TW201418468A - 具交替生物反應器用途之不連續進料批次製程 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種使用交替生物反應器，並結合自生物物質(更明確地為單株抗體)與廢料成分不連續分離出生物質量之哺乳動物細胞(更明確地為CHO細胞)不連續進料批次細胞培養。

Description

具交替生物反應器用途之不連續進料批次製程

本發明係關於一種大規模細胞、特別為懸浮細胞之培養的方法及系統。

可依一實驗室規模或工業規模執行細胞培養。該二種規模將提供使用者不同之挑戰。一實驗室規模下之作業通常不會在一大規模下作業。一主要差異係培養製程之效率。

本發明特別關於大規模進料批次培養或發酵。二基本方法可達成進料批次發酵；定體積進料批次培養與可變體積進料批次培養。

在固定體積進料批次中，可進給有限基質而未稀釋培養物。實務上亦可藉進給未稀釋型之生長有限基質、譬如為一極濃縮液體或氣體(例如氧氣)，來維持培養物體積。某一特定型態之延展進料批次-固定體積系統之循環進料批次培養-係指，週期性回收一部份培養物，且使用剩餘培養物作為另一進料批次製程之起始點。基本上，一旦發酵達到某一特定階段(當無法再維持好氧條件)，將移除部份之培養物，且以含該進料基質之無菌水或介質將剩餘之生物質量稀釋至原始體 積。該稀釋將降低生物質量之濃度，且典型地導致比生長率增加。接著，當進料持續時，生長率將隨生物質量增加而逐漸衰退，且再次達容器中可承擔之最大量，此時可再次以新鮮培養基取代部份培養物。

一可變體積進料批次係體積隨發酵時間改變者。該改變之原因典型地係基質進料。該體積改變之方式係根據操作者之需求、限制、及目的而定。此型態進料批次又可分為反複進料批次製程或循環式進料批次培養、與單次進料批次製程。前者典型地意味著，一旦發酵已達某一特定階段而在其後將不再起作用，即自容器移除一分量培養物，且以新鮮營養物介質取代。細胞數量減少將導致比生長率增加，接著當準穩態建立時，再逐漸減少。

進料批次發酵具有分批生產以及連續發酵之特徵。進料批次可提供優於批次與連續培養之多個優點。在批次進程期間，生長所需成分之進料及/或生產產物所需其他物質不致耗盡，且滋養環境可維持幾近固定不變。亦可藉由將基質之分量限制在僅供產物所需之量，而避免通常與出現高基質濃度相關之副產物產出。

一循環式進料批次培養具有額外優點，即製程之生產時期可在控制條件下延展。獲控制之生長率週期性變動可提供一最佳化產物合成之機會，特別當有用之產物係在生長減速期間出現時尤然。

關聯於使用培養系統生產生物物質之一問題為，相對較高之生產生物物質相關成本。本發明係提供一更具效率 之培養系統。本發明容許符合成本效益且獲控制之一生物物質生產。

本發明之一具體實施例係提供一種藉培養細胞生產一生物物質之方法，其可在一生物反應器中生產該生物物質，該方法包括：-對一生物反應器提供一細胞培養物，該細胞培養物包括懸浮於一培養基中之該等細胞；-該方法尚包括，執行至少一培養與收穫循環，其包括在一生物反應器中培育該細胞培養物，直到其達到前穩定、或穩定期，及藉由自包含該生物物質之該培養基分離出該等細胞，以收穫具有該生物物質之該培養基，且將大體上所有細胞皆進給回一生物反應器中，以與新鮮培養基一同繼續培養。本發明方法之一優點在於，該生物物質之高產率。該物質之產率將隨每又一培育與收穫循環而更增加。是以，本發明之一方法較佳地包括至少2、更佳地至少5、更佳地至少10、且較佳地至少20個培育與收穫循環。

可藉較佳地維持該培育步驟眾多狀態條件之一收穫系統來收穫該細胞培養物。該收穫系統因此較佳地包括一保持培養溫度用裝置。當該生物反應器中之細胞培養物體積超過該收穫系統之容量時，仍可收穫全部細胞培養物。較佳地，這可藉相繼地將該細胞培養物之等分試樣進給至該收穫系統而達成。當大體上全部細胞培養物皆已處理時，即可完成該收穫循環。正等待處理之細胞培養物將不與已藉由該收穫系統處理 之細胞相混合。這可藉由將該已處理細胞進給入一不同生物反應器中而達成。可因此提供該等已處理細胞新鮮介質，且將該等者進給入該不同生物反應器中，以進行後續培育與收穫循環。倘有需要時，可在本階段調整細胞密度。可根據操作者之期望，濃縮或稀釋該等細胞。本發明之一優點在於，可能實現一收穫系統，其具有較該細胞培養物體積低之一容量。

期望細胞密度增加，特別在第一循環中尤然，以快速地獲取生產該生物物質所需之目標細胞密度。後續之循環中典型地期望稀釋，以調和持續增加之細胞數量。

該生物物質較佳地係由該等細胞分泌之一物質。該生物物質較佳地係一蛋白質，較佳地為一分泌蛋白質。該蛋白質較佳地包括超過50、且較佳地超過100個胺基酸。在一特殊較佳具體實施例中，該生物物質係一生長因子、一抗體、或一可溶解型膜結合配位體。該生物物質亦可包括一抗體之一抗原結合斷片。此斷片之非限制性範例係單鏈Fv斷片、FAB斷片、單價抗體、與僅重鏈抗體。在一較佳具體實施例中，該抗體係一哺乳動物抗體。在一較佳具體實施例中，該抗體係一單株抗體。在一較佳具體實施例中，該抗體係一鼠源、人源、或鼠/人嵌合抗體。嵌合抗體較佳地係一人源化鼠源單株抗體或人源抗體。各種型態之人源化皆存在。典型地，至少該抗體之恆定部份係人源者。最新人源化抗體亦包含人源可變區，其中CDR區係由鼠源CDR取代。另一選擇為，該抗體包含鼠源可變區中之突變，以移除預期人類B及/或T細胞抗原決定基。目前，可能生成所謂純人源單株抗體。這些係完全由人類序列 生成。然，亦可能根據監管方式與CDR之本質，而對純人源抗體有免疫反應。

細胞可在懸浮或貼壁培養物中生長。某些細胞可在懸浮中自然生存，無需貼附至一表面，譬如存於血流中之細胞。亦有已修改成能夠在懸浮培養物中續存活之細胞株，容許其可較貼壁條件下生長達一高密度。貼壁細胞需要譬如棉質塑膠或微載體等一表面，其可塗佈有細胞外基質成分，以增加貼附特性，且提供生長與區別所需之其他信號。貼壁細胞典型地可調整成適應於懸浮生長，另一選擇為該等細胞可如上述者貼附至微載體，接著再於該生物反應器中懸浮與培養。本發明中之細胞較佳地係懸浮中生長之細胞。哺乳動物細胞係屬較佳者。較佳之產出細胞係中國鼠卵巢或CHO細胞及NS0細胞株。在一特別較優具體實施例中，該等細胞係CHO細胞。

一典型哺乳動物細胞進料批次培養中之細胞生長，可分為7階段：(A)遲滯期；(B)前對數期；(C)對數/指數期；(D)前穩定期；(E)穩定期；(G)前衰滅期；(F)衰滅期。

A.遲滯期中，細胞係使其本身調整成適應於生長條件。細胞總數未增加。

B.前對數期中，愈來愈多細胞已完成調整適應，且正進入指數期。

C.指數期(有時稱作對數期)係以細胞倍增為特徵之一段時間。每單位時間出現之新細胞數係與現有總數成比例。倘未限制生長，則將依一固定速率持續倍增，使細胞數與總數增加率在每一連貫時段後呈倍數增加。在此型態指數生長 中，細胞數之自然對數對時間之繪圖，可成一直線。該線之斜率係細胞之比生長率。該生長之實際速率(即，圖中直線之斜率)將根據生長條件與細胞型態而定。

D.前穩定期(或前高原期)係對數期與穩定期之間的時期，且以一逐步方式衰退之總數增加率為特徵。該時期之特徵在於，該總數生長率係該指數期中最大生長率的三分之一或更少。該前穩定期係當該細胞總數之生長率為零或更少時終結。

E.該穩定期或高原期通常係基於一生長限制因素造成；這主要係營養物耗盡、及/或形成抑制產物。在該穩定期中，該細胞總數之大小仍大約保持定值。生物物質產出典型地在本時期中係最高者。

F.在該衰滅期中，該細胞用盡營養物，或有毒產物已增長達，使該等細胞衰滅之程度。

G.該前衰滅期係當愈來愈多細胞衰滅時，定義該穩定期終結。

可根據起始培養前已如何處理細胞，而存有或不存有該遲滯期。例如，大規模培養典型地係由種菌培養物或預培養物起始。在這種情況下，由於該等細胞已在一適當種菌及/或預培養物中，調整成適應於該進料批次培養中之培養條件，因此可能具有一非常短、或不存有遲滯期。

在譬如本發明之循環式培養系統中，後續循環典型地係反複階段C及D。可選擇地，一個或更多循環額外包含步驟E、F、及G。後續循環中之指數期可、或不可達成相同 於第一階段者之最大生長率。在每一循環中，該前穩定期起始之特徵在於，該總數生長率係由先前指數期中之最大生長率衰退至三分之一或更少。該生長率典型地係由生長曲線之切線計算出。

第1圖至第3圖中係提供一生物物質生產系統之範例。在該等系統中，可培養用於生產該生物物質之細胞，且將該等細胞與包含有該生物物質之一培養基相分離。在分離後，大體上所有細胞皆進給回一生物反應器中，以與新鮮培養基一同繼續培養。在第1圖中，一收穫系統100包括複數個生物反應器10、15。該等生物反應器係配置成，可對懸浮於該生物反應器內一培養基中之複數個細胞的一細胞培養物進行培育。該系統包括數個培養基進料(16)，其配置成可藉進給培養基或其一成分至該等生物反應器中，以補償流出物損失。

明確地，一進料16係直接連結至該生物反應器，其中用於進給介質與緩衝劑之另一進料17可連結至一泵與交換單元40，該單元係連接至一分離器30。

此外，提供一裝置(未顯示)，用於偵測生物反應器10、15中之一細胞計數或密度。典型地，這種裝置可為一技藝中已知型態之細胞計數偵測器、密度計或流式細胞儀。該偵測器可配置成，偵測一細胞密度。可試錯地或藉一計算決定一既定臨限值，輸入至該偵測器，以指示其中一該等生物反應器中 之一細胞培養物培育，已達以上所闡明之前穩定期或穩定期。

分離器30係配置成，連通地連結於一收穫過濾器模組20與該複數個生物反應器之間。該分離器係獲進給，藉該泵與交換單元自其中一生物反應器10、15抽吸出之細胞培養物，且又獲進給一介質與緩衝劑進料17。在第1圖及第2圖之範例中，分離器30係配置成，藉由一離心機35，自包含有該生物物質之培養基分離出該等細胞。在離心機35中，藉由新鮮介質17之流體流動、來自該生物反應器之細胞進料及離心機35之旋轉速度，經由其本身為已知之離心與流體流動力連續平衡作用而達之一平衡，將可形成一濃縮細胞流體化床。

離心機35包括一新鮮介質17產物，配置成可提供該流體流動力，以自具有該生物物質之培養基分離出該等細胞。

在本範例中，泵與交換單元40係由一雙向泵形成，其連結至複數個開關，可當在分離器35中淨化該細胞培養物後，在其中一生物反應器10與另一生物反應器15之間切換一流體流動。在使用中，當在該複數個生物反應器10、15其中之一偵測到該前穩定期或穩定期時，可藉由自其中一生物反應器15抽取出該細胞培養物且以新鮮介質與緩衝劑進給該分離器，生成一液流而提供分離器30。

藉由自該分離器導回液流，且將液流切向另一生物反應器15，將可經由該泵與交換單元40，將大體上所有細胞自分離器30進給回另一生物反應器15中，以與新鮮培養基 一同繼續培養。

含生物物質與緩衝劑之培養基，將週期性地進給入收穫模組20中，該收穫模組可藉以下進一步說明之過濾，收穫該生物物質。

當該介質係至少部份地循環再利用時，培養物可在培育期間達到較高之細胞密度。是以，對比於第2圖中所揭示之系統，在該細胞培養物培育期間，較佳地至少部份之生物反應器10及15細胞培養物係連續地流入一分離系統50中，該分離系統包括依大小選擇半透性膜片55。

膜片55可自具有一低於生物物質者分子量之物質，分離出該等細胞與生物物質，藉此產生可輸出之一無細胞與生物物質流出物。此外，一含細胞與生物物質液流係進給回該生物反應器中，及至少藉進給培養基或其一成分至該生物反應器中而補償流出物損失。

這種膜片分離裝置50通常稱作交替切向流過濾裝置(或ATF)。此型過濾不同於，進料係通過一膜片或床而使固體捕陷於過濾器中且濾出液在另一端獲釋放之終端過濾。在ATF過濾中，大多數之流體流動係切向地行進橫越過濾器之表面，而不進入該過濾器中。可藉由一隔膜在連接至一過濾器機殼且連附至一生物反應器之一泵頭內作上下運動的作用，產生該交替膜片流。

膜片分離裝置50典型地係一超微過濾裝置。該分離裝置中之過濾器典型地係一半透性膜片，其包括複數個細孔，具有某一特定分子截流量。本發明製程中使用之過濾器或 半透性膜片，能夠自具有一低於生物物質者分子量之物質，分離出該生物物質。換言之，可選擇該分子截流量，使該分子截流量(MWCO)更佳地以至少一因數2、最佳地以至少一因數3小於該生物物質分子量。然，典型地，該分離系統之MWCO當然可根據本發明製程中所生產生物物質之分子量，而較佳地至少5、更佳地至少10、最佳地至少3OkDa，且較佳地至多50OkDa、更佳地至多30OkDa、最佳地至少10OkDa。例如，對於一分子量15OkDa之一IgG，具有至多5OkDa之一MWCO的一分離系統係最佳者。

該培育與收穫循環之收穫步驟，係對全部培養物實施。在本發明中，該培養物體積較佳地高於該收穫裝置之容量。在本具體實施例中，可藉相繼地進給該培養物至該收穫系統中而完成收穫。該收穫系統較佳地包括一交叉流過濾系統，藉此可將具有生物物質介質以新鮮培養基替換。這種交叉流收穫系統典型地包含過濾器或半透性膜片，其具有一MCWO，可自該生物物質與該培養基分離出細胞。在這些裝置中，該MCWO典型地高於200kDa。這種裝置亦稱作交叉流微過濾裝置，且該方法則為微過濾。在這些微過濾裝置中，細孔大小典型地介於0.1微米至10微米之間。

在一特別較優具體實施例中，該收穫系統包括以離心力為基礎之一流體化床系統。在本具體實施例中，本發明之一方法較佳地係使該細胞培養物流入一離心機中，經由離心與流體流動力之連續平衡作用，將該等細胞維持於一濃縮流體化床，以收穫具有生物物質之培養基，其中該流體流動力係由 新鮮介質之內入流施加，以自具有生物物質之培養基分離出該等細胞。

對比地，第3圖係圖示出一分離器30，其顯示一切向流過濾模組。在該模組中，相似於上述之膜片分離裝置50，設有一大小選擇半透性膜片，且配置一新鮮介質進口，以提供切向流。在此，該大小選擇半透性膜片係設計成，可擋留該等細胞，且容許該介質連同該生物物質收集於該流出物中。如此，可自該培養基與該生物物質分離出該等細胞，且大體上所有細胞皆進給回另一生物反應器15中，以與新鮮培養基一同繼續培養。

依據本發明之一大規模培養係一培養，其在每一培育與收穫循環包括至少1公升、且較佳地至少2公升培養基與細胞。較佳地，其包括至少5公升培養基與細胞。

本發明之一方法較佳地包括一進料批次培養系統，用於該培育與收穫循環中之培育步驟。

當後續培養與收穫循環中之細胞培養物培育係在不同或交替生物反應器中實施時，已驚人地觀察到，該等細胞培養物係更快速地發展，且產出更多生物產物。這在培養物(即，培養基與細胞)體積超過收穫系統單次運轉容量之具體實施例中，尤為如此。當收集到之細胞搬移至一不同生物反應器，可發現較高產率。如此導致一較佳操作方法，其中該細胞培養物係在每一培育與收穫循環，搬移至一不同生物反應器。本具體實施例中，較佳地在每一培育與收穫循環，該培養物皆於二生物反應器之間交替。這導致在收穫期間，培養物自某一 生物反應器輸入至該收穫系統中、在該收穫系統中處理、及接著新鮮培養基中之細胞輸出至另一生物反應器的狀況。一經使用生物反應器可在該系統中仍保持其原本之狀態，以在次一循環完成時接收培養物，該反應器可經清潔或其可由一清潔之生物反應器替換或著其一組合。

在一較佳具體實施例中，本發明包括，使用交替生物反應器，結合自生物物質(更明確地係單株抗體)與廢料成分不連續分離出生物質量，進行哺乳動物細胞(更明確地係CHO細胞)不連續進料批次細胞培養。

藉由在前穩定生長期自生物物質與廢料成分分離出生物質量，且將該等存活細胞再引入操作於進料批次模式下之第二生物反應器中，可及時不連續地維持高細胞密度、高細胞存活率、及高生產率。該等細胞接著將繼續在指數期中生長，且達前穩定期(通常在0.5至2日內)。此後，反複該不連續分離製程，且將生物物質搬移回操作於進料批次模式下之第一反應器，及該等細胞再次由指數期生長0.5至2日而達前穩定期。可反複這種分離生物物質與廢料成分後之交替生物反應器中不連續進料批次製程，直到已獲取足夠生物物質或細胞存活率降至90%以下。倘需要時，可在分離後、搬移至次一生物反應器前，濃縮或稀釋生物質量。

可根據需求或需要之細胞密度，依一調整之進料對策將一ATF設備運用至二生物反應器。藉由在收穫過濾器模組20中使用離心分離或交叉流過濾，可實現生物物質與廢料成分(間隙液)之分離。為此，在第1圖至第3圖中，收穫過 濾器模組20包括一廢料出口21及一深度過濾器22，該深度過濾器係配置成，可自具有一高於生物物質者分子量之物質分離出該生物物質。

為考慮細胞存活率，必須在數小時內完成全部生物反應器內容物之分離製程。

本發明之一要素為，在指數生長期與前穩定期之間，於交替生物反應器中反複進行不連續進料批次細胞培養。該製程可因低位準之廢料成分，而在相對較大量處理之一相對較短時間中，提供高生物物質產率。此外，反複這種進料批次製程之短暫、但高產率時期，將可能達成遠較正規批次與進料批次製程高之總產率。該生物物質總產率可在第一次進料批次培養已達前穩定期後之10日內，累積達正規批次製程者之25倍。

本不連續反複進料批次細胞培養之一額外優點在於，可因連貫收穫之間的短暫時距(0.5至2日)，而選擇性地可能達成持續下游製程。可自一中間貯槽連續地流出生物物質，以用於另一純化之進料。藉此製程，可在一低體積連續操作模式下實現高產物產率。

10‧‧‧生物反應器

15‧‧‧生物反應器

16‧‧‧進料

17‧‧‧介質與緩衝劑進料

20‧‧‧收穫過濾器模組

21‧‧‧廢料

22‧‧‧深度過濾器

30‧‧‧分離器

35‧‧‧離心機

40‧‧‧泵與交換單元

50‧‧‧分離系統

55‧‧‧大小選擇半透性膜片

56‧‧‧膜片分離器出口

100‧‧‧收穫系統

10‧‧‧生物反應器

15‧‧‧生物反應器

16‧‧‧進料

20‧‧‧收穫過濾器模組

21‧‧‧廢料

22‧‧‧深度過濾器

30‧‧‧分離器

35‧‧‧離心機

40‧‧‧泵與交換單元

50‧‧‧分離系統

55‧‧‧大小選擇半透性膜片

56‧‧‧膜片分離器出口

100‧‧‧收穫系統

Claims (13)

1. 一種藉培養細胞生產一生物物質之方法，其可在一生物反應器中生產該生物物質，該方法包括：-對一生物反應器提供一細胞培養物，該細胞培養物包括懸浮於一培養基中之該等細胞；及-該方法尚包括，執行至少一培養與收穫循環，其包括在一生物反應器中培育該細胞培養物，直到該細胞培養物達到前穩定期、或穩定，及藉由自包含該生物物質之該培養基分離出該等細胞，以收穫具有該生物物質之該培養基，且將大體上所有細胞皆進給回一生物反應器中，以與新鮮培養基一同繼續培養。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其包括至少2個培育與收穫循環。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中在該細胞培養物培育期間，至少部份該細胞培養物係連續地流入包括一大小選擇半透性膜片之一分離系統中，其中該膜片係自具有一較該生物物質者低分子量之物質分離出該等細胞與該生物物質，以產生一無細胞與生物物質流出物並將其輸出，及一含細胞與生物物質液流，將其進給回該生物反應器中，以及其中至少藉進給培養基或其一成分至該生物反應器中以補償流出物損失。
4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之方法，其中藉由使該細胞培養物流入一離心機中，以收穫該具有生物物質之培養基，該離心機係透過離心與流體流動力之連續平 衡作用，將該等細胞維持於一濃縮流體化床，其中該流體流動力係由新鮮介質內入流施加，以自該具有生物物質之培養基分離出該等細胞。
5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之方法，其中後續培養與收穫循環之細胞培養物培育係在不同或交替生物反應器中實施。
6. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之方法，其中該等細胞係CHO細胞。
7. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之方法，其中該生物物質係一抗體、或其抗原結合斷片。
8. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之方法，其中該等細胞係在一進料批次培養系統中培養。
9. 一種藉培養可生產一生物物質之細胞以生產該生物物質之系統，其包括：-複數個生物反應器(10，15)，每一該等生物反應器皆配置成，可對懸浮於該生物反應器內一培養基中之複數個細胞的一細胞培養物進行培育，-該系統尚包括一培養基進料(16)，配置成藉進給培養基或其一成分到該至少一生物反應器中，以補償流出物損失。-一細胞偵測器，偵測其中一該等生物反應器中之一細胞培養物培育已達前穩定期或穩定期，-一收穫過濾器模組(20)，配置成自含該生物物質之該培養基中收穫該生物物質，及-一分離器(30)，連通地連結於該收穫過濾器模組與該複數 個生物反應器之間，該分離器配置成，自包含有該生物物質之培養基分離出該等細胞，及-一泵與交換單元(40)，配置於該分離器(30)與該複數個生物反應器(10，15)之間，配置成當在其中一該複數個生物反應器(10，15)中偵測到該前穩定期或穩定期時，將細胞與培養基自該其中一生物反應器(10)輸入至該分離器中，及將大體上所有細胞自該分離器(30)經由該泵與交換單元(40)進給回另一該複數個生物反應器(15)中，以與新鮮培養基一同繼續培養。
10. 如申請專利範圍第9項所述之系統，其中該分離器(30)包括一離心機(35)，配置成透過離心與流體流動力之連續平衡作用，將細胞維持於一濃縮流體化床，該離心機包括一新鮮介質進口，配置成提供該流體流動力，以自具有該生物物質之培養基分離出該等細胞。
11. 如申請專利範圍第9項所述之系統，該分離器(30)包括切向流過濾模組，其包括一大小選擇半透性膜片，及一新鮮介質進口，配置成提供該切向流，以自具有該生物物質之培養基分離出該等細胞。
12. 如申請專利範圍第9項所述之系統，其中至少一生物反應器(10)係與一膜片分離器(50)作流體式連通，該膜片分離器包括一大小選擇半透性膜片(55)及一膜片分離器出口(56)，該膜片分離器係與該至少一生物分離器(10)作流體式連通，且配置成使至少部份該細胞培養物自該至少一生物分離器連續地流入該膜片分離器中；該膜片(55)配置成，自 具有一較該生物物質者低分子量之物質分離出該等細胞與該生物物質，以產生一無細胞與生物物質流出物，經由該膜片分離器出口(56)輸出，及一含細胞與生物物質液流，進給回該生物反應器中。
13. 如申請專利範圍第9項所述之系統，其中該收穫過濾器模組(20)包括一廢料出口(21)及一深度過濾器(22)，該深度過濾器配置成，自具有一較該生物物質者高分子量之物質分離出該生物物質，以產生一無生物物質流出物，經由該廢料出口輸出，及其中該生物物質係輸出至下游製程。