HU200194B - Process for removal of pertussis endotoxin - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás pertussis endotoxin eltávolítására és endotoxinmentes pertassis toxoid előállítására.

A pertussis a Bordetella pertussis által okozott csecsemők és kisgyermekek körében súlyos lefolyású fertőző betegség.

A betegség megelőzésére vakcinát alkalmaznak. Az olyan vakcinák azonban, amelyeket a teljes B. pertussis sejt felhasználásával készítenek, erős mellékhatásokat, például lázat okoznak. Amellékhatások kiküszöbölése céljából sejtmentes pertussis vakcinát (ACP vakcina) fejlesztettek ki, amely lényegében véve endotoxin ÓÉT) mentes. Az endotoxin felelős a lázárt és egyéb mellékreakciókért. Az endotoxinmentes vakcinát úgy készítik, hogy elválasztják a fertőzésellenes frakciót (a továbbiakban a helyenként védőfrakciónak nevezzük), úgymint a rostos hemaglutinint (FHA), a pertussis toxint (PT) és a rostokat.

Az ACP vakcina előállításának legfontosabb lépése az endotoxin elválasztása a fertőzésellenes frakciótól, amelyet rendszerint szacharóz-gradiens centrifugálással végeznek (57-50925. sz. közzétett japán szabadalmi leírás, amely megfelel a 47802. sz. közzétett európai szabadalmi leírásnak).

Ezenkívül ismeretes, hogy a pirogén anyagok elválasztására kalcium-foszfát-géles módszert alkalmaznak (34-2549. sz. közzétett japán szabadalmi leírás). Ismeretes továbbá, hogy a hidroxil-apatit-gél, a kalcium-foszfát-gél stabilizált formája, alkalmas a rostos hemaglutinin elválasztására a pertussis toxintól, továbbá, hogy az endotoxin-mentes hemaglutinin elválasztható a pertussis toxintól hidroxil-apatit-gélen végzett kromatográfiával, majd affinítás-kromatográfiával végzett tisztítással és a szacharóz-gradiens centrifugálással. (Japanese Journal of Bacteriolögy, 22(1),423,1983).

Az önmagánban végzett szacharóz gradiens centrifugálás az endotoxinnak körülbelül 99,995%-a eltávolítására alkalmas, de mivel a nyers, fertőzésellenes frakciót tartalmazó folyadék endotoxinban gazdag, nehéz elérni a védőfrakció teljes megtisztítását az endotoxintól, és ennek megfelelően a védőfrakció kihozatala nem elég magas. Továbbá mivel a termelő térfogat kicsi és nagy a költség és időráfordítás, a módszer nem megfelelő kereskedelmi mennyiségű oltóanyag előállítására.

Másrészt a csupán kalcium-foszfát-géllel végzett kezelés az endotoxinnak körülbelül csak 90-99,9%a eltávolítását biztosítja, így nem megfelelő gyakorlati célokra. Laboratóriumi körülmények között a rostos hemaglutinin eléggé endotoxinmentesen elválasztható és megtisztítható a pertussis toxintól történő elválasztás során, ha hidroxil-apatit- oszlopkromatográfiával, affinitás kromatográfiával és szacharóz-gradiens centrifugálással kombináljuk, a módszer azonban kereskedelmi mennyiségű oltóanyagtermelésre nem alkalmazható.

Kísérleteink során úgy találtuk, hogy a szacharóz gradiens cenbifugálást megelőzően kalcium-foszfátgélt képzünk a folyadékban, a védőfrakció nagyon élesen elválasztható az endotoxintól, és emellett javul a térfogatkihozatal és jelentősen javul az endotoxin elválasztásának aránya az önmagában végzett szacharóz sűrűség centrifugáláshoz képest.

A találmány tárgya tehát egyrészt eljárás endoto2 xin eltávolítására Bordetella pertussis I fázisú törzs endotoxinját és fertőzés elleni frakcióját tartalmazó folyadékból zónacentrifugálással oly módon, hogy a zőnacentrifugálás előtt a folyadékban fokozatosan 4 *C és szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten, 6,5 és 9 közötti pH-értéken 0,01-1 milliekv/ml kalciumfoszfát-gél csapadékot képezünk a foszfátionok ekvivalenseinek 1,25-30-szoros fölöslegével a kalciumionok ekvivalenseire számítva, és a kapott csapadékot elkülönítjük, másrészt eljárás pertussis toxoid előállítására oly módon, hogy a fenti módon kapott fertőzés elleni frakciót tartalmazó folyadékot toxinmentesítjük, és olyan pertussis toxoidot nyerünk, amelynek endotoxin tartalma 10 gg protein-nitrogénra vonatkoztatva kevesebb, mint 0,5 ng.

A pertussis endotoxin eltávolítása a találmány szerinti módon lehetővé teszi, hogy a fertőzés ellenes frakciót biztosabban és élesebben válasszuk el az endotoxintól úgy, hogy a védőfrakció könnyebben és jobb kihozatallal nyerhető. Ezenkívül, mivel a zónacentrifugálással nagy térfogatú kiinduló anyag dolgozható fel, a pertussis toxoid kinyerése megduplázható hatékony endotoxin eltávolítás mellett. így a találmány ipari szempontból is értékes.

Azonkívül a találmány szerinti eljárással kapott pertussis toxoid endotoxin tartalma kevesebb, mint tizedrésze a jelenleg forgalomban levő toxoidokénak, így a találmány szerinti eljárással előállított pertussis toxoid alkalmas olyan vakcinák előállítására, amelyeknek immunológiai hatékonysága azonos az ismert vakcinákéval, toxicitása azonban kisebb.

Az említett, Bordetella pertussis I fázisú törzs fertőzésellenes frakcióját és endotoxinját tartalmazó folyadék például a B. pertussis I fázisú törzs tenyésztésével kapott tenyészközeg vagy ennek koncentrátuma lehet, a koncentrátum különösen előnyös. A Bordetella pertussis I fázisú törzs tenyésztése a szokásos módon történhet így például a mikroorganizmust tenyészközegen (példád Cohen-Wheeler vagy StainerScholte közegen) körülbelül 35-37 *C-on, körülbelül

5-7 napig tenyésztjük. Az így kapott fermentlé felülúszóját például szűréssel vagy centrifugálással összegyűjtjük. Afelülúszót közvetlenül vagy betöményítés után alkalmazhatjuk a következő lépésben az endotoxin eltávolítására. A betöményítést az ismert kisózási módszerrel végezhetjük. Például eljárhatunk úgy, hogy 2-5 kg ammónium-szulfátot adagolunk, minden 101 fermentlé felülúszójához, és a kapottesapadékot például szűréssel vagy centrifugálással elválasztjuk. A csapadékot alkalmas mennyiségű 1 mól/1 nátrium-klorid - 0,05 mól/1 foszfát-pufferben feloldjuk, és az oldatot centrifugáljuk, vagy más módon elválasztjuk a felülúszót

A találmány szerinti eljárással az endotoxin elválasztását úgy végezzük, hogy a Bordetella pertussis I fázisú törzs fertőzés elleni frakcióját és endotoxinját tartalmazó folyadékban fölösleges mennyiségű foszfátion jelenlétében kalcium-foszfát-gél csapadékot képezünk, a kapott csakadékot elkülönítjük, és a folyadékfázist zónacentrifugálásnak vetjük alá.

Ha a folyadékban foszfátion nincs jelen, akkor a folyadékhoz foszfátpuffert, például 1 mól/1 nátriumkloriddal kiegészített 0,05 mól/l-es foszfát-puffért adunk, majd kalciumionnal egészítjük ki. Kalciumion-forrásként bármely oldható kalciumsőt alkalmaz-1HU 200 hatunk, mint például kalcium-acetátot, kalcium-kloridot, kalcium-nitrátot, stb. vagy oldhatatlan kalciumsókat, mint például kalcium-foszfátot stb. Ezek közül a kalcium-acetát és a kalcium-klorid előnyös.

A foszfátion aránya a kalciumionhoz viszonyítva körülbelül 1/25-30ekvivalens,előnyösen 1,5-7,5 ekvivalens, és célszerű biztosítani, hogy körülbelül 0,01-0,1 milliekvivalens/ml, előnyösen 0,02-0,7 milliekvivalens/ml kalcium-foszfát-gél képződjön.

A tipikus eljárás a következő: feltételezve, hogy a Boidetella pertussis I fázisú törzs fermen tlevének felülúszóját ammónium-szulfáttal végzett frakcionált kicsapással kezeltük, a csapadékot 1 mól/1 nátriumklorid — 0,05 móÚI-es foszfát-pufferben oldjuk, annyi kalcium-acetátot adagolunk, hogy a végső koncentráció 0,1-1,0 tömeg/térfogat%, előnyösen 0,20,6 tömeg/térfogat% és pH 63-9 érték legyen, az elegyet 20 perc és 2 óra közötti időtartam alatt hagyjuk fokozatosan 4 ’C-ról szobahőmérsékletre melegedni, ez alatt kalcium-foszfát-gél képződik. Ezután a kialakult csapadékot ismert módon, például szűréssel vagy centrifiigálással eltávolítjuk. Ezzel a módszerrel az endotoxinnak körülbelül 90-99,9%-a szelektíven eltávolítható anélkül, hogy a védőfrakcióban észrevehető veszteség keletkezne.

A fenti módon kapott fél-nyers terméket további zónacentriftigálásnak vetjük alá, előnyösen további ammónium-szulfátos töményftés (frakcionált kicsapás) után.

A zónacentrifugálás lehet szacharóz gradiens centrifugálás, kálium-tartarát sűrűség centrifugális, cézium-klorid gradiens centrifugálás stb, ezek közül a szacharóz gradiens centrifugálás az előnyös. A szacharóz gradiens centrifugálás szokásos körülményei a következők: sűrűség gradiens: 0-30 tömeg%; R max: körülbelül 60.000-122.000 G; idő: körülbelül 10-14 óra.

A fenti módon kapott, pertussis fertőzés ellenes frakciót tartalmazó folyadékot úgy toxinmentesítjük, hogy formaldehiddel, glutáraldehiddel, piruvaldehiddel kezeljük, majd a formaldehid, glutáraldehid, piruvaldehid stb. fölöslegét ismert módon, például dialízissel, centrifiigálással vagy ultracentrifugálással stb. eltávolítjuk, így a pertussis toxoidot kapjuk. A toxinmentesítést előnyösen például az 57-50925. sz. közzétett japán szabadalmi leírásban ismertetett módon végezzük úgy, hogy a pertussis exotoxint tartalmazó folyadékhoz formaldehidet adunk körülbelül 0,1-0,6 térfogat% koncentrációban, olyan körülmények között, hogy bázisos aminosavak (például L-lizin, glicin stb.) lényegében ne legyenek jelen (azaz mennyiségük kevesebb, mint 10 mmól/1 legyen), a kapott elegyet32-42 ’C-on körülbelül 3-14 napig inkubáljuk, a ílokulált toxoidot alkalmas módon (például körülbelül 10-50 kilociklusos ultrahangos kezeléssel) megtörjük, és alkalmas vizes közegben (például 1/100-1/250 mól/1 foszfát-pufferes sóoldatban) szuszpendáljuk, így a toxoid folyadékot kapjuk.

A találmány szerinti eljárással olyan pertussis toxoidot lehet előállítani, amelynek endotoxin tartalma 10 gg protein-nitrogénre vonatkoztatva nem több, mint 03 ng, előnyösen nem több, mint 0,1 ng, limulusz-lizát'im teszt segítségével meghatározva. Más szóval az endotoxin eltávolításának aránya 99,9994%, előnyösen 99,9998% arányra javítható.

A találmány szerinti eljárással előállított pertussis toxoid csapadékos pertussis vakcina vagy csapadékos pertussis-diftéria-tetanusz kombinált vakcina előállítására alkalmazható.

Az 1. és 2. ábra a kalcium-foszfát-gél és kontroll minták szacharóz gradiens centrifugálási profilját mutatja.

A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül

A következő példákban a referencia példákban ismertetett eljárásokban alkalmazott Boidetella pertussis Tohama I fázisú törzs tulajdonságait például az Infection and Immunity, &, 899 (1972) helyen ismertetik. A törzset a National Institute of Health, Tokió, Japán (NIHJ) intézetnél tartják fenn, és 1980. augusztus 13-a óta letétbe van helyezve az Institute of Fermenlation, Osaka, Japán intézetnél IFO14073 szám alatt.

1. referencia példa boidet-Gengou tápközeget, amely burgonyából, peptonból, nátrium-kloridból agaiból és borjúvérből készült, beoltunk Boidetella pertussis Tohama I fázisú törzzsel (IFO 14073) és 2 napig 35 ’C-on inkubáljuk. Ezután az áttetsző kerek kolóniákat Kaglutinin antitest reakcióval vizsgáljuk, s a pozitívan reagáló kolóniákat visszaoltjuk Bordet-Gengou tápközegbe oltótenyészet előállítása céljából. Az oltótenyészetet Cohen-Wheeler folyékony tápközegbe visszük át, és 1 napig 35 ’C-on inkubáljuk. A kapott baktérium szuszpenziót Stainer-Scholte folyékony tápközeghez adjuk 1 billió sejt/ml végkoncentrációban, és Rouxpalackban 5 napig 35 ’C-on inkubáljuk. A fermentlevét összegyűjtjük, és a felülúszóhoz körülbelül 20 tö meg/térfogat% ammónium-szulfátot adunk. Alapos keverés után az elegyet 4 ’C-on állni hagyjuk. 14 nap múlva az elegyet centrifugáljuk, a felülúszót eldobjuk, és az üledéket összegyűjtjük. Ezután az üledékhez az összegyűjtött folyadék tizedrészének megfelelő mennyiségű 1 mól/1 nátrium-klorid — 0,05 mól/1 foszfát-puffért adunk (pH= 8,0), és az elegyet alaposan elkeverjük, és 4 napig 4 ’C-on állni hagyjuk. Ezután az elegyet újra centrifugáljuk, és a felülúszót (I extraktum) összegyűjtjük. Ez az első extraktum védőfrakcióban gazdag, rostos hemaglutinint (FHA) és pertussis toxint (PT), valamint endotoxint tartalmaz, azonban sejtmentes.

Az első extraktum aliquot mintáihoz fokozatosan kalcium-acetátot adunk a következő végső koncentrációkig: 0,0,2,0,4,0,6,0,8 és 1,0 tömeg/térfogat%. Az elegyeket szobahőmérsékleten líóra hosszat óvatosan keveijük, majd a kapott csapadékot szűrőpapíron leszűijük. A kapott felülúszókat hemaglutinin (HA) titerre PT-tartalomra és ET tartalomra vizsgáljuk. Az eredményeket az I. táblázat tartalmazza APTtartalmat ELIS A módszerrel, az ET-taitalmat limulus lizát módszerrel (Mallinckrodt kit) határozzuk meg, standardként E. coli endotoxint alkalmazva (Difco 055-B5).

Az I. táblázatból látható, hogy az ET szelektíven eltávolítható úgy, hogy az oldathoz kalciumsót adunk fölösleges mennyiségű foszfátion jelenlétében, és a csapadékot eldobjuk. Ezenkívül 0,2-0,6 tömeg/térfogat% kalcium-acetát adago91ásával az endotoxinnak körülbelül 99%-a távolítható el anélkül, hogy a vé3

-2HU 200 dőfrakcióban (HA-titer és PT-tartalom) a veszteség növekedne.

I. táblázat

Adagolt endotoxin-endotoxin HA- PTkalcium- tartalom eltávolítás tifer tartalom

-acetát (%) (töm/térf.

%) (ng/ml) (%) (Hau/rnl) (Eu/ml)

0	87800	—	1200	1220
05	1043	985	1100	1140
0,4	960	98,9	1400	1400
0,6	720	99,2	1200	1080
0,8	78	99,9	400	1210
1,0	<20	>99,9	<200	1031

HA-titer főleg a FHA-tartalomra utal

2. referencia példa

Az Preferencia példa szerinti módon járunk el, azzal az eltéréssel, hogy a pH-t 5,0 és 10,0 érték között változtatjuk nátrium-hidroxid, ill. sósav segítségével, és az adagolt kalcium-acetát mennyisége 05 tömeg/térfogat%. Az eredményeket a II. táblázat mutatja.

6,0 pH értéktől gélesedés kezdődik és az endotoxin eltávolítása a pH emelkedésével fokozódik. ΑΠ. táblázatból látható, hogy az optimális pH érték 7-9.

Π. táblázat pH endotoxin-endotoxin Ha-titer tartalom eltávolítás (%) mértéke (ng/ml) (%) (HAu/ml)

kezelés előtt	334000		3000
5,0	195000	41,6	2700
6,0	108000	67,7	3000
65	53000	84,1	3000
7,0	24000	92,8	3000
8,0	22000	93,4	3200
9,0	18000	94,6	3000
10,0	268000	19,8	3000

3. referencia példa

A 2. referencia példa szerinti módon járunk el, azzal az eltéréssel, hogy 0,5 tömeg/térfogat% kalciumacetát helyett 5 tömeg/térfogat% hidroxilapatitot (BDH) használunk. Az eredményeket a ΠΙ. táblázat mutatja.

AIII. táblázatból látható, hogy az oldatban a kalcium-foszfát-gél képzésére adagolt kalcium-acetáttal ellentétben a hidroxil-apatit adagolása kevésbé hatékonyan távolítja el az endotoxint, és a fenti pH-függés megfordul.

ΠΙ. táblázat

PH	endotoxin-endotoxin tartalom eltávolítás	Ha-titsr (HAu/ml)
(%) (ng/ml)	mértéke (%)
kezelés előtt	334000	—	3000
6,0	160000	52,1	3000
7,0	195000	41,6	3000
8,0	264000	21,0	3000
9,0	294000	12,0	3000

1. példa

Az 1. referencia példa szerinti módon kapott I extraktumokat (kontrollcsoport) és az I extraktum 05 tömeg/térfogat% kalcium-acetáttal az 1. referencia példa szerinti módon történt kezelése után kapott anyagot azonos térfogatú telített vizes ammónium-szulfáttal keverjük, és az elegyet 4 ’C-on 7 napig állni hagyjuk. Az ammónium-szulfáttal kicsapott anyagot 10000 fordulat/perc sebességgel 20 percig centrifugáljuk, és az üledéket összegyűjtjük. Ezután az oldat téfogatára számítva 1/300 térfogatnyi 1 mól/1 nátrium-klcrid—0,05 mól/1 foszfát puffért (pH= 8,0) adagolunk. Alapos elkeverés után az elegyet 1 mól/l-es nátrium-klorid oldattal (pH= 8,0) szemben dializáljuk. A dializátumot szacharóz gradiens centrifugálásnak vetjük alá a következő feltételek mellett: szacharóz sűrűség grádiens» 1-30 tömeg%, R max= 69400 G, idő= kb. 18 óra. A kalcium-foszfát-géles töltet mennyiségét megduplázzuk a kontroliéhoz képest. Centrifugálás után 34 tömeg% szacharóz oldatot töltünk a rotorba a frakcionálás érdekében. Az így kapott frakciókat vizsgáltuk FHA tartalomra ELISAmódszerrel és PT és ET-tartalomra az 1. referencia példaszerinti módon. Az eredményeket az l.és 2. ábra mutatja. Az ábrán a FHA-, PT- és NT-tartalmat Ο-, -Δ- és -v- jellel jelöltük.

Az 1. és 2. ábrából kitűnik, hogy annak ellenére, hogy a kalcium-foszfát-géles töltet mennyiségét megdupláztuk, a védőfrakció (FHA, PT) elválasztása az endotoxintól sokkal élesebb, mint a kontroliminták esetén.

A kalcium-foszfát-géles minták és a kontrollminták esetén a FHA-ben gazdag és ET-ben változó rakétákatösszegyűjtjük, és protein-nitrogén-tartalmakat körülbelül 50 pg/ml értékre állítjuk be. Ehhez 0,02 tömeg/térfogat% zselatint, 0,05 tömeg/térfogat% Tween 80-at és 0,4 térfogat% formaldehidet adagolunk, és az elegyet 39 ’C-on néhány napig inkubáljuk. A kapott toxoidos folyadékot dializáljuk, és meghatározzuk az ET-tartalmaL Az eredményt a IV. tábláuzat mutatja. Az ET-tartalmat limulus lizátum módszenei határozzuk meg (Wako Pure Chemical kit), standardként E. coli endotoxint alkalmazunk (Difco 055-B5).

AIV táblázatból látható, hogy a vakcinaként alkalmazható pertussis toxoid törzsoldat (protein-nitrogén-tartalom 10 pgAnl) ET tartalmával összehasonlítva a kalcium-foszfát-géles minta ET-tartalma kevesebb mint 1/40-ed részére csökken. Akontrollmintákban.

-3HU 200

8

IV TÁBLÁZAT

Kísérlet	foszfát minták endotoxin tartalom	foszfát minták endotoxin eltávolítás	kontroll minták endotoxin tartalom	kontroll minták endotoxin eltávolítás
1.	0,3 ng/ml (0,06 ng/ml)	99,99994%	19,0 ng/ml (3,8 ng/ml)	99,99591%
2.	0,3 ng/ml (0,06 ng/ml)	99,99988%	12,8 ng/ml (2,6 ng/ml)	99,999458%

A zárójelben megadott értékek a 10 mg/ml protein-nitrogénre vonatkoztatott endotoxin-tartalmat mutatják

2. példa

Levine eredeti módszere szerint (Reo Levine, Joseph L. Stone and Louise Wyman: Factors affecting the efficiency of the alumínium adjuvant in diphtheria and tetanus toxoids. J. Immunology 75.301-307, 1955) két adott pertussis toxoid törzsoldatot 1/250 mól/1 foszfát-pufferes sóoldattal (pH= 7,0) hígítunk, így a protein-nitrogén-tartalom 10 gg/ml lesz, majd alumínium-kloridot adagolunk 0,18 tömeg/térfogat% végső koncentrációhoz. Az elegyet jól elkeverjük, és a pH-ját sósavval vagy nátrium-hidroxiddal 7,0 értékre álútjuk így 03 mg/1 alumíniumon adsztxbeált vakcinát állítunk elő.

A vakcina fő tulajdonságai a következők: pH= 7,0, nyúl-pirogemtás: negatív; egér tömegcsökkenés: 10 B WD-egység/ml vagy ennél kevesebb; egér leukocita fokozódás: 0,5 LP-egység/ml vagy kevesebb; egér hisztamin érzékenység: 0,8 HS-egység/ml vagy kevesebb; pertussis toxoid aktivitás: 8 nemzetközi egység/ml vagy több. Tehát mindkét adat kielégíti a Standard of Biological products helyen meghatározott standard értékeket.

Claims (4)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás endotoxin eltávolítására Bordetella pertussis I fázisú törzs fertőzés elleni fralcbiójátés endotoxint tartalmazó folyadékból zónacentrifugálással, aszal jellemesve, hogy a zónacentrifugálás előtt a folyadékban 4 ’C és szobahőmérséklet közötti hőmér15 sékleten 63 és 9 közötti pH-értéken 0,01-0,1 miUimólekvivalens/ml kalcium-foszfát-gél csapadékot képezünk fokozatosan — mimellett a foszfátionok 135-30-szoros mólekvivalens fölöslegben vannak a kalciumionokhoz viszonyítva — majd a kapott csa20 padékot elkülönítjük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kalciumionra vonatkoztatva 1,5-73 mólekvivalens foszfátiont alkalmazunk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal iellemez25 xftiJiogy kalciumion-forrásként kalcium-acetátot vagy kalcium-ldoridot alkalmazunk.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás áztál jellemezve, hogy csapadékként 0,02-0,07 millimólekvivalens/ml kalcium-foszfát-gélt képezünk.

   30 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a csapadékot fokozatosan, a hőmérsékletnek 4 ’C-ról szobahőmérsékletre és a pH-értéknek 6,5-ről 9 értékre történő emelésével, 20 perc és 2 óra közötti idő alatt képezzük

   35 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kalcium-foszfát-gélt úgy képezzük, hogy Bordetella pertussis I fázisú törzs fermentlevének felülúszójából ammónium-szulfátos frakcionált kicsapással kapott csapadékot 1 mól/1 nátrium-klorid —

   40 0,05 mól/1 foszfát puffeirel oldjuk, majd kalciumacetátot adagolunk 0,1-1,0 tömeg/térfogat% végső koncentrációig 63-9 pH értéknél, és a kapott elegyet 20 perc és 2óra közötti idő alatt 4 ’C-ról szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni.

   45 7. A 6. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kalcium-acetát végső koncentrációját 03 és 0,6 tömeg/térfogat% közötti értékre állítjuk be.