RU2627467C1 - Способ изготовления комплексного антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллёзом животных - Google Patents
Способ изготовления комплексного антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллёзом животных Download PDFInfo
- Publication number
- RU2627467C1 RU2627467C1 RU2016103567A RU2016103567A RU2627467C1 RU 2627467 C1 RU2627467 C1 RU 2627467C1 RU 2016103567 A RU2016103567 A RU 2016103567A RU 2016103567 A RU2016103567 A RU 2016103567A RU 2627467 C1 RU2627467 C1 RU 2627467C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- brucellosis
- brucella
- antigen
- differential diagnosis
- centrifugation
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использовано для получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных. Для этого проводят экстракцию липополисахаридов бруцелл вида Brucella abortus и Brucella melitensis, для чего их берут в равном соотношении. Обрабатывают 2%-ным раствором уксусной кислоты в присутствии 10% NaCl при автоклавировании, затем отделяют экстракт центрифугированием, фракционируют супернатант спиртом с последующим диализом и выделяют О-полисахарид центрифугированием. Использование данного способа позволяет получить комплексный антиген, содержащий О-полисахаридный М- и А-антигены, при этом включение в комплекс М-компонента значительно повышает чувствительность реакции иммунодиффузии при диагностике бруцеллеза, вызываемого B. Melitensis. 1 пр.
Description
Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии и иммунологии, в частности к способу выделения О-цепи полисахаридов бруцелл из штаммов Br.abortus 19 и Br.melitensis 16М, используется в иммунологии, диагностике в т.ч. дифференциальной диагностике вакцинированных и больных бруцеллезом животных.
Известен способ получения частично очищенных О-ПС (K. Nielsen, J. Cherwonogrodzky et al., 1989), включающий автоклавирование бактериальных клеток в 2%-ной уксусной кислоте с 10%-ным раствором хлористого натрия в течение 1 часа при 120°С. Осадок растворяли в 1%-ном растворе уксуснокислого натрия и подвергали ферментативному перевариванию дезоксирибонуклеазой, рибонуклеазой и протеиназой.
После ферментативного переваривания проводили ультрацентрифугирование при 100000 об/мин в течение 18 часов. Затем супернатантный раствор подвергали фенольно-водной экстракции при 22°С, и фенольный слой отбирали и диализировали против 1%-ного раствора ацетата натрия. Окончательную очистку осуществляли на колонке с гелем Сефадекса.
К недостаткам способа можно отнести его трудоемкость, сложность и длительность.
Известен способ получения противобруцеллезного антигенного иммуноферментного конъюгата (ИФК) для дифференциальной диагностики больных бруцеллезом животных от вакцинированных, характеризующийся тем, что вирулентный штамм бруцелл вида В. abortus 54 инактивируют гамма-лучами 60Со в дозе 3,0-3,5×104 Гр, лизируют в растворе, приготовленном на 0,062-0,125 М трис HCL-буфере, рН 6,8, содержащем 2-5% додецилсульфата натрия и 5% меркаптоэтанола, наносят пробы в лунки концентрирующего геля в количестве 50-100 мкг по белку, проводят электрофорез при силе тока 40 мА на две пластины геля до вхождения красителя в гель и затем при силе тока 80 мА на две пластины 3-3,5 ч, фиксируют пластины в растворе, содержащем 40% изопропилового спирта и 10% уксусной кислоты в течение 1 ч, окрашивают в 0,1%-ном растворе "кумасси" бриллиантовым голубым R-250, затем фракции полипептидов окрашивают серебром с использованием раствора формальдегида, денситометрируют пластины геля на сканере SHARP-330Y х в проходящем свете, определяют молекулярную массу и иммунологическую компетентность фракций методом иммуноблотинга, полипептидную антигенную фракцию вирулентного штамма бруцелл В. abortus 54 с молекулярной массой 41,8 кДа конъюгируют с ферментной меткой - пероксидазой хрена из расчета 1 мг белка на 20 мг пероксидазы при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 20 мин (RU 2300107, кл. G01N 33/535, A61K 39/10 от 11.01.2005).
К недостаткам способа можно отнести его трудоемкость, сложность и длительность.
Наиболее близким решением, принятым за прототип, является известный способ получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных, включающий экстракцию липополисахарида из бруцелл вида abortus обработкой 2%-ным раствором уксусной кислоты в присутствии 10%-ного раствора NaCl при автоклавировании, отделение экстракта центрифугированием, фракционирование супернатанта спиртом, выделение О-полисахарида из полученного осадка с последующей его очисткой, при этом выделение О-полисахарида осуществляют трихлоруксусной кислотой на холоду в течение 15 мин, а очистку проводят гель-фильтрацией в агарозе (RU 2035188, кл. А61K 39/10, от 21.02.1992).
Недостатком данного способа является его трудоемкость, сложность и длительность. Необходимость использования трудоемкого процесса гельфильтрации в 1,6%-ной агарозе и дополнительное осаждение белков трихлоруксусной кислотой значительно понижали выход конечного продукта (О-ПС антигена). Кроме того, очистка антигена с помощью гельфильтрации требует громоздкого и дорогостоящего оборудования и реактивов, что существенно повышает стоимость конечного продукта.
Техническая задача - получить высокоочищенный антиген на основе О-цепи полисахарида бруцелл, пригодный для дифференциации вакцинированных и больных животных с такой очисткой от примесей, которая обеспечивает получение высокоочищенного антигена на простом и более дешевом оборудовании и с помощью недорогих реактивов.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения комплексного антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных, включающем экстракцию липополисахаридов бруцелл вида Brucella abortus и Brucella melitensis, для чего их берут в равном соотношении и обрабатывают 2%-ным раствором уксусной кислоты в присутствии 10% NaCl при автоклавировании, затем отделяют экстракт центрифугированием, фракционируют супернатант спиртом и выделяют О-полисахарида центрифугированием.
Антиген, полученный предлагаемым способом, имеет высокий выход (500 мг из 100 г сырой клеточной массы бруцелл) при малом количестве примесей (порядка 2%).
Пример: 100 г сырой клеточной смешанной массы бруцелл из штамма 19 (Brucella abortus, 19) и из штамма 16М (Brucella melitensis, 16М), смешанных в соотношении 1:1 ресуспендировали в 250 мл 2%-ной уксусной кислоты, содержащей 10% NaCl и автоклавировали 30 минут при 120°С. Суспензию охлаждали и центрифугировали 30 минут при 3000 об/мин при 4°С. Осадок отбрасывали, супернатант нейтрализовали 0,5М NaOH, охлаждали до 0°С и добавляли 1,3 л охлажденного этанола, оставляли на ночь для формирования осадка. Осадок отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 минут при 4°С и растворяли в 15 мл 5%-ного раствора NaCl. Растворенный осадок диализировали в 100-кратном объеме 5%-ного раствора NaCl с двукратной сменой раствора в течение 2 суток. Получили около 500 мг свободной О-цепи полисахаридов бруцелл. Препарат содержал 98% О-цепи полисахарида и около 2% примеси, представленных остатками нуклеиновых кислот. Количество белков и нуклеиновых кислот определяли по Лоури и спектрофотометрически.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить высокоочищенный антиген для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных простым и экономичным способом, за более короткий срок и без применения дорогостоящих реактивов и оборудования.
Claims (1)
- Способ получения комплексного антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных, включающий экстракцию липополисахаридов бруцелл вида Brucella abortus и Brucella melitensis, для чего их берут в равном соотношении и обрабатывают 2%-ным раствором уксусной кислоты в присутствии 10% NaCl при автоклавировании, затем отделяют экстракт центрифугированием, фракционируют супернатант спиртом с последующим диализом и выделяют О-полисахарид центрифугированием.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016103567A RU2627467C1 (ru) | 2016-02-03 | 2016-02-03 | Способ изготовления комплексного антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллёзом животных |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016103567A RU2627467C1 (ru) | 2016-02-03 | 2016-02-03 | Способ изготовления комплексного антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллёзом животных |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2627467C1 true RU2627467C1 (ru) | 2017-08-08 |
Family
ID=59632336
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016103567A RU2627467C1 (ru) | 2016-02-03 | 2016-02-03 | Способ изготовления комплексного антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллёзом животных |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2627467C1 (ru) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2035188C1 (ru) * | 1992-02-21 | 1995-05-20 | Товарищество с ограниченной ответственностью - Научно-производственный центр "Ветбиотест" | Способ получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных |
RU2417098C1 (ru) * | 2009-08-03 | 2011-04-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии) | Способ диагностики бруцеллеза животных |
-
2016
- 2016-02-03 RU RU2016103567A patent/RU2627467C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2035188C1 (ru) * | 1992-02-21 | 1995-05-20 | Товарищество с ограниченной ответственностью - Научно-производственный центр "Ветбиотест" | Способ получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных |
RU2417098C1 (ru) * | 2009-08-03 | 2011-04-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии) | Способ диагностики бруцеллеза животных |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Xiu et al. | Immunostimulatory activity of exopolysaccharides from probiotic Lactobacillus casei WXD030 strain as a novel adjuvant in vitro and in vivo | |
Jones et al. | Characterization of allergens prepared from smooth and rough strains of Brucella melitensis | |
US11680111B2 (en) | Method for separation of protein and other impurities from microbial capsular polysaccharides | |
Kaufman et al. | Isolation of a corncob (coaggregation) receptor polypeptide from Fusobacterium nucleatum | |
US3636192A (en) | Meningococcal polysaccharide vaccines | |
FR2570081A1 (fr) | Polysaccharides membranaires utiles notamment comme medicament et procede pour leur preparation | |
RU2627467C1 (ru) | Способ изготовления комплексного антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллёзом животных | |
US20170165343A1 (en) | Vaccine for mycoplasma infection | |
RU2311197C1 (ru) | Способ получения протективной белоксодержащей фракции бактерий | |
RU2341288C1 (ru) | СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ СВОЙСТВОМ ФОРМИРОВАТЬ КЛЕТОЧНЫЙ ИММУНИТЕТ ПРОТИВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS H37 Rv, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЕГО (ВАРИАНТЫ), РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ И СРЕДСТВО ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА | |
Berman et al. | Pilot-scale production of group A and group C meningococcal polysaccharide immunogens | |
RU2483112C1 (ru) | Способ получения липополисахарида возбудителя чумы | |
Andersen et al. | Heterogeneity of lipopolysaccharides of Neisseria meningitidis revealed by thin-layer chromatography combined with monoclonal antibodies | |
RU2799574C1 (ru) | Способ получения холерного токсина для контроля производства холерной химической вакцины | |
KENNY | Antigens of the mycoplasmatales and chlamydiae | |
SU1692580A1 (ru) | Способ получени тул ремийного антигена | |
RU2231364C2 (ru) | Способ получения капсульного вещества возбудителя мелиоидоза | |
RU2035188C1 (ru) | Способ получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных | |
Corbel et al. | Isolation and properties of an RNA fraction present in Brucella culture supernatants | |
Venturini et al. | Production of Trichophyton mentagrophytes antigens and their characterization in mice | |
Cameron et al. | Identification of the protective and toxic antigens of Corynebacterium pseudotuberculosis | |
Kuznetsova et al. | Complex Bfr-O-Antigen of Francisella tularensis Outer Membranes: Production, Characteristics and Potential Use | |
RU2045959C1 (ru) | Аллерген для диагностики туберкулеза и способ его получения | |
RU2236867C1 (ru) | Способ получения антигена возбудителя лихорадки ку | |
Luneva et al. | Design of a latex assay based on monoclonal antibodies for the detection of enterohemorrhagic E. coli belonging to the O157 serogroup |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180204 |