CN115739031A - 壳聚糖或其衍生物在脱除明胶中内毒素的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种壳聚糖或其衍生物在脱除明胶中内毒素的应用，并提供了壳聚糖或其衍生物脱除明胶中内毒素的具体方法。在明胶溶液体系中，本发明所述的壳聚糖类吸附剂对内毒素具有较高的吸附容量，可以使明胶中内毒素脱除率大于50％，对于高内毒素含量的明胶样品，脱除率甚至可以达到80％以上。该方法纯化的低内毒素明胶产品可以用于药物缓释载体、疫苗稳定剂、干细胞培养基、Ⅱ类和Ⅲ类医疗器械等领域。
Description
技术领域
本发明属于生物大分子吸附材料技术领域和医用明胶制备技术领域。更具体地，涉及壳聚糖或其衍生物在脱除明胶中内毒素的应用。
背景技术
明胶是动物的皮、骨、腱与韧带中的胶原蛋白经适度水解(酸法、碱法、酸碱混合或酶法)后纯化得到的制品，或为上述不同明胶制品的混合物，被广泛的用做食品添加剂和药用辅料，是国民经济发展不可或缺的基础工业品。近年来，明胶的良好的力学特性、成膜性、可降解性、生物安全性陆续被科研工作者所发现，作为一种能够治疗、修复或替换人体组织、器官或增进其功能的天然材料，明胶的化学和机械性能与胶原非常相似，经水解过程而消除了潜在的病原体；在功能特性方面具有良好的生物相容性、生物降解性和成膜性，这使它在再生医学领域倍受青睐。以明胶为原料的止血棉、疫苗稳定剂、3D水凝胶、植入性骨修复材料等产品已形成并上市销售。
中国药典2015版规定，非经肠道给药制剂的内毒素含量必须少于5EU/Kg/h，放射性药品注射剂的内毒素限制为2.5EU/Kg/h，鞘内注射液的内毒素阈值限制为0.2EU/kg/h。美国食品和药物管理局FDA规定与心血管和/或淋巴系统接触的产品，内毒素的最大限度为0.5EU/ml或者20EU/装置。与脑脊液接触的内毒素限度是0.06EU/ml或2.15EU/装置。对于直接或间接与眼内环境接触的装置，可采用更低的内毒素限度。市售药用明胶的内毒素一般在102～105EU/g之间，内毒素一旦随原料进入植入性医疗器械，并超过阈值，会引起一系列血管活性肽和细胞因子介质的释放，可导致发热、炎症反应、休克、器官衰竭和死亡。在组织工程应用上，内毒素影响细胞在支架表面的粘附、生长与分化。因此当明胶作为代血浆、组织工程支架、植入物、体内止血等材料时，必须严格限定内毒素的含量。
明胶生产企业一直尝试用多种方式去除明胶中的内毒素。德国嘉利达公司在WO2012031916-A1专利中提出了一种通过碱溶液、酸溶液和氧化剂降低骨素胶原中内毒素的方法。碱溶液的浓度为0.5-1.5mol/L，处理时间12-72小时；酸的浓度为0.1-0.5mol/L，处理时间是6-14小时；氧化剂过氧化氢浓度约为800-3200ppm。该方法主要针对骨胶原中内毒素的去除，胶原是明胶降解之前的产物，因此并未实现低内毒素明胶的制备。
罗赛洛公司在EP3489314-A1专利中公开了一种降低明胶水解物中内毒素的方法，将明胶水解物保持在70～125℃，pH低于3.5，孵育大于等于15分钟。该方法通过明胶与酸作用去除内毒素，得到的产品为明胶水解物，产品失去了明胶特有的溶胶凝胶转化特性和成膜特性。
US2019276707-A1公开了一种降低明胶中内毒素的方法，主要方法是先配制明胶盐溶液，然后用阴离子交换树脂过滤，去除明胶中盐的同时，起到降低内毒素水平的作用。该方法对于内毒素的去除有一定的效果，但不适用于制备内毒素含量仅为10EU/g的高安全性明胶制品，这是由于阴离子交换树脂柱是嗜碱性微生物的温床，一旦有少量革兰氏阴性菌混入，在灭菌后，明胶中的内毒素会大量增加。
JP2005/289841介绍了一种降低B型明胶中内毒素含量的生产方法。该方法包括用氢氧化钙溶液和pH值为12的季铵盐处理动物组织至少5天。通过常规方法在热水溶液中提取明胶，明胶溶液通过0.2μm滤膜过滤，得到的明胶产品中内毒素含量小于5EU/g。但是，由于过滤步骤中使用的滤膜孔径小，分子量大于200KDa的明胶分子不能通过，这会导致明胶的β组分和γ组分缺失，影响明胶的粘度特性。
EP1829946A1公开了一种通过超滤的方式获得低内毒素明胶的方法，采用截留分子量为20～300KDa的超滤膜使明胶分子透过，从而获得了低内毒素明胶透过液，获得的明胶溶液的分子量为1到300KDa，1％明胶溶液中的内毒素含量小于1EU/mL。该方法得到的明胶溶液浓度低，且明胶中的高分子量组分很难透过超滤膜，明胶的高分子量组分损失会导致明胶终产品的粘度有所降低。
法国罗赛洛WO 2016/085345通过添加表面活性剂使明胶中的内毒素在临界胶束浓度或高于临界胶束浓度时形成胶束，然后通过固相吸附剂吸附内毒素胶束或囊泡。其中最优化的表面活性剂为Triton X-100，固相吸附剂为活性炭或者硅藻土。该方法已经成功将重组药物的内毒素去除方法用于明胶中内毒素的分离，实现了较高的分离效率。但由于Triton X-100具有一定毒性，难以从明胶溶液中全部去除，可能面临表面活性剂残留的风险。
目前已发表的文章和公开专利尚未检索到采用亲和吸附的方式脱除明胶溶液中内毒素的方法。
发明内容
鉴于上述明胶中内毒素去除过程中存在的各种问题，例如对明胶性能的影响、安全性问题等，本发明的目的在于提供一种壳聚糖或其衍生物在脱除明胶中内毒素的应用，该方法可以对明胶中的内毒素实现安全、高效地脱除。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明提供一种壳聚糖或其衍生物在脱除明胶中内毒素的应用。
需要说明的是，本发明所述的明胶是指酸法明胶、碱法明胶、酶法明胶或上述类型明胶的混合物。在本发明中，明胶中内毒素浓度(即内毒素含量)被定义为每克明胶中内毒素单位(EU)。内毒素浓度的测定是以大肠杆菌0113：H10K作为参比，通过鲎试剂动态浊度法测试明胶中内毒素含量。
进一步的，所述明胶中内毒素的含量为50～100000EU/g。例如，明胶中内毒素的含量为50～200EU/g，200-1000EU/g，1000-100000EU/g等。本发明的壳聚糖或其衍生物不仅可以处理较低内毒素含量的明胶，对高内毒素含量明胶的脱除效果更佳显著。
进一步的，所述壳聚糖或其衍生物是指壳聚糖、交联壳聚糖、壳聚糖与多氨基配体交联物。
本发明采用天然高分子材料壳聚糖作为内毒素吸附剂载体，与活性炭、硅胶、琼脂糖等其他载体相比，壳聚糖上的游离氨基本身就具有内毒素吸附的作用，当壳聚糖与多氨基配体交联时，加上多氨基配体的游离氨基，具有更多的吸附位点和吸附容量，对明胶中内毒素的脱除具有高的吸附效率。此外，在酸性环境下，明胶呈正电性，与壳聚糖分子的电性相同，从而大大减少了吸附剂与基质的作用，减少了明胶在吸附过程中的损失，有助于提高壳聚糖吸附剂的吸附效率。此外，发明人还发现壳聚糖基的吸附材料在去除内毒素的同时不会影响明胶活性，且不会有毒性物质残留。
根据本发明的具体实施方式，本发明所用的壳聚糖提取自虾蟹等海洋节肢动物的壳，优选脱乙酰度不低于70％的壳聚糖，其表面的自由氨基基团可以作为吸附内毒素分子类酯A磷酸根的活性中心，也可以作为接枝活性氨基的位点。
进一步的，本发明所述交联壳聚糖可以采用本领域已知的方法制备或购买，包括但不限于采用戊二醛、环氧氯丙烷或1,4-丁二醇二缩水甘油醚作为交联剂制成。
根据本发明的具体实施方式，所述交联壳聚糖可以通过下面的方法制成：
1)选用脱乙酰度≥70％的壳聚糖，在搅拌下，将壳聚糖溶于乙酸溶液中，控制壳聚糖的质量分数为1％-3％，形成均一的壳聚糖溶液后，加入交联剂，交联剂(C)的浓度为5％≤C≤30％，慢速搅拌至壳聚糖形成均匀的凝胶，在室温下继续交联一段时间。
2)交联完毕后，将壳聚糖凝胶冷冻干燥，得到多孔的交联壳聚糖吸附剂。
进一步的，本发明所述壳聚糖与多氨基配体交联物可以采用本领域已知的方法进行制备或购买，包括但不限于采用戊二醛、环氧氯丙烷或1,4-丁二醇二缩水甘油醚作为交联剂，采用精氨酸、组氨酸、赖氨酸、聚ε-赖氨酸、多粘菌素B或者其他带游离氨基的化合物作为多氨基配体制成。
根据本发明的具体实施方式，所述壳聚糖与多氨基配体交联物可以通过下面的方法制成：
1)选用脱乙酰度≥70％的壳聚糖，在搅拌下，将壳聚糖溶于乙酸溶液中，控制壳聚糖的质量分数为1％-3％，按照壳聚糖与多氨基配体的质量比1:1加入多氨基配体，继续搅拌0.5-1h至形成均一溶液，冷却至4-10℃。
2)加入交联剂，交联剂(C)的浓度为5％≤C≤30％，慢速搅拌至壳聚糖与多氨基配体形成均匀的凝胶，在室温下继续交联一段时间。
3)交联完毕后，将壳聚糖与多氨基配体交联物凝胶冷冻干燥，即得。
进一步的，在本发明中，使用壳聚糖或其衍生物进行明胶中内毒素脱除时，具体方法包括：
(1)将壳聚糖或其衍生物在碱液中浸泡2～4h，然后用纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL)洗涤至中性，在无菌环境下干燥，粉碎，获得去热原处理的壳聚糖或其衍生物；
(2)将明胶原料溶于50～70℃热水中，配制质量浓度为2～10％的明胶溶液，溶胶用水为纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL，)调节明胶溶液的pH为4.0～6.5；调节pH值的酸碱调节剂可以选自食品级盐酸、柠檬酸、氢氧化钠或氢氧化钾；
(3)将去热原处理的壳聚糖或其衍生物加入到所述明胶溶液中，壳聚糖或其衍生物与明胶原料的质量比为1:1～20(优选的1:5～10)，吸附温度为40～60℃，吸附时间为30～240min，然后采用过滤介质或离心分离的方式将壳聚糖或其衍生物与明胶溶液分离，获得脱除内毒素的明胶溶液；任选的，吸附过程中进行搅拌；
或，
将去热原处理的壳聚糖或其衍生物填装到吸附柱中，通过动态吸附的方式，使明胶溶液通过吸附柱，获得脱除内毒素的明胶溶液；
(4)将脱除内毒素的明胶溶液浓缩，至胶液浓度达到25％以上；
(5)对浓缩胶液进行闪蒸灭菌；
(6)冷冻挤胶，并进行干燥，即得。
上述过程中，所述碱液为氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液，浓度为0.1～0.3M。
进一步的，所述过滤介质为棉饼、滤纸或硅藻土过滤纸板。
进一步的，所述吸附柱内温度为40～60℃。
进一步的，吸附柱中壳聚糖或其衍生物的用量根据流出液中内毒素浓度进行调整，至流出液中内毒素含量低于0.5EU/mL。
进一步的，步骤(4)中，明胶溶液浓缩方式采用三效蒸发。
进一步的，步骤(1)中，所述干燥为冷冻干燥或热风干燥；步骤(6)中，所述干燥为冷冻干燥或者长网干燥，可以有效保护明胶的分子结构。
本发明的有益效果如下：
1、现有低内毒素明胶的制备技术是采用Triton系列表面活性剂通过萃取的方式脱除明胶中的内毒素。但该方法最大的缺点是Triton作为表面活性剂会残留在明胶溶液中，增加了明胶溶液中的杂质。壳聚糖或其衍生物形成的吸附剂不溶于水，为固相吸附剂，容易实现与明胶溶液的分离。由于壳聚糖本身为天然生物大分子，为医用植入性材料的良好原材料，具有与明胶相似的较好的生物相容性和生物安全性，因此壳聚糖或衍生物具有更好的生物安全性。
2、壳聚糖或其衍生物在碱性环境下不溶解，且能够稳定存在，因此可以采用碱处理的方式将吸附剂本身的内毒素脱除，在明胶内毒素脱除过程中减少了外源性内毒素的引入。
3、壳聚糖的原料来源丰富，价格适中，利于控制吸附剂成本，可作为大规模工业化制备的原料来源。
4、在明胶溶液体系中，壳聚糖类吸附剂具有较高的吸附容量，可以使明胶中内毒素脱除率大于50％，对于高内毒素含量的明胶样品，脱除率甚至可以达到80％以上。该方法纯化的低内毒素明胶产品可以用于药物缓释载体、疫苗稳定剂、干细胞培养基、Ⅱ类和Ⅲ类医疗器械等领域。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出壳聚糖原料和壳聚糖与精氨酸交联物经去热原水洗后的FT-IR图。
图2示出壳聚糖、精氨酸、戊二醛交联壳聚糖和壳聚糖与精氨酸交联物经去热原水洗后的热重分析图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1：采用脱乙酰度≥70％的壳聚糖为吸附剂制备低内毒素明胶
1)选用脱乙酰度≥70％的壳聚糖作为内毒素吸附剂；
2)将该壳聚糖在0.1M NaOH溶液中浸泡3h，进行去热原处理，用纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL)将吸附剂洗涤至中性，在无菌环境下干燥，粉碎；
3)将不同内毒素含量的明胶分别溶于60℃热水中，检测吸附剂对于明胶中内毒素含量不同的吸附效果，配制明胶溶液浓度为5％，溶胶用水为纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL)，调节溶液的pH为5.0；
4)步骤2)粉末状吸附剂加入上述明胶溶液中，吸附剂与明胶的质量比为1:10，明胶溶液温度为50℃，适度搅拌，吸附时间为120min，然后采用去热原的棉饼过滤，将吸附剂与明胶溶液分离；
5)冷冻挤胶，并进行冷冻干燥，得到脱除部分内毒素的明胶。
表1吸附前后高内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
| 明胶指标 | 吸附前 | 吸附后 |
| 内毒素含量(EU/g) | 24400 | 1652 |
| 冻力(Bloom g) | 220 | 202 |
| 粘度(mPa·s) | 4.86 | 4.38 |
| 灰分(％) | 0.15 | 0.98 |
| 透射比(％)450nm/620nm | 85.3/94.1 | 75.8/80.5 |
| 羟脯氨酸含量(％) | 13.63 | 13.30 |
| 重金属含量以Pb计(mg/kg) | 0.023 | 0.045 |
在该工艺条件下，该吸附剂对高内毒素含量明胶中内毒素的脱除率为93.2％，冻力下降8.2％，粘度下降9.9％，灰分增加了0.83％。
表2吸附前后中内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
在该工艺条件下，该吸附剂对中内毒素含量明胶中内毒素的脱除率为84.8％，冻力下降9.8％，粘度下降11.0％，灰分增加了0.85％。
表3吸附前后低内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
| 明胶指标 | 吸附前 | 吸附后 |
| 内毒素含量(EU/g) | 73 | 36 |
| 冻力(Bloom g) | 248 | 229 |
| 粘度(mPa·s) | 5.25 | 4.75 |
| 灰分(％) | 0.05 | 0.79 |
| 透射比(％)450nm/620nm | 91.3/96.8 | 89.8/95.0 |
| 羟脯氨酸含量(％) | 13.73 | 13.65 |
| 重金属含量以Pb计(mg/kg) | 0.020 | 0.022 |
在该工艺条件下，该吸附剂对低内毒素含量明胶中内毒素的脱除率为50.7％，冻力下降7.7％，粘度下降9.5％，灰分增加了0.74％。
实施例2：采用脱乙酰度≥80％的壳聚糖为吸附剂制备低内毒素明胶
1)选用脱乙酰度≥80％的壳聚糖作为内毒素吸附剂；
2)将该壳聚糖在0.1M NaOH溶液中浸泡3h，进行去热原处理，用纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL)将吸附剂洗涤至中性，在无菌环境下干燥，粉碎；
3)将不同内毒素含量的明胶分别溶于60℃热水中，检测吸附剂对于明胶中内毒素含量不同的吸附效果，配制明胶溶液浓度为5％，溶胶用水为纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL)，调节溶液的pH为5.0；
4)步骤2)粉末状吸附剂加入上述明胶溶液中，吸附剂与明胶的质量比为1:10，明胶溶液温度为50℃，适度搅拌，吸附时间为120min，然后采用去热原的棉饼过滤，将吸附剂与明胶溶液分离；
5)冷冻挤胶，并进行冷冻干燥，得到脱除部分内毒素的明胶。
表4吸附前后高内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
在该工艺条件下，该吸附剂对高内毒素含量明胶中内毒素的脱除率为84.4％，冻力下降5.0％，粘度下降13.4％，灰分增加了0.64％。
表5吸附前后中内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
| 明胶指标 | 吸附前 | 吸附后 |
| 内毒素含量(EU/g) | 513 | 125 |
| 冻力(Bloom g) | 235 | 215 |
| 粘度(mPa·s) | 4.92 | 4.24 |
| 灰分(％) | 0.10 | 0.89 |
| 透射比(％)450nm/620nm | 87.3/94.8 | 78.6/83.7 |
| 羟脯氨酸含量(％) | 13.71 | 13.13 |
| 重金属含量以Pb计(mg/kg) | 0.022 | 0.037 |
在该工艺条件下，该吸附剂对中内毒素含量明胶中内毒素的脱除率为75.6％，冻力下降8.5％，粘度下降13.8％，灰分增加了0.79％。
表6吸附前后低内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
| 明胶指标 | 吸附前 | 吸附后 |
| 内毒素含量(EU/g) | 73 | 31 |
| 冻力(Bloom g) | 248 | 223 |
| 粘度(mPa·s) | 5.25 | 4.86 |
| 灰分(％) | 0.05 | 0.46 |
| 透射比(％)450nm/620nm | 91.3/96.8 | 86.7/94.8 |
| 羟脯氨酸含量(％) | 13.73 | 13.65 |
| 重金属含量以Pb计(mg/kg) | 0.020 | 0.022 |
在该工艺条件下，该吸附剂对低内毒素含量明胶中内毒素的脱除率为57.5％，冻力下降10.1％，粘度下降7.4％，灰分增加了0.41％。
实施例3：采用脱乙酰度≥90％的壳聚糖为吸附剂制备低内毒素明胶
1)选用脱乙酰度≥90％的壳聚糖作为内毒素亲和吸附剂；
2)将该壳聚糖在0.1M NaOH溶液中浸泡3h，进行去热原处理，用纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL)将吸附剂洗涤至中性，在无菌环境下干燥，粉碎；
3)将不同内毒素含量的明胶分别溶于60℃热水中，检测吸附剂对于明胶中内毒素含量不同的吸附效果，配制明胶溶液浓度为5％，溶胶用水为纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL)，调节溶液的pH为5.0；
4)步骤2)粉末状吸附剂加入上述明胶溶液中，吸附剂与明胶的质量比为1:10，明胶溶液温度为50℃，适度搅拌，吸附时间为240min，然后采用去热原的棉饼过滤，将吸附剂与明胶溶液分离；
5)冷冻挤胶，并进行冷冻干燥，得到脱除部分内毒素的明胶。
表7吸附前后高内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
| 明胶指标 | 吸附前 | 吸附后 |
| 内毒素含量(EU/g) | 24400 | 5685 |
| 冻力(Bloom g) | 220 | 206 |
| 粘度(mPa·s) | 4.86 | 4.23 |
| 灰分(％) | 0.15 | 0.73 |
| 透射比(％)450nm/620nm | 85.3/94.1 | 75.6/80.36 |
| 羟脯氨酸含量(％) | 13.63 | 14.21 |
| 重金属含量以Pb计(mg/kg) | 0.023 | 0.037 |
在该工艺条件下，该吸附剂对高内毒素含量明胶中内毒素的脱除率为76.7％，冻力下降6.4％，粘度下降13.0％，灰分增加了0.58％。
表8吸附前后中内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
在该工艺条件下，该吸附剂对中内毒素含量明胶中内毒素的脱除率为68.2％，冻力下降8.9％，粘度下降12.2％，灰分增加了0.59％。
表9吸附前后低内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
| 明胶指标 | 吸附前 | 吸附后 |
| 内毒素含量(EU/g) | 73 | 32 |
| 冻力(Bloom g) | 248 | 221 |
| 粘度(mPa·s) | 5.25 | 4.54 |
| 灰分(％) | 0.05 | 0.73 |
| 透射比(％)450nm/620nm | 91.3/96.8 | 84.2/93.4 |
| 羟脯氨酸含量(％) | 13.73 | 12.98 |
| 重金属含量以Pb计(mg/kg) | 0.020 | 0.031 |
在该工艺条件下，该吸附剂对低内毒素含量明胶中内毒素的脱除率为56.2％，冻力下降10.9％，粘度下降13.5％，灰分增加了0.68％。
实施例4：交联壳聚糖为吸附剂制备低内毒素明胶
1)选用脱乙酰度≥80％的壳聚糖，在搅拌下，将壳聚糖溶于2％乙酸溶液中，控制壳聚糖的质量分数为2％，形成均一的壳聚糖溶液后，加入5mL浓度为20％的戊二醛溶液，慢速搅拌至壳聚糖形成均匀的凝胶，在室温下继续交联12h。
交联完毕后，将壳聚糖凝胶冷冻干燥，得到多孔的交联壳聚糖吸附剂。
2)将吸附剂在0.1M NaOH溶液中浸泡3h，进行去热原处理，用纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL)将吸附剂洗涤至中性，在无菌环境下干燥，粉碎。
3)将不同内毒素含量的明胶分别溶于60℃热水中，配制明胶溶液浓度为5％，溶胶用水为纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL，)调节溶液的pH为5.0；
4)步骤2)粉末状吸附剂加入上述明胶溶液中，吸附剂与明胶的质量比为1:10，明胶溶液温度为55℃，适度搅拌，吸附时间为120min，然后采用去热原的棉饼过滤，将吸附剂与明胶溶液分离；
5)冷冻挤胶，并进行冷冻干燥，得到脱除部分内毒素的内毒素明胶。
表10吸附前后高内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
在该工艺条件下，该吸附剂对高内毒素含量明胶中内毒素的脱除率为82.4％，冻力下降6.4％，粘度下降11.9％，灰分增加了0.44％。
表11吸附前后中内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
| 明胶指标 | 吸附前 | 吸附后 |
| 内毒素含量(EU/g) | 513 | 126 |
| 冻力(Bloom g) | 235 | 217 |
| 粘度(mPa·s) | 4.92 | 4.36 |
| 灰分(％) | 0.10 | 0.58 |
| 透射比(％)450nm/620nm | 87.3/94.8 | 85.6/93.1 |
| 羟脯氨酸含量(％) | 13.71 | 13.61 |
| 重金属含量以Pb计(mg/kg) | 0.022 | 0.036 |
在该工艺条件下，该吸附剂对中内毒素含量明胶中内毒素的脱除率为75.4％，冻力下降7.7％，粘度下降11.4％，灰分增加了0.48％。
表12吸附前后低内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
| 明胶指标 | 吸附前 | 吸附后 |
| 内毒素含量(EU/g) | 73 | 30 |
| 冻力(Bloom g) | 248 | 221 |
| 粘度(mPa·s) | 5.25 | 4.67 |
| 灰分(％) | 0.05 | 0.54 |
| 透射比(％)450nm/620nm | 91.3/96.8 | 89.6/93.6 |
| 羟脯氨酸含量(％) | 13.73 | 13.11 |
| 重金属含量以Pb计(mg/kg) | 0.020 | 0.036 |
在该工艺条件下，该吸附剂对低内毒素含量明胶中内毒素的脱除率为58.9％，冻力下降10.9％，粘度下降11.1％，灰分增加了0.49％。
实施例5：壳聚糖与精氨酸交联物为吸附剂吸附明胶中的内毒素
1)选用脱乙酰度≥90％的壳聚糖，在搅拌下，将按质量体积比3％将壳聚糖溶于2％乙酸溶液中，按壳聚糖与L-精氨酸质量比1:1加入L-精氨酸，继续搅拌0.5-1h至形成均一溶液，冷却至10℃。按照溶液总体积的5％，向10℃的壳聚糖及L-精氨酸混合溶液中加入浓度为20％的戊二醛溶液，慢速搅拌至壳聚糖与L精氨酸形成均匀的凝胶，在室温下继续交联12h。交联完毕后，冷冻干燥，得到壳聚糖与精氨酸交联物吸附剂。
2)将吸附剂在0.15M NaOH溶液中浸泡3h，进行去热原处理，用纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL)将吸附剂洗涤至中性，在无菌环境下干燥，粉碎。
3)将不同内毒素含量的明胶分别溶于60℃热水中，配制明胶溶液浓度为5％，溶胶用水为纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL，)调节溶液的pH为5.0；
4)步骤2)粉末状吸附剂加入上述明胶溶液中，吸附剂与明胶的质量比为1:10，明胶溶液温度为50℃，适度搅拌，吸附时间为60min，然后采用去热原的棉饼过滤，将吸附剂与明胶溶液分离；
5)冷冻挤胶，并进行冷冻干燥，得到脱除部分内毒素的明胶。
表13吸附前后高内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
| 明胶指标 | 吸附前 | 吸附后 |
| 内毒素含量(EU/g) | 24400 | 1896 |
| 冻力(Bloom g) | 220 | 213 |
| 粘度(mPa·s) | 4.86 | 4.54 |
| 灰分(％) | 0.15 | 0.35 |
| 透射比(％)450nm/620nm | 85.3/94.1 | 84.2/91.3 |
| 羟脯氨酸含量(％) | 13.63 | 13.45 |
| 重金属含量以Pb计(mg/kg) | 0.023 | 0.029 |
在该工艺条件下，该吸附剂对高内毒素含量明胶中内毒素的脱除率为92.2％，冻力下降3.2％，粘度下降6.6％，灰分增加0.20％。
表14吸附前后中内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
在该工艺条件下，该吸附剂对中内毒素含量明胶中内毒素的脱除率为82.7％，冻力下降2.6％，粘度下降6.3％，灰分增加了0.29％。
表15吸附前后低内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
| 明胶指标 | 吸附前 | 吸附后 |
| 内毒素含量(EU/g) | 73 | 15 |
| 冻力(Bloom g) | 248 | 236 |
| 粘度(mPa·s) | 5.25 | 5.01 |
| 灰分(％) | 0.05 | 0.26 |
| 透射比(％)450nm/620nm | 91.3/96.8 | 88.7/94.1 |
| 羟脯氨酸含量(％) | 13.73 | 13.67 |
| 重金属含量以Pb计(mg/kg) | 0.020 | 0.021 |
在该工艺条件下，该吸附剂对低内毒素含量明胶中内毒素的脱除率为68.5％，冻力下降4.8％，粘度下降4.6％，灰分增加了0.21％。
实施例6：壳聚糖与精氨酸交联物作为吸附剂吸附明胶中的内毒素
1)选用脱乙酰度≥90％的壳聚糖，在搅拌下，将按质量体积比1％将壳聚糖溶于2％乙酸溶液中，按壳聚糖与L-精氨酸质量比1:1加入L-精氨酸，继续搅拌0.5-1h至形成均一溶液，冷却至10℃。按照溶液总体积的5％，向10℃的壳聚糖及L-精氨酸混合溶液中加入浓度为20％的戊二醛溶液，慢速搅拌至壳聚糖与L-精氨酸形成均匀的凝胶，在室温下继续交联12h。交联完毕后，冷冻干燥，得到壳聚糖与精氨酸交联物吸附剂。
2)将吸附剂在0.15M NaOH溶液中浸泡3h，进行去热原处理，用纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL)将吸附剂洗涤至中性，在无菌环境下干燥，粉碎。
3)将不同内毒素含量的明胶分别溶于60℃热水中，配制明胶溶液浓度为5％，溶胶用水为纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL，)调节溶液的pH为5.0；
4)步骤2)粉末状吸附剂加入上述明胶溶液中，吸附剂与明胶的质量比为1:10，明胶溶液温度为50℃，适度搅拌，吸附时间为120min，然后采用去热原的棉饼过滤，将吸附剂与明胶溶液分离；
5)冷冻挤胶，并进行冷冻干燥，得到脱除部分内毒素的明胶。
表16吸附前后高内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
| 明胶指标 | 吸附前 | 吸附后 |
| 内毒素含量(EU/g) | 24400 | 2467 |
| 冻力(Bloom g) | 220 | 206 |
| 粘度(mPa·s) | 4.86 | 4.41 |
| 灰分(％) | 0.15 | 0.37 |
| 透射比(％)450nm/620nm | 85.3/94.1 | 83.4/92.3 |
| 羟脯氨酸含量(％) | 13.63 | 13.41 |
| 重金属含量以Pb计(mg/kg) | 0.023 | 0.029 |
在该工艺条件下，该吸附剂对高内毒素含量明胶中内毒素的脱除率为89.9％，冻力下降6.4％，粘度下降9.3％，灰分增加了0.22％。
表17吸附前后中内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
| 明胶指标 | 吸附前 | 吸附后 |
| 内毒素含量(EU/g) | 513 | 177 |
| 冻力(Bloom g) | 235 | 226 |
| 粘度(mPa·s) | 4.92 | 4.49 |
| 灰分(％) | 0.10 | 0.35 |
| 透射比(％)450nm/620nm | 87.3/94.8 | 86.9/92.1 |
| 羟脯氨酸含量(％) | 13.71 | 13.57 |
| 重金属含量以Pb计(mg/kg) | 0.022 | 0.026 |
在该工艺条件下，该吸附剂对中内毒素含量明胶中内毒素的脱除率为63.5％，冻力下降3.8％，粘度下降8.7％，灰分增加了0.25％。
表18吸附前后低内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
在该工艺条件下，该吸附剂对低内毒素含量明胶中内毒素的脱除率为57.5％，冻力下降6.9％，粘度下降9.3％，灰分增加了0.27％。
实施例7：吸附时间影响实验及吸附剂红外和热重数据分析
1)选用脱乙酰度≥90％的壳聚糖，在搅拌下，将按质量体积比2％将壳聚糖溶于2％乙酸溶液中，按壳聚糖与L-精氨酸质量比1:1加入L-精氨酸，继续搅拌0.5-1h至形成均一溶液，冷却至10℃。按照溶液总体积的5％，向10℃的壳聚糖及L-精氨酸混合溶液中加入浓度为20％的戊二醛溶液，慢速搅拌至壳聚糖与L精氨酸形成均匀的凝胶，在室温下继续交联12h。交联完毕后，冷冻干燥，得到壳聚糖与精氨酸交联物吸附剂。
2)将吸附剂在0.15M NaOH溶液中浸泡3h，进行去热原处理，用纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL)将吸附剂洗涤至中性，在无菌环境下干燥，粉碎。
3)将不同内毒素含量的明胶分别溶于60℃热水中，配制明胶溶液浓度为5％，溶胶用水为纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL，)调节溶液的pH为5.0；
4)步骤2)粉末状吸附剂加入上述明胶溶液中，吸附剂与明胶的质量比为1:10，明胶溶液温度为50℃，适度搅拌，吸附时间为30min、60min、90min和120min，然后采用去热原的棉饼过滤，将吸附剂与明胶溶液分离；
5)冷冻挤胶，并进行冷冻干燥，得到脱除部分内毒素的明胶。
表19吸附前后高内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
| 明胶指标 | 吸附前 | 吸附30min | 吸附60min | 吸附90min | 吸附120min |
| 内毒素含量(EU/g) | 24400 | 12550 | 3459 | 1036 | 1024 |
| 冻力(Bloom g) | 220 | 219 | 216 | 214 | 212 |
| 粘度(mPa·s) | 4.86 | 4.79 | 4.70 | 4.56 | 4.44 |
| 灰分(％) | 0.15 | 0.24 | 0.30 | 0.36 | 0.39 |
表20吸附前后中内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
表21吸附前后低内毒素含量明胶的各项检测指标如下：
| 明胶指标 | 吸附前 | 吸附30min | 吸附60min | 吸附90min | 吸附120min |
| 内毒素含量(EU/g) | 73 | 50 | 23 | 15 | 11 |
| 冻力(Bloom g) | 248 | 242 | 234 | 227 | 225 |
| 粘度(mPa·s) | 5.25 | 5.19 | 4.93 | 4.80 | 4.66 |
| 灰分(％) | 0.05 | 0.16 | 0.25 | 0.30 | 0.35 |
红外和热重数据分析：
(1)吸附剂的红外光谱见图1。在FT-IR图中，壳聚糖的红外谱图：2870cm-1的弱吸收峰对应-CH-的伸缩振动；1595cm-1、1150cm-1为伯氨(-NH2)弯曲振动峰和吡喃环上C-O-C的非对称伸缩振动峰。精氨酸的红外谱图：胍基的峰在1620cm-1附近，1420cm-1和1130cm-1的吸收峰分别对应于COO-的对称弯曲、C-C-N的不对称弯曲振动。壳聚糖精氨酸交联物中-CH2的特征吸收峰蓝移至2930cm-1，由于壳聚糖交联精氨酸后增加了亚甲基基团的比例。1620cm-1处的峰为精氨酸中胍基的特征峰，1520cm-1处的新峰很是连接壳聚糖和精氨酸酰胺键产生的。红外数据分析表明，精氨酸已成功负载在壳聚糖表面。
(2)吸附剂的热重分析，见图2。
图2是壳聚糖、精氨酸、戊二醛交联壳聚糖和壳聚糖与精氨酸交联物热重分析图。目的研究吸附剂的热稳定性，该吸附剂与原料均有失重台阶。壳聚糖原料大致分为两个失重阶段：第一次失重在200℃以下，这部分重量下降大部分是材料表面吸附缔合水的挥发引起，失重质量为6.5％；200-450℃发生第二次失重，失重44.2％，归因于壳聚糖上的多糖环分解，超过450℃，壳聚糖材料发生碳化。精氨酸在0-800℃内的失重接近100％，第一次失重在200℃以下，失去的是材料表面吸附缔合水，失重4.5％；第二次失重在200-400℃，失重75.5％。壳聚糖精氨酸交联物也同样发生了两次失重，第一次失重在200℃以下，失去的是材料表面吸附缔合水，失重11.5％；第二次失重在200-400℃，失重70.8％，这一阶段主要是Schiff碱双键发生了断裂和分解；壳聚糖精氨酸交联物主要由壳聚糖和精氨酸组成，这一阶段质量下降可归因于壳聚糖上的多糖环分解和精氨酸链的分解；超过400℃，壳聚糖精氨酸交联物发生碳化。壳聚糖精氨酸交联物整体失重的百分比大于壳聚糖原材料，说明精氨酸已经交联到壳聚糖上。热重分析也表明该吸附剂的热稳定性较好。
实施例8：动态吸附实验
1)将实施例7步骤1)制备的吸附剂在0.15M NaOH中浸泡3h，进行去热原处理，用纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL)将吸附剂洗涤至中性，在无菌环境下干燥，粉碎。
2)将吸附剂浸泡在纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL)中，充分吸水溶胀，然后转移至吸附柱中，并通过吸附柱的外层循环水使柱内温度保持为50℃。
3)将明胶溶于60℃热水中，配制明胶溶液浓度为5％，溶胶用水为纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL)待明胶充分溶解后降温至50℃，调节溶液的pH为5.0。
4)将明胶溶液不断注入恒温吸附柱中，待流出液的内毒素浓度小于0.5EU/mL时，收集流出的明胶溶液。待内毒素浓度高于0.5EU/mL时，停止接收。
5)冷冻挤胶，并进行冷冻干燥，得到脱除部分内毒素的明胶。
表22吸附前后明胶的各项检测指标如下：
| 明胶指标 | 吸附前 | 吸附后 |
| 内毒素含量(EU/g) | 73 | 6 |
| 冻力(Bloom g) | 248 | 238 |
| 粘度(mPa·s) | 5.25 | 5.05 |
| 灰分(％) | 0.05 | 0.29 |
| 透射比(％)450nm/620nm | 91.3/96.8 | 89.3/94.2 |
| 羟脯氨酸含量(％) | 13.73 | 13.6 |
| 重金属含量以Pb计(mg/kg) | 0.020 | 0.024 |
在该工艺条件下，该吸附剂对低内毒素含量明胶中内毒素的脱除率为91.8％，冻力下降4.0％％，粘度下降3.8％，灰分增加0.24％。
实施例9：壳聚糖与组氨酸交联物吸附剂以及壳聚糖与赖氨酸交联物吸附剂吸附明胶中的内毒素
1)选用脱乙酰度≥90％的壳聚糖，在搅拌下，将按质量体积比3％将壳聚糖溶于2％乙酸溶液中，按壳聚糖与组氨酸(赖氨酸)质量比1:1加入组氨酸(赖氨酸)，继续搅拌0.5-1h至形成均一溶液，冷却至10℃。按照溶液总体积的5％，向10℃的壳聚糖及组氨酸(赖氨酸)混合溶液中加入浓度为20％的戊二醛溶液，慢速搅拌至壳聚糖与组氨酸(赖氨酸)形成均匀的凝胶，在室温下继续交联12h。交联完毕后，冷冻干燥，得到壳聚糖与组氨酸交联物吸附剂和壳聚糖与赖氨酸交联物吸附剂。
2)将吸附剂在0.15M NaOH溶液中中浸泡3h，进行去热原处理，用纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL)将吸附剂洗涤至中性，在无菌环境下干燥，粉碎。
3)将不同内毒素含量的明胶分别溶于60℃热水中，配制明胶溶液浓度为5％，溶胶用水为纯水(内毒素含量低于0.05EU/mL，)调节溶液的pH为5.0；
4)将步骤2)粉末状吸附剂加入上述明胶溶液中，吸附剂与明胶的质量比为1:10，明胶溶液温度为50℃，适度搅拌，吸附时间为60min，然后采用去热原的棉饼过滤，将吸附剂与明胶溶液分离；
5)冷冻挤胶，并进行冷冻干燥，得到脱除部分内毒素的明胶。
表23吸附结果检测如下：
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (10)
1.壳聚糖或其衍生物在脱除明胶中内毒素的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述明胶中内毒素的含量为50～100000EU/g。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述壳聚糖或其衍生物为壳聚糖、交联壳聚糖、或壳聚糖与多氨基配体交联物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述壳聚糖为脱乙酰度≥70％的壳聚糖；优选的，所述交联壳聚糖为采用戊二醛、环氧氯丙烷或1,4-丁二醇二缩水甘油醚作为交联剂制成；优选的，所述壳聚糖与多氨基配体交联物为采用戊二醛、环氧氯丙烷或1,4-丁二醇二缩水甘油醚作为交联剂，采用精氨酸、组氨酸、赖氨酸、聚ε-赖氨酸、多粘菌素B或者其他带游离氨基的化合物作为多氨基配体制成。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括：
(1)将壳聚糖或其衍生物在碱液中浸泡2～4h，然后用纯水洗涤至中性，在无菌环境下干燥，粉碎，获得去热原处理的壳聚糖或其衍生物；
(2)将明胶原料溶于50～70℃热水中，配制质量浓度为2～10％的明胶溶液，溶胶用水为纯水，调节明胶溶液的pH为4.0～6.5；
(3)将去热原处理的壳聚糖或其衍生物加入到所述明胶溶液中，壳聚糖或其衍生物与明胶原料的质量比为1:1～20，吸附温度为40～60℃，吸附时间为30～240min，然后采用过滤介质或离心分离的方式将壳聚糖或其衍生物与明胶溶液分离，获得脱除内毒素的明胶溶液；任选的，吸附过程中进行搅拌；
或，
将去热原处理的壳聚糖或其衍生物填装到吸附柱中，通过动态吸附的方式，使明胶溶液通过吸附柱，获得脱除内毒素的明胶溶液；
(4)将脱除内毒素的明胶溶液浓缩，至胶液浓度达到25％以上；
(5)对浓缩胶液进行闪蒸灭菌；
(6)冷冻挤胶，并进行干燥，即得。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述碱液为氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液，浓度为0.1～0.3M。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述过滤介质为棉饼、滤纸或硅藻土过滤纸板。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，吸附柱内温度为40～60℃；优选的，吸附柱中壳聚糖或其衍生物的用量根据流出液中内毒素浓度进行调整，至流出液中内毒素含量低于0.5EU/mL。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，明胶溶液浓缩方式采用三效蒸发。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述干燥为冷冻干燥或热风干燥；步骤(6)中，所述干燥为冷冻干燥或者长网干燥。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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