RU2639556C2 - Технологический способ получения биологического вещества, такого как белок, с периодической подпиткой с применением чередующихся биореакторов - Google Patents
Технологический способ получения биологического вещества, такого как белок, с периодической подпиткой с применением чередующихся биореакторов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2639556C2 RU2639556C2 RU2016105100A RU2016105100A RU2639556C2 RU 2639556 C2 RU2639556 C2 RU 2639556C2 RU 2016105100 A RU2016105100 A RU 2016105100A RU 2016105100 A RU2016105100 A RU 2016105100A RU 2639556 C2 RU2639556 C2 RU 2639556C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- biological substance
- bioreactor
- culture medium
- culture
- Prior art date
Links
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 87
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 13
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 title description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 51
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims abstract description 25
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 164
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 25
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 21
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 17
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 11
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 230000004941 influx Effects 0.000 claims description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 abstract description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 abstract 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 29
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 4
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000011968 cross flow microfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012432 intermediate storage Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000007425 progressive decline Effects 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/10—Separation or concentration of fermentation products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/58—Reaction vessels connected in series or in parallel
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/18—External loop; Means for reintroduction of fermented biomass or liquid percolate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области биохимии. Предложена система и способ получения белка. Способ включает обеспечение биореактора культурой клеток, осуществление цикла культивирования и сбора клеток. Цикл культивирования и сбора клеток заключается в инкубации культуры клеток в биореакторе до того как культура клеток не достигнет экспоненциальной фазы, ранней стационарной фазы или стационарной фазы, сбора культуральной среды с белком, подачи отделенных от культуральной среды клеток в другой биореактор для продолжения культивирования вместе со свежей культуральной средой. Причём для сбора культуральной среды с белком осуществляют подачу культуры клеток в центрифугу. Система включает множество биореакторов, устройство подачи культуральной среды, детектор клеток, фильтрующий модуль сбора, сепаратор, насосный и коммутационный блок. Изобретения обеспечивают эффективное и контролируемое получение белка. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 3 ил.
Description
Настоящее изобретение относится к способам и системам, которые применяют для крупномасштабного культивирования клеток, особенно суспендированных клеток.
Культивирование клеток может быть выполнено в лабораторных масштабах или в промышленных масштабах. Эти два масштаба вызывают у пользователей различные проблемы. То, что работает в лабораторных масштабах, очень часто не работает в крупных масштабах. Основным различием является эффективность способа культивирования.
Настоящее изобретение в особенности относится к крупномасштабному культивированию с подпиткой или ферментации с подпиткой. Существуют два основных подхода к ферментации с подпиткой: культивирование с подпиткой фиксированного объема и культивирование с подпиткой переменного объема.
При подпитке фиксированного объема лимитирующий субстрат подается без разбавления культуры. Объем культуры также может поддерживаться практически постоянным посредством подачи ограничивающего рост субстрата в чистом виде, например в виде очень концентрированной жидкости или газа (например, кислорода). Определенный тип расширенной подпитки - циклическая подпитка культуры для систем фиксированного объема - относится к периодическому снятию части культуры и применению остаточной культуры в качестве отправной точки для дальнейшего процесса подпитки. В основном когда ферментация достигает определенной стадии (например, когда аэробные условия не могут больше поддерживаться), часть культуры удаляют и оставшуюся биомассу разбавляют до первоначального объема стерильной водой или средой, содержащей питающий субстрат. Разбавление уменьшает концентрацию биомассы и обычно приводит к увеличению удельной скорости роста. Впоследствии, с учетом продолжающейся подпитки скорость роста будет постепенно снижаться по мере того как биомасса увеличивается и снова приближается к максимально поддерживаемой в сосуде, и в этот момент часть культуры может быть снова заменена свежей культуральной средой.
Подпитка переменного объема представляет собой такую подпитку, при которой изменения объема происходят с момента ферментации. Причиной изменений обычно является питающий субстрат. Способ данных изменений объема зависит от требований, ограничений и целей оператора. Данный тип подпитки может быть еще дополнительно классифицирован как процесс с повторяющейся подпиткой или циклическое культивирование с подпиткой, а также единый процесс с подпиткой. Первый из вышеупомянутых обычно подразумевает, что как только ферментация достигает определенного этапа, после которого больше не является эффективной, некоторое количество культуры удаляют из сосуда и заменяют свежей питательной средой. Уменьшение количества клеток приводит в результате к увеличению удельной скорости роста, после чего происходит ее постепенное уменьшение по мере того как устанавливается квазистационарное состояние.
Ферментация с подпиткой имеет характерные признаки получения в периодическом режиме, а также непрерывной ферментации. Подпитка дает несколько преимуществ по сравнению с периодическим и непрерывным культивированием. Подпитка требуемых компонентов для роста и/или других субстратов, необходимых для получения продукта, не исчерпывается, и питательная среда может поддерживаться примерно постоянной в течение всего данного периода. Выработки побочных продуктов, которая, как правило, связана с присутствием высоких концентраций субстрата, также можно избежать посредством ограничения его количества теми количествами, которые необходимы исключительно для получения продукта.
Циклическое культивирование с подпиткой имеет дополнительное преимущество, заключающееся в том, что относящаяся к процессу фаза получения может быть расширена в контролируемых условиях. Контролируемые периодические сдвиги в скоростях роста дают возможность оптимизировать синтез продукта, особенно если интересующий продукт происходит во время замедления роста.
Проблема, связанная с получением биологических веществ при помощи культуральных систем, заключается в относительно высоких затратах, связанных с получением биологического вещества. В настоящем изобретении предложена более эффективная система культивирования. Настоящее изобретение дает возможность экономически эффективного и контролируемого получения биологического вещества.
В одном варианте реализации настоящего изобретения предложен способ получения биологического вещества путем культивирования клеток, которые продуцируют указанное биологическое вещество в биореакторе, причем указанный способ включает:
- обеспечение биореактора культурой клеток, содержащей указанные клетки, суспендированные в культуральной среде;
- причем указанный способ дополнительно включает осуществление по меньшей мере одного цикла культивирования и сбора клеток, включающего инкубацию указанной культуры клеток в биореакторе до тех пор, пока не будет достигнута ранняя стационарная или стационарная фаза, и сбор культуральной среды с биологическим веществом путем отделения клеток от культуральной среды, содержащей биологическое вещество, и подпитку, по существу, всех клеток обратно в биореактор для продолжения культивирования вместе со свежей культуральной средой. Преимуществом способа согласно настоящему изобретению является высокая выработка биологического вещества. Выработка вещества в дальнейшем увеличивается с каждым дальнейшим циклом инкубации/культивирования и сбора клеток. Таким образом, предпочтительно способ согласно настоящему изобретению включает по меньшей мере 2, более предпочтительно по меньшей мере 5, более предпочтительно по меньшей мере 10 и предпочтительно по меньшей мере 20 циклов инкубации и сбора клеток.
Культуру клеток собирают с помощью системы сбора клеток, которая предпочтительно поддерживает многие из условий этапа инкубации. Таким образом, система сбора клеток предпочтительно содержит средство для поддержания температуры культуры. Когда объем культуры клеток в биореакторе превышает пропускную способность системы сбора клеток, вся культура клеток еще может быть собрана. Предпочтительно это делается путем последовательной подпитки аликвот культуры клеток в систему сбора клеток. Затем цикл сбора клеток завершается, когда по существу вся культура клеток обработана. Культура клеток, которая ждет обработки, не смешивается с клетками, которые уже были обработаны с помощью системы сбора клеток. Это достигается путем подпитки обработанных клеток в другой биореактор. Обработанные клетки, таким образом, снабжаются свежей средой и подпитываются в другой биореактор для последующего цикла инкубации и сбора клеток. Плотность клеток, если это желательно, может быть скорректирована на данном этапе. Клетки могут быть концентрированными или разбавленными в зависимости от пожеланий оператора. Преимуществом настоящего изобретения является то, что возможно реализовать систему сбора клеток, которая имеет меньшую емкость, чем объем культуры клеток.
Увеличение плотности клеток желательно особенно в первых циклах для того чтобы быстро получить заданную плотность клеток, которая является желательной для получения биологического вещества. Разбавление обычно желательно в более поздних циклах, чтобы вместить продолжающееся увеличение количества клеток.
Биологическое вещество предпочтительно представляет собой вещество, которое выделяется из клеток. Биологическое вещество предпочтительно представляет собой белок, предпочтительно выделенный белок. Белок предпочтительно содержит более 50 и предпочтительно более 100 аминокислот. В особенно предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения биологическое вещество представляет собой фактор роста, антитело или растворимую форму мембранносвязанного лиганда. Биологическое вещество также может содержать антигенсвязывающий фрагмент антитела. Неограничивающими примерами таких фрагментов являются одноцепочечные Fv-фрагменты, Fab-фрагменты, моновалентные антитела и антитела, содержащие только тяжелые цепи. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения антитело представляет собой антитело млекопитающего. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения антитело представляет собой моноклональное антитело. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения антитело представляет собой мышиное, человеческое или мышиное/человеческое химерное антитело. Химерное антитело предпочтительно представляет собой гуманизированное мышиное моноклональное антитело или человеческое антитело. Существует различные типы гуманизации. Обычно по меньшей мере постоянные части антитела являются человеческими. Современные гуманизированные антитела также содержат различные участки человека, причем участки, определяющие комплементарность (CDR), заменены мышиными CDR. В качестве альтернативы антитело содержит мутации в мышиных вариабельных участках, чтобы удалить предсказанные человеческие В-клеточные и/или Т-клеточные эпитопы. В наше время стало возможно генерировать так называемые полностью человеческие моноклональные антитела. Они генерируются полностью из человеческих последовательностей. Иммунный ответ на эти полностью человеческие антитела, тем не менее, все еще возможен в зависимости от способа введения и природы CDR.
Клетки могут быть выращены либо в суспензионной культуре, либо в адгезивной культуре. Некоторые клетки естественным образом живут в суспензии, не привязываясь к поверхности, например к клеткам, которые существуют в кровотоке. Есть также клеточные линии, которые были модифицированы, чтобы иметь возможность выживать в суспензионных культурах таким образом, чтобы они могли быть выращены до более высокой плотности, чем позволяли бы адгезивные условия. Адгезивные клетки требуют поверхности, например пластичной культуры ткани или микроносителя, которые могут быть покрыты компонентами внеклеточного матрикса, чтобы увеличивать адгезионные свойства и давать другие сигналы, необходимые для роста и дифференциации. Адгезивные клетки обычно могут быть адаптированы к росту суспензии, в качестве альтернативы клетки могут быть, как упоминалось выше, прилеплены к микроносителям, которые затем суспендируются и культивируются в биореакторе. Клетки в настоящем изобретении предпочтительно представляют собой клетки, которые растут в суспензии. Предпочтительными являются клетки млекопитающих. Предпочтительные клетки-продуценты представляют собой клетки яичника китайского хомячка или ЯКХ (СНО) клетки, а также клеточную линию NS0. В особенно предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения клетки представляют собой клетки ЯКХ.
Рост клеток в типичном культивировании с периодической подпиткой клеток млекопитающих может быть классифицирован на 7 этапов: (А) лаг-фаза; (В) ранняя фаза логарифмического роста; (С) фаза логарифмического/экспоненциального роста; (D) ранняя стационарная фаза; (Е) стационарная фаза; (G) ранняя фаза гибели; (F) фаза гибели.
A. Во время лаг-фазы клетки адаптируются к условиям роста. Количество клеток в популяции не увеличивается.
B. Во время ранней фазы логарифмического роста все больше и больше клеток адаптируется и вступает в фазу экспоненциального роста.
C. Фаза экспоненциального роста (иногда называемая лог-фазой или фазой логарифмического роста) представляет собой период, характеризующийся клеточным удвоением. Количество новых клеток, появляющихся в единицу времени, пропорционально имеющейся популяции. Если рост не ограничен, удвоение будет продолжаться с постоянной скоростью, так что и количество клеток, и скорость роста популяции будут удваиваться с каждым последующим периодом времени. Для этого типа экспоненциального роста график зависимости натурального логарифма количества клеток от времени представляет собой прямую линию. Наклон этой линии представляет собой удельную скорость роста клеток. Фактический уровень этого роста (т.е. наклон кривой линии на фигуре) зависит от условий роста и типа клеток.
D. Ранняя стационарная фаза (или ранняя фаза плато) представляет собой фазу между фазой логарифмического роста и стационарной фазой и характеризуется прогрессирующим снижением скорости роста популяции. Эта фаза характеризуется тем, что скорость роста популяции составляет треть или менее от максимальной скорости роста в фазе экспоненциального роста. Ранняя стационарная фаза заканчивается, когда рост клеточной популяции равен нулю или менее.
E. Стационарная фаза или фаза плато часто связана с ограничивающим рост фактором; это в основном истощение питательного вещества и/или образование ингибирующих продуктов. В стационарной фазе размер клеточной популяции остается более или менее постоянным. Получение биологического вещества, как правило, самое высокое в этой фазе.
F. В фазе гибели клетки остаются без питательных веществ, или токсичные продукты уже накапливаются до такой степени, что клетки погибают.
G. Ранняя фаза гибели определяет конец стационарной фазы, когда все больше и больше клеток погибает.
В зависимости от того как клетки были обработаны до начала культивирования, лаг-фаза может присутствовать или отсутствовать. Например, крупномасштабные культуры обычно инициируются из посевных культур и прекультур. В таких случаях можно иметь очень короткую или отсутствующую лаг-фазу, так как клетки могут уже быть адаптированы к условиям культивирования при культивировании с подпиткой у посевных культур и/или прекультур.
В циклических системах культивирования, таких как настоящее изобретение, более поздние циклы обычно повторяют этапы С и D. При необходимости один или более циклов дополнительно включают шаги Е, F и G. Фаза экспоненциального роста в более поздних циклах может достичь или не может достичь такой же максимальной скорости роста, как в первом цикле. В каждом цикле начало ранней стационарной фазы характеризуется тем, что скорость роста популяции уменьшается до одной трети или менее максимальной скорости роста в предыдущей экспоненциальной фазе. Скорость роста обычно вычисляется с помощью касательной к кривой роста.
В особенно предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения культуру для каждого цикла собирают в то время, когда культура находится на этапе С, D или Е. Предпочтительно культуру для каждого цикла собирают в то время, когда культура находится на этапе С или D, более предпочтительно на этапе D.
В другом варианте реализации настоящего изобретения культуру в цикле 2 и дальнейших циклах собирают после по меньшей мере одного дня, предпочтительно после по меньшей мере двух дней, более предпочтительно после по меньшей мере трех дней инкубации, клетки независимо от этапа роста находятся внутри в момент инициирования этапа сбора клеток.
В другом варианте реализации настоящего изобретения культуру для каждого цикла собирают, когда достигается заданная плотность клеток. Для культур после первого цикла культивирования и сбора клеток предпочтительно, чтобы их собирали, когда клетки в культуре достигают плотности клеток по меньшей мере 0,7×10е8, предпочтительно по меньшей мере 1×10е8 и более предпочтительно по меньшей мере 2×10е8 на мл.
Примеры систем для получения биологического вещества приведены на фигурах 1-3. В этих системах клетки, которые продуцируют указанное биологическое вещество, культивируют и отделяют от культуральной среды, содержащей биологическое вещество. После отделения предпочтительно по существу все клетки возвращают в биореактор для продолжения культивирования вместе со свежей культуральной средой. На фигуре 1 система сбора клеток 100 содержит множество биореакторов 10, 15. Эти биореакторы выполнены с возможностью инкубации клеточной культуры клеток, суспендированных в культуральной среде в указанном биореакторе. Система состоит из ряда устройств подачи культуральной среды (16), выполненных с возможностью компенсации потерь выходящего потока путем подачи культуральной среды или ее компонента в биореакторы.
В частности, устройство подачи 16 непосредственно соединено с биореактором, при этом другое устройство подачи 16 для подачи среды и буфера могут быть соединены с насосом и коммутационным блоком 40, который соединен с сепаратором 30.
Кроме того, предусмотрены средства (не показаны) для определения количества клеток или плотности в биореакторах 10, 15. Как правило, такими средствами могут быть детектор подсчета клеток, плотномер или проточный цитометр известного в данной области техники типа. Детектор может быть выполнен с возможностью определения плотности клеток. Заданное пороговое значение для введения в детектор может быть определено эвристически или посредством расчета и оно указывает, что инкубация культуры клеток в одном из указанных биореакторов достигла ранней стационарной фазы или стационарной фазы, определенных выше в настоящем описании.
Сепаратор 30 выполнен с возможностью коммуникационной связи между модулем сбора клеток 20 и множеством биореакторов. Сепаратор подпитывается культурой клеток, которую перекачивают с помощью насоса и коммутационного блока из одного из биореакторов 10, 15 и затем подпитывают с помощью среды и буферной подпитки 16. В примере, показанном на фиг. 1 и 2, сепаратор 30 выполнен с возможностью отделения клеток от культуральной среды, содержащей биологическое вещество, посредством центрифуги 35. В центрифуге 35 концентрированный псевдоожиженный слой клеток образуется посредством уравновешивания потоков жидкости свежей среды 16, при этом порция клеток из биореактора и скорость вращения центрифуги 35 являются широко известными через непрерывное сбалансированное действие центробежной силы и силы потока жидкости.
Центрифуга 35 содержит входное отверстие свежей среды 16, выполненное с возможностью достижения указанной силы потока жидкости и, таким образом, отделения клеток от культуральной среды с биологическим веществом.
В примере насосный и коммутационный блок 40 образован посредством двунаправленного насоса, соединенного с коммутаторами, которые переключают поток жидкости между одним из биореакторов 10 и другим биореактором 15 после очистки культуры клеток в сепараторе 35. В работе при обнаружении указанной ранней стационарной фазы или стационарной фазы в одном из указанного множества биореакторов 10, 15 поток генерируется в сепаратор 30 посредством извлечения культуры клеток из одного из биореакторов 15 и подачи в сепаратор свежей среды и буфера.
Путем направления потока обратно из сепаратора и переключением потока в сторону другого биореактора 15 по существу все клетки подаются обратно из сепаратора 30 через указанный насос и коммутационный блок 40 в другой биореактор 15 для продолжения культивирования вместе со свежей культуральной средой.
Культуральную среду, содержащую биологическое вещество и буфер, периодически подают в модуль сбора 20, который собирает биологическое вещество путем фильтрации, как описано ниже в настоящем описании.
Культуры могут достигать более высоких плотностей клеток в процессе инкубации, когда среда является по меньшей мере частично переработанной. Таким образом, во время инкубации культуры клеток, в отличие от системы, описанной на фигуре 2, предпочтительно, чтобы по меньшей мере часть культуры клеток биореакторов 10 и 15 непрерывно текла в систему сепарации 50, которая содержит отбирающую по размеру полупроницаемую мембрану 55.
Мембрана 55 отделяет клетки и биологическое вещество от веществ, имеющих более низкую молекулярную массу, чем биологическое вещество,
создавая тем самым не содержащий клетки и биологическое вещество выходящий поток, который выводится. Кроме того, поток жидкости, содержащий клетки и биологическое вещество, подается обратно в биореактор, и
потери от вытекания по меньшей мере компенсируются путем подачи культуральной среды или ее компонента в биореактор.
Такие устройства мембранного разделения 50 часто упоминаются как устройства для фильтрации переменного тангенциального потока (ПТП). Этот тип фильтрации отличается от тупиковой фильтрации, при которой поданный материал пропускают через мембрану или фильтрующий слой, при этом твердые вещества оказываются в ловушке в фильтре, а фильтрат высвобождается на другом конце. При ПТП-фильтрации большая часть подаваемого потока движется по касательной через поверхность фильтра, а не в фильтр. Переменный тангенциальный поток создается под действием перегородки, движущейся вверх и вниз внутри головки насоса, соединенной с корпусом фильтра и прикрепленной к биореактору (см. для справки WO 2005/095578 и WO 2008/006494).
Устройство мембранного разделения 50 обычно представляет собой ультрафильтрационное устройство. Фильтр в устройстве разделения, как правило, представляет собой полупроницаемую мембрану, содержащую поры с определенной молекулярной массой отсечки. Фильтр или полупроницаемая мембрана, применяемая в способе согласно настоящему изобретению, способна отделять биологическое вещество от веществ, имеющих более низкую, чем биологическое вещество, молекулярную массу. Другими словами, молекулярная масса отсечки выбрана таким образом, что молекулярная масса отсечки (ММО) меньше, более предпочтительно по меньшей мере фактора 2, наиболее предпочтительно по меньшей мере фактора 3, меньше, чем молекулярная масса биологического вещества. Как правило, но, конечно, в зависимости от молекулярной массы биологического вещества, получаемого в способе согласно настоящему изобретению, ММО разделительной системы предпочтительно составляет по меньшей мере 5, более предпочтительно по меньшей мере 10, наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 кДа и предпочтительно не более 500 кДа, более предпочтительно не более 300 кДа, наиболее предпочтительно не более 100 кДа. Например, для иммуноглобулина класса G (IgG) с молекулярной массой 150 кДа наиболее предпочтительной является разделительная система, имеющая ММО не более 50 кДа.
Стадию сбора в цикле инкубации и сбора клеток проводят на всей культуре. В настоящем изобретении предпочтительно, чтобы объем культуры был выше, чем емкость устройства для сбора клеток. В данном варианте реализации настоящего изобретения сбор делается путем последовательной подпитки культуры в систему сбора клеток. Система сбора клеток предпочтительно содержит систему фильтрации поперечного потока, в результате чего среда с биологическим веществом заменяется свежей культуральной средой. Такая поперечно-потоковая система сбора клеток обычно содержит фильтры или полупроницаемые мембраны с ММО, которые отделяют клетки от биологического вещества и культуральной среды. В этих устройствах ММО обычно выше 200 кДа. Такие устройства также называют устройствами микрофильтрации поперечного потока, а способы - микрофильтрацией. В этих устройствах микрофильтрации размер пор обычно составляет от 0,1 микрометра до 10 микрометров.
В особенно предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения система сбора клеток содержит систему с псевдоожиженным слоем, основанную на действии центробежной силы. В этом варианте реализации способа согласно настоящему изобретению предпочтительно, чтобы культуральную среду с биологическим веществом собирали путем пропускания культуры клеток в центрифугу, которая поддерживает клетки в виде концентрированного псевдоожиженного слоя посредством постоянного сбалансированного действия центробежной силы и силы потока жидкости, вследствие чего сила потока жидкости действует за счет притока свежей среды, и тем самым клетки отделяются от культуральной среды с биологическим веществом. Предпочтительные примеры систем с псевдоожиженным слоем, основанных на действии центробежной силы, описаны в WO 10/008579, WO 10/008563 и WO 11/044237. Поэтому эти ссылки включены в настоящее описание посредством ссылки.
Для сравнения на фигуре 3 изображен сепаратор 30, отображающий модуль фильтрации тангенциальным потоком. В модуле аналогично устройству мембранного разделения 50, описанному выше в настоящем описании, предусмотрена отбирающая по размеру полупроницаемая мембрана и входное отверстие для свежей среды, выполненное с возможностью обеспечения тангенциальным потоком. Здесь отбирающая по размеру полупроницаемая мембрана предназначена для удержания клеток и позволяют собирать среду вместе с биологическим веществом в выходящем потоке. Таким образом, клетки отделяют от культуральной среды с биологическим веществом, и по существу все клетки могут быть возвращены в другой биореактор 15 для продолжения культивирования вместе со свежей культуральной средой.
Крупномасштабное культивирование в соответствии с настоящим изобретением представляет собой культивирование, которое содержит по меньшей мере 1 литр и предпочтительно по меньшей мере 2 литра культуральной среды и клеток в цикле инкубации и сбора клеток. Предпочтительно оно содержит по меньшей мере 5 литров культуральной среды и клеток.
Способ согласно настоящему изобретению предпочтительно включает систему культивирования с подпиткой как стадию инкубации в циклах инкубации и сбора клеток.
Когда инкубацию культуры клеток в последующие циклы культивирования и сбора клеток проводили в разных или чередующихся биореакторах, неожиданно было обнаружено, что культуры клеток развивались быстрее и вырабатывалось больше биологического продукта. Это было особенно справедливо для тех вариантов реализации настоящего изобретения, в которых объем культуры (т.е. культуральной среды и клеток) превышал объем системы сбора клеток за один проход. Больший выход был замечен, когда собираемые клетки передавали в другой биореактор. Это приводило к предпочтительному способу работы, при котором культура клеток передавалась в другой биореактор для каждого цикла инкубации и сбора клеток. В этом варианте реализации настоящего изобретения предпочтительно, если культура чередуется между двумя биореакторами для каждого цикла инкубации и сбора клеток. Это приводит к тому, что во время сбора клеток культура вводится в систему сбора клеток из одного биореактора, обрабатывается в системе сбора клеток, и впоследствии клетки в свежей культуральной среде выводятся в другой биореактор. Использованный биореактор может оставаться в системе как есть, с получением культуры после завершения следующего цикла, его можно очистить, или он может быть заменен на чистый биореактор, или может иметь место комбинация этих применений.
В предпочтительном варианте реализации настоящее изобретение включает культивирование клеток с периодической подпиткой клеток млекопитающих (более конкретно клеток ЯКХ) с применением чередующихся биореакторов в сочетании с периодическим отделением биомассы от биологического вещества (более конкретно моноклональных антител) и компонентов отходов.
Высокая плотность клеток, высокая жизнеспособность клеток и высокая продуктивность могут периодически поддерживаться во времени путем отделения биомассы в ранней стационарной фазе роста от биологического вещества и компонентов отходов и повторной подачи этих жизнеспособных клеток во второй биореактор, который работает в режиме загрузки с подпиткой. Клетки затем продолжают расти в фазе экспоненциального роста и достигают ранней стационарной фазы (часто в течение 0,5-2 дней). Далее процесс периодического отделения повторяется, и биомасса передается обратно в первый реактор, который работает в режиме с подпиткой, и снова клетки растут в течение 0,5-2 дней от фазы экспоненциального роста к ранней стационарной фазе. Этот способ периодической подпитки в чередующиеся биореакторы после отделения биологических веществ и отходов компонентов повторяется до тех пор, пока не будет получено достаточно биологического вещества или жизнеспособность клеток не упадет ниже 90%. При необходимости биомасса может быть концентрированной или разбавленной после отделения перед переносом в следующий биореактор.
Предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения, в котором в ходе инкубации культуры клеток в биореакторе по меньшей мере часть культуры клеток непрерывно перетекает в разделительную систему, которая содержит отбирающую по размеру мембрану, предпочтительно объединяют с предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения, в котором культуральную среду с биологическим веществом собирают в результате подачи потока культуры клеток в центрифугу, которая поддерживает клетки в виде концентрированного псевдоожиженного слоя посредством постоянного сбалансированного действия центробежной силы и силы потока жидкости, вследствие чего сила потока жидкости действует за счет притока свежей среды, и тем самым клетки отделяются от культуральной среды с биологическим веществом. Клетки могут быть впоследствии переданы обратно в биореактор для дальнейшего цикла культивирования и сбора клеток или могут быть переданы в другой биореактор. В последнем режиме, как упомянуто выше в настоящем описании, можно реализовать систему сбора клеток, которая имеет меньшую емкость для жидкости, чем объем культуры клеток. При дальнейшей инкубации предпочтительно, чтобы по меньшей мере часть культуры клеток непрерывно перетекала в разделительную систему, которая содержит отбирающую по размеру мембрану. В разделительном устройстве потребляемая среда и вещества (отходы) с более низкой молекулярной массой, чем у биологического вещества, удаляются из культуры. В системе сбора клеток потребляемая среда, биологическое вещество и вещества (отходы), имеющие более высокую молекулярную массу, чем у биологического вещества, такие как клеточный дебрис, нуклеиновые кислоты и белки, удаляются из культуры. Этот предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения является особенно эффективным способом обеспечения условий для многократного цикла культивирования и сбора клеток при очень высокой плотности клеток, при сохранении относительно недорогой системы, связанной с непрерывным культивированием в биореакторе, причем по меньшей мере часть культуры клеток непрерывно протекает в разделительную систему, которая содержит отбирающую по размеру мембрану.
Предпочтительно, чтобы во время культивирования в разделительной системе и центрифуге поддерживали условия культивирования. Таким способом клетки, которые культивируются, испытывают условия культивирования в различных циклах культивирования и сбора клеток согласно настоящему изобретению. С точки зрения клеток культивирование представляет собой непрерывное культивирование, тогда как с точки зрения оператора процесса, ответственного за обработку утилизации отходов и сбор биологической субстанции, культивирование является полунепрерывным. С точки зрения клеток систему, содержащую систему разделения, центрифугу и один или несколько биореакторов можно рассматривать как один биореактор для культуры клеток. Клетки испытывают условия культивирования в течение всей процедуры. Не все условия культивирования должны поддерживаться. Предпочтительным условием культивирования, которое должно поддерживаться, является температура, другим условием культивирования, которое предпочтительно должно поддерживаться, является оксигенация. Еще одним дополнительным условием культивирования, которое предпочтительно должно поддерживаться, является рН. Поддержание условий культивирования предпочтительно означает, что условие в течение всей процедуры не отклоняется более чем на 15% от значения условия в начале процедуры. Температуру предпочтительно поддерживают на уровне 35,5-37,5°С, предпочтительно на уровне 37°С, оксигенацию предпочтительно поддерживают на уровне 40-60% в пересчете на концентрацию растворенного кислорода, предпочтительно на уровне 50% концентрации растворенного кислорода, рН предпочтительно поддерживают на уровне значения рН 6,7-7,5, предпочтительно на уровне рН 7 или 7,1.
В одном варианте реализации настоящего изобретения предпочтительно, чтобы в первом из циклов культивирования и сбора клеток клетки собирали при более низкой плотности клеток, чем в более позднем цикле культивирования и сбора клеток. В этом варианте реализации настоящего изобретения клетки собирают предпочтительно при плотности клеток менее чем 50×10е6, предпочтительно менее чем 25×10е6 клеток/мл.
Плотность клеток, относящаяся к клеткам в культуральной среде, которая выводится на стадии центрифугирования, на стадии сбора клеток может изменяться по отношению к плотности клеток, относящейся к клеткам в культуральной среде, которая вводится в центрифугу. Этот вариант реализации настоящего изобретения позволяет устанавливать плотность клеток, относящуюся к клеткам в культуральной среде в начале культивирования, в следующем цикле культивирования и сбора клеток. В зависимости от желаемой или требуемой плотности клеток использование ПТП-аппарата может быть применено к обоим биореакторам со скорректированной стратегией подачи. Разделение биологического вещества и компонентов отходов (межклеточной жидкости) реализуется путем применения центрифугирования или поперечно-потоковой фильтрации в фильтрующем модуле сбора 20. С этой целью на фигурах 1-3 фильтрующий модуль сбора 20 содержит отверстие для выпуска отходов 21 и фильтрующий элемент глубинного типа 22, который выполнен с возможностью отделения биологического вещества от веществ, имеющих более высокую молекулярную массу, чем биологическое вещество.
Процесс разделения всего содержимого биореактора должен быть завершен в течение нескольких часов из-за жизнеспособности клеток.
Элементом настоящего изобретения является повторяемое культивирование клеток с периодической подпиткой между экспоненциальной фазой роста и ранней стационарной фазой роста в чередующихся биореакторах. Этот способ дает высокую выработку биологического вещества в относительно короткий период времени по сравнению с перфузионной обработкой благодаря низкому уровню компонентов отходов. Кроме того, повторение этой короткой, но дающей высокую выработку фазы способа подпитки дает гораздо более высокие общие выработки, которые можно сравнить с регулярной периодической обработкой и обработкой с подпиткой. Общая выработка биологического вещества может в 25 раз превышать выработку при регулярной периодической обработке в течение 10 дней после того как первое культивирование с подпиткой достигнет ранней стационарной фазы.
Дополнительным преимуществом данного повторяемого культивирования клеток с периодической подпиткой является возможность сделать возможной непрерывную последующую обработку благодаря коротким промежуткам между последовательными сборами клеток (0,5-2 суток). Биологическое вещество может непрерывно выпускаться из промежуточной емкости для хранения для подачи дополнительной очистки. В этом случае посредством обработки может быть реализована высокая выработка продукта в малообъемном непрерывном эксплуатационном режиме.
Claims (21)
1. Способ получения биологического вещества, такого как белок, посредством культивирования клеток, которые продуцируют указанное биологическое вещество в биореакторе, причем указанный способ включает:
- обеспечение биореактора культурой клеток, содержащей указанные клетки, суспендированные в культуральной среде; и
- причем указанный способ дополнительно включает осуществление по меньшей мере одного цикла культивирования и сбора клеток, включающего инкубацию указанной культуры клеток в биореакторе до тех пор, пока культура клеток не достигнет экспоненциальной фазы, ранней стационарной фазы или стационарной фазы, и сбор культуральной среды с биологическим веществом путем отделения клеток от культуральной среды, содержащей биологическое вещество, и подачу по существу всех клеток обратно в другой биореактор для продолжения культивирования вместе со свежей культуральной средой, причем указанную культуральную среду с биологическим веществом собирают посредством подачи культуры клеток в центрифугу, которая поддерживает клетки в виде концентрированного псевдоожиженного слоя посредством постоянного сбалансированного действия центробежной силы и силы потока жидкости, вследствие чего сила потока жидкости действует за счет притока свежей среды, и тем самым клетки отделяются от культуральной среды с биологическим веществом.
2. Способ по п. 1, включающий по меньшей мере 2 цикла культивирования и сбора клеток.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что во время инкубации культуры клеток по меньшей мере часть культуры клеток непрерывно поступает в разделительную систему, которая содержит отбирающую по размеру полупроницаемую мембрану, причем указанная мембрана отделяет клетки и биологическое вещество от веществ, имеющих более низкую молекулярную массу, чем указанное биологическое вещество, создавая тем самым не содержащий клетки и биологическое вещество выходящий поток, который выводится, и
поток жидкости, содержащий клетки и биологическое вещество, который подается обратно в биореактор и в котором потери выходящего потока по меньшей мере компенсируются путем подачи культуральной среды или ее компонента в биореактор.
4. Способ по любому из пп. 1, 2, отличающийся тем, что указанные клетки представляют собой клетки млекопитающего.
5. Способ по любому из пп. 1, 2, отличающийся тем, что указанные клетки представляют собой клетки яичника китайского хомячка.
6. Способ по любому из пп. 1, 2, отличающийся тем, что указанное биологическое вещество представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
7. Способ по любому из пп. 1, 2, отличающийся тем, что указанные клетки культивируют в культуральной системе с подпиткой.
8. Система для получения биологического вещества, такого как белок, путем культивирования клеток, которые продуцируют указанное биологическое вещество, согласно способу по п. 1, причем указанная система включает:
- множество биореакторов (10, 15), каждый из которых выполнен с возможностью инкубации клеточной культуры клеток, суспендированных в культуральной среде в указанном биореакторе,
- причем указанная система дополнительно включает устройство подачи культуральной среды (16), выполненное с возможностью компенсации потерь выходящего потока из по меньшей мере одного биореактора путем подачи культуральной среды или ее компонента по меньшей мере в один биореактор,
- детектор клеток для обнаружения того, что инкубация культуры клеток в одном из указанных биореакторов достигла ранней стационарной фазы или стационарной фазы,
- фильтрующий модуль сбора (20), выполненный с возможностью сбора биологического вещества из культуральной среды, содержащей биологическое вещество, и
- сепаратор (30), коммуникационно связывающий фильтрующий модуль сбора и множество биореакторов, причем установленный сепаратор выполнен с возможностью отделения клеток от культуральной среды, содержащей биологическое вещество, и
- насосный и коммутационный блок (40), расположенный между сепаратором (30) и указанным множеством биореакторов (10, 15), выполненный с возможностью введения, при обнаружении указанной ранней стационарной фазы или стационарной фазы в одном из указанного множества биореакторов (10, 15), клеток и культуральной среды из указанного одного (10) из указанного множества биореакторов в сепаратор, и подачи по существу всех клеток из сепаратора (30) с помощью указанного насосного и коммутационного блока (40) обратно в другой биореактор (15) из указанного множества биореакторов для продолжения культивирования вместе со свежей культуральной средой.
9. Система по п. 8, отличающаяся тем, что сепаратор (30) содержит центрифугу (35), выполненную с возможностью поддержания клеток в виде концентрированного псевдоожиженного слоя посредством постоянного сбалансированного действия центробежной силы и силы потока жидкости, причем указанная центрифуга содержит входное отверстие для свежей среды, выполненное с возможностью обеспечения указанной силы потока жидкости, отделяя тем самым клетки от культуральной среды с биологическим веществом.
10. Система по п. 8, отличающаяся тем, что сепаратор (30) содержит модуль фильтрации тангенциального потока, содержащий отбирающую по размеру полупроницаемую мембрану и входное отверстие для свежей среды, выполненное с возможностью обеспечения указанного тангенциального потока, отделяя тем самым клетки от культуральной среды с биологическим веществом.
11. Система по п. 8, отличающаяся тем, что по меньшей мере один биореактор (10) находится в жидкостной связи с мембранным сепаратором (50), который содержит отбирающую по размеру полупроницаемую мембрану (55) и выпускное отверстие мембранного сепаратора (56), причем указанный мембранный сепаратор находится в жидкостной связи по меньшей мере с одним биореактором (10) и выполнен с возможностью непрерывной подачи по меньшей мере части культуры клеток из указанного по меньшей мере одного биореактора в указанный мембранный сепаратор; причем указанная мембрана (55) выполнена с возможностью отделения клеток и биологического вещества от веществ, имеющих более низкую молекулярную массу, чем указанное биологическое вещество, создавая тем самым не содержащий клетки и биологическое вещество выходящий поток, который выводится через указанное выпускное отверстие мембранного сепаратора (56), и поток жидкости, содержащий клетки и биологическое вещество, который подается обратно в биореактор.
12. Система по п. 8, отличающаяся тем, что фильтрующий модуль сбора (20) содержит отверстие для выпуска отходов (21) и фильтрующий элемент глубинного типа (22), который выполнен с возможностью отделения биологического вещества от веществ, имеющих более высокую молекулярную массу, чем указанное биологическое вещество, создавая тем самым не содержащий биологическое вещество выходящий поток, который выводится через отверстие для выпуска отходов, и причем указанное биологическое вещество выводится для последующей обработки.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NL2012050798 | 2012-11-09 | ||
NLPCT/NL2012/050798 | 2012-11-09 | ||
PCT/NL2013/050805 WO2014073967A1 (en) | 2012-11-09 | 2013-11-08 | Discontinuous fed batch processing with the use of alternating bioreactors |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016105100A RU2016105100A (ru) | 2017-08-21 |
RU2639556C2 true RU2639556C2 (ru) | 2017-12-21 |
Family
ID=47278493
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016105100A RU2639556C2 (ru) | 2012-11-09 | 2013-11-08 | Технологический способ получения биологического вещества, такого как белок, с периодической подпиткой с применением чередующихся биореакторов |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9982226B2 (ru) |
EP (1) | EP2917323A1 (ru) |
AU (1) | AU2013341858B2 (ru) |
BR (1) | BR112015010544B1 (ru) |
CA (1) | CA2890813C (ru) |
MX (1) | MX364790B (ru) |
MY (1) | MY181264A (ru) |
RU (1) | RU2639556C2 (ru) |
SG (2) | SG10201703385YA (ru) |
TW (1) | TWI637057B (ru) |
WO (1) | WO2014073967A1 (ru) |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5746025B2 (ja) * | 2008-07-16 | 2015-07-08 | ケーセップ・システムズ,リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | 流動床を使用して粒子を操作するための方法及びシステム |
HUE039551T2 (hu) | 2013-10-11 | 2019-01-28 | Regeneron Pharma | Metabolikusan optimalizált sejttenyészet |
US11390663B2 (en) | 2013-10-11 | 2022-07-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Metabolically optimized cell culture |
PL3152317T3 (pl) | 2014-06-04 | 2019-08-30 | Amgen Inc. | Sposoby zbierania hodowli ssaczych komórek |
US11339775B2 (en) * | 2016-07-25 | 2022-05-24 | Repligen Corporation | Alternating tangential flow rapid harvesting |
US11932842B2 (en) | 2018-02-09 | 2024-03-19 | Global Life Sciences Solutions Usa Llc | Bioprocessing apparatus |
US11371007B2 (en) * | 2018-02-09 | 2022-06-28 | Global Life Sciences Solutions Usa Llc | System and method for fluid flow management in a bioprocessing system |
US11920119B2 (en) | 2018-02-09 | 2024-03-05 | Global Life Sciences Solutions Usa Llc | Systems and methods for bioprocessing |
US11414639B2 (en) | 2018-02-09 | 2022-08-16 | Global Life Sciences Solutions Usa Llc | Bioprocessing vessel |
US12077743B2 (en) | 2018-02-09 | 2024-09-03 | Global Life Sciences Solutions Usa Llc | Apparatus for fluid line management in a bioprocessing system |
WO2019226618A1 (en) * | 2018-05-22 | 2019-11-28 | Nantkwest, Inc. | Methods and systems for cell bed formation during bioprocessing |
US12071607B2 (en) * | 2018-06-01 | 2024-08-27 | Lonza Ltd. | Midscale model for organic growth and phasing |
US10792618B2 (en) | 2018-06-19 | 2020-10-06 | Sartorius Stedim Biotech Gmbh | Particle separation and/or purification of a fluid |
TWI662122B (zh) * | 2018-07-12 | 2019-06-11 | 聯發生物科技股份有限公司 | 發酵設備 |
GB201904083D0 (en) * | 2019-03-25 | 2019-05-08 | Ge Healthcare Bio Sciences Ab | A bioreactor system |
CN116601279A (zh) * | 2020-07-28 | 2023-08-15 | 思进股份有限公司 | 用于生产多肽的方法和系统 |
EP4056671A1 (en) * | 2021-03-10 | 2022-09-14 | Sartorius Stedim Biotech GmbH | Method for operating a bioprocess installation |
EP4124653A1 (en) * | 2021-07-27 | 2023-02-01 | Sartorius Stedim Biotech GmbH | Method for producing a bioproduct |
WO2023167584A1 (en) * | 2022-03-01 | 2023-09-07 | Biosanapharma B.V. | Continuous manufacturing of a biological substance with process traceability |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2058992C1 (ru) * | 1993-07-14 | 1996-04-27 | Антипин Георгий Васильевич | Способ получения кормового белка и устройство для его осуществления |
WO2005007269A1 (en) * | 2003-06-17 | 2005-01-27 | Centocor, Inc. | Method and apparatus for filtration of bioreactor recombinant proteins |
WO2009023562A2 (en) * | 2007-08-09 | 2009-02-19 | Wyeth | Use of perfusion to enhance production of fed-batch cell culture in bioreactors |
WO2009131659A1 (en) * | 2008-04-22 | 2009-10-29 | Boston Technology Consultants Group, Inc. | Single use centrifuge system |
WO2011062926A2 (en) * | 2009-11-17 | 2011-05-26 | Medarex, Inc. | Methods for enhanced protein production |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK309184D0 (da) | 1984-06-25 | 1984-06-25 | Nordisk Insulinlab | Fremgangsmaade til isolering af insulin eller insulinlignende materiale fra en fermenteringsvaeske |
DE3833925A1 (de) * | 1988-03-11 | 1989-09-21 | Inst Angewandte Biotechnologie | Verfahren und herstellung von virus und viralem antigen und vorrichtung hierzu |
ES2565077T3 (es) * | 2003-10-10 | 2016-03-31 | Novo Nordisk Health Care Ag | Método para producción en gran escala de un polipéptido en células eucariotas |
JP2007525984A (ja) | 2004-03-05 | 2007-09-13 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー.ブイ. | 連続的灌流および交互接線流による細胞培養の方法 |
SI2041259T1 (sl) | 2006-07-14 | 2016-04-29 | Dpx Holdings B.V. | Izboljšan postopek kultiviranja celic |
JP5746025B2 (ja) | 2008-07-16 | 2015-07-08 | ケーセップ・システムズ,リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | 流動床を使用して粒子を操作するための方法及びシステム |
WO2011044237A1 (en) | 2009-10-06 | 2011-04-14 | Kbi Biopharma, Inc. | Methods, systems and apparatus for manipulating particles |
WO2012081931A2 (ko) * | 2010-12-17 | 2012-06-21 | Kim Sung-Chun | 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법 및 장치 |
-
2013
- 2013-02-18 TW TW102105480A patent/TWI637057B/zh active
- 2013-11-08 MY MYPI2015701476A patent/MY181264A/en unknown
- 2013-11-08 SG SG10201703385YA patent/SG10201703385YA/en unknown
- 2013-11-08 RU RU2016105100A patent/RU2639556C2/ru active
- 2013-11-08 US US14/441,818 patent/US9982226B2/en active Active
- 2013-11-08 AU AU2013341858A patent/AU2013341858B2/en active Active
- 2013-11-08 MX MX2015005822A patent/MX364790B/es active IP Right Grant
- 2013-11-08 EP EP13801880.9A patent/EP2917323A1/en active Pending
- 2013-11-08 CA CA2890813A patent/CA2890813C/en active Active
- 2013-11-08 BR BR112015010544-0A patent/BR112015010544B1/pt active IP Right Grant
- 2013-11-08 WO PCT/NL2013/050805 patent/WO2014073967A1/en active Application Filing
- 2013-11-08 SG SG11201601362VA patent/SG11201601362VA/en unknown
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2058992C1 (ru) * | 1993-07-14 | 1996-04-27 | Антипин Георгий Васильевич | Способ получения кормового белка и устройство для его осуществления |
WO2005007269A1 (en) * | 2003-06-17 | 2005-01-27 | Centocor, Inc. | Method and apparatus for filtration of bioreactor recombinant proteins |
WO2009023562A2 (en) * | 2007-08-09 | 2009-02-19 | Wyeth | Use of perfusion to enhance production of fed-batch cell culture in bioreactors |
WO2009131659A1 (en) * | 2008-04-22 | 2009-10-29 | Boston Technology Consultants Group, Inc. | Single use centrifuge system |
WO2011062926A2 (en) * | 2009-11-17 | 2011-05-26 | Medarex, Inc. | Methods for enhanced protein production |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US9982226B2 (en) | 2018-05-29 |
SG11201601362VA (en) | 2016-04-28 |
TW201418468A (zh) | 2014-05-16 |
MY181264A (en) | 2020-12-21 |
TWI637057B (zh) | 2018-10-01 |
AU2013341858B2 (en) | 2017-11-02 |
MX2015005822A (es) | 2016-02-10 |
CA2890813A1 (en) | 2014-05-15 |
WO2014073967A1 (en) | 2014-05-15 |
RU2016105100A (ru) | 2017-08-21 |
US20150299644A1 (en) | 2015-10-22 |
CA2890813C (en) | 2022-07-12 |
MX364790B (es) | 2019-05-03 |
SG10201703385YA (en) | 2017-05-30 |
BR112015010544B1 (pt) | 2021-01-05 |
AU2013341858A1 (en) | 2015-06-11 |
EP2917323A1 (en) | 2015-09-16 |
BR112015010544A2 (pt) | 2017-07-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2639556C2 (ru) | Технологический способ получения биологического вещества, такого как белок, с периодической подпиткой с применением чередующихся биореакторов | |
JP6682172B2 (ja) | 細胞培養装置及び細胞培養方法 | |
KR102539167B1 (ko) | 교번 접선 유동식의 신속한 수확 | |
KR20170015464A (ko) | 포유류 세포 배양물을 회수하는 방법 | |
JP7043125B2 (ja) | 連続培養における有用物質の回収方法 | |
WO2019181234A1 (ja) | 生産物の製造方法 | |
CN104160013A (zh) | 灌流式生物反应器系统及操作其的方法 | |
US20210087512A1 (en) | Cell culture system and cell culture method | |
Berthold et al. | Interaction of cell culture with downstream purification: a case study | |
JP7330834B2 (ja) | 培養方法および培養装置 | |
US20220041976A1 (en) | Separation devices, associated methods, and systems | |
KR20160060058A (ko) | 고밀도의 미정제 세포 배양 수거물의 정화를 위한 방법 | |
JP2014024824A (ja) | 潅流培養における有用タンパク質を含む培養液の濾過方法 | |
WO2023167584A1 (en) | Continuous manufacturing of a biological substance with process traceability | |
Levison et al. | Acoustic Wave Separation–A non-filtration approach for continuous clarification of perfusion cell culture prior to capture chromatography | |
LaPorte et al. | Hybridoma Perfusion system using a sedimentation device |