JP6682172B2 - 細胞培養装置及び細胞培養方法 - Google Patents

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Description

開示の技術は、細胞培養装置及び細胞培養方法に関する。
培養液から特定の成分を膜分離処理によって分離する技術として、以下の技術が知られている。
例えば、特許文献１には、バイオリアクタと、バイオリアクタ内の培養液を循環させるサンプリングラインと、サンプリングラインの途中に設けられ、培養液中の汚染微生物を分離するクロスフロー方式の濾過装置と、濾過装置の透過側室とバイオリアクタを接続する回収ラインと、回収ラインの途中に設けられ、汚染微生物を捕集する濾過膜ユニットと、を備えたサンプリング装置が記載されている。
特許文献２には、液体培地を収容する原液タンクと、液体培地中の夾雑物を分離するクロスフロー方式の第１の濾過手段と、第１の濾過手段により濾過された液体培地を更に濾過するデッドエンド方式の第２の濾過手段と、を備えた濾過装置が記載されている。この濾過装置は、更に、第１の濾過手段により濾過された液体培地を貯留する貯留タンクと、貯留タンク内の圧力を調整する圧力調整手段と、貯留タンクに貯留されている液体培地を第２の濾過手段に供給するポンプとを備える。
特許文献３には、培養液を収容し培養液中で菌を培養する培養槽と、培養槽内に配設され、培養液から菌体を分離するスピンフィルタと、培養液から菌が産生した生成物を回収する第１の濾過手段としての限外濾過膜装置を備えた半連続培養装置が記載されている。スピンフィルタは限外濾過膜装置に培養液を供給する培養液導管に接続されており、培養液導管は途中に配設された精密濾過膜装置を介して限外濾過膜装置に接続されている。限外濾過膜装置は培養槽にその濾液を循環させる濾液導管を備えており、濾液導管は精密濾過膜装置を介して培養槽に接続されている。
特開２０１０−２９１０９号公報 特開２０１１−２１１９６１号公報 特開２０１５−５３８９２号公報
細胞が分泌する抗体を利用したバイオ医薬品の製造に用いられる細胞の培養方式として灌流培養がある。灌流培養は、細胞を含む培養液を連続的に濾過及び排出し、一方で栄養成分を含む新鮮な培地を連続的に培養槽に供給する培養方式である。
灌流培養においては、細胞の死骸、細胞の破砕物、ＤＮＡ（deoxyribonucleic acid）、ＨＣＰ（Host Cell Protein）、抗体、老廃物等の細胞培養に不要な成分をより多く排出することで、細胞の増殖が促進され、抗体の生産性は向上する。しかしながら、不要成分の排出量の増加に伴って培地の使用量が増加し、抗体の生産コストが高くなる。
開示の技術は、上記の点に鑑みてなされたものであり、培地の使用量を抑制しつつ抗体の生産性を高めることを可能とすることを目的とする。
開示の技術に係る細胞培養装置の一態様は、細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養容器と、培養容器から抜き出される細胞懸濁液に対して膜分離処理を施す第１のフィルタ膜を有する第１のフィルタ部と、第１のフィルタ膜によって阻止された成分を培養容器に戻す第１の循環流路と、細胞懸濁液の第１のフィルタ膜を透過した成分に対して膜分離処理を施す第２のフィルタ膜を有する第２のフィルタ部と、第２のフィルタ膜を透過した成分を培養容器に戻す第２の循環流路と、第２のフィルタ膜によって阻止された成分を回収する回収流路と、を含む。開示の技術に係る細胞培養装置において、第１のフィルタ膜の平均孔径が２０μｍ以下であり、第１のフィルタ膜の平均孔径をＡ、第２のフィルタ膜の平均孔径をＢとした場合、０＜Ｂ／Ａ≦０．５を満たしている。
開示の技術に係る細胞培養装置の更なる一態様は、細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養容器と、培養容器から抜き出される細胞懸濁液に対して膜分離処理を施す第１のフィルタ膜を有する第１のフィルタ部と、第１のフィルタ膜によって阻止された成分を培養容器に戻す第１の循環流路と、細胞懸濁液の第１のフィルタ膜を透過した成分に対して膜分離処理を施す第２のフィルタ膜を有する第２のフィルタ部と、第２のフィルタ膜を透過した成分を培養容器に戻す第２の循環流路と、第２のフィルタ膜によって阻止された成分を回収する回収流路と、を含み、第１のフィルタ膜の平均孔径が２０μｍ以下であり、第２のフィルタ膜が限外濾過膜である。
第２のフィルタ膜による膜分離処理の方式が、デッドエンド方式であってもよい。この場合、回収流路は、第１のフィルタ部と第２のフィルタ部の間に設けられていてもよい。
第２のフィルタ膜による膜分離処理の方式が、タンジェンシャルフロー方式であってもよい。この場合、回収流路は、第２のフィルタ部の、第２のフィルタ膜によって阻止された成分を第２のフィルタ部の外部に流出させる流出口に接続されていてもよい。
開示の技術に係る細胞培養装置は、第２のフィルタ部の透過側から供給側に向かう液流を発生させる送液部を更に含んでいてもよい。
第２のフィルタ膜の平均孔径が０μｍより大きく１μｍ以下であることが好ましい。
第１のフィルタ膜は、第１の面に形成された入側の開口と、第１の面とは反対側の第２の面に形成され且つ入側の開口と連通する出側の開口と、を有していてもよく、入側の開口と出側の開口とが膜面と平行な方向においてずれた位置に配置されていてもよい。
第１のフィルタ膜は、第１の面に形成された入側の開口と、第１の面とは反対側の第２の面に形成され且つ入側の開口と連通する出側の開口と、を有していてもよく、入側の開口と出側の開口とを接続する経路が非直線状であってもよい。
第１のフィルタ膜は、繊維状部材を綾畳織りして形成されたメッシュを含んで構成されていてもよい。この場合、メッシュが金属で構成されていてもよい。
第１のフィルタ膜が、精密濾過膜であってもよい。
第２のフィルタ膜が、精密濾過膜であってもよい。
また、第２のフィルタ膜が、限外濾過膜であってもよい。この場合、第２のフィルタ膜の分画分子量が、０ｋＤａより大きく１００ｋＤａ以下であることが好ましく、３０ｋＤａ以上７０ｋＤａ以下であることが更に好ましい。
開示の技術に係る細胞培養方法の一態様は、細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養容器から抜き出された細胞懸濁液に対して第１のフィルタ膜を用いて膜分離処理を施し、第１のフィルタ膜によって阻止された成分を培養容器に戻す第１の膜分離工程と、第１のフィルタ膜を透過した成分に対して第２のフィルタ膜を用いて膜分離処理を施し、第２のフィルタ膜を透過した成分を培養容器に戻す第２の膜分離工程と、第２のフィルタ膜によって阻止された成分を、回収流路を介して回収する回収工程と、を含む。第１のフィルタ膜の平均孔径が２０μｍ以下であり、第１のフィルタ膜の平均孔径をＡ、第２のフィルタ膜の平均孔径をＢとした場合、０＜Ｂ／Ａ≦０．５を満たすように、第１のフィルタ膜及び第２のフィルタ膜を構成する。
開示の技術に係る細胞培養方法の更なる一態様は、細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養容器から抜き出された細胞懸濁液に対して第１のフィルタ膜を用いて膜分離処理を施し、第１のフィルタ膜によって阻止された成分を培養容器に戻す第１の膜分離工程と、第１のフィルタ膜を透過した成分に対して第２のフィルタ膜を用いて膜分離処理を施し、第２のフィルタ膜を透過した成分を培養容器に戻す第２の膜分離工程と、第２のフィルタ膜によって阻止された成分を、回収流路を介して回収する回収工程と、を含み、第１のフィルタ膜の平均孔径が２０μｍ以下であり、第２のフィルタ膜が限外濾過膜である。
回収工程において回収される成分の１日あたりの分量と、培養容器に収容されている細胞懸濁液の分量との比である灌流比をＸとし、第１の膜分離工程において第１のフィルタ膜を透過する成分の１日あたりの分量と、培養容器に収容されている細胞懸濁液の分量との比である循環比をＹとした場合、１．５≦Ｙ／Ｘを満たすように、灌流比及び循環比を定めることが好ましい。
灌流比が０．１以上２以下であることが好ましく、循環比が０．２以上１０以下であることが好ましい。
培養容器に収容された細胞懸濁液に含まれる細胞の濃度を２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上とし、且つ培養容器内に収容された細胞懸濁液に含まれる、粒径が２μｍ以上４μｍ以下の微粒子の濃度を４０×１０７個／ｍｌ以下とすることが好ましい。
第１の膜分離工程における膜分離処理において、細胞の透過率を２０％以下とし且つ粒径が２μｍ以上４μｍ以下の微粒子の透過率を３０％以上とすることが好ましい。
第２のフィルタ膜を透過した成分に含まれる、粒径が２μｍ以上４μｍ以下の微粒子の濃度を１×１０７個／ｍｌ以下とすることが好ましい。
細胞が抗体を発現する細胞である場合、培養容器に収容された細胞懸濁液に含まれる細胞の濃度を２×１０７個／ｍｌ以上とし、培養容器に収容された細胞懸濁液に含まれる抗体の濃度を４ｇ／ｌ以下とすることが好ましい。
細胞が抗体を発現する細胞である場合、第１の膜分離工程における膜分離処理において、抗体の透過率を３０％以上とすることが好ましい。
細胞が抗体を発現する細胞である場合、第２のフィルタ膜を透過した成分に含まれる抗体の濃度を１ｇ／ｌ以下とすることが好ましい。
細胞が抗体を発現する細胞である場合、第２のフィルタ膜によって阻止された成分に含まれる抗体の濃度を０．５ｇ／ｌ以上とすることが好ましい。
第１のフィルタ膜による膜分離処理の方式が、タンジェンシャルフロー方式であってもよい。
第２のフィルタ膜による膜分離処理の方式が、タンジェンシャルフロー方式であってもよい。
第２のフィルタ膜による膜分離処理の方式が、デッドエンド方式であってもよい。
第２のフィルタ膜による膜分離処理の方式が、デッドエンド方式である場合、開示の技術に係る細胞培養方法は、第２のフィルタ膜の膜面の透過側から供給側に向かう液流によって第２のフィルタ膜によって阻止された成分を回収流路に送る逆洗工程を更に含んでいてもよい。
第２のフィルタ膜による膜分離処理の方式が、タンジェンシャルフロー方式である場合、回収工程において、第２のフィルタ膜によって阻止された成分を連続的に回収流路に送ってもよい。
細胞がＣＨＯ細胞であってもよい。
開示の技術によれば、培地の使用量を抑制しつつ抗体の生産性を高めることが可能となる。
開示の技術の第１の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る第１のフィルタ膜として使用される、メッシュフィルタの構造の一例を示す断面図である。 開示の技術の実施形態に係る第１のフィルタ膜として用いることができる綾畳織メッシュの構造を示す斜視図である。 綾畳織メッシュの開口を拡大して示す斜視図である。 綾畳織メッシュを透過する流体の流れを示す図である。 開示の技術の第２の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。 開示の技術の第３の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置を用いて細胞の培養を行ったときの条件を示す図表である。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置を用いて細胞の培養を行い、複数の項目について評価した結果を示す図表である。 分画分子量と限外濾過膜の平均孔径との関係を表すグラフである。
以下、開示の技術の実施形態の一例を、図面を参照しつつ説明する。なお、各図面において同一又は等価な構成要素及び部分には同一の参照符号を付与している。
［第１の実施形態］
図１は、開示の技術の第１の実施形態に係る細胞培養装置１００の構成を示す図である。細胞培養装置１００は、例えば、動物細胞において、抗体を発現させるための細胞培養に好適に用いることができる。
抗体の発現に用いる細胞としては、特に限定されないが、動物細胞、植物細胞、酵母などの真核細胞、枯草菌などの原核細胞及び大腸菌などが挙げられる。ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ−２１細胞及びＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞などの動物細胞が好ましく、ＣＨＯ細胞がより好ましい。
動物細胞において、発現させる抗体としては、特に限定されないが、例えば、抗ＩＬ−６レセプター抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗グリピカン−３抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体及び抗ＶＬＡ４抗体などが挙げられる。抗体としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ及びサル等の動物由来のモノクローナル抗体だけでなく、キメラ抗体、ヒト化抗体及びｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ抗体など人為的に改変した抗体も含む。
得られた抗体又はその断片は、均一にまで精製することができる。抗体又はその断片の分離及び精製は通常のポリペプチドで使用されている分離及び精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルタ、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及び等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離及び精製することができるが、これらに限定されるものではない。得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法（Enzyme-linked immunosorbent assay；ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。
細胞培養装置１００は、細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養容器１０と、培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液に対して膜分離処理を施す第１のフィルタ膜２４を有する第１のフィルタ部２０と、第１のフィルタ膜２４によって阻止された成分を培養容器１０に戻す第１の循環流路としての流路５２とを含む。細胞培養装置１００は、更に、細胞懸濁液の第１のフィルタ膜２４を透過した成分に対して膜分離処理を施す第２のフィルタ膜３４を有する第２のフィルタ部３０と、第２のフィルタ膜３４を透過した成分を培養容器１０に戻す第２の循環流路としての流路５４と、第２のフィルタ膜３４によって阻止された成分を回収する回収流路５６、５７と、を有する。
培養容器１０は、抗体の発現に用いる細胞と培地とを含む細胞懸濁液を収容する容器である。培養容器１０の内部には、撹拌翼１１を有する撹拌装置が設けられている。撹拌翼１１を回転させることで、培養容器１０の内部に細胞とともに収容された培地が撹拌され、培地の均質性が保たれる。
流路５１は、一端が培養容器１０の底部に接続され、他端が第１のフィルタ部２０の流入口２０ａに接続されている。流路５１の途中には、培養容器１０に収容されている細胞懸濁液を抜き出して、第１のフィルタ部２０に送るポンプＰ１が設けられている。
第１のフィルタ部２０は、容器２１と、容器２１内の空間を供給側２２と透過側２３とに隔て、培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液に対して膜分離処理を施す第１のフィルタ膜２４と、を備える。また、第１のフィルタ部２０は、供給側２２において、細胞懸濁液が流入する流入口２０ａと細胞懸濁液が流出する流出口２０ｂとを有する。培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液は、流入口２０ａから容器２１の内部に流入して流出口２０ｂから容器２１の外部に流出する間に第１のフィルタ膜２４上を通過する。第１のフィルタ部２０は、膜分離処理の対象となる液体を第１のフィルタ膜２４の膜面に沿って（膜面と平行な方向に）流しながら、透過成分を透過側に送るタンジェンシャルフロー（クロスフロー）方式による膜分離処理を行う。第１のフィルタ膜２４による膜分離処理の方式である、タンジェンシャルフロー方式は、培養容器から抜き出された細胞懸濁液が第１のフィルタ膜２４の膜面に沿って平行に一方向に循環する流れを形成するものであってもよいし、細胞懸濁液が第１のフィルタ膜２４の膜面に沿って平行に交互に往復する流れを形成するものであってもよい。循環する流れを形成する場合、例えばスペクトラムラボラトリーズ社のＫｒｏｓＦｌｏ灌流培養フローパス装置（ＫＭＬ−１００、ＫＰＳ−２００、ＫＰＳ−６００）を好適に用いることができる。また交互に往復する流れを形成する場合、ＲＥＰＬＩＧＥＮ社のＡＴＦｓｙｓｔｅｍを好適に用いることができる。
細胞懸濁液に含まれる比較的サイズの大きい成分は、第１のフィルタ膜２４を透過せず、流出口２０ｂから容器２１の外部に流出し、流路５２を介して培養容器１０の内部に戻される。すなわち、培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液のうち、第１のフィルタ膜２４によって阻止された成分は、流路５２を介して培養容器１０の内部に戻される。なお、流路５２は、開示の技術における第１の循環流路の一例である。一方、細胞懸濁液に含まれる比較的サイズの小さい成分は、第１のフィルタ膜２４を透過して、透過側２３に設けられた排出口２０ｃから容器２１の外部に排出される。第１のフィルタ部２０の透過側２３には、ポンプＰ２が設けられた流路５３が接続されており、透過側２３に排出された成分は、流路５３を介して第２のフィルタ部３０に送られる。
本実施形態に係る細胞培養装置１００において、第１のフィルタ膜２４は、細胞と、細胞培養に不要な成分と、を分離する目的で用いられる。細胞培養に不要な成分として、細胞の死骸、細胞の破砕物、ＤＮＡ、ＨＣＰ、抗体、老廃物等が挙げられる。すなわち、第１のフィルタ膜２４は、細胞の死骸、細胞の破砕物、ＤＮＡ、ＨＣＰ、抗体、老廃物等の細胞培養に不要な成分を透過させる一方、細胞の透過を阻止するのに好適な分離性能を有している。なお、培養容器１０内で培養される細胞のサイズは、２０μｍよりも大きいことが想定される。また、細胞の死骸及び細胞の破砕物のサイズは、１μｍ以上１０μｍ以下であることが想定される。また、ＤＮＡ、ＨＣＰ及び抗体のサイズは、数十ｎｍ程度であることが想定される。
第１のフィルタ膜２４の平均孔径は、０を超えており且つ２０μｍ以下であることが好ましく、０．０５μｍ以上１０μｍ以下がより好ましく、０．１μｍ以上９μｍ以下が更に好ましく、２μｍ以上８μｍ以下が最も好ましい。第１のフィルタ膜２４の平均孔径を２０μｍ以下とすることで、細胞が第１のフィルタ膜２４を透過してしまうリスクを低減することができ、培養容器１０内の細胞数の減少を抑制することができる。なお、第１のフィルタ膜２４の平均孔径は、メッシュを使用する場合は９５％分離粒子径で測定することができ、精密濾過膜又は限外濾過膜を用いる場合は水銀圧入法で測定することができる。なお、限外濾過膜（ＵＦ膜（Ultrafiltration Membrane）とも称することがある）とは、精密濾過膜（ＭＦ膜（Microfiltration Membrane）とも称することがある）より平均孔径が小さく、平均孔径が０．００１〜０．０１μｍであり、その分離性能が分画分子量で定義される濾過膜である。
孔径が小さい限外濾過膜においては、水銀圧入法では平均孔径の測定が難しい場合がある。その場合、限外濾過膜の平均孔径は、分画分子量に基づいて推算することができる。具体的には、http://chemeng.in.coocan.jp/memb/m_mb4.htmlに記載されているように、既知の分子量を有する複数種類の標準物質を、対象となる限外濾過膜に透過させ、阻止率が９０％となるときの標準物質の分子量を、当該限外濾過膜の分画分子量とする。標準物質の分子量から分子径を推算することができるため、限外濾過膜の平均孔径は、分画分子量に基づいて推算することができる。具体的には、表１に記載のように、分画分子量から平均孔径を推算する。分画分子量が標準物質の分子量と一致しない場合には、分画分子量と平均孔径をプロットし、線形補間等により内挿することによって、平均孔径を推算することができる。一例として、表１の分画分子量と平均孔径をプロットして内挿を行ったときの例を図７に示す。このように得られた推算値を、限外濾過膜の平均孔径として用いることができる。
第１のフィルタ膜２４として、繊維状部材を網目状に織ることにより構成されるメッシュフィルタを用いることが可能である。第１のフィルタ膜として、メッシュフィルタを用いることで、中空糸膜を用いる場合と比較して、細胞の死骸及び細胞の破砕物を含む細胞培養に不要な成分の透過側への排出を促進させることができる。これにより、培養容器１０内から細胞培養に不要な成分を効果的に除去することができ、培養容器１０内における細胞の増殖性を高めることができる。
また、第１のフィルタ膜２４として、精密濾過膜及び限外濾過膜等の中空糸膜を用いることができる。第１のフィルタ膜２４として中空糸膜を用いることで、メッシュフィルタを用いる場合と比較して、細胞が透過側に透過するリスクを低減することができる。また、第１のフィルタ膜２４に細胞が入り込むことによる目詰まりの発生のリスクを低減することができる。これらより、細胞のロスを低減することができる。
図２は、第１のフィルタ膜２４として使用することができる、メッシュフィルタの構造の一例を示す断面図である。なお、第１のフィルタ膜２４として使用することができるフィルタは、図２に示されるものに限定されない。図２には、第１のフィルタ膜２４を用いて、細胞Ｃと、デブリスＤとを分離する場合が例示されている。なお、デブリスＤは、細胞の死骸、細胞の破砕物、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＨＣＰ（宿主細胞由来タンパク質）、抗体、老廃物等の細胞培養に不要な成分である。
第１のフィルタ膜２４は、供給側の第１の面ＦＩ１に形成された入側の開口ＯＰ１と、透過側の第２の面ＦＩ２に形成され且つ開口ＯＰ１と連通する出側の開口ＯＰ２と、を有する。開口ＯＰ１と開口ＯＰ２とは、第１のフィルタ膜２４の膜面と平行な方向に互いにずれた位置に配置されている。換言すれば、開口ＯＰ１と開口ＯＰ２とを接続する経路が非直線状であり、屈曲又は湾曲している。本実施形態において、開口ＯＰ１と開口ＯＰ２は、互いに重なる部分を有していない。すなわち、第１のフィルタ膜２４は第１の面ＦＩ１と第２の面ＦＩ２との間を直線的に貫通する見通し孔を有していない。なお、開口ＯＰ１と開口ＯＰ２とが部分的に重なっていてもよい。第１のフィルタ膜２４は、例えば、金属又はプラスチックなどからなる繊維状部材を編み込むことによって形成される。
上記の構造を有する第１のフィルタ膜２４を用いることで、第１のフィルタ部２０の供給側を第１のフィルタ膜２４の膜面に沿って流れる細胞Ｃは、供給側の開口ＯＰ１から第１のフィルタ膜２４の内部に侵入し得る。しかしながら、第１のフィルタ膜２４の透過側の開口ＯＰ２は、供給側の開口ＯＰ１からずれた位置に配置されているので、或いは開口ＯＰ１と開口ＯＰ２とを接続する経路が非直線状であるので、第１のフィルタ膜２４の内部に侵入した細胞Ｃは、デブリスＤと比較して透過側に容易に流出することができない。
一方、デブリスＤは、細胞Ｃのサイズよりも十分に小さいので、第１のフィルタ膜２４の透過側に容易に流出することができる。また、デブリスＤは、第１のフィルタ膜２４の開口ＯＰ１に侵入した細胞Ｃの脇を抜けて透過側に流出することもできる。
例えば、繊維状部材を平織りすることにより形成される単純なメッシュ状のフィルタ膜を用いて膜分離処理を行った場合には、細胞は変形することによって容易にフィルタ膜の網目を抜けて透過側に流出する。細胞の透過側への流出を防止するために、フィルタ膜の網目のサイズを小さくすると、目詰まりが生じ、また、フィルタ膜の網目によって細胞が分断され、透過側に流出する。このように、膜分離処理において、平織りメッシュ等の単純な構造のフィルタ膜を用いた場合には、フィルタ膜の網目のサイズを適宜選択しても、細胞とデブリスとの分離を適切に行うことが困難となることがある。
これに対し、図２に示す構造のフィルタ膜によれば、透過側の開口ＯＰ２は、供給側の開口ＯＰ１からずれた位置に配置されているので、或いは開口ＯＰ１と開口ＯＰ２とを接続する経路が非直線状であるので、第１のフィルタ膜２４の内部に侵入した細胞Ｃの透過側への流出が抑制され、細胞Ｃと、デブリスＤとを適切に分離することができる。また、細胞Ｃは、第１のフィルタ膜２４の厚さ方向における深部にまで侵入することが困難となるため、フィルタ膜の閉塞（目詰まり）を抑制することができ、また、膜分離処理において細胞が受けるダメージを小さくすることができる。
第１のフィルタ膜２４として、例えば、図３Ａに示すような、繊維状部材を綾畳織りして形成される綾畳織メッシュ２００を好適に用いることができる。綾畳織メッシュ２００は、隣り合う横糸２０１同士が密接し且つ一定の間隔を有して通る縦糸２０２を横糸２０１が例えばｎ本ずつ乗り越えながら縦糸２０２に絡むように編みこまれた構造を有する。なお、ｎは２以上の自然数である（ｎ≧２）。綾畳織メッシュ２００は、網目の見通し孔がなく、横糸２０１と縦糸２０２との交差部に形成される隙間によって開口が形成される。綾畳織メッシュ２００に用いられる繊維状部材は、例えばステンレス等の金属又はポリエステル等の樹脂で構成され、ステンレス等の金属が好ましい。
図３Ｂは、綾畳織メッシュ２００の開口ＯＰを拡大して示す斜視図である。綾畳織メッシュ２００の開口ＯＰは、２本の横糸２０１と１本の縦糸２０２の織りによって生じる隙間によって形成される。なお、綾畳織メッシュ２００の開口ＯＰの平均孔径は、標準粒子による濾過試験を行い、阻止率９５％となる粒子径（すなわち、粒子透過試験による９５％分離粒子径）として算出される。
またフィルタ膜が精密濾過膜又は限外濾過膜の場合、水銀圧入法により平均孔径を測定できる。例えば、島津製作所製のオートポアＩＶ９５２０を用いて、フィルタに高圧で水銀を圧入することで測定することができる。水銀圧入法による平均孔径の測定が難しい場合、限外濾過膜の平均孔径は、先述したとおり、分画分子量に基づいて求めることができる。
図３Ｃは、綾畳織メッシュ２００の断面構造を示す図である。図３Ｃには、綾畳織メッシュ２００を透過する流体の流れが矢印で示されている。綾畳織メッシュ２００は、厚さ方向に直線的に貫通する見通し孔を有しないため、綾畳織メッシュ２００を透過する流体は、流れ方向を変えながら透過側に向けて流れる。従って、流体に含まれる比較的径の大きい粒子は、透過側に流出せずに供給側に残り易い。すなわち、綾畳織メッシュ２００を第１のフィルタ膜２４として使用することで、図２に示す典型構造の場合と同様、細胞懸濁液の膜分離処理において、細胞の透過側への流出を抑制することができる。
図１に示すように、第１のフィルタ部２０の透過側は、流路５３を介して第２のフィルタ部３０の供給側３２に接続されている。流路５３の途中には、バルブＶ１、Ｖ２及びポンプＰ２が設けられている。バルブＶ１、Ｖ２は、第１のフィルタ膜２４を透過した透過液を、第１のフィルタ部２０から第２のフィルタ部３０に送る場合に開状態に制御され、それ以外の場合は閉状態に制御される。
第２のフィルタ部３０は、容器３１と、容器３１内の空間を供給側３２と透過側３３とに隔て、第１のフィルタ膜２４を透過した透過液に対して膜分離処理を施す第２のフィルタ膜３４と、を備える。また、第２のフィルタ部３０は、供給側３２において、細胞懸濁液が流入する流入口３０ａを有する。第１のフィルタ膜２４を透過した透過液は、流入口３０ａから容器３１の内部に流入する。本実施形態において、第２のフィルタ部３０は、供給側３２の液体の略全量を濾過するデッドエンド方式による膜分離処理を行う。
第１のフィルタ膜２４を透過した透過液に含まれる比較的サイズの大きい成分は、第２のフィルタ膜３４を透過せず、第２のフィルタ膜３４の膜面又は第２のフィルタ部３０の供給側３２に残留する。一方、第１のフィルタ膜２４を透過した透過液に含まれる比較的サイズの小さい成分は、第２のフィルタ膜３４を透過して透過側３３に透過する。第２のフィルタ部３０の透過側３３には、排出口３０ｃが設けられており、排出口３０ｃには流路５４が接続されている。第２のフィルタ膜３４を透過した成分は、排出口３０ｃから容器３１の外部に排出され、流路５４を介して培養容器１０に戻される。なお、流路５４は、開示の技術における第２の循環流路の一例であり、一端が第２のフィルタ部３０の透過側３３に接続され、他端が培養容器１０に接続されている。
本実施形態に係る細胞培養装置１００において、第２のフィルタ膜３４は、第１のフィルタ膜２４を透過した透過液に含まれる、抗体を含む培養に不要な成分と、培地とを分離する目的で用いられる。すなわち、第２のフィルタ膜３４は、抗体を含む細胞培養に不要な成分の透過を阻止するのに好適な分離性能を有している。
第２のフィルタ膜３４の平均孔径は、１μｍ以下であることが好ましく、０．１μｍ以下であることがより好ましく、０．０５μｍ以下であることが更に好ましく、０．０１μｍ以下であることが最も好ましい。第２のフィルタ膜３４の平均孔径を、１μｍ以下とすることで、抗体を含む細胞培養に不要な成分が流路５４を介して培養容器１０に戻るリスクを低減することができる。なお、第２のフィルタ膜３４の平均孔径は、メッシュを使用する場合は９５％分離粒子径で測定することができ、精密濾過膜又は限外濾過膜を用いる場合は水銀圧入法で測定することができる。
また、第１のフィルタ膜２４の平均孔径をＡ、第２のフィルタ膜３４の平均孔径をＢとした場合、両者の平均孔径比（Ｂ／Ａ）は、下記の（１）式を満たすことが好ましい。
０＜Ｂ／Ａ≦０．５ ・・・（１）
なお、第１のフィルタ膜２４と第２のフィルタ膜３４の平均孔径比（Ｂ／Ａ）は、０．０００１以上０．３以下がより好ましく、０．００１以上０．２以下が更に好ましく、０．００１以上０．１以下が最も好ましい。第１のフィルタ膜２４と第２のフィルタ膜３４の孔径比（Ｂ／Ａ）を０．５以下とすることにより、細胞培養に不要な成分が培養容器１０に戻るリスクを低減することができる。
第２のフィルタ膜３４として、中空糸精密濾過膜を用いることができる。第２のフィルタ膜３４として中空糸精密濾過膜を用いることで、中空糸限外濾過膜を用いる場合と比較して、目詰まりが発生するリスクを低減することができる。
また、第２のフィルタ膜３４として、本開示の一態様においては、中空糸限外濾過膜を用いる。第２のフィルタ膜３４として中空糸限外濾過膜を用いることで、中空糸精密濾過膜を用いる場合と比較して、抗体を含む細胞培養に不要な成分を効果的に捕集することができる。
また、第２のフィルタ膜３４として中空糸限外濾過膜を用いる場合、中空糸限外濾過膜の分画分子量が１００ｋＤａ以下が好ましく、１ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下がより好ましく、１０ｋＤａ以上８０ｋＤａ以下が更に好ましく、３０ｋＤａ以上７０ｋＤａ以下が特に好ましく、６０ｋＤａ以上７０ｋＤａ以下が最も好ましい。第２のフィルタ膜３４として用いる中空糸限外濾過膜の分画分子量を１００ｋＤａ以下とすることで、抗体を含む細胞培養に不要な成分をより効果的に捕集することができる。また、細胞からサイトカインなどの成長因子が出されるが、成長因子は極力培養槽内に戻した方が細胞増殖性に好影響を及ぼす。成長因子の分子量は１０００〜３００００程度であるため、第２フィルタ膜３４の分画分子量の下限を、上述の範囲ように、成長因子の分子量以上の分画分子量に設定することが好ましい。
なお中空糸限外濾過膜の分画分子量については、既知の分子量を有する標準物質を透過させ、阻止率９０％に相当する分子量から算出される。
流路５４の途中には、第２のフィルタ部３０の透過側３３の近傍にバルブＶ３が設けられている。バルブＶ３は、第２のフィルタ膜３４を透過した成分を培養容器１０に送る場合に開状態に制御され、それ以外の場合は閉状態に制御される。
本実施形態に係る細胞培養装置１００は、第２のフィルタ膜３４によって阻止された抗体を含む細胞培養に不要な成分を回収する回収手段を有する。上記の回収手段は、逆洗流路５５、ポンプＰ３、回収流路５６、５７及び回収タンク４０を含んで構成されている。なお、ポンプＰ３は、開示の技術における送液部の一例である。
逆洗流路５５は、バルブＶ３の入側と出側をバイパスするバイパス流路を形成している。ポンプＰ３は、逆洗流路５５の途中に設けられており、通常の膜分離処理の際に発生する液流とは逆向きの、第２のフィルタ部３０の透過側３３から供給側３２に向かう液流を発生させることで、第２のフィルタ膜３４の逆洗処理を行う。逆洗処理が行われている間、バルブＶ３は閉状態に制御され、逆洗に使用される液は、逆洗流路５５を流れ、第２のフィルタ膜３４に供給される。第２のフィルタ膜３４に対して逆洗処理を行うことで、第２のフィルタ膜３４の膜面及び第２のフィルタ部３０の供給側３２に残留する抗体を含む培養に不要な成分が、第２のフィルタ部３０の流入口３０ａから排出される。
回収流路５６は、第２のフィルタ部３０の流入口３０ａの近傍において、第１のフィルタ部２０の透過側２３と第２のフィルタ部３０の供給側３２とを接続する流路５３に接続されている。逆洗処理が行われている間、バルブＶ１、Ｖ２及びＶ３は閉状態に制御され、バルブＶ４は開状態に制御される。これにより、逆洗処理によって第２のフィルタ部３０の流入口３０ａから排出された抗体を含む培養に不要な成分は、回収流路５６を介して回収タンク４０に収容される。回収タンク４０に収容された抗体を含む培養に不要な成分は、回収流路５７を介して、次工程である抗体の精製工程に送られる。
細胞培養装置１００は、新鮮な培地を培養容器１０に供給するための培地供給流路５８と、培地供給流路５８の途中に設けられたポンプＰ４を有する。また、細胞培養装置１００においては、培養容器１０内の細胞の濃度が過度に高くなることを防止するために、培養期間内における適切なタイミングで培養容器１０内の細胞の一部（例えば１０％程度）を抜き取るセルブリード処理が行われる。セルブリード処理において、培養容器１０内の細胞は、流路５９を介して培養容器１０の外部に排出される。また、細胞培養装置１００は、ポンプＰ１〜Ｐ４、バルブＶ１〜Ｖ４を制御する図示しない制御部を有している。
以下に、細胞培養装置１００の動作について説明する。
細胞培養装置１００において、第１のフィルタ部２０及び第２のフィルタ部３０において膜分離処理を行う場合、ポンプＰ１及びＰ２が駆動状態とされ、ポンプＰ３が停止状態とされる。また、バルブＶ１、Ｖ２及びＶ３が開状態に制御され、バルブＶ４が閉状態に制御される。
ポンプＰ１が駆動されることで、培養容器１０内に収容されている細胞懸濁液が、第１のフィルタ部２０の供給側２２に送られる。培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液は、第１のフィルタ膜２４により、タンジェンシャルフロー方式による膜分離処理が施される。第１のフィルタ膜２４によって阻止された細胞は、流路５２を介して培養容器１０内に戻される。一方、抗体を含む培養に不要な成分は、第１のフィルタ膜２４を透過する。
第１のフィルタ膜２４を透過した透過液は、流路５３を介して第２のフィルタ部３０の供給側３２に送られる。第１のフィルタ膜２４を透過した透過液は、第２のフィルタ膜３４により、デッドエンド方式による膜分離処理が施される。第２のフィルタ膜３４によって阻止された抗体を含む細胞培養に不要な成分は、第２のフィルタ膜３４の膜面又は第２のフィルタ部３０の供給側３２に残留する。一方、第２のフィルタ膜３４を透過した、抗体等の細胞培養に不要な成分が除去された清浄な培地は、流路５４を介して培養容器１０に戻される。
一方、細胞培養装置１００において、逆洗処理を行う場合、ポンプＰ３が駆動状態とされ、ポンプＰ１及びＰ２が停止状態とされる。また、バルブＶ４が開状態に制御され、バルブＶ１、Ｖ２及びＶ３が閉状態に制御される。
ポンプＰ３が駆動されることで、通常の膜分離処理の際に発生する液流とは逆向きの、第２のフィルタ部３０の透過側から供給側に向かう液流が発生し、これにより、第２のフィルタ膜３４の逆洗処理が行われる。第２のフィルタ膜３４に対して逆洗処理を行うことで、第２のフィルタ膜３４の膜面及び第２のフィルタ部３０の供給側３２に残留する抗体を含む細胞培養に不要な成分が第２のフィルタ部３０の流入口３０ａから排出される。逆洗処理によって第２のフィルタ部３０から排出された抗体を含む細胞培養に不要な成分は、回収流路５６を介して回収タンク４０に収容される。回収タンク４０に収容された抗体を含む培養に不要な成分は、回収流路５７を介して、次工程である抗体の精製工程に送られる。培養期間中、ポンプＰ３は、間欠的に駆動状態とされ、逆洗処理が間欠的に実施される。従って、抗体を含む細胞培養に不要な成分の回収流路５６への送液は、間欠的に行われる。本実施形態に係る細胞培養装置１００においては、培養期間中、膜分離処理と逆洗処理とが交互に繰り返し実施される。
ポンプＰ２は、膜分離処理及び逆洗処理が行われている間、連続的又は所定のタイミングで駆動され、回収流路５６を介して回収タンク４０に送られた培地の分量と略同じ分量の新鮮な培地が、培地供給流路５８を介して培養容器１０に供給される。これにより、培養容器１０内における培地の分量は、培養期間中、略一定に保たれる。
本実施形態に係る細胞培養装置１００が、上記のように動作することで、以下の工程を含む細部培養方法による細胞培養が実現される。細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液に対して第１のフィルタ膜２４を用いて膜分離処理を施し、第１のフィルタ膜２４によって阻止された成分を培養容器１０に戻す第１の膜分離工程。第１のフィルタ膜２４を透過した成分に対して第２のフィルタ膜３４を用いて膜分離処理を施し、第２のフィルタ膜３４を透過した成分を培養容器１０に戻す第２の膜分離工程。第２のフィルタ膜３４によって阻止された成分を、回収流路５６を介して回収する回収工程。
ここで、細胞培養装置１００における灌流比をＸとし、循環比をＹとした場合、灌流比Ｘと循環比Ｙとの比Ｙ／Ｘが下記の（２）式によって示される範囲であることが好ましい。
１．５≦Ｙ／Ｘ ・・・（２）
灌流比Ｘは、回収流路５６を介して回収される成分（培地）の１日あたりの分量ｐと、培養容器１０に収容されている細胞懸濁液の分量ｑとの比ｐ／ｑである（Ｘ＝ｐ／ｑ）。なお、回収流路５６を介して回収される成分の１日あたりの分量ｐは、培地供給流路５８を介して供給される培地の１日あたりの分量と一致する。
循環比Ｙは、第１のフィルタ膜２４を透過する成分（培地）の１日あたりの分量ｒと、培養容器１０に収容されている細胞懸濁液の分量ｑとの比ｒ／ｑである（Ｙ＝ｒ／ｑ）。すなわち、灌流比Ｘと、循環比Ｙとの比Ｙ／Ｘは、第１のフィルタ膜２４を透過する成分の１日あたりの分量ｒと、回収流路５６を介して回収される成分の１日あたりの分量ｐとの比ｒ／ｐに相当する（Ｙ／Ｘ＝ｒ／ｐ）。
灌流比Ｘと循環比Ｙとの比Ｙ／Ｘは、（２）式に示すように、１．５以上であることが好ましく、２以上２０以下がより好ましく、２．５以上１５以下が更に好ましく、３以上１０以下が最も好ましい。灌流比Ｘと循環比Ｙとの比Ｙ／Ｘを１．５以上とすることで、抗体を含む細胞培養に不要な成分を十分に除去することができる。
また、灌流比Ｘは、０．１以上２以下であることが好ましく、０．２以上１．５以下がより好ましく、０．３以上１以下が更に好ましい。灌流比を０．１以上とすることで、第２のフィルタ膜３４において目詰まりが発生するリスクを抑制することができる。また、灌流比を２以下とすることで、培地の使用量を抑制することができ、低コストでの培養を達成することができる。
また、循環比Ｙは、０．２以上１０以下であることが好ましく、０．５以上８以下がより好ましく、１以上６以下が更に好ましい。循環比を０．２以上とすることで、抗体を含む培養に不要な成分を十分に除去することができる。また、循環比を１０以下とすることで、第１のフィルタ膜２４及び第２のフィルタ膜３４において目詰まりが発生するリスクを抑制することができる。
また、培養容器１０に収容された細胞懸濁液に含まれる細胞の濃度を２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上とすることが好ましく、５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上２０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下とすることがより好ましく、８×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上１５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下とすることが更に好ましい。培養容器１０に収容された細胞懸濁液に含まれる細胞の濃度を２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上とすることで十分な量の抗体を回収することができる。
また、培養容器１０内に収容された細胞懸濁液に含まれる、粒径が２μｍ以上４μｍ以下の微粒子の濃度を４０×１０７個／ｍｌ以下とすることが好ましく、２０×１０７個／ｍｌ以下とすることがより好ましく、１０×１０７個／ｍｌ以下とすることが更に好ましく、０．１×１０７個／ｍｌ以上５×１０７個／ｍｌ以下とすることが最も好ましい。培養容器１０内に収容された細胞懸濁液に含まれる、粒径が２μｍ以上４μｍ以下の微粒子の濃度を４０×１０７個／ｍｌ以下とすることで、細胞の増殖性を高めることができる。
また、第１のフィルタ膜２４による膜分離処理において、細胞の透過率を２０％以下とすることが好ましく、１０％以下とすることがより好ましく、５％以下とすることが更に好ましく、２％以下とすることが最も好ましい。第１のフィルタ膜２４による膜分離処理において、細胞の透過率を２０％以下とすることで、培養容器１０内における細胞の数の減少を抑制することができる。
また、第１のフィルタ膜２４による膜分離処理において、粒径が２μｍ以上４μｍ以下の微粒子の透過率を３０％以上とすることが好ましく、５０％以上とすることがより好ましく、７０％以上にすることが更に好ましい。第１のフィルタ膜２４による膜分離処理において、粒径が２μｍ以上４μｍ以下の微粒子の透過率を３０％以上とすることで、培養容器１０内における細胞培養に不要な成分の除去を促進することができる。
また、第２のフィルタ膜３４を透過した成分に含まれる、粒径が２μｍ以上４μｍ以下の微粒子の濃度を１×１０７個／ｍｌ以下とすることが好ましく、０．１×１０７個／ｍｌ以下とすることがより好ましく、０．０１×１０７個／ｍｌ以下とすることが更に好ましい。第２のフィルタ膜３４を透過した成分に含まれる、粒径が２μｍ以上４μｍ以下の微粒子の濃度を１×１０７個／ｍｌ以下とすることで、培養容器１０に戻る細胞培養に不要な成分の分量を抑制することができる。
また、培養容器１０に収容された細胞懸濁液に含まれる抗体の濃度を４ｇ／ｌ以下とすることが好ましく、３ｇ／ｌ以下とすることがより好ましく、２ｇ／ｌ以下とすることが更に好ましく、１ｇ／ｌ以下とすることが特に好ましい。培養容器１０に収容された細胞懸濁液に含まれる抗体の濃度を４ｇ／ｌ以下とすることで、細胞の凝集を抑制し、細胞の増殖性を高めることができる。
また、第１のフィルタ膜２４による膜分離処理において、抗体の透過率を３０％以上とすることが好ましく、５０％以上とすることがより好ましく、７０％以上とすることが更に好ましい。第１のフィルタ膜２４による膜分離処理において、抗体の透過率を３０％以上とすることで、培養容器１０内に収容された細胞懸濁液中の抗体濃度を抑制することができ、細胞の増殖性を高めることができる。
また、第２のフィルタ膜３４を透過した成分に含まれる抗体の濃度を１ｇ／ｌ以下とすることが好ましく、０．５ｇ／ｌ以下とすることがより好ましく、０．１ｇ／ｌ以下とすることが更に好ましい。第２のフィルタ膜３４を透過した成分に含まれる抗体の濃度を１ｇ／ｌ以下とすることで、培養容器１０に戻る抗体の量を抑制することができる。
また、第２のフィルタ膜によって阻止された成分に含まれる抗体の濃度を０．５ｇ／ｌ以上とすることが好ましく、１ｇ／ｌとすることがより好ましく、２ｇ／ｌとすることが更に好ましい。第２のフィルタ膜によって阻止された成分に含まれる抗体の濃度を０．５ｇ／ｌ以上とすることで、十分な量の抗体を回収することができる。
以上のように、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液に対して第１のフィルタ膜２４を用いた膜分離処理が施され、第１のフィルタ膜２４によって阻止された成分が培養容器１０に戻される。これにより、培養容器１０に収容された細胞懸濁液から、細胞の死骸、細胞の破砕物、ＤＮＡ、ＨＣＰ、抗体、老廃物等の細胞培養に不要な成分を除去することができる。細胞の死骸や細胞の破砕物を含む培地中で細胞を培養すると、細胞が嫌気して細胞増殖性が低下する。一方、ＤＮＡ、ＨＣＰ、抗体、老廃物を含む培地中で細胞を培養すると、細胞同士が接着し、細胞の凝集体が発生し、細胞の増殖性が低下する。また、ＤＮＡ、ＨＣＰ、抗体、老廃物が培養容器１０内に蓄積すると、培養容器１０内が汚染され、長期培養が困難となる。本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、第１のフィルタ膜２４を用いた膜分離処理によって、培養容器１０に収容された細胞懸濁液から、細胞の死骸、細胞の破砕物、ＤＮＡ、ＨＣＰ、抗体、老廃物等の細胞培養に不要な成分を除去することができるので、培養容器１０内で培養されている細胞の増殖性を高めることができる。また、細胞の増殖性を高めることにより、抗体の生産性を高めることができる。
また、第１のフィルタ膜２４による膜分離処理の方式として、タンジェンシャルフロー方式を採用することで、デッドエンド方式を採用する場合と比較して、細胞へのダメージを軽減することができる。なお、第１のフィルタ膜２４による膜分離処理の方式として、デッドエンド方式を採用することも可能である。
また、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、第１のフィルタ膜２４を透過した透過液に対して第２のフィルタ膜３４を用いた膜分離処理が施され、第２のフィルタ膜３４を透過した透過液が培養容器１０に戻される。これにより、第１のフィルタ膜２４を透過した透過液から、細胞の死骸、細胞の破砕物、ＤＮＡ、ＨＣＰ、抗体、老廃物等の細胞培養に不要な成分が除去され、細胞培養に不要な成分が除去された清浄な培地が、培養容器１０に戻される。このように、第２のフィルタ膜３４の透過側３３に排出される清浄な培地を、培養容器１０に戻すことで、培地の使用量を抑制することができる。一方、細胞から分泌される抗体を、第２のフィルタ膜３４において捕集することができる
また、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、第２のフィルタ膜３４によって阻止された成分が回収流路５６を介して回収される。これにより、第２のフィルタ膜３４によって阻止された抗体を回収することができる。
以上のように、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、培地の使用量を抑制しつつ抗体の生産性を高めることが可能となる。一態様においては、第１のフィルタ膜２４の平均孔径を２０μｍ以下とし、且つ第１のフィルタ膜２４の平均孔径をＡ、第２のフィルタ膜３４の平均孔径をＢとした場合、０＜Ｂ／Ａ≦０．５を満たすように、各フィルタ膜の平均孔径を選定することで、上記の効果が促進される。更なる一態様においては、第１のフィルタ膜２４の平均孔径を２０μｍ以下とし、且つ第２のフィルタ膜３４を限外濾過膜とすることで、上記の効果が促進される。
上記のように、本実施形態に係る細胞培養装置１００は、第２のフィルタ膜３４によって阻止された成分を回収する回収流路５６を有するので、第２のフィルタ膜３４によって阻止された抗体を回収することができる。さらに、第１のフィルタ膜２４の平均孔径Ａや、第２のフィルタ膜３４の平均孔径Ｂの平均孔径Ａに対する比（Ｂ／Ａ）又は第２のフィルタ膜３４の種類を考慮することによって、培養に必要な細胞が系外に出てしまったり、細胞の死骸、細胞の破砕物、ＤＮＡ、ＨＣＰ、抗体、老廃物等の細胞培養に不要な成分が十分系外に排出されなかったり、抗体を効率的に回収できなかったりする可能性を低減することができる。例えば、第１のフィルタ膜２４の平均孔径Ａが２０μｍ以下であることで、第１のフィルタ膜２４から細胞が透過し、回収流路５７から細胞が系外に出ていってしまうことを抑制することができる。さらに、０＜Ｂ／Ａ≦０．５を満たすように各フィルタ膜の平均孔径を選定するか、又は第２のフィルタ膜３４を限外濾過膜とすることで、第１のフィルタ膜２４を透過した培養に不要な成分を、第２のフィルタ膜３４で十分阻止できなくなる可能性を低減することができる。すなわち、第２のフィルタ膜３４によって阻止された成分を回収する回収流路５６を設けるだけでなく、第１のフィルタ膜２４の平均孔径を２０μｍ以下にし、第１のフィルタ膜２４の平均孔径Ａと第２のフィルタ膜３４の平均孔径Ｂの比Ｂ／Ａを０＜Ｂ／Ａ≦０．５にするか、又は第１のフィルタ膜２４の平均孔径を２０μｍ以下にし、第２のフィルタ膜３４を限外濾過膜とすることが重要になる。
通常、培養液のように、大小様々な成分が含まれる液をフィルタ膜を用いて連続的に濾過しながら、フィルタ膜に阻止された成分を連続的に回収しようとすることは非常に困難を伴う。本実施形態に係る細胞培養装置１００のように、第２のフィルタ膜３４によって阻止された成分を逆洗により回収しようとしても、第２のフィルタ膜３４にゲル層が形成されたり、更には目詰まりが起こったりして、数日で濾過ができなくなることが想定される。後述する第２及び第３の実施形態においては、第２のフィルタ膜３４による膜分離処理をタンジェンシャルフロー方式によって行うが、この場合においても、同様のことが起こり得る。本実施形態に係る細胞培養装置１００のように、第１のフィルタ膜２４の平均孔径を２０μｍ以下にし、第１のフィルタ膜２４の平均孔径Ａと第２のフィルタ膜３４の平均孔径Ｂとの比Ｂ／Ａを０＜Ｂ／Ａ≦０．５にするか、又は第１のフィルタ膜２４の平均孔径を２０μｍ以下にし、第２のフィルタ膜３４を限外濾過膜とすることで、ゲル層の形成や目詰まりを抑制しながら、長期間の濾過及び培養が可能になる。
また、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、回収タンク４０に収容され、精製工程に送られる抗体の濃度を高めることができるので、抗体の精製工程における処理コストを削減することができる。また、セルブリード処理において、培養容器１０から抜き出される培地や、細胞培養の終了後に培養容器１０に残留する培地において、抗体の濃度を低くすることができるので、これらの培地を廃棄に伴う抗体の廃棄ロスを減らすことができる。
更に、本実施形態に係る細胞培養装置１００によれば、培養容器１０内の抗体の滞留時間を短くすることができるため、培養容器内での抗体の凝集や分解による抗体品質の悪化を抑制することができる。循環比と灌流比の比であるＹ／Ｘを例えば１０にすることで、第２のフィルタ膜を設置しない場合に比べ培養槽内の抗体の滞留時間をおよそ１／１０に削減することができる。
開示の技術の他に、培養槽内の抗体の滞留時間を下げる策として、第一のフィルタ膜を設けるのではなく遠心分離を行ったり、第二のフィルタ膜を設けるのではなく超遠心分離装置を行ったり、抗体を吸着するアフィニティクロマトグラフィーを行ったりすることによって、定期的に抗体の溶出と回収を行うことも可能であるが、いずれも連続的な処理が難しく、開示の技術が優れる。
［第２の実施形態］
図４は、開示の技術の第２の実施形態に係る細胞培養装置１００Ａの構成を示す図である。細胞培養装置１００Ａは、第２のフィルタ部３０における膜分離処理の方式がタンジェンシャルフロー方式である点及び、第２のフィルタ膜３４によって阻止された成分の回収の態様が、上記した第１の実施形態に係る細胞培養装置１００と異なる。
本実施形態に係る細胞培養装置１００において、第１のフィルタ膜２４の透過側２３に一端が接続された流路５３Ａの他端は、タンク４１に接続されている。
流路５３Ｂは、一端がタンク４１に接続され、他端が第２のフィルタ部３０の流入口３０ａに接続されている。流路５３Ｂの途中には、タンク４１に収容されている液体を抜き出して第２のフィルタ部３０に送るポンプＰ５が設けられている。
第２のフィルタ部３０は、供給側３２において、流入口３０ａ及び流出口３０ｂを有する。タンク４１から抜き出された液体は、流入口３０ａから容器３１の内部に流入して流出口３０ｂから容器３１の外部に流出する間に第２のフィルタ膜３４上を通過する。第２のフィルタ部３０は、膜分離処理の対象となる液体を、第２のフィルタ膜３４によってタンジェンシャルフロー方式による膜分離処理を行う。
回収流路５６は、一端が、第２のフィルタ部３０の流出口３０ｂに接続され、他端がタンク４１に接続されている。タンク４１から抜き出された液体のうち、第２のフィルタ膜３４によって阻止された成分は、回収流路５７を介して次工程である抗体の精製工程に送られる。第２のフィルタ部３０は、透過側３３において、排出口３０ｃを有する。排出口３０ｃには、流路５４が接続されている。
以下に、細胞培養装置１００Ａの動作について説明する。
細胞培養装置１００Ａにおいて、第１のフィルタ部２０及び第２のフィルタ部３０において膜分離処理を行う場合、ポンプＰ１、Ｐ２、Ｐ４、Ｐ５及びＰ６が駆動状態とされる。
ポンプＰ１が駆動されることで、培養容器１０内に収容されている細胞懸濁液が、第１のフィルタ部２０の供給側２２に送られる。培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液は、第１のフィルタ膜２４の膜面に沿って流れることで膜分離処理が施される。第１のフィルタ膜２４によって阻止された細胞は、流路５２を介して培養容器１０内に戻される。一方、抗体を含む細胞培養に不要な成分は、第１のフィルタ膜２４を透過する。
第１のフィルタ膜２４を透過した透過液は、流路５３Ａを介してタンク４１に送られる。タンク４１に収容された、第１のフィルタ膜２４を透過した透過液は、ポンプＰ５によって抜き出され、第２のフィルタ部３０の供給側３２に送られる。第１のフィルタ部２０を透過した透過液は、第２のフィルタ膜３４の膜面に沿って流れることで膜分離処理が施される。第２のフィルタ膜３４によって阻止された抗体を含む細胞培養に不要な成分は、回収流路５６を介してタンク４１に送られる。第２のフィルタ部３０における膜分離処理を連続的に行うことで、タンク４１内における抗体の濃度が所望の濃度にまで高められる。濃縮された抗体を含む培地は、回収流路５７を介して、次工程である抗体の精製工程に送られる。上記した第１の実施形態に係る細胞培養装置１００において、第２のフィルタ膜３４によって阻止された成分は、間欠的に回収流路５６に送られるのに対して、本実施形態に係る細胞培養装置１００Ａにおいては、第２のフィルタ膜３４によって阻止された成分は、連続的に回収流路５６に送られる。一方、第２のフィルタ膜３４を透過した、抗体等の細胞培養に不要な成分が除去された清浄な培地は、排出口３０ｃから第２のフィルタ部３０の外部に排出され、流路５４を介して培養容器１０に戻される。
ポンプＰ４が駆動されることで、培地供給流路５８を介して培養容器１０に供給され、培養容器１０内における培地の分量は、培養期間中、略一定に保たれる。
本実施形態に係る細胞培養装置１００Ａによれば、第２のフィルタ部３０における膜分離処理の方式がタンジェンシャルフロー方式であるので、第２のフィルタ部３０によって阻止された成分を回収する場合に、逆洗処理が不要となる。
本実施形態に係る細胞培養装置１００Ａにおいては、第２のフィルタ部３０における膜分離処理の方式がタンジェンシャルフロー方式であるので、デッドエンド方式による膜分離処理を行う場合と比較して、抗体に加わる圧力を小さくすることができ、抗体の品質劣化を抑制することができる。また、第２のフィルタ部３０における膜分離処理の方式をタンジェンシャルフロー方式とすることで、デッドエンド方式による膜分離処理を行う場合と比較して、第２のフィルタ膜３４において目詰まりが発生するリスクを低減することができる。
また、本実施形態に係る細胞培養装置１００Ａによれば、第２のフィルタ部３０における膜分離処理を連続的に実施することで、タンク４１内における抗体の濃度を所望の濃度にまで高めることができ、濃縮された抗体を含む培地を、回収流路５７を介して精製工程に送ることができる。これにより、精製工程における処理負担を軽減することができる。
［第３の実施形態］
図５は、開示の技術の第３の実施形態に係る細胞培養装置１００Ｂの構成を示す図である。細胞培養装置１００Ｂは、第２のフィルタ部３０における膜分離処理の方式がタンジェンシャルフロー方式である点及び、第２のフィルタ膜３４によって阻止された成分の回収の態様が、上記した第１の実施形態に係る細胞培養装置１００と異なる。
本実施形態に係る細胞培養装置１００Ｂにおいて、第１のフィルタ膜２４の透過側２３に一端が接続された流路５３の他端は、第２のフィルタ部３０の流入口３０ａに接続されている。
第２のフィルタ部３０は、供給側３２において、流入口３０ａ及び流出口３０ｂを有する。第１のフィルタ膜２４を透過した透過液は、流入口３０ａから容器３１の内部に流入して流出口３０ｂから容器３１の外部に流出する間に第２のフィルタ膜３４上を通過する。第２のフィルタ部３０は、膜分離処理の対象となる液体を、第２のフィルタ膜３４によってタンジェンシャルフロー方式による膜分離処理を行う。第２のフィルタ部３０の流出口３０ｂには、回収流路５６が接続されている。第２のフィルタ部３０は、透過側３３において、排出口３０ｃを有する。排出口３０ｃには、流路５４が接続されている。
以下に、細胞培養装置１００Ｂの動作について説明する。
細胞培養装置１００Ｂにおいて、第１のフィルタ部２０及び第２のフィルタ部３０において膜分離処理を行う場合、ポンプＰ１、Ｐ２、Ｐ４及びＰ６が駆動状態とされる。
ポンプＰ１が駆動されることで、培養容器１０内に収容されている細胞懸濁液が、第１のフィルタ部２０の供給側２２に送られる。培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液は、第１のフィルタ膜２４の膜面に沿って流れることで膜分離処理が施される。第１のフィルタ膜２４によって阻止された細胞は、流路５２を介して培養容器１０内に戻される。一方、抗体を含む培養に不要な成分は、第１のフィルタ膜２４を透過する。
第１のフィルタ膜２４を透過した透過液は、ポンプＰ２によって抜き出され、第２のフィルタ部３０の供給側３２に送られる。第１のフィルタ部２０を透過した透過液は、第２のフィルタ膜３４の膜面に沿って流れることで膜分離処理が施される。第２のフィルタ膜３４によって阻止された抗体を含む細胞培養に不要な成分は、回収流路５６を介して、次工程である抗体の精製工程に送られる。上記した第１の実施形態に係る細胞培養装置１００において、第２のフィルタ膜３４によって阻止された成分は、間欠的に回収流路５６に送られるのに対して、本実施形態に係る細胞培養装置１００Ｂにおいては、第２のフィルタ膜３４によって阻止された成分は、連続的に回収流路５６に送られる。一方、第２のフィルタ膜３４を透過した、抗体等の細胞培養に不要な成分が除去された清浄な培地は、排出口３０ｃから第２のフィルタ部３０の外部に排出され、流路５４を介して培養容器１０に戻される。
ポンプＰ４が駆動されることで、回収流路５６を介して精製工程に送られた抗体を含む培地の分量と略同じ分量の新鮮な培地が、培地供給流路５８を介して培養容器１０に供給される。これにより、培養容器１０内における培地の分量は、培養期間中、略一定に保たれる。
本実施形態に係る細胞培養装置１００Ｂによれば、第２のフィルタ部３０における膜分離処理の方式がタンジェンシャルフロー方式であるので、第２のフィルタ部３０によって阻止された成分を回収する場合に、逆洗処理が不要となる。
また、本実施形態に係る細胞培養装置１００Ｂによれば、デッドエンド方式による膜分離処理を行う場合と比較して、抗体に加わる圧力を小さくすることができ、抗体の品質劣化を抑制することができる。また、デッドエンド方式による膜分離処理を行う場合と比較して、第２のフィルタ膜３４において目詰まりが発生するリスクを低減することができる。
また、本実施形態に係る細胞培養装置１００Ｂによれば、第２のフィルタ部３０を１回だけ通過した処理液が次工程に送られるので、第２のフィルタ部３０を複数回に亘り通過した処理液を次工程に送る場合と比較して、第２のフィルタ部３０における処理負担を軽減することができる。これにより、第２のフィルタ膜３４において目詰まりが発生するリスクを抑制することができる。
［実施例及び比較例］
上記した開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置を用いて細胞の培養を行い、下記に説明する複数の項目について評価した結果を、図６Ａ及び図６Ｂに示す。各実施例及び各比較例における、培養細胞の種類、第１のフィルタ膜２４及び第２のフィルタ膜３４の仕様、膜分離方式、灌流比、循環比、培養容器１０中の細胞濃度、培養容器１０中の微粒子濃度、培養容器１０中の抗体濃度は、図６Ａに示すとおりである。実施例１〜２０及び比較例１、２は図１の実施形態で示され、実施例２１は図５で示される実施形態にて、実施した。比較例３、４は図１の実施形態から第二のフィルタ部を除いた実施形態にて、実施した。評価項目を、細胞増殖性、培地使用量、培養容器内凝集物、培養容器内微粒子濃度、培養容器内抗体濃度、１段目濾過目詰まり、２段目濾過目詰まり、抗体回収率、メインピーク割合（抗体品質）、及びこれらを総合した総合判定とした。
なお、第１のフィルタ膜２４及び第２のフィルタ膜３４の平均孔径は、メッシュを使用する場合は９５％分離粒子径で測定し、精密濾過膜（ＭＦ膜）又は限外濾過膜（ＵＦ膜）を用いる場合は水銀圧入法で測定した。
培養容器１０内の細胞濃度を制御するため、セルブリード処理を実施した。セルブリード比は、１日あたりに抜き出されるセルブリード液量と、培養容器１０に収容されている細胞懸濁液の分量との比（１日あたりに抜き出されるセルブリード液量／培養容器１０に収容されている細胞懸濁液の分量）で定義される。実施例１〜２１と比較例１〜４において、セルブリード比は０．１で培養を実施した。
細胞径及び細胞の濃度は、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社のＶｉ−ＣＥＬＬを用いて測定した。微粒子の濃度は、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社のＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ４を用いて測定した。
細胞径の測定においては、培養容器１０からサンプリングした細胞懸濁液に含まれる細胞を測定対象とした。培養容器１０中の細胞の濃度及び抗体の濃度の測定においては、培養容器からサンプリングした細胞懸濁液を測定対象とした。
第１のフィルタ膜２４における細胞の透過率は、第１のフィルタ膜２４を透過する前の培地中の細胞の濃度ｄ１と、第１のフィルタ膜２４を透過した後の培地中の細胞の濃度ｄ２との比ｄ２／ｄ１を百分率（％）としたものである。
第１のフィルタ膜２４における微粒子の透過率は、第１のフィルタ膜２４を透過する前の培地中の微粒子の濃度ｄ３と、第１のフィルタ膜２４を透過した後の培地中の細胞の濃度ｄ４との比ｄ４／ｄ３を百分率（％）としたものである。
第１のフィルタ膜２４における抗体の透過率は、第１のフィルタ膜２４を透過する前の培地中の抗体の濃度ｄ５と、第１のフィルタ膜２４を透過した後の培地中の抗体の濃度ｄ６との比ｄ６／ｄ５を百分率（％）としたものである。
第１のフィルタ膜２４を透過する前の培地は、培養容器からサンプリングした。第１のフィルタ膜２４を透過した後の培地は、第１のフィルタ部２０の透過側に接続された流路５３からサンプリングした。
第２のフィルタ膜３４を透過した透過液における微粒濃度の測定においては、第２のフィルタ部３０の透過側に接続された流路５４からサンプリングした培地を測定対象とした。
回収液に含まれる抗体の濃度の測定においては、回収流路５６からサンプリングした回収液を測定対象とした。
抗体の培養容器１０内の抗体の滞留時間が短いほど、抗体品質は良くなる傾向にある。抗体品質として、サイズ排除クロマトグラフィーにより、抗体の分解及び凝集状態を以下のような手順で評価した。
（１）分離処理によって得られた透過液又は上澄み液７ｍｌにＡｂ Ｃａｐｃｈｅｒ Ｅｘｔｒａ（プロテノバ株式会社）１００μｌを加え３０分間静置した。
（２）得られた液を遠心分離し、上清液は廃却し、沈殿したゲルを回収した。
（３）２ｍｌのマイクロチューブにセットしたマイクロバイオスピンカラム６（バイオ・ラッド社）内に得られたゲルを入れ、溶出バッファー（０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．８））４００μｌをカラムに加え遠心分離した。
（４）カラムを通過しチューブ内に溜まった液内に、中和バッファー（１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ９．０）を３０μｌ添加し中和した。
（５）得られた中和液をアミコンウルトラ３０ｋＤａ（メルク株式会社）を用い、リン酸緩衝生理食塩水８０％と超純水２０％の混合液にバッファー交換し、抗体濃度が５ｍｇ／Ｌになるよう調製した。
（６）上記調製液を東ソー社製のＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって抗体のサイズ分布を測定し、メインピークの割合を算出した。メインピークの割合が大きい程、透過液又は上澄み液に含まれる抗体が高品質であることを示す。
抗体回収率は下記式で定義される。
１日あたりに透過液から回収される抗体量÷（１日あたりの透過液から回収される抗体量＋１日あたりのセルブリードにより廃却される抗体量）×１００
細胞増殖性についての判定基準は以下のとおりである。
Ａ：培養容器中の細胞濃度が８×１０７［ｃｅｌｌｓ／ｍｌ］以上である。
Ｂ：培養容器中の細胞濃度が５×１０７［ｃｅｌｌｓ／ｍｌ］以上、８×１０７［ｃｅｌｌｓ／ｍｌ］未満である。
Ｃ：培養容器中の細胞濃度が２×１０７［ｃｅｌｌｓ／ｍｌ］以上、５×１０７［ｃｅｌｌｓ／ｍｌ］未満である。
Ｄ：培養容器中の細胞濃度が２×１０７［ｃｅｌｌｓ／ｍｌ］未満である。
培地使用量についての判定基準は以下のとおりである。
Ａ：灌流比が１以下である。
Ｂ：灌流比が１より大きく、１．５以下である。
Ｃ：灌流比が１．５より大きく、２以下である。
Ｄ：灌流比が２を超える。
培養容器内凝集物についての判定基準は以下のとおりである。
Ａ：継続可能な培養期間が３０日以上である。
Ｂ：継続可能な培養期間が２５日以上２９日以下である。
Ｃ：継続可能な培養期間が２０日以上２４日以下である。
Ｄ：継続可能な培養期間が１９日以下である。
培養容器内微粒子濃度についての判定基準は以下のとおりである。
Ａ：培養容器内の微粒子濃度が５×１０７［個／ｍｌ］以下である。
Ｂ：培養容器内の微粒子濃度が５×１０７［個／ｍｌ］より大きく、１０×１０７［個／ｍｌ］以下である。
Ｃ：培養容器内の微粒子濃度が１０×１０７［個／ｍｌ］より大きく、４０×１０７［個／ｍｌ］以下である。
Ｄ：培養容器内の微粒子濃度が４０×１０７［個／ｍｌ］を超える。
培養容器内抗体濃度についての判定基準は以下のとおりである。
Ａ：培養容器内の抗体濃度が１［ｇ／ｌ］以下である。
Ｂ：培養容器内の抗体濃度が１［ｇ／ｌ］より大きく、２［ｇ／ｌ］以下である。
Ｃ：培養容器内の抗体濃度が２［ｇ／ｌ］より大きく、４［ｇ／ｌ］以下である。
Ｄ：培養容器内の抗体濃度が４［ｇ／ｌ］を超える。
１段目濾過目詰まりについての判定基準は以下のとおりである。
Ａ：第１のフィルタ膜を継続して使用できる期間が３０日以上である。
Ｂ：第１のフィルタ膜を継続して使用できる期間が２５日以上２９日以下である。
Ｃ：第１のフィルタ膜を継続して使用できる期間が２０日以上２４日以下である。
Ｄ：第１のフィルタ膜を継続して使用できる期間が１９日以下である。
２段目濾過目詰まりについての判定基準は以下のとおりである。
Ａ：第２のフィルタ膜を継続して使用できる期間が３０日以上である。
Ｂ：第２のフィルタ膜を継続して使用できる期間が２５日以上２９日以下である。
Ｃ：第２のフィルタ膜を継続して使用できる期間が２０日以上２４日以下である。
Ｄ：第２のフィルタ膜を継続して使用できる期間が１９日以下である。
抗体回収率についての判定基準は以下のとおりである。
Ａ：抗体回収率が９０％以上である。
Ｂ：抗体回収率が８０％以上９０％未満である。
Ｃ：抗体回収率が６０％以上８０％未満である。
Ｄ：抗体回収率が６０％未満である。
サイズ排除クロマトグラフィーによって得られたメインピークの割合に関する評価判定基準は以下のとおりである。
Ａ：メインピークの割合が９９％以上である。
Ｂ：メインピークの割合が９７％以上である。
Ｃ：メインピークの割合が９５％以上である。
Ｄ：メインピークの割合が９５％未満である。
総合判定の判定基準は以下のとおりである。
Ａ：Ｄが１つもなくＡが７個以上、且つ１段目濾過目詰まりについての判定がＡである。
Ｂ：Ｄが１つもなくＡが１個以上、且つ総合判定Ａの基準を満たさない。
Ｃ：Ｄが１つもなくＡが０個である。
Ｄ：Ｄが１個以上である。
図６に示すように、比較例１〜４は、第１のフィルタ膜２４の平均孔径Ａ、第２のフィルタ膜３４の平均孔径Ｂとした場合の平均孔径比（Ｂ／Ａ）が、上記の（１）式を満たさない点が、実施例１〜実施例２１と異なる。上記の差異に起因して、比較例１〜４における総合判定は、全てＤとなったのに対して、実施例１〜実施例２１における総合判定は、Ａ、Ｂ及びＣのいずれかとなった。すなわち、実施例１〜実施例２１において、培地の使用量を抑制しつつ抗体の生産性を高めることができた。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
１０ 培養容器
１１ 撹拌翼
２０ 第１のフィルタ部
２０ａ 流入口
２０ｂ 流出口
２０ｃ 排出口
２１ 容器
２２ 供給側
２３ 透過側
２４ 第１のフィルタ膜
３０ 第２のフィルタ部
３０ａ 流入口
３０ｂ 流出口
３０ｃ 排出口
３１ 容器
３２ 供給側
３３ 透過側
３４ 第２のフィルタ膜
４０ 回収タンク
４１ タンク
５１、５２、５３、５３Ａ、５３Ｂ、５４ 流路
５５ 逆洗流路
５６、５７ 回収流路
５８ 培地供給流路
５９ 流路
１００、１００Ａ、１００Ｂ 細胞培養装置
２００ 綾畳織メッシュ
２０１ 横糸
２０２ 縦糸
Ｃ 細胞
Ｄ デブリス
ＦＩ１ 第１の面
ＦＩ２ 第２の面
ＯＰ、ＯＰ１、ＯＰ２ 開口
Ｐ１〜Ｐ６ ポンプ
Ｖ１〜Ｖ４ バルブ

Claims (35)

  1. 細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養容器と、
    前記培養容器から抜き出される前記細胞懸濁液に対して膜分離処理を施す第１のフィルタ膜を有する第１のフィルタ部と、
    前記第１のフィルタ膜によって阻止された成分を前記培養容器に戻す第１の循環流路と、
    前記細胞懸濁液の前記第１のフィルタ膜を透過した成分に対して膜分離処理を施す第２のフィルタ膜を有する第２のフィルタ部と、
    前記第２のフィルタ膜を透過した成分を前記培養容器に戻す第２の循環流路と、
    前記第２のフィルタ膜によって阻止された成分を回収する回収流路と、
    を含み、
    前記第１のフィルタ膜の平均孔径が２０μｍ以下であり、
    前記第１のフィルタ膜の平均孔径をＡ、前記第２のフィルタ膜の平均孔径をＢとした場合、０＜Ｂ／Ａ≦０．５を満たす
    細胞培養装置。
  2. 細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養容器と、
    前記培養容器から抜き出される前記細胞懸濁液に対して膜分離処理を施す第１のフィルタ膜を有する第１のフィルタ部と、
    前記第１のフィルタ膜によって阻止された成分を前記培養容器に戻す第１の循環流路と、
    前記細胞懸濁液の前記第１のフィルタ膜を透過した成分に対して膜分離処理を施す第２のフィルタ膜を有する第２のフィルタ部と、
    前記第２のフィルタ膜を透過した成分を前記培養容器に戻す第２の循環流路と、
    前記第２のフィルタ膜によって阻止された成分を回収する回収流路と、
    を含み、
    前記第１のフィルタ膜の平均孔径が２０μｍ以下であり、
    前記第２のフィルタ膜が限外濾過膜である
    細胞培養装置。
  3. 前記第２のフィルタ膜による膜分離処理の方式が、デッドエンド方式である
    請求項１又は請求項２に記載の細胞培養装置。
  4. 前記回収流路は、前記第１のフィルタ部と前記第２のフィルタ部の間に設けられている
    請求項３に記載の細胞培養装置。
  5. 前記第２のフィルタ膜による膜分離処理の方式が、タンジェンシャルフロー方式である
    請求項１又は請求項２に記載の細胞培養装置。
  6. 前記回収流路は、前記第２のフィルタ部の、前記第２のフィルタ膜によって阻止された成分を前記第２のフィルタ部の外部に流出させる流出口に接続されている
    請求項５に記載の細胞培養装置。
  7. 前記第２のフィルタ部の透過側から供給側に向かう液流を発生させる送液部を更に含む
    請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  8. 前記第２のフィルタ膜の平均孔径が０μｍより大きく１μｍ以下である
    請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  9. 前記第１のフィルタ膜は、第１の面に形成された入側の開口と、前記第１の面とは反対側の第２の面に形成され且つ前記入側の開口と連通する出側の開口と、を有し、前記入側の開口と前記出側の開口とが膜面と平行な方向においてずれた位置に配置されている
    請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  10. 前記第１のフィルタ膜は、第１の面に形成された入側の開口と、前記第１の面とは反対側の第２の面に形成され且つ前記入側の開口と連通する出側の開口と、を有し、前記入側の開口と前記出側の開口とを接続する経路が非直線状である
    請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  11. 前記第１のフィルタ膜は、繊維状部材を綾畳織りして形成されたメッシュを含んで構成されている
    請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  12. 前記メッシュが金属で構成されている
    請求項１１に記載の細胞培養装置。
  13. 前記第１のフィルタ膜が、精密濾過膜である
    請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  14. 前記第２のフィルタ膜が、精密濾過膜である
    請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  15. 前記第２のフィルタ膜が、限外濾過膜である
    請求項１及び請求項３から請求項１３のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  16. 前記第２のフィルタ膜の分画分子量が、０ｋＤａより大きく１００ｋＤａ以下である
    請求項１５に記載の細胞培養装置。
  17. 前記第２のフィルタ膜の分画分子量が、３０ｋＤａ以上７０ｋＤａ以下である
    請求項１５に記載の細胞培養装置。
  18. 細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養容器から抜き出された前記細胞懸濁液に対して第１のフィルタ膜を用いて膜分離処理を施し、前記第１のフィルタ膜によって阻止された成分を前記培養容器に戻す第１の膜分離工程と、
    前記第１のフィルタ膜を透過した成分に対して第２のフィルタ膜を用いて膜分離処理を施し、前記第２のフィルタ膜を透過した成分を前記培養容器に戻す第２の膜分離工程と、
    前記第２のフィルタ膜によって阻止された成分を、回収流路を介して回収する回収工程と、を含み、
    前記第１のフィルタ膜の平均孔径が２０μｍ以下であり、
    前記第１のフィルタ膜の平均孔径をＡ、前記第２のフィルタ膜の平均孔径をＢとした場合、０＜Ｂ／Ａ≦０．５を満たす
    細胞培養方法。
  19. 細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養容器から抜き出された前記細胞懸濁液に対して第１のフィルタ膜を用いて膜分離処理を施し、前記第１のフィルタ膜によって阻止された成分を前記培養容器に戻す第１の膜分離工程と、
    前記第１のフィルタ膜を透過した成分に対して第２のフィルタ膜を用いて膜分離処理を施し、前記第２のフィルタ膜を透過した成分を前記培養容器に戻す第２の膜分離工程と、
    前記第２のフィルタ膜によって阻止された成分を、回収流路を介して回収する回収工程と、を含み、
    前記第１のフィルタ膜の平均孔径が２０μｍ以下であり、
    前記第２のフィルタ膜が限外濾過膜である
    細胞培養方法。
  20. 前記回収工程において回収される成分の１日あたりの分量と、前記培養容器に収容されている前記細胞懸濁液の分量との比である灌流比をＸとし、前記第１の膜分離工程において前記第１のフィルタ膜を透過する成分の１日あたりの分量と、前記培養容器に収容されている前記細胞懸濁液の分量との比である循環比をＹとした場合、１．５≦Ｙ／Ｘを満たす
    請求項１８又は請求項１９に記載の細胞培養方法。
  21. 前記灌流比が０．１以上２以下である
    請求項２０に記載の細胞培養方法。
  22. 前記循環比が０．２以上１０以下である
    請求項２０又は請求項２１に記載の細胞培養方法。
  23. 前記培養容器に収容された前記細胞懸濁液に含まれる前記細胞の濃度を２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上とし、且つ前記培養容器内に収容された前記細胞懸濁液に含まれる、粒径が２μｍ以上４μｍ以下の微粒子の濃度を４０×１０７個／ｍｌ以下とする
    請求項１８から請求項２２のいずれか１に記載の細胞培養方法。
  24. 前記第１の膜分離工程における膜分離処理において、前記細胞の透過率を２０％以下とし且つ粒径が２μｍ以上４μｍ以下の微粒子の透過率を３０％以上とする
    請求項１８から請求項２３のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  25. 前記第２のフィルタ膜を透過した成分に含まれる、粒径が２μｍ以上４μｍ以下の微粒子の濃度を１×１０７個／ｍｌ以下とする
    請求項１８から請求項２４のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  26. 前記細胞は抗体を発現する細胞であり、
    前記培養容器に収容された前記細胞懸濁液に含まれる前記細胞の濃度を２×１０７個／ｍｌ以上とし、前記培養容器に収容された前記細胞懸濁液に含まれる前記抗体の濃度を４ｇ／ｌ以下とする
    請求項１８から請求項２５のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  27. 前記細胞は抗体を発現する細胞であり、
    前記第１の膜分離工程における膜分離処理において、前記抗体の透過率を３０％以上とする
    請求項１８から請求項２６のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  28. 前記細胞は抗体を発現する細胞であり、
    前記第２のフィルタ膜を透過した成分に含まれる前記抗体の濃度を１ｇ／ｌ以下とする
    請求項１８から請求項２７のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  29. 前記細胞は抗体を発現する細胞であり、
    前記第２のフィルタ膜によって阻止された成分に含まれる前記抗体の濃度を０．５ｇ／ｌ以上とする
    請求項１８から請求項２８のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  30. 前記第１のフィルタ膜による膜分離処理の方式が、タンジェンシャルフロー方式である
    請求項１８から請求項２９のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  31. 前記第２のフィルタ膜による膜分離処理の方式が、タンジェンシャルフロー方式である
    請求項１８から請求項３０のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  32. 前記第２のフィルタ膜による膜分離処理の方式が、デッドエンド方式である
    請求項１８から請求項３１のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  33. 前記第２のフィルタ膜の膜面の透過側から供給側に向かう液流によって前記第２のフィルタ膜によって阻止された成分を前記回収流路に送る逆洗工程を更に含む
    請求項３２に記載の細胞培養方法。
  34. 前記回収工程において、前記第２のフィルタ膜によって阻止された成分を連続的に前記回収流路に送る
    請求項１８から請求項３１のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  35. 前記細胞がＣＨＯ細胞である
    請求項１８から請求項３４のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
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