WO2004072292A1 - Procede et dispositif pour la production de biomolecules en continu - Google Patents

Procede et dispositif pour la production de biomolecules en continu Download PDF

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WO2004072292A1
WO2004072292A1 PCT/CA2004/000184 CA2004000184W WO2004072292A1 WO 2004072292 A1 WO2004072292 A1 WO 2004072292A1 CA 2004000184 W CA2004000184 W CA 2004000184W WO 2004072292 A1 WO2004072292 A1 WO 2004072292A1
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WO
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membrane
filtration
bioreactor
culture medium
target
Prior art date
Application number
PCT/CA2004/000184
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Hassan Chadjaa
Mohamed Rahni
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Centre National En Electrochimie Et En Technologies Environnementales Inc.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method and a device used for the production of recombinant biomolecules.
  • this method and this device allow the production of biomolecules continuously, using growing microorganisms in a bioreactor and a means of continuously taking a defined amount of suspension of microorganisms to subject it, continuously, to stages of filtration allowing the production of purified or concentrated biomolecules.
  • Biotechnology represents a most important strategic research area.
  • the major biotechnology companies identified produce recombinant bioreactors for the production of recombinant or natural biomolecules with high added value.
  • biological molecules essentially protein
  • HLA high-density lipoprotein
  • P53 molecules high-density lipoprotein
  • interferons anti-carcinogenic
  • insulin antibiotics
  • the first bioreactors with membranes combined the purification capacity of microorganisms and the separation possibilities of membrane filtration techniques. It is based on the use of a membrane bioreactor where secondary settling is replaced by tangential microfiltration. Filtration allows the retention of suspended particles depending on their size.
  • the characteristic of the process is that it is compact and modular.
  • Batch production has several disadvantages compared to continuous production. The most important consist in the operating costs which are more expensive compared to a production in continuous mode, the lower production yield, longer maintenance and preparation (monitoring) times and consequently times of use. shorter. This last point translates into higher capital costs. Finally, the continuous mode ensures a greater production capacity than the batch mode. In the case of this platform, the optimized continuous production capacity is more than five (5) times higher than that of batch production.
  • a first object of the present invention consists of a process for the continuous production of biomolecules of interest produced by microorganisms.
  • this process comprises the following stages: a) growing microorganisms expressing the recombinant biomolecules of interest in a bioreactor; b) transferring a portion of the suspension of producer microorganisms and a fraction of the medium into a container; c) separating and concentrating the microbial biomass from the culture medium resulting from biofermentation; in the case of exogenous molecules, the recombinant biomolecules produced are found in the filtration permeate; in the case of endogenous molecules, the biomolecules are released by cell lysis (sonication).
  • the membrane filtration sequence (s) consist of separating, concentrating and purifying the recombinant biomolecules of interest from the substances and other nutrients composing the medium (amino acids, organic acids, mineral elements, etc.); in the case of non-secreted molecules (endogenous), the biomolecules of interest are released from the cell compartments by lysis (sonication) and the membrane filtration sequences, consist in a first step in separating the biomolecules of interest from the cell lysate ( cell debris, constituent proteins, etc.) and in a second step to separate, concentrate and purify the biomolecules of interest from the remaining medium (permeate from the first filtration step); and e) harvesting the biomolecules of interest.
  • the invention also relates to a device for the continuous production of microbial biomolecules comprising: a) a bioreactor; b) a source of nutrients, and a means for introducing said nutrients into the bioreactor; c) a means of aerating the bioreactor; d) a means for agitating the bioreactor; e) a first transient tank and a means of introducing the suspension of producer microorganism into said transient tank; f) a first filtration means and a means for introducing the suspension of microorganisms into the first filtration means from the first transient tank; g) a second reservoir for the suspension of biomolecules and a means of introducing the suspension of biomolecules into the reservoir after a first filtration; h) a second filtration means and a means for introducing the suspension of biomolecules having undergone a first filtration into the second filtration means from the second reservoir; and i) a third reservoir for the suspension of biomolecules of interest and means for introducing
  • Another object of the present invention consists in a process for the continuous production and n of target polypeptides by a microorganism comprising the steps of: a) allowing the growth of a microorganism producing at least one target polypeptide in a bioreactor supplied with medium growing independently over a predetermined period of time; b) allow a portion of the culture medium to be transferred independently in a first container, so that this container promotes the accumulation of volumes withdrawn from the bioreactor in compensation for the volumes of fresh medium added continuously, the container being refrigerated at 4 ° C to allow the accumulation and residence of a mixture of cells and culture broth before their sonication, a second refrigerated container of the same capacity and nature as the first container used for storage at 4 ° C of the mixture after sonication; c) autonomously inducing the separation of the target polypeptides from the portion of the culture medium by at least one passage through at least one first membrane, chosen (nature and cutoff threshold) according to the filtration objectives, the characteristics of the solution
  • Said bioreactor can be an external membrane bioreactor.
  • the target polypeptides are preferably native or recombinant proteins and are produced in the culture medium or endogenously, that is to say that they are accumulated, in the producer cell. They can be selected from enzymes, transport proteins, antioxidant proteins or food proteins.
  • microorganisms which can be used to carry out the present invention can be chosen from the group of bacteria, yeasts, molds, viruses, a protozoan, a fungus, or even a yeast, a plant cell, an animal cell, or an insect cell.
  • the growth of the producer cells preferably corresponds, but not limitatively, to a point at the end of the logarithmic growth phase, with an optical density (OD) of 1.8, at a concentration of 0.2 ⁇ 10 10 cells per milliliter, this cell concentration being obtained between 7 and 8 hours after the start of the biofermentation and 2 hours after the departure of the pumps provided for transfers between the bioreactor and the first and second containers, the starting of the pumps for adding fresh medium being carried out at a flow rate of 37 ml / min, for the type of fermenter used, and purging at an equivalent flow rate having been optimized and the average time for starting the pumps was determined at 5.30 am after the start of fermentation , the OD being equal to 1.5, the OD and the cell concentration remaining stable and constant (variability ⁇ 10% calculated on the basis of 30 fermentations) throughout the bioferment production stage Eur.
  • a device for the continuous production of at least one target polypeptide comprising:
  • a source of culture medium and nutritive substrates and a means allowing them to be introduced into the bioreactor; - a means of aerating the bioreactor;
  • a first reservoir intended for the sterile conservation of the culture medium and a means for allowing its transfer autonomously and continuously into said bioreactor; - at least a first filtration means (microfiltration) and a means of separating the cells (biomass) in the concentrate of the partially consumed culture medium (permeate) by a filtration means (microfiltration) from the biofermenter; means ensuring that after the membrane separation, the concentrate remains in the first reservoir and the permeate is conveyed to a second reservoir, this second reservoir being arranged to form a suspension of filtered target polypeptide;
  • Said bioreactor is preferably, but not limited to, an external membrane bioreactor, the first filtration means a membrane, membrane a ceramic membrane, the second filtration means also a membrane, which may alternatively be or cumulatively or in combination a microfiltration, ultrafiltration, nanofiltration, reverse osmosis or dialysis membrane.
  • Fig. 1 shows a diagram illustrating a device for producing recombinant biomolecules which can be used for carrying out the present invention.
  • Fig. 2 illustrates a device for producing recombinant molecules expressed in the intracellular compartments of bacteria
  • Fig 3 illustrates a diagram of different stages of filtration allowing the separation, the concentration and the purification of a molecule produced in an endogenous way in a bacterium
  • Fig. 4 illustrates an example of a diagram of different filtration steps allowing the separation, the concentration and the purification of a secreted molecule
  • Fig. 5 illustrates the evolution of the permeate flow rate as a function of the concentration rate during the separation of cellular debris
  • Fig. 6 illustrates the evolution of the permeate flow as a function of the concentration rate during separation of GFP
  • Fig. 7 illustrates the evolution of the total proteins and of the TOC in the concentrate during the diafiltration.
  • the technology used is based on the production of microorganisms producing the biomolecules of interest and on the extraction / purification of these biomolecules by filtration on membranes. These two technologies are combined to develop a technological platform for production and extraction / purification.
  • the production / separation system of the present invention is preferably composed of a series of process and technology sequences making it possible to produce, extract and purify, continuously or without interruption, the protein molecules of interest at using a bioreactor coupled with membrane technologies.
  • Membrane technologies which include microfiltration, ultrafiltration, nanofiltration and reverse osmosis, once the molecule has been produced and secreted in the medium, have the function of separating, extracting and purifying it according to desired parameters. purity. Those skilled in the art will understand that these methods can also be used when the microorganisms have undergone prior lysis.
  • the system can be used for the continuous production of exogenous and / or endogenous biomolecules for various applications, biopesticides (bactericides, fungicides, etc.), nutraceuticals and functional foods (probiotics), agro-food (additives, food supplements, enzymes , digestive aids, etc.) and pharmaceuticals.
  • biopesticides bactericides, fungicides, etc.
  • nutraceuticals and functional foods probiotics
  • agro-food additives, food supplements, enzymes , digestive aids, etc.
  • the present invention does not show any return of bacteria in the fermenter (bioreactor).
  • the claimed production system is continuous, while the systems used in the treatment of wastewater are stopped when the sludge matures, that is to say when the biological treatment has come to an end. In this case, we speak of a fermentation in batch mode.
  • the microbial strains found in the treatment of wastewater are heterogeneous while the biological systems used for the growth and production of biomolecules continuously are pure strains and, in the majority of cases, preferentially recombinant. Continuity of growth and production is ensured by coupling the bioreactor and the membranes, the latter being arranged either in series or in parallel, as required (system with variable geometry).
  • the nutrients are continuously added to the bioreactor and an equivalent volume of culture broth is taken synchronously to be conveyed to the membrane filtration system.
  • the nature of the molecules of interest which can be produced by the method and the system of the present invention are essentially protein molecules. These can be food proteins or those with biological activity such as enzymes (proteases, lipases, dehydrogenase, oxidase, etc.) or transport proteins (hemoglobin, myoglobin, transferin) or antioxidants (cosmetics). Recombinant proteins from the food industry offer great potential.
  • a single-cell fermenter is optimized for continuous production of protein molecules. The extraction is carried out using a membrane system in order to separate the molecules from the producing cells.
  • the determination of the factors allowing the continuous operation of the bioreactor, its control and its optimization, are based on the following parameters: pH, temperature, oxygen diffusion, dilution volumes, etc.
  • the ensuing phase taking into account the choice of membrane made beforehand, makes it possible to extract, concentrate and purify the biomolecule produced.
  • the biological molecules that the system can produce are the molecules secreted in the medium and the molecules not secreted.
  • the separation, concentration and purification of the secreted biomolecules does not require a continuous cell lysis step, whereas such a step is required for the treatment of non-secreted molecules.
  • the bioreactor must contain the microorganisms which produce the biomolecules to be extracted and purified;
  • Ventilation should be optimized according to the mode and respiratory rate of the microorganisms;
  • the reactor must be equipped with a system, the shape of which, preferably but not limited to cylindrical geometry, has been optimized as a function of the production system to be used in order to provide optimum agitation and homogenization of the medium and good diffusion of l oxygen therein;
  • the pressure pump can be of different types but a centrifugal type pump gives the best results.
  • the outer membranes are chosen according to the biomolecule that we want to extract.
  • the first membrane sequence is a membrane chosen at a cutoff threshold which allows the biomolecule to pass, but which retains cells and other large compounds.
  • the membrane used is preferably a ceramic membrane because they are very resistant membranes. In fact, they can easily be sterilized thermally or chemically. They can be easily cleaned with chemicals or by pressure reversal (sending air or water). These are qualities that are not found in conventional organic membranes. In addition, these membranes are autoclavable.
  • the cutoff threshold is strict. A ceramic membrane with a cutoff threshold of one micron will not allow any molecule larger than one micron to pass through. Conversely, polymeric membranes may allow a few particles of one micron to pass through. This notion is very important when talking about the profitability of extraction. Finally, the ceramic membranes are certified safe in the food industry, cosmetics, nutraceuticals and are pharmaceutical grade.
  • the first filtration produces two fractions: a concentrate composed mainly of cells and a permeate composed of all the molecules not retained by the membrane.
  • a concentrate composed mainly of cells
  • a permeate composed of all the molecules not retained by the membrane.
  • biomolecules of interest are found completely in the permeate.
  • the biomolecules of interest are found in the concentrate (in the cell compartments).
  • Their release is carried out by cell lysis (sonication) and their extraction is carried out by membrane filtration which consists in separating the lysate into a concentrate (composed mainly of cellular debris and molecules of high molecular weight) and a permeate which contains the molecule target and the set of substances that cross the membrane.
  • the first filtration allows on the one hand to reduce the costs of lysis (sonication) and on the other hand to remove a large part of the organic and mineral substances present from the broth of fermentation.
  • the membranes used during this extraction step do not have the significant separation power of the target biomolecules in order to reduce the losses in target product.
  • the concentration and the purification which follow the extraction can be carried out according to different membrane techniques which can partially or totally ensure the purification at the targeted level.
  • Diafiltration is a purification operation which consists, once the desired concentration level has been reached, of continuing filtration by adding concentrate of a diafiltration solution to the tank. This can be either demineralized water or a buffer solution.
  • the addition of the diafiltration solution can be continuous (at a rate equivalent to that of the permeate extracted) or batchwise (addition to the concentrate and extraction by the permeate of successive equal volumes).
  • the concentration of target molecule remains constant (the target molecule does not pass through the membrane and the volume of the concentrate does not change) and the compounds not retained by the membrane will continue to pass into the permeate. This therefore results in an increase in the degree of purity.
  • the purification must be optimized in order to use as few chemicals as possible. Among the membrane techniques used in this platform, we find microfiltration, ultrafiltration and nanofiltration.
  • the finished product must consist of purified and concentrated biomolecules.
  • the concentrate should contain microorganisms and nutrients in high concentrations.
  • the pH, temperature, agitation and dissolved oxygen are also optimized.
  • a culture medium comprising a suspension of microorganisms 5 is stored in a bioreactor 1. Nutrients are added to the suspension of microorganism 5 in the bioreactor through a conduit 3. An aerator 2 and an agitator 4 respectively provide aeration adapted to the microorganism and the homogeneity of the suspension of microorganisms 5.
  • a pump 7 ensures the transfer of a portion of the suspension of microorganism 5 into a transient tank 9 through a conduit 25.
  • a conduit 39 located at the lower end of the transient tank 9 and a pump 13 ensure the continuous transfer of the suspension to be purified to a primary filtration membrane 15.
  • the concentrate of microorganisms is conveyed to the transient tank 9 through a conduit 27 while the permeate is directed to a primary filtrate reservoir 17 through a conduit 29.
  • the primary filtrate 41 is conveyed by a conduit 35 and a pump 23 to a second filtration membrane 19.
  • the concentrate is conveyed to the primary filtrate reservoir 17 by a conduit 31 while the permeate is conveyed to the final solution reservoir 21 by a conduit 33.
  • the solution produced is composed of cells, various metabolites, nutrients not consumed, etc. Since GFP (target molecule) is endogenous, it is found inside cells.
  • the objective of membrane filtration aims to separate, concentrate and purify the target molecule (GFP). As shown in Fig. 3, the separation, concentration and purification process by membrane filtration is composed of the following steps:
  • Step 1 Concentration and separation of cells from the rest of the medium.
  • Step 2 Lysis of cells to release GFP from cell compartments.
  • Step 3 Separation of cellular debris and macromolecules.
  • Step 4 Concentration of GFP and purification by diafiltration.
  • the membrane filtration sequences to achieve separation, concentration and purification are reduced to two stages (Fig. 4).
  • the first consists in the separation of cells and molecules of high molecular weight.
  • the target molecule is in the permeate.
  • the second filtration step is a concentration of ⁇ -lactamase followed by a diafiltration to increase its purity.
  • the membranes used in the various filtration stages are ceramic membranes. This type of membranes is characterized by a high resistance to chemicals and to temperature and therefore they meet the requirements of bioprocesses (disinfection and sterilization).
  • the membrane used in the first filtration step is a microfiltration membrane with a pore size of 0.2 ⁇ m.
  • the separation of cellular debris and macromolecules (step 3) was carried out on a 300 kD membrane cut-off threshold (MWCO).
  • Concentration and purification (steps 4) were carried out on an ultrafiltration membrane with a cutoff threshold of 15kD. This membrane makes it possible to effectively concentrate (little loss) the target molecule and it lets through a large proportion of dissolved matter of low molecular weight.
  • the membranes used come from the company TAMI.
  • the membranes used have an outside diameter of 2.5 cm (23 channels) and a length of 1.1 m.
  • the filtering surface is 0.35 m.
  • the concentration of the cells by membrane filtration was carried out at an average pressure of 16 psi (or 110 kPa), at a feed rate of approximately 20 l / min and at a temperature of 7 ⁇ 1 ° C.
  • the separation of cellular debris was carried out at 6.2 psi (42 kPa), at a feed rate of 2 1 / min and at a temperature of 7 ⁇ 1 ° C.
  • GFP concentration and diafiltration were carried out at an average pressure of 7.5 psi (52 kPa), at a feed rate of 2 1 / min and at a temperature of 7 ⁇ 1 ° C.
  • the average pressure is calculated from the measurements of the pressure at the inlet and the outlet of the membrane module. All tests filtration were carried out at constant pressure. However, the filtration system used can be operated either at constant pressure (clogging results in a reduction in the permeate flow), or at constant permeate flow (in this case, the clogging effect is compensated by an increase in pressure).
  • Each membrane filtration operation included the following steps:
  • the lysis of the cells was carried out using a continuous sonication device.
  • the optimal sonication conditions adopted are: an intensity of 100% and. a residence time of 4 minutes. These conditions correspond to the best rate of lysis of the cells present in the concentrate without affecting the integrity of the target molecule (GFP).
  • the growth of the fermenting cells as well as the separation and the concentration of the cells by membrane filtration were determined from the optical density measurements at the wavelength of 600 nm made using a Pharmacia spectrophotometer. Biotech Novaspec II. The effectiveness of this rapid method of analysis has been validated by agar culture tests.
  • the determination of the cells in the microfiltration permeate (step 1) was carried out by culture on agar, due to the low values of optical density (OD at 600 nm) obtained.
  • the performance of membrane processes with regard to the separation, concentration and purification of GFP was determined by fluorescence measurements.
  • the device used is a luminotox TM from the company Lab-Bell TM.
  • the Rushton blades which have a higher shear factor than the propeller blades ensure a more homogeneous distribution of the air and consequently of the oxygen (the percentage of diffusion of oxygen is higher with the blades Rushton), the bubbles generated by this type of agitation are small and better distributed compared to the other types tested.
  • the diffusion of oxygen that results from the use of Rushton blades has resulted in faster growth kinetics than those obtained with propeller blades.
  • the mixed blades give intermediate growth kinetics, between those obtained with the Rushton blades and the propeller blades.
  • the aeration of the fermenter was ensured by a pump of Maxima R type.
  • the aeration rates which were tested are 2L / min, 3.5L / min and 6L / min.
  • the flow rate of 6 1 / min gave the best results translated into growth rate and quantity of ⁇ -Lactamase and of GFP produced continuously.
  • the production of ⁇ -Lactamase was substantially equivalent in the case of a flow rate of 3.5 and 61 / min.
  • the first stage of membrane filtration is microfiltration which consists in separating the cells from the rest of the solution. This filtration therefore produces a concentrate (mainly composed of cells) and a permeate, composed of all the substances not retained by the microfiltration membrane (buffer, nutrients, etc.). The target molecule, being endogenous, it is therefore at this stage of the operation inside the cells.
  • the membrane used in this filtration step is a ceramic membrane with a pore size of 0.2 ⁇ m.
  • the diafiltration volume was set at twice the volume of the concentrate (ie 30 liters). Table 1 summarizes the results of this operation.
  • the results (table 1) show that the concentration of the cells is complete, it corresponds to the concentration rate determined from the volumes (initial volume / volume of the concentrate).
  • the DO concentration at 600nm is lower, which indicates that part of the dissolved matter has been removed (approximately 20% of the DO at 600nm).
  • the removal of the TOC is 87%.
  • the OD at 600nm further decreases under the effect of the diafiltration, thereby improving the rate of removal of dissolved matter present in the cell concentrate (removal of 30% of the initial OD).
  • the filtration of the culture broth leads to a rapid drop in the permeate flow rate by more than 90% compared to the flow rate measured with demineralized water (including the effect of viscosity since the permeability to demineralized water was carried out at 25 ° C.). This rapid loss is followed by a slight gradual drop in the permeate flow under the effect of the concentration.
  • the permeate flow varied between 24 l / m 2 / h at the start of the concentration and around 17 l / m 2 / h at the end of the concentration.
  • the clogging is reversible in nature since rinsing with water made it possible to recover approximately 50% of the permeability of the membrane and washing with a sodium hypochlorite solution completely restored the initial permeability of the membrane.
  • step 2 Cell lysis by sonication
  • This step consists of a lysis of cells to release GFP (endogenous molecule) from cell compartments.
  • the process used to carry out cell lysis is sonication.
  • the sonication parameters (sonication intensity and time) have been optimized so as to obtain the best lysis yields while preserving the integrity of the target molecule (GFP).
  • the sonication was carried out on the cell concentrate produced in the first filtration (step 1) to which a resuspension buffer (PI buffer: Tris-HCl, 500mM, pH 8; EDTA lOOmM; Sodium azide ⁇ .2% (P / N)) is added.
  • the volume of the buffer represents 10% of the total volume of the solution.
  • the sonication performance results are summarized in Table 2.
  • the sonication conditions applied allowed the lysis of 83% of the cells.
  • the results show a release of a large quantity of proteins (measurement of proteins total) and an increase in organic carbon (part of the TOC is provided by the buffer) in the lysate. It should be noted that the TOC and total protein measurements were carried out after centrifugation of the samples at 14000 g for 20 minutes.
  • step 2 After the release of the target molecule from the cell compartments (step 2), the solution undergoes a second membrane filtration whose objective is to separate the cellular debris and the molecules of high molecular weight from the rest of the solution. This filtration therefore produces a concentrate, composed essentially of cellular debris, and a permeate containing the target molecule is the rest of the compounds of low molecular weights.
  • FIG. 3 shows the evolution of the permeate flow as a function of the concentration rate (initial volume / volume of the concentrate) during filtration.
  • the permeate flow is characterized by a rapid drop of more than 90% (including the viscosity effect due to the fact that the measurement of the permeability to demineralized water in summer performed at 25 ° C) after a few minutes of filtration (compared to that measured with demineralized water). Then there is a gradual decrease with the increase in the concentration rate which stabilizes around 41 / m 2 / h.
  • the permeability of the membrane was restored to its initial level by chemical washing (sodium hypochlorite solution).
  • This filtration step aims on the one hand to concentrate the GFP and on the other hand to increase the purity by diafiltration.
  • the objective of the concentration operation is to reduce the volume of the solution with a minimum loss of the target molecule (GFP).
  • the choice of the most suitable membrane for carrying out this operation corresponds to that which allows effective concentration of the target molecule (minimizing losses) and removal of the maximum impurity.
  • the results obtained are summarized in the table. We can note the efficiency of the membrane used to concentrate GFP (loss rate of about 7%). In addition, the membrane allowed the removal of 87% of the TOC present in the initial solution.
  • the evolution of the permeate flow as a function of the concentration rate is characterized by a rapid drop of approximately 84% (compared to the pemeat flow measured with demineralized water at the same pressure and at a temperature of 25 ° C) followed by a slight gradual decrease under the effect of concentration.
  • the permeate flow stabilizes around 31 / m 2 / h (pressure of 7.5 psi and a temperature of 7 ⁇ 1 ° C).
  • the purification by diafiltration is carried out on the same filtration system of step 4 (Fig. 1). Once the desired concentration rate is reached (step 4), we start filtration in diafiltration mode.
  • This consists of adding a buffer solution to the concentrate of the concentrate (TE: Tris-HCl, 10mM, pH8; EDTA, ImM; Sodium azide 0.02%).
  • TE Tris-HCl, 10mM, pH8; EDTA, ImM; Sodium azide 0.02%.
  • the objective of diafiltration is to increase the degree of purity of the target molecule (GFP) in the concentrate.
  • GFP target molecule
  • the role of the buffer is to preserve the integrity and stability of GFP.
  • Table 5 show the characteristics of the concentrate before and after diafiltration.
  • FIG. 9 shows the evolution of TOC and of total proteins in the concentrate as a function of the volume of diafiltration.
  • Microfiltration on a 0.2 ⁇ m porosity membrane makes it possible to concentrate all of the cells present in the fermentation broth and to considerably reduce the volume of the solution. It also leads to the removal of a significant part of the dissolved matter (20% of the DO at 600nm and 87% of the TOC). In addition, removal rates of dissolved material can be increased by diafiltration.
  • 300kD leads to the total removal of cellular debris (total elimination of the DO at 600nm). In addition, it retains 41% of total protein and 16% of TOC, compared to centrifugation at 14000g for 20 minutes.

Abstract

Un procédé et un dispositif permettant la production en continu de polypeptides natifs endogènes ou recombinants. Le procédé et le dispositif comprennent les étapes de faire croître des microorganismes recombinants dans un bioréacteur, prélever d'une façon continue une portion de la suspension microbienne dans le réacteur et la soumettre à une première filtration afin de séparer les biomolécules de la suspension microbienne et à une seconde filtration afin de séparer les biomolécules d'intérêt des autres biomolécules.

Description

PROCÉDÉ ET DISPOSITIF POUR LA PRODUCTION DE BIOMOLÉCULES EN CONTINU
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention se rapporte à un procédé et à un dispositif utilisé pour la production de biomolécules recombinantes. Particulièrement, ce procédé et ce dispositif permettent la production de biomolécules en continu, en utilisant des microorganismes en croissance dans un bioréacteur et un moyen de prélever en mode continu une quantité définie de suspension de microorganismes pour la soumettre, en continu, à des étapes de filtrations permettant l'obtention de biomolécules purifiées ou concentrées. TECHNIQUE ANTÉRDDURE
Les biotechnologies représentent un axe de recherche stratégique des plus importants. Les grandes compagnies de biotechnologies recensées produisent des bioréacteurs recombinants pour la production de biomolécules recombinantes ou naturelles à hautes valeurs ajoutées. Plusieurs compagnies concentrent leurs efforts sur la production en vrac de molécules biologiques (essentiellement protéiques) d'intérêt pharmaceutique, cosmétique ou médical. Les exemples de ces molécules sont nombreux : les anticorps monoclonaux, les HLA, les molécules P53 et les interférons (anti-cancérigène), l'insuline, les antibiotiques, etc. La liste des molécules s'allonge de jour en jour et leurs applications sont de plus en plus larges.
La majorité des compagnies de biotechnologies concentrent leur efforts de recherche dans la production de bioréacteurs transgéniques ou bien issus de processus de sélection comme les bactéries, les levures, les champignons, les plantes et les animaux. Toutefois, les efforts de recherche sont beaucoup plus restreints dans le domaine de l'extraction et de la purification des molécules naturelles ou recombinantes produites.
L'extraction et la purification des molécules représentent les principaux freins au développement de la majorité des technologies de production. En effet, les compagnies qui incluent dans leurs objectifs de recherche la production, l'extraction et la purification de molécules recombinantes se heurtent en plus des difficultés techniques, aux coûts extrêmement élevés reliés aux processus d'extraction et de purification chimique.
Afin de palier à ces inconvénients, certains chercheurs ont développé des modèles de production suivant d'autres approches, tels les animaux et les plantes transgéniques. Les modèles développés, comparativement aux bioréacteurs cellulaires, présentent des désavantages de plus en plus importants. En effet, la gestion de ces systèmes est problématique au vu des contraintes environnementales, de santé publique, d'image, en plus d'être extrêmement coûteuse. Il en résulte que, même si la plupart des compagnies ont développé des procédés pour produire des biomolécules à l'échelle du laboratoire, ils ne poussent cependant pas leur recherche à une échelle pilote, semi-industrielle ou industrielle car, les contraintes reliées aux coûts de production font que ces recherches ne dépassent pas la phase du laboratoire. L'objectif prioritaire qui est retenu dans la plupart des cas est de s'assurer de la production de la molécule cible à l'échelle cellulaire, puis à la valider. Le bioréacteur à membranes externes (BRM) a fait ses preuves dans des applications telles le traitement des eaux usées. Cependant, son utilisation dans les applications biotechnologiques est à ce jour pratiquement inexistante. Les premiers bioréacteurs avec membranes combinaient les capacités d'épuration des micro-organismes et les possibilités de séparation des techniques de filtration membranaire. Il est basé sur l'utilisation d'un bioréacteur à membranes où la décantation secondaire est remplacée par une microfiltration tangentielle. La filtration permet la rétention des particules en suspension dépendamment de leur taille. Le procédé a pour caractéristique d'être compact et modulaire.
La production en batch présente plusieurs désavantages comparativement à une production en mode continu. Les plus importants consistent dans les coûts d'opération qui sont plus onéreux comparativement à une production en mode continu, le rendement de production plus faible, des temps d'entretien et de préparation (monitoring) plus longs et par conséquent des temps d'utilisation plus courts. Ce dernier point se traduit par des coûts d'immobilisation plus importants. Enfin, le mode continu permet d'assurer une capacité de production plus grande que le mode batch. Dans le cas de cette plate-forme la capacité de production en continu optimisée est de plus de cinq (5) fois plus élevée que celle d'une production en mode batch.
Il serait donc avantageux de pouvoir bénéficier d'une méthode d'extraction et de purification de biomolécules recombinantes ou natives permettant la réduction des coûts inhérents à cette étape de la production de telles molécules. Dé même, il serait avantageux de pouvoir bénéficier d'une méthode permettant la production en continu de biomolécules de différents poids moléculaires, par culture de micro-organismes (bactéries, levures, moisissures) ou cellules végétales et cellules animales, exprimant des gènes d'intérêt provenant de différentes sources (végétaux, animaux, humaines, etc.).
RÉSUMÉ DE L'INVENTION Un premier objet de la présente invention consiste en un procédé pour la production en continu de biomolécules d'intérêt produites par des microorganismes. De façon générale, ce procédé comprend les étapes suivantes: a) faire croître des microorganismes exprimant les biomolécules recombinantes d'intérêt dans un bioréacteur; b) transférer une portion de la suspension de microorganismes producteurs et une fraction du milieu dans un récipient; c) séparer et concentrer la biomasse microbienne du milieu de culture issu de la biofermentation; dans le cas des molécules exogènes, les biomolécules recombinantes produites se retrouvent dans le perméat de la filtration; dans le cas des molécules endogènes, les biomolécules sont libérées par une lyse cellulaire (sonication). d) dans le cas des biomolécules sécrétées (exogène), la (ou les) séquence(s) de filtration membranaire consistent à séparer, concentrer et purifier les biomolécules recombinantes d'intérêt des substances et autres éléments nutritifs composant le milieu (acides aminés, acides organiques, éléments minéraux, etc.); dans le cas des molécules non sécrétées (endogène), les biomolécules d'intérêt sont libérées des compartiments cellulaires par une lyse (sonication) et les séquences de filtration membranaires, consistent dans une première étape à séparer les biomolécules d'intérêt du lysat cellulaires (débris cellulaires, protéines constitutives, etc.) et dans une seconde étape à séparer, concentrer et purifier les biomolécules d'intérêts du milieu restant (perméat de la première étape de filtration); et e) récolter les biomolécules d'intérêt.
L'invention concerne aussi un dispositif de production en continu de biomolécules microbiennes comprenant: a) un bioréacteur; b) une source de nutriments, et un moyen permettant d'introduire les dits nutriments dans le bioréacteur; c) un moyen d'aération du bioréacteur; d) un moyen d'agitation du bioréacteur; e) une première cuve transitoire et un moyen d'introduire la suspension de microorganisme producteur dans la dite cuve transitoire; f) un premier moyen de filtration et un moyen d'introduire la suspension de microorganismes dans le premier moyen de filtration à partir de la première cuve transitoire; g) un second réservoir pour la suspension de biomolécules et un moyen d'introduire la suspension de biomolécules dans le réservoir après une première filtration; h) un second moyen de filtration et un moyen d'introduire la suspension de biomolécules ayant subit une première filtration dans le second moyen de filtration à partir du second réservoir; et i) un troisième réservoir pour la suspension de biomolécules d'intérêt et un moyen pour introduire la solution de biomolécule d'intérêt dans le réservoir après la seconde filtration.
Un autre objet de la présente invention consiste en un procédé pour la production et n en continu de polypeptides cibles par un microorganisme comprenant les étapes de: a) permettre la croissance d'un microorganisme produisant au moins un polypeptide cible dans un bioréacteur alimenté en milieu de culture de manière autonome sur une période de temps prédéterminée; b) permettre à une portion du milieu de culture d'être transférée de manière autonome dans un premier récipient, de façon à ce que ce récipient favorise l'accumulation de volumes soutirés du bioréacteur en compensation des volumes de milieu frais ajoutés en continu, le récipient étant réfrigéré à 4°C pour permettre l'accumulation et le séjour d'un mélange de cellules et de bouillon de culture avant leur sonication, un second récipient réfrigéré de même capacité et nature que le premier récipient servant à la conservation à 4°C du mélange après la sonication; c) induire de manière autonome la séparation des polypeptides cibles de la portion du milieu de culture par au moins un passage dans au moins une première membrane, choisie (nature et seuil de coupure) selon les objectifs de filtration, les caractéristiques de la solution à filtrer et les critères d'opération, de préférence des membranes en céramique de microfiltration ou d'ultrafiltration; d) séparer les polypeptides cibles des molécules microbiennes par un passage à travers au moins une seconde membrane; et e) récolter les polypeptides cibles.
Ledit bioréacteur peut être un bioréacteur à membrane externe.
Les polypeptides cibles sont préférablement des protéines natives ou recombinantes et sont produite dans le milieu de culture ou de manière endogène, c'est-à-dire qu'elles sont accumulées, dans la cellule productrice. Elles peuvent être sélectionnées parmi enzymes, des protéines de transports, des protéines antioxydantes ou des protéines alimentaires.
Les microorganisme utilisables pour réaliser la présente invention peuvent être choisis parmi les groupe de bactéries, levures, moisissures, virus, un protozoaire, un champignon, ou encore une levure, une cellule végétale, une cellule animale, ou une cellule d'insecte.
La croissance des cellules productrice correspond préférablement, mais non limitativement, à un point à la fin de la phase de croissance logarithmique, avec unedensité optique (DO) de 1,8, à une concentration de 0,2 x 1010 cellules par millilitre, cette concentration cellulaire étant obtenue entre 7 et 8 heures après le début de la biofermentation et 2 heures après le départ des pompes prévues pour les transferts entre le bioréacteur et les premier et second récipients, la mise en marche des pompes d'ajout de milieu frais s'effectuant à un débit de 37 ml/min, pour le type de fermenteur utilisé, et de purge à un débit équivalent ayant été optimisée et le temps moyen de mise en fonction des pompes à été déterminé à 5h30 après le début de la fermentation, la DO étant égale à 1.5, la DO et la concentration cellulaire restant stable et constante (variabilité <10% calculée sur une base de 30 fermentations) durant toute l'étape de production en biofermenteur. Un dispositif de production en continu d'au moins un polypeptide cible comprenant:
- un bioréacteur
- une source de milieu de culture et substrats nutritifs, et un moyen permettant de les introduire dans le bioréacteur; - un moyen d'aération du bioréacteur;
- un moyen d'agitation du milieu de culture dans le bioréacteur;
- un premier réservoir destiné à la conservation stérile du milieu de culture et un moyen pour permettre son transfert de manière autonome et continu dans ledit bioréacteur; - au moins un premier moyen de filtration (microfiltration) et un moyen de séparer les cellules (biomasse) dans le concentrât du milieu de culture partiellement consommé (perméat) par un moyen de filtration (microfiltration) à partir du biofermenteur; un moyen faisant en sorte qu'après la séparation membranaire, le concentrât reste dans le premier le réservoir et le perméat est acheminé vers un second réservoir, ce second réservoir étant agencé pour former une suspension de polypeptide cible filtré;
- un moyen d'introduire la suspension de polypeptide cible filtré dans le second réservoir après une première filtration, le second réservoir permettant la collecte et le séjour du perméat en conditions stériles à une température de 4°C, ce perméat constituant la fraction qui contient la protéine cible lorsqu'elle est libérée dans le milieu de culture ou dans le compartiment cellulaire, cette dernière étant libérée après une lyse par sonication, la séparation s' effectuant après l'étape de la sonication, le polypeptide cible se retrouvant dans le perméat après une séparation par microfiltration; - au moins un second moyen de filtration (membrane céramique d'ultrafiltration) et un moyen d'introduire la suspension de polypeptide ayant subit une première filtration dans le second moyen de filtration à partir du second réservoir; et
- un moyen de récolte du polypeptide cible ayant subi au moins une première et une seconde filtration. . Ledit bioréacteur est préférablement, mais non limitativement, un bioréacteur à membrane externe, le premier moyen de filtration une membrane, membrane une membrane de céramique, le second moyen de filtration aussi une membrane, qui elle peut être alternativement ou cumulativement ou en combinaison une membrane à microfiltration, à ultrafiltration, à nanofiltration, à osmose inverse ou à dialyse.
BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES
Fig. 1 montre un schéma illustrant un dispositif de production de biomolécules recombinantes pouvant être utilisé pour la réalisation de la présente invention.
Fig. 2 illustre un dispositif de production de molécules recombinantes exprimées dans les compartiments intracellulaires de bactéries;
Fig 3 illustre un schéma de différentes étapes de filtration permettant la séparation, la concentration et la purification d'une molécule produite de manière endogène chez une bactérie; Fig. 4 illustre un exemple de schéma de différentes étapes de filtration permettant la séparation, la concentration et la purification d'une molécule sécrétée;
Fig. 5 illustre l'évolution du débit du perméat an fonction du taux de concentration durant la séparation des débris cellulaires;
Fig. 6 illustre l'évolution du débit du perméat en fonction du taux de concentration durant séparation de GFP; et
Fig. 7 illustre l'évolution des protéines totales et du COT dans le concentré durant la diafiltration.
DESCRD?TION DES RÉALISATIONS PRÉFÉRÉS En accord avec la présente invention, une plate-forme technologique de production, d'extraction et de purification de biomolécules protéiques, en mode continu est développée. Le procédé et le dispositif sont utilisés pour la production et la purification des molécules sécrétées par les cellules microbiennes et les molécules qui sont exprimées dans les différents compartiments cellulaires. Pour cette dernière catégorie de molécules, l'extraction et la purification peut requérir une étape supplémentaire de lyse du microorganisme, indépendamment du compartiment où la molécule est retrouvée dans la cellule.
La technologie utilisée est basée sur la production de microorganismes produisant les biomolécules d'intérêt et sur l'extraction/purification de ces biomolécules par filtration sur membranes. Ces deux technologies sont associées pour mettre au point une plate-forme technologique de production et d'extraction/purification.
Le système dé production/séparation de la présente invention est préférablement composé d'une série de séquences de procédés et de technologies permettant de produire, d'extraire et de purifier, en continu ou de manière ininterrompue, les molécules protéiques d'intérêt à l'aide d'un bioréacteur couplé aux technologies membranaires.
Les technologies membranaires qui incluent la microfiltration, l'ultrafiltration, la nanofiltration et l'osmose inverse, une fois la molécule produite et sécrétée dans le milieu, ont pour fonction de la séparer, l'extraire et de la purifier selon des paramètres désirés de pureté. La personne versée dans l'art comprendra que ces méthodes peuvent aussi être utilisées lorsque les microorganismes ont fait l'objet d'une lyse préalable.
Le système peut être utilisé pour la production en continu de biomolécules exogènes et/ou endogènes pour des applications diverses, biopesticides (bactéricides, fongicides, etc.), nutraceutiques et aliments fonctionnels (probiotiques), agro-alimentaire (aditifs, compléments alimentaires, enzymes, facilitateurs de la digestion, etc.) et pharmaceutiques.
À la différence des bioréacteurs à membranes utilisés dans le traitement des eaux usées, la présente invention ne présente pas de retour des bactéries dans le fermenteur (bioréacteur). De plus, le système de production revendiqué est en continu, alors que les systèmes utilisés dans le traitement des eaux usées sont arrêtés lorsque les boues arrivent à maturation, c'est-à-dire lorsque le traitement biologique est arrivé à terme. On parle alors dans ce cas d'une fermentation en mode discontinu. De plus, les souches microbiennes retrouvées dans le traitement des eaux usées sont hétérogènes alors que les systèmes biologiques utilisés pour la croissance et la production de biomolécules en continu sont des souches pures et, dans la majorité des cas, préférentiellement recombinantes. La continuité de la croissance et de la production est assurée par le couplage du bioréacteur et des membranes, ces dernières étant agencées soit en série, soit en parallèle, selon les besoins (système à géométrie variable). Les nutriments sont ajoutés en continu dans le bioréacteur et un volume équivalent de bouillon de culture est prélevé de façon synchrone pour être acheminé vers le système de filtration par membranes. La nature des molécules d'intérêt pouvant être produites par la méthode et le système de la présente invention sont essentiellement les molécules protéiques. Ces dernières peuvent être des protéines alimentaires ou celles dotés d'une activité biologique comme les enzymes (protéases, lipases, déshydrogénase, oxydase, etc.) ou des protéines de transport (hémoglobine, myoglobine, transférine) ou des antioxydants (cosmétiques). Les protéines recombinantes qui proviennent du secteur de l' agro-alimentaire offrent un très gros potentiel. Pour ce qui est de la production de biomolécules protéiques, un fermenteur unicellulaire est optimisé pour une production en continu des molécules protéiques. L'extraction s'effectue à l'aide d'un système membranaire afin de séparer les molécules des cellules productrices. La détermination des facteurs permettant le fonctionnement en continu du bioréacteur, son contrôle et son optimisation, sont basés sur les paramètres suivants : le pH, la température, la diffusion d'oxygène, les volumes de dilution, etc. La phase qui s'ensuit, en tenant compte du choix de la membrane effectué au préalable, permet d'extraire, de concentrer et de purifier la biomolécule produite.
Les molécules biologiques que le système peut produire sont les molécules sécrétées dans le milieu et les molécules non sécrétées. La séparation, la concentration et la purification des biomolécules sécrétées ne nécessitent pas d'étape de lyse cellulaire en continu, alors qu'une telle étape est requise pour le traitement des molécules non sécrétées.
Les principaux aspects à contrôler et à optimiser afin de maximiser le rendement des opérations sont les suivantes :
Les nutriments doivent être appropriés et en quantité adéquate pour maximiser la production de biomolécules;
Le bioréacteur doit contenir les micro-organismes qui produisent les biomolécules à extraire et purifier;
L'aération doit être optimisée en fonction du mode et du taux respiratoire des microorganismes; Le réacteur doit être équipé d'un système dont la forme à géométrie préférablement, mais non limitativement, cylindrique, a été optimisée en fonction du système de production à employer afin de fournir une agitation et une homogénéisation optimale du milieu et une bonne diffusion de l'oxygène dans celui-ci;
La pompe de pression peut être de différent type mais une pompe de type centrifuge donne les meilleurs résultats. Les membranes externes sont choisies en fonction de la biomolécule que l'on veut extraire.
La première séquence membranaire et ce, indépendamment du type de molécule produite, est une membrane choisie à un seuil de coupure qui permet de laisser passer la biomolécule, mais qui retient les cellules et autres composés de grandes tailles. La membrane utilisée est préférentiellement une membrane de céramique parce que ce sont des membranes très résistantes. En effet, on peut les stériliser facilement par voie thermique ou chimique. On peut les nettoyer facilement avec des produits chimiques ou par inversion de pression (envoi d'air ou d'eau). Ce sont des qualités qui ne se retrouvent pas chez les membranes organiques classiques. De plus, ces membranes sont autoclavables. Le seuil de coupure est strict. Une membrane céramique de seuil de coupure de un micron ne laissera passer aucune molécule de taille supérieure à un micron. À l'inverse, des membranes polymériques pourront laisser passer quelques particules de un micron. Cette notion est très importante lorsque l'on parle de rentabilité de l'extraction. Finalement, les membranes céramiques sont certifiées sécuritaires en agro-alimentaire, cosmétique, nutraceutique et sont de grade pharmaceutique.
La première filtration produit deux fractions: un concentré composé principalement de cellules et un perméat composé de l'ensemble des molécules non retenues par la membrane. Dans le cas de production de biomolécules sécrétées (exogènes) celles-ci se retrouvent totalement dans le perméat. Dans le cas des modèles endogènes, les biomolécules d'intérêt se retrouvent dans le concentré (dans les compartiments cellulaires). Leur libération est réalisée par une lyse cellulaire (sonication) et leur extraction s'effectue par filtration membranaire qui consiste à séparer le lysat en un concentré (composé principalement de débris cellulaires et de molécules de haut poids moléculaire) et un perméat qui contient la molécule cible et l'ensemble des substances qui traversent la membrane. Dans le cas du modèle endogène, la première filtration (concentration des cellules) permet d'une part de réduire les coûts de la lyse (sonication) et d'autre part d'enlever une grande partie des substances organiques et minérales présentes de le bouillon de fermentation. Dans les deux cas (exogène et endogène), les membranes utilisées durant cette étape d'extraction (séquence) n'ont pas le pouvoir de séparation significatif des biomolécules cibles et ce afin de réduire les pertes en produit cible. Dans les deux cas (molécules exogène et endogène), la concentration et la purification (par diafiltration) qui suivent l'extraction peuvent être réalisées selon différentes techniques membranaires qui peuvent assurer en partie ou totalement, la purification au niveau visé. La membrane appropriée aux opérations de concentration et de purification correspond à celle qui retient totalement la molécule cible (pour minimiser les pertes en produit cible) et qui laisse passer le maximum d'impuretés. La diafiltration est une opération de purification qui consiste, une fois le taux de concentration désiré atteint, à continuer la filtration en ajoutant dans le réservoir, du concentré d'une solution de diafiltration. Celle-ci peut être soit de l'eau déminéralisée ou une solution tampon. L'ajout de la solution de diafiltration peut être en continu (à un débit équivalent à celui du perméat extrait) ou en discontinu (ajout dans le concentré et extraction par le perméat de volumes égaux successifs). En mode diafiltration, la concentration de molécule cible reste constante (la molécule cible ne passe pas au travers la membrane et le volume du concentré ne change pas) et les composés non retenus par la membrane continueront à passer dans le perméat. Il en résulte donc une augmentation du degré de pureté. La purification doit être optimiser afin d'utiliser le moins de produits chimiques possibles. Parmi les techniques membranaires employées dans cette plate-forme, on retrouve la microfiltration, l'ultrafiltration et la nanofiltration.
Le produit fini doit être constitué de biomolécules purifiées et concentrées.
Le concentrât doit contenir des micro-organismes et des nutriments à de fortes concentrations. Le pH, la température, l'agitation et l'oxygène dissous sont aussi optimisés.
Référant maintenant aux Fig. 1 et 2, un milieu de culture comprenant une suspension de microorganismes 5 est emmagasiné dans un bioréacteur 1. Des nutriments sont ajoutés à la suspension de microorganisme 5 dans le bioréacteur par un conduit 3. Un aérateur 2 et un agitateur 4 assurent respectivement une aération adaptée au microorganisme et l'homogénéité de la suspension de microorganismes 5.
Une pompe 7 assure le transfert d'une portion de la suspension de microorganisme 5 dans une cuve transitoire 9 par un conduit 25. Un conduit 39 situé à l'extrémité inférieure de la cuve transitoire 9 et une pompe 13 assurent le transfert continu de la suspension à purifier vers une membrane de filtration primaire 15. Le concentrât de microorganismes est acheminé vers la cuve transitoire 9 par un conduit 27 alors que le perméat est dirigé vers un réservoir à filtrat primaire 17 par un conduit 29. Le filtrat primaire 41 est acheminé par un conduit 35 et une pompe 23 vers une seconde membrane de filtration 19. Le concentrât est acheminé vers le réservoir à filtrat primaire 17 par un conduit 31 alors que le perméat est acheminé vers le réservoir à solution finale 21 par un conduit 33.
Quelques-unes des caractéristiques du système et de la méthode de production/séparation de la présente invention seront illustrées dans l'exemple suivant. Toutefois, il sera reconnu que cet exemple n'est présenté qu'à titre complémentaire et n'a pas pour objet de limiter ou restreindre la portée de la présente invention.
EXEMPLE I Production, séparation, concentration et purification de la GFP
Pour la validation de cette plate-forme nous avons testé les modèles endogène et exogène de production de biomolécules par la bactérie E-coli. Le modèle de molécule exogène a été testé par la production de la β-lactamase. La production de la GFP a fait l'objet de la validation du modèle endogène. Les poids moléculaires de la GFP et de la β-lactamase sont respectivement d'environ 27KD et 29KD.
Fermentation en continu
Une optimisation de la fermentation en continu a été réalisée. Les paramètres de production, les volumes de dilution et de soutirage ont été optimisés ce qui a permis de limiter la variabilité des rendements à moins de 5%. Les résultats des rendements obtenus montrent qu'ils sont répétitifs d'une fermentation à l'autre et ce pour un nombre de fermentation supérieure à 30.
Séparation, concentration et purification par filtration membranaire
À la sortie du bioréacteur, la solution produite est composée de cellules, de diverses métabolites, des substances nutritives non consommées, etc. La GFP (molécule cible) étant endogène, elle se trouve à l'intérieur des cellules. L'objectif de la filtration membranaire vise à séparer, concentrer et purifier la molécule cible (la GFP). Comme montré sur la Fig. 3, le procédé de séparation, concentration et purification par filtration membranaire est composé des étapes suivantes:
Étape 1 : Concentration et séparation des cellules du reste du milieu. Étape 2 : Lyse des cellules pour libérer la GFP des compartiments cellulaires. Étape 3: Séparation des débris cellulaires et des macromolécules.
Étape 4: Concentration de la GFP et purification par diafiltration.
Dans le cas de la molécule exogène (la β-lactamase), les séquences de filtration membranaire pour réaliser la séparation, la concentration et la purification (diafiltration) sont réduites à deux étapes (Fig. 4). La première consiste en la séparation des cellules et des molécules de haut poids moléculaire. À la fin de cette étape, la molécule cible se trouve dans le perméat. La seconde étape de filtration est une concentration de la β-lactamase suivie d'une diafiltration pour augmenter sa pureté.
Matériel et méthodes Filtration membranaire
Les membranes utilisées dans les différentes étapes de filtration sont des membranes en céramique. Ce type de membranes est caractérisé par une forte résistance aux produits chimiques et à la température et par conséquent, elles répondent aux exigences des bioprocédés (désinfection et stérilisation). La membrane utilisée dans la première étape de filtration (séparation et concentration des cellules) est une membrane de microfiltration de taille de pores de 0.2μm. La séparation des débris cellulaires et des macromolécules (étape 3) a été réalisée sur membrane de 300kD de seuil de coupure (MWCO). La concentration et la purification (étapes 4) ont été réalisées sur une membrane d'ultrafiltration d'un seuil de coupure de 15kD. Cette membrane permet de concentrer efficacement (peu de perte) la molécule cible et elle laisse passer une grande proportion de matière dissoute de faible poids moléculaire. Les membranes utilisées proviennent de la compagnie TAMI. Les membranes utilisées ont un diamètre extérieur de 2.5 cm (23 canaux) et une longueur de 1.1 m. La surface filtrante est de 0.35 m .
Paramètres d'opération
La concentration des cellules par filtration membranaire a été réalisée à une pression moyenne de 16 psi (soit 110 kPa), à un débit d'alimentation d'environ 20 1/min et à une température de 7±1°C. La séparation des débris cellulaires a été réalisée à 6.2 psi (42 kPa), à un débit d'alimentation de 2 1/min et à une température de 7±1°C. La concentration de la GFP et la diafiltration ont été effectuées à une pression moyenne de 7.5 psi (52 kPa), à un débit de d'alimentation de 2 1/min et à une température de 7±1°C. La pression moyenne est calculée à partir des mesures de la pression à l'entrée et la sortie du module membranaire. Tous les essais de filtration ont été réalisés à pression constante. Cependant, le système de filtration utilisé peut être opéré soit à pression constante (le colmatage se traduit par une baisse du débit de perméat), soit à débit de perméat constant (dans ce cas, l'effet du colmatage est compensé par une augmentation de la pression). Déroulement d'une opération de filtration
Chaque opération de filtration sur membrane a comporté les étapes suivantes :
1. Mesure de la perméabilité de la membrane à l'eau déminéralisée. Cette mesure est une caractérisation de l'état de la membrane propre.
2. Filtration de la solution à traiter. Durant la filtration, le comportement de la membrane a été déterminé par des mesures du débit de production de perméat (évaluation du colmatage de la membrane). Des échantillons ont été prélevés pour suivre l'évolution des performances de séparation de la membrane.
3. Rinçage de la membrane à l'eau déminéralisée.
4. Mesure de la perméabilité à l'eau déminéralisée. Cette mesure permet d'évaluer le colmatage de la membrane.
5. Lavage chimique de la membrane.
6. Mesure de la perméabilité à l'eau déminéralisée. L'objet de cette mesure est d'évaluer l'efficacité du lavage à rétablir l'état initial de la membrane (évaluer par les mesures de perméabilité à l'eau déminéralisée). Lyse des cellules
La lyse des cellules a été réalisée à l'aide d'un dispositif de sonication en continue.
Après une étude d'optimisation, les conditions optimales de sonication retenues sont : une intensité de 100 % et. un temps de séjour de 4 minutes. Ces conditions correspondent au meilleur taux de lyse des cellules présentes dans le concentré sans affecter l'intégrité de la molécule cible (la GFP).
Méthodes d'analyses
La croissance des cellules en fermentation ainsi que la séparation et la concentration des cellules par filtration membranaire ont été déterminées à partir des mesures de la densité optique à la longueur d'onde de 600nm effectuées à l'aide d'un spectrophotomètre Pharmacia Biotech Novaspec II. L'efficacité de cette méthode rapide d'analyse a été validée par des essais de culture sur gélose. La détermination des cellules dans le perméat de microfiltration (étape 1) a été réalisée par culture sur gélose et ce, en raison des faibles valeurs de densité optique (DO à 600nm) obtenues. Les performances des procédés membranaires quant à la séparation, la concentration et la purification de la GFP ont été déterminées par des mesures de la fluorescence. L'appareil utilisé est un luminotox™ de la compagnie Lab-Bell™. L'efficacité de la diafiltration a été suivie par les mesures du carbone organique total (COT) à l'aide d'un appareil Shimadzu TOC 5000A et des protéines totales (selon la méthode Bradford en utilisant une courbe standard au BSA). Des analyses de différentes classes de protéines (Western-Blott en conditions dénaturantes) ont été réalisées à l'aide d'électrophorèses.
Résultats
Optimisation de l'agitation
Les résultats obtenus suite à l'optimisation de ce paramètre suggèrent que les pales de type Rushton engendrent une meilleure cinétique de croissance comparativement aux pales de type hélices ou hélice + Rushton. Comparativement aux pales Rushton, les pales en hélices présentent le désavantage d'engendrer une distribution hétérogène de l'air (oxygène) dans le fermenteur, les bulles sont de grandes tailles ce qui rend leur distribution dans le milieu peu homogène et par conséquent, la diffusion de l'oxygène s'est avérée faible dans leur cas. Par contre, les pales Rushton qui ont un facteur de cisaillement plus important que les pales en hélices assurent une distribution plus homogène de l'air et par conséquent de l'oxygène (le pourcentage de diffusion de l'oxygène est plus élevé avec les pales Rushton), les bulles générés par ce type d'agitation sont de petites tailles et mieux distribuées par rapport aux autres types testés. La diffusion de l'oxygène qui découle de l'emploi des pales Rushton s'est traduite par des cinétiques de croissance plus rapides que celles obtenues avec les pales en hélices. Les pales mixtes donnent des cinétiques de croissance intermédiaires, entre celles obtenues avec les pales Rushton et les pales en hélices.
De cette étude, il se dégage que les pales Rushton sont les plus appropriées pour la fermentation en continu avec la souche de E.coli recombinante utilisée comme bioreacteur. Détermination de la vitesse d'agitation Une gamme de vitesses d'agitation variant de 100 à 500 rpm a été testée. Les résultats
(Fig.5) obtenus suggèrent que la vitesse d'agitation comprise entre 300 et 400 rpm engendre la cinétique de croissance la plus rapide dans sa phase exponentielle. Par exemple, une vitesse 350 rpm donne une cinétique de croissance 20% plus rapide, durant la phase exponentielle, comparativement à la vitesse de 250 rpm. Dans les deux cas (250 et 350 rpm), la formation de mousse est équivalente. Le volume d' antimousse utilisé pendant les fermentations lorsque la vitesse d'agitation était de 350 rpm est de 10% supérieur au volume utilisé avec une agitation de 250 rpm.
Optimisation de l'aération
L'aération du fermenteur (bioflo 110 de 14 litres avec console de contrôle des paramètres physico-chimiques) a été assurée par une pompe de type Maxima R. Les débits d'aération qui ont été testés sont 2L/min, 3.5L/min et 6L/min. Le débit de 6 1/min a donné les meilleurs résultats traduits en vitesse de croissance et en quantité de la β-Lactamase et de GFP produit en continu. La production de la β-Lactamase a été sensiblement équivalente dans le cas d'un débit de 3.5 et de 61/min. D'un point de vu économique, la meilleure corrélation a été obtenue avec un débit de 6 L/min lorsqu'il est couplé à un volume de dilution dé 37 ml/min pour le cas d'une protéine libérée dans le milieu (β-Lactamase) ou endogène, la GFP. Dans ces deux cas avec ce débit, durant plusieurs fermentations (30), la DO obtenue était stable et constante pendant une durée de plus de six jours en continu (Fig.6). Concentration des cellules (étape 1)
La première étape de filtration sur membrane est une microfiltration qui consiste à séparer les cellules du reste de la solution. Cette filtration produit donc un concentré (composé principalement de cellules) et un perméat, composé de l'ensemble des substances non retenues par la membrane de microfiltration (tampon, substances nutritives, etc.). La molécule cible, étant endogène, elle se trouve donc à ce stade de l'opération à l'intérieur des cellules. La membrane utilisée dans cette étape de filtration est une membrane en céramique de taille de pores de 0.2μm. Une fois le taux de concentration désiré atteint, une diafiltration avec un tampon PBS (Na2HPO4, 8mM ; NaH2PO4, 2mM et NaCl, 0.14mM) est réalisée pour réduire la concentration des composés organiques et minéraux présents dans le concentré de cellules. Le volume de diafiltration a été fixé à deux fois le volume du concentré (soit 30 litres). Le table 1 résume les résultats de cette opération. Les résultats (table 1) montrent que la concentration des cellules est complète, elle correspond au taux de concentration déterminé à partir des volumes (volume initial/volume du concentré). Le taux de concentration de la DO à 600nm est plus faible ce qui indique un enlèvement d'une partie de la matière dissoute (environ 20% de la DO à 600nm). L'enlèvement du COT est de 87%. La DO à 600nm diminue encore sous l'effet de la diafiltration, améliorant ainsi le taux d'enlèvement de la matière dissoute présente dans le concentré de cellules (enlèvement de 30% de la DO initiale).
Pour ce qui est du colmatage de la membrane, la filtration du bouillon de culture conduit à une baisse rapide du débit de perméat de plus de 90% par rapport au débit mesuré à l'eau déminéralisée (incluant l'effet de la viscosité puisque la perméabilité à l'eau déminéralisée a été réalisée à 25°C). Cette perte rapide est suivie d'une faible baisse graduelle du débit de perméat sous l'effet de la concentration. Le débit de perméat a varié entre 24 l/m2/h au début de la concentration et environ 17 l/m2/h à la fin de la concentration. Le colmatage est de nature réversible puisque le rinçage à l'eau a permis de récupérer environ 50% de la perméabilité de la membrane et un lavage avec une solution d'hypochlorite de sodium a rétabli entièrement la perméabilité initiale de la membrane.
Tableau 1 Résultats de la concentration des cellules par filtration membranaire
Figure imgf000018_0001
0 DO à 600nm mesurée après diafiltration.
Lyse des cellules par sonication (étape 2)
Cette étape consiste en une lyse des cellules pour libérer la GFP (molécule endogène) des compartiments cellulaires. Le procédé retenu pour réaliser la lyse des cellules est la sonication. Les paramètres de sonication (intensité et temps de sonication) ont été optimisés de sorte à obtenir les meilleurs rendements de lyse tout en préservant l'intégrité de la molécule cible (la GFP). La sonication a été réalisée sur le concentré de cellules produit dans la première filtration (étape 1) auquel, un tampon de re-suspension (tampon PI : Tris-HCl, 500mM, pH 8 ; EDTA lOOmM ; Sodium azideθ.2% (P/N)) est ajouté. Le volume du tampon représente 10% du volume total de la solution. Les résultats des performances de la sonication sont résumés dans le tableau 2. Les conditions de sonication appliquées ont permis la lyse de 83% des cellules. Les résultats montrent une libération d'une importante quantité de protéines (mesure de protéines totales) et une augmentation du carbone organique (une partie du COT est apportée par le tampon) dans le lysat. Il est à noter que les mesures de COT et des protéines totales ont été effectuées après centrifugation des échantillons à 14000g pendant 20 minutes.
Tableau 2 Résultats de la lyse des cellules par sonication
Figure imgf000019_0001
(*) les protéines totales et la fluorescence sans débris et le carbone organique ont été mesurés après une centrifugation des échantillons à 14000g pendant 20min.
Séparation des débris cellulaires (étape 3
Après la libération de la molécule cible des compartiments cellulaires (étape 2), la solution subit une deuxième filtration par membrane dont l'objectif est de séparer les débris cellulaire et les molécules de haut poids moléculaire du reste de la solution. Cette filtration produit donc un concentré, composé essentiellement de débris cellulaires, et un perméat contenant la molécule cible est le reste des composés de faibles poids moléculaires. Les performances de cette étape du procédé sont résumées dans le tableau 3. La figure 3 montre l'évolution du débit de perméat en fonction du taux de concentration (volume initial/volume du concentré) durant la filtration.
Les résultats du tableau montrent que la membrane de 300 D de seuil de coupure permet un enlèvement total des débris cellulaires (mesure de DO à 600nm) et une réduction de la quantité de protéines totales et du COT de 41% et de 16% respectivement et ce comparativement à une centrifugation à 14000g pendant 20 minutes. La perte de GFP dans le concentré (estimé du bilan de matière calculé à partir des mesures de la fluorescence) est d'environ 15%. Cependant, un volume de diafiltration plus important permettrait de réduire le taux de perte de la GFP dans le concentré. En ce qui concerne le colmatage de la membrane (Fig.7), deux observations peuvent être faites : le débit de perméat est caractérisé par une baisse rapide de plus de 90% (incluant l'effet de viscosité du fait que la mesure de la perméabilité à l'eau déminéralisée à été réalisée à 25 °C) après quelques minutes de filtration (comparativement à celui mesuré avec de l'eau déminéralisée). Il y a ensuite une baisse graduelle avec l'augmentation du taux de concentration qui se stabilise autour de 41/m2/h. La perméabilité de la membrane a été rétablie à son niveau initial par un lavage chimique (solution d'hypochlorite de sodium).
Tableau 3 Séparation des débris cellulaires par filtration membranaire
Figure imgf000020_0001
(*) les protéines totales et la fluorescence sans débris et. le carbone organique ont été mesurés après une centrifugation des échantillons à 14000g pendant 20min. (**) pourcentage de perte de la fluorescence. 0 volume du perméat après diafiltration avec 1 litres d'eau déminéralisée.
Concentration de la molécule cible (la GFP') et diafiltration (étape 4) Cette étape de filtration vise d'une part à concentrer la GFP et d'autre part à augmenter la pureté par diafiltration. L'objectif de l'opération de concentration est de réduire le volume de la solution avec un minimum de perte de la molécule cible (la GFP). Le choix de la membrane la plus appropriée à la réalisation de cette opération correspond à celle qui permet de concentrer efficacement la molécule cible (minimiser les pertes) et l'enlèvement du maximum d'impureté. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau. On peut noter l'efficacité de la membrane utilisée à concentrer la GFP (taux de perte d'environ 7%). De plus la membrane a permis l'enlèvement de 87% du COT présent dans la solution initiale. Quant au colmatage de la membrane durant l'opération de concentration, l'évolution du débit de perméat en fonction du taux de concentration (Fig.8) est caractérisée par une baisse rapide d'environ 84% (comparativement au débit de peméat mesuré avec de l'eau déminéralisée à la même pression et à une température de 25°C) suivie d'une faible diminution graduelle sous l'effet de la concentration. Le débit du perméat se stabilise autour de 31/m2/h (pression de 7.5 psi et une température de 7±1°C). La purification par diafiltration est réalisée sur le même système de filtration de l'étape 4 (Fig. 1). Une fois que le taux de concentration désiré est atteint (étape 4), nous démarrons la filtration en mode diafiltration. Celle-ci consiste en l'ajout dans le réservoir du concentré d'une solution tampon (TE : Tris-HCl, lOmM, pH8; EDTA, ImM; Sodium azide 0.02%). L'objectif de la diafiltration est d'augmenter le degré de pureté de la molécule cible (la GFP) dans le concentré. En effet, en mode diafiltration, la concentration de la GFP reste constante (la molécule cible ne passe pas au travers la membrane) et les composés non retenus par la membrane continueront à passer dans le perméat. Il en résulte donc une augmentation du degré de pureté. Le rôle du tampon est de préserver l'intégrité et la stabilité de la GFP. Les résultats du tableau 5 montrent les caractéristiques du concentré avant et après diafiltration. La figure 9 montre l'évolution COT et des protéines totales dans le concentré en fonction du volume de diafiltration. On peut observer l'importante diminution du COT jusqu'au volume de diafiltration de 1.5 litres. La diafiltration n'a aucune efficacité quant à l'enlèvement des protéines totales (Fig.9). En effet, l'analyse sur gel a montré que la majorité des protéines totales qui passe à travers la membrane 300kD se situe entre 15 et 70kD (Fig.10) et par conséquent, leur concentration par la membrane 15kD est quasi-totale. En ce qui concerne le colmatage, la diafiltration n'occasionne aucune perte supplémentaire de la perméabilité de la membrane. En effet, le débit de perméat durant la diafiltration est resté stable et similaire à celui enregistré à la fin de l'étape de concentration (soit environ 31/m2/h). Comme pour les membranes 0.2μm et 300kD, la perméabilité initiale de la membrane a été rétablie par le lavage chimique (solution d'hypochlorite de sodium).
Tableau 4 Concentration de la molécule cible (GFP) par filtration membranaire
Figure imgf000021_0001
Tableau 5
Purification par diafiltration
Figure imgf000022_0001
La microfiltration sur une membrane 0.2μm de porosité permet de concentrer la totalité des cellules présentes dans le bouillon de fermentation et de réduire considérablement le volume de la solution. Elle conduit également à l'enlèvement d'une partie importante de la matière dissoute (20% de la DO à 600nm et 87% du COT). De plus, les taux d'enlèvement de la matière dissoute peuvent être augmentés par diafiltration.
En ce qui concerne la libération de la GFP des compartiments cellulaires, la sonication a permis d'atteindre un taux de lyse de 83%. Il est à noter qu'en plus de la libération de la GFP, il y a libération d'une quantité importante de protéines. La séparation des débris cellulaires sur une membrane d'un seuil de coupure de
300kD conduit à l'enlèvement total des débris cellulaires (élimination totale de la DO à 600nm). De plus, elle retient 41% des protéines totales et 16% du COT et ce comparativement à une centrifugation à 14000g pendant 20 minutes.

Claims

REVENDICATIONS:
1. Procédé pour la production et la séparation en continu de polypeptides cibles par un microorganisme comprenant lés étapes de: a) permettre la croissance d'un microorganisme produisant au moins un polypeptide cible dans un bioréacteur alimenté en milieu de culture de manière autonome sur une période de temps prédéterminée; b) permettre à une portion du milieu de culture d'être transférée de manière autonome dans un premier récipient, de façon à ce que ce récipient favorise l'accumulation de volumes soutirés du bioréacteur en compensation des volumes de milieu frais ajoutés en continu, le récipient étant réfrigéré à 4°C pour permettre l'accumulation et le séjour d'un mélange de cellules et de bouillon de culture avant leur sonication, un second récipient réfrigéré de même capacité et nature que le premier récipient servant à la conservation à 4°C du mélange après la sonication; c) induire de manière autonome la séparation des polypeptides cibles de la portion du milieu de culture par au moins un passage dans au moins une première membrane, choisie (nature et seuil de coupure) selon les objectifs de filtration, les caractéristiques de la solution à filtrer et les critères d'opération, de préférence des membranes en céramique de microfiltration ou d'ultrafiltration; d) séparer les polypeptides cibles des molécules microbiennes par. un passage à travers au moins une seconde membrane; et e) récolter les polypeptides cibles.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit bioréacteur est un bioréacteur à membrane externe.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits polypeptides cibles sont des protéines.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que lesdites protéines sont des enzymes, des protéines de transports, des protéines antioxydantes ou des protéines alimentaires.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit microorganisme est une bactérie, une levure, une moisissure, un virus, un protozoaire, ou un champignon.
6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits polypeptides cibles sont des polypeptides recombinants.
7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits polypeptides cibles sont des polypeptides (protéines recombinantes) endogènes audit microorganisme.
8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit microorganisme est remplacé par une levure, une cellule végétale, une cellule animale, ou une cellule d'insecte.
9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite croissance correspond à un point à la fin de la phase de croissance logarithmique, avec unedensité optique (DO) de 1,8, à une concentration de 0,2 x 1010 cellules par millilitre, cette concentration cellulaire étant obtenue entre 7 et 8 heures après le début de la biofermentation et 2 heures après le départ des pompes prévues pour les transferts entre le bioréacteur et les premier et second récipients, la mise en marche des pompes d'ajout de milieu frais s'effectuant à un débit de 37 ml/min, pour le type de fermenteur utilisé, et de purge à un débit équivalent ayant été optimisée et le temps moyen de mise en fonction des pompes à été déterminé à 5h30 après le début de la fermentation, la DO étant égale à 1.5, la DO et la concentration cellulaire restant stable et constante (variabilité <10% calculée sur une base de 30 fermentations) durant toute l'étape de production en biofermenteur.
10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite portion de milieu de culture de l'étape b) contient le polypeptide cible seul, ou le microorganisme contenant le polypeptide cible de manière endogène.
11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit milieu de culture contient les substrats nutritifs essentiel à la croissance dudit microorganisme.
12. Un dispositif de production en continu d'au moins un polypeptide cible comprenant:
- un bioréacteur
- une source de milieu de culture et substrats nutritifs, et un moyen permettant de les introduire dans le bioréacteur;
- un moyen d'aération du bioréacteur;
- un moyen d'agitation du milieu de culture dans le bioréacteur;
- un premier réservoir destiné à la conservation stérile du milieu de culture et un moyen pour permettre son transfert de manière autonome et continu dans ledit bioréacteur;
- au moins un premier moyen de filtration (microfiltration) et un moyen de séparer les cellules (biomasse) dans le concentrât du milieu de culture partiellement consommé (pennéat) par un moyen de filtration
(microfiltration) à partir du biofermenteur; un moyen faisant en sorte
** qu'après la séparation membranaire, le concentrât reste dans le premier le réservoir et le perméat est acheminé vers un second réservoir, ce second réservoir étant agencé pour former une suspension de polypeptide cible filtré;
- un moyen d'introduire la suspension de polypeptide cible filtré dans le second réservoir après une première filtration, le second réservoir permettant la collecte et le séjour du perméat en conditions stériles à une température de 4°C, ce perméat constituant la fraction qui contient la protéine cible lorsqu'elle est libérée dans le milieu de culture ou dans le compartiment cellulaire, cette dernière étant libérée après une lyse par sonication, la séparation s'effectuant après l'étape de la sonication, le polypeptide cible se retrouvant dans le perméat après une séparation par microfiltration;
- au moins un second moyen de filtration (membrane céramique d'ultrafiltration) et un moyen d'introduire la suspension de polypeptide ayant subit une première filtration dans le second moyen de filtration à partir du second réservoir; et - un moyen de récolte du polypeptide cible ayant subi au moins une première et une seconde filtration.
13. Dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce que le dit bioréacteur est un bioréacteur à membrane externe.
14. Dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce que le premier moyen de filtration est une membrane.
15. Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce que ladite membrane est une membrane de céramique.
16. Dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit second moyen de filtration est une membrane.
17. Dispositif selon la revendication 16, caractérisé en ce que ladite membrane est une membrane à microfiltration, à ultrafiltration, à nanofiltration, à osmose inverse ou à dialyse.
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