CN103182199A - 一种纯化多酚类化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纯化多酚类化合物的方法，将含有多酚类化合物的样品溶解于体积百分含量为10.0-50.0%的乙醇水溶液中，上样纯化，等度模式洗脱，采用装填有琼脂糖凝胶微球的层析柱，流动相为乙醇、乙酸体积比为1:1的水溶液，其中乙醇和乙酸的体积百分含量分别为10.0-30.0%。本发明通过增大琼脂糖基质浓度可以提高制备的分离介质羟基数目，从而对多酚类化合物具有很好的选择性吸附作用，最优条件下目标物的质量回收率和纯度均高于95.0%和98.0%。

Description

一种纯化多酚类化合物的方法
技术领域
本发明涉及一种纯化多酚类化合物的方法，属于天然产物活性成分分离提纯技术领域。
背景技术
多酚是指分子结构中含有多羟基的一类生物活性小分子化合物的总称，其相对分子质量在500-3000范围内，是植物的次生代谢产物之一，广泛存在于水果、蔬菜、茶叶及中草药中。多酚和生物大分子如蛋白质、多糖的结合以及与金属离子的络合等化学性质使其具有多种生物活性，如抗氧化、抗病毒、抗癌及抑菌等。现代医学研究表明，困扰人类的多种疾病如组织器官的老化，冠心病、动脉粥样硬化及中风等心脑血管疾病均与人体内活性氧自由基的过剩(失衡)密切相关，研究发现植物源的多酚物质具有很强的氧自由基清除能力及抑制脂质体过氧化作用等，因而从植物中分离高效抗氧化多酚化合物成为当前抗氧化领域的研究热点。
目前，多酚化合物的分离纯化方法主要有大孔树脂吸附、硅胶柱层析和逆流色谱分离等。大孔吸附树脂吸附容量大、易于再生，但有机试剂用量大且目标物纯度不高；硅胶柱层析价格便宜，但操作繁琐、得率较低；逆流色谱分离效果好、产品纯度高，但其成本相对较高，且制备量小，不易实现规模化生产。所以，开发低生产成本、高纯度的多酚类化合物分离纯化方法，具有重要的经济和社会意义。
琼脂糖具有良好的亲水性、大孔性、非特异性和生物学相容性，表面带有大量的羟基，是应用最广的一种多糖类色谱分离介质。目前已开发出多种商品化低糖浓度（琼脂糖基质浓度为2%-6%）分离介质，如Sepharose 4FF、Sepharose 6FF以及以此为基质偶联不同配基所制备的一系列疏水、亲和、离子交换等分离介质，主要用于蛋白质、核酸等大分子的分离，在生物制药、食品工业及化工等领域具有广泛应用。
发明内容
本发明目的在于提供一种纯化多酚类化合物的方法，本发明使用高浓度的琼脂糖凝胶微球作为分离介质用于天然多酚类化合物分离纯化。
本发明实现过程如下：
一种纯化多酚类化合物的方法，包括如下步骤：
（1）将含有多酚类化合物的样品溶解于体积百分含量为10.0-50.0%的乙醇水溶液中，所述的多酚类化合物为白藜芦醇、虎杖苷、丹参素、表没食子儿茶素没食子酸酯；
（2）上样纯化，等度模式洗脱，采用装填有琼脂糖凝胶微球的层析柱，洗脱液为乙醇、乙酸体积比为1:1的水溶液，其中乙醇和乙酸的体积百分含量分别为10.0-30.0%。
上述方法多酚类化合物的质量回收率大于95%，纯度大于98%。
所述的琼脂糖凝胶微球中琼脂糖的质量百分含量为16～24%，微球的粒径范围为20-60μm，最大耐压大于0.4MPa，其制备方法包括如下步骤：
（1）将乳化剂与油相溶剂混匀，乳化剂质量百分含量为0.05-1.0%，然后将质量百分含量为16～24%的琼脂糖水溶液加入到乳化剂与油相溶剂混合液中进行悬浮乳化制球，混合液与琼脂糖水溶液的体积比为3:1～6:1；
所述的乳化剂选自Tween 60、Span 80、NP-4、OP-500，油相溶剂选自石油醚、四氯化碳、液体石蜡、大豆油、菜籽油；
（2）将制得的微球在含有1-5%的KBH4的30-45%的NaOH溶液中活化；
（3）加入交联剂进行交联，清洗筛分即可得到琼脂糖凝胶微球，所述的交联剂选自2,3-二溴丙醇、二乙烯基苯、环氧氯丙烷、1,4-丁二醇缩水甘油醚。
本发明的优点与积极效果：
（1）增大琼脂糖基质浓度可以提高制备的分离介质羟基数目，从而对多酚类化合物具有很好的选择性吸附作用，最优条件下目标物的质量回收率和纯度均高于95.0%和98.0%。高浓度琼脂糖凝胶分离介质（琼脂糖基质浓度为16%-24%，为常规琼脂糖凝胶分离介质的4-8倍）在天然产物活性物质分离中的应用潜力巨大。（2）采用乙醇-乙酸二元混合液为洗脱液，在等度模式下常压分离，分辨率高、负载量大、操作简单且溶剂条件无毒无害。
附图说明
图1为制备的高浓度琼脂糖凝胶分离介质的扫描电镜图（1000×）；
图2为高浓度琼脂糖凝胶分离介质纯化虎杖中白藜芦醇和虎杖苷的色谱图；
图3为白藜芦醇和虎杖苷收样组分的高分辨质谱图；
图4为白藜芦醇和虎杖苷收样组分的高效液相色谱图。
具体实施方式
实施例1 高浓度琼脂糖凝胶分离介质的制备
（1）将160.0-240.0g琼脂糖加入到1.0L超纯水中，在压力0.12- 0.18Mpa、温度110-125℃的高压反应釜中保温0.5-1.5h，完全溶解为水溶液；
（2）将乳化剂与油相溶剂混合均匀，乳化剂质量百分含量为0.05-1.0%，然后将琼脂糖水溶液加入到油相溶剂悬浮乳化制球，油水相比例为3:1- 6:1，体系温度为60-80℃，转速为600-1000rpm；其中油相溶剂选自石油醚、四氯化碳、液体石蜡、大豆油、菜籽油、二甲苯、二氯苯，乳化剂选自Tween 60、Tween 20、Span 80、Span 40、Arlacel C、NP-4、OP-500；
（3）搅拌5-30min后将反应体系置换为冰浴，待体系温度降到20-40℃后，除去乳化剂清洗后将微球在含有1-5%的KBH4的30-45%的NaOH溶液中活化，温度为20-30℃，活化0.5-1.0h；
（4）加入交联剂升温到45-65℃进行交联，交联6.0-12.0h后，清洗筛分即可得到用于液相色谱的高浓度琼脂糖凝胶微球，交联剂选自2,3-二溴丙醇、二乙烯基苯、环氧氯丙烷、1,4-丁二醇缩水甘油醚、三甲基丙烯酸甘油酯；
（5）制备的高浓度琼脂糖凝胶微球粒径范围在20-60μm之间（图1），尺寸分布均匀；最大耐压大于0.4MPa，机械性能良好，易于清洗和重复使用。
实施例2 天然多酚活性物质——白藜芦醇和虎杖苷的分离纯化
使用实施例1方法制备得到16%琼脂糖凝胶分离介质，其中，油相溶剂为石油醚，乳化剂为Tween 60，交联剂为2,3-二溴丙醇。
（1）称取0.40g虎杖粗提物超声溶解于20.0%的乙醇水溶液中，超声助溶5min，0.45μm滤膜过滤；
（2）流动相为乙醇、乙酸体积比为1:1的水溶液，其中乙醇和乙酸的体积百分含量分别为20.0%，0.45μm滤膜过滤后超声脱气15min，室温静置0.5h备用；
（3）将制备的高浓度琼脂糖凝胶微球抽滤清洗，加入适量超纯水后超声分散15min，然后将分散均匀的微球装入层析柱管（600mm×16 mm id.），流动相平衡2个柱体积后进样；
（4）流速为3.0mL/min，检测波长UV 280nm，等度模式下进行洗脱，根据分离图谱收集各组分（图2）；
（5）将白藜芦醇、虎杖苷收样组分和标准对照品进行高分辨质谱对比鉴定，采用配置UltiMate3000 HPLC (Dionex, US)的MicrOTOF-MS QⅡ(Bruker, Germany)进行分析，质谱条件：负离子模式，喷雾电压为5kV，保护气为高纯氦气，毛细管温度为275℃，分子量范围为50-3000 amu，检测信号采用Xcalibur软件进行记录分析（图3）；
（6）同时将虎杖粗提物、白藜芦醇和虎杖苷标准对照品及高浓度琼脂糖凝胶分离介质纯化后的收样组分进行HPLC定性定量分析，色谱条件：流动相为甲醇-水溶液(65:35,v/v, 0.5% HAc)，进样量20μL，流速1mL/min，检测波长为UV 280nm（图4）。
（7）最优条件下可得纯度为99.1%的白藜芦醇39.8mg，质量回收率为98.5%；纯度为98.7%的虎杖苷20.6mg，质量回收率为98.1%。
实施例3 天然多酚活性物质——丹参素的分离纯化
使用实施例1方法制备得到20%琼脂糖凝胶分离介质，其中，油相溶剂为液体石蜡，乳化剂为Span 80，交联剂为环氧氯丙烷。
（1）称取0.50g丹参粗提物超声溶解于10.0%的乙醇水溶液中，超声助溶5min，0.45μm滤膜过滤；
（2）流动相为乙醇、乙酸体积比为1:1的水溶液，其中乙醇和乙酸的体积百分含量分别为10.0%，0.45μm滤膜过滤后超声脱气15min，室温静置0.5h备用；
（3）将制备的高浓度琼脂糖凝胶微球抽滤清洗，加入适量超纯水后超声分散15min，然后将分散均匀的微球装入层析柱管（600mm×16 mm id.），流动相平衡2个柱体积后进样；
（4）流速为2.0mL/min，检测波长UV 280nm，等度模式下进行洗脱，根据分离图谱收集各组分；
（5）将丹参素收样组分和标准对照品进行高分辨质谱对比鉴定，并用高效液相色谱进行定性定量分析；
（6）最优条件下可得纯度为98.7%的丹参素47.6mg，质量回收率为96.8%。
实施例4 天然多酚活性物质——表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的分离纯化
使用实施例1方法制备得到24%琼脂糖凝胶分离介质，其中，油相溶剂为1:1的液体石蜡与菜籽油，乳化剂为OP-500，交联剂为1,4-丁二醇缩水甘油醚。
（1）称取0.45g茶多酚粗提物超声溶解于30.0%的乙醇水溶液中，超声助溶5min，0.45μm滤膜过滤；
（2）流动相为乙醇、乙酸体积比为1:1的水溶液，其中乙醇和乙酸的体积百分含量分别为25.0%，0.45μm滤膜过滤后超声脱气15min，室温静置0.5h备用；
（3）将制备的高浓度琼脂糖凝胶微球抽滤清洗，加入适量超纯水后超声分散15min，然后将分散均匀的微球装入层析柱管（600mm×16 mm id.），流动相平衡2个柱体积后进样；
（4）流速为1.5mL/min，检测波长UV 280nm，等度模式下进行洗脱，根据分离图谱收集各组分；
（5）将表没食子儿茶素没食子酸酯的收样组分和标准对照品进行高分辨质谱对比鉴定，并用高效液相色谱进行定性定量分析；
（6）最优条件下可得纯度为98.2%的表没食子儿茶素没食子酸酯58.2mg，质量回收率为95.2%。

Claims (5)

1.一种纯化多酚类化合物的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将含有多酚类化合物的样品溶解于体积百分含量为10.0-50.0%的乙醇水溶液中；
（2）上样纯化，等度模式洗脱，采用装填有琼脂糖凝胶微球的层析柱，流动相为乙醇、乙酸体积比为1:1的水溶液，其中乙醇和乙酸的体积百分含量分别为10.0-30.0%。
2.根据权利要求1所述纯化多酚类化合物的方法，其特征在于：所述的多酚类化合物为白藜芦醇、虎杖苷、丹参素、表没食子儿茶素没食子酸酯、黄芩甙或灯盏乙素。
3.根据权利要求1所述纯化多酚类化合物的方法，其特征在于：所述的琼脂糖凝胶微球中琼脂糖的质量百分含量为16～24%，微球的粒径范围为20～60μm，最大耐压大于0.4MPa。
4.根据权利要求1所述纯化多酚类化合物的方法，其特征在于所述的琼脂糖凝胶微球制备方法包括如下步骤：
（1）将乳化剂与油相溶剂混匀，乳化剂质量百分含量为0.05～1.0%，然后将质量百分含量为16～24%的琼脂糖水溶液加入到乳化剂与油相溶剂混合液中进行悬浮乳化制球，混合液与琼脂糖水溶液的体积比为3:1～6:1；
所述的乳化剂选自Tween 60、Tween 20、Span 80、Span 40、Arlacel C、NP-4、OP-500，油相溶剂选自石油醚、四氯化碳、液体石蜡、大豆油、菜籽油、二甲苯、二氯苯；
（2）将制得的微球在含有1-5%的KBH4的30-45%的NaOH溶液中活化；
（3）加入交联剂进行交联，清洗筛分即可得到琼脂糖凝胶微球，所述的交联剂选自2,3-二溴丙醇、二乙烯基苯、环氧氯丙烷、1,4-丁二醇缩水甘油醚、三甲基丙烯酸甘油酯。
5.根据权利要求3所述纯化多酚类化合物的方法，其特征在于：多酚类化合物的质量回收率大于95%，纯度大于98%。
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