包括至少一中性及至少一帶電的寡醣。 6.  如實施態樣1~5中任一項之方法，其中該培養或發酵液包括寡醣、生物質、基質成分及汙染物的混合物。 7.  如實施態樣1~6中任一項之方法，其中該至少一細胞經過基因改造以生產至少一種寡醣，較佳該至少一細胞經過基因改造以生產至少兩種不同的寡醣。 8.  如實施態樣1~7中任一項之方法，其中該至少一細胞為經過基因改造以生產至少一種寡醣的一微生物的細胞，較佳該至少一微生物經過基因改造以生產至少兩種不同的寡醣。 9.  如實施態樣1~8中任一項之方法，其中在該培養或發酵液中的該寡醣混合物藉由培養至少一基因改造的細胞，較佳藉由培養能夠生產該寡糖混合物的一微生物的細胞而獲得，且該寡醣混合物較佳來一自內化碳水化合物前驅物。 10.    如實施態樣1~9中任一項之方法，其中該至少一細胞，較佳為微生物，在具有一碳源的一基礎鹽培養基(minimal salt medium)中培養，該至少一細胞，較佳為微生物，在該碳源上生長。 11.    如實施態樣10之方法，其中所述基礎鹽培養基包含硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物、銨、鈣離子、鎂離子、鈉、鉀離子、鐵離子、銅離子、鋅離子、錳離子、鈷離子及／或硒離子。 12.    如實施態樣10或11之方法，其中該碳源包括葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、玉米浸液、乳糖、半乳糖、高果糖糖漿、澱粉、纖維素、半纖維素、麥芽寡醣、海藻糖、甘油、醋酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽和丙酮酸鹽中的一者或多者。 13.    如實施態樣1~12中任一項之方法，其中在該發酵液中的該寡醣混合物的總純度以總乾燥固體計，小於80%，及／或在該溶液中的該寡醣混合物的總純度以總乾燥固體計，等於或高於80%。 14.    如實施態樣1~13中任一項之方法，其中在該培養或發酵液中的該寡醣混合物的總純度在純化前以總乾燥固體計，＜70%、＜60%、＜50%、＜40%、＜30%、＜20%、＜10%，及／或純化的該寡醣混合物的總純度在純化後以總乾燥固體計，＞80%，較佳＞85%，更加＞90%，又更加＞95%，最佳＞97%。 15.    如實施態樣1~14中任一項之方法，其中澄清該培養或發酵液的步驟i)包括澄清(clarification)、清除(clearing)、過濾、微濾、離心、傾析和超濾中的一者或多者，較佳步驟i)更包括使用一助濾劑及／或絮凝劑；較佳該助濾劑為一吸附劑，更佳為活性碳。 16.    如實施態樣15之方法，其中步驟i)包括對該培養或發酵液進行使用不同濾膜的兩道膜過濾步驟。 17.    如實施態樣1~16中任一項之方法，其中從澄清的該培養或發酵液中去除鹽類及／或基質成分的步驟ii)包括奈米過濾、透析、電滲析、活性炭或碳的使用、溶劑的使用、醇的使用以及含水酒精混合物的使用、木炭的使用、切向流高效過濾、切向流超濾、親和層析、離子交換、陽離子交換、陰離子交換、混合床離子交換、模擬移動床層析、離子交換層析、疏水作用層析、凝膠過濾、配位基交換層析、管柱層析、陽離子交換吸附樹脂和離子交換樹脂的使用中的至少一者或多者。 18.    如實施態樣17之方法，其中從該澄清的培養或發酵液中去除鹽類及／或基質成分的步驟ii)包括陰離子交換，其中該陰離子交換的樹脂之特徵在於具有30-48%的一水分含量，以及較佳為微孔或一凝膠型陰離子交換劑，較佳選自Dowex 1-X8、XA4023、XA3112、DIAION SA20A、DIAION SA10A的群組。 19.    如實施態樣1~18中任一項之方法，其中步驟ii)包括使用混合床離子交換樹脂，較佳Diaion SA20A和Amberlite FPC 22H以1.1:1至 1.9:1的比例混合的混合床管柱，的一處理。 20.    如實施態樣1~19中任一項之方法，其中濃縮的步驟iii)包括奈米過濾、逆滲透、蒸發、刮膜蒸發和降膜蒸發中的一者或多者。 21.    如實施態樣1~20中任一項之方法，其中該寡醣混合物包括岩藻糖基化寡醣、唾液酸化寡醣、路易斯型抗原、含有N-乙醯葡萄糖胺的中性寡醣、含有N-乙醯基乳糖胺的寡醣、含有乳糖-N-雙醣的寡醣、非岩藻糖基化中性寡醣、殼聚醣、殼寡醣、肝素寡醣、硫酸軟骨寡醣、醣胺聚醣寡糖、肝素、硫酸乙醯肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、玻尿酸或透明質酸及／或硫酸角質素中的至少一者。 22.    如實施態樣1~21中任一項之方法，其中該寡醣混合物包括至少一哺乳動物乳寡醣，較佳至少一人乳寡醣，更佳該混合物中的所有寡醣皆為哺乳動物乳寡醣，最佳該混合物中的所有寡醣皆為人乳寡醣。 23.    如實施態樣1~22中任一項之方法，其中步驟i)包括微濾澄清的一第一步驟。 24.    如實施態樣1~22中任一項之方法，其中所述步驟i)包括離心澄清的一第一步驟。 25.    如實施態樣1~22中任一項之方法，其中步驟i)包括絮凝澄清的一第一步驟。 26.    如實施態樣1~22中任一項之方法，其中步驟i)包括超濾澄清的一第一步驟。 27.    如實施態樣1~26中任一項之方法，其中步驟i)包括超濾。 28.    如實施態樣26或27之方法，其中步驟i)中的超濾具有等於或大於1 kDa、2 kDa、3 kDa、4 kDa、5 kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10 kda、11 kDa、12kDa、13 kDa、14 kDa、15 kDa的一載留分子量(molecular weight cut off)。 29.    如實施態樣1~28中任一項之方法，其中步驟i)包括連續的兩次超濾，且其中第一次超濾的濾膜載留分子量大於第二次超濾的濾膜載留分子量。 30.    如實施態樣1~29中任一項之方法，其中步驟ii)包括奈米過濾及／或電滲析。 31.    如實施態樣30之方法，其中該奈米過濾及／或電滲析執行兩次。 32.    如實施態樣31之方法，其中該奈米過濾及／或電滲析的步驟連續執行。 33.    如實施態樣26~32中任一項之方法，其中步驟i)中的超濾滲透物在步驟ii)中奈米過濾及／或電滲析。 34.    如實施態樣1~22、26~32中任一項之方法，其中步驟i)為超濾，步驟ii)為奈米過濾及／或電滲析的處理結合使用一離子交換樹脂及／或層析的處理。 35.    如實施態樣34之方法，其中該離子交換樹脂為一強酸性陽離子交換樹脂及／或一弱鹼性陰離子交換樹脂。 36.    如實施態樣35之方法，其中該離子交換樹脂為一強酸性陽離子交換樹脂及一弱鹼性陰離子交換樹脂。 37.    如實施態樣1~36中任一項之方法，其中步驟ii)包括使用H+形式或Na+形式的一強陽離子交換樹脂以及游離鹼形式，較佳Cl-形式，或者較佳OH-形式的一弱陰離子交換樹脂的處理。 38.    如實施態樣35~37中任一項之方法，其中使用H+形式或Na+形式的一強陽離子交換樹脂的處理後直接接著使用游離鹼形式的一弱陰離子交換樹脂的一處理。 39.    如實施態樣1~38中任一項之方法，其中該方法不包括電滲析。 40.    如實施態樣1~38中任一項之方法，其中步驟ii)包括電滲析。 41.    如實施態樣35~38、40中任一項之方法，其中使用一強陽離子交換樹脂及／或一弱陰離子交換樹脂的處理之前，先進行超濾，然後進行奈米過濾及／或電滲析。 42.    如實施態樣1~41中任一項之方法，其中步驟i)至iii)中的任一者或多者執行不止一次。 43.    如實施態樣33~42中任一項之方法，其中步驟ii)中奈米過濾膜的載留分子量低於步驟i)中超濾膜的載留分子量。 44.    如實施態樣33~43中任一項之方法，其中步驟ii)中奈米過濾膜的載留分子量等於或高於200 Da、300 Da、400 Da、500 Da、600 Da、700Da、800 Da、900 Da或1000 Da。 45.    如實施態樣17~44中任一項之方法，其中步驟ii)包括在中性固相上的一離子交換樹脂處理及／或層析。 46.    如實施態樣1~45中任一項之方法，其中包括純化的該寡醣混合物的該溶液具有約8至約75%的白利糖度值(Brix value)，較佳包括純化的該寡醣混合物的該溶液具有約30至65%的白利糖度值。 47.    如實施態樣1~46中任一項之方法，其中該至少一微生物為乳糖滲透酶陽性表型的一大腸桿菌或酵母菌，其中該乳糖滲透酶分別由基因LacY或LAC12編碼。 48.    如實施態樣1~47中任一項之方法，其中該微生物為一細菌，較佳為一大腸桿菌菌株，更佳為一K-12菌株的大腸桿菌菌株，又更佳該大腸桿菌K-12菌株為E. coli MG1655。 49.    如實施態樣1~47中任一項之方法，其中該至少一微生物為一酵母菌。 50.    如實施態樣50之方法，其中該酵母菌選自由酵母屬酵母屬(Saccharomyces)、念珠菌屬(Candida)、漢遜氏酵母菌屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母菌屬(Pichia)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、許旺酵母屬(Schwanniomyces)、有孢圓酵母屬(Torulaspora)、耶氏酵母屬(Yarrowia)和接合酵母屬(Zygosaccharomyces)所組成的群組；較佳選自由釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)、乳酸克魯維酵母菌(Kluyveromyces lactis)、馬克斯克魯維酵母菌(Kluyveromyces marxianus)、巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、甲醇畢赤酵母菌(Pichia methanolica)、樹幹畢赤酵母菌(Pichia stipites)、博伊丁假絲酵母菌(Candida boidinii)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、德爾布有孢圓酵母(Torulaspora delbrueckii)、脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)的群組。後一種真菌較佳屬於根黴菌屬(Rhizopus)、網柱黏菌屬(Dictyostelium)、青黴屬(Penicillium)、毛黴屬(Mucor)或麴菌屬(Aspergillus)所組成的群組。 51.    如實施態樣1~50中任一項之方法，其中步驟i)之前為一酶處理。 52.    如實施態樣51之方法，其中該酶處理包括用一種或多種酶培養該培養或發酵液，該酶選自由糖苷酶、乳糖酶、b-半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、唾液酸酶、麥芽糖酶、澱粉酶、六糖苷酶、葡醣醛酸酶、海藻糖酶和轉化酶所組成的群組。 53.    如實施態樣51或52之方法，其中該酶處理將乳糖及／或蔗糖轉化為單醣類。 54.    如實施態樣1~53中任一項之方法，其中該方法更包括脫色。 55.    如實施態樣1~54中任一項之方法，其中純化的該寡醣混合物溶液具有(以總乾燥固體計)小於1%的灰含量，較佳(以總乾燥固體計)小於0.5%的灰含量，較佳小於0.1 mg/kg乾燥固體的鉛含量、小於0.2 mg/kg乾燥固體的砷含量、小於0.1 mg/kg乾燥固體的鎘含量及／或小於0.5 mg/kg乾燥固體的汞含量。 56.    如實施態樣1~55中任一項之方法，其中將純化的該寡醣混合物溶液進一步濃縮為至少40%為乾燥物質的一糖漿，或將該寡醣混合溶液乾燥為一粉末。 57.    如實施態樣1~56中任一項之方法，其中所述純化的寡醣混合物溶液具有每公斤乾燥固體小於100毫克的一蛋白質含量、每克乾燥固體小於10奈克的DNA含量及／或每克乾燥固體小於10000EU的內毒素含量。 58.    如實施態樣1~57中任一項之方法，其中將純化的該寡醣混合物溶液乾燥。 59.    如實施態樣57或58之方法，其中乾燥步驟包括噴霧乾燥、冷凍乾燥、蒸發、沉澱和乾燥中的任一者或多者。 60.    如實施態樣59之方法，其中將純化的該寡醣混合物溶液噴霧乾燥。 61.    如實施態樣59之方法，其中該乾燥為將純化的該寡醣混合物溶液噴霧乾燥或冷凍乾燥，且其中較佳該溶液的pH小於5.0。 62.    一種純化的寡醣混合物，藉由如實施態樣1~61中任一項之方法獲得。 63.    一種乾燥粉末，藉由如實施態樣58~61中任一項之方法獲得，其中該乾燥粉末具有≤ 15%-wt的水，較佳≤ 10%-wt的水，更佳≤ 7%-wt的水，最佳≤ 5%-wt的水。 64.    一種噴霧乾燥的粉末，藉由如實施態樣59~63中任一項之方法獲得，其中該粉末通過雷射繞射測定具有50至250µm的一平均粒徑，較佳該粉末具有95至120µm的一平均粒徑，更佳該粉末具有110至120µm的一平均粒徑。 65.    一種如實施態樣58~64中任一項的寡醣混合物的粉末，其中當所述粉末以10%(質量/體積濃度)的一濃度重新溶解在水中時，提供了具有在4至7之間，較佳4至6之間的pH的一溶液。 66.    一種乾燥的純化的寡醣混合物的粉末，可藉由如實施態樣58~65中任一項之方法獲得，其中該粉末表現出： 一約500至約700g/L的鬆散體積密度， 一約600至約850g/L的100x振實體積密度， 一約600至約900g/L的625x振實體積密度，及／或 一約650至約900g/L的1250x振實體積密度。 67.    如實施態樣66之寡醣混合物的粉末，其中該粉末表現出： 一約600至約700g/L的鬆散體積密度， 一約750至約850g/L的100x振實體積密度， 一約750至約850g/L的625x振實體積密度，及／或 一約850至約900g/L的1250x振實體積密度。 68.    如請求項66之寡醣混合物的粉末，其中該粉末表現出： 一約500至約600g/L的鬆散體積密度， 一約600至約700g/L的100x振實體積密度， 一約700至約800g/L的625x振實體積密度，及／或 一約750至約800g/L的1250x振實體積密度。 69.    一種藉由如實施態樣1~61中任一項之方法獲得的純化的寡醣混合物在一食物或飼料調製(feed preparation)、一膳食補充劑、一妝品成分或一藥物成分中的用途。 70.    一種如實施態樣62~68中任一項之純化的寡醣混合物在一食物或飼料調製、一膳食補充劑、一妝品成分或一藥物成分中的用途。 71.    如實施態樣69或70之用途，其中該食物為一人類食物。 72.    如實施態樣69~71中任一項之用途，其中該食物為一嬰兒食物。 73.    如實施態樣69~72中任一項之用途，其中該食物為一嬰兒配方產品或一嬰兒補充劑。 74.    如實施態樣69或70之用途，其中該飼料為一寵物食品、動物代乳品、獸醫產品、斷奶後飼料或教槽飼料。 75.    一種生產純化的帶電寡醣的方法，包括： 培養至少一細胞，較佳一微生物的細胞，其在合適的一培養或發酵基質中合成一帶電寡醣以形成一培養或發酵液， 從該培養或發酵液中純化該帶電寡醣，藉由 i) 澄清該培養或發酵液，以及 ii)從澄清的該培養或發酵液中去除鹽類及／或基質成分，及／或 iii)濃縮澄清的該培養或發酵基質中的該寡醣混合物， 且該方法的特徵在於步驟ii)包括使用a)一混合床離子交換或b)陽離子和陰離子交換的一處理，從而提供一溶液，包含純化的該帶電寡醣。 76.    如實施態樣75之方法，其中在a)或b)中任一者所使用的該陰離子交換的樹脂具有30-48%的一水分含量，並且較佳為一凝膠型陰離子交換劑，較佳選自包括Dowex 1-X8、XA4023、XA3112、DIAION SA20A、DIAION SA10A的群組。 77.    如實施態樣76之方法，其中該陰離子交換的樹脂為OH-形式。 78.    如實施態樣75或76之方法，其中該處理為a)混合床離子交換，且該混合床離子交換的樹脂為Diaion SA20A和Amberlite FPC 22H以1.1:1至1.9:1的比例混合的混合床管柱。 79.    如實施例75~78中任一項之方法，其中該帶電寡醣選自包含唾液酸化寡醣、硫酸化殼聚醣、脫乙醯殼聚醣的列表。 80.    如實施例75~79中任一項之方法，其中將該帶電寡醣溶液更進一步濃縮為至少40%為乾燥物質的一糖漿，或將該寡醣混合物溶液乾燥為一粉末。
將在例示中更詳細地描述本發明
實施例
實施例 1. 材料與方法
基質與培養
Luria Broth (LB)培養基由1%胰蛋白腖(tryptone peptone)(Difco, Erembodegem, Belgium)、0.5%酵母萃取物(Difco)和0.5%氯化鈉(VWR. Leuven, Belgium)組成。用於96孔盤或搖瓶的培養實驗的基礎培養基(minimal medium)含有2.00 g/L NH4Cl、5.00 g/L (NH4)2SO4、2.993 g/L KH2PO4、7.315 g/L K2HPO4、8.372 g/L MOPS、0.5 g/L NaCl、0.5 g/L MgSO4.7H2O、30 g/L蔗糖或30 g/L甘油、1 ml/L維生素溶液、100 µl/L鉬酸鹽溶液以及1 mL/L硒溶液。如各自實施例中所述，將0.30 g/L唾液酸、20 g/L乳糖、20 g/L LacNAc、20 g/L LNnT、20 g/L LNT及／或20 g/L LNB作為前驅物額外添加到 基質中。使用1M KOH將基礎培養基的pH值設定為7。維生素溶液由3.6 g/L FeCl2.4H2O、5 g/L CaCl2.2H2O、1.3 g/L MnCl2.2H2O、0.38 g/L CuCl2.2H2O、0.5 g/L CoCl2.6H2O、0.94 g/L ZnCl2、0.0311 g/L H3BO4、0.4 g/L Na2EDTA.2H2O以及1.01 g/L鹽酸硫胺明(Thiamine HCl)組成。鉬酸鹽溶液包含0.967 g/L NaMoO4.2H2O。硒溶液包含42 g/L SeO2。
發酵用的基礎培養基包含6.75 g/L NH4Cl、1.25 g/L (NH4)2SO4、2.93 g/L KH2PO4及7.31 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、0.5 g/L MgSO4.7H2O、30 g/L蔗糖或30 g/L甘油、1 mL/L維生素溶液、100 µL/L鉬酸鹽溶液及1 mL/L硒溶液，具有與上述相同的組成。如各自實施例中所述，將0.30 g/L唾液酸、20 g/L 乳糖、20 g/L LacNAc、20 g/L LNnT、20 g/L LNT及／或20 g/L LNB作為前驅物額外添加到基質中。
複合基質通過高壓滅菌釜(121°C，21 分鐘)進行滅菌且基礎培養基通過過濾(0.22 µm Sartorius)進行滅菌。
生物反應器(bioreactor)的預培養從特定菌株的整個1 mL冷凍管開始，接種在1 L或2.5 L搖瓶中的250 mL或500 mL基礎培養基中，並在37°C下在迴轉式振盪機(orbital shaker)上以200轉/分的速度培育(incubate)24 h。然後接種5 L或30 L的生物反應器(250 mL接種物(inoculum)在2 L批次基質(batch medium)中或 1 L接種物在 17 L批次基質中)；該製程由MFCS控制軟體(Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Germany)控制。培養條件設為37℃，最大攪拌；壓力氣體流速(pressure gas flow rates)取決於菌株和生物反應器。使用0.5 M H2SO4和20% NH4OH將pH控制在6.8。冷卻廢氣。發酵過程中起泡時加入10%矽酮消泡劑溶液。
菌株和突變
大腸桿菌K12 MG1655 [λ -, F -, rph-1]在2007年3月從Coli Genetic Stock Center (US)獲得，CGSC Strain#: 7740。使用Datsenko和Wanner發表的技術(PNAS 97 (2000), 6640-6645)進行基因中斷(Gene disruptions)、基因導入和基因置換。該技術基於lambda Red重組酶進行同源重組後的抗生素選擇。翻轉酶重組酶(flippase recombinase)的後續催化確保去除最終生產菌株中的抗生素選擇匣。攜帶Red輔助質體pKD46的轉形體(transformants)在含胺苄青黴素(ampicillin)(100mg/L)和L-阿拉伯糖(10mM)的10mL LB培養基中於30℃下生長至OD 600nm為0.6。藉由第一次用50 mL冰冷水(ice-cold water)洗滌細胞，第二次用1 mL冰冷水洗滌，使細胞電勝任(electrocompetent)。然後，將細胞重新懸浮在50 µL冰冷的水中。使用Gene Pulser™ (BioRad)(600 Ω、25 µFD和250伏)對50 µL細胞和10-100 ng線性雙股DNA產物進行電穿孔。電穿孔後，將細胞加入1 mL LB培養基中，在37 °C培育1 h，最後塗佈在含有 25 mg/L氯黴素(chloramphenicol)或50 mg/L康黴素(kanamycin)的LB瓊脂上，以篩選抗生素抗藥性轉形體。用修飾區上游和下游的引子進行PCR驗證所選擇的突變體，並在LB瓊脂中在42°C下生長以失去輔助質體。對這些突變體進行胺苄青黴素敏感性測試。線性ds-DNA擴增子是用pKD3、pKD4和它們的衍生物作為模版而通過PCR獲得的。使用的引子有一部分序列與模版互補，另一部分與染色體DNA上必須發生重組的一側互補。對於基因敲除(genomic knock-out)，同源區被設計在目標基因(gene of interest)的起始和終止密碼子的上游50nt和下游50nt。對於基因敲入(genomic knock-in)，必須考量轉錄起始點(+1)。PCR產物經PCR純化，用Dpnl消化，從瓊脂糖凝膠中重新純化，並懸浮在沖提緩衝液(5mM Tris，pH 8.0)中。選定的突變體用pCP20質體進行轉形，此質體是一種抗胺苄青黴素和氯黴素的質體，顯示出對溫度敏感的複製和熱誘導FLP合成。在30℃下選擇抗胺苄青黴素的轉形體，之後在42℃的LB中對少數轉形體進行菌落純化(colony purified)，然後檢測所有抗生素抗藥性和FLP輔助質體的損失。用對照引子檢查基因敲除和敲入的情況。
在一個用於生產GDP-岩藻醣和岩藻醣化寡醣的一實施例中，突變株來自大腸桿菌K12 MG1655，包括E. coli中 wcaJ及 thyA基因的敲除和組成型表達構建體(constitutive expression constructs)的基因敲入，所述組成型表達構建體含有蔗糖轉運子例如源自大腸桿菌W (UniProt ID E0IXR1)的CscB、果糖激酶例如源自運動發酵單胞菌( Zymomonas mobilis)的frk( ZmFrk) (UniProt ID Q03417)，蔗糖磷酸化酶例如源自青春雙歧桿菌( Bifidobacterium adolescentis)的BaSP(UniProt ID A0ZZH6)，另外還包括表達質體，所述表達質體包含alpha-1,2-岩藻糖基轉移酶例如來自幽門螺旋桿菌(H.pylori)的HpFutC(GenBank No. AAD29863.1)及／或alpha-1,3-岩藻糖基轉移酶例如源自幽門螺桿菌的HpFucT(UniProt ID O30511)的組成型表達構建體，以及大腸桿菌thyA(UniProt ID P0A884)的組成型表達構建體()作為選擇性標記。岩藻糖轉移酶基因的組成型表達構建體也可以通過基因敲入的方式出現在突變的大腸桿菌菌株中。GDP-岩藻糖的生產可以在突變的大腸桿菌中通過基因敲除包括 glgC、 agp、 pfkA、 pfkB、 pgi、 arcA、 iclR、 pgi和 lon的大腸桿菌基因而進一步優化，如WO2016075243和WO2012007481中所述。GDP-岩藻糖的生產可以通過甘露糖-6-磷酸異構酶例如源自大腸桿菌的manA(UniProt ID P00946)、磷酸甘露糖變位酶例如源自大腸桿菌的manB(UniProt ID P24175)、甘露糖-1-磷酸鳥苷酸轉移酶例如源自大腸桿菌的manC(UniProt ID P24174)、GDP-甘露糖4,6-脱水酶例如來自大腸桿菌的gmd(UniProt ID P0AC88)、以及GDP-L-岩藻醣合成酶例如源自大腸桿菌的fcl(UniProt ID P32055)的組成型表達構建體的基因敲入而進一步優化。GDP-岩藻糖的生產也可通過基因敲除大腸桿菌 fucK及 fucI基因並同時基因敲入包含岩藻醣通透酶，例如來自大腸桿菌的fucP(UniProt ID P11551)及具有岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鳥苷酸轉移酶活性的雙功能酶，例如來自脆弱類桿菌( Bacteroides fragilis)的fkp(UniProt ID SUV40286.1)的組成型表達構建體而達成。如果生產GDP-岩藻糖的突變菌株旨在製造岩藻糖基化乳糖結構，則該菌株還需要通過基因敲除大腸桿菌 LacZ、 LacY及 LacA基因以及基因敲入乳糖通透酶，例如大腸桿菌LacY (UniProt ID P02920)的組成型表達構建體進行修飾。
在生產乳糖-N-丙糖(LN3、GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)的一個實施例中，突變株源自於大腸桿菌K12 MG1655，並通過敲除大腸桿菌的 lacZ、 lacY、 lacA及 nagB基因，以及基因敲入乳糖通透酶，例如大腸桿菌LacY(UniProt ID P02920)以及半乳糖苷beta-1,3-N-乙醯葡萄糖胺轉移酶(galactoside beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase)，例如來自腦膜炎雙球菌( N. meningitidis)的lgtA(UniProt ID Q9JXQ6)的組成型轉錄單元。
在生產源自例如乳糖-N-四糖(LNT、Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)的寡醣的LN3的實施例中，生產突變的LN3的菌株是將N-乙醯葡萄糖胺beta-1,3-半乳糖基轉移酶(N-acetylglucosamine beta-1,3-galactosyltransferase)(例如，來自大腸桿菌O55:H7的wbgO)的組成型轉錄單元通過基因敲入或從表達質體遞送至菌株而進一步修飾。
在生產源自例如乳糖-N-新四糖(LNnT、Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)的寡醣的LN3的實施例中，生產突變的LN3的菌株是將N-乙醯葡萄糖胺beta-1,4-半乳糖基轉移酶(N-acetylglucosamine beta-1,4-galactosyltransferase)(例如，來自腦膜炎雙球菌的lgtB)的組成型轉錄單元通過基因敲入或從表達質體遞送至菌株而進一步修飾。
光學密度
培養物的細胞密度經常通過測量600 nm處的光學密度來監測(Implen Nanophotometer NP80, Westburg, Belgium，或使用Spark 10M微量盤分析儀，Tecan, Switzerland)。
解析分析( Analytical analysis)
標準品如但不限於蔗糖、乳糖、N-乙醯乳糖胺(LacNAc、Gal-b1,4-GlcNAc),、乳糖基-N-雙醣(LNB、Gal-b1,3-GlcNAc)、岩藻糖化LacNAc(2’FLacNAc、3-FLacNAc)、唾液酸化LacNAc(3’SLacNAc、6’SLacNAc)。岩藻糖基化LNB(2'FLNB、4'FLNB)、乳糖基-N-三糖II(LN3)，乳糖基-N-四糖(LNT)、乳糖基-N-新四糖(LNnT)、LNFP-I、 LNFP-II、LNFP-III、LNFP-V、LNFP-VI、LSTa、LSTc和LSTd均購自Carbosynth(英國)、Elicityl(法國)和IsoSep(瑞典)。其他化合物用內部製作的標準品進行分析。
中性寡醣在Waters Acquity H-class UPLC上使用蒸發光散射偵測器(Evaporative Light Scattering Detector, ELSD)或折射率(Refractive Index, RI)偵測器分析。將體積為0.7 µL的樣品注入Waters Acquity UPLC BEH Amide管柱(2.1 x 100 mm; 130 Å; 1.7 µm)和Acquity UPLC BEH Amide VanGuard管柱，130 Å, 2.1x 5 mm。管柱溫度為50°C。流動相由1/4水和3/4乙腈溶液組成，其中添加了0.2%三乙胺。此方法是等度的，流速為0.130 mL/min。ELS偵測器的漂移管溫度為50°C，N2氣壓為50 psi，增益為200，數據速率為10 pps。RI偵測器的溫度設置為35°C。
在 Waters Acquity H-class UPLC上分析唾液酸化寡醣，並使用了折射率(RI)偵測器。將0. 5 µL樣品注入Waters Acquity UPLC BEH Amide管柱(2.1 x 100 mm；130 Å；1.7 µm)。管柱溫度為50°C。流動相由70%乙腈、26%醋酸銨緩衝液(150 mM)和4%甲醇的混合物組成，其中加入了0.05%吡咯啶。該方法是等度的，流速為0.150 mL/min。RI偵測器的溫度設置為35°C。
中性糖和唾液酸化糖均在Waters Acquity H-class UPLC上使用折射率(RI)偵測器進行分析。將0.5 µL樣品注入Waters Acquity UPLC BEH醯胺管柱(2.1 x 100 mm；130 Å；1.7 µm)。管柱溫度為50°C。流動相由72%乙腈和28%醋酸銨緩衝液(100 mM)的混合物組成，其中加入了0.1%三乙胺。該方法是等度的，流速為0.260 mL/min。RI偵測器的溫度設置為35°C。
對於在質譜儀(mass spectrometer, MS)上的分析，使用帶有電子噴霧電離(Electron Spray Ionisation, ESI)的Waters Xevo TQ-MS，去溶劑化溫度為450°C，去溶劑化氮氣流量為650 L/h，錐電壓(cone voltage)為20 V。MS在選擇離子監測(selected ion monitoring, SIM)下對所有寡醣進行負模式操作。在配備Thermo Hypercarb管柱(2.1 x 100 mm；3 µm)的Waters Acquity UPLC上在35°C下進行分離。使用梯度，其中沖提液(eluent)A是含0.1%甲酸的超純水，其中沖提液B是含0.1%甲酸的乙腈。使用以下梯度在55分鐘內分離寡醣：在21分鐘內從2 %的沖提液B初始增加到12 %，在11分鐘內從12 %二次增加到40 %的沖提液B，在5分鐘內從40 %三次增加到100 %沖提液B。作為洗滌步驟，使用100%的沖提液B 5分鐘。對於管柱平衡，2%的沖提液B的初始條件在1分鐘內恢復並維持12分鐘。
為了鑒定本文所述所生產的寡醣混合物中的單一寡醣，可以通過本領域已知的標準方法鑒定單體組合單元(monomeric building blocks)(例如單醣或聚醣單元組成)、側鏈的變旋異構體結構(anomeric configuration)、取代基的存在和位置、聚合度/分子量和連接模式，例如甲基化分析、還原裂解、水解、氣相層析-質譜(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)、介質輔助鐳射解吸/電離-質譜(Matrix-assisted laser desorption / ionization-mass spectrometry, MALDI-MS)、電噴霧離子化-質譜(Electrospray ionization-mass spectrometry, ESI-MS)、帶紫外線或折射率檢測的高性能液相層析(High-Performance Liquid chromatography with ultraviolet or refractive index detection, HPLC)、帶脈衝安培檢測的高性能陰離子交換層析(High-Performance Anion-Exchange chromatography with Pulsed Amperometric Detection, HPAEC-PAD)、毛細管電泳(CE, capillary electrophoresis)、紅外/拉曼光譜(IR (infrared)/Raman spectroscopy)和核磁共振(Nuclear magnetic resonance, NMR)光譜技術。晶體結構可以用例如固態核磁共振、傅裡葉變換紅外光譜(Nuclear magnetic resonance, FT-IR)和廣角X射線散射(wide-angle X-ray scattering, WAXS)來解決。聚合度(degree of polymerization, DP)、DP分佈和多分散性可以通過例如黏度測定和高效粒徑篩析層析(high performance size-exclusion chromatography, SEC-HPLC)來確定。為了確定醣類的單體組分，可以使用諸如酸催化水解、高效液相層析法(high performance liquid chromatography, HPLC)或氣液層析法(gas-liquid chromatography, GLC)(在轉化為醋酸醛醣醇(alditol acetate)之後)等方法。為了確定糖苷連接，在DMSO中用碘化甲烷和強鹼使醣類甲基化，進行水解，達成還原為部分甲基化的醛醣醇(alditols)，進行乙醯化處理，使之成為甲基化的醋酸醛醣醇(methylated alditol acetates)，並通過氣液層析與質譜聯用儀(gas-liquid chromatography coupled with mass spectrometry, GLC/MS)進行分析。為了確定寡醣序列，使用酸或酶進行部分解聚合(depolymerization)以確定結構。為了確定變旋異構體結構(anomeric configuration)，對寡醣進行酶分析法，例如與對特定類型的連接有特異性的酶接觸，如btea-半乳糖苷酶，或alpha-葡萄糖苷酶等，並可使用核磁共振分析其產物。
灰分 (ash) 含量
灰分含量是衡量食物或成分(例如寡醣)中礦物質總量的量度，而礦物質含量則是衡量食物中存在的特定無機成分的量的量度，例如Ca、Na、K、Mg、磷酸鹽、硫酸鹽和Cl。確定食品或寡醣的灰分和礦物質含量十分重要，由於以下多種原因：營養標籤。存在的礦物質的濃度和類型通常必須在食品或成分例如寡醣的標籤上規定。許多食物的品質取決於它們所含礦物質的濃度和類型，包括它們的味道、外觀、質地和穩定性。微生物穩定性。有時高礦物質含量被用於延緩特定微生物的生長。營養。有些礦物質對健康飲食至關重要(例如鈣、磷、鉀和鈉)，然而其他礦物質可能有毒(例如鉛、汞、鎘和鋁)。加工。在加工過程中了解食品／產品的礦物質含量通常很重要，因為這會影響食品或成分例如寡醣的物化特性。
灰分是在氧化劑存在的情況下通過加熱去除水和有機物後剩餘的無機殘留物，它提供了食物中礦物質總量的量度。提供礦物質總含量資訊的分析技術基於礦物質(分析物)可以一些可測量的方式與食物或成分中的所有其他成分(基質)區分開來。最廣泛使用的方法是基於礦物質不會被加熱而破壞，並且與其他食物成分相比，它們的揮發性較低。用於確定食品灰分含量的三種主要分析方法均基於此原理：乾灰化、濕灰化和低溫電漿乾灰化。為特定分析選擇的方法取決於進行分析的原因、所分析的食品或成分的類型以及可用的設備。灰化也可作為準備樣品的第一步，通過原子光譜或下述各種傳統方法對特定礦物進行分析。
對於樣品製備，選擇組成代表成分的樣品，以確保其組成在分析前不會發生顯著變化。例如，乾燥的寡醣樣品通常是吸濕的，所選樣品應保持在乾燥條件下，避免吸水。通常，1-10g的樣品用於分析灰分含量。固體成分經過精細研磨，然後仔細混合，以方便選擇具有代表性的樣品。在進行灰分分析之前，通常對水分含量高或溶液中的樣品進行乾燥，以防止灰化過程中的飛濺。其他可能的問題包括在分析過程中與樣品接觸的研磨機、玻璃器皿或坩堝中的礦物質污染樣品。出於同樣的原因，製備樣品時使用去離子水，空白樣品中也使用去離子水。
乾灰化程序使用能夠將溫度保持在500至600 oC之間的高溫蒙孚爐(muffle furnace)。水和其他揮發性物質被蒸發，有機物質在空氣中的氧氣存在下燃燒成CO 2、H 2O和N 2。大多數礦物質會轉化為氧化物、硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物或矽酸鹽。儘管大多數礦物質在這些高溫下具有相當低的揮發性，但有些是揮發性的並且可能會部分喪失，例如鐵、鉛和汞，對於這些礦物質，產品的ICP-MS分析更適合於定量。
食品樣品在灰化前後稱重以確定存在的灰分濃度。灰分含量可以乾基(dry basis)表示，其計算方法是將灰化的材料、成分或食物的質量除以灰化前乾燥的材料、成分或食物的質量，並乘以100，即可得出材料、成分或食物中灰分的百分比。以類似的方式，可以確定液體產品的濕灰分百分比，其中使用灰化前後的液體質量而不是乾燥的材料、成分或食物的質量。
重金屬測定
一種基於電感耦合電漿質譜(inductively coupled plasma-mass spectrometry, ICP-MS)的穩健通用方法被用於檢測和定量以下每種元素：砷(As)、硒(Se)、鎘(Cd)、錫(Sn)、鉛(Pb)、銀(Ag)、鈀(Pd)、鉑(Pt)、汞(Hg)、鉬(Mo)、鈉(Na)、鉀(K)、鈣(Ca)、鎂(Mg)、鐵(Fe)、鋅(Zn)、錳(Mn)、磷(P)、硒(Se)。
硝酸(≥65%，Sigma-Aldrich)用於微波消化和標準品／樣品製備。所有的稀釋都使用18.2 MΩ-cm(Millipore, Bedford, MA, USA)的去離子水(de-ionized water, DIW)。使用微波消化(CEM，Mars 6)程式，在100W和50°C下，15分鐘(min)的升溫時間和15分鐘的保持時間，然後在1800W和210°C下，15分鐘的升溫時間和20分鐘的保持時間，將各約0.2g的寡醣、成分、樣品在5 mL的HNO3中進行消化。冷卻消化後的樣品30分鐘。然後用去離子水將完全消化的樣品稀釋到50毫升。
分析是使用標準的Agilent 7800 ICP-MS進行的，其中包括第四代ORS池系統(fourth-generation ORS cell system)，以使用氦碰撞模式(He模式)有效控制多原子干擾。ORS利用氦氣控制多原子干擾，以減少所有常見的基於基質的多原子干擾的傳播。利用動能分辨(kinetic energy discrimination, KED)將較小、較快的分析物離子與較大、較慢的干擾離子分開。除Se外，所有元素都在流速為5 mL/min的He模式下測量。Se是在高能氦(High Energy He, HEHe)模式下測量的，池氣體流速為10 mL/min。7800 ICP-MS配置了標準的樣品引入系統，包括MicroMist玻璃同心霧化器、石英噴霧室、具有2.5mm內徑進樣器(2.5 mm i.d. injector)的石英焰炬(torch)和鎳介面錐體。ICP-MS的操作條件是：1550W RF功率，8毫米採樣深度，1.16l/min霧化氣體，以自動調節的透鏡調節(autotuned lens tuning)，5或10ml/min氦氣流量，5V KED。
乾燥物質 / 乾燥固體和水分含量定量
Sartorius MA150紅外水分分析儀用於測定寡醣的乾燥物質含量。在分析天平上稱取0.5g寡醣，在紅外水分儀中乾燥至樣品重量穩定。乾燥樣品的質量除以乾燥前樣品的質量給出寡醣或包括寡醣的樣品的乾燥物質含量(以百分比計)。以類似的方式稱量液體樣品，然而，使稱量的液體量適應於液體中預期的乾燥物質量，因此乾燥物質的質量可以在分析天平上適當地測量。
水分分析儀測量乾燥物質，但不測量水含量。卡爾費雪滴定法(Karl Fisher titration)用於確定粉末、食品成分中的水量。卡爾費雪滴定法是用Mettler Toledo的卡爾費雪滴定儀DL31進行的，採用雙組分技術(two-component technique)，使用Hydra-Point溶劑G和Hydra-Point滴定劑(5mg H 2O/ml)，兩者都購自J.T. Baker(Deventer, Holland)。雙指示電極電位終點(bipotentiometric end-point)測定的極化電流為20微安，停止電壓為100 mV。終點標準是漂移穩定(15微克H 2O min -1)或最大滴定時間(10分鐘)。
樣品的含水量(moisture content, MC)使用以下公式計算：
MC=V_KF W_eq 100/ W_sample；其中 V_KF為滴定劑的消耗量，單位為mL，W_eq為滴定劑的滴定量，單位為mg H 2O/mL，W_sample為樣品的重量，單位為mg。
生物質乾燥物質含量 ( 細胞乾燥物質 )
通過在預乾燥(70°C，隔夜)和稱重的離心管(falcons)中離心(15 分鐘，5000 克)20g培養液獲得細胞乾重。隨後用20 ml生理溶液(9 g/l NaCl)將片狀沉澱物(pellets)洗滌一次，並在70°C下乾燥至恆重。最終重量根據添加到樣品中的氯化鈉進行校正。
蛋白質定量
對於蛋白質定量，使用與還原劑(例如還原糖或具有還原末端的寡醣)兼容的方法。為此，使用了Bradford分析(Thermo Scientific，Pierce)，其線性範圍在1到1500 µg/ml之間。此測定用BSA的標準曲線校準。乾燥的寡醣產品的蛋白質含量通過將預先稱重的定量物溶解在18.2 MΩ·cm(Millipore，Bedford，MA，USA)去離子水(DIW)中進行定量，直至達到50% (m/v)的量。在595 nm處測量蛋白質的量，並使用基於BSA的校準曲線轉換為濃度。
DNA 定量
生產宿主的特定DNA殘基(residue)通過RT-qPCR定量，為此設計了宿主上的特定引子，以便擴增生產宿主的殘留DNA。RT-qPCR根據從Sigma獲得的試劑盒的標準方案進行，並基於SYBR Green檢測。
總DNA是通過Threshold分析(Molecular Devices)測量的，基於免疫分析，允許測量溶液樣品中低至2 pg的DNA。雙股DNA通過SpectraMax® Quant™ AccuBlue™ Pico dsDNA檢測試劑盒(Molecular Devices)測量，線性範圍介於5 pg和3ng的dsDNA之間。
內毒素測定
液體中的內毒素通過LAL測試進行測量。
雷射繞射
粉末粒徑可以通過雷射繞射進行評估。該系統通過同心排列的感測器元件陣列檢測散射光和繞射光。然後，軟體演算法通過計算到達不同感測器元件的光強度值的z值來近似粒子計數。可以使用SALD-7500 Aggregate Sizer(Shimadzu Corporation，Kyoto，Japan)定量雷射繞射系統(qLD)進行分析。
每個樣品的少量(刮刀尖端)可以分散在2 ml異辛烷中，並通過超音波處理均質5分鐘。然後將分散體轉移到裝有異辛烷的分批池(batch cell)中，並以手動模式進行分析。
數據採集的設定可以如下：每次測量的訊號平均計數：128，訊號累積計數：3，間隔：2秒。
在測量之前，系統可以用異辛烷進行空白處理(blanked)。每個樣品分散體將測量3次，並報告平均值和標準偏差。可以使用軟體WING SALD II version V3.1評估數據。當樣品的折射率未知時，糖(雙醣)顆粒的折射率(1.530)可用於確定尺寸分佈曲線。報告平均直徑和中間直徑的尺寸值。由於使用的噴霧乾燥器設置，所有樣品的平均粒徑非常相似。此外，粒徑分佈將顯示所有樣品都存在一個主要尺寸群體。
實施例 2. 利用修飾的大腸桿菌宿主在分批補料發酵 ( fed-batch fermentations ) 中生產包含 2'FL 、 3-FL 及 DiFL 的寡醣混合物
用表達幽門螺桿菌alpha-1,2-岩藻糖轉移酶的組成性轉錄單元的第一質體和表達幽門螺桿菌alpha-1,3-岩藻糖轉移酶的組成型轉錄單元的第二相容質體依序轉化本領域所述或實施例1所述的用於生產GDP-岩藻糖的大腸桿菌K12菌株。這種改良的突變株在分批和分批補料發酵製程中進行評估。如實施例1所述，在生物反應器規模(5和30L)下進行分批補料發酵。在這些實施例中，蔗糖被用作碳源，乳糖被作為前驅物添加到分批培養基中。如實施例1所述，定期採集培養液樣品，並利用UPLC測量2'FL、3-FL和DiFL的生產。實驗表明，分批階段結束時的培養液樣品包含2'FL和3-FL以及未經修飾的乳糖的寡醣混合物，而在分批補料階段結束時的培養液樣品包含2'FL、3-FL和DiFL的寡醣混合物。由於乳糖、2'FL、3-FL和DiFL的比例在分批補料過程中隨時間變化，它們可以通過將發酵製程停止在分批補料階段的所欲時期，來操控發酵製程。
按照如實施例12所述的方法，將所得培養液進行澄清。在分開的實施例中，如實施例11所述，裂解細胞以增加寡醣的釋放，並如實施例12所述進一步澄清。
實施例 3. 在以甘油作為碳源、唾液酸和乳糖作為前驅物的分批補料發酵製程中評估突變大腸桿菌菌株發酵液中包含 LN3 、唾液酸化 LN3 、 LNT 、 LSTa 和 3'SL 的寡醣混合物的生產
如本領域所述或如實施例1所述，經修飾以生產LNT的大腸桿菌菌株進一步通過基因敲除大腸桿菌 lacZ基因進行修飾，並用表達質體進行轉化，所述表達質體含有來自敗血性巴斯德拉菌( P. multocida)且編碼N-醯基神經胺酸胞苷酸轉移酶(N-acylneuraminate cytidylyltransferase)的 NeuA基因，以及來自敗血性巴斯德拉菌的α-2,3-唾液酸轉移酶基因的組成型表達閘。此菌株生產包含LN3、3'-唾液酸化LN3(Neu5Ac-a2,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)、LNT、3'SL和LSTa(Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)的寡醣混合物，並在5L和30L生物反應器中分批和分批補料發酵製程中生長。生物反應器規模的分批補料發酵如實施例1中所述般進行。在這些實施例中，使用甘油作為碳源並且將乳糖作為前驅物添加到分批 基質中。在分批補料期間，還通過額外的進料添加唾液酸。定期採集培養液樣品，並如實施例1所述測量生產的糖。UPLC分析表明，在分批階段後得到的選定菌株的發酵液含有乳糖、LN3和LNT，而在分批補料階段後得到的選定菌株的發酵液包含具有LN3、3'-唾液酸化LN3 (Neu5Ac-a2,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)、LNT、LSTa和3'SL的寡醣混合物。
按照如實施例12所述的方法，將所得培養液進行澄清。在分開的實施例中，如實施例11所述，裂解細胞以增加寡醣的釋放，並如實施例12所述進一步澄清。
實施例 4. 在使用蔗糖、乳糖的分批補料發酵製程中評估突變大腸桿菌菌株發酵液中包含 LN3 、唾液酸化 LN3 、 LNT 、 LSTa 和 3'SL 的寡醣混合物的生產
如WO2018122225所述的經修飾以生產唾液酸的大腸桿菌菌株，進一步通過基因敲入來自腦膜炎雙球菌( N. meningitidis)的半乳糖苷beta-1,3-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶基因( LgtA)和來自大腸桿菌O55的N-乙醯葡萄糖胺beta-1,3-半乳糖基轉移酶基因( WbgO)的組成型轉錄單元，以允許生產LNT。在下一步驟中，此新菌株進一步通過基因敲除大腸桿菌 lacZ基因並通過表達質體轉化，所述表達質體含有源自敗血性巴斯德拉菌( P. multocida)且編碼N-醯基神經胺酸胞苷酸轉移酶的 NeuA基因，以及源自敗血性巴斯德拉菌的α-2,3-唾液酸轉移酶基因的組成型轉錄單元。當根據實施例1中提供的培養條件在生長實驗中進行評估時，其中培養 基質含有蔗糖作為碳源和乳糖作為前驅物，新菌株生產包含LN3、3’-唾液酸化LN3 (Neu5Ac-a2,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)、LNT、3’SL以及LSTa的寡醣混合物。
選擇此突變體以在5L及30L的生物反應器的分批補料發酵製程中進行進一步的評估。生物反應器規模的分批補料發酵如實施例1中所述進行。在這些實施例中，蔗糖用作碳源並且將乳糖作為前驅物添加到分批 基質中。定期採集培養液樣品，並如實施例1所述測量生產的糖。UPLC分析表明，在分批階段後得到的選定菌株的培養液含有乳糖、LN3、3’SL和LNT，而在分批補料階段後得到的選定菌株的發酵液包含具有LN3、3'-唾液酸化LN3 (Neu5Ac-a2,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)、LNT、LSTa和3'SL的寡醣混合物。
按照如實施例12所述的方法，將所得培養液進行澄清。在分開的實施例中，如實施例11所述，裂解細胞以增加寡醣的釋放，並如實施例12所述進一步澄清。
實施例 5. 在使用甘油、唾液酸、乳糖的分批補料發酵製程中評估突變大腸桿菌菌株發酵液中包含 LN3 、唾液酸化 LN3 、 LNnT 、對 - 乳糖基 -N- 新六糖、二唾液酸化 LNnT 、 LSTc 和 6'SL 的寡醣混合物的生產
如本領域所述或如 實施例1所述，經修飾以生產LNnT的大腸桿菌菌株進一步通過基因敲除大腸桿菌 lacZ基因進行修飾，並用表達質體進行轉化，所述表達質體包含源自敗血性巴氏桿菌且編碼N-醯基神經胺酸胞苷酸轉移酶的 NeuA基因，以及選自發光桿菌( P. damselae)的一α-2,6-唾液酸轉移酶基因的組成型表達閘。此菌株生產包含6’SL、LN3、6’-唾液酸LN3 (Neu5Ac-a2,6-(GlcNAc-b1,3)-Gal-b1,4-Glc)、LNnT以及LSTc(Neu5Ac-a2,6-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)的寡醣混合物。
此突變菌株在5L及30L的生物反應器的分批和分批補料發酵製程中培養。生物反應器規模的分批補料發酵如實施例1中所述進行。在這些實施例中，甘油用作碳源並且將乳糖作為前驅物添加到分批 基質中。在分批補料的過程中，還通過額外的進料添加了唾液酸。定期採集培養液樣品，並如實施例1所述測量生產的糖。UPLC分析表明，在分批階段後得到的選定菌株的發酵液含有乳糖、LN3和LNnT，而在分批補料階段後得到的選定菌株的發酵液包含具有LN3、6'-唾液酸化LN3 (Neu5Ac-a2,6-(GlcNAc-b1,3)-Gal-b1,4-Glc)、LNnT、LSTc和6'SL的寡醣混合物。在分批補料結束時，混合物還包含對-乳糖基-N-新六糖(para-lacto-N-neohexaose, pLNnH)和二唾液酸化LNnT，這兩種結構由於檢測水平有限和總體生產量較低而未在生長實驗測定中檢測到。
按照如實施例12所述的方法，將所得培養液進行澄清。在分開的實施例中，如實施例11所述，裂解細胞以增加寡醣的釋放，並如實施例12所述進一步澄清。
實施例 6. 在使用蔗糖、乳糖的分批補料發酵製程中評估突變大腸桿菌菌株發酵液中包含 LN3 、唾液酸化 LN3 、 LNnT 、對 - 乳糖基 -N- 新六糖、二唾液酸化 LNnT 、 LSTc 和 6'SL 的寡醣混合物的生產
如WO2018122225所述的經修飾以生產唾液酸的大腸桿菌菌株，進一步通過基因敲入來自腦膜炎雙球菌( N. meningitidis)的 LgtA基因和來自腦膜炎雙球菌的 LgtB基因的組成型轉錄單元進行修飾，以允許生產LNnT。在下一步驟中，此新菌株進一步通過基因敲除大腸桿菌 lacZ基因修飾，並通過表達質體轉化，所述表達質體含有源自敗血性巴斯德拉菌( P. multocida)且編碼N-醯基神經胺酸胞苷酸轉移酶的 NeuA基因，以及源自發光桿菌( Photobacterium)sp. JT-ISH-224的α-2,6-唾液酸轉移酶基因的組成型轉錄單元。此菌株生產包含LN3、6’-唾液酸化LN3 (Neu5Ac-a2,6-(GlcNAc-b1,3)-Gal-b1,4-Glc)、6’SL、LNnT以及LSTc的寡醣混合物。
此菌株在5L及30L的生物反應器中的分批和分批補料發酵製程中生長。生物反應器規模的分批補料發酵如實施例1中所述進行。在這些實施例中，蔗糖用作碳源並且將乳糖作為前驅物添加到分批 基質中。定期採集培養液樣品，並如實施例1所述測量生產的糖。UPLC分析表明，在分批階段後得到的選定菌株的發酵液含有乳糖、LN3、6’SL和LNnT，而在分批補料階段後得到的選定菌株的發酵液包含具有LN3、6'-唾液酸化LN3 (Neu5Ac-a-2,6-(GlcNAc-b-1,3)-Gal-b-1,4-Glc)、LNnT、LSTc和6'SL的寡醣混合物。在分批補料結束時，混合物還包含對-乳糖基-N-新六糖和二唾液酸化LNnT，這兩種結構由於檢測水平有限和總體生產量較低而未在生長實驗測定中檢測到。
按照如實施例12所述的方法，將所得培養液進行澄清。在分開的實施例中，如實施例11所述，裂解細胞以增加寡醣的釋放，並如實施例12所述進一步澄清。
實施例 7. 在分批補料發酵中評估在修飾的大腸桿菌宿主生產的包含 LNT 、 LNnT 和聚半乳糖基化結構 (poly-galactosylated structures) 的寡醣混合物
如本領域所述或如實施例1所述的LNnT突變菌株，進一步經來自腦膜炎雙球菌的N-乙醯葡萄糖胺beta-1,4-半乳糖基轉移酶基因( LgtB)的一個或多個拷貝的組成型轉錄單元修飾。為了增加UDP-半乳糖的生產，敲除 ushA以及 galT基因。突變的大腸桿菌菌株通過基因敲入源自大腸桿菌的UDP-葡萄糖-4-差向異構酶基因( galE)、源自大腸桿菌的磷酸葡萄糖胺變位酶基因( glmM)、以及源自大腸桿菌的N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯轉移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶(N-acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase / glucosamine-1-phosphate acetyltransferase)基因( glmU)的組成型轉錄單元而進一步修飾。此突變菌株通過基因敲入包含源自大腸桿菌W的蔗糖轉運蛋白基因(CscB)、源自青春雙歧桿菌( B. adolescentis)的果糖激酶基因(Frk)以及蔗糖磷酸化酶組成型轉錄單元，進一步突變以在蔗糖上生長。此菌株更進一步通過基因敲入來自大腸桿菌O55:H7的 WbgO基因的組成型轉錄單元而修飾。
最終突變菌株生產乳糖基-N-丙糖II(LN3)、乳糖基-N-新四糖(LNnT)、乳糖基-N-四糖(LNT)、對-乳糖基-N-新五糖、對-乳糖基-N-戊糖、對-乳糖基-N-新六糖、對-乳糖基-N-六糖、beta-(1,3)半乳糖基-對-乳糖基-N-新戊糖和beta-(1,4)半乳糖基-對-乳糖基-N-戊糖的混合物。
如實施例1中所述，此突變菌株在5L及30L的生物反應器中的分批和分批補料發酵製程中評估。在此實施例中，蔗糖用作碳源並且將乳糖作為前驅物添加到分批基質中。定期採集培養液樣品，並如實施例1所述測量生產的糖。UPLC分析表明，在分批補料階段定期採集的所選菌株的發酵液具有含有乳糖基-N-丙糖II(LN3)、乳糖基-N-新四糖(LNnT)、乳糖基-N-四糖(LNT)、對-乳糖基-N-新五糖、對-乳糖基-N-五糖、對-乳糖基-N-新六糖、對-乳糖基-N-六糖、beta-(1,3)半乳糖基-對-乳糖基-N-新五糖和beta-(1,4)半乳糖基-對-乳糖基-N-五糖的寡醣混合物。
按照如實施例12所述的方法，將所得培養液進行澄清。在分開的實施例中，如實施例11所述，裂解細胞以增加寡醣的釋放，並如實施例12所述進一步澄清。
實施例 8. 利用修飾的大腸桿菌宿主生產包含 2'FL 、 3-FL 、 DiFL 、 LN3 、 LNT 和 LNFP-I 的寡醣混合物
如以上實施例所描述的針對GDP-岩藻糖進行修飾的大腸桿菌菌株，更進一步修飾以表現源自大腸桿菌的 glmS*54基因、源自腦膜炎雙球菌的 LgtA基因、源自大腸桿菌O55:H7的 WbgO基因、源自幽門螺旋桿菌的a-1,2-岩藻糖基轉移酶基因、以及a-1,3-岩藻糖基轉移酶基因(HpFucT)。在按照實施例1提供的培養條件進行的生長實驗中，其中培養 基質中含有蔗糖作為碳源以及乳糖作為前驅物，此新菌株生產包括2’FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT以及LNFP-I (Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)的寡醣混合物。如實施例1所述，此菌株在5L及30L的生物反應器中的分批和分批補料發酵製程中評估。在此實施例中，蔗糖用作碳源並且將乳糖作為前驅物添加到分批 基質中。定期採集培養液樣品，並如實施例1所述測量生產的糖。UPLC分析表明，在分批補料階段定期採集的選定菌株的發酵液具有含有2’FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT以及LNFP-I(Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)的寡醣混合物。
按照如實施例12所述的方法，將所得培養液進行澄清。在分開的實施例中，如實施例11所述，裂解細胞以增加寡醣的釋放，並如實施例12所述進一步澄清。
實施例 9. 利用修飾的大腸桿菌宿主生產包含岩藻糖基化和唾液酸化寡醣結構的寡醣混合物
將WO2018122225中描述的適於唾液酸生產的大腸桿菌菌株，通過基因敲除大腸桿菌 wcaJ基因以增加GDP-岩藻糖的細胞內池(intracellular pool)，以及基因敲入源自腦膜炎雙球菌的 LgtA基因和源自大腸桿菌O55:H7的 WbgO基因的組成型表達閘，而進一步修飾。在接下來的步驟中，新菌株通過兩個相容的表達質體而轉化，其中第一個質體pMF_2包括兩種岩藻糖基轉移酶基因(幽門螺桿菌alpha-1,2-岩藻糖基轉移酶基因( HpFutC)和幽門螺桿菌alpha-1,3-岩藻糖基轉移酶基因(HpFucT))的(一個或多個)組成型表達單元。而第二個質體pMS_2包括兩種唾液酸轉移酶基因(來自敗血性巴氏桿菌的alpha-2,3-唾液酸轉移酶，和來自美人魚發光桿菌( Photobacterium damselae)的alpha-2,6-唾液酸轉移酶(PdST6))以及來自多敗血性巴氏桿菌且編碼N-醯基神經胺酸胞苷酸轉移酶的 NeuA基因的組成型表達單元。此菌株在全培養液樣品中生產包含岩藻糖基化和唾液酸化的乳糖、LNB、岩藻糖基化和唾液酸化的LNB、LN3、唾液酸化LN3、LNT和岩藻糖基化和唾液酸化的LNT結構的寡醣混合物。根據實施例1中提供的培養條件在實驗中培養菌株，其中培養物中含有蔗糖作為碳源和乳糖作為前驅物。
如實施例1所述，此突變菌株在5L及30L的生物反應器中的分批和分批補料發酵製程中評估。在此實施例中，蔗糖用作碳源並且將乳糖作為前驅物添加到分批 基質中。定期採集培養液樣品，並如實施例1所述測量生產的糖。UPLC分析表明，在分批補料階段定期採集的所選菌株的發酵液具有含有2’FL、3-FL、DiFL、3’SL、6’SL、di-SL、3’S-2’FL、3’S-3-FL、6’S-2’FL、6’S-3-FL、LNB、2’FLNB、4-FLNB、Di-FLNB、3’SLNB、6’SLNB、LN3、3’S-LN3、6’S-LN3、LNT、LNFP-I、LSTa的寡醣混合物。
按照如實施例12所述的方法，將所得培養液進行澄清。在分開的實施例中，如實施例11所述，裂解細胞以增加寡醣的釋放，並如實施例12所述進一步澄清。
實施例 10. 發酵液的組成測定
對於實施例2-9中獲得的發酵液，根據表1中描述的方法，其組成通過測量培養液的細胞乾燥質量、上清液和培養液的灰分含量、上清液和培養液的寡醣含量以及培養液中的總乾燥固體來確定。對於所有樣品，總寡醣含量低於總乾燥固體的80%。培養液中寡醣混合物的純度在30%到77%之間。
實施例 11. 細胞裂解
在上述許多突變菌株中，產物很容易從細胞中排出。然而，較大的分子往往在發酵製程中更難釋放。因此，可選地引入附加步驟以從細胞中釋放產物。將來自實施例2-8的發酵製程的培養液用於細胞裂解實驗。
通過加熱培養液1小時，使其溫度在60°C至80°C之間，以建立產物的軟釋放(soft release)。溫度越高，獲得的釋放越多，但顏色形成增加。產物釋放在pH低於6.5和高於3的情況下最佳。在pH值高於3.9的情況下，單醣的形成最少。產物的釋放通過測量處理前後的培養液中的總寡醣池(oligosaccharide pool)(實施例1中的cfr方法)來定量。當觀察到寡醣濃度增加時，產物從細胞中釋放出來。
為了更加破壞細胞完整性，其他方法也常使用，例如冷凍解凍及／或通過超音波處理、混合、均質機及／或法式壓碎機的剪切應力的方法。
實施例 12. 培養液澄清
源自培養或發酵的培養液，以及視情況而定，實施例2-11中描述的裂解步驟的培養液可通過微濾而進一步澄清。對於過濾，幾種類型的孔徑在0.1至10μm之間的微濾膜(陶瓷、PES、PVDF膜)已用於澄清的發酵液。濾膜類型首先用作垂直式端點過濾(dead-end filtration)，並在掃流過濾(cross flow filtration)中進行進一步優化。在此純化步驟後，在掃流過濾之後進行透析過濾(diafiltration)以增加產物產率。濾膜能夠分離大的懸浮固體，如膠體、顆粒、脂肪、細菌、酵母、真菌、細胞，同時允許糖、蛋白質、鹽類和低分子量分子通過濾膜。
濾液中的顆粒濃度用分光光度計通過在600 nm處的光吸收進行測量。該方法允許驗證顆粒的去除和過濾的優化。
使用超濾膜替代微濾膜。測試載留值介於1000 Da 和10 kDa之間的超濾膜(microdyne Nadir (3kDa PES)、Synder(3 kDa，PES)、Synder Filtration MT(5 kDa，PES)和 Synder Filtration ST(10 kDa，PES))。具有較大載留值的替代膜也可用於培養液澄清。濾膜以掃流模式(cross flow mode)使用，並應用類似於上述微濾操作的透析過濾以增加產物產率。基於濾液的顆粒濃度評估過濾效率。除細胞和細胞碎片外，低於10 kDa的濾膜可有效去除DNA、蛋白質和內毒素，這些是使用實施例1中描述的方法進行測量。10到500 kDa 之間的較高載留值的濾膜可有效去除細胞塊(cell mass)，但不會有效保留較小分子量的產物，因此需要額外的載留分子量低於10kDa的超濾步驟。藉由超濾的培養液澄清的最終回收率達到95%以上。
為了通過離心提升培養液澄清，使用了絮凝劑/凝結劑。通常，石膏、明礬、氫氧化鈣、聚合氯化鋁(polyaluminium chloride)、氯化羥鋁(Aluminium chlorohydrate)用作良好的絮凝劑。這些絮凝劑在pH＞7和4°C至20°C之間，更較佳4°C至10°C之間的溫度下使用。pH＜ 7釋放的有毒陽離子，進一步通過陽離子交換去除。測試的替代絮凝劑基於聚丙烯醯胺或生物聚合物(殼聚醣)、Floquant (SNF inc)、Superfloc (Kemira)或hyperfloc (Hychem inc)、Tramfloc。這些絮凝劑以不同的濃度使用：在用RO水1:1稀釋培養液後以0.05、0.1和0.2 v/v%，將它們直接添加到培養液中，並在室溫下輕輕混合10分鐘。pH值保持在中性條件，即6和7之間。在較高的pH值下，絮凝劑會發生一些降解，導致通過離子交換的方式被去除的化合物。
為了測試絮凝效率，在4000g下進行離心，並在不同離心時間後評估片狀沉澱物強度(pellet strength)和上清液濁度。通過測量寡醣上清液濃度和總上清液體積來測量寡醣產率。將片狀沉澱物洗滌數次以增加寡醣的釋放。得到90%至98%的最終寡醣回收率。
實施例 13. 超濾
在由運行Convergence Inspector軟體的PC控制的Colossus裝置(Convergence Industry, The Netherlands)上進行超濾。在線(inline)測量滲餘物和濾液兩者的溫度、壓力和電導率，使用校準的pH探針(Hanna Instruments)離線(offline)測量pH。用於進一步去除DNA、蛋白質和內毒素的濾膜是基於PES的10kDa濾膜(Synder)，用於掃流。過濾後，測定濾液中的DNA、蛋白質和內毒素含量。蛋白質含量低於100mg/kg乾燥固體，DNA含量低於10ng/g乾燥固體，內毒素低於10000EU/g乾燥固體。在濾液中沒有檢測到來自生產宿主的DNA。
雖然在這個實施例中使用了基於聚碸的濾膜，但其他濾膜材料將具有相同的表現，這些濾膜材料可以由陶瓷或合成或天然的聚合物製成，例如來自Synder、Tami、TriSep、Microdyn Nadir、GE等供應商的聚丙烯、醋酸纖維素或聚乳酸。
實施例 14. 通過奈米過濾 (nanofiltration) 去除離子和雙醣
在由運行Convergence Inspector軟體的PC控制的Colossus裝置(Convergence Industry, The Netherlands)上進行切向流奈米過濾。在線測量滲餘物和濾液兩者的溫度、壓力和電導率，使用校準的pH探針(Hanna Instruments)離線測量pH。將來自 實施例13的經超濾處理的澄清液體進一步進行奈米過濾和接續的透析過濾。為此，在40°C下使用載留值在300到500Da之間的基於聚醯胺的濾膜(TriSep XN-45(TriSep Corporation，USA))。使用去離子水進行透析過濾，去離子水的總體積為寡醣混合物的濃縮物的5倍。該步驟將乾燥固體中的雙醣級分降低到5%以下，並且將液體的總灰分含量降低了50%。寡醣混合物的濃度增加到約200g/l。
實施例 15. 藉由電滲析去除離子
使用的電滲析(electrodialysis, ED)設備是PCCell ED 64004實驗室規模的ED疊層(stack)，裝有5對PC SA和PC SK標準離子交換膜。初始稀釋液和濃縮物均由實施例12和13中澄清和超濾後所獲得的1.5L進料流(feed stream)組成。這些 實施例中獲得的液體含有寡醣和陽離子和陰離子，其灰分含量高於乾燥固體的10％。脫鹽(desalination)是針對濃度梯度進行的。當施加7.5V的恆定電壓時，將兩種流(stream)都進行再循環，並監測電流和電導率。在開始和結束時以及在實驗期間定期取樣。通過在實驗結束時測量所有流的體積來監測跨膜的水傳輸。為確保電流有效轉移到疊層，將60 g/L NaNO3的電解質溶液在電極處循環。
維持ED實驗，直到觀察到電流和電導率的穩定。這表明脫鹽變得緩慢且效率低下的點。電導率從進料(feed)中的3.79 mS/cm降低到實驗結束時的0.88 mS/cm，表明總體脫鹽率為77%。多價陰離子被去除高達90%。最終寡醣回收率在90%和99%之間。電滲析後乾燥固體的灰分含量約為乾燥固體的2.5%
實施例 16. 藉由離子交換去除離子
為了從培養液中去除離子至灰分含量＜1%，首先進行陽離子交換，然後進行陰離子交換步驟。根據寡醣混合物，選擇不同的陰離子交換樹脂以提高純化步驟的產率。
對於含有非帶電寡醣源自實施例8、7和2的澄清培養液，首先在10°C的溫度下通過質子形式之含有強酸性陽離子交換樹脂(1L Amberlite IR120)的管柱，使液體中的所有陽離子與質子交換。由陽離子交換步驟得到的液體在10℃的溫度下經過氫氧化物形式之含有弱鹼性陰離子交換樹脂的管柱(1L Amberlite IR400)，將液體中的陰離子交換為氫氧根離子。在陽離子和陰離子交換後，將pH值設定為6至7之間。寡醣回收率為95%至98%
替代的陽離子和陰離子交換樹脂是Amberlite IR100、Amberlite IR120、Amberlite FPC22、Dowex 50WX、Finex CS16GC、Finex CS13GC、Finex CS12GC、Finex CS11GC、Lewatit S、Diaion SK、Diaion UBK、Amberjet 1000、Amberjet 1200及Amberjet 4200、Amberjet 4600、Amberlite IR400、Amberlite IR410、Amberlite IR458、Diaion SA、Diaion UBA120、Lewatit MonoPlus M、Lewatit S7468。
然後測試經過陽離子和陰離子交換處理的液體的灰分、寡醣含量和重金屬含量。處理後的灰分含量低於0.5%(以總乾燥固體計)，鉛含量低於0.1 mg/kg乾燥固體，砷：低於0.2 mg/kg乾燥固體，鎘低於0.1 mg/kg乾燥固體和汞低於0.5 mg/kg乾燥固體。
對於源自實施例3、4、5、6和9的澄清培養液，使用不保留帶電寡醣(含有唾液酸基團)的特定陰離子交換樹脂。這些樹脂的特徵在於具有30-48%的含水量並且較佳為凝膠型陰離子交換劑。這種樹脂的例子是DIAION SA20A、Diaion WA20A (Mitsubishi)、XA4023 (Applexion)、Dowex 1-X8 (Dow)。在第一步驟中，液體首先在10°C的溫度下通過質子形式之含有強酸陽離子交換樹脂的管柱(1L Amberlite IR120)，使液體中的所有陽離子與質子交換。然後將其立即通過陰離子交換樹脂柱(1L XA4023)，將磷酸鹽和硫酸鹽等鹽類交換為氫氧根離子。所得液體的pH值設定為5到7之間。經過離子交換處理後，唾液酸化寡醣的鈉反離子(sodium counter ion)校正後的灰分含量低於1%(以總乾燥固體計)，鉛含量低於0.1mg/kg乾燥固體，砷：低於0.2 mg/kg乾燥固體，鎘低於0.1 mg/kg乾燥固體，汞低於0.5 mg/kg乾燥固體。
連續陽離子和陰離子交換步驟的替代方法是混合床離子交換。通常以在35:65和65:35體積百分比範圍內的比例混合樹脂。通常，混合床離子交換步驟在如奈米過濾步驟、電滲析步驟或離子交換步驟的第一去離子步驟之後引入製程之中，但也用作單獨的離子交換步驟。對於實施例8、7和2中得到的寡醣混合物，將實施例13中超濾後的澄清培養液經過1L管柱上以1:1.3的比例混合的Amberlite FPC 22H和Amberlite FPA51的混合床管柱。混合床步驟在4°C至10°C之間的溫度下進行。最後，將液體的pH值設定為5和7之間，測量溶液的灰分含量低於1%。寡醣回收率在95到98%之間。
對於源自實施例3、4、5、6和9的澄清培養液，在經過實施例13中的超濾後，將液體經過1L管柱上以1.3:1的比例混合的Diaion SA20A和Amberlite FPC 22H的混合床管柱。與上述類似，混合床步驟是在4°C和10°C之間的溫度下進行的。最後，將液體的pH值設定為5和7之間，測量溶液的灰分含量低於1%。在此步驟中沒有任何唾液酸化寡醣被保留，保留混合物組成，寡醣回收率在95%和98%之間。
實施例 17. 藉由奈米過濾濃縮
奈米過濾利用載留值為200 Da的NF-2540膜(DOW)進行，以將離子交換、電滲析或奈米過濾後的去離子溶液濃縮至25白利糖度(Brix)。在過濾過程中，使用了20-25 bar範圍內的跨膜壓力和45°C的製程溫度。溶液在膜上連續再循環以進行濃縮，使濃縮物的乾燥物質含量高達25% Brix。
實施例 18. 顏色去除
為實現脫色，在整個過程中，數個樣品都經過Norit SX PLUS活性炭(0.5% m/v)進行活性炭處理。用分光光度計在420 nm處測量顏色去除。在所有樣品中，420 nm處的顏色強度降低了50到100倍。較佳在升高的溫度下，通過板式過濾器(plate filter)或箱式壓濾機(chamber filter press)過濾活性炭。
實施例 19. 寡醣混合物的噴霧乾燥
用實驗性(pilot)噴霧乾燥設備噴霧乾燥不同濃度的寡醣混合物。此設備的蒸發量為25 kg/h。
為了噴霧乾燥，將液體加熱至50至100°C之間的溫度，以降低黏度。液體的pH值設定為4至6。更較佳地將pH值設定為4至5並且溫度保持在50至70°C之間。
進料(feed)中的寡醣濃度在20%到80%白利糖度之間。這些濃度是通過旋轉蒸發或刮膜蒸發獲得的。濃縮的液體以50%至90%的速率送入噴霧乾燥器。白利糖度百分比越高，進料速度越快
使用的入口溫度範圍在120到280°C之間。出口溫度介於100°C和180°C之間。霧化輪轉速設定在10000到28000 rpm之間。在一項特定測試中，入口溫度設定為184°C，出口溫度設定為110°C，霧化器速度設定為21500 rpm。
所得粉末呈白色至灰白色，以10%濃度再次溶解於水中後，其pH值在4-6之間。寡醣混合物的純度以乾燥固體計，寡醣含量高於80%。噴霧乾燥的寡醣混合物具有約3%至10%的水分，蛋白質含量低於100mg/kg乾燥固體，DNA含量低於10ng/g乾燥固體並且內毒素低於10000EU/g乾燥固體。在濾液中沒有檢測到來自生產宿主的DNA。處理後灰分低於1%(以總乾燥固體計)，鉛含量低於0.1 mg/kg乾燥固體，砷：低於0.2 mg/kg乾燥固體，鎘低於0.1 mg/kg乾燥固體且汞低於0.5 mg/kg乾燥固體。
實施例 20. 逐步純化岩藻糖化的寡醣混合物
首先，將實施例8的培養液通過使用0.45 µm孔徑的濾膜進行微濾來澄清，在60°C和4至5的pH值下去除生物質。微濾步驟的濾液在第二步驟中使用10 kD的PES膜進行超濾，去除蛋白質、內毒素和DNA。得到的濾液通過奈米過濾進一步濃縮，在40℃下用300至500Da的聚醯胺膜從液體中部分去除鹽類和雙醣。在奈米過濾步驟中，寡醣混合物被濃縮到大約200g/l或20白利糖度的濃度。所得濃縮物通過活性炭進一步脫色，並通過陽離子交換步驟和陰離子交換步驟去離子，使灰分含量低於1%，以乾燥質量計。將此去離子液體的pH值設定為5至7，並通過蒸發濃縮至約50白利糖度。在Procept噴霧乾燥器上以160°C的入口溫度、75°C的出口溫度、600L/h的氣流和8ml/min的進料速率對最終溶液進行噴霧乾燥。得到的粉末呈白色至灰白色，在以10%濃度重新溶解在水中後，其pH值在4至6之間。寡醣混合物的純度以乾燥固體計，寡醣含量高於80%。噴霧乾燥的寡醣混合物的水分約為3至10%，蛋白質含量低於100mg/kg乾燥固體，DNA含量低於10ng/g乾燥固體，內毒素低於10000 EU/g乾燥固體。在濾液中沒有檢測到來自生產宿主的DNA。處理後的灰分低於1%(以總乾燥固體計)，鉛含量低於0.1 mg/kg乾燥固體，砷：低於0.2 mg/kg乾燥固體，鎘低於0.1 mg/kg乾燥固體和汞低於0.5 mg/kg乾燥固體。所得粉末中存在的寡醣為2’FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT和LNFP-I。
實施例 21. 逐步純化唾液酸化的寡醣混合物
首先，將實施例6的培養液通過使用0.45 µm孔徑膜進行微濾來澄清，在60°C和4至5的pH值下去除生物質。微濾步驟的濾液在第二步驟中使用10 kDa的PES膜進行超濾，去除蛋白質、內毒素和DNA。將所得濾液進一步利用電滲析濃縮及去離子，得到電導率為約0.9 mS/cm的液體溶液。在電滲析步驟之後，滲餘物在奈米過濾步驟中進一步處理，將寡醣混合物濃縮至約200g/l或20白利糖度的濃度。所得濃縮物通過活性炭進一步脫色，並通過陽離子交換步驟和陰離子交換步驟去離子，使灰分含量低於1%，以乾燥質量計。將此去離子液體的pH值設定為5至7，並通過蒸發濃縮至約50白利糖度。在Procept噴霧乾燥器上以160°C的入口溫度、75°C的出口溫度、600L/h的氣流和8ml/min的進料速率對最終溶液進行噴霧乾燥。所得粉末呈白色至灰白色，以10%濃度再次溶解在水中後，其pH值在4-7之間。寡醣混合物的純度以乾燥固體計，寡醣含量高於80%。噴霧乾燥的寡醣混合物具有約3%至10%的水分，蛋白質含量低於100mg/kg乾燥固體，DNA含量低於10ng/g乾燥固體並且內毒素低於10000EU/g乾燥固體。在濾液中沒有檢測到來自生產宿主的DNA。處理後灰分低於1%(以總乾燥固體計)，鉛含量低於0.1 mg/kg乾燥固體，砷：低於0.2 mg/kg乾燥固體，鎘低於0.1 mg/kg乾燥固體且汞低於0.5 mg/kg乾燥固體。所得粉末中存在的寡醣為LN3、6'-唾液酸化LN3 (Neu5Ac-a-2,6-(GlcNAc-b-1,3)-Gal-b-1,4-Glc)、LNnT、LSTc和6 'SL。
實施例 22. 逐步純化唾液酸化及岩藻糖化的寡醣混合物
首先，將實施例9的培養液通過使用0.45 µm孔徑的濾膜進行微濾來澄清，在60℃和4至5的pH值下去除生物質。微濾步驟的濾液在第二步驟中使用10kDa的PES膜進行超濾，去除蛋白質、內毒素和DNA。所得的濾液通過奈米過濾進一步濃縮，在40℃下用300至500Da的聚醯胺膜從液體中部分去除鹽和雙醣。在奈米過濾步驟中，寡醣混合物被濃縮到約200克/升或20白利糖度的濃度。得到的濃縮物通過活性炭進一步脫色，並通過陽離子交換步驟和陰離子交換步驟進行去離子，使灰分含量低於1%，以乾燥質量計。此去離子液體的pH值在5和7之間，並通過蒸發濃縮到約50白利糖度。最後的溶液加熱到70℃，在Anhydro噴霧乾燥器上以進口溫度184℃、出口溫度104℃、霧化器速度21800rpm、進料率66%進行噴霧乾燥。得到的粉末呈白色至灰白色，在以10%濃度重新溶解在水中後，pH值在4至7之間。寡醣混合物的純度以乾燥固體計，寡醣的含量大於80%。噴霧乾燥的寡醣混合物的含水量約為3-10%，蛋白質含量低於100mg/kg乾燥固體，DNA含量低於10ng/g乾燥固體，內毒素低於10000EU/g乾燥固體。濾液中沒有檢測到生產宿主的DNA。處理後的灰分含量低於1%(總乾燥固體)，鉛含量低於0.1mg/kg乾燥固體，砷：低於0.2mg/kg乾燥固體，鎘低於0.1mg/kg乾燥固體，汞低於0.5mg/kg乾燥固體。獲得的粉末中存在的寡醣有2'FL、3-FL、DiFL、3'SL、6'SL、di-SL、3'S-2'FL、3'S-3-FL、6'S-2'FL、6'S-3-FL、LNB、2'FLNB、4-FLNB、Di-FLNB、3'SLNB、6'SLNB、LN3、3'S-LN3、6'S-LN3、LNT、LNFP-I、LSTa。
實施例 23. 硫酸鹽、去乙醯化 (deacetylated) 和非去乙醯化 (non-deacetylated) 殼聚醣的混合物的純化
在發酵製程中混合物的生產根據實施例1並基於Samain等人(1999)的先前文獻進行 (E. Samain et al. : Journal of Biotechnology 72 (1999) 33–47)。在發酵結束時，發酵液的pH值降至5，並加熱至70°C的溫度1小時以釋放寡醣混合物。含有裂解細胞的培養液通過使用0.22 µm陶瓷過濾器的微濾步驟進一步澄清。然後將濾液在3kDa 陶瓷膜上處理以去除內毒素、蛋白質和DNA。此後將寡醣混合物濃縮至10白利糖度並通過電滲析去除離子至灰分含量低於1%。電滲析後，將pH值設定為5到7。在室溫下通過陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂進一步處理滲餘物，將沖提液的pH值再次設定為5到7。然後將其在旋轉蒸發器中濃縮並用活性炭處理以脫色。活性炭通過板式過濾器過濾掉，且最終濾液在Procept噴霧乾燥器上噴霧乾燥。
實施例 24. 本發明的逐步實施的實施例
下文描述的每個步驟必須理解為如本文所述。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)奈米過濾、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)電滲析、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)奈米過濾、3)混合床離子交換、4)濃縮、5)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)電滲析、3)混合床離子交換、4)濃縮、5)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)奈米過濾、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)電滲析、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)奈米過濾、3)混合床離子交換、4)濃縮、5)活性炭處理、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)電滲析、3)混合床離子交換、4)濃縮、5)活性炭處理、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)奈米過濾、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)電滲析、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)奈米過濾、3)混合床離子交換、4)濃縮、5)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)電滲析、3)混合床離子交換、4)濃縮、5)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)奈米過濾、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、87)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)電滲析、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)奈米過濾、3)混合床離子交換、4)濃縮、5)活性炭處理、6)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)電滲析、3)混合床離子交換、4)濃縮、5)活性炭處理、6)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)冷凍乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)奈米過濾、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)電滲析、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)奈米過濾、3)混合床離子交換、4)濃縮、5)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)電滲析、3)混合床離子交換、4)濃縮、5)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)奈米過濾、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)電滲析、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)奈米過濾、3)混合床離子交換、4)濃縮、5)活性炭處理、6)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)電滲析、3)混合床離子交換、4)濃縮、5)活性炭處理、6)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)濃縮為至少40%為乾燥物質的糖漿。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)奈米過濾、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)電滲析、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)奈米過濾、3)混合床離子交換、4)濃縮、5)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)電滲析、3)混合床離子交換、4)濃縮、5)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)奈米過濾、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)電滲析、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)奈米過濾、3)混合床離子交換、4)濃縮、5)活性炭處理、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)電滲析、3)混合床離子交換、4)濃縮、5)活性炭處理、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)奈米過濾、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)電滲析、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)奈米過濾、3)混合床離子交換、4)濃縮、5)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)電滲析、3)混合床離子交換、4)濃縮、5)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)奈米過濾、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)陽離子交換、5)陰離子交換、6)濃縮、7)活性炭處理、8)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)電滲析、3)陽離子交換、4)陰離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)奈米過濾、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)奈米過濾、3)混合床離子交換、4)濃縮、5)活性炭處理、6)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過微濾澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過離心澄清培養液、2)超濾、3)電滲析、4)混合床離子交換、5)濃縮、6)活性炭處理、7)噴霧乾燥。
從培養或發酵製程中獲得的中性及帶電寡醣混合物的純化，包括以下步驟1)通過超濾澄清培養液、2)電滲析、3)混合床離子交換、4)濃縮、5)活性炭處理、6)噴霧乾燥。

Claims (80)

  1. 一種生產不同寡糖的純化混合物的方法，包括： 培養至少一細胞，較佳為一微生物的細胞，其在合適的一培養或發酵基質中合成一不同寡糖的混合物以形成一培養或發酵液， 從該培養或發酵液中純化該寡糖混合物，藉由 i)澄清該培養或發酵液，以及 ii)從澄清的該培養或發酵液中去除鹽類及／或基質成分，及／或 iii)濃縮澄清的該培養或發酵液中的該寡糖混合物， 從而提供一溶液，包含純化的該寡糖混合物。
  2. 如請求項1之方法，其中步驟iii)在步驟ii)前進行。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該寡糖混合物包括至少兩種不同的寡糖，較佳至少三種不同的寡糖，更佳至少四種不同的寡糖，又更加至少五種不同的寡糖，最佳至少六種不同的寡糖。
  4. 如請求項1~3中任一項之方法，其中該寡糖混合物包括聚合度不同的至少兩種不同的寡糖，較佳該寡糖混合物包括聚合度不同的至少三種不同的寡糖，更佳該寡糖混合物包括聚合度不同的至少四種不同的寡糖。
  5. 如請求項1~4中任一項之方法，其中該寡糖混合物包括至少一中性及至少一帶電的寡糖。
  6. 如請求項1~5中任一項之方法，其中該培養或發酵液包括寡糖、生物質、基質成分及汙染物的混合物。
  7. 如請求項1~6中任一項之方法，其中該至少一細胞經過基因改造以生產至少一種寡糖，較佳該至少一細胞經過基因改造以生產至少兩種不同的寡糖。
  8. 如請求項1~7中任一項之方法，其中該至少一細胞為經過基因改造以生產至少一種寡糖的一微生物的細胞，較佳該至少一微生物經過基因改造以生產至少兩種不同的寡糖。
  9. 如請求項1~8中任一項之方法，其中在該培養或發酵液中的該寡糖混合物藉由培養至少一基因改造的細胞，較佳藉由培養能夠生產該寡糖混合物的一微生物的細胞而獲得，且該寡糖混合物較佳來一自內化碳水化合物前驅物。
  10. 如請求項1~9中任一項之方法，其中該至少一細胞，較佳為微生物，在具有一碳源的一基礎鹽培養基(minimal salt medium)中培養，該至少一細胞，較佳為微生物，在該碳源上生長。
  11. 如請求項10之方法，其中該基礎鹽培養基包含硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物、銨、鈣離子、鎂離子、鈉、鉀離子、鐵離子、銅離子、鋅離子、錳離子、鈷離子及／或硒離子。
  12. 如請求項10或11之方法，其中該碳源包括葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、玉米浸液、乳糖、半乳糖、高果糖糖漿、澱粉、纖維素、半纖維素、麥芽寡醣、海藻糖、甘油、醋酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽和丙酮酸鹽中的一種或多種。
  13. 如請求項1~12中任一項之方法，其中在該發酵液中的該寡糖混合物的總純度以總乾燥固體計，小於80%，及／或在該溶液中的該寡糖混合物的總純度以總乾燥固體計，等於或高於80%。
  14. 如請求項1~13中任一項之方法，其中在該培養或發酵液中的該寡糖混合物的總純度在純化前以總乾燥固體計，＜70%、＜60%、＜50%、＜40%、＜30%、＜20%、＜10%，及／或純化的該寡糖混合物的總純度在純化後以總乾燥固體計，＞80%，較佳＞85%，更加＞90%，又更加＞95%，最佳＞97%。
  15. 如請求項1~14中任一項之方法，其中澄清該培養或發酵液的步驟i)包括澄清(clarification)、清除(clearing)、過濾、微濾、離心、傾析和超濾中的一種或多種，較佳步驟i)更包括使用一助濾劑及／或絮凝劑；較佳該助濾劑為一吸附劑，更佳為活性碳。
  16. 如請求項15之方法，其中步驟i)包括對該培養或發酵液進行使用不同濾膜的兩道膜過濾步驟。
  17. 如請求項1~16中任一項之方法，其中從澄清的該培養或發酵液中去除鹽類及／或基質成分的步驟ii)包括奈米過濾、透析、電滲析、活性炭或碳的使用、溶劑的使用、醇的使用以及含水酒精混合物的使用、木炭的使用、切向流高效過濾、切向流超濾、親和層析、離子交換、陽離子交換、陰離子交換、混合床離子交換、模擬移動床層析、離子交換層析、疏水作用層析、凝膠過濾、配位基交換層析、管柱層析、陽離子交換吸附樹脂和離子交換樹脂的使用中的至少一種或多種。
  18. 如請求項17之方法，其中從澄清的該培養或發酵液中去除鹽類及／或基質成分的步驟ii)包括陰離子交換，其中該陰離子交換的樹脂之特徵在於具有30-48%的一水分含量，以及較佳為微孔或一凝膠型陰離子交換劑，較佳選自Dowex 1-X8、XA4023、XA3112、DIAION SA20A、DIAION SA10A的群組。
  19. 如請求項1~18中任一項之方法，其中步驟ii)包括使用混合床離子交換樹脂，較佳Diaion SA20A和Amberlite FPC 22H以1.1:1至 1.9:1的比例混合的混合床管柱，的一處理。
  20. 如請求項1~19中任一項之方法，其中濃縮的步驟iii)包括奈米過濾、逆滲透、蒸發、刮膜蒸發和降膜蒸發中的一種或多種。
  21. 如請求項1~20中任一項之方法，其中該寡糖混合物包括岩藻糖基化寡糖、唾液酸化寡糖、路易斯型抗原、含有N-乙醯葡萄糖胺的中性寡糖、含有N-乙醯基乳糖胺的寡糖、含有乳糖基-N-雙醣的寡糖、非岩藻糖基化中性寡糖、殼聚醣、殼聚醣寡醣、肝素原、硫酸軟骨寡糖、醣胺聚醣寡糖、肝素、硫酸乙醯肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、玻尿酸或透明質酸及／或硫酸角質素中的至少一種。
  22. 如請求項1~21中任一項之方法，其中該寡糖混合物包括至少一哺乳動物乳寡糖，較佳至少一人乳寡糖，更佳該混合物中的所有寡糖皆為哺乳動物乳寡糖，最佳該混合物中的所有寡糖皆為人乳寡糖。
  23. 如請求項1~22中任一項之方法，其中步驟i)包括微濾澄清的一第一步驟。
  24. 如請求項1~22中任一項之方法，其中步驟i)包括離心澄清的一第一步驟。
  25. 如請求項1~22中任一項之方法，其中步驟i)包括絮凝澄清的一第一步驟。
  26. 如請求項1~22中任一項之方法，其中步驟i)包括超濾澄清的一第一步驟。
  27. 如請求項1~26中任一項之方法，其中步驟i)包括超濾。
  28. 如請求項26或27之方法，其中步驟i)中的超濾具有等於或大於1 kDa、2 kDa、3 kDa、4 kDa、5 kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10 kda、11 kDa、12kDa、13 kDa、14 kDa、15 kDa的一載留分子量(molecular weight cut off)。
  29. 如請求項1~28中任一項之方法，其中步驟i)包括連續的兩次超濾，且其中第一次超濾的濾膜載留分子量大於第二次超濾的濾膜載留分子量。
  30. 如請求項1~29中任一項之方法，其中步驟ii)包括奈米過濾及／或電滲析。
  31. 如請求項30之方法，其中該奈米過濾及／或電滲析執行兩次。
  32. 如請求項31之方法，其中該奈米過濾及／或電滲析的步驟連續執行。
  33. 如請求項26~32中任一項之方法，其中步驟i)中的超濾滲透物在步驟ii)中奈米過濾及／或電滲析。
  34. 如請求項1~22、26~32中任一項之方法，其中步驟i)為超濾，步驟ii)為奈米過濾及／或電滲析的處理結合使用一離子交換樹脂及／或層析的處理。
  35. 如請求項34之方法，其中該離子交換樹脂為一強酸性陽離子交換樹脂及／或一弱鹼性陰離子交換樹脂。
  36. 如請求項35之方法，其中該離子交換樹脂為一強酸性陽離子交換樹脂及一弱鹼性陰離子交換樹脂。
  37. 如請求項1~36中任一項之方法，其中步驟ii)包括使用H+形式或Na+形式的一強陽離子交換樹脂以及游離鹼形式，較佳Cl-形式，或者較佳OH-形式的一弱陰離子交換樹脂的處理。
  38. 如請求項35~37中任一項之方法，其中使用H+形式或Na+形式的一強陽離子交換樹脂的處理後直接接著使用游離鹼形式的一弱陰離子交換樹脂的一處理。
  39. 如請求項1~38中任一項之方法，其中該方法不包括電滲析。
  40. 如請求項1~38中任一項之方法，其中步驟ii)包括電滲析。
  41. 如請求項35~38、40中任一項之方法，其中使用一強陽離子交換樹脂及／或一弱陰離子交換樹脂的處理之前，先進行超濾，然後進行奈米過濾及／或電滲析。
  42. 如請求項1~41中任一項之方法，其中步驟i)至iii)中的任一者或多者執行不止一次。
  43. 如請求項33~42中任一項之方法，其中步驟ii)中奈米過濾膜的載留分子量低於步驟i)中超濾膜的載留分子量。
  44. 如請求項33~43中任一項之方法，其中步驟ii)中奈米過濾膜的載留分子量等於或高於200 Da、300 Da、400 Da、500 Da、600 Da、700Da、800 Da、900 Da或1000 Da。
  45. 如請求項17~44中任一項之方法，其中步驟ii)包括在中性固相上的一離子交換樹脂處理及／或層析。
  46. 如請求項1~45中任一項之方法，其中包括純化的該寡醣混合物的該溶液具有約8至約75%的白利糖度值(Brix value)，較佳包括純化的該寡醣混合物的該溶液具有約30至65%的白利糖度值。
  47. 如請求項1~46中任一項之方法，其中該至少一微生物為乳糖滲透酶陽性表型的一大腸桿菌或酵母菌，其中該乳糖滲透酶分別由基因LacY或LAC12編碼。
  48. 如請求項1~47中任一項之方法，其中該微生物為一細菌，較佳為一大腸桿菌菌株，更佳為一K-12菌株的大腸桿菌菌株，又更佳該大腸桿菌K-12菌株為E. coli MG1655。
  49. 如請求項1~47中任一項之方法，其中該至少一微生物為一酵母菌。
  50. 如請求項49之方法，其中該酵母菌選自由酵母屬(Saccharomyces)、念珠菌屬(Candida)、漢遜氏酵母菌屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母菌屬(Pichia)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、許旺酵母屬(Schwanniomyces)、有孢圓酵母屬(Torulaspora)、耶氏酵母屬(Yarrowia)和接合酵母屬(Zygosaccharomyces)所組成的群組，更佳選自由釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)、乳酸克魯維酵母菌(Kluyveromyces lactis)、馬克斯克魯維酵母菌(Kluyveromyces marxianus)、巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、甲醇畢赤酵母菌(Pichia methanolica)、樹幹畢赤酵母菌(Pichia stipites)、博伊丁假絲酵母菌(Candida boidinii)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、德爾布有孢圓酵母(Torulaspora delbrueckii)、解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)和拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)所組成的群組。
  51. 如請求項1~50中任一項之方法，其中步驟i)之前為一酶處理。
  52. 如請求項51之方法，其中該酶處理包括使用一種或多種酶培養該培養或發酵液，該酶選自由糖苷酶、乳糖酶、b-半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、唾液酸酶、麥芽糖酶、澱粉酶、六糖苷酶、葡醣醛酸酶、海藻糖酶和轉化酶所組成的群組。
  53. 如請求項51或52之方法，其中該酶處理將乳糖及／或蔗糖轉化為單醣類。
  54. 如請求項1~53中任一項之方法，其中該方法更包括脫色。
  55. 如請求項1~54中任一項之方法，其中純化的該寡糖混合物溶液具有(以總乾燥固體計)小於1%的灰含量，較佳(以總乾燥固體計)小於0.5%的灰含量，較佳小於0.1 mg/kg乾燥固體的鉛含量、小於0.2 mg/kg乾燥固體的砷含量、小於0.1 mg/kg乾燥固體的鎘含量及／或小於0.5 mg/kg乾燥固體的汞含量。
  56. 如請求項1~55中任一項之方法，其中將純化的該寡糖混合物溶液進一步濃縮為至少40%為乾燥物質的一糖漿，或將該寡糖混合溶液乾燥至一粉末。
  57. 如請求項1~56中任一項之方法，其中純化的該寡糖混合物溶液具有每公斤乾燥固體小於100毫克的一蛋白質含量、每克乾燥固體小於10奈克的DNA含量及／或每克乾燥固體小於10000EU的內毒素含量。
  58. 如請求項1~57中任一項之方法，其中將純化的該寡糖混合物溶液乾燥。
  59. 如請求項57或58之方法，其中乾燥步驟包括噴霧乾燥、冷凍乾燥、蒸發、沉澱和乾燥中的任一種或多種。
  60. 如請求項59之方法，其中將純化的該寡糖混合物溶液噴霧乾燥。
  61. 如請求項59之方法，其中該乾燥為將純化的該寡糖混合物溶液噴霧乾燥或冷凍乾燥，且其中較佳該溶液的pH小於5.0。
  62. 一種純化的寡糖混合物，藉由如請求項1~61中任一項之方法獲得。
  63. 一種乾燥粉末，藉由如請求項58~61中任一項之方法獲得，其中該乾燥粉末具有≤ 15%-wt的水，較佳≤ 10%-wt的水，更佳≤ 7%-wt的水，最佳≤ 5%-wt的水。
  64. 一種噴霧乾燥的粉末，藉由如請求項59~63中任一項之方法獲得，其中該粉末通過雷射繞射測定具有50至250µm的一平均粒徑，較佳該粉末具有95至120µm的一平均粒徑，更佳該粉末具有110至120µm的一平均粒徑。
  65. 一種如請求項58~64中任一項的寡糖混合物的粉末，其中當該粉末以10%(質量/體積濃度)的一濃度重新溶解在水中時，提供了具有在4至7之間，較佳4至6之間的pH的一溶液。
  66. 一種乾燥的純化的寡糖混合物的粉末，可藉由如請求項58~65中任一項之方法獲得，其中該粉末表現出： 約500至約700g/L的鬆散堆積密度， 約600至約850g/L的100x振實堆積密度， 約600至約900g/L的625x振實堆積密度，及／或 約650至約900g/L的1250x振實堆積密度。
  67. 如請求項66之寡糖的混合粉末，其中該粉末表現出： 約600至約700g/L的鬆散堆積密度， 約750至約850g/L的100x振實堆積密度， 約750至約850g/L的625x振實堆積密度，及／或 約850至約900g/L的1250x振實堆積密度。
  68. 如請求項66之寡糖的混合粉末，其中該粉末表現出： 約500至約600g/L的鬆散堆積密度， 約600至約700g/L的100x振實堆積密度， 約700至約800g/L的625x振實堆積密度，及／或 約750至約800g/L的1250x振實堆積密度。
  69. 一種藉由如請求項1~61中任一項之方法獲得的純化的寡糖混合物在一食物或飼料調製(feed preparation)、一膳食補充劑、一妝品成分或一藥物成分中的用途。
  70. 一種如請求項62~68中任一項之純化的寡糖混合物在一食物或飼料調製、一膳食補充劑、一妝品成分或一藥物成分中的用途。
  71. 如請求項69或70之用途，其中該食物為一人類食物。
  72. 如請求項69~71中任一項之用途，其中該食物為一嬰兒食物。
  73. 如請求項69~72中任一項之用途，其中該食物為一嬰兒配方產品或一嬰兒補充劑。
  74. 如請求項69或70之用途，其中該飼料為寵物食品、動物代乳品、獸醫產品、斷奶後飼料或教槽飼料。
  75. 一種生產純化的帶電寡糖的方法，包括： 培養至少一細胞，較佳為一微生物的細胞，其在合適的一培養或發酵基質中合成一帶電寡糖以形成一培養或發酵液， 從該培養或發酵液中純化該帶電寡糖，藉由 i) 澄清該培養或發酵液，以及 ii)從澄清的該培養或發酵液中去除鹽類及／或基質成分，及／或 iii)濃縮澄清的該培養或發酵基質中的該寡糖混合物， 且特徵在於步驟ii)包括使用a)一混合床離子交換或b)陽離子和陰離子交換的一處理，從而提供一溶液，包含純化的該帶電寡糖。
  76. 如請求項75之方法，其中在a)或b)中任一者所使用的該陰離子交換的樹脂具有30-48%的一水分含量，並且較佳為一凝膠型陰離子交換劑，較佳選自包括Dowex 1-X8、XA4023、XA3112、DIAION SA20A、DIAION SA10A的群組。
  77. 如請求項76之方法，其中該陰離子交換的樹脂為OH-形式。
  78. 如請求項75或76之方法，其中該處理為a)混合床離子交換，且該混合床離子交換的樹脂為Diaion SA20A和Amberlite FPC 22H以1.1:1至1.9:1的比例混合的混合床管柱。
  79. 如請求項75~78中任一項之方法，其中該帶電寡糖選自包含唾液酸化寡糖、硫酸化殼聚醣、脫乙醯殼聚醣的列表。
  80. 如請求項75~79中任一項之方法，其中將該帶電寡糖溶液更進一步濃縮為至少40%為乾燥物質的一糖漿，或將該寡糖混合物溶液乾燥為一粉末。
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