BRPI0620600A2

BRPI0620600A2 - concentrado de imunoglobulina g (igg) isento de anticorpos anti-a e anti-b e de iggs poli-reativas

Info

Publication number: BRPI0620600A2
Application number: BRPI0620600-0A
Authority: BR
Inventors: Abdessatar Chtourou; Frederic Dhainaut; Philippe Paolantonacci
Original assignee: Lab Francais Du Fractionnement
Priority date: 2005-12-26
Filing date: 2006-12-26
Publication date: 2011-11-16
Also published as: CA2634997A1; EP2345425A3; KR20080098486A; CN101346153A; ES2517540T3; US20090074749A1; EP1968634A2; JP2015091866A; JP5726403B2; BRPI0620600B1; IL231806A; EP2345425A2; JP2009521520A; ES2690664T3; WO2007077365A2; FR2895263B1; DK1968634T3; DK2345425T3; IL192289A; IL231806A0

Abstract

CONCENTRADO DE IMUNOGLOBULINA G (IgG) ISENTO DE ANTICORPOS ANTI-A E ANTI-B E DE IgGs POLI-REATIVAS. A presente invenção se refere a um concentrado de imunoglobulina G para uso terapêutico, no qual os conteúdos respectivos de anticorpos anti-A e anti-B estão de acordo com o resultado negativo do teste indireto de Coombs in vitro. Este concentrado de IgG também possui um conteúdo de IgG poli-reativa entre 0,01% e 0,1%, em particular entre 0,07% e 0,1%, relativo ao conteúdo total de IgG.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "CONCENTRADO DE IMUNOGLOBULINA G (IgG) ISENTO DE ANTICORPOS ANTI-A E ANTI-B E DE IgGs POLI-REATIVAS" .

A presente invenção se refere a um concentrado de imunoglobulina G (IgG) isento de anticorpos anti-A (AcaA) e anti-B (AcaB) e possuindo poli-reatividade fortemente reduzida e a um método para obter os referidos concentrados.

O uso de frações de plasma humano enriquecido em imunoglobulinas (Ig) para o tratamento de várias infecções ou deficiências congênitas ê conhecido desde o desenvolvimento do método de precipitação com etanol de Cohn (Cohn et al. , 1946, J. Am. Chem. Soe. 68, 459; Oncley et al., 1949, J. Am Chem. Soe. 71, 541).

Há uma necessidade crescente de produzir concentrados de Ig altamente purificados, para injeção através da via intravenosa (IgIV), obtidos de plasmas humanos, por exemplo. A estrutura complexa de imunoglobulinas (quatro cadeias polipeptídicas unidas por ligações em ponte de dissulfeto) e a variedade de anticorpos presentes na mistura de plasma de várias centenas de doadores, atualmente são fatores os quais não promovem o desenvolvimento biotecnológico de imunoglobulinas. Embora anticorpos monoclonais sejam produzidos através de engenharia genética, sua estrema especificidade adiciona uma desvantagem para aplicações terapêuticas nas quais a poli-especificidade parece ser uma necessidade.

Adicionalmente, numerosas patologias, de origem auto- imune, por exemplo, são atualmente tratadas com concentrados de IgG, o que levou a um déficit dos mesmos na Europa e nos Estados Unidos em anos recentes.

Métodos para obter imunoglobulinas e, em particular, concentrados de IgG, além de precipitação seletiva das proteínas através de etanol, pode também compreender vários outros tratamentos, tais como precipitação através de polietileno glicol, tratamento com enzima proteolítica controlado... destinados a remover agregados de polímeros de imunoglobulina os quais podem ativar o sistema de complemento com riscos associados de reações anafiláticas. Também, a presença de dímeros em IgGIVs foi correlacionada à queda de tensão arterial in vivo (Bleeker W.K. et al., Blood, 95, 2000, páginas 1856-1861).

Uma via alternativa à precipitação com etanol foi descrita por Steinbuch et al. (Rev. Franç. Et. Clin. et Biol. 1969, XIV, 1054), a qual tem o recurso de precipitação através de ácido octanóico. Esse ácido precipita a maioria das proteínas no plasma e deixa as imunoglobulinas no sobrenadante. Purificação dessas imunoglobulinas é obtida passando através de um permutador de ânions, DEAE-celulose, sob condições as quais não retêm as IgGs. A fração de IgG não-retida é, então, concentrada.

Vários métodos também foram desenvolvidos para aumentar a pureza dos produtos usando técnicas cromatográficas. Menção particular pode ser feita aos pedidos de patente EP 0 703 922 e WO 99/64462, os quais descrevem a associação de pelo menos duas etapas cromatográficas sucessivas, uma através de troca de ânions, a outra através de troca de cátions. A especificidade desses métodos é proporcionada pela propriedade dos permutadores de ânions, por meio do qual eles não retêm imunoglobulinas G, sob condições de cromatografia convencional, mas, ao invés disso, eles fixam a maioria das outras proteínas co-purifiçadas durante as etapas de pré-purificação. Similarmente, o pedido de patente WO 02/092632 pode ser citado, depositado pelo Requerente, o qual divulga o preparo de concentrados de Ig usando uma única etapa de cromatografia sobre um permutador de ânions, conduzida em pH alcalino, para sua retenção sobre o meio cromatográfico.

Contudo, numerosas publicações científicas indicam que a injeção de IgGs obtidas através das técnicas de fracionamento acima pode causar hemólise acidental, algumas vezes grave, em pacientes que sofrem tratamento. Como exemplos, as seguintes publicações podem ser citadas: Buchta C. et al. , Biologicals, 33, 2005, 41-48, Wilson J.R. et al., Muscle & Nerve, 29(9), 1997, 1142-1145, Copelan E.A. et al., Transfusion, 26, 1986, 410-412 e Misbah S.A.

et al., Drug Safety, 9, 1993, 254-262. O estudo dos efeitos sobre o sangue de pacientes com hemólise, realizado utilizando o teste de Coombs direto (teste de Coombs direto - DCT) em particular, mostrou que as células sangüíneas vermelhas são revestidas com imunoglobulinas dirigidas contra antígenos A, B ou D presentes sobre sua superfície, desse modo, causando sua hemólise. Isso é o porquê as IgGs disponíveis no mercado são obtidas de plasmas selecionados para evitar a presença de imunoglobulinas anti-D ou outros anticorpos com maiores titulações de anti-A ou anti-B.

Buchta et al., meneionados acima, consideraram diferentes abordagens para obter uma redução significativa em anticorpos anti-A, originário de doadores do grupo de sangue B e 0 e em anticorpos anti-B derivados de doadores do grupo A e 0, em derivados de plasma tais como IgGs, com vistas à minimização dos riscos de hemólise que estão diretamente correlacionados aos níveis desses anticorpos, quando de tratamento de pacientes com esses derivados de plasma. Notavelmente, foi considerado escolher os doadores, para remover os anticorpos anti-A e anti-B, para produzir derivados de plasma sangüíneo originário de um grupo específico, grupo A e/ou B, e excluir dos lotes aqueles plasmas tendo uma alta titulação em anticorpos anti-A e anti-B. Algumas abordagens são consideradas como sendo não realísticas levando-se em conta o custo ou complexidade das etapas a serem realizadas. É notado que anticorpos anti-A e anti-B são parcialmente removidos durante o fracionamento com etanol mencionado acima.

Uma vez que a necessidade de IgGs está constantemente crescendo, há uma necessidade por reservas crescentemente maiores de doadores os quais, estatisticamente, incluirão números maiores de doadores do grupo O. Como um resultado, derivados de sangue, tais como IgGs, conterão quantidades de anticorpos anti-A e anti-B que são muito altas para sua remoção através de fracionamento convencional.

Essas necessidades crescentes impedem considerar a possível seleção de doadores apenas do grupo AB, de forma a assegurar um baixo teor de anticorpos anti-A e anti-B.

Cada lote de concentrados ou preparados de IgG purificada é controlado com relação aos anticorpos anti-A e anti-B usando o teste 2.6.20 da Farmacopéia Européia (1997), o qual é uma aplicação in vitro do teste de Coombs indireto (teste de Coombs indireto - ICT). O teste ICT consiste da adição, a uma suspensão, de células sangüíneas vermelhas, revestidas com anticorpos anti-A ou anti-B do tipo IgG contidos nos concentrados de IgG, uma solução de anticorpos (antiglobulinas) dirigidos contra motivos de IgG humana. Esses anticorpos se ligam a anticorpos anti-A ou anti-B presos às células sangüíneas vermelhas e, desse modo, causam sua aglutinação através da formação de ligações em ponte entre as IgGs. A análise para detecção de anticorpos anti-A e anti-B ê diretamente inspirado por esse teste convencional em sorologia hematológica (teste de Coombs).

De acordo com a Farmacopéia Européia, IgIVs não devem mostrar qualquer aglutinação de células sangüíneas vermelhas A ou B sob o teste ICT em uma diluição de 1:64, conduzida com uma solução de IgG cuja concentração inicial e reduzida para 30 g/l.

Isso é o porquê amostras de IgG a serem testadas devem ser diluídas para obter uma titulação, isto é, o valor da última diluição a qual não causa mais aglutinação. Resultados negativos do ICT sobre soluções de IgIV cujas diluições são menores do que a diluição de 1:64, segundo a Farmacopéia Européia, indicam um baixo teor de anticorpos anti-A e anti-B, o qual é aceitável. Contudo, mesmo com concentrados de IgG que proporcionam um resultado negativo para o teste prescrito pela Farmacopéia Européia, isto é, aqueles com uma proporção de diluição menor que 1:64, os riscos de reações hemolíticas não podem ser excluídos (Buchta et al., citados acima).

Deve ser notado que as Farmacopéias Americana e Japonesa não fazem menção à necessidade de controlar teores residuais de anticorpos anti-A e anti-B.

Conforme mencionado acima, anticorpos anti-A e anti-B são parcialmente removidos durante o preparo de concentrados de IgG através de fracionamento com etanol, contudo, um teor residual é observado, o qual pode exceder o limite máximo da farmacopéia Européia. Adicionalmente, concentrados preparados segundo o método desenvolvido pelo Requerente e descrito em seu pedido de patente WO 02/092632 têm um maior teor dos mesmos do que aqueles obtidos através de fracionamento com etanol. Purificação adicional dos concentrados de IgG assim obtidos, com relação a anticorpos anti-A e anti-B, portanto, é necessária, uma vez que alguns lotes de concentrados de IgG podem conter teores dos mesmos que são maiores do que o limiar apresentado pela Farmacopéia Européia.

Uma técnica para remover esses anticorpos de concentrados de IgG consiste de purificação através de cromatografia por afinidade, usando imunoadsorventes como meio, do tipo oligossacarídeo, similar aos antígenos A e B dos grupos sangüíneos, os referidos oligossacarídeos sendo particularmente trissacarídeos enxertados sobre uma matriz cromatográfica.

Como exemplo, menção pode ser feita à publicação de Mazid M. A. et al. , J. Appl. Biomater., 3 (1), 1992, 9-15, os quais usam um meio cromatográfico contendo partículas de sílica sobre as quais são enxertados haptenos de oligossacarídeos sintetizados, característicos dos grupos sangüíneos AeBe, em particular, A-trissacarídeos. Também, Hout M.S. et al. (ÂSAIO J, 46(6), 2000, 702-706) descrevem o uso de membranas fibrosas tubulares enxertadas com antígenos anti-A e anti-B específicos para a remoção de anticorpos anti-A e anti-B do sangue total. É também descrito que os referidos meios cromatográficos são muito estáveis, o que limita a liberação desses haptenos individuais nos concentrados de interesse.

O pedido de patente WO 01/27623 descreve um método para obter um plasma não especificado em anticorpos dos grupos sangüíneos AeB, isto é, um plasma adequado para qualquer receptor. Essas especificidades são essencialmente trazidas por imunoglobulinas M (IgM). Não-especificação é obtida passando através de um meio de afinidade experimental para o grupo A, então, através de outro meio de afinidade, também experimental, para õ grupo B. No caso de presença simultânea de anti-A e anti-B (grupo O), é necessária a passagem sucessiva através dos dois suportes de meio.

Uma das características adicionais de concentrados de IgG disponíveis no mercado é sua poli-reatividade. Deve também ser lembrado que anticorpos policlonais, tais como IgGs, normalmente são combinados com um único epítopo (motivo antigênico) de um modo único. Contudo, essa especificidade restrita dos anticorpos pode, algumas vezes, se estender a outros motivos antigênicos e mostrar afinidade por epítopos secundários com ligação mais fraca, todavia, do que pelo motivo nominal. IgGs policlonais podem reagir, em um grau maior ou menor, com estruturas tais como actina, miosina, albumina modificada com trinitrofenila.

A esse respeito, imunoglobulinas intravenosas (IgIV) são preparados de IgGs humanas policlonais contendo:

- anticorpos imunes dirigidos contra antígenos externos e resultantes de um processo de imunização;

- anticorpos naturais que reconhecem proteínas intracelulares, antígenos na membrana da superfície, auto- proteínas em circulação e á região variável de outros anticorpos. Os últimos são denominados anticorpos anti- idiotipo (Kazatchkine M. D. et al., Immunol. Rev., 139, 1994, 79-107). Anticorpos naturais não resultam de imunização deliberada (Coutinho A. et al., Curr. Opin. Immunol., 7, 1995, 812-818) . Eles são poli-reativas pelo fato de que eles expressam afinidades variáveis pelos auto-antígenos (Berneman A. et al. , Eur. J. Immunol., 22, 1992, 625-631 e Lacroix-Desmazes et al., J. Immunol. Methods, 216, 1988, 117-137).

Tratamentos químicos (uréia a 6M, tiocianato de sódio a 1,3M e tratamento com ácido, pH = 2,0) de IgIVs podem aumentar a atividade poli-reativa desses imunoglobulinas policlonais (Bouvet J.P. et al., J. Autoimmun., 16(2), 2001, 163-172). Contudo, nenhum efeito benéfico foi ainda demonstrado em pacientes tratados com as referidas imunoglobulinas.

Para resumir, a atividade poli-reativa dos anticorpos presentes em um preparo de IgIV pode ser em virtude de:

- a presença de anticorpos naturais contidos em cada plasma individual,

- a presença de anticorpos anti-idiotípicos contidos em cada plasma individual,

- a poli-reatividade dos anticorpos gerados pelo método de produção. Portanto, alguns autores consideram que a poli- reatividade é uma propriedade intrínseca de IgGs as quais estão, portanto, naturalmente presentes no corpo humano.

Outros demonstram que um método para purificar IgGs monoclonais ou policlonais pode revelar poli-reatividade a qual é indetectável antes da purificação. De fato, métodos para produzir IgGs a partir de plasma também geram uma poli-reatividade a qual se traduz como "estresse oxidativo" e carbonilação parcial de IgGs durante produção.

Isso é confirmado por Bouvet J.P et al. , Journal of Autoimmunity, 16, 2001, páginas 163-172, para os quais IgGs policlonais se tornam altamente poli-reativas após tratamento com uréia em particular. Também é indicado nesse documento que parte da eficácia de IgGs em uso clínico é atribuída à sua poli-reatividade.

Segue que a poli-reatividade desses concentrados de IgG pode, portanto, ser explicada pela presença de IgGs poli- reativas naturais e IgGs poli-reativas obtidas através de métodos de purificação usuais e somando 0,5 a 1% de todas as IgGs polivalentes. 0 tratamento de pacientes com preparados de IgG pode requerer a administração de altas doses de até 1 a 2 g/kg. Essas dosagens levam ao tratamento a curto prazo, por exemplo, em um dia, com quantidades de 7 a 10 vezes maior do que as quantidades de IgG fisiológicas do receptor, Como um resultado, esse nível de IgGs poli- reativas gerado pelo método de produção em concentrados de IgG pode causar efeitos colaterais adversos, tais como febre, náusea ou dor de cabeça.

Portanto, uma distinção deve ser feita entre a poli- reatividade de anticorpos em virtude de anticorpos naturais e anti-idiotipo os quais possuem vantagens, conforme mostrado pelo Requerente em seu pedido de patente EP 1 05 9 088, a partir da poli-reatividade dos anticorpos gerados através do método de produção. Poi mostrado pelo Requerente no pedido de patente EP 1 05 9 088 que frações de IgGs poli- reativas naturalmente contidas no plasma, isoladas de IgIVs polivalentes humanas, podem ser usadas vantajosamente para tratar determinadas doenças inflamatórias, tal como poliartrite reumatóide, levando-se em conta a menor dosagem requerida para essa fração.

Portanto, para evitar reações adversas, tanto em relação à hemólise de células sangüíneas vermelhas e quanto em relação às reações colaterais as quais podem ocorrer com administração massiva de IgGs durante um curso de tratamento, parece haver uma necessidade por concentrados de IgG para uso terapêutico, em particular para injeção intravenosa, significativamente sem anticorpos anti-A e anti-B e cuja poli-reatividade gerada pelo método de produção é, de preferência, grandemente reduzida comparada com concentrados de IgG atualmente disponíveis no mercado, ao mesmo tempo em que tem eficácia pelo menos idêntica com relação à imunoterapia.

Portanto, a invenção se refere a um concentrado de imunoglobulinas G para uso terapêutico caracterizado pelo fato de que seus respectivos teores de anticorpos anti-A e anti-B proporcionam um resultado negativo com um teste de Coombs indireto in vitro.

A invenção também se refere a um método para produzir imunoglobulinas G com as quais é possível não gerar esses anticorpos poli-reativos os quais podem ser menos bem tolerados em relação aos anticorpos naturais e anti- idiotipo. Levando isso em conta, as IgIVs obtidas com o método têm uma menor poli-reatividade do que as outras IgIVs testadas.

Sob a invenção, as ígGs desses concentrados são, vantajosamente, IgGs policlonais obtidas de plasma sangüíneo ou de uma fração de plasma humano já enriquecida com IgGs. Os concentrados de IgG para uso terapêutico têm concentrações de IgG que são freqüentemente usadas no momento, de preferência entre 50 e 100 g/l. Esses concentrados são destinados a uso clínico e podem, em particular, ser injetados através da via intravenosa. Para essa finalidade, eles devem ser viralmente seguros e podem, opcionalmente, conter excipientes tais como estabilizantes compatíveis com seu uso clínico.

O Requerente descobriu que é possível proporcionar os referidos concentrados de IgG possuindo teores de anticorpo anti-A e anti-B que são muito menores do que aqueles encontrados em concentrados de IgG padrões, isto é, aqueles obtidos através de fracionamento com etanol e/ou usando técnicas de purificação associadas à cromatografia, conforme mencionado acima, e os quais não sofreram tratamento adicional para remover os anticorpos em consideração. Também, seus teores estão bem abaixo dos liminares aceitos pela Farmaeopéia Européia, a qual limita muito significativamente os riscos de hemólise em alguns pacientes que recebem tratamento. Quando os concentrados de IgG da invenção são enviados a testes destinados a avaliar as quantidades de anticorpos anti-A e anti-B, é observado que os resultados de testes de aglutinação in vitro de células sangüíneas vermelhas A, B e/ou AB na presença de anticorpos anti-IgG humana são sistematicamente negativos, notavelmente na concentração inicial de 3 0 g/l estabelecida pelo método da Farmaeopéia Européia. A condução do teste de Coombs indireto, definido anteriormente, com concentrados de IgG da invenção, portanto, leva a resultados sistematicamente negativos mesmo com amostras de IgG como tal, isto é, não diluídas. Portanto, parece que o teor desses anticorpos anti-A e anti-B nesses concentrados já não é detectável pelo teste ICT.

Se o nível de anticorpos anti-A e anti-B é muito baixo nos concentrados de IgG, o teste IAT não pode mais ser aplicado, ainda mais sob as condições da Farmacopéia Européia, uma vez que as reações de aglutinação das células sangüíneas vermelhas não ocorrem mais, mesmo com a adição de anticorpos anti-IgG humana, uma vez que a densidade de anticorpos anti-A e anti-B é muito fraca para permitir que ligações em ponte sejam ajustadas entre as células sangüíneas vermelhas através de ligação de anticorpos anti- A e anti-B fixadas às células sangüíneas vermelhas e os anticorpos anti-IgG humana.

É possível, contudo, verificar a presença desses anticorpos anti-A e/ou anti-fí em concentração muito baixa, causando imuno-hemólise das células sangüíneas vermelhas as quais fixaram esses anticorpos e através de medição de depleção comparado com um concentrado convencional o qual não sofreu tratamento para remover anticorpos anti-A e anti-B. A imuno-hemólise é uma reação imunológica específica a qual ocorre quando o anticorpo é preso ao seu alvo na presença de fatores de complemento. Ativação da atividade de complemento leva à liberação de perforinas as quais perfuram a membrana da célula sangüínea vermelha, permitindo que a hemoglobina escape. Tudo que é requerido subseqüentemente é usar um método sensível, por exemplo, com rastreadores radioativos (veja abaixo) para medir a quantidade de hemoglobina liberada, proporcional à quantidade de anticorpos anti-A e anti-B presentes.

O Requerente demonstrou, de uma maneira particularmente vantajosa, que o concentrado de IgG da invenção tem um teor de anticorpos anti-A de não mais do que 23 ng/mg de IgG, em particular entre 19 e 23 ng/mg de IgG e um teor de anticorpos anti-B de não mais do que 2 0 ng/mg de IgG, em particular entre 12 e 20 ng/mg de IgG.

Vantajosamente, o Requerente descobriu que também ê possível proporcionar os referidos concentrados de IgG com um teor muito baixo de IgGs poli-reativas, em particular aquelas geradas pelo método de produção, desse modo, conferindo um caráter próximo do não poli-reativo a esses concentrados, os quais são tão eficientes para o tratamento de imunoterapias do que os concentrados de IgG da técnica anterior. Essa notável ausência, nessas IgGs, de um caráter de poli-reatividade em virtude do método de produção, reduz substancialmente os riscos de efeitos colaterais os quais podem surgir subseqüentes a tratamentos requerendo altas dosagens.

Também é possível, vantajosamente, corrigir efeitos adversos que surgem da presença de IgGs poli-reativas no concentrados de IgG em virtude do método de produção, essa presença gerada, em particular, através de "estresse oxidativo" e carbonilação durante métodos de purificação.

De preferência, o teor residual de IgGs poli-reativas está compreendido entre 0,01% e 0,1%, em particular entre 0,07 e 0,1%. Sob a invenção, por teor de IgGs poli-reativas entenda-se um percentual molar ou em peso. Esse teor é determinado usando métodos descritos pelo Requerente no pedido de patente 1 059 088.

Os concentrados de IgG da invenção são, portanto, definidos por uma notável ausência de anticorpos anti-A e anti-B nos ingredientes ativos, os quais estão direcionados contra os epítopos presentes sobre as células sangüíneas vermelhas.

Os concentrados de IgG podem estar na forma líquida ou liofilizada, na presença de estabilizantes adequados e podem ser armazenados para uso posterior. Esses estabilizantes são, vantajosamente, aqueles desenvolvidos pelo Requerente em seu pedido de patente WO 2004/091656 A2, isto é, uma mistura de um álcool de açúcar, de preferência manitol, sorbitol ou seus isômeros, de glicina e de um emulsif icante não-iônico, tal como Tween® 80, Tween® 20, Triton® XlOO ou Pluronic® F68, todos os três compostos sendo farmaceuticamente aceitáveis.

As concentrações da formulação foram determinadas pelo Requerente para estabilizar formas líquidas e/ou Iliofilizadas.

De preferência, as concentrações finais de manitol nos concentrados repousam entre 30 g/l e 50 g/l, aquela do emulsif icante entre 20 e 50 ppm e aquela de glicina entre 7 g/l e 10 g/l. As concentrações desses compostos representam as concentrações finais nos concentrados de IgG.

Os referidos concentrados de IgG, para uso terapêutico, podem, em particular, ser injetados através da via intravenosa conforme indiciado anteriormente. Para essa finalidade, os concentrados de IgG da invenção devem ser viralmente seguros utilizando um tratamento com solvente- emulsificante convencional, por exemplo, conhecidos na técnica, por exemplo, usando uma mistura de Tween® 80/TnBP ou Triton® X 100/TnBP e/ou etapas de filtração para remoção opcional de vírus e/ou outras macromoléculas as quais podem não ter sido removidas através do tratamento viricida com solvente-emulsificante, por exemplo, o prion - o agente responsável pela encefalopatia espongiforme transmissível. A invenção também se refere a um método para obter um concentrado de IgG tal como mencionado acima, compreendendo as seguintes etapas:

a) preparo de um concentrado de IgG através de fracionamento com etanol e/ou separação cromatográfica, associada a uma etapa de inativação viral,

b) cromatografia por imunoafinidade através da percolação do referido concentrado de IgG através de uma mistura de suportes de meio cujas matrizes são enxertadas com grupos oligossacarídeos os quais têm similaridade antigênica com grupos sangüíneos AeB, e

c) filtração para remover vírus e/ou partículas de um tamanho maior do que 20 nm.

Descobriu-se, de maneira extraordinária pelo Requerente, que não apenas esse método pode ser vantajosamente implementado em uma escala industrial, mas também que, através de combinação das etapas que levam ao preparo de concentrados de IgG com uma etapa específica para remover anticorpos anti-A e anti-B, é possível obter um concentrado de IgG da invenção, para uso terapêutico, o qual também, de preferência, compreende um teor de IgGs poli-reativas que é menos do que 0,1% com relação ao teor de IgG total. Adicionalmente, no referido concentrado, o teor de anticorpos anti-A e anti-B indesejados está bem abaixo do limite mínimo do teste descrito na Farmacopéia Européia, mesmo dando um resultado negativo para o teste ICT com as referidas amostras não diluídas.

De preferência, a etapa a) do método pode, em si, ser um método para obter concentrados de IgG tais como aqueles previamente mencionados. Ele se refere ao fracionamento com etanol desenvolvido por Cohn et al. ou separação cromatográfica, tal como descrito, por exemplo, no EP 0 703 922 e WO 99/64462. Preferência particular ê dada aos métodos desenvolvidos pelo Requerente nos pedidos de patente WO 94/29334 e WO 02/092632 Al e, mais particularmente, àquele descrito no WO 02/092632 Al. Nesse caso, a etapa a) do método da invenção compreende a pré- purificação através da precipitação de lipídeos contaminantes do plasma sangüíneo ou de uma fração enriquecida em IgG de plasma sangüíneo, cromatografia simples sobre uma resina de troca de ânions conduzida em pH alcalino, eluição seletiva das IgGs em uma etapa usando um tampão adequado em um pH compreendido entre 4 e 7.

A etapa a) do método compreende tratamento de inativação viral, de preferência usando um solvente- emulsificante conforme descrito por Horowitz na patente US 4764 369. Isso é criteriosamente realizado antes de a) ou, quando aplicável, antes da etapa cromatográfica subseqüente realizada em particular para remover os resíduos químicos desse tratamento.

A fração de IgG coletada já está suficientemente concentrada e pode, então, sofrer etapas de concentração adicionais através de ultrafiltração e filtração esterilizante.

Esse concentrado é, então, submetido à cromatografia por imunoafinidade sobre uma mistura de dois suportes de meio enxertados com grupos antigênicos tendo similaridade com grupos sangüíneos AeB, de preferência sobre uma coluna carregada com a referida mistura de meio.

De preferência, o meio cromatográfico consiste de uma matriz polimérica reticulada natural, do tipo agarose, sobre a qual espaçadores ôu braços de acoplamento são enxertados os quais, por sua vez, são enxertados com oligossacarídeos, esses sendo vantajosamente trissacarídeos correspondendo aos epítopos dos grupos sangüíneos AeB. Em particular, resultados muito bons são obtidos usando o referido meio, cujos trissacarídeos, correspondendo ao epítopo do grupo sangüíneo A, têm a estrutura N- acetilgalactosamina (GalNAc) - Galactose (Gal) - Fucose (Fuc) e aqueles correspondendo ao epítopo do grupo sangüíneo B têm a estrutura Galactose-Galactose-Fucose. 0 referido meio, de modo altamente vantajoso, é um gel ou resina comercialmente disponível sob a marca comercial GLYCOSORB ABO® da Glycorex Transplantation S/A (Suécia).

À título de exemplo, se esse meio é usado, o trissacarídeo correspondendo ao epítopo do grupo sangüíneo

A tem a seguinte estrutura:

<figure>figure see original document page 23</figure>

N-acetilgalactosamina (Ga1NAc)

Galactose (Ga1) Fucose (Fuc)

Por exemplo, se esse meio é usado, o trissacarídeo correspondendo ao epítopo do grupo sangüíneo B tem a seguinte estrutura:

<formula>formula see original document page 24</formula>

Vantajosamente, a mistura de meio enxertada com grupos antigênicos similares ao grupo sangüíneo A e grupo sangüíneo B tem uma proporção respectiva compreendida entre 25/75 e 75/25 (v/v). É eficazmente possível ajustar a proporção dos dois suportes de meio na coluna para a população de doadores de acordo com a distribuição de seus grupos sangüíneos. Para uso comum, a coluna é, de preferência, carregada com uma mistura a 50/50 (v/v) de cada meio específico mencionado acima. Colunas de análise de 15 a 25 cm de comprimento podem ser usadas e com 0,5 a 1 cm de diâmetro. Para aplicação em uma escala piloto, colunas com um comprimento de 40 a 60 cm e largura de 40 a 60 mm podem ser usadas. Nesse caso, é possível carregar a coluna com 600 ml de meio de imunoafinidade.

O referido meio é armazenado em NaOH a IM entre dois ciclos de uso. Antes do uso, ele é lavado com água.

A coluna de cromatografia por imunoafinidade é, então, carregada com concentrado de IgG, de preferência para uma proporção de 0,2 a 4 litros, em particular 1 ou 2 litros, por mililitro de meio. A especificidade do referido meio não requer acondicionamento prévio da fração de IgG, isto é, qualquer fração ou concentrado de IgG obtido através de métodos de fracionamento de plasma conhecidos na técnica anterior é adequado.

Percolação do concentrado não requer qualquer mecanismo de eluição. Portanto, a despeito da maneira pela qual o concentrado de IgG é obtido, ele é percolado através da coluna, opcionalmente usando uma bomba. Essa percolação permite retenção dos anticorpos anti-A e anti-B e das IgGs poli-reativas. Vantajosamente, a coluna é, então, lavada com água para coletar as IgGs ainda presentes no volume morto da coluna.

Após percolação do concentrado de IgG, uma fração de IgG é obtida sem anticorpos anti-A e anti-B e de IgGs poli- reativas derivadas do método de produção. Os anticorpos anti-A e anti-B são retidos sobre seu motivo antigênico do meio cromatográfico o qual modifica sua conformação. Portanto, as IgGs poli-reativas geradas durante o método de produção são também retidas sobre os locais expostos através dessa alteração conformacional. A afinidade dessas IgGs poli-reativas retidas secundariamente é muito menor do que aquela dos anticorpos anti-A e anti-B. Sua eluição é possível através de fracionamento, após passagem das IgGsi através de uso de um tampão de eluição contendo, por exemplo, um sal de metal alcalino terroso tendo uma concentração de entre 0,1 e 1,5M em um pH de 3-8,6.

Após a etapa b), o método pode compreender etapas de concentração através de ultrafiltração e filtração esterilizante.

A coluna cromatográfica e o meio são, então, lavados com uma solução ácida, tal como glicina-HCl, pH de 2,8, para desabsorção dos anticorpos anti-A e anti-B retidos sobre o meio. Esse meio é, então, enxaguado com água e tratado com uma solução de NaOH a IM.

O concentrado de IgG altamente isento de anticorpos anti-A e anti-B e de IgGs poli-reativas é, então, submetido à filtração para remover quaisquer vírus os quais possam ter resistido ao tratamento com solvente-emulsificante e/ou remover outras partículas de tamanho maior que 20 nm, tais como prions, polímeros de IgG gerados durante etapas de produção, lipopolissacarídeos micelares, ácidos nucléicos agregados e proteínas. O referido tratamento é, vantajosamente, uma nanofiltração implementada com filtros de porosidade decrescente de 100 a 15 nm, em particular três filtros dispostos em série e com limiares de retenção decrescentes de 100, 50 e 20 nm.

Após a etapa c) , o método pode compreender uma etapa adicional para adicionar estabilizantes primeiramente para assegurar a estabilidade dos concentrados de IgG durante seu armazenamento e, em segundo, para permitir liofilização para impedir a desnaturação das IgGs nas várias fases associadas ao mesmo. De preferência, uma única formulação de estabilização é adicionada, a qual é farmaceuticamente aceitável, indo de encontro ao objetivo de estabilização das duas formas de armazenamento consideradas das IgGs, isto é, forma líquida ou forma liofilizada, e da manutenção e mesmo aperfeiçoamento da eficácia terapêutica dessas IgGs, conforme descrito no pedido de patente WO 2004/091656 A2.

De acordo com outras modalidades, coleta seletiva de outras imunoglobulinas também ê possível, conforme descrito na patente WO 02/092632 Al.

Os concentrados de IgG eão opcionalmente submetidos a uma subseqüente etapa de concentração através de ultrafiltração, seguida por filtração esterilizante, e podem ser armazenados em garrafas, de preferência em temperaturas na região de 4°C.

Conforme amplamente explicado acima, os concentrados de IgG da invenção têm teores de anticorpo anti-A e anti-B que estão bem abaixo dos limiares aceitos pela Farmacopéia Européia. Portanto, o método de análise 2.6.20 (1997) descrito na mesma pode provar ser insuficientemente sensível para detectar os anticorpos sob consideração, presentes em níveis muito baixos nos concentrados de IgG da invenção. Portanto, é essencial desenvolver métodos de análise para esses anticorpos requerendo um limiar de detecção menor do que aquele do teste ICT a Farmacopéia Européia aplicado à detecção de anticorpos anti-A e anti-B.

O referido método de. análise para anticorpos anti-A e/ou anti-B nos concentrados de IgG da invenção compreende as etapas consistindo de:

a) preparo e calibração de uma suspensão de células vermelhas dos grupos sangüíneos A, B e/ou O Rhesus+,

b) preparo de soluções de anticorpos anti-D monoclonais sobre uma faixa de concentrações de 0 a 2 00 ng/ml em um tampão biologicamente aceitável,

c) contato das referidas células sangüíneas vermelhas com amostras de soluções de IgG ou com as soluções de anticorpos anti-D monoclonais e incubação das misturas de células sangüíneas vermelhas assim obtidas durante um tempo predeterminado,

d) adição, a cada mistura de células sangüíneas vermelhas, de um fragmento de anticorpo anti-IgG humana F(ab')2 marcado com um fluorocroma e incubação das referidas células sangüíneas vermelhas,

e) sujeição de cada mistura de células sangüíneas vermelhas obtidas na etapa d) à citometria de fluxo,

f) determinação do teor de anticorpos anti-A e/ou anti- B nos concentrados de IgG.

Uma modalidade do referido método para determinar o teor de anticorpos anti-A e/ou anti-B pode compreender o preparo de uma suspensão a 1% v/v de células vermelhas do grupo sangüíneo A, B e/ou 0 em um tampão de PBS, com pH entre 7,0 e 7,4, contendo de 0,8 a 1,5% em peso de albumina de soro bovino, BSA. As células sangüíneas vermelhas da suspensão são contadas em um dispositivo de citometria de fluxo usual, cujo funcionamento é conhecido por aqueles habilitados na técnica, então, a suspensão é calibrada a 37 a 43,10^6 corpúsculos vermelhos/ml de suspensão.

Soluções de anticorpos anti-D monoclonais são preparadas, cujas concentrações oscilam de 0 a 200 ng/ml de tampão, de preferência um tampão de PBS com pH entre 7,0 e 7,4, opcionalmente contendo de 0,8 a 1,5% em peso de albumina de soro bovino, BSA. Cada solução assim preparada é analisada através de absorciometria para determinar seu coeficiente de extinção molar (ε).

Os concentrados de IgG da invenção são, então, ajustados para uma concentração na faixa de valores de 1 a 5 mg/ml, de preferência 1 mg/ml, usando um tampão de PBS com pH entre 7,0 e 7,4, contendo 0,8 a 1,5% em peso de albumina de soro bovino, BSA.

Um volume de 50 a 100 μl da suspensão de células vermelhas de cada grupo sangüíneo é colocado em cada poço de uma microplaca, por exemplo, uma microplaca com 96 poços, seguido por 50 a 100 μl de solução de IgG nessa suspensão de células sangüíneas vermelhas ou 50 a 100 μl de soluções de anticorpo anti-D nessa suspensão de células sangüíneas vermelhas.

O todo é deixado incubar durante um tempo compreendido entre lh30 e 2h30, em particular durante 2h em temperaturas usualmente oscilando entre 30 e 40°C, de preferência 37°C.

As diferentes misturas de células sangüíneas vermelhas assim obtidas são, então, de preferência, lavadas com o tampão de PBS contendo o BSA precedente e são centrifugadas; então, a cada mistura de células sangüíneas vermelhas contidas em uma placa com micropoços, são adicionados de 50 a 100 μΐ de anticorpo anti-IgG humana de cabra F(ab'2) marcados com um fluorocroma, por exemplo, ficoeritrina, presente no tampão de PBS e BSA anteriormente definido.

O todo é deixado incubar em torno de 20 a 30 minutos no escuro.

As diferentes misturas de células sangüíneas vermelhas assim obtidas são, então, lavadas e submetidas à citometria de fluxo usando qualquer aparelho adequado disponível no mercado contendo um dispositivo para detectar fluorescência dos compostos analisados.

A intensidade média de fluorescência (MFI) é determinada com relação à concentração de anticorpos anti-D monoclonais, e a equação de regressão linear é obtida usando o software Excel. Então, para cada amostra, a concentração de anticorpo anti-D equivalente é obtida usando a equação de regressão linear. Uma vez que lotes triplos das amostras são analisados, a concentração média é determinada e o coeficiente de variação é calculado usando o software Excel.

O teor de anticorpos afiti-A e anti-B nos concentrados de IgG da invenção podem ser deduzidos dos mesmos, o que é vantajosamente o teor fornecido acima.

De preferência, um método de análise para os anticorpos anti-A e anti-B nos concentrados de IgG acima é conduzido através de citometria de fluxo adaptado ao contexto da invenção, cujo princípio é baseado no uso de células vermelhas humanas do grupo sangüíneo A ou B, de acordo com a determinação específica desejada de teor de anticorpo anti-A e anti-B, usando detecção de um sinal de fluorescência proporcional ao teor desses anticorpos.

O referido método de análise compreende as etapas consistindo de:

a) preparo e calibração de uma suspensão de células vermelhas do grupo sangüíneo A ou B7

b) contato das referidas células sangüíneas vermelhas com amostras diluídas de soluções de IgG e incubação da mistura obtida durante um período de tempo predeterminado,

c) incubação das referidas células sangüíneas vermelhas na presença de um anticorpo anti-IgG marcado com um fluorocroma e

d) sujeição da suspensão das células sangüíneas vermelhas obtidas na etapa c) à citometria de fluxo.

Uma suspensão a 1% (v/v) de células vermelhas preparada do grupo sangüíneo A ou B em tampão de PBS, com pH de entre 7,0 e 7,4, contendo de 0/8 a 1,5% em peso de albumina de soro bovino, BSA. As células sangüíneas vermelhas da suspensão são contadas em um dispositivo de citometria de fluxo usual, cujo funcionamento é conhecido por aqueles habilitados na técnica, e a suspensão é calibrada a 37 a 43,10"6 células sangüíneas vermelhas/ml de suspensão.

Um volume de 50 a 100 μl de suspensão é colocado em cada poço de uma microplaca com 96 poços, seguido por 50 a 100 μl de diferentes soluções de IgG diluídas em incrementos de dois a dois a partir de uma solução de 30 g/l até que uma solução de IgG de 0,234 g/l seja obtida.

O todo é deixado incubar durante entre lh3 0 e 2h3 0, em particular 2h, em uma temperatura usualmente oscilando de 30 a 40°C, de preferência 37°C.

As células sangüíneas vermelhas são, então, lavadas com o tampão de PBS contendo o BSA precedente e são centrifugadas, então, a cada 50 a 100 μl de anticorpo anti- IgG humana de cabra F(ab')2 adicionado, marcado com um fluorocroma, tal como ficoeritrina.

O todo (etapa c)) é incubado durante cerca de 20-30 min longe da luz.

A suspensão obtida é, então, lavada e submetida à citometria de fluxo usando qualquer aparelho adequado disponível no mercado, compreendendo um dispositivo de detecção de fluorescência para os compostos analisados.

Por exemplo, os teores de anticorpos anti-A e anti-B de três concentrados de IgG denominados BI, B2 e B3, respectivamente preparados através de fracionamento com etanol segundo o método de Cohn (citado acima) (Bl), de acordo com o pedido de patente WO 02/092632 (B2) e de acordo com o pedido de patente WO 02/092632 seguido por cromatografia por imunoafinidade (B3) para eliminação de anticorpos anti-A e anti-B e são indicados na Tabela 1 abaixo. Os resultados são fornecidos com relação à titulação de controle de anticorpos anti-A e anti-B na amostra Bl cujo teor desses anticorpos foi arbitrariamente ajustada em 1 como referência. Tabela 1:

<table>table see original document page 34</column></row><table>

Os resultados nessa tabela mostram primeiramente que os teores de anticorpos anti-A e anti-B dos concentrados de IgG (Bl) preparados segundo o método de Cohn, contêm cerca de quatro vezes menos do que os concentrados de IgG (B2) preparados seguindo o método descrito no WO 02/092632. Além disso, o subseqüente tratamento desses concentrados de IgG sobre colunas de imunoafinidade específicas reduz a titulação de anticorpos anti-A em um fator próximo de 5, e de anticorpos anti-B em um fator próximo de 7 (B3).

Outro método para determinar o teor de anticorpos anti- A e anti-B o qual pode ser vantajosamente aplicado consiste de lise in vítro com o complemento, conhecido por aqueles habilitados na técnica, mas o qual foi especificamente projetado para as necessidades da invenção.

O referido método de análise compreende as etapas consistindo de:

a) radio-marcação de uma suspensão de células sangüíneas vermelhas tratadas com papaína escolhidas dentre os grupos sangüíneos A, B, AB e O, previamente contadas, usando um marcador radioativo adequado,

b) contato das células sangüíneas vermelhas radio- marcadas com amostras de um volume predeterminado de concentrados de IgG,

c) adição de um volume idêntico ao volume na etapa b) de soro normal do grupo sangüíneo AB,

d) incubação da mistura obtida na etapa c) durante um tempo predeterminado, e

e) medição da radioatividade da solução incubada obtida. Uma suspensão a 1% (v/v) de células sangüíneas vermelhas tratadas com papaína é preparada do grupo sangüíneo A, B, AB ou 0, a qual é, então, contada em uma célula Malassez para obter 10"6 células sangüíneas vermelhas. 100 μCi de 51Cr (1 volume por 1 volume de células sangüíneas vermelhas) são adicionados. O todo é incubado durante entre 1 e 2 horas e as células sangüíneas vermelhas radio-marcadas são, então, lavadas entre 4 e 6 vezes.

As células sangüíneas vermelhas radio-marcadas são, então, postas em contato com amostras de concentrados de IgG em uma concentração, de preferência, entre 1 e 3 mg/ml, em particular 1,2 mg/ml por 4-6,IO6 células sangüíneas vermelhas radio-marcadas, em um volume de 10 0 μΐ, por exemplo.

Um volume idêntico ao volume precedente, por exemplo, 100 μl de soro normal do grupo sangüíneo AB é, então, adicionado à mistura precedente para fornecer os diferentes fatores de complemento.

A mistura de reação obtida é, então, incubada, de preferência durante um tempo compreendido entre 3 a 5h, em particular 4h, em uma temperatura usualmente compreendida entre 30 e 40°C, de preferência 37°C. A mistura de reação é, então, de preferência, centrifugada e a radioatividade da solução incubada é medida usando dispositivos adequados comercialmente disponíveis. A radioatividade medida da solução é proporcional à extensão de hemólise das células sangüíneas vermelhas tratadas e, portanto, ao teor de anticorpos anti- A e anti-B.

À título de exemplo, a extensão de hemólise obtida para as células vermelhas dos grupos sangüíneos A, B e AB, considerando um concentrado de IgG da invenção (B3) e um concentrados de IgG da técnica anterior (Cl) tendo os menores níveis de hemólise dentre todos os concentrados disponíveis no mercado, são indicadas na Tabela 2 a seguir.

Tabela 2:

<table>table see original document page 37</column></row><table>

Os exemplos a seguir ilustram modalidades da presente invenção, sem limitar, contudo, seu escopo.

EXEMPLO 1

Uma amostra de 4 0 g/l de concentrado de IgG (B2) é obtida segundo o método descrito no WO 02/092632.

Uma coluna de cromatografia de 50 cm de comprimento e 44 mm de diâmetro é carregada com uma mistura a 50/50 (v/v) de meio GLYCOSORB ABO® enxertado com trissacarídeos correspondendo aos epítopos do grupo sangüíneo A e do grupo sangüíneo B e é, então, submetida a uma etapa de lavagem prévia em 1200 ml de água.

O concentrado de IgG B2 é injetado na proporção de 0,2 l/ml de meio usando uma bomba. Uma vez que esse volume tenha percolado através da coluna, a coluna.é lavada com um volume mínimo de água para um preparado injetável (IP) para coletar as IgGs presentes no volume morto da coluna.

O concentrado de IgG B3 é coletado em torno de 40 g/l sem anticorpos anti-A e anti-B e de IgGs poli-reativas o qual é, então, submetido à ultrafiltração para levar o concentrado para 60 g/l e nanofiltração para remover vírus sobre três filtros dispostos em série e tendo limiares de retenção decrescentes de 100, 50 e 20 nm.

Os excipientes de estabilização consistindo de uma mistura de glicina (7 g/l), manitol (30 g/l) e Tween 80® a 20 ppm são dissolvidos no concentrado de IgG a 60 g/l e a concentração de IgG é ajustada para 50 g/l usando água PI, então, o concentrado é submetido à filtração estéril e dividido em garrafas. EXEMPLO 2: Quantificação de anti-A/Bs em IgIVs

1) Princípio da análise

1-1) Preparo de células sangüíneas vermelhas humanas

As suspensões de células sangüíneas vermelhas do grupo sangüíneo A Rhesus+, B Rhesus+ ou 0 Rhesus+ são normalizadas para uma concentração de 40 χ 10^6 células sangüíneas verme lhas/ml em tampão de PBS + BSA a 1% em um pH = 7,4.

1-2) Preparo da faixa anti-D monoclonal

Um preparado de anti-D monoclonal (denominado R297) é analisado com relação à Densidade Óptica (OD) a 280 nm contra seu tampão de PBS com pH de 7,4. O coeficiente de extinção molar (ε) da proteína é calculado com relação à sua composição em diferentes aminoácidos e a concentração (C) em anti-D monoclonal é obtida aplicando a fórmula:

C = 0D/E1, na qual 1 = largura do vaso para conduzir a medição de OD.

Uma faixa de 0 a 200 ng/ml de anticorpos anti-D monoclonais é produzida em 12 pontos (200; 15 0; 100; 75; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,13; 1,56; 0,78 e 0 ng/ml).

1-3) Preparo de soluções de ímunoglobulina

Diferentes imunoglobulinas intravenosas disponíveis no mercado foram testadas. As Características básicas dessas imunoglobulinas são detalhadas na tabela abaixo: <table>table see original document page 40</column></row><table>

* segundo o método descrito no WO 02/092632, seguido pela etapa de imunoafinidade descrita no Exemplo 1.

** obtida segundo o método descrito no WO 02/092632 sem a etapa de imunoafinidade descrita no Exemplo 1.

Os diferentes preparados de imunoglobulina foram ajustados para uma concentração de 1 mg/ml usando um tampão de PBS + BSA a 1% com um pH de 7,4.

1-4) Sensibilização de células sangüíneas vermelhas

Em uma microplaca de fundo redondo, o seguinte foi depositado nos poços:

- 50 μl da suspensão de células sangüíneas vermelhas A Rhesus+, B Rhesus+ ou O Rhesus + , com 40 χ 10^6 células sangüíneas vermelhas/ml,

- 50 μl da faixa anti-D ou 50 μΐ das amostras (IgIV) a serem analisadas.

As amostras a serem analisadas são depositadas em lotes triplos.

As placas são, então, incubadas 2 horas a 3 7 0C sob agitação.

1-5) Lavagens

As placas são centrifugadas 1 minuto a 770 g. O sobrenadante é descartado através de inversão, então, 200 μl de PBS + BSA a 1% são adicionados a cada poço. A operação é repetida 3 vezes.

1-6) Adição de conjugado e lavagens

Um F(ab'2) anti-IgG humana de cabra (Fc-específico) marcado com ficoeritrina (PE) (Beckmann Coulter, Ref: PN IM0550) é diluído para 1/20° em tampão de PBS + BSA a 1%, pH de 7,4, então, 50 μΐ da solução são depositados em cada poço. A placa é, então, incubada 20 a 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. Três lavagens sucessivas são realizadas conforme descrito sob o parágrafo 1-5.

1-7) Leitura da citometria de fluxo

As suspensões de células sangüíneas vermelhas são lidas no citômetro de fluxo (Beckmann Coulter FC500) usando um programa adequado. Leitura é conduzida sobre 50 000 eventos e o aparelho calcula automaticamente a intensidade média de fluorescência (MFI) de cada ponto ou amostra. 1-8) Interpretação de resultados

A MFI é obtida com relação à concentração do anticorpo anti-D monoclonal e a equação de regressão linear ê obtida usando o software Excel. Então, para cada amostra, a concentração em anticorpos anti-D equivalentes é obtida usando a equação de regressão linear. Uma vez que as amostras foram analisadas em triplicata, a concentração média é determinada e o coeficiente de variação (CV) é calculado usando o software Excel.

2) Resultados

2-1) Concentração de anticorpos anti-A

<table>table see original document page 42</column></row><table> <table>table see original document page 43</column></row><table>

ns = não significativo

2-2) Concentração de anticorpos anti-B

<table>table see original document page 43</column></row><table> <table>table see original document page 44</column></row><table>

ns = não significativo

3) Conclusões

A etapa de afinidade contribui verdadeiramente para a remoção de anticorpos anti-A e anti-B. Dentre as diferentes imunoglobulinas testadas que estão disponíveis no mercado, o produto IgNG2 é o produto o qual contém o menor número de anticorpos anti-A e anti-B.

EXEMPLO 3

Uma suspensão a 1% (v/v) de células sangüíneas vermelhas do grupo sangüíneo A é preparada em tampão de PBS, pH de 7,4 contendo 1% em peso de albumina de soro bovino (BSA). 50 μl da suspensão de células sangüíneas vermelhas são tomados e adicionados a um tubo de citometria de fluxo (Beckmann-Coulter Epics XL) junto com 50 μl de uma solução de marcação interna que medindo o fluxo. A suspensão é calibrada a 4 0,10^6 células sangüíneas vermelhas/ml.

Oito lotes de soluções de IgG são preparados através de diluição sucessiva em um fator de 2 do concentrado de IgG (v/v) (B3) obtido no Exemplo 1, o lote mais concentrado tendo 30 g/l, o mais diluído tendo 0,234 g/l. Um volume de 50 μl da suspensão é, então, colocado em cada poço de uma microplaca com 96 poços, seguido por 50 μl das diferentes soluções de IgG diluídas.

O todo é deixado incubar durante 2 h em uma temperatura de 37°C enquanto se agita.

Cada poço é, então, lavado com 200 μl de tampão de PBS contendo o BSA precedente e a microplaca é centrifugada durante 1 minuto a 2000 rpm. Após remoção do sobrenadante, 50 μl de uma solução de anticorpos F(ab'2) anti-IgG humana de cabra diluída para 1/20 com PBS-BSA são adicionados, marcada com fluorocroma de ficoeritrina (Beckmann Coulter).

O todo é deixado incubar durante 3 0 min no escuro.

A suspensão obtida é, então, lavada conforme previamente.

O resíduo de cada poço é dissolvido em 100 μl de PBS- BSA. O volume contido em cada poço da microplaca é transferido para um tubo nó qual 500 μl de fluido de proteção Isoflow são adicionados (Coulter) e, então, o volume submetido à citometria de fluxo sobre um aparelho Coulter-Beckmann Epics XL compreendendo software para aquisição de dados e análise de resultados. Fluorometria é medida para cada amostra.

O mesmo procedimento é realizado para células vermelhas do grupo B.

Esse modo de operação é seguido para três lotes diferentes de IgG (B3) e é também aplicado a três lotes diferentes de IgG preparados através de fracionamento com etanol de acordo com o método de Cohn (mencionado acima) (Bl) .

Os resultados obtidos são fornecidos na Tabela 3 abaixo:

Tabela 3:

<table>table see original document page 46</column></row><table>

EXEMPLO 4

Uma suspensão a 1% (v/v) de células vermelhas tratadas com papaína dos grupos sangüíneos A, B, AB ou O é preparada e contada em uma célula Malassez para obter 10"6 células sangüíneas vermelhas. 100 μCi de 51Cr são adicionados (1 volume por 1 volume de células sangüíneas vermelhas). O todo é deixado incubar durante 1 hora e as células sangüíneas vermelhas radio-marcadas são, então, lavadas 5 vezes.

As células sangüíneas vermelhas radio-marcadas são, então, contatadas com amostras de concentrados de IgG (B2) obtidos no Exemplo 1, em uma concentração de 1,2 mg/ml por 5,106 células sangüíneas vermelhas radio-marcadas, em um volume de 100 μl.

Um volume idêntico ao acima de 10 0 μl de soro normal do grupo sangüíneo AB é, então, adicionado à mistura anterior para fornecer os diferentes fatores de complemento.

A mistura de reação obtida é, então, incubada durante 4h em uma temperatura de 37°C.

A mistura de reação é, então, centrifugada durante 1 minuto a 2000 rpm e a radioatividade da solução de sobrenadante incubada é medida, usando dispositivos adequados disponíveis no mercado. A radioatividade medida da solução é proporcional à extensão de hemõlise das células sangüíneas vermelhas tratadas e, conseqüentemente, ao teor de anticorpos anti-A e anti-B.

Procedimento idêntico é seguido com células vermelhas dos grupos sangüíneos B, AB e 0, todos sendo Rhesus+, e com uma amostra de soro do grupo 0+. Esse modo de operação é seguido para três lotes diferentes de IgG (B2).

Além disso, o procedimento é aplicado a três lotes de amostras comerciais de concentrados de IgGi denotados de C2 a C4, e uma amostra de soro do grupo 0+ denotada C5 incluída como controle negativo.

A radioatividade medida da solução é proporcional à extensão de hemólise das células sangüíneas vermelhas tratadas e, conseqüentemente, à quantidade de anticorpos anti-A e anti-B ligados às células sangüíneas vermelhas.

Os resultados de hemólise são fornecidos na Tabela 4 abaixo:

Tabela 4:

<table>table see original document page 48</column></row><table> <table>table see original document page 49</column></row><table>

Os resultados obtidos mostram que o concentrado de IgG B3, o qual foi submetido à eromatografia por afinidade de acordo com a invenção, contém a menor quantidade de anticorpos anti-A e anti-B, uma vez que os percentuais de hemólise das células sangüíneas vermelhas originárias de diferentes grupos sangüíneos são os menores.

Nenhuma hemólise é observada com as células sangüíneas vermelhas do fenotipo 0+ incluído como controle negativo.

EXEMPLO 5

Medição da poli-reatividade de concentrados de IgG B2 (antes de eromatografia por imunoafinidade) e após essa eromatografia (concentrado de IgG B3) descrito no Exemplo 1.

A medição da poli-reatividade desses concentrados de IgG é conduzida seguindo a patente EP 1 059 08 8 usando dois antígenos os quais reagem com IgGs poli-reativas. Esses são miosina e albumina modificada por grupos dinitrofenila (DNP Albumina).

A Tabela 5 fornece os fatores de enriquecimento das IgGs poli-reativas nas amostras B2, B3 e C4 do Exemplo 3, cujo teor de IgG foi arbitrariamente ajustado em 1 como referência.

Essas medições foram conduzidas sobre três diferentes lotes dos concentrados de IgG sob consideração. Tabela 5:

<table>table see original document page 50</column></row><table>

Os resultados indicam que o concentrado de IgG B3 da invenção contém 5 a 8 vezes menos IgGs poli-reativas do que o concentrado C4 da técnica anterior. EXEMPLO 6

Exemplo comparando a eficácia dos concentrados de IgG B3 sem anticorpos anti-A e anti-B e de IgGs poli-reativas com os concentrados de IgG Bl

O teste incluía camundongos deficientes em receptores Fc/RI e FcyRIII tratados com vistas a avaliar a atividade de imunomodulação dos concentrados de IgG da invenção. Esses animais são usados como modelo para púrpura trombocitopênica.

Como controle um concentrado de IgG (B1) foi usado, obtido através de fracionamento com etanol de acordo com Cohn.

O protocolo experimental foi o protocolo descrito por Teeling J.L. et ai. (Blood, 15/08/2001, vol. 98, número 4, páginas 1095-1099).

As plaquetas, destruídas através de injeção de IgGs monoclonais anti-plaqueta de 9,108/ml para 2,108/ml, elevam para 7,108/ml naqueles animais tratados com concentrados de IgG B1 e B3 em uma dose terapêutica de 1 g/kg.

A atividade de imunomodulação do concentrado de IgG B3 de acordo com a invenção não foi modificada pela cromatografia por imunoafinidade.

Claims

1. Concentrado de imunoglobulinas G (IgG) para uso terapêutico caracterizado pelo fato de que ele tem respectivos conteúdos de anticorpos anti-A e anti-B conformando a um resultado negativo para o teste indireto de Coombs in vitro.

2. Concentrado de imunoglobulinas G, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ter um teor de anticorpos anti-A de não mais do que 23 ng/mg de IgG e um teor de anticorpos anti-B de não mais do que 2 0 ng/mg de IgG.

3. Concentrado de imunoglobulinas G, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de também possuir um teor residual de IgGs poli-reativas entre 0,01% e 0,1%, em particular entre 0,07 e 0,1% com relação ao teor de IgG total.

4. Concentrado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de conter estabilizantes destinados a permitir o armazenamento do referido concentrado.

5. Concentrado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que os estabilizantes são uma mistura de um álcool de açúcar, de preferência manitol ou sorbitol, de glicina e de um emulsificante não-iônico.

6. Concentrado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de poder ser injetado através da via intravenosa.

7. Método para obter um concentrado de IgG de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) preparo de um concentrado de IgG através de fracionamento com etanol e/ou separação cromatográfica, associada a uma etapa de inativação viral, b) cromatografia por imunoafinidade através de percolação do referido concentrado de IgG sobre uma mistura de meios cujas matrizes são enxertadas com grupos oligossacarídeo tendo similaridade antigênica aos grupos sangüíneos A e B, e c) filtração para remover vírus e/ou partículas com um tamanho maior do que 20 nm.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a etapa a) do método da invenção compreende pré-purificação, através de precipitação, de contaminantes lipídicos de um plasma sangüíneo ou de uma fração enriquecida em IgG de plasma sangüíneo, após cromatografia simples sobre uma resina de troca de ânions conduzida em um pH alcalino e eluição seletiva das IgGs em uma etapa usando um tampão adequado com pH entre 4 e 7.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que os grupos oligossacarídeo são trissacarídeos correspondendo a epítopos dos grupos sangüíneos AeB.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que os trissacarídeos correspondendo ao epítopo do grupo sangüíneo A têm a estrutura N-acetil-galactosamina (GalNAc) - Galactose (Gal) - Fucose (Fuc) e aqueles correspondendo ao epítopo do grupo sangüíneo B têm a estrutura Galactose-Galactose-Fucose.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 10, caracterizado pelo fato de que a etapa de inativação viral ê conduzida com um solvente- emulsificante.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 11, caracterizado pelo fato de que a mistura de suportes de meio com grupos tendo similaridade antigênica ao grupo sangüíneo A e ao grupo sangüíneo B tem uma respectiva proporção compreendida entre 25/75 e 75/25 (v/v), de preferência 50/50 (v/v) de cada um dos referidos suportes de meio.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 12, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de concentração através de ultrafiltração e filtração esterilizante.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 13, caracterizado pelo fato de que filtração para remover vírus é conduzida através de nanofiltração.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 14, caracterizado pelo fato de compreender, após a etapa c) , uma etapa para adicionar estabilizantes para armazenamento do referido concentrado de IgG.

16. Método de análise de anticorpos anti-A e anti-B em um concentrado de imunoglobulina G tal como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6 caracterizado pelo fato de compreender as etapas consistindo de: a) preparo e calibração de uma suspensão de células sangüíneas vermelhas do grupo sangüíneo A ou B, b) contato das referidas células sangüíneas vermelhas com amostras diluídas de soluções de IgG e incubação da mistura obtida durante um tempo predeterminado, c) incubação das referidas células sangüíneas vermelhas na presença de um anticorpo anti-IgG marcado com um fluorocroma, e d) sujeição da suspensão de células sangüíneas vermelhas obtidas na etapa c) à citometria de fluxo.

17. Método de análise de anticorpos anti-A e anti-B em um concentrado de imunoglobulina G tal como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6 caracterizado pelo fato de compreender as etapas consistindo de: a) radio-marcação de uma suspensão de células sangüíneas vermelhas tratadas com papaína escolhidas dentre os grupos sangüíneos A, B, AB e O, previamente contadas, usando um marcador radioativo adequado, b) contato das células sangüíneas vermelhas radio- marcadas com amostras de um volume predeterminado de concentrados de IgG, c) adição de um volume idêntico ao volume na etapa b) de soro normal do grupo sangüíneo AB, d) incubação da mistura obtida na etapa c) durante um tempo predeterminado, e e) medição da radioatividade da solução incubada obtida.