HRP20070097B1 - Uređaji i postupci za integriranu kontinuiranu proizvodnju bioloških molekula - Google Patents

Abstract

Ovaj izum se odnosi na proces i aparaturu za pročišćavanje molekule od interesa iz heterogene mješavine iz kulture tkiva. Aparatura izuma općenito obuhvaća kontinuirani perfuzijski fermentacijski sustav, kontinuirani sustav za odstranjivanje čestica integriran s perfuzijskim fermentacijskim sustavom; i kontinuirani sustav za pročišćavanje integriran s sustavom za odstranjivanje čestica, a koja aparatura je održavana u sterilnim uvjetima. Proces obuhvaća filtriranje heterogene bistre tekuće mješavine s pomoću kontinuirane ultrafiltracije kod specifične stope protoka ispod točke tranzicije molekule od interesa u regiji koja je ovisna o tlaku na krivulji koja prikazuje protok naspram TMP, a gdje se specifična stopa protoka održava zadovoljavajuće konstantnom kroz cijeli proces kontinuirane ultrafiltracije. Primjer usporedbe ukupnog nanosnog kapaciteta u 10<SUP>"</SUP> kapsule za filtar za konvencionalni šaržni proces i izvedba inventivne naprave i metode za kontinuirano odstranjivanje čestica (integrirani kontinuirani proces filtriranja) koji rabi identične komercijalne filtarske kapsule. Primjer metode za proizvodnju čimbenika zgrušavanja VIII iz krvi.

Description

Polje izuma

Ovaj izum se odnosi na poboljšani postupak i sustav za pročišćavanje molekule od interesa iz heterogene mješavine molekula. Specifičnije, ovaj izum se odnosi na metode za pročišćavanje proteina od interesa iz mlaza tekuće podloge iz kulture tkiva iz kontinuiranog perfuzijskog procesa vrenja.

Pozadina izuma

Stručnjacima je poznato da je tijekom zadnjih godina s velikim komercijalnim uspjehom predstavljeno nekoliko kontinuiranih procesa za kulturu tkiva, koji se još zovu kontinuirani perfuzijski procesi. Međutim, proces izolacije iz takovih sustava je općenito šaržni proces te je fizički i logistički odvojen od uzvodnog kontinuiranog procesa. U ovim procesima, glavni cilj izolacijskog koraka je lovljenje produkta iz velikog volumena relativno razrijeđenog supernatanta stanične kulture. Koncentracija produkta mora se promatrati s obzirom na logistiku i prostor koji je potreban procesu, dok je simultano odstranjivanje (pročišćavanje) važno kako bi se smanjio potreban broj daljnjih nizvodnih koraka pročišćavanja.

Slika 1 predstavlja shemu tipičnog najmodernijeg izolacijskog procesa iz kontinuirane perfuzijske fermentacije, kao što je vrlo dobro poznato stručnjacima. Kontinuirani perfuzijski fermentacijski sustav obuhvaća napravu za zaustavljanje stanica (1), koja zadržava najveći broj stanica koje proizvode produkt unutar sustava za vrenje. Kontinuirana struja sa žetvom iz kontinuiranog perfuzijskog sustava, koja još uvijek sadrži nešto stanica, taloga i druge čestice pumpa se koristeći se pumpom za žetvu (2) u velike posude za sakupljanje (3) poput onih od nehrđajućeg čelika. Ove posude koje služe za spremanje žetve uobičajeno moraju biti hlađene kako bi se spriječio gubitak produkta zbog degradacije u ostvarivom rasponu.

Nakon što se sakupi odgovarajući volumen, koji tipično nastaje nakon 1-4 dana ili više, posude za sakupljanje žetve odvajaju se od sterilne fermentacijske posude, a sakupljeni materijal dobiva oznaku šarže iz jedne žetve. Slijedeći korak je odstranjivanje stanica, taloga i čestica (korak 2). U industrijskim razmjerima ovo se obavlja centrifugiranjem (4) nakon čega slijedi filtracija kroz membranu sa slijepim krajem (5) ili dubinska-filtracija kroz membranu sa slijepim krajem (6), a nakon toga ponovno filtracija kroz membranu sa slijepim krajem (7). Druga tehnika koja se ponekad koristi je mikrofiltracijski tangentalni protok (ili „ukršteni protok“). U svakom slučaju, korist ovoga je dobivanje šaržno pročišćene tekućine stanične kulture ili cTCF (8). Detaljni opis odvajanja čestica iz biotehnoloških produkata može se pronaći u uobičajenim udžbenicima poput Biotechnology, Vol. 3, Bioprocessing, Wiley-VCH, 2 izdanje (1996), ISBN: 3527283137.

U slijedećem koraku (korak 3), šaržna pročišćena tekućina stanične kulture procesira se nadalje kako bi se koncentrirala te, ukoliko je moguće, kako bi se produkt pročistio. Ovo se tipično provodi s pomoću unakrsne ultrafiltracije ili kromatografijom spakiranih zrnaca.

U slučaju unakrsne ultrafiltracije, cTCF se pumpa u spremnik za recikliranje (9) unutar sustava. Koristi se pumpa (10) kako bi se materijal gurao kroz unakrsni filtar. Produkt se zadržava membranom te se reciklira kao talog u spremniku za recikliranje, a voda i manje kontaminacije prolaze kroz membranu i idu u permeat (11) zbog trans-membranskog tlaka koji nastaje zbog pada tlaka u ultrafiltracijskom modulu. Tijekom svake pasaže kroz filtar, cTCF se sve više koncentrira, a ukupni volumen cTCF se smanji sve dok se ne postigne željena koncentracija. Jednom kada se ista postigne, proces se zaustavlja, a ostatak volumena koncentrata (izolata) se iscijedi iz sustava i sakupi. Detaljni opis unakrsne ultrafiltracije za koncentriranje biotehnoloških produkata može se pronaći u uobičajenim udžbenicima poput Biotechnology, Vol. 3, Bioprocessing, Wiley-VCH, 2 izdanje (1996), ISBN: 3527283137.

U slučaju kada se koristi kromatografija spakiranih zrnaca, cTCF se pumpa kroz kromatografsku kolonu (12) koja sadrži nosač sa zrncima. Produkt se veže na nosač, a tada se ispire s odgovarajućem puferom za ispiranje (14) pa se dobiva u uobičajenom koncentriranom i pročišćenom obliku (izolat, 13). Nakon toga kolona se čisti i regenerira s pomoću odgovarajućih pufera i otopina za pročišćavanje (14).

Drugi sustavi kromatografije koji su bili sugerirani za koncentriranje/pročišćavanje cTCF-a su kromatografija s povećanim zrncima i membranska kromatografija. Kromatografija s proširenim zrncima može procesirati čestice koje sadrže otopinu. Međutim, filtriranje izolata nakon kromatografije je ipak potrebno premda su filtracijski dijelovi smanjeni. Membranska kromatografija koristi naslage modificiranih membrana za mikrofiltraciju umjesto nosača od spakiranih zrnaca. Prednost je to što je masovni transfer uvelike konvektivan umjesto difuzijski što omogućava brže odvajanje. Osim ovoga, proces je tipično ekvivalentan standardnoj kromatografiji spakiranih zrnaca.

Detalji opis kromatografije za koncentraciju i pročišćavanje biotehnoloških produkata može se naći u uobičajenim udžbenicima poput Protein Purification, Principles, High-Resolution Methods, and Applications, Wiley-VCH, 2. izdanje (1998), ISBN 0-471-18626-0.

Često, grubi izolat se nakon svega smrzava i skladišti za kasniju uporabu u daljnjim nizvodnim koracima pročišćavanja.

Tako, kako je ranije opisano, proces izolacije općenito je šaržni proces koji je fizički i logistički odvojen od uzvodnog kontinuiranog procesa. Također, i dok se vrenje mora provoditi sterilno, izolacija (primjerice odvajanje čestica i koncentracija/pročišćavanje) se uobičajeno provodi čisto, ali ne i sterilno.

Opisani najmoderniji proces ima nekoliko glavnih problema:

P1. Gubitak u prinosu i potencijalno padanje kvalitete moguće je zbog dugog vremena zadržavanja produkta. Žetva iz kontinuirane perfuzijske fermentacije treba se sakupiti i spremiti tijekom značajnog vremenskog razdoblja, kako je ranije opisano, prije no će se krenuti u proces izolacije. Sakupljena žetva, premda ohlađena, još uvijek je podloga za nastanak nestabilnih proteinskih produkata. Stoga, značajan gubitak produkta se javlja, a to smanjuje kapacitet procesa i povećava cijenu produkta. Nadalje, kvaliteta produkta može biti značajno narušena.

P2. Za spremanje međuprodukta potrebna su velika hladna postrojenja ili hladne posude velikoga volumena, što povećava troškove te smanjuje već spomenutu kompaktnost i mobilnost perfuzijskih fermentora.

P3. Konvencionalne tehnologije za koncentriranje/pročišćavanje (poput ultrafiltracije, kromatografije spakiranih zrnaca) imaju relativno mali volumetrijski protok, veliki broj ponovljenih operacija i zahtijevaju dodatni rad. Kao rezultat, tipično se na dan provede ne više od 1 šaržnog procesa.

P4. Štoviše, današnji procesi izolacije i metode imaju logističke poteškoće jer se suočavaju s različitim procesnim volumenima u fermentacijskim postrojenjima u kojima ima više od jednog bioreaktora. U industrijskim kontinuiranim perfuzijskim postrojenjima radi veliki broj bioreaktora odjednom.

P5. Nadalje, današnji procesi izolacije su čisti tj. s njima se radi čisto, ali ne i sterilno. Ovo često dovodi do velikog broja odbačenih šarži zbog kontaminacija mikroorganizmima.

P6. Uporaba jednokratnih filtara ili sklopivih naprava, vreća i sl., premda vrlo poželjna u proizvodnji ljudskih preparata (za izbjegavanje čišćenja i potvrda čišćenja i druge radnje), je vrlo skupo i zapravo često nije gospodarski opravdano.

Sukladno ovome, predmet ovoga izuma je osiguravanje integriranog, kontinuiranog procesa za odvajanje proteina koji je sposoban raditi duže vrijeme u sterilnim uvjetima.

Sažetak izuma

Ovaj izum se odnosi na novu aparaturu i proces za pročišćavanje molekula iz heterogene tekuće mješavine. Posebice, ovaj izum se odnosi na proces za pročišćavanje molekule od interesa iz bistre heterogene tekuće mješavine iz koje su krute kontaminacije odstranjene. Proces obuhvaća korak filtriranja bistre heterogene tekuće mješavine s pomoću kontinuirane ultrafiltracije uz točno određenog protoka ispod točke tranzicije za molekulu od interesa u dijelu krivulje koji je ovisan o tlaku unutar grafa protok naspram TMP, dok se specifičan protok održava konstantnim kroz cjelokupan proces kontinuirane ultrafiltracije.

U nekim izvedbama, proces iz ovoga izuma obuhvaća filtriranje bistre tekuće mješavine kroz ultrafiltracijsku membranu koja posjeduje površinu u kvadratnim metrima otprilike podjednaku od 0.1 do 2 puta volumetrijskog protoka bistre tekuće mješavine u litrama/satu. U drugoj izvedbi, proces iz ovoga izuma podrazumijeva filtriranje bistre mješavine tekućina kroz ultrafiltracijsku membranu koja ima površinu u metrima kvadratnim otprilike jednake od 0.3 do 1 puta volumetrijske stope protoka bistre tekuće mješavine u litrama/satu.

Proces iz ovoga izuma dozvoljava (što se smatra poboljšanjem) filtriranje bistre mješavine kod specifične stope protoka koja stvara koncentraciju stjenke koja je za manje od oko 20%, manje od 15% ili manje od 10% veća no što je koncentracija zaostatka bez značajne polarizacije koncentracije.

U specifičnijoj izvedbi, ovaj izum se odnosi na integriran, kontinuiran i sterilan proces za kontinuiranu perfuzijsku fermentaciju, za odstranjivanje čestica i pročišćavanje/koncentriranje. U jednom aspektu ovoga izuma, proces obuhvaća filtriranje mješavinu iz kulture tkiva s pomoću separacijskog procesa koji specifično odvaja proteina od interesa iz mješavine u programiranoj operacijskoj točki nizvodno od točke tranzicije proteina u regiji na krivulji protok naspram TMP koja ovisi o tlaku kako bi nastao sterilan, oslobođen od čestica, djelomično pročišćen i koncentriran produkt, a gdje se specifična stopa protoka kroz separacijski proces održava konstantnom na razini koja je niža od tranzicijske točke proteina.

U drugom aspektu ovoga izuma, proces je kontinuirani proces za pročišćavanje proteina od interesa iz heterogene tekuće mješavine iz kulture tkiva i obuhvaća:

(a) osiguravanje s pomoću kontinuiranog perfuzijskog fermentacijskog procesa heterogenu tekuću mješavinu iz kulture tkiva koja sadrži protein od interesa;

(b) prijenos tekuće mješavine iz kulture tkiva u kontinuirani proces za odstranjivanje čestica, a koji je integriran s procesom kontinuirane perfuzijske fermentacije;

(c) odstranjivanje čestica koje su kontaminanti iz tekuće mješavine iz kulture tkiva u kontinuirani proces odstranjivanja čestica kako bi nastala bistra tekućina iz kulture tkiva koja sadrži protein od interesa;

(d) prijenos bistre tekućine iz kulture tkiva u kontinuirani perfuzijski proces koji je integriran s procesom kontinuiranog odstranjivanja čestica; i

(e) pročišćavanje proteina od interesa iz bistre tekućine iz kulture tkiva u kontinuiranom procesu pročišćavanja;gdje se specifična stopa protoka mješavine kroz kontinuirani perfuzijski fermentacijski proces, kroz kontinuirani proces odstranjivanja čestica i kroz kontinuirani proces pročišćavanja održava postojanom.

U drugom aspektu ovoga izuma, proces je polu-kontinuiran proces za pročišćavanje proteina od interesa iz heterogene tekuće mješavine iz kulture tkiva, a koja obuhvaća:

(a) osiguravanje s pomoću kontinuiranog perfuzijskog fermentacijskog procesa heterogenu tekuću mješavinu iz kulture tkiva koja sadrži protein od interesa;

(b) prijenos tekuće mješavine iz kulture tkiva u kontinuirani proces odvajanja čestica koji je integralan s kontinuiranim perfuzijskim fermentacijskim procesom;

(c) odstranjivanje čestica koje kontaminiraju iz tekućine iz kulture tkiva u kontinuirani proces odstranjivanja čestica kako bi se dobila bistra tekućina iz kulture tkiva koja sadrži protein od interesa;

(d) prijenos bistre tekućine iz kulture tkiva u posebnu posudu koja je integrirana s procesom kontinuirane perfuzijske fermentacije;

(e) prijenos u razmacima bistre tekućine iz kulture tkiva u proces pročišćavanja koji je integriran s posebnom posudom; i

(e) pročišćavanje proteina od interesa iz bistre tekućine iz kulture tkiva u proces pročišćavanja kako bi nastao sterilni, oslobođen od čestica, koncentriran i djelomično pročišćen produkt koji sadrži protein od interesa;

gdje se specifična stopa protoka mješavine kroz kontinuirani perfuzijski fermentacijski proces i kroz proces odstranjivanja čestica održava postojanom.

Ovaj izum se također odnosi na aparat za odvajanje proteina od interesa iz heterogene tekuće mješavine iz kulture tkiva. U ovom aspektu izuma, aparat obuhvaća: (a) kontinuirani perfuzijski fermentacijski sustav; (b) sustav za kontinuirano odstranjivanje čestica koji je integriran sa sustavom za perfuzijsku fermentaciju; i (c) kontinuirani sustav za pročišćavanje koji je integriran sa sustavom za odstranjivanje čestica, a gdje je aparat adaptiran tako da održava sterilne uvjete.

U drugom aspektu ovoga izuma, aparat obuhvaća: (a) kontinuirani sustav za perfuzijsku fermentaciju; (b) kontinuirani sustav za odstranjivanje čestica koji je integriran sa sustavom za kontinuiranu perfizujsku fermentaciju; i (c) povratni sustav za pročišćavanje koji je integriran sa sustavom za odstranjivanje čestica, a gdje je aparat adaptiran kako bi se održavali sterilni uvjeti.

Sustav za pročišćavanje može primjerice biti ultrafiltracijski sustav ili konvektivan sustav za adsorpciju/desorpciju ili bilo koji drugi sustav koji je sposoban za pročišćavanje ili za djelomično pročišćavanje proteina od interesa iz heterogene mješavine u integriranom, kontinuiranom ili polu-kontinuiranom, sterilnom sustavu kako je ovdje opisano.

Proces i aparatura iz ovoga izuma adaptirani su kako bi dozvoljavali kontinuirano procesiranje heterogene tekuće mješavine poput tekućine iz kulture tkiva uz kontinuiranu stopu protoka. U posebnom aspektu ovoga izuma, proces i aparatura iz ovoga izuma adaptirani su kako bi omogućili kontinuirano procesiranje heterogene tekuće mješavine iz stanične kulture ili iz kulture tkiva uz postojanu stopu protoka ispod točke tranzicije za protein u regiji koja je ovisna o tlaku na krivulji koja prikazuje protok naspram TMP za kontinuirano razdoblje i kroz sustav za pročišćavanje.

Ovi i ostali aspekti ovoga izuma opisani su detaljno u opisu izuma koji slijedi.

Kratak opis slika

Slike koje prate ovaj dokument, a koje su uključene u nj i čine njegov dio ilustriraju izvedbe ovoga izuma te skupa s detaljnim opisom izvedbi imaju zadaću objasniti principe i koristi ovoga izuma.

SL. 1: Shema konvencionalnog procesa za kontinuiranu perfuziju kojeg slijede 3 fizički i logistički odvojena koraka u procesu izolacije (sakupljanje šaržne žetve, šaržno odstranjivanje čestica i šaržno koncentriranje/pročišćavanje).

SL. 2: Shematski prikaz dviju izvedbi za inovativnu napravu A za kontinuiranu, integriranu i sterilnu proizvodnju. Shematski prikaz izvedbe A1 nalazi se na lijevoj strani, a shematski prikaz izvedbe A2 nalazi se na desnoj strani.

SL. 3: Shematski prikaz dviju izvedbi za inovativnu napravu B za kontinuiranu, integriranu i sterilnu proizvodnju. Shematski prikaz izvedbe B1 nalazi se na lijevoj strani, a shematski prikaz izvedbe B2 nalazi se na desnoj strani.

SL. 4: Shematski prikaz izvedbe inventivnog sustava za integrirano, kontinuirano odstranjivanje čestica (100), elementa obiju inventivnih naprava A i B.

SL. 5: Shematski prikaz dodatnih izvedbi inventivne naprave A koja kombinira višestruke elemente kako bi povećala ili cjelokupni kapacitet postrojenja (A3) ili izvođenje procesa koncentriranja i odvajanja (A4).

SL. 6: Shematski prikaz dodatnih izvedbi inventivne naprave B.

SL. 7: Dodatna izvedba inventivnih naprava koje kombiniraju elemente iz naprave A i naprave B u serijama kako bi povećale cjelokupnu izvedbu koncentriranja i odvajanja.

SL. 8: Usporedba ukupnog kapaciteta u 10'' kapsule za filtar za konvencionalni šaržni proces naspram izvedbe inventivne naprave i postupka za kontinuirano odstranjivanje čestica (integrirani kontinuirani proces filtriranja) koji koristi identične komercijalne kapsule za filtar. Prikazan je postupak proizvodnje rekombinantnog koagulacijskog čimbenika VIII iz krvi.

SL. 9: Primjer krivulje protoka naspram tlaka (specifični permeativni protok u LMH = litri/sat/m2 kroz transmembranski tlak) i određivanje operacijske točke. Krivulja pokazuje tipičnu operacijsku točku koja će biti podešena s pomoću TMP-a za konvencionalni šaržni proces. Kvadrat prikazuje poželjnu operacijsku regiju koja će biti podešena s pomoću pumpom za permeat barem za postupak koji rabi inventivnu napravu A.

SL. 10: Primjer distribucije rezidentnog vremena i srednjeg vremena u integriranom kontinuiranom UF sustavu (300) za metodu kada se rabi inventivna naprava A. Izmjerena za jednokratni kontinuirani sustav s modulom od 290 cm2 (duljine 62.5 cm), unakrsni protok je 120 LMH, protok u zaostatku je 0.2 LMH, stalni protok je 2 LMH.

SL. 11: Primjer izolacije rFVIII iz kontinuirane perfuzijske fermentacije bez prisutnosti proteina plazme koristeći se jednom izvedbom inventivne naprave A. Usporedba prosječnog izolacijskog prinosa za inventivnu kontinuiranu metodu s prosječnim prinosom šaržne izolacije, uključujući jedan raspon standardne devijacije. Tri uzastopne šarže su bile rabljene za određivanje prinosa šarže, a za kontinuirani proces su bile korištene tri uzastopne točke (dani).

SL. 12: Primjeri rada inventivne naprave A. Prikazana su tri različita primjera za transmembranski tlak i specifični protok integriranog kontinuiranog ultrafiltracijskog sustava (300) kao funkcija vremena kontinuiranog procesa. Trokuti = membrana za 100 kD, rekombinantni koagulacijski čimbenik VIII iz krvi (rFVIII); Četverokuti = membrana za 10 kD, rekombinantni interleukin-2; Krugovi = membrana za 50 kD, genetički preinačeni glikoprotein (Mr > 100 kD). Svi primjeri koji su prikazani su za kontinuirani perfuzijski sustav bez prisutnosti proteina plazme.

SL: 13: Primjer dugotrajnog rada inventivne naprave A koja je izravno vezana na kontinuirani perfuzijski sustav za rast stanične linije koja istovremeno eksprimira dva proteinska produkta (zeleni fluorescentni protein GFP i IL-2SA). Rabljeni su transmembranski tlak i specifični protok inventivnog kontinuiranog ultrafiltracijskog sustava (300) kao funkcija vremena kontinuiranog procesa. Korištena je membrana za 10 kD.

SL. 14: Primjer dugotrajnog rada inventivne naprave A izravno spojene na kontinuirani perfuzijski sustav za rast stanične linije koja istovremeno eksprimira dva proteinska produkta (zeleni fluorescentni protein GFP i IL-2SA). Korištena je membrana za 10 kD. Čimbenik koncentriranja oba proteina, određen specifičnim testom te volumetrijski koncentracijski čimbenik predstavljen je kao funkcija vremena kontinuiranog procesa.

SL. 15: Primjer rada inventivne naprave B. Prinos i pad tlaka od preko 100 uzastopnih ciklusa adsorpcije/desorpcije s konvektivnim adsorberom (ciljni protein: varijanta genetički preinačenog koagulacijskog čimbenika FVIII iz krvi; konvektivni adsorber, Mustang Q, Pall Corporation).

SL. 16: Primjer za rad inventivne naprave B. Profili UV-a i provodljivosti tijekom tipičnog ciklusa adsorpcije/desorpcije s konvektivnim adsorberom (ciljni protein: varijanta genetički preinačenog koagulacijskog čimbenika FVIII iz krvi; konvektivni adsorber, Mustang Q, Pall Corporation).

SL. 17: Primjer rada inventivne naprave B. Predstavljena je SDS-gel-elektroforeza (bojanje srebrom) uzorka za nanašanje = bistra žetva koja postojano izlazi iz sustava za odstranjivanje čestica (100), a koja je polu-kontinuirano nanašana na konvektivni sustav za adrospciju (400) i tipični eluat nakon adsorpcije/desorpcije. Ciljni protein: varijanta genetički preinačenog koagulacijskog čimbenika FVIII iz krvi; konvektivni adsorber, Mustang Q, Pall Corporation. Eluat je bio ponovno razrijeđen do koncentracije uzorka za nanašanje prije elektroforeze.

Detaljan opis izuma

Definicije

Osim ako nije drugačije definirano, terminologija koja se rabi u ovoj aplikaciji standardna je za polje. Slijedeće definicije određenih pojmova ovdje su navedeni kako bi se osigurala jasnoća i nedvosmislenost značenja zahtjeva.

Jedinice, nastavci i simboli mogu se označiti u njihovom prihvatljivom SI obliku. Brojčani rasponi koji se ovdje navode su uključuju bojeve koji definiraju i uključuju raspon te prihvaćaju svaki cijeli broj u definiranom rasponu. Osim ako nije drugačije navedeno, kada se govori u nominativu treba se shvatiti da se govori kao «najmanje jedan». Podnaslovi se ovdje koriste samo u organizacijskom smislu te ih se ne treba shvatiti kao ograničenja predmeta ovoga izuma. Svi dokumenti ili njihovi dijelovi citirani u ovoj prijavi, koji uključuju patente ali se ne ograničavaju s njima, patentne prijave, članci, knjige i ugovori ovdje su uključeni cjelokupno referencom.

Pojmovi «bistrenje» i «bistra» označavaju da je otopina očišćena od čestica tako da ista može proći kroz membranu s porama od 0.2 μm.

Pojam «kontinuirana perfuzijska fermentacija» se odnosi na sustav za stabilnu fermentaciju ili na proces koji radi bez prekidanja te u kojemu se stanice ili mikroorganizmi održavaju u kulturi u fazi eksponencijalnog rasta s pomoću kontinuiranog dodavanja svježe podloge što je usklađeno s odstranjivanjem stanične suspenzije iz bioreaktora.

Pojmovi «kultiviranje», «kultura stanica», «rast», «održavanje», «podržavanje» i «povećanje opsega» su sinonimi te označavaju da stanice ostaju vijabilne i sposobne za diobu.

Pojam «koncentracije» u svojem glagolskom obliku označava odstranjivanje vode iz otopine tako da se količina molekule od interesa povećava prema volumenu preostale otopine.

Pojam «koncentracijska polarizacija» označava akumulaciju zaostalih molekula (sloj gela) na površini membrane uzrokovane zbog više čimbenika: transmembranskog tlaka, brzina ukrštenog protoka, brzina uzorka i koncentracije otopljene tvari.

Pojam «kontinuiran» označava da se nešto odvija neprekinuto tijekom vremena, u sekvenci i/ili nekoj operaciji za duže vremensko razdoblje. Na način na koji se ovdje koristi vezano uz vrenje, bistrenje i filtracije iz ovoga izuma, «kontinuiran» označava da su procesi fizički i logistički integrirani kako bi se osigurala neprekinuta operacija tijekom vremena koje je dovoljno da nastane sterilan, očišćen od čestica, koncentriran i djelomično pročišćen izolat produkta koji sadrži protein od interesa. Pojam kontinuiran, na način na koji se ovdje koristi u svezi s procesima ovoga izuma, također se treba shvatiti da označava da se proces ne provodi u šaržama ili na stvarno kontinuiran načinu izvedbe. Procesi iz ovoga izuma sposobni su za kontinuiranu operaciju, primjerice u dužem vremenskom razdoblju koje se proteže od jednog dana do nekoliko mjeseci bez prekidanja operacije ili neke sekvence procesa. Na način kako je predstavljeno u ovom izumu, procesi teku u kontinuiranom razdoblju koje je veće od 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 dana, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 tjedana ili 3, 4, 5, 6 ili više mjeseci.

Pojmovi «polu-kontinuiran» i «na mahove» označavaju da jedan ili više procesa ili elemenata integriranog sustava rade u diskontinuirano ili u šaržama, dok ostali procesi ili elementi integriranog sustava rade kontinuirano. Primjerice, u nekim izvedbama ovoga izuma sustav pročišćavanja je konvektivni proces adsorpcije/desorpcije koji tipično zahtjeva adsorpciju heterogene mješavine na adsorpcijski supstrat što konačno dovodi do zasićenja supstrata pa zbog toga je nužno isključivanje procesa adsorpcije te narušavanje ili oslobađanje vezane frakcije. Takav proces je nužno povratan (na mahove) premda ga se može integrirati s uzvodnim procesima koji su kontinuirani.

Pojam «konvektivna adsorpcija/desorpcija» označava kromatografski proces u kojemu do velikog prijenosa primarno dolazi pomoću konvekcije. Konvektivna adsorpcija/desorpcija je proces u kojemu se frakcija mješavine koja sadrži molekulu od interesa odvaja od druge frakcije iz mješavine s pomoću adsorpcije spomenute frakcije na supstrat nakon čega slijedi desorpcija iste frakcije sa supstrata.

Pojmovi «unakrsni protok» ili «unakrsni protok tekućine» označavaju protok tekućine kroz vrh membranske površine.

Pojam «integriran», na način na koji se koristi u referencama za multipne sustave i/ili procese označava da su sustavi i/ili procesi fizički ili logistički vezani kako bi tvorili kontinuirani, spojeni sustav koji može raditi kontinuirano. U svezi sa sustavom iz ovoga izuma, a koji je povezan na integrirani kontinuirani ili polu-kontinuirani sustav koji stvara protein od interesa koji je očišćen od čestica, koncentriran i djelomično pročišćen, integrirani sustav će spojiti različite komponente izravno i na način koji može održavati sterilne uvjete između različitih komponenti sustava.

Pojmovi «podloge» (množina) i «podloga» (jednina) su sinonimi koji se nadopunjuju tako da uporaba jednog termina ne isključuje drugi.

Pojam «mješavina» označava heterogenu kombinaciju molekula i spojeva koja sadrži molekulu od interesa poput proteina i veliki broj kontaminacija. Poželjna mješavina iz ovoga izuma je tekućina iz kulture tkiva koja je sastavljena od heterogene mješavine proteina i kojoj se nalazi egzogeni protein od interesa koji je inicijalno dobiven iz kontinuirane perfuzijske fermentacije.

Pojam «sloj gela» označava mikroskopski tanki sloj molekula koji se može oblikovati na površinu membrane. Ovaj sloj može utjecati na usporavanje molekula začepljujući površinu membrane i time smanjujući protok tijekom filtriranja ili na način da tijekom konstantnog operiranja poveća TMP.

Pojam «molekula od interesa» označava čestice ili druge vrste molekula koje se trebaju odvojiti iz otopine ili suspenzije tretirane tekućine. Čestice ili molekule od interesa najčešće su od ostatka tekućine odvojene od ostatka dugih molekula. Veličina molekule od interesa koja se razdvaja određuje veličinu pora na membrani koja će se koristiti. Najpoželjnije je da su molekule od interesa iz biološkog ili biokemijskog izvora ili da su transgenične ili da su nastale u in vitro procesu te da uključuju proteine, peptide, polipeptide, antitijela ili fragmente antitijela. Primjeri preferiranih mlazova hranjivih podloga uključuju stanice sisavaca u kulturi i mikroorganizama u kulturi poput bakterija, gljiva i kvasce. Također se treba istaknuti da vrste koje će se filtracijom odstraniti uključuju nepoželjne polipeptide, proteine, stanične komponente, DNA, koloide, mikoplazme, endotoksine, viruse, ugljikohidrate i druge molekule od biološkog interesa bez razlike da li su glikolizirane ili ne.

Pojam «permeat» ovdje je sinonim filtratu.

Pojam «izolat produkta» označava produkt koji je djelomično pročišćen, koncentriran i oslobođen od čestica. Izolat produkta je produkt koji je dostigao određeni stupanj pročišćavanja i koncentriranja koji se može usporediti s stupnjem koji nastupa nakon ultrafiltracije ili konvektivne adsorpcije/desorpcije. Izolat produkta nije nužno homogen, ali je dovoljno pročišćen s obzirom na početni grubi produkt koji je nastao tijekom vrenja.

Pojam «specifična stopa protoka» ovdje se koristi usporedno s pojmom «protok filtrata» jer se odnosi na filtrat. Specifična stopa zaostalog protoka je ona stopa protoka zaostatka koja je normalizirana prema membrani koja se koristi.

Na način na koji se ovdje koristi s obzirom na protok, pojam «u suštini konstantan» označava da se protok održava na općenito konstantnoj razini tijekom određenog razdoblja filtracije.

Pojam «tekućina iz kulture tkiva» označava heterogenu mješavinu spojeva koji su nastali iz podloge iz kulture tkiva. U poželjnim aspektima ovoga izuma, tekućina iz kulture tkiva nastaje tijekom procesa kontinuirane perfuzijske fermentacije. «Bistra» tekućina iz kulture tkiva je takva tekućina koja je najprije bila predfiltrirana kako bi se odstranio talog i druge velike molekule.

Pojam «transmembranski tlak» je akronim «TMP» i označava prosječni primijenjeni tlak od mlaza hranjive podloge pa do one strane membrane na kojoj je filtrat. TMP se izražava u barima, TMP[bar]=[(PF+PR)/2] – gdje PF predstavlja tlak mlaza hranjive podloge, PR tlak zaostatka, a Pf je tlak filtrata.

Pojam «obnavljanje» označava količinu molekula od interesa koja se dobije nakon procesiranja. Uobičajeno se prikazuje kao postotak od početnog materijala ili prinos.

Pojam «zaostatak» označava dio uzorka koji ne prođe kroz membrane, a koji je također poznat i kao koncentrat.

Pojam «ultrafiltracije» označava oblik filtriranja koji rabi membrane s mikroporama ili polu-propustljive membrane kako bi se odvojile tekućine ili ione na osnovu različite molekularne mase. Ultrafiltracija tipično se koristi kako bi se filtrirale molekule koje imaju molekularnu masu veću od oko 10000 daltona.

Ovaj izum se odnosi na integrirani, kontinuirani i sterilni proces koji obuhvaća kontinuiranu perfuzijsku fermentaciju, odstranjivanje čestica i pročišćavanje/koncentraciju. U jednom aspektu ovaj proces obuhvaća filtriranje mješavine iz kulture tkiva s pomoću procesa odvajanja koji selektivno odvaja proteina od interesa iz mješavine u točno određenoj operacijskoj točki koja je ispod tranzicijske točke proteina u regiji koja je ovisna o tlaku na krivulji protoka naspram TMP kako bi se proizveo sterilni, očišćeni od čestica, koncentrirani i djelomično pročišćeni izolat produkta, a gdje se specifična stopa protoka kroz proces odvajanja održava u suštini konstantom na razini koja je niža od one za tranzicijsku točku proteina.

U drugom aspektu ovoga izuma, proces je kontinuirani i obuhvaća: (a) kontinuiranu proizvodnju heterogene mješavine tekućina iz kulture tkiva koja sadrži protein od interesa u kontinuiranoj perfuziskoj fermentaciji; (b) kontinuirani prijenos mješavine iz kulture tkiva u proces odstranjivanja čestica koji je integriran s kontinuiranim perfuzijskim sustavom; (c) kontinuirano odstranjivanje nečistoća iz tekućine iz kulture tkiva koja sadrži protein od interesa; (d) kontinuirani prijenos bistre tekućine iz kulture tkiva u proces pročišćavanja koji je integriran sa sustavom za odstranjivanje čestica; i (e) kontinuirano odvajanje proteina od interesa iz bistre tekućine iz kulture tkiva u sustavu za pročišćavanje kako bi se kontinuirano proizvodio sterilni, očišćen od čestica, koncentrirani i djelomično pročišćeni izolat produkta koji sadrži protein od interesa.

U drugom aspektu ovoga izuma, proces je polu-kontinuirani i obuhvaća: (a) kontinuiranu proizvodnju u kontinuiranom perfuziskom fermentacijskom procesu heterogenu tekuću mješavinu iz kulture tkiva koja sadrži protein od interesa; (b) kontinuirani prijenos mješavine iz kulture tkiva u proces odstranjivanja čestica koji je integriran s kontinuiranim perfuzijskim sustavom; (c) kontinuirano odstranjivanje čestica koje onečišćavaju iz tekućine iz kulture tkiva kroz proces za odstranjivanje čestica kako bi kontinuirano nastajala bistra tekućina iz kulture tkiva koja sadrži protein od interesa; (d) kontinuirani prijenos bistre tekućine iz kulture tkiva u posebnu posudu koja je integrirana s procesom za odstranjivanje čestica; (e) povratni (na mahove) prijenos bistre tekućine iz kulture tkiva u proces pročišćavanja koji je integriran s posebnom posudom; i (e) odvajanje proteina od interesa iz bistre tekućine iz kulture tkiva u sustav za pročišćavanje kako bi nastajao sterilni, oslobođeni od čestica, koncentrirani i djelomično pročišćeni izolat produkta koji sadrži protein od interesa, a gdje specifična stopa protoka mješavine kroz kontinuirani perfuzijski sustav za fermentaciju i kontinuirani proces odstranjivanja čestica održava u suštini konstantnom te u prosijeku podjednakom prosječnom protoku za integrirani polu-kontinuirani proces pročišćavanja.

Naprave koje izvode postupak iz ovoga izuma

Ovaj izum se također odnosi na odgovarajuću aparaturu za odvajanje proteina od interesa iz heterogene tekuće mješavine iz kulture tkiva. Općenito, aparatura obuhvaća: (a) kontinuirani perfuzijski fermentacijski sustav; (b) kontinuirani sustav za odstranjivanje čestica koji je integriran sa sustavom za perfuzijsku fermentaciju; i (c) kontinuirani perfuzijski sustav integriran sa sustavom za odstranjivanje čestica, a gdje je spomenuti aparat adaptiran kako bi održavao sterilne uvjete. U drugom aspektu ovoga izuma, aparat obuhvaća: (a) kontinuirani perfuzijski fermentacijski sustav; (b) sustav za kontinuirano odvajanje čestica integriran s perfuzijskim fermentacijskim sustavom; i (c) povratni (na mahove) sustav za pročišćavanje integriran sa sustavom za odstranjivanje čestica, a gdje je aparatura adaptirana kako bi održavala sterilne uvjete. Sustav za pročišćavanje može primjerice biti sustav za ultrafiltraciju ili konvektivni sustav adsorpcije/desorpcije ili bilo koji drugi sustav sposoban za pročišćavanje ili djelomično pročišćavanje proteina od interesa iz heterogene mješavine u integriranom, kontinuiranom ili polu-kontinuiranom, sterilnom sustavu kako je ovdje opisano.

Proces i aparatura iz ovoga izuma su adaptirane kako bi omogućavale kontinuirano procesiranje heterogene tekuće mješavine iz kulture tkiva sa u suštini konstantom stopom protoka. U posebnom aspektu ovoga izuma, proces i aparatura ovoga izuma su adaptirani kako bi omogućavali kontinuirano procesiranje heterogene tekuće mješavine iz kulture tkiva sa u suštini konstantnom stopom protoka ispod tranzicijske točke proteina u regiji koja je ovisna o tlaku na krivulji protok naspram TMP u kontinuiranom razdoblju kroz cijeli proces pročišćavanja.

U specifičnoj izvedbi, ovaj izum osigurava dvije nove naprave (A, B) od kojih svaka obuhvaća tri odvojena, ali potpuno integralna dijela, od koji svaki ima ključnu ulogu tako da skupa čine jedinstvenu učinkovitu, kontinuiranu platformu za proces izolacije proteina koja može riješiti probleme iz sadašnjeg stanja tehnike koje je ovdje opisano.

Tri odvojena elementa svake naprave prvo su integrirani, kontinuirani sustav za odstranjivanje čestica (100), potom sterilna posebna posuda (200), a tek onda integrirani sustav za koncentriranje/pročišćavanje (300 i 400). Sva tri elementa pa stoga i nove naprave i metode koje rabe spomenute naprave detaljno su opisani ispod.

Kako bi osigurala kontinuirani ili polu-kontinuirani sustav za koncentriranje/pročišćavanje proteinskog produkta, inventivna naprava A (od koje su predstavljene dvije izvedbe na Slici 2) obuhvaća integralni, kontinuirani, sterilni sustav za ultrafiltraciju (300), dok inventivna naprava B (od koje su također predstavljene dvije izvedbe na Slici 3) obuhvaća integrirani, polu-kontinuirani konvektivni sustav za adsorpciju/desorpciju (400).

Naprave iz ovoga izuma su izravno integrirane s jednim ili više kontinuiranih perfuzijskih bioreaktora te na taj način čine novu kontinuiranu, integriranu proizvodnu platformu.

NAPRAVA A

Integrirani kontinuirani sustav za odstranjivanje čestica (100)

Slika 2 prikazuje dvije izvedbe inventivne naprave A. Integrirani kontinuirani sustav za odstranjivanje čestica (100) izravno je povezan s mjestom sakupljanja žetve kontinuiranog perfuzijskog fermentacijskog sustava (1).

Slika 4 prikazuje detaljniji shematski prikaz jedne izvedbe inventivnog integriranog kontinuiranog sustava za odstranjivanje čestica (100) koji se sastoji od pumpe (101), kalibra za tlak ili prijenosnik (107), spojna cijev s više otvora (102) te jedan sklop od nekoliko filtarskih sljedova (103). Sve komponente su povezane s fleksibilnim sustavom cijevi i/ili čvrstih pipa.

Pumpa (101) je uobičajena peristaltička pumpa koja omogućava nježno pumpanje žetve iz stanične kulture bez da preokreće njene dijelove ili da utječe na čvrste spojnice koje održavaju sterilnost. Pumpa i njen sustav cjevčica su smanjeni kako bi bili u mogućnosti osiguravati željeni protok žetve kroz fermentacijski sustav kulture tkiva koji je do oko 15 bioreaktorskih volumena po danu tj. do najviše 9.4 litara/satu za bioreaktor od 15 litara te najviše do 125 litara/satu za bioreaktor od 200 litara.

Kalibar za tlak ili prijenosnik tlaka (107) dizajniran je tako da ga se može sterilizirati autoklaviranjem ili zračenjem. U postojećem dizajnu koristi se ili višekratni piezootporan prijenosnik u kućištu od nehrđajućeg čelika ili višekratni kalibar od nehrđajućeg čelika. Međutim, buduća poboljšanja mogu uključiti jednokratne prijenosnike koje se jednostavno mogu sterilizirati zračenjem.

U ovoj izvedbi, spojna cijev s više otvora (102) sastoji se od fleksibilnog sustava cjevčica, s klemama (ili zaliscima) te s odgovarajućim sterilnim spojnicama koje omogućavaju spajanje dodatnih sklopova s filtarskim sljedovima bez da se narušava sterilnost. Poželjno, promjer cjevčica je sveden na onu razinu koja omogućava brzinu protoka prinosa na oko 2 m/s ili manje kod željenih stopa protoka, pa stoga se izbjegava visoki stražnji tlak i pucanje. U drugoj izvedbi, umjesto sterilnih spojnica, koriste se specijalni komadići fleksibilnih cjevčica koje mogu biti zavareni s komercijalnim zavarivačem za cjevčice bez da se narušava sterilnost. Takav sustav komadića cjevčica načinjen je od PVC-a ili drugih sterilnih polimera.

Sklop filtarskih sljedova (103) sastoji se od najmanje dva, a poželjnije je od više identičnih filtarskih sljedova (kako je shematski prikazano) tako da je u danom vremenu otvoren samo jedan slijed kako je prikazano kao primjer na Slici 4 (105).

Svaki filtarski slijed se sastoji od najmanje jednog filtara, a poželjnije od jednog pred-filtara i jednog konačnog filtara u serijama (kako je prikazano na Slici 4). Ukoliko se želi povećati kapacitet za pojedinačnu aplikaciju, svaki filtarski slijed (105, 106 itd.) za sebe može sadržavati više filtara ili filtarskih sljedova paralelno postavljenih (nije prikazano).

U jednoj izvedbi iz ovoga izuma prikazanoj na Slici 4, drugi filtarski slijed iz sklopa (106) zatvoren je s pomoću diska koji pukne u ovisnosti o visini tlaka ili djelovanjem igle koja ga razdere (104). Tijekom rada, funkcija ovoga diska ili spomenute igle je da automatski omogući protok ka drugom filtarskom slijedu (107) jednom kada je tlak u prvom filtarskom slijedu (105) dosegao specifičnu granicu te na taj način omogućava neprekinuto odvijanje filtracijskog procesa. U ovom sustavu se rabe komercijalno dostupni diskovi ili igle koji se inače ionako rabe kako bi se osigurao siguran pad tlaka. U ovoj izvedbi koriste se diskovi ili igle sa specifičnim tlakom razdiranja koji nije veći od 16 PSI, a koji su se pokazali vrlo korisnima. Međutim, mogući je i specifični raspon tlaka.

Svaki daljnji filtarski slijed iz filtarskog sklopa također je odvojen ručnim ili automatskim zaliskom i drugim diskom ili iglom. Jednom kada se počne rabiti drugi filtarski slijed (106), zalistak slijedećeg diska ili igle se otvara kako bi slijedeći filtarski slijed djelovao kao pričuva itd.

U jednoj alternativnoj izvedbi ekskluzivno se koriste automatski zalisci gdje tijekom rada kontrolni sustav aktivira zaliske na osnovu signala koji dolazi od piezoosjetljivog senzora za tlak (107) koji se također može sterilizirati autoklaviranjem. Međutim, podnositelji ovog dokumenta su otkrili da sustav koji sadrži disk ili iglu osigurava veliku opstojnost u dugotrajnim operacijama.

Konačno rangiranje filtara je najmanje 3 μm ili manje, poželjnije 0.45 μm, a najpoželjnije je 0.2 μm. Tako, operacijski filtarski slijed (6) zadržava sve zaostale stanice, kao i stanični talog i ostale čestice što dovodi do nastanka izlazne struje koja je oslobođena čestica (9) tj. bistre tekućine iz kulture tkiva (cTCF).

Različiti komercijalno dostupni filtarski materijali se mogu rabiti. U ovoj izvedbi se rabe jednokratne filtarske kapsule poput pred-filtarske kapsule Sartopure ili Sartoclear (Sartorius, Goettingen) te konačne filtarske kapsule Sartobran (Sartorius, Goettingen) koji se mogu sterilizirati autoklaviranjem ili zračenjem.

Kao primjer ove izvedbe inventivne naprave, koja je dizajnirana za stopu protoka od 1 litra/min, svaki filtarski slijed (105, 106 itd.) iz sklopa (103) se sastoji od 3 30“ pred-filtarskih kapsula (Kleenpak Ultipleat, Pall Corp., ranga 4.5 μm, 0.75 m2 svaki) nakon čega slijede kapsule konačnog filtara od 3 30“ (Sartobran P, Sartoruis, ranga 0.45 μm/0.2 μm, 1.3 m2 svaki). Ova izvedba je posebice korisna za dugotrajniju proizvodnju rekombinantnog koagulacijskog čimbenika VIII iz krvi kao i za genetički promijenjenu varijantu FVIII uključujući FVIII s odstranjenom B-domenom.

Međutim, podnositelji ove prijave su otkrili da kada se rabi inventivna naprava i metoda, učinkovitost odstranjivanja čestica s brojnim dostupnim filtarskim materijalima i konfiguracijama različitih proizvođača (Pall, Sartorius, Cuno) značajno je poboljšana u usporedbi s postojećim konvencionalnim šaržnim procesiranjem.

Stoga, nova inventivna naprava i proces biti će također korisni za uporabu novih filtarskih tipova i oblika tj. s filtarskim tipovima koji povećavaju korisnu filtarsku površinu po kapsuli kao i s filtarskim tipovima koji osiguravaju unakrsni obrazac i druge načine minimiziranja izobličavanja poput vibracije ili rotacije filtarskih elemenata.

U drugoj izvedbi inventivnog procesa, filtarski slijed iz sklopa (103) obuhvaća samo jedan sterilni pomoćni filtarski slijed koji je zatvoren diskom ili iglom, ali još uvijek sadrži višestruke operacijske filtarske sljedove. Prvi filtarski slijed iz sklopa se rabi sve dok se ne završi procesiranje specifičnog unaprijed određenog radnog volumena, nakon čega se operacija zaustavlja (ručno ili automatski) do slijedećeg filtarskog slijeda u sklopu. Specifični radni volumen je onaj volumen koji kod normalnih radnih uvjeta dosegne ograničenje tlaka koji aktivira disk ili iglu. Ukoliko se međutim tlak poveća više no što je uobičajeno tijekom filtracije tj. zbog nekog neuobičajenog niskog stupnja filtracije žetve, pričuvni filtar tada opet omogućava neprekinutu kontinuiranu filtraciju otvarajući se kada je specifični tlak dosegnut. Nakon otvaranja pričuvnog filtarskog slijeda, filtracija se prebacuje na drugi filtarski slijed iz sklopa, a drugi pričuvni filtracijski slijed s diskom ili iglom se instalira bez da se naruši sterilnost sustava.

Stručnjacima je dobro poznato da kako bi se troškovi za filtre i vrijeme za šaržno procesiranje odstranjivanja čestica održavali na minimum, šaržni filtarski sljedovi se trebaju ograničiti na najmanju moguću površinu koja osigurava željenu stopu protoka (u litrama/satu) uz maksimalni tlak. Željena apsolutna stopa protoka zauzvrat mora biti dovoljno visoka kako bi osigurala dovoljno vremena za željeni šaržni volumen. Ovo nužno zahtjeva visoke specifične stope protoka (u litrama/satu/m2 filtarske površine).

Suprotno optimiziranom šaržnom filtracijskom sustavu, inventivna naprava je dizajnirana za specifičnu stopu protoka nekoliko puta manju, a koja je održavana konstantnom (u litrama/satu/m2 instalirane filtarske površine) tako da apsolutna stopa protoka bude jednaka stopi protoka žetve iz kontinuirane perfuzijske fermentacije.

Podnositelji ove prijave su neočekivano otkrili da kod tako niske specifične stope protoka, volumen koji se može procesirati kroz filtar je neproporcionalno viši nego li kod stope protoka koja je podešena za šaržne procese.

Vrlo je važno primijetiti da kod konvencionalnih šaržnih izolacijskih procesa takve niske specifične stope protoka neće biti primjetljive ili zbog ekstremno velike filtracijske površine (što košta) ili zbog toga što su preniske za apsolutne stope protoka. Ovo je ponajprije zbog toga što u najvećem broju slučajeva šaržna oprema za odstranjivanje čestica ostaje mirovati dok se žetva nakuplja za slijedeću šaržu. Štoviše, iznenađujuće neproporcionalno povećanje u zadovoljavajućem kapacitetu filtara iz inventivne metode dozvoljava značajno smanjenje potrošnje filtara te time i troškove proizvodnje.

Posebna posuda (200)

Posebni dio integriranog kontinuiranog sustava za odstranjivanje čestica izravno je i postojano vezan za posebnu posudu (201) kako je prikazano na Slici 2. Ova posebna posuda je sterilna poput neke jednokratne vreće ili nehrđajuće posude s najmanje jednim ulaznim i jednim izlaznim djelom, od kojih je zadnji poželjno pri dnu posude. Široki raspon veličina posuda i njihovih izvedbi je moguć. Međutim, posebna posuda poželjno je takva da je manja u usporedbi s volumetrijskim protokom sustava kako bi produkt u njoj bio što kraće vrijeme tj. ispod 24 sata, poželjno ispod 8, a najpoželjnije ispod 4.

Podnositelji ove prijave su otkrili da je takvo nisko vrijeme otpornosti produkta moguće jedino zbog inventivnih naprava te da omogućava značajno povećanje prinosa kod prirodno nestabilnih proteinskih produkata što rješava jedan od problema u sadašnjem stanju tehnike.

U nekim izvedbama inventivnih naprava, posebna posuda počiva na vazi ili na težinskoj ćeliji (202) kao što je prikazano za naprave B1 i B2 na Slici 3. Ova vaga ili težinska ćelija osigurava signal težine kojeg prima računalni sustav kontrole (nije prikazano).

Dodatno, u jednoj izvedbi inventivnih naprava (B2), pomoćna posuda (204) je povezana preko peristaltičke pumpe (203) na posebnu posudu. Tijekom rada, ovaj raspored se rabi za podešavanje karakteristika mlaza žetve bez čestica poput provodljivosti (ionska jakost) ili pH i to dodavanjem odgovarajućeg pufera ili sredstva za razrjeđivanje. U takvom slučaju ponekad se rabi i sustav za miješanje (205) i senzori koji motre opisane karakteristike (206) poput pH ili provodljivosti. U ovom dizajnu se koristi magnetska miješalica; međutim, drugi sustavi za miješanje poput naprava koje tresu ili pulsiraju također se mogu primijeniti.

Integrirano kontinuirano koncentriranje/pročišćavanje (300)

Naprava A, čije su dvije izvedbe prikazane na Slici 2, obuhvaća integrirani, kontinuirani, sterilni ultrafiltracijski sustav (300). Izvedbe kontinuiranog, sterilnog ultrafiltracijskog sustava obuhvaćaju pumpu za recikliranje (301) i omču za recikliranje (306), jedan ili više sterilnih ultrafiltracijskih modula s unakrsnim protokom (307) postavljenih na vazi ili težinskoj ćeliji (309) te pumpa za zaostatak (311). Nadalje, izvedba obuhvaća instrumentarij koji je u obliku ulaznog kalibra za tlak ili prijenosnika (302), kalibra za tlak permeata ili prijenosnik (304), izlazni kalibar za tlak ili prijenosnik (308) kao i mjerač za reciklirani protok (310). Tijekom rada, izlazna spojka sustava (312) osigurava kontinuirani protok koncentriranog ili djelomično pročišćenog proteinskog produkt koji se može kontinuirano sakupljati ili smrznuti za daljnje procesiranje.

Inventivna izvedba A2 obuhvaća posudu s puferom ili razrjeđivačem (314), dodatnu peristaltičku pumpu za pufer/razrjeđivač (313) kao i senzori za protok koji prate stanje koncentrata u omči za reciklažu poput senzora za pH i provodljivosti (315, 316). Tijekom rada, ova izvedba se rabi za podešavanje karakteristika mlaza žetve bez čestica poput provodljivosti (ionska jakost) ili pH i to dodavanjem odgovarajućeg pufera ili razrjeđivača. Ova izvedba također se može rabiti za dodavanje stabilizatora za proteine. Premda u inventivnoj napravi A2 omča za reciklažu sama po sebi djeluje kao miješalica, podešavanje uvjeta također može alternativno biti provedeno uporabom posebne posude kako je prikazano za napravu B (izvedba B2) koja obuhvaća komponente (203, 204, 205, 206) kako je objašnjeno kasnije u ovom razotkrivanju (vidi opis naprave B).

Izvedbe inventivne naprave također obuhvaćaju sustav za spremanje podataka i programiranje kontrole sustava koji je sposoban bilježiti dolazeće podatke iz instrumentarija (poput, ali bez ograničenja na njih, tlaka, stope protoka, težine posude, pH, provodljivosti) te kontrolirati brzinu pumpe sukladno kontrolnom algoritmu koji je ranije definiran.

Sve pumpe (301, 305, 311, 313) su peristaltičke što omogućava pumpanje odgovarajućeg mlaza iz tekućine bez rotacije i sprječavaju kontakt zatvarača sa sterilnim mlazom produkta. Podnositelji ove prijave su otkrili da je to poželjno kako bi se osigurao dugotrajan sterilan rad. Međutim, mogu se rabiti i druge izvedbe sterilnih pumpi. Pumpa za recikliranje (301) sa svojim sustavom cjevčica smanjena je kako bi se omogućilo podešavanje željene stope unakrsnog protoka između 80 i 800 litara/satu po m2 za predviđenu površinu membrane u ovisnosti o karakteristikama ultrafiltracijskog modula koji se rabi. Pumpa za permeat smanjena je kako bi omogućila precizno podešavanje specifičnog protoka permeata između 90% i 99% stope protoka žetve iz kontinuirane perfuzijske fermentacije. Pumpa za zaostatak je smanjena kako bi omogućila precizno podešavanje protoka zaostatka od između 1% i 10% stope protoka žetve iz kontinuirane perfuzijske fermentacije.

Zatvoreni ultrafiltracijski moduli (303) rabe se kako bi se omogućila robusna sterilna operacija, a steriliziraju se autoklaviranjem. Optimalna nominalna granična molekularna masa odabrana je na osnovu molekularne mase proteina od interesa, a mora se potvrditi standardnim eksperimentima poznatima stručnjacima. Različiti membranski materijali poput polietersulfona, hidroliziranog polietersulfona ili regenerirane celuloze mogu se rabiti sve dok se cijeli membranski modul može sterilizirati zračenjem i/ili autoklaviranjem bez da se membrana ošteti. Očekivano je da hidrofilni materijali mogu povećati učinkovitost zbog njihove smanjene tendencije „obrastanja“.

Podnositelji ove prijave su otkrili da naprava A je posebno učinkovita ukoliko je ukupna ultrafiltracijska površina membrane u kvadratnim metrima podjednaka rasponu između 0.1 i 2 puta od volumetrijske stope protoka za žetve iz kontinuirane perfuzijske fermentacije u litrama/satu. Tako, za perfuzijsku žetvu sa stopom protoka od 1 litra/satu instalirana ukupna membranska površina treba biti između 0.1 i 2 metra kvadratna. Podnositelji ove prijave su otkrili da naprava A je još učinkovitija ukoliko je površina instalirane ultrafiltracijske membrane u metrima kvadratnim podjednaka rasponu od između 0.3 i 1 puta volumetrijske stope protoka za žetvu niz kontinuirane perfuzijske fermentacije u litrama/satu.

U jednoj izvedbi ovoga izuma, rabe se komercijalno dostupni „jednokratni“ moduli s membranama od šupljih vlakana (GE Healthcare, bivši Amersham Biosciences).

Međutim, mogu se rabiti mnoge izvedbe zatvorenih membrana i modula koji postoje poput spiralnih modula, zatvorenih kaseta ili kapsula s povećanim prijenosom zbog sekundarnog obrasca protoka (tj. vrtložnog protoka), rotirajući elementi (tj. dinamični filtri u obliku diska) ili vibrirajući filtri. Očekivano je da se posebice zatvorene ultrafiltracijske kasete mogu korisno rabiti u ovim inventivnim napravama jer osiguravaju velike koeficijente masovnog prijenosa kod relativno niske potrebne stope protoka što smanjuje kapacitet pumpe i održava kompleksnost sustava te smanjuje investicijske troškove.

Inventivna naprava omogućava ne samo kontinuirani već i uistinu sterilni rad suprotno samo aseptičkim uvjetima. Podnositelji ove prijave su ovo postigli dizajniranjem svih komponenti sustava, koji dolaze u kontakt s produktom, takvima da se mogu ne samo očistiti već da ih se može sterilizirati autoklaviranjem, uparivanjem in situ ili zračenjem γ-zrakama. U ovim izvedbama jednokratni zatvoreni moduli se rabe za kontinuirano odstranjivanje čestica (100) kao i za kontinuiranu ultrafiltraciju (300). Peristaltičke pumpe se rabe kako bi se izbjegao kontakt produkta s rotirajućim elementima i mehaničkim zatvaračima. Štoviše, u ovim izvedbama jednokratne cjevčice i vreće se rabe umjesto krutog sustava cjevčica. Jednokratne komponente koje dolaze u kontakt s produktom (tj. cjevčice, vreće, moduli) ili skupine komponenata se najprije sastave i steriliziraju što pojednostavljuje početak operacije. Sustavi su dizajnirani kako bi sprječavali bilo kakvu mogućnost otvaranja sterilnog sustava (tj. hud za laminarni protok) zbog toga jer je tijekom rada uzorkovanje, promjena vreća ili instrumentarija svedena na minimum.

U ovim izvedbama naprava, cijevi s više otvora su dizajnirane tako da se preklapaju kako bi omogućili uključivanje jedne sterilne komponente (poput vreće koja prihvaća produkt) u drugu bez njihovog otvaranja. Dodatne promijene sustava cjevčica, modula ili vreća poželjno se provodi uporabom sterilnih zavarivača za cjevčice umjesto sterilnih spojnica.

Druge buduće izvedbe inventivne naprave također mogu sadržavati komponente poput nehrđajućih posuda, kućišta za filtre ili pipe koje se mogu sterilizirati in situ, kako pojedinačno tako i u kombinaciji s jednokratnim komponentama sve dok se održavaju uvjeti dugotrajnog sterilnog rada.

Dodatne izvedbe inventivne naprave A dizajnirani su kako bi procesirali materijal iz više bioreaktora u velikim proizvodnim centralama (A3). Primjer je prikazan shematski na Slici 5. Daljnje izvedbe su dizajnirane kako bi povećale sveukupni čimbenik koncentriranja i izvedbu odvajanja kombiniranjem 2 stupnja kontinuiranih sustava za ultrafiltraciju (300) u serijama (A4, kako je shematski prikazano na Slici 5).

OPIS POSTUPKA ZA UPORABU NAPRAVE A

Kontinuirane perfuzijske fermentacije operiraju tijekom dugog vremenskog razdoblja (jedna runda), tipično između 2 tjedna i 6 mjeseci ili više. Tekućina iz kulture tkiva (TCF) koja sadrži produkt, stanice i staničnog taloga kontinuirano se procesira s pomoću naprave A. Sterilan, očišćen od čestica, koncentriran i djelomično očišćen mlaz koji sadrži produkt (izolat produkta) nastaje te kontinuirano napušta napravu preko izlaznog ventila (312). Koristeći se pumpom (101) iz kontinuiranog i sterilnog sustava za odstranjivanje čestica (100) žetva se kontinuirano pumpa kroz filtracijski sklop (103) kod željene stope protoka, Qh, perfuzijske žetve iz fermentacije.

Izlazni mlaz kontinuiranog filtracijskog sustava tj. bistra tekućina iz kulture tkiva (cTCF) postojano ulazi u posebnu posudu (201). Iz te posude cTCF se kontinuirano procesira s pomoću kontinuiranog, sterilnog ultrafiltracijskog sustava (300) kod stope protoka koja je podjednaka stopi protoka koja dolazi iz kontinuiranog perfuzijskog sustava fermentacije. Zbog male veličine posebne posude u odnosu na podešene stope protoka, srednje vrijeme zadržavanja produkta u posudi se održava na minimum tj. ispod 12 sati, poželjnije ispod 4 sata, a još poželjnije ispod 2 sata.

Odgovarajući unakrsni protok te s time i masovni prijenos u ultrafiltracijskom modulu podešen je s pomoću pumpe za reciklažu (301). Stopa protoka zaostatka je podešena i kontrolirana uporabom pumpe za zaostatak (311) što osigurava konstantnu i kontinuiranu stopu protoka, Qi, koncentriranog izolata produkta koji napušta napravu A kroz izlazni ventil (312). Pumpa za permeat (305) se rabi za podešavanje i kontroliranje stope protoka, Qp, permeata koji se kontinuirano kreće sa strane permeata iz ultrafiltracijskog/ih modula, a koji sadrži vodu i otopljene komponente koje su tako male da prolaze kroz ultrafiltracijsku membranu (poput soli, malih proteina).

Stope protoka permeata (Qp) i zaostatka/izolata (Qi) su pažljivo podešene i kontrolirane kako bi odgovarale stopu protoka žetve, Qh, iz fermentacije i to tako da:

Qp + Qi = Qh

Istovremeno, stope protoka su podešene i kontrolirane tako da željeni čimbenik koncentriranja bude podešen kako bi zadovoljavao:

Qi = 1/cf * Qh

Primjerice, kako bi se postigao željeni čimbenik koncentriranja produkta od 10 puta u izolatu s obzirom na početnu njegovu koncentraciju u žetvi, Qi se održava na Qi = 1/10 * Qh koristeći se pumpu za zaostatak/izolat (311), dok Qp se održava na Qp = 0.9 * Qh s pomoću pumpe za permeat (305).

Budući da su izlazne stope kontrolirane s pomoću pumpi (305) i (311), ultrafiltracijski sustav automatski osigurava protok od Qp + Qi iz male posebne posude (201).

U slučaju da se primjenjuje izvedba A2 (vidi Sliku 2, desna strana), sterilni mlaz pufera ili vode iz posude 314 se injektiranjem dodaje kontinuiranom ultrafiltracijskom sustavu kontinuirano kod konstantne stope protoka, Qp, koristeći se pumpom za dodavanje pufera (313). Stoga, uvjeti izolata mogu biti podešavani slobodno i kontinuirano tj. s obzirom na ionski jakost, pH, dodavanja stabilizatora itd. Stoga, stope protoka su kontrolirane prema

Qp + Qi = Qh + Qb

Nadalje, omjer stopa protoka može biti izabran tako da se željeni čimbenik koncentriranja cf postiže zadovoljavanjem Qi = 1/cf * (Qh + Qb). Alternativno, ovaj proces se može rabiti samo radi toga da se promijene uvjeti (tj. pH, provodljivost) i to s pomoću definiranja Qi = Qh + Qb.

Novi postupak rabljenja naprave A također je suprotan šaržnim procesima UF (stanje tehnike) s obzirom na operacijsku točku podešavanja same ultrafiltracije. Uobičajeni šaržni procesi UF su konstruirani za točno određeni protok kroz manju membransku površinu tijekom kraćeg vremenskog razdoblja. Šarža UF tako općenito operira kod tranzicijske točke u regiji masovnog prijenosa koja je kontrolirana tlakom (vidi Sliku 9). Ovo dovodi do željenog visokog početnog protoka, koji međutim pada značajno i ubrzano tijekom nekoliko sekunda do minuta jer polarizacija koncentracije ubrzano dovodi do pojave osmotskog pod-tlaka te nastanak ograničenog sloja gela (sekundarna membrana). Takva visoka koncentracija stjenke makromolekula također dovodi do povećanja adsorpcije spojeva na vanjskoj i unutrašnjoj površini membrane tj. do membranskog „obrastanja“. Ovo „obrastanje“ će dodatno smanjiti protok permeata tijekom vremena.

Podnositelji ove prijave su otkrili da s napravom A, višestruko prekoračenje nanošenog uzorka po površini instalirane ultrafiltracijske membrane se može postići radom kod nižeg dijela krivulje ovisnosti protoka o tlaku (vidi Sliku 9).

Normalizirana koncentracija stjenke, cstjenka, potpuno zaustavljenog produkta može se opisati kako slijedi:

cstjenka = eJ/kd x cgrubo

gdje je

J = specifični protok permeata u litrama/satu/m2

kd = koeficijent masovnog prijenosa u litrama/satu/m2

cgrubo = koncentracija komponente u gruboj otopini

Kao i kod šaržnog UF, kontinuirani UF radi kod optimiziranog koeficijenta masovnog prijenosa kako bi se minimizirala polarizacija koncentracije. Međutim, suprotno šaržnoj ultrafiltraciji, podnositelji ove prijave su podesili protok permeata J kako bi se nalazio na niskom kraju krivulje ovisnosti protoka o tlaku (vidi Sliku 9). Kao rezultat eksponencijalnog omjera, koncentracija stjenke cstjenka na površini membrane stoga je značajno smanjena no što bi bila u šaržnoj ultrafiltraciji. Primjera radi, ova izvedba inventivne metode podešava ciljni specifični protok permeata na otprilike 1/10 postignutog koeficijenta masovnog prijenosa te stoga podešava koncentraciju stjenke od oko 10% iznad podešene grube (ili zaostale) koncentracije.

Slijedeća Tablica 1 prikazuje primjer metode za uporabu naprave A (izvedba A1) za kontinuiranu izolaciju proteinskog produkta iz razvojnog bioreaktora.

Tablica 1

Primjer metode za uporabu izvedbe naprave A za kontinuiranu izolaciju proteinskog produkta iz kontinuirane perfuzijske fermentacije

[image]

Za svaku pojedinačnu molekulu produkta može se definirati kriterij polu-života za sterilni kontinuirani ultrafiltracijski sklop primjerice koji se zasniva na trans-membranskom tlaku. Jednom kada je dosegnuto ograničenje trans-membranskog tlaka, kontinuirani sterilnu ultrafiltracijski sklop se zamijeni s identičnim sklopom bez da se narušava integritet i sterilnost sustava. Ovo se može provesti analogno s kontinuiranim, sterilnim filtracijskim sklopom koristeći ili cijev s više otvora i sterilne spojnice ili jednokratne savitljive cjevčice i sterilne zavarivače za cjevčice.

NAPRAVA B

Integrirani kontinuirani sustav za odstranjivanje čestica (100)

Slike 3 prikazuje dvije izvedbe inventivne naprave B. Integrirani kontinuirani sustav za odstranjivanje čestica (100) izravno je povezan na stranu gdje izlazi žetva iz kontinuiranog perfuzijskog fermentacijskog sustava. Ova strana naprave B je identična s istom kod naprave A (vidi detaljan opis naprave A na Slici 4).

Posebna posuda (200)

Izlaz integralnog kontinuiranog sustava za odstranjivanje čestica izravno je i kontinuirano povezan na posebnu posudu (201) kako je prikazano na Slici 3. Ova posuda je sterilna poput jednokratne vreće ili nehrđajuće posude s najmanje jednim ulazom i jednim izlazom, od kojih se zadnji poželjno nalazi pri dnu posude. Široki raspon veličina za posudu je moguć. Međutim, pomoćna posuda poželjno je manja u usporedbi s volumetrijskim protokom sustava kako bi smanjivala vrijeme zadržavanja produkta u posudi primjerice ispod 26 sati, poželjno ispod 12 sati, a najpoželjnije ispod 4 sata.

Kod naprave B, pomoćna posuda je postavljena na vazi ili na težinskoj ćeliji (202) kako je predstavljeno u izvedbama B1 i B2 na Slici 3. Ova vaga ili težinska ćelija šalje signal težine u kompjuterizirani sustav kontrole (nije prikazano).

Dodatno, u izvedbi inventivne naprave (B2), posuda za pufer (204) je spojena preko peristaltičke pumpe (203) na pomoćnu posudu. Tijekom rada, ovakav sklop se rabi za podešavanje parametara mlaza žetve koja je očišćena od čestica poput provodljivosti (ionska jakost) ili pH, dodavanjem komponenata za modificiranje karakteristika bistre tekućine iz kulture tkiva koja dolazi iz sustava za odstranjivanje čestica, poput odgovarajućeg pufera ili razrjeđivača ili pogodnog stabilizatora proteina. U tom slučaju, ova izvedba također obuhvaća sustav za miješanje (205) i senzore koji motre željeno stanje (206) poput pH ili provodljivosti. U ovoj izvedbi, rabi se magnetska miješalica; međutim, drugi sustavi za miješanje poput uređaja za potresanje ili pulsiranje također se mogu rabiti.

U drugoj izvedbi inventivne naprave rabe se dvije posebne posude. U bilo kojem trenutku jedna od posuda je izravno spojena na kontinuirani sustav za odstranjivanje čestica (100) pa stoga i prihvaća bistru tekućinu, dok druga je povezana na polu-kontinuirani sustav za koncentriranje/pročišćavanje (400) s ciljem napajanja konvektivnog ciklusa adsorpcije/desorpcije. Izmjena jedne s drugom omogućeno je kroz sustav kontrole rabeći težinu zaprimajuće posude kao signal promijene jednom kada je dosegnut maksimalni volumen zaprimanja.

Integrirani polu-kontinuirani sustav za koncentriranje/pročišćavanje (400)

Naprava B, čije su dvije izvedbe prikazane na Slici 3, obuhvaća integrirani polu-kontinuirani, konvektivni sustav za adsorpciju/desorpciju (400).

Integrirani polu-kontinuirani konvektivni sustav za adsorpciju/desorpciju je načinjen one veličine tako da njegova stopa početnog protoka (Qpočetni) bude značajno viša nego li stopa protoka kontinuirane perfuzijske žetve i kontinuiranog filtracijskog procesa (Qh) tj. Qpočetno >> Qh.

Izvedbe integriranog polu-kontinuiranog sustava za koncentriranje/pročišćavanje (400) obuhvaća pumpu za nanašanje (401), sklop sa zaliscima za više ulaza (402) te nekoliko posuda za pufer (404), trostruki zalistak (403) koji je spojen na sterilnu posudu za zaprimanje otpada (413) te jedan ili više konvektivnih modula za adsorpciju (406), ulazni i izlazni kalibri za tlak ili prijenosnike (405, 408), dodatni instrumentarij poput UV senzora (409), senzori za pH i provodljivost (409, 410), mjerač protoka (412) kao i dodatni trostruki zalistak (407) koji je spojen također na posudu za otpad (413) te izlaz za eluat produkta (414).

Izvedbe inventivne naprave također obuhvaćaju logere i kontrolni sustav koji se može programirati (nije prikazano) koji snimaju ulazne signale iz instrumentarija (poput, ali nisu time ograničeni, tlaka, UV, pH, provodljivosti, stopu protoka, težinu posebne posude) te kontroliraju automatizirane zaliske i pumpu sukladno protokolu iz programa.

Pumpa za nanašanje (401) poželjno je peristaltička kako bi se izbjegao izravni kontakt produkta ili sterilnih pufera s bilo kojim zatvaračem ili mehaničkim dijelom. Podnositelji ove prijave su otkrili da je ovo vrlo poželjno kako bi se osigurala otporna i sterilna dugotrajna operacija. Međutim, u principu mogu se rabiti i druge izvedbe sterilne pumpe. Pumpa za nanašanje je smanjena u ovisnosti o instaliranom volumena nosača konvektivnog adsorbera (406) kako bi se osiguralo otporno podešavanje od najmanje 12 volumena nosača/minuti. Tako, u ovoj izvedbi se rabe kapsule s membranom za adsorbiranje tipa Mustang (Pall Corp.) koja ima volumen nosača od otprilike 0.3 litara. Stoga, pumpa za nanašanje je smanjena kako bi dozvolila početne stope protoka od najviše 3.6 litara/minuti.

Funkcija sklopa sa zaliscima za više izlaza (402) je ta da omogućava prebacivanje između mlaza koji sadrži početni produkt iz posebne posude (201) i bilo koje od sterilnih pufera i otopina za čišćenja iz posuda sa sterilnim puferom (404). Ove izvedbe naprave B rabe serije zalistaka sa štipaljkom koji rade automatski tako da stišću fleksibilne cjevčice koje su spojene na svaku posudu s puferom izvana kako bi zatvarali i otvarali svaku liniju. Podnositelji ove prijave su otkrili da ovi zalisci osiguravaju posebno korisno rješenje za napravu B budući izbjegavaju kontakt s produktom te stoga ne trebaju biti čišćeni i sterilizirani. Međutim, široki raspon komercijalno dostupnih zalistaka koji su pogodni za sterilno procesiranje, a koji su poznati stručnjacima mogu se rabiti kao membranski zalisci.

U ovoj izvedbi, trostruki zalisci (403, 407) su membranski zalisci koji se mogu autoklavirati. Međutim, mogu se rabiti brojni komercijalno dostupni zalisci pogodni za sterilno procesiranje uključujući na primjer zaliske sa štipaljkom.

Konvektivni modul za adsorbiranje (406) sadrži kromatografski nosač s pre-dominantnim konvektivnim prijenosom mase produkta na adsorptivnu površinu te, suprotno konvencionalnoj kromatografiji, može se sterilizirati autoklaviranjem, vrućom parom ili zračenjem prije rada. Pre-dominantni konvektivni masovni prijenos omogućava, za razliku od konvencionalne kromatografije spakiranih zrnaca, vrlo kratko vrijeme ciklusa adsorpcije/elucije/regeneracije koje su podnositelji ove prijave koristili u inventivnoj napravi kako bi ostvarili polu-kontinuiranu operaciju.

U ovoj izvedbi inventivne naprave, konvektivni adsorber (406) se sastoji od jedne ili više komercijalno dostupnih membranskih kapsula sposobni za izmjenu iona (Mustang, Pall corporation ili Sartobind, Sartorius). Međutim, naprava može rabiti druge membranske adsorpcijske materijale i oblike te nove konvektivne kalupe poput monolitnih kalupa jer je za razliku od konvencionalne kromatografije smolasto pakiranje odbačeno pa kalupi općenito mogu biti ugrađeni u kapsulama koje su odmah spremne za uporabu.

Štoviše, druge izvedbe, uključujući tu i konvektivne afinitetne kalupe koji obuhvaćaju specifične ligande za vezanje produkta se također pokazuju vrlo korisnima za rad inventivne naprave.

U jednoj izvedbi inventivne naprave rabi se višestruki konvektivni adosrpcijski modul u obliku sklopa konvektivnih adsorpcijskih sljedova koji su poredani paralelno, slično kontinuiranom sustavu za odstranjivanje čestica (100). Cijeli sklop sa svim adsorpcijskim sljedovima se može sterilizirati što omogućava izmjenu tijekom rada s jednog na drugi adsorpcijski slijed kada stari dosegne kraj radnog vijeka kao što je unaprijed određeno kriterijima poput pod-tlaka tijekom nanašanja ili maksimalnog borja operacija koje je odradio. Svaki adsorpcijski slijed se sastoji od pojedinačnog ili višestrukih konvektivnih adsorbera postavljenih paralelno i/ili u serijama kako bi se povećao kapacitet vezanja i/ili poboljšalo iskorištavanje kapaciteta.

Vrlo je važno shvatiti da inventivna naprava dozvoljava ne samo kontinuirani, već također i uistinu sterilni rad za razliku od samo aseptičkih uvjeta. Podnositelji prijave ovo su postigli dizajniranjem svih komponenti koji dolaze u kontakt s produktom takvima da ih se može ne samo očistiti, već i sterilizirati autoklaviranjem, uparivanjem in situ ili zračenjem γ-zrakama. U ovoj izvedbi moduli u kapsulama se rabe za kontinuirano odstranjivanje čestica (100) kao i za polu-kontinuiranu sterilnu adsorpciju/desorpciju (400). Peristaltičke pumpe se rabe kako bi se izbjegao bilo kakav kontakt produkta s rotirajućim elementima i mehaničkim poklopcima. Štoviše, u ovoj izvedbi se rabe jednokratne cjevčice te sklopove vreća umjesto pipe. Jednokratne komponente koje sadrže produkt (poput cjevčica, vreća, modula) ili skupine komponenata se najprije sklope i steriliziraju skupa što pojednostavljuje početak procesa. Sustavi su dizajnirani kako bi spriječili bilo kakvu mogućnost otvaranja sterilnog sustava ka atmosferi (poput poklopca za laminarni protok) kao i tijekom uzorkovanja, tijekom izmjene vreća i instrumentarija. U ovoj izvedbi naprave, cjevčice s više otvora su dizajnirani kako bi se ponavljale zato da se omogući izmjena jedne sterilne komponente (poput vreće koja zaprima produkt) sa slijedećom bez otvaranja. Dodatne izmijene cjevčica, modula ili vreća se poželjno izvodi rabeći sterilne zavarivače za cjevčice prije no sterilnih spojnica.

Druge buduće izvedbe inventivnih naprava mogu također obuhvaćati komponente poput nehrđajućih posuda, kućišta za filtre ili pipe koje se mogu sterilizirati in situ, pojedinačno ili u kombinaciji s jednokratnim komponentama sve dok se održavaju otpornost i sterilnost dugotrajne operacije.

Dodatne izvedbe inventivne naprave B su dizajnirane kako bi se procesirao materijal iz višestrukih bioreaktora u velikim proizvodnim sustavima (B3). Jedan primjer shematski je prikazan na Slici 6. Daljnje izvedbe inventivne naprave B su dizajnirane kako bi povećale sveukupni čimbenik koncentriranja i izvedbu odvajanja s pomoću kombiniranja višestrukih konvektivnih sustava za adsorpciju/desorpciju (400) u serijama, s odgovarajućim sterilnim posebnim posudama između njih (200) (vidi Sliku 6, B4).

Druge izvedbe inventivnih naprava su dizajnirane kako bi povećale sveukupni čimbenik koncentriranja i izvedbu odvajanja kombiniranjem kontinuiranog ultrafiltracijskog sustava (300) u serijama s polu-kontinuiranim konvektivnim sustavom za adsorpciju/desorpciju (400) s pomoću dodatne pomoćne posude. Primjer jedne izvedbe je shematski prikazan na Slici 7.

OPIS METODE ZA UPORABU NAPARAVE B

Kontinuirane perfuzijske fermentacije rade tijekom dužeg vremenskog razdoblja (jedna runda), tipično između 2 tjedna i 6 mjeseci ili više. Tekućina iz kulture tkiva (TCF) koja sadrži produkt, stanice i stanični talog je kontinuirano procesirana s pomoću naprave B. Sterilni mlaz koji sadrži produkt, očišćen od čestica, koncentriran i djelomično očišćen («izolat produkta») se procesira te kontinuirano napušta napravu kroz vanjski izlaz (414). Rabeći pumpu (101) iz kontinuiranog, sterilnog sustava za odstranjivanje čestica (100), žetva se kontinuirano pumpa kroz filtracijski sklop (103) kod željene stope protoka perfuzijske žetve Qh iz fermentacije.

Izlazni mlaz kontinuiranog sustava za filtraciju tj. bistra tekućina iz kulture tkiva (cTCF), kontinuirano ulazi u posebnu posudu (201).

Kada se posebna posuda napuni do ranije određene razine, nastale signal težine ili razine koji automatski uključi ciklus adsorpcije/desorpcije iz integriranog, sterilnog polu-kontinuiranog sustava za koncentriranje/pročišćavanje. Materijal koji je sakupljen u posebnoj posudi brzo se nanosi na adsorpcijski sklop primjerice za 4 sata, poželjnije za 2 sata, a još poželjnije za 1 sat ili manje, što omogućava pražnjenje posude. U izvedbi prikazanoj na Slici 3, sakupljanje bistre tekućine iz kulture tkiva koja ne sadrži čestice (cTCF) postojano se odvija tijekom vremena u istoj maloj posebnoj posudi. Volumen ove male posebne posude stoga varira između minimalne i maksimalne vrijednosti. U drugoj opisanoj izvedbi u ranijem tekstu, sakupljanje se izmjenjuje između dvije istovjetne posebne posude.

Dok se cTCF kontinuirano sakuplja u posebnoj posudi, napunjeni adsorber prolazi nekoliko daljnjih koraka iz ranije zadanog protokola, koji je dizajniran da desorbira ciljni produkt u koncentriranom, pročišćenom obliku kako bi priredio adsorber za slijedeći ciklus nanašanja. Tako, cjelokupni ciklus obuhvaća nanašanje, pranje, eluciju, regeneraciju i ponovno uravnoteženje, svaki s jednim ili više pogodnih pufera.

Budući da tijekom ovih koraka stope protoka mogu biti visoke zbog prirode konvektivnih adsorbera, ukupno vrijeme ciklusa se održava čim kraće tj. ispod 6 sati, poželjno ispod 3 sata te još poželjnije ispod 1.5 sati. Stoga, integrirani sustav je dizajniran tako da sklop adsorbera bude spreman za slijedeći ciklus nanašanja uzorka prije no se posebna posuda ponovno napuni, što omogućava polu-kontinuiranu operaciju.

Slijedeća Tablica 2 prikazuje jedan primjer metode za uporabu ove izvedbe u inventivnoj napravi B za izolaciju rekombinantnog ljudskog čimbenika zgrušavanja VIII iz krvi (veća skala nije prikazana). Postupak se pokazao jedinstveno korisnim. Prinosi i izvedba svakog ciklusa adsorpcije/desorpcije bili su slični šaržnoj s povećanjem ukupnog prinosa produkta za više od 10% zbog kratkog vremena zadržavanja produkta što smanjuje raspadanje produkta. Isti postupak se također pokazao vrlo korisnim za izolaciju genetički promijenjenih varijanti čimbenika VIII uključujući čimbenik VIII s odstranjenom B-domenom koji je značajno različit od čimbenika VIII nativne dužine u samoj duljini, ali i u drugim značajkama. Očekuje se da će postupak biti koristan za proizvodnju drugih proteina i biomolekula.

Sam kromatografski protokol (kemija pufera & sekvenci, nanosnih volumena i stope protoka) može se razvijati u eksperimentima šaržne kromatografije za svaku pojedinačnu molekulu te tada može biti uspješno primijenjen u izvedbama ove inventivne naprave.

Tablica 2

Primjer za metodu koja rabi jednu izvedbu naprave B za kontinuiranu izolaciju FVIII i varijanta FVIII iz kontinuirane perfuzijske fermentacije.

[image]

Za svaki individualni molekulski produkt definirani su kriteriji polu-života za sklop konvektivnog adsorbera koji se zasnivaju na tlaku tijekom nanošenja ili obnavljanja. Tipično, maksimalni broj ciklusa nmax je specificiran i potvrđen. Jednom kada se sklop adrosbera rabi u polu-kontinuiranoj operaciji kroz nmax ciklusa zamijeni se s identičnim sklopom adsorbera bez da se naruši integritet i sterilnost sustava. U ovoj izvedbi ovo se postiže analogno kontinuiranom, sterilnom sklopu za filtraciju rabeći ili cjevčicu s više otvora i sterilne spojnice ili rabeći jednokratne savitljive cjevčice i sterilne zavarivače za cjevčice.

Kada se rabi izvedba inventivne naprave prikazane na Slici 3, s desne strane, dodaje se sterilni mlaz pufera, otopinu za podešavanje pH, otopinu za stabilizaciju ili voda za injektiranje ili kontinuirano ili u razmacima iz sterilne posude (204) koristeći se pumpom za dodavanje pufera (203). Stoga, karakteristike cTCF se mogu slobodno podešavati tj., to se odnosi na ionsku jakost, pH, dodavanja stabilizatora i sl.

Koristi od ovoga izuma

Inventivne naprave i odgovarajuće metode za uporabu naprava rješavaju problem konvencionalnih izolacijskih procesa koji su bili navedeni ranije (vidi općenitu pozadinu izuma).

U svim izvedbama naprava A i B te odgovarajućih metoda za njihovu uporabu, vrijeme zaostatka u potencijalno škodljivoj sredini je jedinstveno minimizirano što značajno povećava prinos i kvalitetu prirodno nestabilnih složenih bioloških produkata. Kapacitet postrojenja može se povećati, a troškovi proizvodnje smanjiti.

Štoviše, naprave i odgovarajuće metode eliminiraju potrebu za velikim hladnim postrojenjima ili hlađenim posudama za privremeno skladištenje žetve velikih volumena što smanjuje investiranje u postrojenje te potpuno omogućava prednosti cjelovite i mobilne perfuzijske fermentacije.

Izvedbe obiju inventivnih naprava i odgovarajućih metoda zbog visokog stupnja automatizacije smanjuju troškove rada u usporedbi s konvencionalnim šaržnim procesiranjem koje zahtjeva dodatni rad. Nove naprave omogućavaju kontinuiranu operaciju od 24 h na dan tijekom dužeg vremenskog razdoblja maksimalno povećavajući volumetrijski protok i iskorištavanje opreme.

Nadalje, inventivne naprave eliminiraju logističke poteškoće u postrojenjima s jednim ili više bioreaktora. Izvedbe mogu procesirati materijal iz jedne ili više kontinuiranih perfuzijskih fermentacija.

Važno je to što su, budući nove naprave i metode omogućavaju potpuno sterilnu operaciju, eliminirana pitanja mikrobioloških kontaminacija tijekom nanošenja i pitanja endotoksina koji se nisu mogli riješiti samo aseptičkim procesiranjem koje je bilo praćeno sterilnom filtracijom uzorka.

Dodatno, inventivne naprave omogućavaju izbjegavanje ili minimiziranje potrebe potvrđivanja čistoće zbog uporabe jednokratnih dijelova. Zbog jedinstvenih karakteristika inventivnih naprava i metoda, jednokratnih modula kao i cjevčica, vreća i sklopova svaki se može rabiti kroz duže vremensko razdoblje (sve do kraja jedne runde) što stoga značajno smanjuje troškove i čini uporabu jednokratnih dijelova vrlo privlačnom čisto iz gospodarskih razloga.

Ove izvedbe inventivnih naprava A i B te odgovarajućih metoda pokazale su se posebice korisnima za proizvodnju rekombinantnog čimbenika zgrušavanja VIII kao i njegovih genetički preinačenih verzija uključujući, bez ograničenja, čimbenik FVIII kojemu je izrezana B-domena. Međutim, za izume se može s pravom očekivati da budu podjednako korisni za proizvodnju drugih proteina i bioloških molekula, posebice složenih, nativno nestabilnih proteina poput čimbenika VII, čimbenika IX, čimbenika X i dr.

Prednost naprave A i odgovarajuće metode

Slika 8 prikazuje primjer iznenađujućeg povećanja kapaciteta filtara kojeg su podnositelji ove prijave otkrili za integrirani kontinuirani element odstranjivanja čestica (100).

Slika 10 prikazuje distribuciju tipičnog vremena zadržavanja i srednje vrijeme zadržavanja produkta kontinuiranog sustava UF (300) za jednu izvedbu inventivne naprave A koje je bilo određeno apsorpcijom UV svijetla kod 280 nm u zaostatku s modelnim proteinom u tipičnim uvjetima. Kao što se vidi, srednje vrijeme zadržavanja produkta u sustavu je približno 40 min. Stoga, ukupno vrijeme zadržavanja produkta u ovoj izvedbi naprave A, od žetve koja izlazi iz bioreaktora pa do kraja, je takvo da se koncentrirani zaostatak (izolat) održava unutar 1-2 sata ili manje. Ovo je manje no 1/10 vremena zadržavanja od 28 sati ili više u konvencionalnom šaržnom procesu izoliranja u kojemu se produkt (žetva) sakuplja tijekom najmanje 24 sata (do nekoliko dana) nakon čega se produkt procesira tijekom tipično najmanje 4-10 sati.

Slika 11 prikazuje usporedbu dobivenih ukupnih izolacijskih prinosa rekombinantnog čimbenika zgrušavanja (rFVIII) za kontinuiranu perfuzijsku fermentaciju koja ne sadrži proteine plazme za oba tipa procesa, konvencionalnog šaržnog izolacijskog procesa (šaržna filtracija + šaržna UF) i uporabu inventivne naprave A i odgovarajuće metode. Kao što se može vidjeti iz slike, inventivni kontinuirani proces postiže značajno veći prinos produkta koji može dovesti do povećanja kapaciteta proizvodnje i smanjenja troškova rada.

Tijekom korištenja inventivne metode rabeći napravu A, transmembranski tlak integrirane kontinuirane ultrafiltracije će se povećati tijekom vremena, dok će se specifični membranski protok (u litrama/satu/m2/baru) smanjivati do konstantnog volumetrijskog protoka. Ovo je uobičajeno za sve ultrafiltracijske procese te nastaje zbog učinaka poput polariziranja koncentracije, nastanak sloja gela i izobličenja membrane. Međutim, za razliku od šaržne ultrafiltracije, kao što se može vidjeti iz primjera prikazanog na Slici 12, promijene tlaka i specifičnog protoka su ekstremno spore s napravom A što omogućava kontinuirani rad tjednima prije no će se javiti potreba čišćenja ili zamjene membrane. Dodatno, stopa mijenjanja sveukupnih karakteristika sustava je vrlo neosjetljiva na proizvedeni produkt ili na staničnu liniju koja se rabi u kontinuiranoj perfuzijskoj fermentaciji (Slika 12). Stoga, inventivna naprava A i odgovarajuća metoda također su idealni kao generička platforma za brzu proizvodnju različitih proteina jer njihov rad je robustan i predvidljiv s obzirom na različite ciljne proteine iz različitih staničnih linija.

Iznenađujuće, podnositelji ove prijave su otkrili da negativan učinak nastanka sloja gela i izobličavanje membrane su zapravo toliko minimizirani kod naprave A da je moguće procesirati značajno veće volumene po instaliranoj ultrafiltracijskoj površini prije no će čišćenje ili zamjena filtara postati neophodna. Slika 13 prikazuje robusni rad inventivne naprave A tijekom dugotrajnog rada. Nakon otprilike 25 dana, pokazalo se da transmembranski tlak iznenađujuće ostaje stabilan u polu-mirujućem stanju što sugerira čak i bolji dugotrajni rad. Tijekom 27. dana, stopa protoka zaostatka bila je namjerno dva puta povećana kako bi se testirao učinak većeg protoka. Nakon 34 dana, izvedeno je kratko ispiranje sa sterilnim 0.5 M NaOH bez da se sustav otvara te bez da se narušava integritet i sterilnost cijelog sustava. Nakon toga, TMP se ponovno stabilizirao ili se povećao, ali tek kod ekstremno male stope. Nakon 70 dana kontinuirane, sterilne operacije, reciklažna stopa protoka bila je namjerno smanjena na pola kako bi se testirao učinak na karakteristike sustava. Kao što je bilo očekivano, TMP se počeo povećavati s nešto višom stopom zbog smanjenog transfera mase, a ovo je povećalo koncentraciju stjenke na površini membrane. Međutim, 95 dana rada je bilo uspješno i robusno okončano prije no je sustav bio isključen. Ukupno od blizu 4500 litara je bilo procesirano kroz membranske površine od m2 s minimalnim radom (uzorkovanje se provodilo jedino dnevno). Usporedbe radi, optimizirani konvencionalni šaržni ultrafiltracijski proces za istu primjenu ima 4-5 puta manji kapacitet nanašanja uzorka od otprilike 100 l/m2 te zahtjeva najmanje 1-2 operatora tijekom cijele operacije.

Također iznenađujuće, selektivnost inventivne naprave A, posebice njenog integriranog kontinuiranog ultarfiltracijskog sustava (300), pokazala se značajno većom no selektivnost konvencionalnog šaržnog procesa. Stručnjacima je dobro poznato da tijekom konvencionalne šaržne ultrafiltracije nastaje sekundarna membrana od zaostalih molekula tijekom inicijalne faze procesa (sloj gela) koja smanjuje protočnost jer ograničava prolaznost molekula s određenom molekularnom masom. Rezultat toga je da i ciljne molekule i male molekule kontaminanti počinju zaostajati što simultano pročišćavanje čini nemogućim. Stoga, s konvencionalnom šaržnom ultrafiltracijom rijetko je moguće odvajanje proteina koji imaju manje od 10 puta različitu molekularnu masu. Međutim, kako se može vidjeti na Slici 14, s inventivnim integriranim kontinuiranim ultrafiltracijskim procesom moguće je podesiti uvijete kako bi se učinkovito odvojili IL-2SA (otprilike 16 kD) i zeleni fluorescentni protein GFP (27-30 kD). Ovo razdvajanje koje je osjetljivije nego li očekivano omogućava simultanu koncentraciju i pročišćavanje.

Prednosti naprave B i njene odgovarajuće metode

Slika 15 prikazuje rad inventivne naprave B. Rabeći komercijalni konvektivni adsorber (Mustang G, Pall Corporation, 15-slojni modul), blizu 100 uzastopnih adsorpcijskih/desorpcijskih ciklusa je bilo izvedeno, što znači koncentriranje i pročišćavanje rekombinantne varijante FVIII iz kontinuirane perfuzijske kulture. Prosječni dobiveni prinos je otprilike 95% (srednji rezultati iz nekoliko testova), dok je tlak ostajao relativno konstantan tijekom svih ciklusa koji su izvedeni. Stoga, može se specificirati da se najmanje 100 uzastopnih ciklusa može provesti prije no se mora zamijeniti adsorberski sklop.

Kako je detaljno prikazano u opisu metode koja rabi inventivnu napravu B, ukupno srednje vrijeme zaostajanja produkta u ovoj izvedbi je manje no 3 sata, prije no je produkt eluiran, koncentriran, pročišćen i dobiven u stabiliziranom obliku u odgovarajućem puferu. Ovo je značajno manje no 24 sata vremena zaostajanja u konvencionalnom šaržnom izolacijskom procesu koji se izvodi jednom na dan te stoga rezultira značajno višim prinosima nativno označenim proteinskim produktima. U opisanoj izvedbi, približno 13 ciklusa se provodi na dan, što s obzirom na Sliku 15 znači da polu-kontinuirani adsorberski sklop treba biti zamijenjen jednim svakih 7-8 dana što se čini bez da se naruši sterilnost i kontinuitet operacije.

Slika 16 prikazuje primjer profila UV i provodljivosti tijekom jednog tipičnog adsorpcijsko/desorpcijskog i regeneracijskog ciklusa s napravom B. Može se vidjeti da više od 450 adsorberskih volumena (CV) se mogu nanijeti dok se produkt eluira u vrlo oštrom piku. Kontaminanti su većim dijelom odstranjeni kroz protok tijekom faze nanašanja kao i tijekom ispiranja i skidanja (regeneracijska faza).

Slika 17 ilustrira izvedbu pročišćavanja s pomoću inventivnog procesa koji obuhvaća polu-kontinuiranu konvektivnu adsorpciju/desorpciju. Prikazana je SDS gel elektroforeza izolata varijante FVIII. Kao što se može vidjeti, frakcije eluiranja koje uključuju 95% nanesene varijante FVIII (kao što je određeno testom aktivnog odvajanja) sadrže značajno manje proteina nego li naneseni uzorak te su stoga pročišćene. Ipak, dodatne vrpce raspadanja su vidljive u eluatu (izolatu) uključujući i izvrsnu kvalitetu produkta.

Zaključno, inventivna naprava B je sposobna postići sličnu izvedbu pročišćenja kao i usporedni šaržni procesi, dok istovremeno smanjuje gubitak prinosa za nativno nestabilne proteinske produkte kao i kvalitetu produkta zbog minimiziranja vremena njegovog zaostajanja. Istovremeno, troškovi rada su dramatično smanjeni zbog prirodno velikog stupnja automatizacije inventivnog procesa koji zahtjeva minimalnu intervenciju operatora.

Premda je ovaj izum bio opisan u nekoliko detalja s pomoću ilustracije i primjera radi boljeg razumijevanja, stručnjacima će biti očigledno da određene promijene i modifikacije se mogu primijeniti. Stoga, opis i primjeri ne bi se trebali shvatiti kao ograničenja okvira izuma što je specificirano patentnim zahtjevima.

Prema tome, treba se shvatiti da izvedbe izuma koje osiguravaju poboljšanu metodu filtracije kako bi se dobio visoki prinos molekule od interesa iz određenog mlaza hranjive podloge iz kulture tkiva tek su ilustrativnog karaktera primjene principa izuma. Biti će očigledno iz slijedećeg opisa da će promijene u obliku, metodi uporabe i primjene elemenata razotkrivanja biti moguće bez da se udaljimo od smisla ovoga izuma ili okvira pridodanih zahtjeva.

Claims (9)

1. Proces za pročišćavanje proteina od interesa iz tekuće heterogene mješavine iz kulture tkiva, koji obuhvaća: (a) proizvodnju pomoću kontinuiranog perfuzijskog fermentacijskog procesa tekuće heterogene mješavine iz kulture tkiva koja sadrži protein od interesa; (b) prijenos tekuće mješavine iz kulture tkiva u kontinuirani proces odstranjivanja čestica koji je integriran s procesom kontinuirane perfuzijske fermentacije; (c) odstranjivanje čestica iz tekućine iz kulture tkiva kroz kontinuirani proces za odstranjivanje čestica kako bi se dobila bistra tekućina iz kulture tkiva koja sadrži protein od interesa; (d) prijenos bistre tekućine iz kulture tkiva u kontinuirani proces pročišćavanja koji je integriran s kontinuiranim procesom odstranjivanja čestica, pri čemu kontinuirani proces pročišćavanja je ultrafiltracijski proces i bistra tekućine iz kulture tkiva se filtrira kod specifične stope protoka koja stvara koncentraciju stjenke veću za manje od 20% nego li koncentraciju zaostatka; i (e) pročišćavanje proteina od interesa iz bistre tekućine iz kulture tkiva kroz proces kontinuiranog pročišćavanja; naznačen time da se specifična stopa protoka mješavine kroz kontinuirani perfuzijski fermentacijski proces, kontinuirani proces odstranjivanja čestica i kontinuirani proces pročišćavanja održava u suštini konstantnom.

2. Proces prema zahtjevu 1, naznačen time da se bistra mješavina iz kulture tkiva filtrira kod specifične stope protoka koja stvara koncentraciju stjenke veću za manje od 15% nego li koncentraciju zaostatka.

3. Proces prema zahtjevu 1, naznačen time da se bistra mješavina iz kulture tkiva filtrira kod specifične stope protoka koja stvara koncentraciju stjenke veću za manje od 10% nego li koncentraciju zaostatka.

4. Proces prema zahtjevu 1, naznačen time da se bistra mješavina iz kulture tkiva filtrira kroz ultrafiltracijsku membranu koja ima površinu u metrima kvadratnim koja je između 0.1 do 2 puta stopa volumetrijskog protoka iz kontinuirane perfuzijske fermentacije u litrama/satu.

5. Proces prema zahtjevu 1, naznačen time da se bistra mješavina iz kulture tkiva filtrira kroz ultrafiltracijsku membranu koja ima površinu u metrima kvadratnim koja je između 0.3 do 1 puta stopa volumetrijskog protoka iz kontinuirane perfuzijske fermentacije u litrama/satu.

6. Aparatura za odvajanje proteina od interesa iz tekuće heterogene mješavine iz kulture tkiva, naznačena time da sadrži (a) kontinuirani perfuzijski fermentacijski sustav; (b) kontinuirani sustav za odstranjivanje čestica integriran s perfuzijskim fermentacijskim sustavom; i (c) kontinuirani sustav za pročišćavanje koji je ultrafiltracijski sustav integriran sa sustavom za odstranjivanje čestica; pri čemu se aparatura održava kod sterilnih uvjeta.

7. Aparatura prema zahtjevu 6, naznačena time da sadrži: (a) kontinuirani perfuzijski fermentacijski sustav prilagođen za kontinuiranu proizvodnju tekućine iz kulture tkiva koja sadrži protein od interesa kod u suštini konstantne stope volumetrijskog protoka; (b) kontinuirani sustav za odstranjivanje čestica integriran s perfuzijskim fermentacijskim sustavom i prilagođen kako bi kontinuirano zaprimao tekućinu iz kulture tkiva iz perfuzijskog fermentacijskog sustava te kako bi kontinuirano proizvodio bistru tekućinu iz kulture tkiva; te (c) kontinuirani sustav za pročišćavanje integriran sa sustavom za odstranjivanje čestica i prilagođen za kontinuirano zaprimanje bistre tekućine iz kulture tkiva iz sustava za odstranjivanje čestica te za kontinuiranu proizvodnju izolata produkta koji sadrži protein od interesa; pri čemu se aparatura održava kod sterilnih uvjeta.

8. Aparatura prema zahtjevu 7, naznačena time da ultrafiltracijski sustav obuhvaća ultrafiltracijsku membranu koja ima površinu u metrima kvadratnim koja je između 0.1 i 2 puta stopa volumetrijskog protoka iz kontinuirane perfuzijske fermentacije u litrama/satu.

9. Aparatura prema zahtjevu 7, naznačena time da ultrafiltracijski sustav obuhvaća ultrafiltracijsku membranu koja ima površinu u metrima kvadratnim koja je između 0.3 do 1 puta stopa volumetrijskog protoka iz kontinuirane perfuzijske fermentacije u litrama/satu.