FR2731162A1

FR2731162A1 - Procede d'extraction d'au moins un actif a partir de cellules vegetales indifferenciees

Info

Publication number: FR2731162A1
Application number: FR9502379A
Authority: FR
Inventors: Lionel Breton; Richard Martin; Michel Hocquaux
Original assignee: LOreal SA
Current assignee: LOreal SA
Priority date: 1995-03-01
Filing date: 1995-03-01
Publication date: 1996-09-06
Anticipated expiration: 2015-03-01
Also published as: FR2731162B1

Abstract

L'invention concerne un procédé d'extraction, à partir de matériel végétal obtenu par culture in vitro, d'au moins un actif, caractérisé par le fait que dans une première étape on broie du matériel obtenu par culture in vitro dans une solution aqueuse à froid, dans une deuxième étape les particules en suspension sont éliminées de la solution aqueuse issue de la première étape, et que dans une troisième étape on stérilise la solution aqueuse issue de la deuxième étape.

Description

L'invention concerne un procédé d'extraction d'au moins un actif à partir de matériel végétal obtenu par culture in vitro.

Par actif, il faut entendre selon l'invention, toute substance, purifiée ou en solution, capable d'exercer, seule ou associée, une activité biologique, éventuellement mesurable par toute technique connue de l'homme du métier.

Depuis longtemps les végétaux sont considérés comme des sources potentielles d'actifs utilisables dans beaucoup de domaines comme par exemple la cosmétique ou la pharmacie.

L'art antérieur décrit de nombreuses méthodes qui permettent d'extraire de tels actifs à partir de matériel végétal.

Les différentes méthodes décrites font en général intervenir des solvants, dans lesquels par différentes techniques, souvent compliquées, on peut récupérer les actifs à partir de n'importe quel matériel végétal.

Parmi les solvants, on peut notamment citer les alcools, en particulier l'éthanol, utilisés généralement dans des solutions hydroalcooliques, le diméthylsulfoxyde (DMSO) en solution, I'acétone ou encore l'acétate d'éthyle, le méthanol, le dichlorométhane ou un mélange de ces composés.

Cependant, même si de nombreuses applications de ces diverses techniques sont connues, il est constant que les extraits ainsi obtenus présentent de nombreux inconvénients comme par exemple, pour les extraits hydroalcooliques, une incompatibilité avec les récepteurs biologiques rendant quasiment impossible toute fixation de l'actif contenu dans ces extraits à son récepteur.

On peut également citer les grandes difficultés qu'il y a à débarrasser l'extrait obtenu du solvant utilisé, ce qui dans certains cas n'est pas forcement compatible avec une utilisation dudit extrait en cosmétique ou en pharmacie.

Par ailleurs, il se trouve que certaines techniques d'extraction utilisées dans l'art antérieur aboutissent à une forme de l'extrait obtenu qui rend pratiquement impossible son utilisation. Parfois la forme de l'extrait obtenu est telle que les pertes de matériel sont tellement importantes que l'on arrive par conséquent à des produits dont le prix de revient est extrêmement élevé et donc incompatible avec une application industrielle économique. C'est le cas par exemple lorsque l'on utilise de l'acétone qui permet d'obtenir des poudres qui sont en général extrêmement difficiles à redissoudre.

Certaines techniques utilisées dans l'art antérieur conduisent à l'obtention d'actifs dénaturés, c'est à dire soit n'ayant pas leur structure tridimensionnelle traditionnelle essentielle à leur bonne activité, soit ayant perdu une partie de leurs éléments constitutifs, ce qui a généralement pour effet de détruire ou de réduire partiellement leur activité.

De plus, I'utilisation à grande échelle de solvants est une source non négligeable de pollution. Et de manière générale, les différents procédés connus de l'art antérieur sont longs et coûteux.

C'est pour pallier ces inconvénients que la demanderesse a cherché un nouveau procédé d'extraction conduisant à l'obtention d'actifs utilisables facilement, en particulier dans les domaines de la cosmétique ou de la pharmacie.

Ainsi, de manière surprenante et inattendue la demanderesse à pu montrer par de nombreuses expériences, qu'il est possible d'obtenir à partir de matériel végétal obtenu par culture in vitro, à l'aide d'un procédé nouveau, de manière simple et efficace, au moins un actif facilement utilisable.

L'invention concerne donc un nouveau procédé d'extraction à partir de matériel végétal obtenu par culture in vitro, d'au moins un actif, caractérisé par le fait que dans une première étape on broie le matériel végétal obtenu par culture in vitro dans une solution aqueuse à froid, dans une deuxième étape les particules en suspension sont éliminées de la solution aqueuse issue de la première étape, et que dans une troisième étape on stérilise la solution aqueuse issue de la deuxième étape.

Par matériel obtenu par culture in vitro, on entend des cellules indifférenciées, des embryons, des racines ou encore chevelu racinaire.

La pression de sélection imposée par les conditions physico chimiques lors de la croissance des cellules végétales in vitro permet d'obtenir un matériel végétal standardisé et disponible tout au long de l'année contrairement aux plantes cultivées.

De préférence le matériel végétal obtenu par culture in vitro est constitué de cellules indifférenciées.

Le procédé selon l'invention peut également comprendre une quatrième étape consistant en une étape de purification d'au moins un actif.

Le procédé selon l'invention permet donc l'obtention d'une solution aqueuse contenant au moins un actif ou éventuellement au moins un actif purifié à partir de la solution aqueuse ayant entre autres conservé son intégrité et sa compatibilité pour présenter une activité biologique.

La solution aqueuse contenant au moins un actif obtenue selon le procédé de l'invention ou l'actif éventuellement purifié à partir de la solution aqueuse obtenue selon le procédé de l'invention est utilisable directement sans autre forme de préparation, en particulier dans des tests d'affinité d'un actif pour un récepteur biologique.

La solution aqueuse contenant au moins un actif obtenue selon le procédé ou l'actif éventuellement purifié à partir de la solution aqueuse ainsi obtenue peut être utilisé pour la préparation de compositions cosmétiques ou de compositions pharmaceutiques.

Selon le procédé de l'invention, on broie dans une première étape le matériel végétal obtenu par culture in vitro dans une solution aqueuse froid.

Le terme culture in vitro recouvre l'ensemble des techniques connues de l'homme du métier qui permet de manière artificielle l'obtention d'un végétal ou d'une partie d'un végétal.

Le matériel végétal obtenu par culture in vitro utilisé selon le procédé de l'invention peut être obtenu par l'ensemencement dans un système de culture in vitro d'un explant isolé à partir d'une plante entière.

Selon l'invention, I'explant utilisé pour l'ensemencement du système de culture in vitro peut être au moins une feuille, une racine, une tige ou tout autre organe de la plante entière, ou au moins une partie de ceux-ci.

Selon l'invention, le matériel végétal obtenu par culture in vitro utilisé peut provenir de n'importe quelle plante. Cependant, on peut citer, à titre d'exemples, les plantes suivantes Ginkgo biloba, Medicago sativa,
Catharantus roseus. On utilise, de préférence, du matériel végétal obtenu par culture in vitro provenant de Ginkgo biloba.

II est bien entendu que le système de culture in vitro utilisé selon l'invention est un système connu, choisi parmi les différents systèmes dont on peut trouver la description dans l'un quelconque des nombreux ouvrages ou publications disponibles sur le sujet.

Par cellules végétales indifférenciées, on entend toute cellule végétale ne présentant aucun des caractères d'une spécialisation particulière et capable de vivre par elle-même et non en dépendance avec d'autres cellules. Ces cellules végétales indifférenciées sont éventuellement aptes, sous l'effet d'une induction, à toute différenciation conforme à son génome.

Selon la méthode de culture choisie, et en particulier selon le milieu de culture choisi, il est possible d'obtenir à partir d'un même explant des cellules végétales indifférenciées présentant des caractères différents. II est bien entendu que le procédé selon l'invention peut s'appliquer à toute sorte de cellules végétales indifférenciées quelques soit leur mode d'obtention.

On verra par la suite dans le texte un exemple de préparation de cellules végétales indifférenciées.

De préférence, le matériel végétal obtenu par culture in vitro utilisé dans le procédé selon l'invention est conservé par lyophilisation, congélation ou hypoxie. De manière avantageuse, le matériel est congelé, ce qui permet notamment de maintenir l'hydratation du matériel et d'avoir éventuellement un éclatement partiel de ce matériel facilitant l'étape de broyage qu'il va subir selon le procédé de la présente invention.

Le matériel végétal obtenu par culture in vitro, par facilité technique et pour rendre plus facile l'extraction de l'actif, est utilisé sous forme fractionnée.

Cette forme fractionnée est obtenue par broyage du matériel végétal obtenu par culture in vitro.

II est bien évident que pour obtenir cette forme on applique au matériel végétal obtenu par culture in vitro utilisé toute technique connue conduisant à ce broyage.

Le broyage sert à casser la paroi pecto-cellulosique des cellules présentes.

On peut citer à titre d'exemple le broyage à l'aide d'un Potter, d'un mortier, d'un sonicateur, d'un cryobroyeur, par la technique de cellulolysepectinolyse.

Préférentiellement, selon l'invention, on utilise un Potter pour broyer le matériel végétal obtenu par culture in vitro.

Le Potter utilisé peut avoir des dimensions allant de 150 à 250 zm.

La solution aqueuse dans laquelle on broie le matériel végétal obtenu par culture in vitro peut être de l'eau ou un tampon aqueux. De préférence on utilise de l'eau. Cette eau peut être naturelle, c'est à dire n'ayant subi aucun traitement, ou encore filtrée, distillée, ou osmosée.

Par eau osmosée, on entend l'eau ayant subi une osmose inverse.

De préférence, on utilise de l'eau osmosée.

Cependant, la nature même de l'actif que l'on cherche à isoler peut faire que l'extraction nécessite l'utilisation d'un tampon d'acidité etlou de dureté etlou de salinité.

Dans ce cas, le tampon utilisé est un tampon réalisé selon les méthodes classiques utilisées dans le domaine.

Avantageusement, ledit tampon peut être réalisé à partir de l'eau osmosée.

L'actif que l'on cherche à extraire est en général selon la définition donnée précédemment un matériel biologique. Sa manipulation nécessite donc que des précautions soient prises en particulier pour éviter une destruction due par exemple à la température ou aux protéases présentes dans l'extrait. C'est ainsi que l'étape de broyage réalisée dans la première étape du procédé selon l'invention s'effectue à froid et avantageusement à une température comprise entre 0 C et 10"C, et encore plus préférentiellement comprise entre 3"C. et 5"C..

A la fin de la première étape du procédé selon l'invention, on se trouve en présence d'un mélange constitué d'une solution aqueuse et de particules végétales de toute taille en suspension. Pour faciliter l'utilisation future de la solution aqueuse et donc de l'actif qu'elle contient, le procédé selon l'invention prévoit une étape d'élimination des particules en suspension de la solution aqueuse issue de la première étape. Cette étape a pour objet essentiel d'éliminer les particules de gros diamètre, c'est à dire les particules dont le diamètre sera supérieur à 5 lim., de préférence 2,5 clam.

Avantageusement, cette étape, pour les mêmes raisons que celles exposées plus avant, peut s'effectuer à froid et avantageusement à une température comprise entre 0 C et 10"C et préférentiellement entre 3"C et 5"C..

Toute méthode efficace permettant une séparation physique desdites particules en suspension et de la solution aqueuse peut être utilisée dans le procédé selon l'invention. On peut ainsi réaliser cette séparation par décantation, centrifugation ou filtration.

Préférentiellement, la séparation est réalisée par centrifugation ou filtration.

Afin de rendre l'extrait obtenu utilisable, sans risque dans des processus biologiques etlou d'en assurer une bonne conservation, le procédé selon l'invention prévoit une étape de stérilisation de l'extrait obtenu contenant au moins un actif. Cette stérilisation doit être réalisée par des méthodes douces n'altérant pas la nature de l'actif.

Ainsi, selon le procédé de l'invention, la solution aqueuse issue de la seconde étape est stérilisée.

Pour cela, on peut utiliser tout procédé connu en soi garantissant la préservation de l'actif.

Préférentiellement, selon l'invention, la solution aqueuse issue de la seconde étape est stérilisée par filtration
Cette filtration peut être effectuée au travers de tout support capable de générer des pores qui ont un diamètre compris entre 0,05 et 1 pm..

Préférentiellement, le support a des pores d'un diamètre compris entre 0,1 et 0,25 Crm..

Un tel support peut être constitué d'une membrane de nitrocellulose, d'acétate de cellulose, ou encore de fibre de verre, préalablement stérilisée.

Avantageusement, on utilise selon l'invention une membrane d'acétate de cellulose.

L'actif extrait selon le procédé de l'invention correspond selon la définition donnée à une substance capable d'exercer, seule ou associée, une activité biologique, éventuellement mesurable par toute technique connue de l'homme du métier.

Par activité biologique, il faut entendre, sans limitation et à titre d'exemple, aussi bien les activités pharmacologiques qu'une molécule peut présenter dans un système biologique, en particulier par la reconnaissance etlou la fixation à un récepteur biologique, que la modulation (activation etlou ralentissement) de l'activité ou de la stabilité d'éléments biologiques, comme des gènes, d'autres acides nucléiques, des enzymes.

Par récepteur biologique, on entend toute entité biologique apte à être reconnue, dans son entier ou partiellement, par un actif et apte à fixer de quelque manière que ce soit ledit actif, ladite fixation engendrant une activité biologique nouvelle ou modifiée. Pour illustrer, sans limitation, cette définition on peut citer les protéines membranaires, nucléaires ou cytosoliques, ou les acides nucléiques.

Un des avantages majeurs de l'invention est donc de procurer en trois étapes simples un extrait végétal contenant au moins un actif, directement utilisable soit dans les techniques d'évaluation de l'activité, soit dans la préparation d'actifs purifiés, soit encore dans la préparation de compositions.

II n'est pas nécessaire dans le procédé selon l'invention de réaliser des étapes de purifications successives de l'extrait etlou de l'actif, qui entraînent à l'évidence une augmentation du temps de préparation, des difficultés et des coûts de réalisation.

Cependant, dans le cas où l'on désire purifier au moins un actif, cette étape de purification d'au moins un actif à partir de l'extrait obtenu selon le procédé décrit précédemment peut être réalisée par toute méthode connue en soi. Plus particulièrement, cette étape de purification est réalisée par électrophorése, chromatographie, centrifugation ou précipitation sélective non dénaturante.

L'invention a donc également pour objet une solution aqueuse contenant au moins un actif susceptible d'être obtenue selon le procédé précédemment décrit.

L'invention a aussi pour objet une composition cosmétique ou pharmaceutique utilisant une solution aqueuse susceptible d'être obtenue selon le procédé de la présente invention ou au moins un actif obtenu à partir d'une solution aqueuse susceptible d'être obtenue selon le procédé de la présente invention.

L'activité de l'extrait végétal obtenu selon l'invention, donc de I' (ou des) actif qu'il contient, peut être mesurée par toute technique connue de l'homme du métier.

On peut citer à titre d'exemple la technique de fixation membranaire, qui permet de mesurer l'activité de l'extrait végétal obtenu selon l'invention, donc de l'actif qu'il contient, sur différents récepteurs impliqués dans des processus physiologiques.

On va maintenant donner à titre d'illustration des exemples d'extraction d'actif à partir de cellules végétales indifférenciées et de tests d'activité réalisés sur ces extraits.

Ces exemples ne sauraient limiter en aucune façon la portée de l'invention.

EXEMPLES
Exemple 1: Culture de cellules végétales indifférenciées:
Les techniques exposées ci-après sont des techniques parfaitement connues de l'homme du métier. Les détails se retrouvent sans aucune difficulté dans les ouvrages traitant de la question, comme par exemple Plant Tissue
Culture Manual, K Lindsey Ed., 1991-1995.

a/ Obtention de cellules végétales indifférenciées:
Des explants prélevés sur une plante entière (feuilles, racines, ...) sont stérilisés par un agent chimique non dénaturant (Hypochlorite de Ca ou de Na, HgCI2...). Ces explants sont ensuite lavés avec de l'eau stérile. En condition aseptique, ils sont alors découpés en fragments de quelques millimètres et déposés sur des milieux de culture gélosés. Les milieux de départ sont généralement choisis pour leur diversité tant en terme de facteurs trophiques qu'en terme de balance hormonale (auxines...). Ils sont alors placés à 26"C avec une photopériode de 12/12 Heures. Après 2 à 4 semaines, des cellules indifférenciées peuvent apparaître au niveau de la coupure des tissus. Ce sont les cals primaires. Ils sont alors transférés sur milieu neuf identique.L'opération se répète jusqu'à stabilisation des cellules indifférenciées.

b/ Passage en milieu liquide:
Les cellules indifférenciées stabilisées sont transférées en milieu identique liquide (sans Agar-Agar). On prélève 4 grammes en poids frais de ces cellules indifférenciées que l'on introduit dans un Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml de milieu stérilisé (115"C/20'). Ces Erlenmeyers sont alors agités sur agitateurs rotatifs à 100 tours par minutes à 26"C. Une phase d'adaptation des cellules est souvent nécessaire à ce stade. Lorsque les cellules sont stabilisées après plusieurs repiquages (régularité des amas cellulaires, homogénéité de couleur, de masse...), on peut les transférer en fermenteur (bioréacteur).

c/ Culture en fermenteur de 10 litres:
Le même milieu de culture que précédemment est placé en fermenteur de petite taille (10 litres) puis stérilisé (30 à 40 minutes à 121"C). Après stérilisation, on ajuste sa température à 26"C, on calibre sa sonde oxygène, le transfert de tissus est alors possible. II se réalise en conditions aseptiques. On l'inocule à 40 g poids frais par litre avec les tissus obtenus au point b. La culture est alors mise sous les contrôles suivants: agitation (Rushton 100 à 150 RPM), T": 26"C, pO2:15 % par action sur le taux d'aération (air stérile filtré). Le pH peut être surveillé. Au bout de 2 semaines, les cellules se sont multipliées et ont consommé le substrat carboné.On atteint alors une concentration de l'ordre de 450 g" en poids frais. Le rapport poids sec/poids frais est assez stable chez les cellules végétales et tourne aux environs de 5 %. On atteint donc environ 22 g/l de cellules poids exprimé en matière sèche.

d/ Passage en fermenteur de production:
Avec un fermenteur de 10 litres on peut inoculer un fermenteur de 100 litres préparé dans les mêmes conditions qu'au point c. Le matériel obtenu avec cette préparation de 100 litres après 2 semaines peut servir d'inoculum pour un fermenteur de 1000 litres et ainsi de suite.

e/ Récolte:
Les cellules sont récoltées sur une toile filtrante de 50 ou 100 lim. La taille supérieure à 100 zm des cellules permet de récupérer en fin de croissance la quasi totalité des cellules. Elles peuvent alors être congelées ou traitées immédiatement.

Exemple 2 : Préparation d'un extrait végétal à partir de cellules indifférenciées de Medicago Sativa:
15,5 grammes de cellules indifférenciées de Medicago Sativa (représentant environ 0,77 gramme de matière sèche), obtenues selon la technique développée à l'exemple 1, sont broyés à 4"C. dans 12,5 ml d'eau osmosée en utilisant un Potter de taille 150 à 250 clam. Le broyat est centrifugé dans une centrifugeuse (Sorval) à une force gravitationnelle de 10000 g, pendant 10 minutes, à la température de 4"C..

Le sumageant obtenu est ensuite filtré, en conditions stériles, sur filtre stérile Millipore (pores de 0,22 clam), pour assurer sa stérilisation.

Cette filtration s'effectue à la température de 4"C..

On obtient ainsi environ 10 ml d'un extrait limpide pouvant être utilisé directement dans toutes techniques destinées à mesurer son activité biologique ou à en extraire l'actif qu'il contient.

L'extrait ainsi obtenu peur être conservé par lyophilisation, congélation ou hypoxie. II peut également être utilisé directement pour toute expérimentation envisageable.

Cet extrait peut être en particulier utilisé dans les tests de fixation membranaire habituellement réalisés pour évaluer l'activité d'une substance vis à vis d'un (ou de plusieurs) récepteur biologique.

La préparation d'extraits végétaux à partir de cellules indifférenciées de
Catharanthus roseus et de Ginkgo biloba s'effectue exactement dans les mêmes conditions que celles exposées à l'exemple 2.

Exemple 3 . Comparaison de l'activité des extraits obtenus selon l'invention, avec des extraits réalisés selon des méthodes connues de l'art antérieur. Essais comparatifs des activités obtenues avec Medicago sativa et
Catharanthus roseus
L'activité pharmacologique des différents types d'extraits est évaluée dans une procédure de criblage qui utilise la technique de fixation membranaire.

Cette méthode permet de mesurer l'affinité des composés, présents dans les extraits, sur différents récepteurs impliqués dans des processus physiologiques.

La technique de fixation est réalisée sur différents tissus (préparation membranaire, cellules en suspension, coupes) reconnus comme possédant les récepteurs sélectionnés.

Après incubation et fixation réceptorielle d'un ligand sélectif radiomarqué, I'affinité des différents extraits se mesure en quantifiant leur capacité à se substituer au ligand naturel sur son site récepteur spécifique.

Dans la présente étude de comparaison des différents modes d'extraction, deux récepteurs ont été choisis: le récepteur H3 de l'histamine et le récepteur NK1 des neurokinines, fixant notamment la substance P.

Le détail des méthodologies utilisées pour ces études est décrit dans les publications suivantes:
Arrang, J.M et al, Eur.J.Pharmacol., 1990, 188, 219-217 et Heuillet, E. et ai, J.Neurochem. 1993, 60, 868-876.

Au cours des expérimentations, les différents extraits sont testés sur chaque récepteur à 2 concentrations (1 et 10% de leur concentration initiale).

Les mesures sont effectuées en double.

Lors de chaque expérience, la molécule de référence du récepteur étudié est parallèlement testée à 8 concentrations pour l'obtention d'une courbe de compétition permettant de valider cette expérience.

Les molécules de référence sont celles citées dans les publications de
J.M Arrang et E. Heuillet: pour le récepteur H3 de l'histamine, il s'agit de la (R) cr-méthyl-histamine et pour le récepteur NK; de la Substance P, il s'agit de [Sar9, Meut(02)1 1]- SP.

Les extractions comparatives sont réalisées dans les mêmes conditions à l'exception du solvant qui dans le cas du DMSO est utilisé en solution à 3 % (Volume/volume) dans l'eau, et pour l'méthanol à 30 % dans l'eau. Dans ce demier cas compte tenu de l'incompatibilité de l'éthanol à l'égard des récepteurs, on élimine l'alcool par distillation sous vide à basse température.

Résultats
La liaison spécifique du ligand radioactif sur chaque récepteur est donc calculée par la différence entre la liaison totale et la liaison non spécifique déterminée en présence d'un excès de ligand non radioactif.

Les résultats moyennés, exprimés en pourcentage d'inhibition de cette liaison, sont présentés dans le tableau 1
Les valeurs d'lCso (concentration inhibant de 50 % la liaison spécifique) et du coefficient de Hill (nH) sont calculées pour les molécules de référence à partir des courbes de compétition selon un modèle de régression non linéaire.

Ces paramètres sont obtenus par "curve-fitting" de l'équation de Hill à l'aide du logiciel Sigmaplot TM (Jandel).

Tableau 1
Pourcentages d'inhibition de liaison spécifique obtenus avec les différents extraits testés sur les récepteurs H3 et NK1 et valeurs d'lCso déterminées pour les molécules de références de ces récepteurs.

<tb>

<SEP> Récepteur <SEP> H3 <SEP> Récepteur <SEP> NK1 <SEP>
<tb> <SEP> Extraits <SEP> 1% <SEP> 10% <SEP> 1% <SEP> 10% <SEP>
<tb> <SEP> Extrait <SEP> aqueux <SEP> 59 <SEP> 92 <SEP> - <SEP> 35
<tb> <SEP> Medicago <SEP> Extrait <SEP> DMSO <SEP> 5 <SEP> % <SEP> 62 <SEP> 94 <SEP> - <SEP> 37
<tb> <SEP> sativa
<tb> <SEP> Extrait <SEP> éthanolique <SEP> 58 <SEP> 89 <SEP> - <SEP> 26
<tb> <SEP> Extrait <SEP> aqueux <SEP> - <SEP> 41 <SEP> - <SEP> 41
<tb> Catharanthus <SEP> Extrait <SEP> DMSO <SEP> 5 <SEP> % <SEP> 33 <SEP> - <SEP> 60
<tb> <SEP> roseus
<tb> <SEP> Extrait <SEP> éthanolique <SEP> - <SEP> 45 <SEP> - <SEP> 79
<tb> <SEP> IC50 <SEP> (nH) <SEP> IC50 <SEP> (nH)
<tb> <SEP> (nM) <SEP> (nM)
<tb> <SEP> (R) <SEP> a-MET-histamine <SEP> 3.2 <SEP> (o. <SEP> 90) <SEP>
<tb> <SEP> [sar9, <SEP> Met(O2)11]-SP <SEP> 4.0 <SEP> (0. <SEP> 78)
<tb>
Le signe - indique une inhibition inférieure à 10 %.

L'extrait éthanolique non lyophilisée et repris en H2O, n'a pas pu être étudié, car il n'est pas compatible avec ces systèmes d'évaluation biologique.

L'analyse des résultats met en évidence des activités de ces différents extraits sur les récepteurs étudiés.

Les résultats sont identiques (à l'intervalle de confiance près) quelque soit le mode d'extraction utilisée.

Les conclusions de ces travaux démontrent clairement que les activités présentes dans les extraits obtenus selon le procédé de l'invention sont au moins identiques à celles obtenues avec des procédures d'extraction complexes, comme celles par exemple utilisant l'éthanol à 30% ou le DMSO à 5 %.

Exemple4:
Etude de l'affinité d'un extrait de cellules indifférenciées de Ginkgo biloba pour les récepteurs H3 de l'histamine et pour le récepteur GABA-A.

L'extrait a été préparé selon le procédé de l'invention tel que décrit dans l'exemple 2.

Les dosages d'affinité ont été réalisés de façon identique à celle décrite dans l'exemple 3.

La fraction membranaire utilisée est une préparation membranaire de cortex cérébral.

Résultats:
L'extrait à montré de l'affinité pour les deux récepteurs.

Les valeurs d'lC50 sont, exprimées en % d'extrait de:
Récepteur H3 de l'histamine 0,21 %
Récepteur GABA-A 0,032 %
Ces activités ne sont pas retrouvées, dans les mêmes concentrations avec un extrait obtenu dans les mêmes conditions de préparation à partir de plante entière (cellules différenciées).

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé d'extraction, à partir de matériel végétal obtenu par culture in vitro, d'au moins un actif, caractérisé par le fait que dans une première étape on broie du matériel obtenu par culture in vitro dans une solution aqueuse à froid, dans une deuxième étape les particules en suspension sont éliminées de la solution aqueuse issue de la première étape, et que dans une troisième étape on stérilise la solution aqueuse issue de la deuxième étape.

2. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le matériel végétal obtenu par culture in vitro est constitué de cellules végétales indifférenciées.

3. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le matériel végétal obtenu par culture in vitro utilisé est conservé par lyophilisation, congélation ou hypoxie, de préférence par congélation.

4. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que le matériel végétal obtenu par culture in vitro résulte de l'ensemencement dans un système de culture in vitro d'un explant isolé à partir d'une plante entière.

5. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que l'explant est une feuille, une racine, une tige d'une plante entière, ou un morceau de ceux-ci.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le broyage du matériel végétal obtenu par culture in vitro s'effectue à l'aide d'un Potter, d'un mortier, d'un sonicateur, d'un cryobroyeur ou par la méthode de cellulolyse-pectinolyse.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la solution aqueuse dans laquelle on broie le matériel végétal obtenu par culture in vitro est de l'eau ou un tampon aqueux.

8. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que la solution aqueuse dans laquelle on broie le matériel végétal obtenu par culture in vitro est de l'eau.

9. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que l'eau est de l'eau osmosée.

10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que la solution aqueuse dans laquelle on broie le matériel végétal obtenu par culture in vitro est un tampon aqueux.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la température de l'étape de broyage du matériel végétal obtenu par culture in vitro est comprise entre 0 C et 10."C.

12. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que la température de l'étape de broyage du matériel végétal obtenu par culture in vitro est comprise entre 3"C et 5"C.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les particules en suspension qui sont éliminées dans la deuxième étape ont un diamètre supérieur à 5 clam, de préférence 2,5 clam..

14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les particules en suspension sont éliminées à froid.

15. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que les particules en suspension sont éliminées à une température comprise entre 0et100C.

16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les particules en suspension sont éliminées par décantation, par centrifugation ou par filtration.

17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la solution aqueuse issue de la deuxième étape est stérilisée par filtration.

18. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que la filtration est effectuée au travers d'un support dont les pores ont un diamètre compris entre 0,05 et 1 clam.

19. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que la filtration est effectuée au travers d'un support dont les pores ont un diamètre compris entre 0,1 et 0,25 clam.

20. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la filtration est effectuée à une température comprise entre 0 et 1 00C.

21. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, dans une quatrième étape, on procède à la purification d'au moins un actif extrait.

22. Solution aqueuse contenant au moins un actif susceptible d'être obtenue selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 20.

23. Composition cosmétique ou pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend une solution aqueuse susceptible d'être obtenue selon le procédé de l'une des revendications 1 à 20 ou au moins un actif obtenu selon le procédé de la revendication 21.