FR2767528A1 - Methode et materiaux immunologiques pour le dosage de la dihydropyrimidine deshydrogenase - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un anticorps monoclonal reconnaissant spécifiquement la dihydropyrimidine déshydrogénase (DPD), en particulier la DPD humaine.Ledit anticorps présente une forte réactivité vis-à-vis d'un homogénat provenant de la lignée de cellules tumorales humaine HT-3. L'invention porte également sur la lignée cellulaire d'hybridomes qui produit ledit anticorps ainsi qu'une trousse de détection pour la détermination de la quantité de dihydropyrimidine déshydrogénase dans un échantillon biologique.

Description

La présente invention concerne des matériaux et méthodes immunologiques

utiles pour le dosage do la dihydropyrimidine déshydrogénase (DPD) dans des

échantillons biologiques.

La dihydropyrimidine déshydrogénase (DPD) est connue pour être une enzyme qui catalyse la réduction de pyrimidines en S,6- dihydropyrimidines, o les catabolites résultants, le dihydrouracile et la dihydrothymidine, sont encore catabolisées en P- alanine

ou acide P-aminoisobutylique, respectivement.

La DPD est aussi connue pour catalyser les réactions réductrices de 5fluorouracile (5-FU) et divers catabolites à partir d'analogues et dérivés de pyrimidine, qui sont largement utilisés en tant que

médicaments antitumoraux, tels que la 2'-désoxy-5-

fluorouridine (2'-dFUrd), la 5'-désoxy-5-fluorouridine (5'-dFUrd, doxifluridine), et analogues. Il a été indiqué que le taux de DPD dans des échantillons biologiques d'individus souffrant d'une tumeur est un marqueur intéressant de l'efficacité thérapeutique de

médicaments antitumoraux de la série des dérivés de 5-

fluorouracile (voir par exemple Ligo et al., 1969,

Biochem. Pharmacol., 38, 1885-1889).

On sait qu'une déficience en DPD est responsable de la toxicité des métabolites de médicaments antitumoraux à base de pyrimidine, ce qui donne lieu à un état menaçant la vie du patient durant une chimiothérapie (Milano, G. et Etienne, 1988, M.C., Pharmacogenetics, 4, 301-306). On a récemment trouvé que le trouble de déficience en DPD est plus fréquent qu'on ne le pensait initialement (Diasio et Lu, 1994, J. Clin. Oncol., 12, 2239-2242). Il est donc important d'identifier les patients présentant une déficience en DPD. On a par conséquent besoin d'un dosage sensible et fiable pour déterminer la quantité de DPD dans des

échantillons biologiques.

Plusieurs méthodologies pour ces dosages ont été décrites. FernandezSalguero et al. ont indiqué un protocole de chromatographie sur couche mince (CCM) pour déterminer l'activité de DPD dans les lymphocytes périphériques humains (Fernandez-Salguero et al., 1995, Biochem. Pharm. 50, 1015-1020). Le dosage utilise comme substrat de l'uracile radiomarqué. Toutefois, une méthode utilisant un marqueur radioactif n'est évidemment pas adaptée à un diagnostic de routine dans les hôpitaux. Par ailleurs, une telle méthode par CCM

prend du temps.

D'autres méthodes de dosage utilisant une CLHP ont aussi été décrites, par exemple par van Gennip et al., 1982, Adv. Exp. Med. Biol., 253A: 111- 118, et

Sommadossi et al., 1982, J. Biol. Chem., 257: 8271-

8276. Ces méthodes se basent sur la mesure de l'activité enzymatique par la détermination de la somme de divers catabolites de 5-FU au moyen d'une CLHP à inversion de phases. Ces méthodes sont lourdes et

prennent du temps.

Le problème qu'aborde la présente invention est de trouver des matériaux et méthodes pour la détermination de la quantité de DPD, qui ne présentent pas les inconvénients des méthodes connues ci-dessus, et, en particulier, qui permettent un dosage simple et rapide

pour une utilisation de routine dans des hôpitaux.

Le problème ci-dessus est résolu par l'invention

telle qu'elle est définie dans les revendications

annexées. La présente invention propose un anticorps monoclonal reconnaissant spécifiquement la dihydropyrimidine déshydrogénase (DPD) et, en particulier, la dihydropyrimidine déshydrogénase

humaine.

L'anticorps monoclonal ci-dessus est, de façon convenable, un anticorps monoclonal qui présente une forte réactivité vis-à-vis d'un homogénat provenant de la lignée de cellules tumorales humaines HT-3 (ATCC HTB- 32), mais une faible réactivité ou pas de réactivité vis-à- vis d'un homogénat provenant de la

lignée de cellules tumorales humaines MCF-7 (ATCC HTB-

22). L'anticorps monoclonal ci-dessus est un anticorps

monoclonal qui présente une spécificité élevée vis-à-

vis de la DPD.

De façon convenable, l'immunoprécipité obtenu avec un homogénat provenant de la lignée de cellules tumorales humaines HT-3 (ATCC HTB-32) va présenter une

bande unique lors d'une analyse par SDS-PAGE.

L'anticorps monoclonal peut, de façon convenable, être produit par une lignée cellulaire d'hybridomes choisie dans le groupe constitué par les lignées cellulaires d'hybridomes 2B6-11-1, 9C7-30-1, 5E6-19-1,

3A5-6-1 (FERM BP-6015), 6HS-42-1, 4B9-12-1 (FERM BP-

6016), 2E2-B3-1-3 (FERM BP-6014) et 3B12-B1-56-1-2. De préférence, l'anticorps monoclonal est produit par une lignée cellulaire d'hybridomes choisie parmi 3A5-6-1

(FERM BP-6015), 4B9-12-1 (FERM BP-6016), 2E2-B3-1-3

(FERM BP-6014).

L'anticorps monoclonal peut aussi être n'importe quel anticorps monoclonal qui se fixe à la DPD d'une manière équivalente à celle d'un anticorps monoclonal produit par l'une des lignées cellulaires ci-dessus, c'est-à-dire un anticorps monoclonal qui se fixe au même épitope qu'un anticorps monoclonal produit par l'une des lignées cellulaires ci- dessus, ou qui réagit fortement par réaction croisée avec un anticorps monoclonal produit par l'une des lignées cellulaires ci-dessus. L'invention concerne aussi une lignée cellulaire d'hybridomes produisant l'anticorps monoclonal défini ci-dessus. Cette lignée cellulaire d'hybridomes est convenablement choisie dans le premier groupe ci- dessus de lignées cellulaires d'hybridomes spécifiques, et de préférence dans le deuxième groupe ci-dessus de lignées

cellulaires d'hybridomes spécifiques.

La présente invention concerne aussi une paire d'anticorps monoclonaux qui est utile pour la détection qualitative et/ou quantitative de DPD, dans laquelle la paire comprend un premier anticorps monoclonal reconnaissant spécifiquement la dihydropyrimidine déshydrogénase et un deuxième anticorps monoclonal reconnaissant spécifiquement la dihydropyrimidine déshydrogénase, dans laquelle le premier anticorps monoclonal et le deuxième anticorps monoclonal

reconnaissent des épitopes différents l'un de l'autre.

Une telle paire d'anticorps monoclonaux peut comprendre, en tant que premier anticorps monoclonal, un anticorps monoclonal choisi dans le groupe constitué par Mab-3A5-6-1, Mab-6HS-42-1 et Mab-3B12-Bl-56-12, et, en tant que deuxième anticorps monoclonal, un anticorps

monoclonal choisi dans le groupe constitué par Mab-4B9-

12-1, Mab-2E2-B3-1-3, Mab-9C7, Mab-2B6 et Mab-5E6-19-1.

De préférence, le premier anticorps monoclonal est Mab-3A5-6-1, et le deuxième anticorps monoclonal est

Mab-4B9-12 ou Mab-2E2-B3-1-3.

En outre, la présente invention concerne une trousse pour la détection et/ou la détermination de la quantité de dihydropyrimidine déshydrogdnase dans un échantillon biologique, qui comprend: (a) au moins un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, et (b) un marqueur pour détecter qualitativement et/ou quantitativement l'immunoconjugué de l'anticorps

monoclonal et de dihydropyrimidine déshydrogénase.

De préférence, cette trousse comprend une paire d'anticorps monoclonaux et un marqueur tels que définis ci-dessus. Selon un autre aspect, l'invention concerne un dosage immunologique pour détecter et/ou déterminer la quantité de dihydropyrimidine déshydrogénase dans un échantillon biologique, qui comprend: (a) le traitement de l'échantillon avec au moins un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, de façon à produire un immunoconjugué entre cet anticorps et la dihydropyrimidine déshydrogénase, et (b) la détection qualitative ou quantitative dudit

immunoconjugué à l'aide d'un marqueur.

Le dosage immunologique peut avoir n'importe quel format de dosage immunologique connu dans la technique des dosages immunologiques (voir par exemple M. Ferencik, 1993, dans "Handbook of Immunochemistry", publié par Chapman & Hall, Londres, Royaume-Uni). En particulier, il peut s'agir d'un dosage par fixation en un point, par exemple une méthode d'immunoprécipitation, ou un dosage par fixation en deux points (dosage en sandwich), par exemple un dosage ELISA. Un dosage par fixation en deux points utilise de préférence une paire d'anticorps monoclonaux, telle que

définie ci-dessus.

Préparation d'anticorps monoclonaux La méthodologie pour la production d'un anticorps monoclonal d'un antigène spécifique est bien connue dans la technique et est décrite, par exemple, par Harlow et al., 1988, Section 6 de "Antibodies: a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, New York, USA. On établit d'abord les lignées cellulaires d'hybridomes qui produisent des anticorps monoclonaux reconnaissant spécifiquement la DPD. A cette fin, on immunise un animal d'expérience par la protéine DPD ou

des fragments de celle-ci, servant d'antigènes.

L'animal d'expérience peut être d'une espèce quelconque possédant des cellules immunocompétentes telles que des lymphocytes et des splénocytes utilisables pour établir une lignée cellulaire d'hybridomes. Des espèces convenables sont par exemple les souris, les rats, les lapins et les chèvres. Les souris et les rats sont particulièrement commodes. L'antigène peut être la protéine DPD elle- même ou des fragments de celle-ci, y compris un mélange de tels fragments. La protéine DPD ou ses fragments servant d'antigènes peuvent être obtenus soit par isolement de la protéine à partir d'une source naturelle soit par production à l'aide d'une technologie de recombinaison. La protéine DPD peut être obtenue auprès d'une source naturelle, telle que des tissus hépatiques, de préférence humains, par la méthode d'isolement déjà indiquée, par exemple, par

Lu et al. dans J. Biol. Chem. 267, 17102-17105, 1992.

La technologie de recombinaison génétique offre un

moyen commode pour préparer des antigènes recombinés.

L'information de la séquence de nucléotides de la DPD humaine est disponible auprès de GenBank /EMBL Data Bank avec le numéro d'accès U09179 (voir Yokota, H., et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, pages 23192 à 23196). La séquence de nucléotides de la DPD humaine et la séquence d'acides aminés qui en est déduite sont indiquées dans la liste de séquences ci-dessous sous les dénominations de Séquence N 1 et Séquence N 2, respectivement. Sur la base de ces informations de séquences, on peut produire une protéine DPD recombinée ou un de ses fragments en utilisant un ADN synthétique ou un gène de DPD cloné A l'aide d'un système

d'expression conventionnel de gènes recombin6s.

Lorsqu'on souhaite un clonage, la stratégie de clonage peut être basée sur n'importe quelle méthode d'amplification d'acides nucléiques, par exemple par utilisation d'amplification en chaîne par polymérase (ACP), amplification en chaîne par ligase (ACL), amplification par transcription ou réplication de séquences auto- entretenue. L'amplification en chaîne par polymérase (ACP) est particulièrement fiable et commode. La stratégie de clonage par ACP peut donner la séquence de nucléotides complète du gène de DPD ou la séquence de nucléotides partielle de ce gène. Les exemples montrent qu'un fragment de DPD sous la forme d'une protéine de fusion avec une protéine GST est un

antigène efficace pour immuniser un animal.

La séquence d'acides aminés décrite dans la Séquence N 2 offre des informations utiles pour la synthèse chimique d'un ou de plusieurs fragments de DPD. Ces peptides synthétiques sont également utiles

comme antigènes pour la présente invention.

L'antigénicité des antigènes préparés par l'une des méthodes ci- dessus peut être estimée par

immunotransfert Western.

Par l'injection dudit antigène dans une souris, un rat, un mouton, un lapin ou analogue, les anticorps monoclonaux de la présente invention peuvent être préparés par récupération des cellules productrices d'anticorps à partir de cet animal immunisé et immortalisation desdites cellules. L'immunisation des animaux avec l'antigène ci-dessus peut être réalisée par des protocoles bien connus dans la technique, décrits, par exemple, par Harlow et al. dans la référence ci-dessus. L'immortalisation donne des lignées cellulaires d'hybridomes produisant des anticorps monoclonaux, et elle peut être effectuée d'une façon conventionnelle, telle qu'une fusion des cellules ci-dessus avec des cellules de myélome de souris. On dépiste les anticorps monoclonaux dans les surnageants de la culture de ces hybridomes par un protocole conventionnel tel que des dosages par fixation immunologique sur tache, comme un immunotransfert Western, ou des radioimmunodosages, des

dosages immunoenzymatiques ou analogues.

Les anticorps monoclonaux peuvent être purifiés à partir des surnageants d'hybridomes par des protocoles chromatographiques conventionnels, par exemple par chromatographie par échange d'ions, chromatographie par affinité sur protéine G ou protéine A, CLHP ou analogues. Pour la production de grandes quantités d'anticorps monoclonaux conformément à des méthodes bien connues dans la technique, des hybridomes sécrétant l'anticorps souhaité peuvent être injectés par voie intrapéritonéale à des souris qui ont été prétraitées au pristane avant injection. Jusqu'à environ 100 mg d'un anticorps monoclonal peuvent être produits par ces tumeurs d'ascite dans une souris. Les anticorps monoclonaux peuvent être purifiés par exemple à partir du fluide ascitique produit par ces tumeurs,

comme décrit dans l'Exemple 2.

Les anticorps monoclonaux peuvent être caractérisés en fonction de leur sous-classe par des méthodes connues telles que l'immunodiffusion d'ouchterlony, ou par utilisation d'une trousse de test disponible dans le commerce, telle que la trousse Mouse

Mono Ab-ID EIA Kit (Zymed, San Francisco, CA, USA).

Dans la présente invention, la sous-classe des anticorps monoclonaux particuliers provenant des lignées cellulaires d'hybridomes préparées dans l'Exemple 2 est déterminée comme étant respectivement

Mab-2B6-11-1 (IgGl, K), Mab-9C7-30-1 (IgG1, K), Mab-

E6-19-1 (IgG3, K), Mab-3AS-6-1 (MgM, K), Mab-6HS-42-1

(IgM, K).

Les lignées cellulaires d'hybridomes selon l'invention portant les désignations 4B9-12-1, 3A5-6-1 et 2E2-B3-1-3 sont particulièrement utiles pour la production des anticorps monoclonaux de la présente invention, en particulier pour des dosages par fixation à sites multiples. Ces lignées cellulaires ont été déposées au National Institute of Bioscience and Human Technology (HIBHT) au Japon le 8 juillet 1997, conformément au Traité de Budapest, avec les numéros d'accès suivants: FERM BP-6014 pour 2E2-B3-1-3, FERM

BP-6015 pour 3A5-6-1 et FERM BP-6016 pour 4B9-12-1.

Les anticorps monoclonaux de la présente invention peuvent être utilisés pour la purification par immunoaffinité de DPD. Ces anticorps peuvent, à cette fin, être liés à des supports solides par des méthodes bien connues dans la technique, par exemple par fixation covalente à de la gélose activée au CNB, telle

que la Sepharose, ou analogue.

En outre, les anticorps monoclonaux de la présente invention peuvent aussi être utilisés comme des outils diagnostiques pour la détermination de la quantité de DPD dans des échantillons biologiques qui peuvent être des tissus tumoraux de patients humains. Pour un tel usage, les anticorps monoclonaux peuvent être couplés à un colorant fluorescent, à une substance produisant une couleur, telle qu'une enzyme (méthode immunoenzymatique, ELISA), ou à un marqueur classiquement utilisé dans la technique, tel que la biotine. Dans le but d'étudier les performances du format de dosage pouvant être réalisé par l'utilisation d'anticorps monoclonaux de la présente invention, on peut utiliser le dosage conventionnel suivant, qui

utilise un radio-isotope.

Méthode de dosage de l'activité enzvmaticue de la DPD On peut déterminer l'activité enzymatique de la DPD en mesurant la somme des catabolites de 5-FU,

c'est-à-dire le dihydrofluorouracile, le a-fluoro-p-

uréidopropionate, et la a-fluoro-p-alanine, formés à partir de [6-"C]5FU. En pratique, on peut appliquer

au dosage ci-dessus le protocole suivant.

Le mélange réactionnel standard contient du phosphate de potassium 10 mM (pH 8,0), de 1'EDTA 0,5 mM, du 2-mercaptoéthanol 0,5 mM, du dithiothréitol 1 mM, du MgCl, 2,5 mM, du NADPH 250 pM, du [6-"4C]5-FU 25 pM (56 mCi/mmol), et 25 p1 d'enzyme brute (concentration finale de protéines: 1 mg/ml) dans un volume total de 50 pi. On fait réagir à 370C pendant 30 minutes et ensuite on stoppe la réaction en immergeant les tubes réactionnels (tubes Eppendorf de 0,5 ml) dans un bain d'eau bouillante pendant 30 minutes). On congèle les tubes réactionnels à -20 C pendant au moins

minutes avant d'entreprendre d'autres manipulations.

On élimine les protéines par centrifugation, puis on dépose 10 p1 du fluide surnageant sous forme de taches sur des feuilles pour CCM sur gel de silice (MERCK 5735) qui avaient été tachées au préalable avec 5 p1 de mélange de marqueurs identifiés, constitué de 5-FU mM, de dihydrouracile 50 mM, de P-uréidopropionate mM, de a-fluoro-p-alanine 10 mM, et d'urée 50 mM. On développe les taches dans un système solvant constitué lZ d'un mélange 65/23/12 en volume d'acétate d'éthyle/isopropanol/HO. On identifie par les méthodes de Naguib et al., 1985, Cancer Res. 45, 5405, ces marqueurs développés. On peut détecter la radioactivité S des taches identifiées comme étant les catabolites de -FU au moyen du dispositif BAS 1000 System (Fuji Film). L'activité de DPD est exprimée en pmol de 5-FU

converties/mg de protéine/minute.

Dosaqe immunoenzvrnatiaue par la méthode ELISA Comme application caractéristique des anticorps monoclonaux de la présente invention dans des dosages immunologiques quantitatifs, on envisage une méthode de fixation en un point et une méthode de fixation en deux points (appelée aussi dosage en sandwich). On peut généralement dire que les méthodes de fixation en deux points sont avantageuses pour l'obtention d'une meilleure précision et d'une meilleure sensibilité. Un dosage ELISA utilisant une paire d'anticorps monoclonaux, telle que définie ci-dessus, s'est avéré être un format de dosage sensible et rapide (voir

l'Exemple 3).

On peut réaliser ce dosage ELISA en immobilisant l'un des anticorps sur un support solide, en soumettant l'anticorps ainsi immobilisé à un contact avec un échantillon suspecté de contenir de la DPD pour former un conjugué DPD-anticorps, en faisant réagir ce conjugué avec l'autre anticorps monoclonal pour former

un conjugué à DPD en sandwich, c'est-à-dire anticorps-

DPD-anticorps, et en marquant ce dernier conjugué, par exemple avec de l'anticorps immunoglobuline anti-souris de rat marqué à la peroxydase de raifort (HRP), pour détecter le conjugué. Dans le cas o on utilise le marqueur HRP, on peut réaliser la détection par une réaction de coloration utilisant, par exemple, un système de trousse à la peroxydase en micropuits de TMB (KPL) qui contient du TMB et H202 comme substrat développant une couleur dans la réaction enzymatique catalysée par la HRP. Comme marqueur pour la détection, l'anticorps immunoglobuline anti-souris de rat peut avoir un marqueur conventionnel quelconque, tel que la biotine, une enzyme, un radio-isotope et analogue. D'une autre façon, l'anticorps monoclonal en phase mobile peut être marqué avec la HRP, la biotine, un

radio-isotope, des particules de latex et analogues.

Comme le montre l'Exemple 3, on peut obtenir une sensibilité élevée du dosage ELISA en utilisant la paire définie ci-dessus d'anticorps monoclonaux. Cette sensibilité élevée rend le dosage utile pour déterminer la quantité de DPD dans des échantillons biologiques provenant d'un corps humain, même dans le cas d'une faible proportion de DPD, comme dans la condition

décrite plus haut de déficience en DPD.

Immunoprécipitation Les anticorps monoclonaux selon l'invention sont également utiles pour l'isolement et la détermination de la protéine DPD par une méthode d'immunoprécipitation. La méthodologie de l'immunoprécipitation elle-même est bien connue dans la technique. L'utilisation d'un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus permet la séparation spécifique de l'antigène cible (DPD) à partir d'un échantillon complexe du fait de la spécificité de fixation élevée

de cet anticorps monoclonal.

L'un des agents de précipitation caractéristiques que l'on peut utiliser est la protéine G-Sepharose 4B, dans laquelle la protéine G capable de se fixer à la région Fc d'immunoglobuline de souris est immobilisée sur la surface de perles de Sepharose 4B. Cet agent forme un complexe DPDanticorps-protéine G-perles de Sepharose lorsque la DPD est présente, et le complexe peut être séparé par centrifugation. A partir du précipité recueilli du complexe, l'antigène (DPD) et l'anticorps peuvent être dissociés dans des conditions

acides, par exemple dans du tampon glycine-HCl, pH 3,0.

La DPD ainsi séparée peut facilement être isolée de l'immunoglobuline à l'aide d'une filtration sur gel. Ce complexe auquel est liée de la DPD est utile non seulement pour l'isolement de cette enzyme, mais aussi pour la quantification de l'enzyme. Ainsi, les anticorps monoclonaux de la présente invention sont des outils puissants pour l'isolement et la détermination de DPD à partir d'échantillons biologiques complexes,

comme le montre l'Exemple 6 ci-dessous.

Dosaqe par capture d'anticorps Les anticorps monoclonaux de la présente invention sont également utiles dans le dosage par capture d'anticorps. Dans ce format de dosage, l'anticorps monoclonal est immobilisé sur les surfaces d'un récipient approprié, tel que les puits d'une plaque de microtitrage. L'immobilisation est réalisée par un procédé classique connu dans la technique. Quand un échantillon contenant de la DPD est ajouté à ces puits, le peptide de DPD est capturé par l'anticorps monoclonal immobilisé de la présente invention. Après lavage des puits, on ajoute une solution contenant le substrat de DPD. Ainsi, le système de détection de produit enzymatique va offrir un moyen de détermination de l'activité de DPD. Ce format de dosage sera utile pour déterminer si l'action enzymatique de la DPD capturée est ou non intacte, puisque les patients présentant des défauts génétiques sur le gène de DPD peuvent avoir des protéines de DPD mutées qui manquent

d'activité enzymatique.

En variante, après capture de la DPD par l'anticorps monoclonal immobilisé, on lave cet immunocomplexe et ensuite on élue le polypeptide de DPD au moyen d'une solution tampon appropriée, par exemple dans des conditions acides. Cette manipulation donne

aussi une préparation de DPD purifiée.

Méthodes cliniques utilisant des anticorps monoclonaux selon l'invention Selon un autre aspect, l'invention concerne une méthode pour la détermination de l'état de déficience en DPD chez un patient, qui comprend: (a) le traitement d'un échantillon biologique provenant du

patient avec un anticorps monoclonal tel que défini ci-

dessus, et (b) la détection quantitative de l'immunoconjugué de l'anticorps monoclonal et de la

dihydropyrimidine déshydrogénase.

Selon un autre aspect, l'invention concerne une méthode pour estimer la sensibilité de patients atteints d'un cancer au traitement avec des médicaments antitumoraux de la série des dérivés du 5-fluorouracile (5FU), qui comprend: (a) le traitement d'un échantillon biologique provenant du patient avec un anticorps monoclonal tel que défini ci- dessus, (b) la détection quantitative de l'immunoconjugué de l'anticorps monoclonal et de la dihydropyrimidine déshydrogénase, de façon à déterminer la quantité de dihydropyrimidine déshydrogénase dans 1 'échantillon biologique provenant du patient afin d'obtenir une

mesure de sensibilité.

La méthode ci-dessus permet au médecin, par comparaison de la quantité mesurée de DPD pour un patient à celle d'un jeu de patients de référence, de

prévoir l'efficacité des médicaments ci-dessus.

Selon un autre aspect, l'invention concerne une méthode pour estimer la sensibilité de patients atteints d'un cancer au traitement avec des médicaments antitumoraux de la série des dérivés du 5-fluorouracile (5FU), qui comprend: (a) le traitement d'un échantillon biologique provenant du patient avec un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, (b) la détection quantitative de l'immunoconjugué de l'anticorps monoclonal et de la dihydropyrimidine déshydrogénase, de façon à déterminer la quantité de dihydropyrimidine déshydrogénase dans l'échantillon biologique provenant du patient, (c) la détermination de la quantité de pyrimidine nucléoside phosphorylase dans ledit échantillon biologique provenant dudit patient, et (d) le calcul du rapport entre la quantité de pyrimidine nucléoside phosphorylase et la quantité de dihydropyrimidine déshydrogénase pour obtenir une

mesure de sensibilité.

La méthode ci-dessus permet au médecin, par comparaison de ce rapport calculé entre la quantité de pyrimidine nucléoside phosphorylase et la quantité de dihydropyrimidine déshydrogénase pour un patient avec celui d'un jeu de patients de référence, de prévoir

l'efficacité des médicaments ci-dessus.

Abréviations Les abréviations suivantes seront souvent

utilisées ci-dessous.

DPD dihydropyrimidine déshydrogénase PyNPasepyrimidine nucléoside phosphorylase GST glutathion S-transférase IPTG isopropyl-D-Dthiogalactopyranoside KLH hémocyanine de patelle -FU 5- fluorouracile CFA Adjuvant complet de Freund IFA Adjuvant incomplet de Freund EIA Dosage immunoenzymatique ELISA Dosage immunoenzymatique par la méthode ELISA CCM Chromatographie sur couche mince STP Solution salée tamponnée au phosphate ACP Amplification en chaîne par polymérase TMB Tétraméthylbenzidine

(la trousse de TMB contient de la 3,3',5,5'-

tétramdthylbenzidine et du H:O) STT Solution tamponnée au Tris (Tris 20 mM/NaCl 50 mM, pH 7,4) STTT STT contenant 0,05 % de TWEEN -20 La présente invention va être davantage illustrée

par les exemples suivants. La description suivante sera

mieux comprise en référence aux Figures 1, 2, 3, 4, 5,

6-1 et 6-2 qui suivent.

La Figure 1 illustre la confirmation de l'antigénicité des protéines de fusion GST-DPD recombinées produites dans l'Exemple 1 par immunotransfert Western avec l'anticorps anti- peptide 2 de DPD. Sur la Figure 1, la ligne 1 est un marqueur de

poids moléculaire, la ligne 2 est la protéine GST elle-

même, la ligne 3 est la protéine de fusion GST-DPD.

La Figure 2 illustre le schéma de l'immunotransfert Western des anticorps monoclonaux de la présente invention contre des homogénats de tissu humain contenant de la DPD. Sur cette figure, la ligne 1 concerne le marqueur de poids moléculaire; la ligne 2 concerne la DPD recombinée (rDPD); la ligne 3 concerne un homogénat de xénogreffe d'une lignée de cellules tumorales humaine, HT-3; et les lignes 4, 5 et 6 concernent respectivement les différents

homogénats de carcinome du poumon humain.

La Figure 3 illustre une courbe d'étalonnage obtenue par la méthode ELISA selon l'invention, qui est décrite dans l'Exemple 3. Sur cette figure, l'axe horizontal concerne le logarithme de l'activité de HT-3 et l'axe perpendiculaire concerne le logarithme de la mesure de densité optique (DO) à la longueur d'onde de 450 nm. La Figure 3 montre que la méthode ELISA de la présente invention permet la détermination de l'activité de DPD sur la plage allant d'environ 2,5 àenviron 170 pmol/minute/ml.

La Figure 4 illustre la corrélation entre les quantités de DPD détectées par un dosage d'activité de DPD et la méthode ELISA de la présente invention dans des tissus de sein tant normaux que tumoraux. Le dosage d'activité de DPD est réalisé par une méthode de CCM classique utilisant un marqueur au 4C radioactif. La méthode ELISA utilisée ici est celle décrite dans

l'Exemple 3.

La Figure 5 illustre les résultats de l'étude de la sensibilité à des médicaments antitumoraux de la série des dérivés du 5-fluorouracile (5FU), tels que le FURFURULON, par détermination des rapports PyNPase/DPD comme décrit dans l'Exemple 5. On a déterminé les quantités de PyNPase en utilisant la

méthode décrite par Nishida M. et al., 1996, Biol.

Pharm. Bull. 19(11), 1407-1411. La méthode ELISA

utilisée ici est celle décrite dans l'Exemple 3.

La Figure 6 illustre les résultats d'un dosage par immunoprécipitation utilisant des anticorps monoclonaux

selon l'invention, comme décrit dans l'Exemple 6.

Les Figures 6-1 (a) et (b) montrent les résultats de SDS-PAGE, o (a) concerne les surnageants et (b) concerne les éluats de perles des immunoprécipités. Les Figures 6-2 (a), (b) et (c) montrent les résultats d'un immunotransfert Western, o (a) concerne le résultat obtenu à partir du surnageant détecté au moyen de l'anticorps anti- polypeptide 1 de DPD, (b) concerne le résultat des élutions à partir des immunoprécipités détectés par utilisation d'anticorps anti-polypeptide 1 de DPD, et (c) concerne le résultat pour les mêmes élutions qu'en (b) dans lesquels on a utilisé, pour la détection, l'anticorps monoclonal 3A5-6-1 de la présente invention. Les lignes respectives correspondent aux résultats du dosage par immunoprécipitation utilisant les échantillons suivants : ligne 1: IgG de souris; ligne 2: 2B6-11-1; ligne

3: 2E2-B3-1-3; ligne 4: B9-12-1; et ligne 5: 9C7-

-1. La ligne c sur la Figure 6-2 (b) représente

l'homogénat de HT-3 en tant que témoin positif.

Exemole 1 Préparation d'antiqènes Comme décrit précédemment, la séquence de nucléotides de la DPD humaine et la séquence d'acides aminés déduite de celle-ci ont été indiquées par Yokota, H. et al., 1994, J. Biol. Chem., 269 (37) 23192-23196 (voir Séquence N 1 et Séquence N 2). On prépare une protéine de fusion servant d'antigène en se basant sur les informations génétiques de la position 1170 à la position 3164 de la Séquence N 1, cette protéine de fusion étant exprimée en tant que protéine de fusion GST-DPD à l'aide de l'organisme hôte E. coli JM 109 transformé par le vecteur pGEX 4 T-3 portant

lesdites informations génétiques, comme indiqué ci-

dessous. 1) Construction d'un vecteur d'expression de DPD Sur la base des informations génétiques de la position 1170 à la position 3164 de la Séquence N 1, on prépare trois amorces d'ADN dans le but de cloner un segment du gène de DPD par amplification en chaîne par polymérase (ACP). On prépare l'amorce 1 (lieur EcoRI + brin sens) sous la forme d'un 25-mère ayant une séquence constituée d'un lieur EcoRI (CGCGAATTC) à la partie d'extrémité 5' et d'un brin positif correspondant aux nucléotides 1770 à 1785 de la Séquence N 1: Amorce 1: 5'-CGCGAATTCTTTTGAAGCTGGATGG-3'(Séquence N 3) (1770 lieur EcoRI + brin sens) On prépare l'amorce 2 (lieur EcoRI + brin antisens) sous la forme d'un 26-mère ayant une séquence constituée d'un lieur EcoRI à la partie d'extrémité 5' et d'un brin négatif complémentaire des nucléotides 3148 à 3164 de la Séquence N 1: Amorce 2: 5'- CGCGAATTCTCACCTTAACACACCGG-3' (Séquence N 4) (3164 lieur EcoRI + brin antisens) On prépare l'amorce 3 (brin antisens) sous la forme d'un 16-mère ayant une séquence complémentaire de la séquence correspondant aux nucléotides 3495 à 3510 de la Séquence N 1): Amorce 3: 5'-AATCAAATATGGAGCA-3' (Séquence N 5) (3510 Brin antisens) On prépare de l'ARN total à partir de cellules de la lignée cellulaires de diploïde pulmonaire humain WI38 (ATCC CLL-75) par une méthode classique utilisant une trousse d'isolement d'ARN (Stratagene, Lajolla, CA, USA) et se basant sur une extraction à l'acide/thiocyanate de guanidium/phénol/chloroforme (AGPC) (voir par exemple Chomczynski, P. et Sacci, N., 1987, Anal. Biochem. 162, 156-159), et on le soumet à une réaction de transcription inverse de transcriptase inverse RAV-2 en utilisant l'amorce 3 pour obtenir une préparation d'ADNc. Dans la réaction, on soumet 1 pg de l'ARN total à la réaction de transcription inverse dans p1 de la solution réactionnelle, à 42 C pendant 60 minutes, après quoi on dénature la transcriptase inverse par chauffage à 95 C pendant 5 minutes. On maintient à 4 C la préparation d'ADNc ainsi obtenue, jusqu'à utilisation dans l'amplification ACP. La solution tampon utilisée dans la synthèse du premier brin d'ADNc contient MgCl2 5 mM, dGTP, dATP, dTTP et dCTP tous 1 mM, un inhibiteur de RNase, 20 unités de

transcriptase inverse RAV-2 et 0,75 MM des amorces.

Puis on soumet cette préparation d'ADNc à une amplification ACP utilisant les amorces 1 et 2 et une trousse d'ACP du commerce, à savoir la trousse RT-PCR (Takara Shuzo, Shiga, Japon), conformément aux instructions d'utilisation de la trousse, sauf qu'on utilise de l'ADN polymérase (3,5 unitds de pfu) à la place de la Taq polymérase sur un appareil de cyclisation thermique (ZYMOREACTOR II, ATTO, Tokyo, Japon). La solution tampon pour l'amplification ACP, ayant un volume total de 100 Pl, contient MgCl, 2 mM, dGTP, dATP, dTTP et dCTP tous 0,2 mM, et 0,4 pM de chacune des amorces. Le programme d'ACP est constitué de 32 cycles de 94 C pendant 30 secondes, 55 C pendant 1 minute, et 75 C pendant 4 minutes. On isole ces fragments d'ADNc de DPD amplifiés par électrophorèse sur gel d'agarose sous la forme d'une bande correspondant à 1,4 kbp, puis on les purifie en utilisant une trousse d'extraction sur gel QIAEXll (QIAGEN, Hilden, Allemagne). On fait digérer par EcoRI le fragment d'ADNc purifié et on insère le fragment EcoRI dans le site EcoRI du vecteur pGEX4T-3 (Pharmacia, Uppsala, Suède) en utilisant une trousse de ligature d'ADN (Takara Shuzo, Shiga, Japon) à 16 C

jusqu'au lendemain. Le vecteur ainsi obtenu (appelé ci-

après pGEX4TG-3-DPD) est capable d'exprimer une protéine de fusion GST-DPD. On détermine la séquence de nucléotides partielle du fragment d'insertion ci-dessus et il est confirmé qu'elle a la sous- séquence attendue

du gène de DPD.

2) Expression de la protéine de fusion GST-DPD On transforme E. coli JM109 (Toyobo, Osaka, Japon) avec pGEX4T-3-DPD, et on cultive le transformé dans du milieu SOB (20 g/l de Bacto-tryptone, 5 g/1 d'extrait de Bacto-levure, 0,5 g/l de chlorure de sodium, 0,186 g/1 de chlorure de potassium et 0,95 g/l de chlorure de magnésium; pH 7,0) contenant 50 pg/ml d'ampicilline, à une température de 22 C, pour exprimer la protéine de fusion. On traite les cellules dudit transformé de E.

coli par addition d'IPTG (isopropyl-p-D-

thiogalactopyranoside) 0,5 mM et on les incube à 22 C pendant environ 16 heures, après quoi on les soumet à une sonication dans une solution tamponnée contenant 1 % de Triton X-100, i % de sarcosyle, DTT 10 mM et ETDA/STP 2 mM. On centrifuge le lysat de cellules et on introduit la fraction soluble dans une colonne de

Glutathione-Sepharose 4B (Pharmacia, Uppsala, Suède).

On élue avec 10 mM de glutathion réduit la protéine de fusion DST-DPD adsorbée. On identifie la protéine de fusion DST-DPD par SDS-PAGE comme étant une protéine

d'environ 75 kDa.

Cette protéine de fusion visée est confirmée par la réaction avec un anticorps anti-peptide de DPD. A cette fin, on synthétise chimiquement deux peptides de DPD, à savoir le Peptide 1 (Séquence N 6) et le Peptide 2 (Séquence N 7), en se basant sur la séquence décrite comme étant la Séquence N 2, et on les couple avec de la KLH à l'aide de la méthode au glutaraldéhyde pour obtenir les antigènes, comme décrit, par exemple, par Harlow et al., 1988 dans "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, New York, USA, pages 78 et 79. On injecte par voie sous-cutanée à des lapins les antigènes respectifs, en une quantité de 200 Mg et conjointement avec du CFA afin d'immuniser les animaux, après quoi on injecte des doses de rappel en des quantités identiques des antigènes avec du IFA. On traite les antisérums ainsi produits sur une colonne de KLH (qui est une colonne dans laquelle de la KLH est immobilisée sur un support, à savoir Affigel-10, disponible auprès de BioRad, Hercules, CA, USA) pour éliminer les anticorps anti-KLH, puis on les purifie en les introduisant dans une colonne de protéine G (MAB Trap GII, Pharmacia, Uppsala, Suède) ou une colonne de peptide, et en éluant avec un tampon de glycine-HCl 0,1 M, pH 3,0, après quoi on neutralise avec du tampon Tris-HCl 1 M, pH 8,0, avant utilisation. On prépare la colonne de peptide en couplant le Peptide 1 ou Peptide 2 mentionné plus haut avec de l'Affigel-15 (BioRad, Hercules, CA, USA) Ces deux anticorps polyclonaux anti-peptide 1 de DPD et anti-peptide 2 de DPD sont réactifs avec la DPD provenant de foie humain ou murin dans l'immunotransfert Western, et, par conséquent, on les utilise pour confirmer la production de protéine de fusion GST-DPD. Comme décrit ci-dessus, il est confirmé que le transformé a produit ladite protéine de fusion

GST-DPD par immunotransfert Western avec un anti-

peptide 2 de DPD (voir la Figure 1). Sur la Figure 1, la ligne 1 représente le marqueur moléculaire, la ligne 2 représente la protéine GST elle-même, la ligne 3 représente la protéine de fusion GST-DPD. Comme le montre la ligne 3, il est confirmé que la protéine de

fusion est une protéine d'environ 75 kDa.

Exemple 2

Préparation d'anticorDs monoclonaux anti-DPD 1) Fusion cellulaire On injecte par voie intrapéritonéale à des souris Balb/c la protéine de fusion GST-DPD préparée dans l'Exemple 1, à raison de 50 Mg par animal et conjointement avec du CFA, en un volume de 100 il/souris, puis on injecte des doses de rappel, par voie intrapéritonéale, d'environ 10 Fg par animal de protéine GST-DPD conjointement avec du IFA, deux fois à intervalles de deux semaines. Trois jours après l'immunisation finale, on sacrifie les souris sensibilisées pour en retirer les rates, et on prépare les splénocytes. On lave les splénocytes ainsi obtenues soigneusement avec du milieu RPMI 1640 sans sérum (Nikken Seibutu Igaku Kenkyusho, Kyoto, Japon) que l'on avait préchauffé à environ 37 C. On réalise les protocoles de fusion subséquents à environ 37 C en utilisant des réactifs préchauffés comprenant une

solution tampon.

On lave aussi soigneusement des cellules de la lignée cellulaire de myélome de souris P3x63 Ag8-U1 (achetées auprès de Flow Laboratories Ltd. , Irvine, R.U.) avec le milieu RPMI-1640 sans sérum. On mélange les splénocytes (environ 4 x 10") avec la lignée cellulaire de myélome de souris P3x63 Ag8-U1 (8 x 10') selon un rapport de 5/1, et on réalise la fusion cellulaire de la façon suivante. On culotte par centrifugation le mélange des cellules, et on aspire le milieu, puis on ajoute au culot du mélange des cellules, lentement en l'espace d'une minute, 2S0 p1 d'une solution à 50 % de polyéthylèneglycol (PEG1500, Boehringer Mannheim), tout en agitant le culot avec la pointe d'une micropipette; on ajoute ensuite lentement, en l'espace d'une minute, 250 p1 supplémentaires de solution à 50 % de PEG, tout en agitant le culot avec la pointe de la micropipette; et ensuite on poursuit l'agitation pendant 2 minutes en tournant doucement le tube. On ajoute lentement au mélange de fusion cellulaire, goutte à goutte et en l'espace de 5 minutes, 50 ml de milieu RPMI 1640 sans sérum (Nikken Seibutu Igaku Kenkyusho, Kyoto, Japon), et on lave les cellules par centrifugation pour

éliminer le PEG.

On remet le mélange des cellules culottées après la fusion cellulaire en suspension dans du milieu RPMI 1640 (Nikken Seibutu Igaku Kenkyusho, Kyoto, Japon) contenant 10 % de sérum de veau foetal (SVF), de la pénicilline/streptomycine et du 2ME, puis on le pipette dans les puits de plaques à 96 puits que l'on incube ensuite sous 5 % de CO2 à 37 C. Les 2ème, 4ème et 7ème jours de l'incubation, on remplace la moitié de la quantité du milieu de chaque puits par du milieu HAT (préparé par addition d'une solution de HAT (Flow Laboratories Ltd., Irvine, R. U.) à du milieu RPMI contenant 10 % de SVF) et on poursuit l'incubation. Au bout d'environ le 10oème jour de l'incubation, il se forme des colonies botrytiques dans certains des puits, et, finalement, on observe une prolifération de

cellules d'hybridomes dans 1056 puits.

2) Criblaqe d'anticorDs monoclonaux (2-1) Criblaqe primaire Dans tous les puits dans lesquels on a observé la prolifération d'hybridomes, on recherche les puits positifs par la méthode immunoenzymatique ELISA, de la façon suivante. On revêt les puits d'immunoplaques à 96 puits (Maxisorp, Nunc, Rosklide, Danemark) avec de la protéine de fusion GST- DPD ou de la GST en utilisant une quantité de 50 pl/puits des solutions contenant 1 pg/ml de l'une ou l'autre protéine. On élimine par lavage à la STTT les protéines non adsorbées et on effectue le blocage par incubation avec de la STT contenant 3 % de lait écrémé pendant 1 heure. On lave de nouveau les puits avec de la STTT et on y ajoute 50 pl/puits du surnageant de culture d'hybridomes, puis on les maintient à 37 C pendant 1 heure. Après lavage des puits respectifs trois fois avec de la STTT, on ajoute de l'immunoglobuline anti-souris de chèvre marquée à la peroxydase de raifort (HRP) IgG+A+M (KPL) et on maintient les plaques à 37 C pendant 1 heure. On lave les puits respectifs quatre fois avec de la STTT, puis

on ajoute un substrat (TMB, Microwell Kit System, KPL).

Après arrêt de la réaction par addition d'acide phosphorique 1 M, on mesure l'absorption à 450 nm en utilisant un lecteur de microplaque. On réunit en tant que matériel mère primaire les puits positifs réagissant plus fortement avec le revêtement de

protéine de fusion GST-DPD que ceux avec la GST.

(2-2) Criblaqe secondaire Pour assurer l'efficacité du criblage, on réalise le criblage secondaire en utilisant une protéine recombinée ayant la séquence complète de DPD dans un

immunotransfert Western.

(A) Préparation d'une Protéine recombinée avant la néauence complete dc DPD On prépare une partie recombin6e de la séquence complète de DPD en clonant la longueur totale de DPD sur la base d'un clonage par ACP avec la trousse RT-PCR et par l'expression du gène inséré dans un vecteur d'expression de E. coli, pTrcHisA (Invitrogen, San Diego, USA), cette méthode étant pratiquement identique à celle décrite dans le cas du clonage et de

l'expression de la protéine de fusion GST-DPD.

Tout d'abord, on prépare le premier brin d'ADNc par la réaction de transcription inverse de la préparation d'ARNm de foie et de placenta humain (Clontech, Palo Alto, CA, USA) en utilisant l'amorce synthétique 2 et la transcriptase inverse RAV-2. Puis on réalise l'amplification ACP de l'ADNc cible en utilisant l'amorce 1 et l'amorce 2 synthétiques et

l'ADN polymérase de pfu (Stratagene, Lajolla, CA, USA).

On réalise l'ACP en utilisant la trousse RT-PCR de Takara conformément aux instructions d'utilisation sur le cycleur thermique ZYMOREACTOR 11 (ATTO, Tokyo, Japon) avec 35 cycles de 94 C pendant 30 secondes, 55 C pendant 1 minute, et 75 C pendant 8 minutes. On sépare les fragments d'ADNc ainsi amplifiés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % et on purifie l'ADN dans la bande souhaitée en utilisant la trousse de purification d'ADN QIAEXll (QIAGEN, Hilden, Allemagne). On fait digérer le fragment d'ADNc purifié par EcoRI et on le sous-clone ensuite dans le site EcoRI d'un vecteur d'expression, à savoir pTrcHisA (Invitrogen, San Diego, USA). L'ADNc de DPD ainsi cloné exprime une protéine d'environ 120 kDa sous la forme d'une protéine de fusion de la DPD complète avec la protéine étiquetée à

l'histidine, que l'on utilise dans le criblage suivant.

(B) Criblaqe On soumet la DPD recombinée obtenue ci-dessus à une électrophorèse sur gel NPT-D520L (Pagel, ATTO, Tokyo, Japon) conformément à la méthodologie de Laemmli, et on transfère la protéine sur des membranes de PVDF (Immobilon, Millipore, Bedford, MA, USA) en utilisant un dispositif de buvardage à moitié sec (ATTO, Tokyo, Japon). On bloque avec de la STT contenant 3 % de lait écrémé les membranes de PBDF sur lesquelles la protéine DPD a été transférée, et on les lave à la STTT, puis on les soumet ensuite à une réaction avec les surnageants de culture des hybridomes décrits dans l'Exemple 1 sur un dispositif de buvardage Screener Blotter Mini 28 (Sanplatec Corp., Japon) à température ambiante pendant une heure. Puis, après lavage des membranes de PVDF avec de la STTT, on les fait réagir avec de l'anticorps IgG+A+M anti-souris de chèvre marqué à la HRP (KPL) à température ambiante pendant une heure. On lave de nouveau les membranes avec de la STTT et on les soumet à une réaction de coloration en utilisant un dispositif de marquage immunologique Konica Immunostaining HRP-1000 (Konica, Tokyo, Japon). On recueille comme candidats les colonies telles que, par exemple, celles portant les désignations 2B6, 9C7, 5E6, 3A5 et 6H5 qui réagissent fortement avec la DPD recombinée d'environ 120 kDa. Tel qu'utilisé ici, un anticorps monoclonal produit par un hybridome particulier, par exemple l'hybridome 2B6, est désigné par l'addition du préfixe "Mab-" au début du

nom de l'hybridome, par exemple Mab-2B6.

On clone les candidats ci-dessus par répétition deux fois ou plus de la méthode des dilutions limites afin d'établir les lignées cellulaires d'hybridomes (comprenant, par exemple, 2B6-11-l, 9C7-30-1, 5E6-19-1, 3A56-1 et 6H5-42-1). Après la première dilution limite, on évalue par immunotransfert Western la spécificité des anticorps monoclonaux ci-dessus, à savoir Mab-2B6-11, Mab-9C7-30, Mab-5E6-19, Mab- 3A5-6 et Mab-6H5-42, en utilisant les lignées contenant de la DPD. La Figure 2 montre les résultats de l'immunotransfert Western pour des anticorps monoclonaux produits par les lignées cellulaires

d'hybridomes 2B6-11, 9C7-30, 3A5-6-1, 5E6-19 et 6HS-42.

Comme le montre cette figure, les immunoconjugués résultants avec les anticorps et la DPD sont observés autour de la position de poids moléculaire d'environ

à 120 kDa.

On examine la sous-classe des anticorps monoclonaux produits par les lignées cellulaires d'hybridomes ci-dessus en utilisant une trousse Mouse Mono Ab-ID EIA (Zymed, San Francisco, CA, USA) et on détermine qu'il s'agit respectivement de Mab-2B6-11-1 (IgG1, K), Mab-9C7-30-1 (IgGl, K), Mab-5E6-19-1 (IgG3, K), Mab-3A5-6-1 (MgM, K), Mab-6H5-42-1 (IgM, K). Il est confirmé que les anticorps monoclonaux ci- dessus sont applicables à une méthode ELISA en sandwich pour la détection de DPD. Toutefois, dans le but de construire un système ELISA plus sensible, on décide qu'un criblage supplémentaire est préférable puisqu'on s'attend à ce que la concentration de DPD dans des tissus tumoraux soit inférieure à celle dans le fois, et qu'une sensibilité plus élevée sera souhaitée de façon à permettre la distinction entre une quantité

déficiente en DPD et une quantité normale.

(2-3) Troisième criblaqe En considérant comme représentatif l'anticorps monoclonal de l'hybridome 3A5-6-1, on effectue un criblage d'autres anticorps monoclonaux qui reconnaissent des épitopes différents de celui reconnu par l'anticorps Mab-3A5-6-1 et qui devraient permettre une sensibilité de la détection de la DPD native dans des tissus meilleure qu'avec les anticorps mentionnés ci-dessus. On utilise l'anticorps monoclonal Mab-3A5-G-1 pour revêtir les puits d'une plaque, à raison de 50 pl/puits à la concentration de 10 pg/ml, et après avoir éliminé l'anticorps non fixé, on bloque les puits respectifs en utilisant de la STT contenant 3 % de lait écrémé, à température ambiante pendant une heure. Apres lavage à la STTT, on fait réagir les puits avec 50 pl/puits d'un homogénat de foie de souris à une concentration d'environ 2 mg/ml, à température ambiante pendant une heure. Apres lavage à la STTT, on fait réagir les puits avec le matériel mère primaire des surnageants de culture d'hybridomes en une quantité de 50 pl/puits à 37 C pendant 1 heure. Apres lavage à la STTT de nouveau, on fait réagir les puits avec de l'anticorps monoclonal spécifique IgGl anti-souris de rat marqué à la HRP (Zymed, San Francisco, CA, USA) à 37 C pendant 1 heure. Après un lavage à la STTT, on soumet les puits à un développement de couleur avec un système de trousse à la peroxydase pour micropuits de TMB (KPL), puis on arrête la réaction par addition d'acide phosphorique 1 M, et on mesure l'absorption à 450 nm au moyen d'un

lecteur de plaque de microtitrage.

On détermine les 22 puits présentant une forte réaction et on soumet les hybridomes de ces puits à un

autre criblage de la même manière que celle décrite ci-

dessus en remplaçant l'homogénat de foie de souris ci-

dessus par les homogénats de lignées de cellules tumorales humaines HT- 3 et MCF-7. Ladite HT-3 a une activité de DPD de 160 pmol/minute/mg de protéine et est détectée sous la forme d'une bande unique aux alentours de 110 kDa par immunotransfert Western utilisant de l'anticorps polyclonal anti-peptide 1 ou anti-peptide 2 de DPD de lapin. D'autre part, bien que la lignée cellulaire MCF-7 ait une activité de DPD d'environ 1,6 pmol/minute/mg, elle n'est pas détectée par un immunotransfert Western similaire. Les inventeurs ont donc sélectionné les hybridomes (désignés 4B9 et 2E2) réagissant fortement avec la lignée cellulaire HT-3 mais pas avec la lignée cellulaire MCF-7. On soumet encore ces hybridomes 4B9 et 2E2 à la méthode des dilutions limites, deux fois ou plus, et on établit les clones d'hybridomes 4B9-12-1 et 2E2-B3-1-3 (dont les anticorps ont été déterminés comme

IgG1, >).

La spécificité des anticorps monoclonaux Mab-4B9-

12-1 et Mab-2E2-B3-1-3 vis-A-vis de l'antigène de DPD à l'état solubilisé est confirmée par immunoprécipitation. (2-4) Purification d'anticorDs monoclonaux En général, une fois qu'un hybridome capable de produire un anticorps monoclonal de la présente invention est établi, la production et la purification de l'anticorps monoclonal peuvent être réalisés par n'importe quel moyen de production et de purification d'anticorps monoclonaux connu dans la technique. Par exemple, on peut réaliser la production des anticorps monoclonaux en cultivant les cellules d'hybridomes dans un milieu de culture approprié, et en récupérant et purifiant les anticorps A partir de la culture.En variante, on peut réaliser la prolifération des cellules d'hybridomes en insérant les cellules dans un ascite péritonéal de souris. La production et la purification des anticorps monoclonaux sont réalisées par une méthode classique, dont un exemple est proposé dans ce qui suit pour des anticorps monoclonaux spécifiques. 1) Mab-4B9-12-1

On cultive la lignée cellulaire d'hybridomes 4B9-

12-1 dans un milieu sans sérum (trousse PM 1000, Eiken, Tokyo, Japon) à une concentration de cellules d'environ x 10%/ml. On recueille le surnageant de la culture et on purifie les anticorps (IgG) en introduisant le surnageant dans une colonne de protéine G HiTrap

(Pharmacia, Uppsala, Suède), de la façon suivante.

On équilibre la colonne de protéine G HiTrap avec du tampon phosphate 20 mM (pH 7,0), puis on introduit la préparation de surnageant dans la colonne. Apres lavage de la colonne avec de la solution salée tamponnée au phosphate 20 mM, on élue les fractions d'IgG avec du tampon glycine- HCl 0,1 M (pH 3,0). On neutralise l'élution ainsi recueillie avec du Tris-HCl 1 M (pH 9,0) puis on la dialyse contre de la STP. La détermination de protéines de la fraction d'anticorps purifiée, utilisant une trousse de dosage de protéines Bio-Rad Dc (Biorad, Hercules, CA, USA, le témoin étant de la SAB) indique environ 4 mg d'anticorps à partir de 300 ml du surnageant de culture. On détermine que la sous-classe de cet anticorps monoclonal est IgGl, K. 2) Mab-3A5- 6-1 Une semaine après l'injection de 0,5 ml de pristane (Sigma, St. Louis, MO, USA) par voie intrapéritonéale à des souris, on inocule dans la cavité abdominale des animaux, par injection, 5 x 10' cellules d'hybridomes 3A5-6-1. Au bout de deux semaines, on recueille les ascites des animaux, on les centrifuge et on les filtre sur un filtre à membrane de 0,8 Mm. On réalise la purification des anticorps (IgM) en utilisant une trousse de purification d'IgM ImmunoPure (Pierce, Rockford, Illinois, USA). A 0,5 ml d'ascite, on ajoute 0,5 ml de tampon de fixation d'IgM ImmunoPure et on introduit le mélange dans une colonne MBP d'ImmunoPure immobilisé. Après lavage de la colonne avec du tampon de fixation d'IgM ImmunoPure, on élue les anticorps avec le tampon d'élution d'IgM ImmunoPure, et on dialyse la fraction des anticorps contre de la STP. Une détermination de protéines utilisant de la SAB comme témoin révèle qu'on obtient environ 2 mg d'anticorps (IgM) à partir d'environ

0,5 ml d'ascite.

Exemple 3

ELISA utilisant les anticorps monloclonaux de la Drésente invention A titre de dosages immunologiques quantitatifs, on connaît bien dans la technique les méthodes de fixation en un point et les méthodes de fixation en deux points (appelées dosages en sandwich). On peut généralement dire que les méthodes de fixation en deux points sont avantageuses pour obtenir une meilleure précision et une meilleure sensibilité. On utilise les anticorps monoclonaux obtenus dans l'Exemple 2 ci-dessus pour construire des systèmes de dosage ELISA en sandwich, de

la façon décrite ci-dessous.

(a) Revêtement par le premier anticorDs On prépare une solution de Mab4B9-12-1 en utilisant de la STP (pH 7,4) à une concentration de 10 gg/ml, et on introduit 50 il de cette solution dans chacun des puits d'immunoplaques à 96 puits (Maxsorp, Nunc, Riskilde, Danemark), puis on scelle les puits par un joint en membrane et on incube à 4 C jusqu'au lendemain pour immobiliser l'anticorps (dans cet

exemple, on scelle les plaques durant l'incubation).

Après récupération de l'anticorps non fixé, on lave les puits avec de la STTT puis on les bloque par incubation avec de la STT contenant 3 % de lait écrémé

à température ambiante pendant 3 heures.

(b) Application d'échantillons On prépare un échantillon standard contenant de la DPD et de l'homogénat de xénogreffe de HT-3, à une concentration de 2 mg/ml. On prépare des dilutions en série de l'homogénat dans de la STT contenant 1 % de lait écrémé, et on introduit 50 g1 des échantillons aux puits respectifs, puis on incube l'immunoplaque à 37 C

pendant 2 heures.

(c) Réaction avec le deuxième anticorps Après lavage des puits avec de la STTT, on introduit dans chaque puits, en un volume de 50 p1, la solution de deuxième anticorps qui contient 2 pg/ml de Mab-3A5-6-1 dans de la STT contenant 3 % de lait écrémé, et on incube l'immunoplaque à 37 C pendant 1 heure. Avec ce traitement, on produit un immunoconjugué de [Mab-4B9-12-1]-[DPD]-[Mab-3A5-6-1] dans lequel la DPD est prise en sandwich entre les deux anticorps monoclonaux, lorsque la DPD est présente dans les

échantillons ci-dessus.

(d) Marouaqe Dans le but de détecter le conjugué, on utilise de l'anticorps IgM anti-souris de rat marqué à la HRP (Zymed, San Francisco, CA, USA) pour marquer le conjugué. Cet anticorps marqué à la HRPdisponible dans le commerce est utilisé après dilution au millième avec

de la STT contenant 3 % de lait écrémé.

On lave avec de la STTT les puits d'une immunoplaque et on y ajoute 50 p1 de l'anticorps marqué à la HRP ci-dessus, puis on incube la plaque à 37"C

pendant 1 heure.

(e) Détection Après lavage des puits, on réalise la réaction de coloration en utilisant un système de trousse à la peroxydase en micropuits de TMB (KPL) qui contient du TMB et H20, comme substrat développant une couleur dans la réaction enzymatique catalysée par la HRP. On introduit la solution de substrat dans les puits respectifs, et après avoir stoppé la réaction par addition d'acide phosphorique 1 M, on mesure l'absorption des puits au moyen d'un lecteur de

microplaque (BioRad, Hercules, CA, USA) à 450 nm.

Les résultats représentatifs sont résumés dans le Tableau 1 ci-dessous, et la courbe d'étalonnage obtenue

par le système ELISA ci-dessus comprenant le Mab-4B9-

12-1 et le Mab-3A5-6-1 est illustrée sur la Figure 3.

Sur cette figure, l'axe horizontal concerne le logarithme de l'activité de HT-3 et l'axe perpendiculaire concerne le logarithme de densité

optique (DO) mesurée a la longueur d'onde de 450 nm.

Comme le montre la Figure 3, ce système ELISA de la présente invention permet la détermination de l'activité de DPD dans la plage allant d'environ 2,5 a environ 170 pmol/minute/ml. Cette sensibilité élevée du dosage ELISA de DPD sera utile pour déterminer la quantité de DPD dans des échantillons biologiques provenant d'un corps humain. En outre, le dosage ELISA de DPD ci-dessus va donc permettre la détermination de la quantité de DPD dans des échantillons provenant d'un patient atteint de déficience, dont on sait qu'il

présente une quantité plutôt faible de DPD.

*Tableau 1

Activité de HT-3* (pmol/minute/ml) DO4,0*

167,5 1,313

83,75 0,894

41,88 0,548

20,94 0,320

,47 0,175

,23 0,105

2,61 0,060

* On utilise un étalon de HT-3 ayant une activité de 167,5 pmol/mg/minute À* * DO soustraite de la valeur à blanc

Exemple 4

Comparaison entre les résultats du dosage ELISA et de l'activité de DPD On étudie la corrélation entre la quantité déterminée par la présente méthode ELISA, qui a été décrite dans l'Exemple 3, et la quantité d'activité enzymatique de DPD. Les échantillons proviennent de tissus de cancer du sein adjacents à des tissus normaux qui sont des évulsions chirurgicales. On prépare les échantillons sous la forme d'homogdnats de tissuPour résumer, on homogénéise d'abord les tissus tumoraux et normaux dans du tampon Tris-HC1 10 mM (pH 7,4) contenant NaCl 15 mM, MgCl, 1,5 mM et du phosphate de potassium 50 mM, puis on les centrifuge à 105 000 x g pendant 90 minutes. On dialyse le surnageant jusqu'au lendemain contre du tampon phosphate de potassium 20 mM

(pH 7,4) et du 2-mercaptoéthanol 1 mM.

On détermine l'activité de DPD par une méthode sur

plaque par CCM, proche de celle décrite par Fernandez-

Salguero et ai., 1995, Biochem. Pharm. 50, 1015-1020, dans laquelle on mesure de la façon décrite ci-dessus la somme des catabolites de 5-FU, c'est-à-dire le dihydrofluorouracile, le a-fluoro-p-uréidopropionate et

la a-fluoro-p-alanine, formés à partir de [6-'4C]5-Fu.

On réalise le dosage ELISA de la même manière que celle décrite dans l'Exemple 3, en utilisant un homogénat de

xénogreffe Scaber (105 pmol/minute/mg) comme étalon.

On analyse chaque échantillon à la fois par la méthode sur plaque par CCM et par la méthode ELISA, et on trace les données de chaque échantillon sur un graphique dont l'axe vertical représente la quantité de DPD en pmol/minute/mg, mesurée par la méthode ELISA, et l'axe horizontal représente l'activité de DPD mesurée

par la méthode par CCM, comme le montre la Figure 4.

Une corrélation élevée entre les résultats du dosage d'activité et le dosage ELISA de la présente invention est confirmée pour les tissus tant tumoraux que normaux.

Exemple 5

Application de la méthode ELISA de l'invention à la mesure de l'efficacité de médicaments antitumoraux de la série des dérivés du 5- fluorouracile (5-FU) tels aue le FURTULON L'un des composés représentatifs des médicaments antitumoraux de la série des dérivés du 5-fluorouracile

(5-FU), à savoir le FURTULON (5'-désoxy-5-

fluorouridine, 5'-dFUrd) est un promédicament qui est converti en 5- FU par l'action de la pyrimidine nucléoside phosphorylase (PyNPase), c'est-a-dire la

thymidine phosphorylase dans les cellules humaines.

On imagine un système de détermination commode pour évaluer le rapport PyNPase/DPD dans des tissus tumoraux. Ce système comprend une combinaison du système ELISA pour le dosage de PyNPase décrit par Nishida M. et al., 1996, Biol. Pharm. Bull. 19(11), 1407-1411, et du système ELISA de l'invention décrit

dans l'Exemple 3 ci-dessus.

Pour déterminer si le rapport PyNPase/DPD est ou non un marqueur de l'efficacité du FURTULON, on détermine ce rapport pour un certain nombre de tissus tumoraux dont on sait déjà qu'ils sont sensibles au FURTULON, et pour un certain nombre de tissus tumoraux

dont on sait déjà qu'ils sont réfractaires au FURTULON.

Les lignées cellulaires utilisées comme étant représentatives des tissus sensibles au FURTULON sont les 9 lignées cellulaires humaines de xénogreffe de tumeur suivantes: Scaber (carcinome cellules squameuses, ATCC HTB-3), ZR-75 (carcinome du sein), MCF-7 (adénocarcinome du sein, ATCC HTB-22), LoVo (cancer colorectal, ATCC CCL-229), MKN45 (cancer

gastrique), SIHA (carcinome à cellules squameuses), ME-

(carcinome épidermique), HCT116 (cancer colorectal) et COL0205 (cancer colorectal, ATCC CCL 222). Les lignées cellulaires utilisées comme étant représentatives des tissus réfractaires au FURTULON sont les sept lignées cellulaires de xénogreffe suivantes: SK-OV-3 (tumeur ovarienne, ATCC HTB-77), MAD-MB-231 (carcinome du sein), HIT-29 (cancer colorectal, ATCC HTB-38), T- 24 (cancer de la vessie, ATCC HTB-4), PC-3 (adénocarcinome de la prostate), WiDr-1 (cancer colorectal, ATCC CCL-218), et MKN28

(cancer gastrique).

Les rapports déterminés sur la base du système ELISA de la présente invention sont tracés sur le graphique de la Figure 5. Comme le montre cette figure, les lignées cellulaires sensibles au FURTULON présentent des rapports PyNPase/DPD nettement

supérieurs à ceux des lignées cellulaires réfractaires.

Ce résultat montre que le rapport PyNPase/DPD dans les tissus tumoraux est utile pour mesurer l'efficacité du FURTULON dans le traitement de patients souffrant

d'une tumeur.

Exemple 6

Dosage par immunoprécipitation utilisant des anticorps monoclonaux selon l'invention En tant qu'échantillon biologique contenant de la DPD, on utilise un homogénat de xénogreffe de lignée de cellules tumorales HT-3. On traite l'homogénat de xénogreffe (8,6 mg/ml) sur une colonne Sepharose 4B de protéine G, deux fois, pour absorber les anticorps provenant de l'hôte, et on le soumet au dosage par

immunoprécipitation suivant.

Dans des tubes contenant 150 p1 d'homogénat de xénogreffe de HT-3, on ajoute 5 pg des anticorps monoclonaux selon l'invention devant être testés et on incube les tubes à 4 C pendant 2 heures. Puis on ajoute dans chacun des tubes 20 il de protéine G-Sepharose à % (Sigma, St. Louis, MO, USA) et on incube encore les mélanges à 4 C pendant 2 heures. Après la réaction, on centrifuge les mélanges pour les séparer en fractions de perles et surnageants. On lave les fractions de perles recueillies avec du tampon phosphate de sodium 20 mM (pH 7,0), cinq fois, et on les élue dans 60 a1 de tampon glycine-HCl 0,1 M (pH 3,0); on neutralise les éluats avec 3 p1 de Tris-HCl 1 M (pH 8, 0) pour obtenir la préparation des immunoprécipités. On analyse par SDS-PAGE et immunotransfert Western les échantillons des surnageants et des éluats provenant des fractions de perles, appelés ci-après

"éluats de perles".

La Figure 6 illustre les résultats du dosage par immunoprécipitation utilisant les anticorps monoclonaux de la présente invention Mab-2B6-111, Mab-2E2-B3-1-3,

Mab-4B9-12-1 et Mab-9C7-30-1.

Les Figures 6-1 (a) et (b) montrent le schéma électrophorétique de SDS-PAGE, o (a) concerne les surnageants et (b) concerne les éluats de perles des immunoprécipités, les bandes étant visualisées par marquage à l'argent (marquage à l'argent 2D Daiichi,

Daiichi Pure Chemicals, Tokyo, Japon).

Les Figures 6-2 (a), (b) et (c) montrent les résultats de l'immunotransfert Western, o (a) montre le résultat obtenu a partir du surnageant détecté au moyen d'anticorps anti-polypeptide 1 de DPD, (b) montre le résultat obtenu à partir des éluats de perles provenant des immunoprécipités détectés par utilisation d'anticorps anti-polypeptide 1 de DPD, et (c) montre le résultat obtenu à partir des mêmes éluats de perles qu'en (b) o on utilise l'anticorps monoclonal 3A5-6-1 de la présente invention pour la détection. Les lignes respectives correspondent aux résultats du dosage par immunoprécipitation utilisant les échantillons

suivants: ligne 1: IgG de souris; ligne 2: 2B6-11-

1; ligne 3: 2E2-B3-1-3; ligne 4: B9-12-1; et ligne : 9C7-30-1. La ligne c sur la Figure 6-2 (b) représente l'homogénat de HT-3 en tant que témoin positif. Comme le montre la Figure 6-1(b), on observe une immunoprécipitation sous la forme des bandes correspondant à environ 120 kDa dans les cas des

anticorps monoclonaux de la présente invention, Mab-

2E2-B3-1-3 (ligne 3) et Mab-4B9-12-1 (ligne 4). Sur le gel PAGE, les bandes visibles aux alentours de 50 kDa et de 25 kDa correspondent à la chaîne lourde et & la

chaîne légère des anticorps utilisés.

Parallèlement, on réalise un immunotransfert Western en utilisant le surnageant et l'éluat de perles. Pour la détection de la DPD, on utilise soit de l'anticorps de lapin anti-peptide 1 de DPD, soit du Mab-3A5-6-1. Comme le montre la Figure 6-1(a), on n'observe pas la bande correspondant à la DPD dans les échantillons du surnageant (voir les lignes 3 et 4), tandis qu'on observe des bandes uniques autour de 120 kDa en utilisant l'anticorps de lapin anti-peptide 1 de DPD, ou du Mab-3A5-6-1 dans les échantillons qui ont été éluées à partir des perles résultant de

l'immunoprécipitation avec Mab-4B9-12-1 et Mab-2E2-B3-

1-3, comme le montrent les Figures 6-2 (b) et (c), ce qui met en évidence le fait que la bande unique observée à proximité de 120 kDa sur SDS-PAGE correspond à la DPD. En outre, on détermine les activités de DPD dans les échantillons des éluats de perles provenant des immunoprécipités avec le Mab-4B9-12-1 et le surnageant correspondant, et on n'observe l'activité de DPD que dans les éluats de perles provenant des

immunoprécipités, comme le montre le Tableau 2 ci-

dessous.

Tableau 2

Activité de DPD: pmol/minute/ml Homogénat de HT-3/ Mab + perles AnticorDs ajout Surnaqeants Eluats de perles IgG1 de souris 118,2 < 1,A1 4B9-12-l < 1,41 85,3 Ces résultats montrent que les anticorps

monoclonaux de la présente invention, à savoir Mab-4B9-

12-1 et Mab-2E2-B3-1-3, reconnaissent la molécule de DPD active ayant la conformation native, et que la spécificité de ces anticorps vis-à-vis de la DPD est très élevée, puisqu'on observe leurs immunoprécipités

sous la forme de bandes uniques.

En outre, il est confirmé que Mab-3A5-6-1 reconnaît spécifiquement la molécule de DPD qui était aussi spécifiquement reconnue par Mab-4B9-12-1; ceci assure la fiabilité du système ELISA en sandwich utilisant ces anticorps monoclonaux de la présente

invention.

Comme le comprendra facilement l'homme du métier, les anticorps monoclonaux selon la présente invention sont aussi utiles dans la préparation d'une colonne

d'affinités pour la purification de DPD.

LISTE DE SEQUENCES

(1) INFORMATIONS GENERALES

(1) INFORMATIONS GENERALES

(i) DEPOSANTS:

NOM: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG

RUE: Grenzacherstrasse 124 VILLE: Bâle PAYS: Suisse

CODE POSTAL: CH-4002

TELEPHONE: 061-688 25 11

TELECOPIE: 061-688 13 95

TELEX: 962292/965542 hlr c (ii) TITRE DE L'INVENTION: MATERIELS ET

METHODES IMMUNOLOGIQUES POUR

DETECTER LA

DIHYDROPYRIMIDINE

DESHYDROGENASE

(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 7

(2) INFORMATIONS SUR LA SEQUENCE N 1

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 3951 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: 1

(D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) SOURCE: ORGANISME: Homo sapiens (iv) CARACTERISTIQUE:

CARACTERISTIQUE CLE: CDS

POSITION: 1... 3951

METHODE DE SEQUENCAGE: E

(v) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE N 1:

-i' 1 -

GCTGTCACTT GGCTCTCTGG CTGGAGCTTG ACGGACGCACAG GAGGGTTTGT CACTCCGGCAGA 060

CTCGAGACTG TACCGGCACTGC CATGGCCCCT GTGCTCAGTA ACCGGACTCGGC CCGGACATCGAG 120

AGTATCCTGG CTTTA\TCC TCGCAA.CACAA ACTCATGCA\ CTlCTGTGTTC CACTTCGGCC 180 AAGAAATTAG ACAGC,V\ACA TTGGAkA\GA AATCCTGATA AGAA\CTGCTT TAATTGTGAG 240

AAGCTCGGAGA ATAATTTTGA TGACATCAAG CACACGACTC TTGGTGACCC AGGAGCTCTC 300

CGAGAAGC\AA TGAGATGCCT GAAATGTGCA GATGCCCCGT GTCAGA.AGAG CTGTCCAACT 360

AATCTTGATA TTAAATCATT CATCACAAGT ATTGCAAACA AGAACTATTA TGGAGCTGCT 420

AAGATGATAT TTTCTGACAA CCCACTTGGT CTGACTTGTG GAATGGTATG TCCA.ACCTCT 480

GATCTATGTG TAGGTGGATG CAATrTATAT GCCACTGAAG AGGGACCCAT TAATATTGGT 540

GGATTGCAGC AATTTGCTAC TGAGGTATTC AAAGCAATGA GTATCCCACA GATCAGAAAT 600

CCTTCGCTGC CTCCCCCAGA AAAAATGTCT GAAGCCTATT CTGCAAAGAT TGCTCTTTT 660

GGTGCTGGGC CTGCAAGTAT AAGTTGTGCT TCCTTTTTGG CTCGATTGGG GTACTCTGAC 720

ATCACTATAT TTGAAAAACA AGAATATGTT GGTGGTTTAA GTACTTCTGA AATTCCTCAG 780

TTCCGGCTGC CGTATGATGT AGTGAATTTT GAGATTGAGC TAATGAAGGA CCTTGGTGTA 840

AAGATAATTT GCGGTAAAAG CCTTTCAGTG AATGAAATGA CTCTTAGCAC TrTGAAAGAA 900

AAAGGCTACA AAGCTGCTTT CATTGGAATA GGTTTGCCAG AACCCAATAA AGATGCCATC 960

TTCCAAGGCC TGACGCAGGA CCAGGGGTTT TATACATCCA;0;GACT-TTT GCCACTTGTA 1020

GCCAAAGGCA GTAAA\GCAGG AATGTGCGCC TGTCACTCTC CATTGCCATC GATACGGGGA 1080

GTCGTGATTG TACTTGGAGC TGGAGACACT GCCTTCGACT GTGCAACATC TGCTCTACGT 1140

TGTGGAGCTC GCCGAGTGTT CATCGTCTTC AGAAAAGGCT TTGTTAATAT AAGAGCTGTC 1200

CCTGAGGAGA TGGAGCTTGC TAAGGAAGA\ AAGTGTGAAT TTCTGCCATT CCTGTCCCCA 1260

CGGAAGGTTA TAGTAAAAGG TGGGAGAATT GTTGCTATGC AGTTTGTTCG GACAGAGCAA 1320

GATGAAACTG G,.\AATGGAA TGAAGATGAA GATCAGATGG.CCATCTGAA ACCGATGTG 1380

GTCATCAGTG CCTTTGGTTC AGTTCTGAGT GATCCTAAAG TAAAAGAAGC CTTGAGCCCT 1440

ATAAAATTTA ACAGATGGGG TCTCCCAGAA GTAGATCCAG ".\CTATGCA AACTAGTGAA 1500

GCATGGGTAT TTGCAGGTGG TGATGTCGTT GGTTTGGCTA ACACTACAGT GGAATCGGTG 1560

ANTGATGGC\ AGCAA\GCTTC TTGGTACATT CACAAATACG -ACAGTCACA ATATGGAGCT 1620

TCCGTTTCTG CCAAGCCTGA ACTACCCCTC TTTTACACTC CTATTGATCT GGTGGACATT 1680

AGTGTAGAA,\ TGGCCGGATT GAAGTTTATA AATCCTTTTG GTrCTTGCTAG CGCAACTCCA 1740

GCCACCAGCA CATCNATGAT TCGAAGAGCT TTTGAAGCTG GATGGGGTTT TGCCCTCACC 1800

- 't,2 -

AAA>CTTTCT CTCTTGATAA GGACA-TGTG ACAAATGTTT CCCCCAGAAT CATCCGGGGA 1860

ACCACCTCTG GCCCCATGTA TGGCCCTGGA CAAAGCTCCT TTCTGCA\TAT TGAGCTCATC 1920

AGTGAGAAAA CGGCTGCATA TTGGTGTCAA AGTGTCACTG AACTAAAGGC TGACTTCCCA 1980

GACAACATTG TGATTGCTAG CATTATGTGC AGTTACAATA AAA\ATGACTG GACGGAACTT 2040

GCCAAGAAGT CTGAGGATTC TGGAGCAGAT GCCCTCGAGT TAAATTTATC ATGTCCACAT 2100

CGCATGGGAG AAAGAGGAAT GGGCCTCGCC TGTGGGCAGG ATCCAGAGCT GGTGCGGAAC 2160

ATCTGCCGCT GGGTTAGGCA AGCTGTTCAG ATTCCTTTTT TTCCAAGCT GACCCCAAAT 2220

GTCACTGATA TTGTGAGCAT CGCAAGACCT GCAAAGG,\G TGTGGTGCCAA TGGCGTTACA 2280

GCCACCAACA CTGTCTCAGG TCTGATGGGA TTAAAATCTG ATCCGGCACACC TTGGCCAGCA 2340

GTGGGGATTG CAAAGCGAAC TACATATGGA GGAGTGTCTG GGACAGCAAT CAGACCTATT 2400

GCTTTGAGAG CTGTGACCTC CATTGCTCGT GCTCTGCCTG GATTTCCCAT TTTGGCTACT 2460

GGTGGAATTG ACTCTGCTGA AAGTGGTCTT CAGTTTCTCC ATAGTGGTGC TTCCGTCCTC 2520

CAGGTATGCA GTGCCATTCA GAATCAGGAT TTCACTGTGA TCGAAGACTA CTGCACTGGC 2580

CTCAAAGCCC TGCTTTATCT GAAAAGCATT GAAGAACTAC AAGACTGGGA TGGACAGAGT 2640

CCAGCTACTG TGAGTCACCA GAAAGGGAAA CCAGTTCCAC GTATAGCTGA ACTCATGGAC 2700

AAGAAACTGC CAAGTTTTGG ACCTTATCTG GAACAGCGCA AGAAAATCAT AGCAGAAAAC 2760

AAGATTAGAC TGAAAGAACA AAATGTAGCT TTTTCACCAC TTAAGAGAAG CTGT-"TTATC 2820

CCCAAAAGGC CTATTCCTAC CATCAAGGAT GTAATAGGA.A A\GCACTGCA GTACCTTGGA 2880

ACATTTGGTG AATTGAGCAA CGTAGAGCAA CTTGTGGCTA TGATTGATGA AGAAATGTGT 2940

ATCAACTGTG GTAAATGCTA CATGACCTGT AATGATTCTG GCTACCACGGC TATACAGTTT 3000

GATCCAGA.AA\ CCCACCTGCC CACCATAACC GACACTTGTA CAGGCTGTAC TCTGTGTCTC 3060

AGTGTTTGCC CTATTGTCGA CTGCATCAAA ATGGTTTCCA GGACAACACC TTATGAACCA 3120

AAGAGAGGCG TACCCTTATC TGTGAATCCG GTGTGTTAAG GTGATTTGTG AAACAGTTGC 3180

TGTGAACTTT CATGTCACCT ACATATGCTG ATCTCTTAAA ATCATGATCC TTGTGTTCAG 3240

CTCTTTCCAA ATTAAAACAA ATATACATTT TCTAAATAAA AATATGTAAT TTCAAAATAC 3300

ATTTGTAAGT GTAA.;\AATG TCTCATGTCA ATGACCATTC,A\TTAGTGGC ATAAAATAGA 3360

ATAATTCTTT TCTGAGGATA GTAGTTAAAT AACTGTGTGG CAGTTAATTG GATG.TCACT 3420

GCCAGTTGTC TTATGTGAjA AATTAACTTT TTGTGTCGGCA ATTAGTGTGA CAGTTTCCAA 3480

ATTGCCCTAT GCTGTGCTCC ATATTTGATT TCTAATTGTA AGTGAAATTA AGCATTTTGA 3540

AACAAAGTAC TCTTTAACAT ACAAGAAAAT GTATCCAAGG,XACATTTTA TCAATAAAAA 3600

TTACCTT'rTAA TTTTAATGCT GTTTCTAAGA AAATGTAGTT AGCTCCATAA AGTACAAATG 3660 sI,- sJ. all dsy dry;,-id VSY ULY no -.a LAIN njo SAD '-Y--.d LAbD ury LA. dsZ -d ut y 5A dz& s.A s5A sLA dsy r.; scZ ScZ vI 0t 5Z 0Z :es:-.;,:aS --AD ne7 zuW v1Y sip,.:'i' zTD 'qL Zzy oze usY nl glY : 01 5 l0

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Z oN 3DNEnÈSS VI SC NOIldIUDSSE (^) 3 30ODNSnÈSS 3a SGOH13W SZOT ''' I: NOIIISOd : 3D sOIiS ISiDawv :SOISI siD IW'D (Ad) suaTdes OWOH: SWSINIfOEO : 3Dnos () uD9Tzoad: 3qSaqON 30 SdAi (TT) aleguTI: 3IOOqOdOl (D) 9uTme W poe: PdXi (E) snPsp6a SZ0I: M9ONOI (IV) oN3nON3s n SC SEn0IISIUSIDIoDSW (!) Z oN 3DNS33S VUnS SNOIIW04NI (z) 156t D lú\9DDDDD sDDYLYDYD DlDlDYLlLl DIDYDDYIú1DDDDlYDYL 006t DDYYDY^Y DD1DIYIDY YYLllD'Dlll 0tt Dt'D 9DD'YDYD'DD DúYDVD&DY D1LYDDY YYW YD30 lDy ll (lTYYD)DD 0E!t Y'YDDYOY' QDLlQ'DDú L iDQú 1WD'ODDDll DDDD>s OYYLú LD 02t, YDD'D....LVYD DDY DY'.'YD'YLY9 DYD9D1Y'DD L YLk" D:D1D:Y O! E C D':DD o::':Y:xDD:- úQkL X OVD o c.o>y:::':D:rvVDDDI DXtVV D':f9i1 -44 - Thr Thr Leu Gly Glu Arg Gly Ala Leu Arg Glu Ala Mec Arg Cys Leu

, 70 75 80

Lys Cys Ala Asp Ala Pro Cys Gln Lys Set Cyn Pro Thr Ann Lcu Asp

90 95

Ile Lys Ser Pho Ilc Thr Set Ila Ala Asn Lys Asn Tyr Tyr Gly Ala

105 110

Ala Lys Met Ile Pho Sur Asp Asn Pro Lou Gly Lau Thr Cys Gly Mat

120 125

Val Cys Pro Thr Ser Asp Leu Cy5 Val Gly Gly Cys Asn Leu Tyr Ala

130 135 140

Thr Glu Glu Gly Pro Ile Asn Ile Gly Gly Leu Gin Gin Phe Ala Thr

150 155 160

Glu Val Phe Lys Ala Met Ser Ile Pro Gin Ile Arg Asn Pro Set Leu

170 175

Pro Pro Pro Glu Lys Me: Set Glu Ala Tyr Set Ala Lys Ile Ala Leu

185 190

Phe Gly Ala Gly Pro Ala Set Ile Set Cys Ala Ser Phe Lcu Ala Arg

200 205

Leu G!y Tyr Set Asp Ile Thr Ile Phe Glu Lys Gin Glu Tyr Val Gly

210 215 220

Gly Leu Ser Thr Set Glu Ile Pro Gln Phe Arg Leu Pro Tyr Asp Val

225 230 235 240

Val Asn Phe Glu Ile Glu Leu Met Lys Asp Leu Gly Val Lys Ile Ile

245 250 255

Cys Gly [Lys Set Leu Set Val Asn Glu Met Thr Leu Set Thr Leu Lys

260 265 270

Glu Ly:; Gly Tyr Lys Ala Ala Phe Ile GIy Ile Gly Leu Pro Glu Pro 275 2a80 285 Asn Ly:; Asp Ala Ile Phe Gln Gly Leu Thr Gln Asp Gln Gly PIhe Tyr

290 295 300

Thr Scr Lys Asp Phe Leu Pro Leu Val Ala Lys Gly Set Lys Ala Gly

305 310 315 320

Met Cys Ala Cys His Ser Pro Leu Pro Sur Ile Arg Gly Val Val Ile

325 330 335

Val Lcu Gly AlA Gly Asp Thr Ala Phu Asp Cys Ala Thr Ser Ala Leu

340 345 350

Arg Cys Gly AlA Arg Arg Val Pha Ile Val Pha Arg Lys Gly Phc Val

355 360 365

Asn Ile Arg Ala Val Pro Glu Glu Met Glu Leu Ala Lys Glu Glu Lys

370 375 380

Cys Glu Phe Leu Pro Phe Leu Ser Pro Arg Lys Val lle Val Lys Gly

385 390 395 400

Gly Arg Ile Val Ala Met Gln Phe Val Arg Thr Glu Gln Asp Glu Thr

405 410 415

Gly Lys Trp Asn Glu Asp Glu Asp Gln Mec Val His Leu Lys Ala Asp

420 425 430

Val Val lie Ser Ala Phe Gly Ser Val Leu Ser Asp Pro Lys Val Lys

435 440 445

- l 6 -

Glu Ala Leu Ser Pro le Lys Phe Asn Arg Trp Gly Leu Pro Glu Val

450 455 460

Asp Pro Glu Thr Met Gin Thr Set Glu Ala Trp Val Phc Ala Gly Gly

465 470 475 480

Asp Val Val Gly Leu Ala Asn Thr Thr Val Glu Ser Val Asn A5p Gly

485 490 495

Lys Gln Ala Set Trp Tyr Iloa His Lys Tyr Val Gln Secr Gin Tyr Gly

500 505 510

Ala Ser Val Ser Ala Lys Pro Glu Leu Pro Leu Phe Tyr Thr Pro Ile

515 520 525

Asp Leu Val Asp Ile Set Val Glu Met Ala Gly Leu Lys Phe Ile Asn

530 535 540

Pro Phe Gly Leu Ala Set Ala Thr Pro Ala Thr Set Thr Set Met Ile

545 550 555 560

Arg Arg Ala Phe Glu Ala Gly Trp Gly Phe Ala Leu Thr Ly3 Thr Phe

565 570 575

Set Leu Asp Lys Asp Ile Val Thr Asn Val Set Pro Arg Ile Ile Arg

580 585 590

Gly Thr Thr Ser Giy Pro Met Tyr Gly Pro Gly Gin Secr Set Phe Leu

595 600 605

Asn Ile Glu Leu Ile Set Glu Lys Thr Ala Ala Tyr Trp Cys Gln Secr

610 615 620

Val Thr Glu Leu Lys Ala Asp Phe Pro Asp Asn Ile Val Ile Ala Ser

625 630 635 640

Ile blct Cys Set Tyr Asn Lys Asn Asp Trp Thr Glu Leu Ala Lys Lys

645 650 655

Set Glu Asp Set Gly Ala Asp Ala Leu Clu Leu Asn Leu Set Cys Pro

660 665 670

His Gly lMet Gly Glu Arg Gly Met Gly Leu Ala Cys Gly Gln Asp Pro

675 680 685

Glu Leu Val Arg Asn Ile Cys Arg Trp Val Arg Gln Ala Val Gln Ile

0'6 SC6 0C6

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945 950 955 960

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965 9 70 975

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990 995 990

Leu Ser Val Cys Pro Ile Val A5p Cyi Ile Ly: Met Val S-er Arg Thr

995 1000 1005

Thr Pro Tyr Glu Pro Lys Arg Gly Val Pro Leu Se.r VaL Ain Pro Val

1010 1015 1020

Cys

(2) INFORMATIONS SUR LA SEQUENCE NO 3

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: 1

(D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ii) CARACTERISTIQUE:

CARACTERISTIQUE CLE: CDS

(iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE N 3:

CGCGAATTCT TTTGAAGCTG GATGG 25

(2) INFORMATIONS SUR LA SEQUENCE N 4

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 26 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: 1

(D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN

CARACTERISTIQUE CLE: CDS

(iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE N 4:

CGCGAATTCT CACCTTAACA CACCGG 26

(2) INFORMATIONS SUR LA SEQUENCE N 5

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: 1

(D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (iv) CARACTERISTIQUE:

CARACTERISTIQUE CLE: CDS

(iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE N 5:

AATCAAATAT GGAGCA 16

(2) INFORMATIONS SUR LA SEQUENCE N 6

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 18 résidus (B) TYPE: acide aminé (C) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) CARACTERISTIQUE:

CARACTERISTIQUE CLE:

POSITION: 52... 69

METHODE DE SEQUENCAGE: E

(iv) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE N 6:

Cys Glu Lys Leu Glu Asn Asn Phe Gly Asp Ile Lys His Thr

60

Thr Leu Gly Glu

(2) INFORMATIONS SUR LA SEQUENCE N 7

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 résidus (B) TYPE: acide aminé (C) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) CARACTERISTIQUE:

CARACTERISTIQUE CLE:

POSITION: 660... 679

METHODE DE SEQUENCAGE: E

(v) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE N 7:

Ser Gly Ala Asp Ala Leu Glu Leu Asn Leu Ser Cys Pro His

660 665 670

Gly Met Gly Glu Arg Gly

675 679

Claims (21)

REVENDICATIONS

1. Anticorps monoclonal reconnaissant spécifiquement la dihydropyrimidine déehydrogénase

(DPD).

2. Anticorps monoclonal selon la revendication 1, reconnaissant spécifiquement la dihydropyrimidine

déshydrogénase humaine.

3. Anticorps monoclonal selon la revendication 1 ou 2, qui présente une forte réactivité vis-à-vis d'un homogénat provenant de la lignée de cellules tumorales humaine HT-3 (ATCC HTB-32), mais une faible réactivité ou une absence de réactivité vis-à-vis d'un homogénat provenant de la lignée de cellules tumorales humaine

MCF-7 (ATCC HTB-22).

4. Anticorps monoclonal selon la revendication 3, dans lequel l'immunoprécipité obtenu avec un homogénat provenant de la lignée de cellules tumorales humaine HT-3 (ATCC HTB-32) présente une bande unique lorsqu'il

est analysé par SDS-PAGE.

5. Anticorps monoclonal selon l'une quelconque des

revendications 1 à 4, qui peut être produit par une

lignée cellulaire d'hybridomes choisie dans le groupe

constitué par les lignées cellulaires d'hybridomes 2B6-

11-1, 9C7-30-1, SE6-19-1, 3A5-6-1 (FERM BP-6015), 6HS-

42-1, 4B9-12-1 (FERM BP-6016), 2E2-B3-1-3 (FERM BP-

6014) et 3B12-B1-56-1-2.

6. Anticorps monoclonal selon l'une quelconque des

revendications 1 a 4, qui se fixé à la DPD d'une

manière équivalente A celle d'un anticorps monoclonal selon la revendication 5.

7. Lignée cellulaire d'hybridomes qui produit un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des

revendications 1 à 6.

8. Lignée cellulaire d'hybridomes selon la revendication 7, qui est choisie dans le groupe

constitué par les lignées cellulaires d'hybridomes 2B6-

11-1, 9C7-30-l, 5E6-19-1, 3A5-6-l, 6H5-42-1, 4B9-12-l,

2E2-B3-1-3 et 3B12-Bl-56-1-2.

9. Paire d'anticorps monoclonaux, comprenant un premier anticorps monoclonal selon l'une quelconque des

revendications 1 à 6 et un deuxième anticorps

monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1

& 6, dans laquelle le premier anticorps monoclonal et le deuxième anticorps monoclonal reconnaissent des

épitopes différents.

10. Paire selon la revendication 9, dans laquelle le premier anticorps monoclonal est choisi dans le

groupe constitué par Mab-3AS-6-1, Mab-6HS-42-1 et Mab-

3B12-B1-56-12, et le deuxième anticorps monoclonal est

choisi dans le groupe constitué par Mab-4B9-12-1, Mab-

2E2-B3-1-3, Mab-9C7-30-1, Mab-2B6-11-1 et Mab-SE6-19-1.

11. Paire selon la revendication 10, dans laquelle le premier anticorps monoclonal est Mab-3A5-6-l et le

deuxième anticorps monoclonal est Mab-4B9-12-1.

12. Paire selon la revendication 10, dans laquelle le premier anticorps monoclonal est Mab-3A5-6-1 et le

deuxième anticorps monoclonal est Mab-2E2-B3-1-3.

13. Trousse pour la détection et/ou la détermination de la quantité de dihydropyrimidine 3S déshydrogénase dans un échantillon biologique, qui comprend: - 53 (a) au moins un anticorps monoclonal selon l'une

quelconque des revendications 1 à 6, et

(b) un marqueur pour détecter qualitativement et/ou quantitativement l'immunoconjugud de l'anticorps monoclonal et de dihydropyrimidine déshydrogénase.

14. Trousse selon la revendication 13, qui comprend une paire d'anticorps monoclonaux selon l'une

quelconque des revendications 9 à 11il et un marqueur

pour détecter qualitativement et/ou quantitativement l'immunoconjugué de l'anticorps monoclonal et de

dihydropyrimidine déshydrogénase.

15. Utilisation d'une trousse selon la revendication 13 ou 14, pour détecter et/ou déterminer la quantité de dihydropyrimidine déshydrogénase dans un

échantillon biologique.

16. Dosage immunologique pour détecter et/ou déterminer la quantité de dihydropyrimidine déshydrogénase dans un échantillon biologique, qui comprend: (a) le traitement de l'échantillon avec au moins un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des

revendications 1 à 6, de façon à produire un

immunoconjugué entre cet anticorps et la dihydropyrimidine déshydrogénase, et (b) la détection qualitative ou quantitative dudit

immunoconjugué à l'aide d'un marqueur.

17. Dosage selon la revendication 16, qui est un

dosage par immunoprécipitation.

18. Dosage selon la revendication 16, qui est un

dosage immunoenzymatique selon la méthode ELISA.

19. Méthode pour la détermination de l'état de déficience en DPD d'un patient, qui comprend: (a) le traitement d'un échantillon biologique provenant du patient avec un anticorps monoclonal selon

l'une quelconque des revendications 2 à 6, et

(b) la détection quantitative de l'immunoconjugué de l'anticorps monoclonal et de dihydropyrimidine d6shydrogénase.

20. Méthode pour estimer la sensibilité de S patients souffrant d'un cancer au traitement avec des

médicaments antitumoraux de la série des dérivés du 5-

fluorouracile (5-FU), qui comprend: (a) le traitement d'un échantillon biologique provenant du patient avec un anticorps monoclonal selon

l'une quelconque des revendications 2 & 6, et

(b) la détection quantitative de l'immunoconjugué de l'anticorps monoclonal et de dihydropyrimidine déshydrogénase, de façon à déterminer la quantité de dihydropyrimidine déshydrogénase dans l'échantillon biologique provenant du patient afin d'obtenir une mesure de sensibilité,

21. Méthode pour estimer la sensibilité de patients souffrant d'un cancer au traitement avec des

médicaments antitumoraux de la série des dérivés du 5-

fluorouracile (5-FU), qui comprend: (a) le traitement d'un échantillon biologique provenant du patient avec un anticorps monoclonal selon

l'une quelconque des revendications 2 à 6,

(b) la détection quantitative de l'immunoconjugué de l'anticorps monoclonal et de dihydropyrimidine déshydrogénase, de façon à déterminer la quantité de dihydropyrimidine déshydrogénase dans l'échantillon biologique provenant du patient, (c) la détermination de la quantité de pyrimidine nucléoside phosphorylase dans l'échantillon biologique provenant du patient, et (d) le calcul du rapport entre la quantité de pyrimidine nucléoside phosphorylase et la quantité de dihydropyrimidine déshydrogénase pour obtenir une

mesure de sensibilité.