CN108815879A - 一种复合填料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合填料,其包含主要由琼脂糖和纤维素制成的复合基质以及与复合基质交联的复合配基,所述复合配基包括离子交换配基和亲和配基,所述离子交换配基为偏重亚硫酸钠、氨基苯,所述亲和配基为羟基磷灰石、蛋白A或重组蛋白A。该复合填料兼具有多种基质和多种配基的性质,具有高蛋白载量的特点,同时能增加工作流速,从而有效提高蛋白质的纯化效率和效果。
Description
【技术领域】
本发明属于蛋白纯化填料技术领域,具体涉及一种复合填料及其制备方法。
【背景技术】
国外的填料生产技术及填料的多样性研发已经发展到很高的程度。1959年诺贝尔奖获得者Arne Tiselius教授领导的团队正式提出凝胶过滤填料的概念,打开了蛋白纯化新方法的大门。迄今为止,已有几十种不同类型的填料被研发出来。填料构成主要分为两部分:第一部分是基质,由多糖或者聚合物交联而成的球状颗粒,基球大小约为90um,其表面和内部有大量的小孔,以供蛋白进入其内部。同时基球表面和内部具有丰富的羟基,方便修饰各种配基。能做成基球的物质也很多,根据原料不同,做成的基球性质也不同;第二部分是配基,基球做好之后,会修饰不同类型的配基。由于蛋白具有一定的大小、有等电点、疏水性和特异性等特点,所以修饰基球的配基类型也有相应的离子交换配基、疏水配基和亲和配基等。
国内外主要生产的填料从配基类型来分主要有:凝胶过滤层析填料、离子交换层析填料、疏水层析填料、亲和层析填料和新型复合填料等,从填料基质来分主要有琼脂糖填料、葡聚糖填料、纤维素填料、聚合物填料、硅胶填料和新型复合填料等。
1、凝胶层析填料
凝胶层析填料主要根据蛋白质分子量大小进行分离纯化的一种填料,它可以将分子量差别较大蛋白的混合物分离开来,适合分离几种蛋白的混合物。一般操作是将填料装入TXK50/50层析柱,用PBS缓冲液平衡2CV,然后上样,在紫外检测下,分别收集不同的蛋白峰,电泳检测分离纯化效果。凝胶过滤层析单次上样体积不超过柱体积的1/3,每次上样量不多,纯化蛋白量较少,效率比较低,且对多种复杂蛋白混合的分离效果不好。一般来说,凝胶过滤放在蛋白纯化最后一步,蛋白纯化达到85%以上且蛋白种类较少时具有良好的分离纯化效果。目前凝胶过滤填料基球主要有琼脂糖基球和葡聚糖基球,不用修饰配基即可用于分离纯化。
2、离子交换层析填料
离子交换层析填料是由琼脂糖基球交联配基而成,根据交换配基类型可以分为强阳离子交换填料、弱阳离子交换填料、强阴离子交换填料和弱阴离子交换填料。例如,弱阳离子和弱阴离子交换填料配基分别是羧甲基基团和二乙基氨基乙基,由于羧基和氨基的存在,在水中不完全水解,离子交换强度较弱,所以叫弱离子交换填料。此填料对pH比较敏感,不同pH会得到不同的纯化效果,一般用于蛋白的精分阶段。强离子交换填料配基为磺丙基和季铵基团,在水中完全电离,对pH不敏感,但其载量很高一般能达到40mg HSA/ml,一般用于纯化初期捕获阶段。
3、疏水层析填料
疏水层析填料是由琼脂糖基球交联疏水配基而成。根据配基不同可以分为Phenyl、Butyl和Octyl三种填料,分别为苯基、丁基和辛基,疏水性Phenyl>Octyl>Butyl。可以根据蛋白疏水性的强弱选择合适的疏水填料。
4、亲和填料
根据蛋白的特异性,可以将能与蛋白特异性结合的基团交联到基球上,形成不同的亲和填料。如Protein A亲和填料,即将抗原Protein A交联到基球上,广泛用于人和动物抗体IgG的纯化。目前,国内外蛋白药物趋势逐渐向抗体药物发展,通过药物与病灶特异性,靶向性给药,达到快速准确副作用小的治疗效果。近几年来,抗体药越来越受重视,各国大型药企都在加大研发力度,美国FDI每年批准上市抗体大药达六七种,年增长率达到30%,且有升高的趋势。到目前为止,FDI批准了66种抗体药物,年销售额达100亿美元之多。大部分抗体药物的生产都需要用Protein A填料进行纯化,因此Prtein A填料在市场上的需求呈井喷式发展。国内年需求量也在50亿元人民币以上。目前国内填料载量低,一般为30mg/ml,流速慢影响纯化效率,且蛋白回收率低,蛋白活性低。
目前,国内厂家也能生产出多种类型的纯化填料,但还存在一定的局限性,如蛋白质的种类由于成千上万,一些蛋白质还同时具备离子交换性能和疏水性能,因而采用目前厂家生产的填料对该类蛋白质进行纯化时,填料的物理和化学性质会受蛋白质离子交换性能和疏水性能的影响,从而影响了填料的载量以及流速,导致填料对蛋白质纯化效率低,因此同时具备离子交换性能和疏水性能的蛋白质的纯化问题仍尚未解决。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种复合填料,该复合填料兼具有多种基质和多种配基的性质,具有高蛋白载量的特点,同时能增加工作流速,从而有效提高蛋白质的纯化效率和效果。
本发明的另一目的在于提供上述一种复合填料的制备方法,能够制备出高流速高载量的复合填料,提高蛋白质的纯化效率和效果。
本发明的一个技术方案是:
一种复合填料,其包含主要由琼脂糖和纤维素制成的复合基质以及与复合基质交联的复合配基,所述复合配基包括离子交换配基和亲和配基,所述离子交换配基为偏重亚硫酸钠、氨基苯、所述亲和配基为羟基磷灰石、蛋白A或重组蛋白A。
本发明首先是利用纤维素和琼脂糖高度的生物相容性,将纤维素和琼脂糖混合搭配制成复合基质,从而使制得的复合基质兼具纤维素基质和琼脂糖基质的优点,使制得复合基质具有粒径更加均匀、孔径更易控制、刚性更强的效果。其次,本发明还将离子交换配基、疏水配基以及亲和配基同时交联到纤维素琼脂糖复合基质上,从而使本发明制得的复合填料兼具离子交换填料、疏水性填料、亲和性填料的性质,使复合填料在高流速的情况下,兼具高载量的特点,采用本发明制得的复合填料可以用来纯化兼具疏水性和离子交换性能的蛋白质,相较于现有技术中的填料,本发明的复合填料可以提高蛋白质的纯化效率和效果。
作为优选,所述复合基质由琼脂糖、纤维素、甲苯、司盘80、中碱性pH调节剂以及去离子水制成;所述琼脂糖、纤维素、去离子水的质量比为1:(4~6):(10~20),所述甲苯的加入量为去离子水体积的2/1~2倍,所述司盘80的加入量为甲苯体积的120/1~80/1倍。
更优选地,所述中碱性pH调节剂为磷酸氢二钠和硫酸钠。
作为优选,该复合填料是由所述复合基质与偏重亚硫酸钠、丙酮、二甲基亚砜、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、氨基苯、羟基磷灰石、蛋白A或重组蛋白A、交联剂以及pH调节剂制成,所述交联剂为环氧氯丙烷,所述pH调节剂为氢氧化钠、硼氢化钠。
本发明的另一技术方案是:
一种上述的复合填料的制备方法,包括以下步骤:
S1、制备琼脂糖纤维素复合基质;
S2、将离子交换配基与步骤S1中制备的复合基质进行交联反应,制得复合离子交换填料中间体;
S3、将亲和配基与步骤S2制备的复合离子交换填料进行交联反应,制得本发明的高流速高载量的复合填料。
作为优选,上述步骤S1的制备方法包括以下步骤:
(1)在纤维素中加入去离子水,在40~60℃下以200~400rpm的转速进行搅拌0.5~1.5h,升高加热温度至90~100℃,加入琼脂糖继续搅拌2~4h,制得琼脂糖纤维素混合液,加入中碱性pH调节剂,调节其pH至中碱性;
(2)取步骤(1)制得的琼脂糖纤维素混合液进行粘度测量,当粘度为600~800Pa.s,停止加热,并将琼脂糖纤维素混合液降温至50~70℃;
(3)将甲苯在50~70℃下以100~200rpm的转速进行搅拌0.5~1.5h,加入司盘80继续搅拌1~3h;
(4)将步骤(2)降温完成的琼脂糖纤维素混合液缓慢加入步骤(3)中,继续加热搅拌0.5~1h,制得琼脂糖纤维素复合基球溶液,将溶液中的琼脂糖纤维素复合基球进行洗净、筛分、收集。
更优选地,上述琼脂糖、纤维素、去离子水的质量比为1:(4~6):(10~20),所述甲苯的加入量为去离子水体积的2/1~2倍,所述司盘80的加入量为甲苯体积的120/1~80/1倍。
更优选地,上述琼脂糖、纤维素、去离子水的质量比为1:5:15,所述甲苯的加入量为去离子水体积的1倍,所述司盘80的加入量为甲苯体积的100/1倍。
更优选地,上述步骤(1)中所述的中碱性pH调节剂为磷酸氢二钠、硫酸钠,调节pH至9~10。
更优选地,上述步骤(4)还包括将制得的琼脂糖纤维素复合基球溶液置于显微镜下,观察复合基球粒径的大小,若粒径过大则调高转速,粒径过小则降低转速,以使复合基球的粒径为45~120微米。
更优选地,上述步骤(4)中,所述洗净是将制得的复合基球分别用甲苯和水进行洗涤;所述筛分是将制得的复合基球分别过500目和100目的筛,收集粒径为100~500目的复合基球。
作为优选,上述步骤S2的制备方法包括以下步骤:
(1)将偏重亚硫酸钠溶于去离子水,在40~50℃下以200~300rpm转速下搅拌8~15min,加入氢氧化钠和硼氢化钠,继续搅拌20~40min,继续加入环氧氯丙烷和步骤S1中洗净的琼脂糖纤维素复合基球,以250~350rpm继续搅拌2.5~3.5h,制得离子交换填料中间体,洗净;
(2)将步骤(1)洗净的离子交换填料中间体取出放入干净的反应器中,加入丙酮和二甲基亚砜溶液,在40~50℃下搅拌20~40min;加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚、硼氢化钠、氨基苯,继续搅拌5~7h,制得复合离子交换填料中间体,洗净。
更优选地,上述步骤(2)和(3)中的洗净是指分别用甲苯、乙醇以及水洗涤2~3遍。
作为优选,上述步骤S3的制备方法包括以下步骤:
(1)将羟基磷灰石研磨破碎,加入丙酮浸泡20~28h,除去丙酮,将羟基磷灰石烘干;
(2)将步骤(1)处理后的羟基磷灰石加入到去离子水中,加入步骤S2中制得的复合离子交换填料中间体,在40~60℃下以200~400rpm转速搅拌20~40min,加入氢氧化钠、硼氢化钠调节pH,然后加入环氧氯丙烷继续搅拌反应4~6h,制得的复合填料中间体,清洗;
(3)取蛋白A或重组蛋白A粉末加入EDTA溶液中进行溶解,制成蛋白A或重组蛋白A溶液,加入等体积的步骤(2)制得的复合填料中间体溶解5~15min,继续加入无水硫酸钠进行搅拌,加入碱调节溶液pH至8~9,在30~35℃反应2~4小时,清洗,即制得本发明的高流速高载量的复合填料。
作为优选,上述步骤(3)为,取蛋白A或重组蛋白A粉末加入1mmol/L的EDTA溶液中进行溶解,制成蛋白A或重组蛋白A溶液,加入等体积的步骤(2)制得的复合填料中间体溶解10min,继续加入无水硫酸钠进行搅拌,加入2mol/L的氢氧化钠调节溶液pH至8.2~8.6,在304℃反应3小时,清洗,即制得本发明的高流速高载量的复合填料。
上述的蛋白A或重组蛋白A均来自市售。
本发明的技术方案具有以下有益的技术效果:
(1)本发明的复合填料兼具离子交换配基、疏水性配基、亲和配基的性质,因此采用本发明的复合填料来分离纯化兼具疏水性和离子交换性能的蛋白质时,该复合填料的理化性质更加稳定,不会受蛋白质的疏水性和离子交换性能的影响,具有高载量、高选择性优点,使得在较高的流速下,该复合填料仍保持高蛋白载量,提高了分离效率,分离时间短;现有技术中的填料在流速为30~150cm/h时,载量一般为30~50mg/ml;而本复合填料在流速为30~500cm/h时,载量可达到45~60mg/ml,从而提高了对蛋白质的纯化效率,并且减少了填料介质的使用,降低了填料的使用成本,满足工业生产的要求。
(2)本发明的复合填料对该类蛋白进行分离纯化的同时,物理和化学性质保存更稳定,具有具有高选择性、高负载量等优点,从而能实现兼具高载量高流速的分离要求。本发明通过利用纤维素和琼脂糖的高度生物相容的特性,将纤维素和琼脂糖制得的复合基球,使制得的复合基球具有粒径更加均匀、孔径更易控制、刚性更强的优点。同时,本发明制得的复合基球也具有高流速的特点,目前市场常见基球流速通常为200cm/h左右,而本发明复合基球流速的高达500cm/h,流速提高一倍之多。另外,本申请发明人通过不断的研究,来调整纤维素、琼脂糖以及水达到最佳的比例,从而使该复合基球在对蛋白载量不变的情况下,对蛋白质的纯化效率大大提高,这样就能在短时间内将蛋白质纯化分离出来,有效缩短了蛋白质暴露在不利环境中的时间,从而有利于增加蛋白质活性,降低蛋白质的损失率。
(3)本申请发明人通过尝试多种制备方法以及改变反应比例和条件,研发出一个高效利用率和转化率高的制备方法,发明人通过控制填料反应体系的温度、pH以及通气量等,从而实现了将多种配基交联在同一基球该条件下,克服了现有技术将多种配基交联在同一基球上的困难。
【具体实施方式】
以下结合具体实施例,对本发明做进一步描述。
以下所提供的实施例并非用以限制本发明所涵盖的范围,所描述的步骤也不是用以限制其执行顺序。本领域技术人员结合现有公知常识对本发明做显而易见的改进,亦落入本发明要求的保护范围之内。
实施例一
复合填料的制备:
(1)制备复合基球:取100g的纤维素,加入到1L的三口烧瓶中,加入200ml去离子水,将三口烧瓶放入恒温水浴锅中,在40℃、200rpm下搅拌0.5h;将水浴锅的温度升至92℃,往三口烧瓶中加入17g琼脂糖,搅拌反应2h;继续加入1g磷酸氢二钠和1g硫酸钠,使混合液的pH为9~10;取琼脂糖纤维素混合液用粘度计测量其粘度,当粘度为600~800Pa.s时,即停止加热,将琼脂糖纤维素混合液降温至50℃。取100ml甲苯放入另外一个500ml三口烧瓶中,将三口烧瓶放入水浴锅,在50℃、100rpm下搅拌0.5h,加入1ml司盘80,继续搅拌反应1h。将降温完成的琼脂糖纤维素混合液缓慢倒入甲苯司盘80混合液中,继续搅拌反应0.5h,制得琼脂糖纤维素基球溶液;取琼脂糖纤维素基球溶液置于显微镜下观察基球粒径的大小;若粒径过大,则将转速调高,粒径过小,则将转速降低,使粒径为45~120微米;最后将制得的琼脂糖纤维素基球用甲苯和水洗涤干净,用500目和100目的筛进行筛分,收集粒径为100~500目的琼脂糖纤维素基球。
(2)制备离子交换填料中间体:取0.5克偏重亚硫酸钠,溶于70ml去离子水,放入三口烧瓶中,以40℃、200rpm搅拌5min;加入2g氢氧化钠和0.5g硼氢化钠,继续搅拌反应20min;用移液管量取10ml环氧氯丙烷加入到上述三口烧瓶中,再加入步骤(1)收集的基球50ml,以250rpm继续搅拌2h,制得离子交换填料;最后将离子交换填料取出,分别用丙酮、乙醇、蒸馏水洗涤2~3遍。
(3)制备复合离子交换填料中间体:取50ml步骤(2)中制得的离子交换填料加入三口烧瓶,加入10g丙酮和15g二甲基亚砜溶液,在40℃下搅拌反应20min;继续加入5ml的1,4-丁二醇二缩水甘油醚、0.05g硼氢化钠、0.5g氨基苯,继续搅拌反应4h,制得复合离子交换填料,最后将复合离子交换填料取出,分别用丙酮、乙醇、蒸馏水洗涤2~3遍。
(4)制备高流速高载量的复合填料:先取1g羟基磷灰石研磨破碎,加入丙酮没过羟基磷灰石浸泡20h,除去丙酮,将羟基磷灰石烘干;取上述处理后的羟基磷灰石0.3g加入到30ml去离子水中,加入步骤(3)制得的复合离子交换填料中间体50ml,在40℃、200rpm下搅拌反应20min;继续加入5g氢氧化钠、0.5g克硼氢化钠、10ml环氧氯丙烷,继续搅拌反应4h,制得复合填料中间体,清洗;取1.5g蛋白A粉末,溶解在1mmol/L的EDTA中,制得蛋白A溶液;取上述复合填料中间体50ml,加入40ml蛋白A溶液溶解10min,加入无水硫酸钠进行搅拌,最后加入2mol/L的氢氧化钠调节溶液pH至8.2-8.6,在34℃反应3小时,将高流速高载量的复合填料用去离子水清洗4~5遍,即得到高流速高载量的复合填料。
上述蛋白A产自上海雅心生物技术有限公司。
实施例二
复合填料的制备:
(1)制备复合基球:取100g的纤维素,加入到1L的三口烧瓶中,加入300ml去离子水,将三口烧瓶放入恒温水浴锅中,在50℃、300rpm下搅拌1h;将水浴锅的温度升至98℃,往三口烧瓶中加入20g琼脂糖,搅拌反应3h;继续加入1.5g磷酸氢二钠和1.5g硫酸钠,使混合液的pH为9~10;取琼脂糖纤维素混合液用粘度计测量其粘度,当粘度为600~800Pa.s时,即停止加热,将琼脂糖纤维素混合液降温至60℃。取300ml甲苯放入另外一个500ml三口烧瓶中,将三口烧瓶放入水浴锅,在60℃、150rpm下搅拌1h,加入3ml司盘80,继续搅拌反应2h。将降温完成的琼脂糖纤维素混合液缓慢倒入甲苯司盘80混合液中,继续搅拌反应40min,制得琼脂糖纤维素基球溶液;取琼脂糖纤维素基球溶液置于显微镜下观察基球粒径的大小;若粒径过大,则将转速调高,粒径过小,则将转速降低,使粒径为45~120微米;最后将制得的琼脂糖纤维素基球用甲苯和水洗涤干净,用500目和100目的筛进行筛分,收集粒径为100~500目的琼脂糖纤维素基球。
(2)制备离子交换填料中间体:取1g偏重亚硫酸钠,溶于100ml去离子水,放入三口烧瓶中,以45℃、250rpm搅拌10min;加入4g氢氧化钠和1g硼氢化钠,继续搅拌反应30min;用移液管量取20ml环氧氯丙烷加入到上述三口烧瓶中,再加入步骤(1)收集的基球100ml,以300rpm继续搅拌3h,制得离子交换填料;最后将离子交换填料取出,分别用丙酮、乙醇、蒸馏水洗涤2~3遍。
(3)制备复合离子交换填料中间体:取100ml步骤(2)中制得的离子交换填料加入三口烧瓶,加入19g丙酮和24g二甲基亚砜溶液,在45℃下搅拌反应30min;继续加入10ml的1,4-丁二醇二缩水甘油醚、0.1g硼氢化钠、1g氨基苯,继续搅拌反应6h,制得复合离子交换填料,最后将复合离子交换填料取出,分别用丙酮、乙醇、蒸馏水洗涤2~3遍。
(4)制备高流速高载量的复合填料:先取1g羟基磷灰石研磨破碎,加入丙酮没过羟基磷灰石浸泡20h,除去丙酮,将羟基磷灰石烘干;取上述处理后的羟基磷灰石0.3g加入到30ml去离子水中,加入步骤(3)制得的复合离子交换填料中间体50ml,在40℃、200rpm下搅拌反应20min;继续加入5g氢氧化钠、0.5g克硼氢化钠、10ml环氧氯丙烷,继续搅拌反应4h,制得复合填料中间体,清洗;取1.5g蛋白A粉末,溶解在1mmol/L的EDTA中,制得蛋白A溶液;取上述复合填料中间体50ml,加入50ml蛋白A溶液溶解10min,加入无水硫酸钠进行搅拌,最后加入2mol/L的氢氧化钠调节溶液pH至8.2-8.6,在34℃反应3小时,将高流速高载量的复合填料用去离子水清洗4~5遍,即得到高流速高载量的复合填料。
上述蛋白A产自上海雅心生物技术有限公司。
实施例三
复合填料的制备:
(1)制备复合基球:取100g的纤维素,加入到1L的三口烧瓶中,加入400ml去离子水,将三口烧瓶放入恒温水浴锅中,在60℃、200rpm下搅拌2h;将水浴锅的温度升至100℃,往三口烧瓶中加入25g琼脂糖,搅拌反应4h;继续加入1.5g磷酸氢二钠和1.5g硫酸钠,使混合液的pH为9~10;取琼脂糖纤维素混合液用粘度计测量其粘度,当粘度为600~800Pa.s时,即停止加热,将琼脂糖纤维素混合液降温至70℃。取600ml甲苯放入另外一个1L三口烧瓶中,将三口烧瓶放入水浴锅,在60℃、150rpm下搅拌1h,加入3ml司盘80,继续搅拌反应3h。将降温完成的琼脂糖纤维素混合液缓慢倒入甲苯司盘80混合液中,继续搅拌反应50min,制得琼脂糖纤维素基球溶液;取琼脂糖纤维素基球溶液置于显微镜下观察基球粒径的大小;若粒径过大,则将转速调高,粒径过小,则将转速降低,使粒径为45~120微米;最后将制得的琼脂糖纤维素基球用甲苯和水洗涤干净,用500目和100目的筛进行筛分,收集粒径为100~500目的琼脂糖纤维素基球。
(2)制备离子交换填料中间体:取1.5g偏重亚硫酸钠,溶于150ml去离子水,放入三口烧瓶中,以50℃、300rpm搅拌20min;加入6g氢氧化钠和2g硼氢化钠,继续搅拌反应40min;用移液管量取30ml环氧氯丙烷加入到上述三口烧瓶中,再加入步骤(1)收集的基球150ml,以400rpm继续搅拌4h,制得离子交换填料;最后将离子交换填料取出,分别用丙酮、乙醇、蒸馏水洗涤2~3遍。
(3)制备复合离子交换填料中间体:取100ml步骤(2)中制得的离子交换填料加入三口烧瓶,加入24g丙酮和28g二甲基亚砜溶液,在50℃下搅拌反应40min;继续加入15ml的1,4-丁二醇二缩水甘油醚、0.2g硼氢化钠、2g氨基苯,继续搅拌反应7h,制得复合离子交换填料,最后将复合离子交换填料取出,分别用丙酮、乙醇、蒸馏水洗涤2~3遍。
(4)制备高流速高载量的复合填料:先取1g羟基磷灰石研磨破碎,加入丙酮没过羟基磷灰石浸泡20h,除去丙酮,将羟基磷灰石烘干;取上述处理后的羟基磷灰石0.3g加入到30ml去离子水中,加入步骤(3)制得的复合离子交换填料中间体50ml,在40℃、200rpm下搅拌反应20min;继续加入5g氢氧化钠、0.5g克硼氢化钠、10ml环氧氯丙烷,继续搅拌反应4h,制得复合填料中间体,清洗;取1.5g蛋白A粉末,溶解在1mmol/L的EDTA中,制得蛋白A溶液;取上述复合填料中间体50ml,加入60ml蛋白A溶液溶解10min,加入无水硫酸钠进行搅拌,最后加入2mol/L的氢氧化钠调节溶液pH至8.2-8.6,在34℃反应3小时,将高流速高载量的复合填料用去离子水清洗4~5遍,即得到高流速高载量的复合填料。
上述蛋白A产自上海雅心生物技术有限公司。
对比例一
在复合基球上交联氨基苯、羟基磷灰石、蛋白A配基,而不交联偏重亚硫酸钠配基,即去掉实施例一中步骤(2),将步骤(1)制得的复合基球加入至步骤(3)中,其他步骤与实施例一相同。
对比例二
在复合基球上交联偏重亚硫酸钠、羟基磷灰石、蛋白A配基,而不交联氨基苯配基,即去掉实施例一中步骤(3),将步骤(2)制得的复合基球加入至步骤(4)中,其他步骤与实施例一相同。
对比例三
市售的以蛋白A为配基的亲和填料。
为了测试实施例1~3和对比例1~3所制备的填料介质的载量和流速效果,进行下述测试。
将实施例1~3和对比例1~3所制备的填料层析介质装填于3.0×150mm色谱柱中,连接在AKTA Purifier 100层析系统;配置样品浓度2mg/mL的IgG磷酸缓冲溶液(pH=7.0,50mM磷酸缓冲液),流动相为pH=3.0的甘氨酸-HCl缓冲液溶液,流速分别为1mL/min、5mL/min、10mL/min,进样至色谱柱中,紫外检测进样浓度和流出色谱柱的样品浓度,计算IgG的动态吸附载量,表1分别记载了各填料层析介质对IgG的动态载样量。
表1
根据表1的数据能够分析出,实施例1~3对IgG的载量大于对比例1~3的载量。由此可见,本发明制得的复合填料具有高载量的优点,同时在高流速的情况下,本发明的复合填料还保持较高的载量。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节。
Claims (10)
1.一种复合填料,其特征在于:其包含主要由琼脂糖和纤维素制成的复合基质以及与复合基质交联的复合配基,所述复合配基包括离子交换配基和亲和配基,所述离子交换配基为偏重亚硫酸钠、氨基苯,所述亲和配基为羟基磷灰石、蛋白A或重组蛋白A。
2.根据权利要求1所述的复合填料,其特征在于:所述复合基质由琼脂糖、纤维素、甲苯、司盘80、中碱性pH调节剂以及去离子水制成;所述琼脂糖、纤维素、去离子水的质量比为1:(4~6):(10~20),所述甲苯的加入量为去离子水体积的2/1~2倍,所述司盘80的加入量为甲苯体积的120/1~80/1倍。
3.根据权利要求2所述的复合填料,其特征在于:该复合填料是由所述复合基质与偏重亚硫酸钠、丙酮、二甲基亚砜、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、氨基苯、羟基磷灰石、蛋白A或重组蛋白A、交联剂以及pH调节剂制成,所述交联剂为环氧氯丙烷,所述pH调节剂为氢氧化钠、硼氢化钠。
4.一种上述权利要求1~3任一所述的复合填料的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
S1、制备琼脂糖纤维素复合基质;
S2、将离子交换配基与步骤S1中制备的复合基质进行交联反应,制得复合离子交换填料中间体;
S3、将亲和配基与步骤S2制备的复合离子交换填料进行交联反应,制得本发明的高流速高载量的复合填料。
5.根据权利要求4所述的复合填料的制备方法,其特征在于:所述步骤S1的制备方法包括以下步骤:
(1)在纤维素中加入去离子水,在40~60℃下以200~400rpm的转速进行搅拌0.5~1.5h,升高加热温度至90~100℃,加入琼脂糖继续搅拌2~4h,制得琼脂糖纤维素混合液,加入中碱性pH调节剂,调节其pH至中碱性;
(2)取步骤(1)制得的琼脂糖纤维素混合液进行粘度测量,当粘度为600~800Pa.s,停止加热,并将琼脂糖纤维素混合液降温至50~70℃;
(3)将甲苯在50~70℃下以100~200rpm的转速进行搅拌0.5~1.5h,加入司盘80继续搅拌1~3h;
(4)将步骤(2)降温完成的琼脂糖纤维素混合液缓慢加入步骤(3)中,继续加热搅拌0.5~1h,制得琼脂糖纤维素复合基球溶液,将溶液中的琼脂糖纤维素复合基球进行洗净、筛分、收集。
6.根据权利要求5所述的复合填料的制备方法,其特征在于:所述琼脂糖、纤维素、去离子水的质量比为1:(4~6):(10~20),所述甲苯的加入量为去离子水体积的2/1~2倍,所述司盘80的加入量为甲苯体积的120/1~80/1倍。
7.根据权利要求5所述的复合填料的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述的中碱性pH调节剂为磷酸氢二钠、硫酸钠,调节pH至9~10。
8.根据权利要求5所述的复合填料的制备方法,其特征在于:步骤(4)还包括将制得的琼脂糖纤维素复合基球溶液置于显微镜下,观察复合基球粒径的大小,若粒径过大则调高转速,粒径过小则降低转速,以使复合基球的粒径为45~120微米;步骤(4)所述洗净是将制得的复合基球分别用甲苯和水进行洗涤;所述筛分是将制得的复合基球分别过500目和100目的筛,收集粒径为100~500目的复合基球。
9.根据权利要求5所述的复合填料的制备方法,其特征在于:所述步骤S2的制备方法包括以下步骤:
(1)将偏重亚硫酸钠溶于去离子水,在40~50℃下以200~300rpm转速下搅拌8~15min,加入氢氧化钠和硼氢化钠,继续搅拌20~40min,继续加入环氧氯丙烷和步骤S1中洗净的琼脂糖纤维素复合基球,以250~350rpm继续搅拌2.5~3.5h,制得离子交换填料中间体,洗净;
(2)将步骤(1)洗净的离子交换填料中间体取出放入干净的反应器中,加入丙酮和二甲基亚砜溶液,在40~50℃下搅拌20~40min;加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚、硼氢化钠、氨基苯,继续搅拌5~7h,制得复合离子交换填料中间体,洗净。
10.根据权利要求9所述的复合填料的制备方法,其特征在于:所述步骤S3的制备方法包括以下步骤:
(1)将羟基磷灰石研磨破碎,加入丙酮浸泡20~28h,除去丙酮,将羟基磷灰石烘干;
(2)将步骤(1)处理后的羟基磷灰石加入到去离子水中,加入步骤S2中制得的复合离子交换填料中间体,在40~60℃下以200~400rpm转速搅拌20~40min,加入氢氧化钠、硼氢化钠调节pH,然后加入环氧氯丙烷继续搅拌反应4~6h,制得的复合填料中间体,清洗;
(3)取蛋白A或重组蛋白A粉末加入EDTA溶液中进行溶解,制成蛋白A或重组蛋白A溶液,加入等体积的步骤(2)制得的复合填料中间体溶解5~15min,继续加入无水硫酸钠进行搅拌,加入碱调节溶液pH至8~9,在30~35℃反应2~4小时,清洗,即制得本发明的高流速高载量的复合填料。
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Cited By (1)
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---|---|---|---|---|
CN111346622A (zh) * | 2018-12-24 | 2020-06-30 | 内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司 | 色谱填料及其制备方法和用途 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20040018625A (ko) * | 2002-08-23 | 2004-03-04 | 한미약품 주식회사 | 형질전환 동물의 젖으로부터 재조합 펩타이드 또는단백질의 정제 방법 |
CN103182199A (zh) * | 2013-03-22 | 2013-07-03 | 西北大学 | 一种纯化多酚类化合物的方法 |
CN103418358A (zh) * | 2012-05-15 | 2013-12-04 | 北京化工大学 | 一种复合配基的色谱介质 |
-
2018
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20040018625A (ko) * | 2002-08-23 | 2004-03-04 | 한미약품 주식회사 | 형질전환 동물의 젖으로부터 재조합 펩타이드 또는단백질의 정제 방법 |
CN103418358A (zh) * | 2012-05-15 | 2013-12-04 | 北京化工大学 | 一种复合配基的色谱介质 |
CN103182199A (zh) * | 2013-03-22 | 2013-07-03 | 西北大学 | 一种纯化多酚类化合物的方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
GUOFENG ZHAO: "Ligands for mixed-mode protein chromatography: Principles, characteristics and design", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 * |
王淼: "《食品科学与工程专业主干课程:生物化学》", 31 January 2017 * |
郑铁生: "《临床生物化学检验》", 31 August 2015 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111346622A (zh) * | 2018-12-24 | 2020-06-30 | 内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司 | 色谱填料及其制备方法和用途 |
CN111346622B (zh) * | 2018-12-24 | 2023-05-09 | 内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司 | 色谱填料及其制备方法和用途 |
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