JPH082920B2

JPH082920B2 - ヒト腫瘍関連抗原

Info

Publication number: JPH082920B2
Application number: JP63503303A
Authority: JP
Inventors: クリスチャンジェンセニウス，ジェンス; クリスチャンセン，ペールボゥラップー; エルブ，カリン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-04-03
Filing date: 1988-03-30
Publication date: 1996-01-17
Anticipated expiration: 2011-01-17
Also published as: FI894650A0; EP0285173A3; US5338661A; IE60993B1; AU1596588A; ZA882353B; ES2059418T3; JPH02503383A; DE3884646D1; EP0285173B1; DK169987D0; IL85955A0; NZ224156A; FI894650A; WO1988007377A1; AU618260B2; DE3884646T2; EP0285173A2; IL85955A; KR890700358A

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野この発明は、腫瘍関連抗原、その抗原に対する抗体、
その抗原または抗体からなる診断用薬剤、多種の診断ま
たは治療の目的のための抗原または抗体の使用に関す
る。

発明の背景腫瘍に関連する抗原（即ち、腫瘍により発現される抗
原）の同定及び特性決定により、一層正確に癌を検出し
診断する方法を開発する可能性は、医学上非常に興味深
い。

腫瘍関連抗原に対するモノクロナール抗体は、その著
しい特異性のために癌の検出に重要な役割を果たす。こ
れまで、癌関連抗原に対応するほとんどのモノクロナー
ル抗体は、免疫感作されたマウスの脾臓細胞とヒトの癌
細胞系との融合または癌患者の細胞とマウスの骨髄腫細
胞系との融合から得られるハイブリドーマによって発現
される。マウスの免疫原性は、マウスのモノクロナール
抗体により認識される抗原の必要条件であり、それらは
必ずしもヒトの抗体により認識される抗原に対応するも
のではない。さらに、患者は、これらの抗体を異種の蛋
白質と認識しマウスの抗体に対し逆の免疫応答をするの
で、これらマウスのモノクロナール抗体の治療価値は制
限される。その結果、治療効果が無効になり、潜存的に
危険なアレルギー反応を引起こすことになる。

ヒトのモノクロナール抗体は、ヒトにおいて非相同抗
体よりも免疫原性が少ないので関連抗原を認識できると
仮定すると、ヒトハイブリドーマ抗体は癌患者に投与さ
れる診断用及び治療用薬剤として非常に有望である。

マウスのモノクロナール抗腫瘍抗体の特異性に関する
問題は診断と治療に用いられている結腸の腺癌抗体17-A
lにより説明されるが、腫瘍組織と同様に正常の組織と
も反応することが判明している［ハイブリドーマ（Hybr
idoma）５巻補遺1,1986年、特集Ca-17-Alについて、ゼ
ット．ステプルゥスキー（Z,Steplewski）］。

投与されたマウスモノクロナール抗体に対する患者の
免疫応答については、多くの研究者達により報告されて
いる［例えば、エイチ．エフ．シーアズ等（H.F.Sears
et al.）、ランセット（Lancet）1985年,i:762〜765
頁；及びエム．エス．ミッチェル等（M.S.Mitchell et
al.）、プログレスキャンサーリサーチセラポイ
ティックス（Prog.Cancer.Res.Ther.）21巻、1982年、R
aven出版、ニューヨーク］。

結腸−直腸ガンは、最頻度で発生するガンの１つであ
り、ガンによる主な死因の１つである。このタイプのガ
ンの予知は、長期間に亘って改善されておらず、従って
結腸−直腸ガンの検出及びその手術に伴うアジュバント
治療の新規な方法が必要である。

従って、ヒトの癌腫瘍に関連する抗原、特に実質的に
正常な組織では発現されない抗原及び抗原に対応する抗
体が診療及び治療のために必要である。

発明の説明従って、この発明は見掛けの分子量が約43,000で、等
電点が約5.4〜6.2の範囲で、かつヒトのハイブリドーマ
細胞系B9165（ECACC 87040201）またはそれらの類似体
（analogue）により産生されるモノクロナール抗体と反
応性の、少なくとも１つのエピトープ（構造既知の抗原
決定基）を有するヒトのカルチノーマ（癌腫）に関連す
る抗原に関する。

本願で用いる「類似体」という用語は、この抗原と類
似のアミノ酸の組成または配列の蛋白質またはポリペプ
チドを示すために用いられ、類似体の免疫原性に逆効果
を及ぼさないような小さな変化は許容される。類似のポ
リペプチドまたは蛋白質は、例えば組換え体生物からの
ような、癌腫瘍組織以外の起原から誘導されるか、また
は一部もしくは全部が合成体であってもよい。この語は
さらに例えばその免疫原性サブシィケンス（subsequenc
e）のような抗原誘導体を意味する。

抗原に対して特異的な反応性を有する単クローン抗体
を用いる標準の方法による免疫細胞化学的分析結果は、
ヒトの結腸癌腫（carcinoma）、乳癌腫組織には、新し
い抗原が存在するが、十二指腸腺癌（adenocarcinoma）
組織、黒色腫もしくはバーキットリンパ腫組織またはヒ
トの末梢血白血球には存在しないことを示す（下記第１
表参照）。

抗原に対して特異的な反応性を有する単クローン抗体
を用いる標準の方法による免疫組織化学的分析結果は、
結腸腺癌腫、卵巣腺癌腫、腎臓腺癌腫、乳腺癌腫、肺腺
癌腫及び非精上皮の睾丸癌腫組織には新しい抗原の存在
を示すが、しかし肺上皮癌腫肉腫、悪性の黒色腫、Ｂ−
リンパ腫もしくは胸腺腫組織、または乳管、乳細管もし
くは前立腺上皮以外の正常組織には存在しないことを示
す（下記第IIA及びIIB表参照）。

従って、標準免疫細胞化学的及び免疫組織化学的分析
により測定されるように、この新規の抗原は、実質的に
正常なヒトの組織には見出されず、癌腫組織、特に腺癌
腫組織により発現されるが、その他の悪性組織には発現
されないことが見出された抗原であると結論づけられ
る。特にこの新規の抗原は結腸腺癌腫に関連していると
思われる。

結腸癌腫で発現される腫瘍関連抗原は、ヨーロッパ特
許第199,586号に開示されている。しかしながら、この
抗原は分子量や等電点のような特性が、本発明の抗原と
は異なっており、正常な結腸組織と悪性の結腸組織の両
方に存在していることが示されている（即ち、腫瘍特異
的でないようである）が、本発明の抗原は、上記のよう
に数種の異なる悪性組織に存在することが分かってい
る。

本発明の抗原は、例えば、当業者によく知られた方法
に従い本発明の抗原に対する抗体を不溶化するアフィニ
ティクロマトグラフィに付して、癌腫細胞の抽出物また
は癌腫瘍の抽出物から分離することによって得ることが
できる［ジョンストン，エー．（Johnstone,A.）及びソ
ープ，アール．（Thope,R.）、イムノケミストリーイ
ンプラクティス（Immunochemistry in Practice）、
ブラックウェルオックスフォード 1987年参照］。さ
らに詳細な分子特性を測定し、かつ診断または治療の目
的に使用するのに十分な純粋な形で抗原を得るために
は、１つまたはそれ以上の蛋白質精製法（例えば、ゲル
濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、
配位子アフィニティクロマトグラフィ、疎水性インター
ラクションクロマトグラフィ（interaction chromatogr
aphy）、変性もしくは未変性のゲルによる電気泳動及び
種々の沈殿法）による精製が必要である。

しかしながら抗原の適当な供給を保証するために、組
換えDNA法により抗原を産生することが有利である。こ
の方法は、（ａ）例えば、常法によりヒトの癌腫細胞の
相補的DNA（cDNA）または遺伝子ライブラリーを作製
し、陽性のクローンをスクリーニングすることによっ
て、抗原をコードするヌクレオチド配列を分離し；
（ｂ）適切な複製可能な発現ベクターに上記配列を挿入
し；（ｃ）適切な宿主の微生物を（ｂ）工程で産生した
ベクターで形質転換し；（ｄ）（ｃ）工程で産生した微
生物を抗原を発現する適切な条件下で培養し；及び
（ｅ）抗原を培地から収穫することからなる方法であ
る。

この方法の工程（ａ）〜（ｅ）は、標準方法により行
なうことができる、例えばマニアティス等（Maniatis e
t al）、（分子クローニング（Molecular cloning）：
ラボラトリィマニュアル（A laboratory manual）、
コールドスプリングハーバー、1982年）に記載され
ている。

抗原をコードする遺伝子が一旦分離されると、そのDN
A配列を標準方法により［例えばサンガー等（Sanger et
al）、サイエンス214巻、1981年、1205頁またはギルバ
ート（Gilbert）、サイエンス214巻、1981年、1305頁に
記載のような方法で］確立することができ、かつそのDN
A配列に基づいてアミノ酸配列を推定することができ
る。ついで、抗原またはそのサブシィケンスは、通常の
ペプチド合成法により製造することができる。例えば液
相または固相ペプチド合成法があり、固相ペプチド合成
法が好ましい方法である［アール．ビー．メリーフィー
ルド（R.B.Merryfield）、J.Am.Chem Soc 85,2149（196
3年）、またはスチュアート（Stewart）及びヤング（Yo
ung）、Solid Phase Peptide Syntheses,Freeman ＆
Co.,米国、サンフランシスコ、1969年参照］。固相合成
法においてアミノ酸配列は、はじめのアミノ酸を固形担
体に結合し、ついで所望の長さが得られるまでペプチド
結合法によって他のアミノ酸をその配列の中に付加する
ことによって構成される。

他の観点では、この発明は上記の癌腫抗原に特異的に
対応する抗体に関する。

上記の抗体はモノクロナール抗体の方が有利である。
その理由はポリクロナール抗体より高度に特異的である
ために正確な診断測定に有用だからである。上記のこと
を考慮して患者に注入しようとする抗体はヒトに由来す
るものが好ましい。即ち、これまでヒト腫瘍関連抗原に
対応するモノクロナール抗体の生成に有用であったマウ
スのリンパ球とマウスの骨髄腫細胞系との融合生成物よ
りもむしろ、ヒトのリンパ球とヒトの細胞系との融合生
成物またはヒトのリンパ球と例えばマウスの骨髄腫細胞
系との融合生成物により産生されるものが好ましい。そ
のようなモノクロナール抗体は抗原の種々のエピトープ
に対応して生成される。有用なモノクロナール抗体の１
例は、ヒトハイブリドーマ細胞系B9165（1985年４月２
日に英国、ウィルトシア、サリスベリー、ポートンダ
ウン、the European Collection of Animal Cell Cultu
res（ECACC）の応用微生物研究センターに、受託番号EC
ACC 87040201で寄託（ブダペスト条約に基づく国際寄
託））によって産生されたC-OU1と命名された抗体であ
る。

この発明のモノクロナール抗体は、（ａ）癌患者から抗体産生細胞を分離し；（ｂ）抗体産生細胞と適当なヒト融合細胞系の細胞とを
融合し、得られた前記の抗体産生のハイブリドーマ細胞
を選択し、次いでクローン化し：及び（ｃ）上記抗体産生に適切な培地で工程（ｂ）の細胞を
増殖させ、ついで増殖培地から抗体を収穫することから
なる方法により製造される。

ヒト融合細胞との融合に用いられる抗体産生細胞とし
ては、脾臓またはリンパ節の細胞が好ましい。抗体産生
細胞とヒト融合細胞との融合は、実質的にキューラー及
びミルシュタイン（Koehler and Milstein）、Nature 2
56巻 1975年 495頁、またはキューラー（Koehler）、
Immunological Methode II巻、1981年、285〜288頁、Ac
ademic Pressに記載のようにして行なわれ、すなわちポ
リエチレングリコールのような融合プロモーターの存在
下で行なうことが好ましい。使用されるヒト融合細胞系
は選択された培地の中で生存できないタイプのものが好
ましい。細胞融合に頻繁に用いられる細胞系の１つは、
ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ酵素が欠けていて、その結果、ヒポキサンチ
ン、アミノプリテンおよびチミジンを含有する培地（HA
T培地）では増殖できない細胞系である。

ついで、癌腫抗原に対応する抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞の選択を、未融合の抗体産生細胞、未融合の
ヒト融合細胞及び推定上の融合細胞を選択培地（HATの
ような）中で培養することによって行なうが、その培地
中では未融合のヒト融合細胞は増殖できず、最後は死に
絶える。未融合の抗体産生細胞は限られた時間内だけ生
存でき、その後に死に絶える。一方うまく融合した細胞
は、親のヒト融合細胞から永久増殖性を、かつ親の抗体
産生細胞から選択培地中で生存する能力を遺伝されるた
め、増殖が続く。

産生した抗体産生細胞は、例えばPRMI 1640のような
適切な培地でクローン化した後、生体外で増殖させるこ
とができる。その結果、細胞によってモノクロナール抗
体が培地の上清中に分泌されるため、モノクロナール抗
体は非常に高純度で産生される。ついでその抗体は、遠
心分離法、濾過法、沈澱法、クロマトグラフィー法また
はそれらの組合せのような常法により分離することがで
きる。

モノクローン性を必要としない場合には、抗体はポリ
クロナール抗体であってもよい。これは、適当な動物
（例、ウサギ、マウスまたはヤギ）に抗原の実質的に純
粋の製剤を注射し、次いで最初の採血までの６ケ月間、
適切な間隔（例、２週間〜１ケ月）をおいて１回以上の
追加免疫注射を行なうことにより調整される。ついでこ
の確立された免疫法を続ける間、動物は各追加免疫化を
行なってから約１週間後に採血し、次いで常法、例えば
ハーボエ（Harboe）及びインギルド（Ingild）（Scand.
J.Immun.,2巻、（補遺.1）,1973年、161〜164）に記載
のような方法で、抗体を血清から分離する。

いくつかの目的のために抗体は、ハイブリッド抗体で
あるのが有利で、このハイブリッド抗体は、この発明の
抗原のエピトープと特異的に対応する１つの結合部位
（combining site）と、同一抗原の他のエピトープ、他
の抗原のエピトープまたは薬剤と特異的に対応する結合
部位とを有する。「結合部位（combining site）」とい
う語は、抗体分子の種々の領域における抗原認識構造を
意味すると理解される。ハイブリッド抗体によって、試
料中の抗原を検出し、試薬が最大の効果を示す腫瘍の部
位に、薬剤または他の生物学的活性分子または他の抗原
を結合させる特殊な方法が可能になる。有利な具体例で
は、ハイブリッド抗体が反応性である他の抗原として
は、細胞障害性Ｔ細胞の分化した抗原があげられる（St
aerz et al.,Nature,314巻,1985年、628頁参照）。ハイ
ブリッド抗体が反応性である薬剤としては、細胞障害性
薬剤または抗腫瘍性薬剤から選択されるのが好ましい
（Collier,R.J.及びKaplan D.A.,Scientific American
251巻、1984年、44頁参照）。

ハイブリッド抗体は、２つの関連抗体を産生する２つ
のモノクロナール細胞系間のハイブリッドにより製造さ
れるかまたはその２つの抗体のフラグメント（片）を化
学的に結合することにより製造される。

種々の目的のためには抗体は下記に示すように、抗イ
ディオタイプ抗体（anti-idiotypic antibody）、即ち
抗原エピオトープと反応性の抗体部位に対応する抗体で
あってもよい。抗イディオタイプ抗体はこの発明の抗原
と反応性の抗体に対応する。抗イディオタイプ抗体はモ
ノクロナールまたはポリクロナール抗体についてさきに
は概説したのと同様な方法で製造できる。抗体は上記定
義した抗イディオタイプ抗体に対応する抗抗イディオタ
イプ抗体であってもよい。

一層重要な観点では、この発明は、上記のようなこの
発明の抗体、上記のような抗イディオタイプ抗体、また
は上記のような抗抗イディオタイプ抗体からなる診断用
薬剤に関する。

いくつかの場合、例えばテストを受ける試料中、癌腫
抗原の存在下、抗体が凝集して結合する固形粒子の凝集
定量法に、この診断用薬剤が用いられる時には、抗体の
標識化は必要でないが、多くの目的のためには結合抗体
を検出するために、抗体に標識をつけた方が好ましい。
二重抗体検定法（サンドイッチ法）では、抗体の少なく
とも１つが標識を備えている。これに関連して標識とし
て有用な物質は、酵素、蛍光物質、放射性同位元素及び
ビオチンのような配位子から選択される。

標識物質として用いられる酵素の例としては、ペルオ
キシターゼ、例えばホースラディシュ（ワサビダイコ
ン）ペルオキシターゼ、またはホスファターゼ類、例え
ばアルカリホスファターゼ類が挙げられる。酵素は直接
検出できないので、酵素は例えば蛍光性または着色性で
検出可能な反応生成物を形成するような基質と結合しな
ければならない。有用な基質の例としては、過酸化水素
/o−フェニレンジアミン、過酸化水素／アジノジエチル
ベンゾチアゾリンスルホン酸、過酸化水素／ジアミノベ
ンジジン及びｐ−ニトロフェニルホスフェートが挙げら
れる。このような反応生成物は発色または変色を目視に
よりまたは分光光度計で検出できる。

標識物質として有用な蛍光物質の例として、過酸化水
素/p−ヒドロキシフェニル酢酸及びメチルウンベリフェ
ニルホスフェートが挙げられる。このような物質は、そ
れ自体公知の方法で蛍光分光光度計により検出できる。

標識物質として有用な放射性同位元素の例としては、
I-125、S-35及びP-35が挙げられる。これらの同位元素
により放射される放射線は、それ自体公知の方法でγ線
カウンターまたはシンチレーションカウンターにより検
出される。

好ましい具体例では、診断用薬剤は固形担体に結合し
た少なくとも１つの抗体で構成される。これは未結合抗
体は標識されているが、固形担体に結合した抗体は標識
されない場合の二重抗体検定法に用いられる。固形担体
は、ポリマーからなるか、またはポリマーが塗布される
マトリックスから構成されていてもよい。固形担体はプ
ラスティック（例、ラテックス、ポリスチレン、ポリ塩
化ビニル、ナイロン、ポリビニリデンジフルオリド）、
セルロース（例、ニトロセルロース）、シリコン、シリ
カ及びアガロースもしくはデキストランのような多糖類
から選択される。

診断法に用いるには、固形担体は、通常の形態のいず
れであってもよい。即ち、板状形（例えば薄層または好
ましくはマイクロタイター板のような）、ストリップ、
フィルム、紙またはラテックスビーズなどのような微粒
子の形態であってもよい。

モノクロナール抗体は、固形担体に直接結合させるの
ではなくて、固形担体の上に固定されたスペーサーと結
合させてもよい。スペーサーの例としてはプロティンＡ
が挙げられる。

実用的には、完全な抗体に基づくすべての方法または
応用法は、完全な抗体の代わりに抗体のフラグメント、
例えばＦ（ab′）₂またはFabフラグメント、を用いて行
なうことができるということは注目すべきである（Dela
loye,B.et.,J.Chin.Invest 87巻、1986年、301頁参
照）。

サンドイッチ検定法に使用する際には、診断用薬剤は
さらに他の抗体から構成されていてもよい。この他の抗
体は標識され、及び／または上記の固形担体と結合して
もよい。この具体例では、抗体の一方または両方が上記
のようにモノクロナール抗体であってもよい。

別に、この発明の診断用薬剤は上に定義したような癌
腫抗原から構成されてもよい。この薬剤は試料中の癌腫
抗原に対応する抗体の存在を検出するのに用いられる。
この診断用薬剤は、この発明の抗体からなる診断用薬剤
として前記したいずれの特徴も別の方法で示すが、抗原
と抗体とが結合するのを検出するよりもむしろ結合した
抗体を検出する。

さらに別の観点では、この発明は、ガンの疑いのある
患者からの体液の試料を、この発明の抗体からなるこの
発明の診断用薬剤に接触させ、結合した抗原の存在を測
定することからなるこの発明の抗原を発現するヒト癌腫
生体外診断法に関する。抗体は標識をつけられ、及び／
または上に例示した固形担体に結合されていてもよい。
体液は、血液、血漿、血清、リンパ液、喀痰、尿及び胃
腸液から選択される。

この方法の好ましい具体例では、試料は固形担体に結
合した第１のモノクロナール抗体と共に培養され、次に
標識をつけた第２のモノクロナール抗体まはポリクロナ
ール抗体と共に培養される。この具体例の１例としてサ
ンドイッチエライサ法（ELISA）（酵素結合免疫吸着
検定法、enzyme-linked immunosorbent assay）（Volle
r,A.等.,Bull.World Health Organ.53巻、1976年、55頁
に記載）がある。

別の具体例（いわゆる競合的結合測定法）では、試料
は固形担体に結合したモノクロナール抗体と共に培養
し、次に標識をつけた癌腫抗原と共に培養して、後者
（標識をつけた癌腫抗原）は、試料中に存在する癌腫抗
原と、抗体の結合部位について競合する。

その他の具体例は、癌の疑いのある患者からの組織試
料にこの発明の抗体からなるこの発明の診断用薬剤を接
触させ、試料の抗体が結合される部位を測定することか
らなる、この発明の抗原を発現するヒト癌腫生体外診断
法に関する。このような免疫組織化学的方法は十分に確
立された方法、例えば下記実施例２に記載した方法で行
なうことができる。

この発明の診断法のさらなる具体例は、この発明の抗
体による生体内腫瘍（特に癌腫）の位置確認法に関す
る。この方法は検出が可能なように標識をつけたこの発
明の抗体の診断上有効な量を投与し結合した抗体の位置
する部位を決定することからなる方法である。抗体は放
射性同位元素により標識され、ついで注入し、公知方
法、例、適切な構成のγ線検出器により位置を決定する
（Mach,J,-P.等、Nature 248巻、1974年、704頁参
照）。

なおさらなる具体例は、癌の疑いのある患者からの体
液試料に、この発明の抗原または抗イディオタイプ抗体
から構成されるこの発明の診断用薬剤を接触させ、上記
体液中に存在するこの発明の抗原に対応する結合抗体の
存在を測定することからなる、この発明の抗原を発現す
るヒト癌腫生体外診断法に関する。

さらなる観点では、この発明は、この発明の抗原、ま
たはこの発明の抗体及び医薬的に受容な賦形剤からな
る、ヒト癌腫治療用医薬組成物に関する。

この発明の組成物に用いられる賦形剤は、医薬的に受
容な基剤のいずれでもよい、この基剤は、注射用組成物
の製造に通常用いられる基剤、例えば等張液または緩衝
生理食塩水のような希釈剤、懸濁剤等のいずれでもよ
い。組成物は、抗原または抗体の治療上の有効量に組成
物中の抗原または抗体の所望な濃度を生成するような基
剤量を混合して製造される。

いくつかの場合、抗原または抗体を担体、特に高分子
担体と結合させるのが有利である。担体としては、通
常、毒素が疎水性非共有結合の相互作用により結合する
プラスチックのようなポリマー、例えばポリスチレン、
または抗原または抗体が共有結合する多糖類またはポリ
ペプチドのようなポリマー、例えばウシ血清アルブミ
ン、卵アルブミンまたはスカシ貝ヘモシアニン（keyhol
e limpet hemocyanin）が挙げられる。さらに担体は、
抗原または抗体が結合される薬剤、例えば細胞障害性剤
または抗腫瘍性剤から選択されるのが有利である。また
は担体は細胞障害性エフェクター（effector）機構、例
えば細胞障害細胞に対応する他の抗体であってもよい。
担体は無毒性でかつ非アレルギー誘発物であるのが好ま
しい。高分子担体が組成物の免疫原性を高めるように、
抗原または抗体は高分子担体と多価結合させてもよい。

経口投与には、組成物は錠剤、カプセル剤、顆粒剤、
パスタ剤、ゲル剤、混合物または任意に徐放性剤皮もし
くは胃を通過する際抗原を保護する剤皮を備えた懸濁剤
の形態であってもよい。

固形製剤、即ち顆粒剤、錠剤及びカプセル剤は、充填
剤（例えば、糖、ソルビトール、マンニトール及びケイ
酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロースの
ようなセルロース誘導体及びポリビニルピロリドン）、
崩壊剤（例えば、澱粉、炭酸水素ナトリウム及び炭酸カ
ルシウム）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウ
ム、タルク及びステアリン酸カルシウム）を含有してい
てもよい。半固形製剤、即ちパスタ剤またはゲル剤は、
アルギン酸塩、ゼラチン、カラゲナン、トラガントゴム
及びペクチンのようなゲル剤、流動パラフィンのような
鉱物油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、ナタ油及びブド
ウ種子の仁油（grape kernel oil）のような植物油、並
びに澱粉、ゴム、ゼラチンのような増粘剤等から構成さ
れていてもよい。液体製剤、即ち混合物及び懸濁剤は、
水性または油性基剤、例えば水、流動パラフィンのよう
な鉱物油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、ナタネ油、ブ
ドウ種子仁油のような植物油から構成されていてもよ
い。この発明の抗原は、通常の方法に従って液体基剤中
に懸濁される。

徐放性剤皮は、例えば腸溶剤皮が挙げられ、シェラッ
ク（shellac）、セルロースアセテートフタレートのよ
うなセルロースアセテートエステル類、ヒドロキシプロ
ピルメチルセルロースフタレートのようなヒドロキシプ
ロピルメチルセルロースエステル類、ポリビニルアセテ
ートフタレートのようなポリビニルアセテートエステ
ル類、及びメタクリル酸と（メタ）アクリル酸エステル
とのポリマー類から選択される。

この組成物は、例えば坐剤のような直腸投与にも適用
される。このような坐剤は、カカオ脂または他のグリセ
リドのような通常の賦形剤を含有してもよい。

最後に、この発明は、ヒト腺癌治療薬剤の製造のため
のこの発明の抗原もしくはこの発明の抗イディオタイプ
抗体の使用、またはヒト癌腫治療薬剤の製造のためのこ
の発明の抗体もしくは抗抗イディオタイプ抗体の使用に
関する。

この発明の癌腫抗原を発現する癌、特に癌腫の治療
は、当業者に公知の多種の方法で行われる。抗原に対応
する抗体（特に上記の理由のヒトモノクロナール抗体）
が癌患者に注射され、腫瘍を、直接攻撃するかまたは多
種のエフェクター機構、例えば補体媒介細胞障害作用ま
たは抗体依存性細胞媒介細胞障害作用によって攻撃す
る。この抗体は、上記のように患者に注射する前に、例
えば薬剤に結合するか（即ち、この薬剤が抗体の活性部
位に輸送されて）、または細胞障害性Ｔ細胞もしくは他
の細胞障害性細胞における抗原のような細胞障害エフェ
クター機構に対応する他の抗体と結合することにより修
飾されてもよい。抗原に対する１つの結合部位と、上記
のような他の抗原または薬剤に対する他の結合部位とを
有するハイブリッド抗体は、問題の腫瘍に対して二通り
の攻撃を行うのに有利に用いられる。

この発明の抗体は、循環腫瘍抗原または腫瘍抗原を含
有する免疫複合体を除去し、その結果上記腫瘍抗原また
は免疫複合体によって誘発された麻痺から免疫系を回復
させて抗癌免疫応答を再構成する生体外装置に用いられ
る。

この発明の癌腫抗原は、体内に抗癌免疫応答を誘発す
るための免疫化に用いられる。さらにこの抗原は、癌患
者の白血球と共に抗原を培養することにより癌に対応す
るエフェクター細胞を産生させるために生体外で用いら
れる。

癌腫抗原は、抗体を用いるのと同様な方法で、抗腫瘍
抗体または免疫複合体を除去する生体外装置で用いられ
る。

さらに癌腫抗原に対応する抗体は、抗イディオタイプ
または抗抗イディオタイプの免疫応答を誘発するために
投与される。この発明の癌腫抗原と反応する抗体に対応
する抗イディオタイプ抗体（モノクロナール、ポリクロ
ナールまたはこれらのフラグメントのいずれか）は、抗
原のエピトープと同様なエピトープを発現し、従って、
抗腫膓免疫応答を誘発する免疫化に対して同様の様式で
用いられる。このような抗体は、さらに抗原及び第１の
抗体に対して、上記のような生体外装置中で用いられ
る。

抗抗イディオタイプ抗体は、第１の抗腫瘍抗体と同様
な方法で用いられる。

図面の簡単な説明この発明は、次の実施例及び添付の図面によりさらに
詳細に説明される。

第１図ＡはCOLO 201細胞類（結腸の腺癌細胞類）のC-
OU1による免疫細胞化学的染色（陽性）を、及び同Ｂ
は、同細胞類の非反応ヒトハイブリドーマIgMによる染
色（陰性）を示す第2Aおよび2B図は、結腸腺癌の冷凍組織標本（2A図）
と正常な扁桃腺組織（2B図）のC-OU1による免疫細胞化
学的染色を示す。

第3A図および3B図は、C-OU1とColon 137細胞類（結腸
性腺癌細胞類、陽性）との反応（3A図）及びHUTU 80
（十二指腸腺癌細胞類、陰性）との反応（3B図）の電子
顕微鏡による分析結果を示す。

第４図は、等電点電気泳動法によって分離された組織
抽出物の免疫ブロット分析結果を示す。

第５図は、C-OU1で標識をつけて、SDS-PAGEブロット
法で癌腫抗原を分析した結果を示す。Colon 137（結腸
腺癌細胞、陽性）の抽出物（5A図）及びHUTU 80（十二
指腸腺癌細胞、陰性）の抽出物（5B図）である。

実施例１ヒトモノクロナール抗体（C-OU1）の産生結腸−直腸癌患者の腫瘍領域をドレーンする（draini
ng）腸間膜リンパ節を無菌条件下で細かくきざんだ。破
片を脱脂綿で濾過して除去し、フィコール−イソパク
（Ficoll-Isopaque）（ベーリンガー−マンハイム社、
西ドイツ、マンハイム）で遠心分離してリンパ球を精製
した。キューラー［Ｋhler（イムノロギカルメソッ
ドII巻、アカデミック・プレス,1981年、285〜298頁）
に従って、リンパ球を、ヒト融合細胞系W1-L2-729-HF2
（以下、HF2と称する）［テクニクローン研究所、米
国、カリフォルニア州、サンタ・アナ］と融合させた。
HF2とリンパ球（10⁷）の比は1:2であった。

RPMI-1640培地中のHF2とリンパ球を洗浄後、遠心分離
にかけ、得られた細胞ペレットを、１分間振盪して、0.
5mlの50％PEG（ポリエチレングリコール）6000中に再度
懸濁し、得られたPEGをRPMI-1640で希釈する前に、細胞
をさらに２分間培養した。ついで、融合生成物を洗浄
し、溶液培地［RPMI-1640,HAT（２×10^-4Ｍヒポキサン
チン、４×10^-7Ｍアミノプテリン、3.2×10^-6Ｍチミジ
ン）を補った10％FCS（子牛の胎児の血清）］中に再懸
濁した。この細胞を、96ウェルのマイクロタイタープレ
ートに、１ウェル当り２×10⁵個の細胞含有の200μｌず
つを入れた。この細胞は、選択培地の中で２週間保持さ
れた。さらに培養を、RPMI-1640＋ヒポキサンチンとチ
ミジンを補った10％FCS中で行なった。融合後増殖した
ハイブリッドが、10日から４週間にあらわれた。クロー
ン化は、支持細胞なしで希釈を制限することにより行わ
れた。

増殖したクローンの入ったウェルの上清液を、0.1M重
炭酸塩（pH9.6）で1:10,000に希釈されたウサギ抗ヒトI
g（Ｈ及びＬ鎖）［ダコパッツ社（Dakopatts）、デンマ
ーク、コペンハーゲン）で被覆したマイクロタイタープ
レート上で、ELISA法（enzyme-linked immunosorbent a
ssay）により免疫グロブリン産生について分析した。被
覆されたウェルを、PBS−ツゥイーン液（リン酸緩衝生
理食塩水−0.05％ツゥイーン20）で洗浄し、PBS−ツゥ
イーンで1:10に希釈した上清液と共に室温で２時間培養
した。PBS−ツゥイーンで1:3000に希釈した IgM,IgAまたはIgG（ダコパッツ社、コペンハーゲン）に
特異的なアルカリホスファターゼ（AP）結合抗体により
展開が行われた。室温で１時間培養した後、ｐ−ニトロ
フェニルホスフェート基質（PNPP）、1mg/ml10％ジエチ
ルアミン、1mM塩化マグネシウム、pH9.6を、加えた。37
℃で１時間培養後、光学濃度を405nmで測定した。定量
用の標準曲線は、IgM（Cappel）またはIgG（Kabi AB,ス
ウェーデン、ストックホルム）を希釈して作製した。EL
ISA法で検定した免疫グロブリン（Ig）産生ハイブリッ
ドを、24ウェルのマクロプレートに移して増殖させ［ナ
ンク（Nunc）A/s、デンマーク）、さらに上清液を、下
記のように、腫瘍細胞との反応について免疫細胞化学的
に分析するかまたは腫瘍組織との反応について免疫組
織化学的に分析した。

下記の方法により選択されたハイブリドーマ細胞系B916
5（ECACC 87040201）は、培地を全く変えずに２週間増
殖させた時、IgMを、1ml当り１〜５μｇ産生することが
ELISA法により分かった。

実施例２抗原の特性決定ａ）免疫細胞化学的分析抗腫瘍反応性の分析は免疫細胞化学的分析及び免疫組
織化学的分析により行われた。免疫細胞化学的分析は、
種々のヒト腫瘍細胞系とヒト末梢血液白血球とから調製
した細胞の塗まつ標本について行われた。細胞類を、ホ
ルモル−アセトン（9.5％ホルムアルデヒド、43％アセ
トンの86mMホスフェート緩衝液、Ph7.2）で処理してス
ライドグラス上に固定した。C-OU1上清液（ハイブリド
ーマB9165;ECACC87040201由来）約50μｌを、固定した
細胞塗まつ標本の上に置き、加湿室中４℃で１夜培養
し、次にすすいでから、PBS−ツゥイーンで1:80に希釈
したホースラディッシュペルオキシターゼ（HRP）で
標識したウサギ抗ヒトIgM（ダコパッツ）と共に室温で
１夜培養した。最後に、ペルオキシダーゼ基質（PBS
中、0.01％H₂O₂とジアミノベンジジン0.6μg/ml）を加
えた。塗まつ標本を、ヘマトキシリンで軽くカウンター
ステイン（counter stain）し、封じ込めた。第Ｉ表
は、種々の細胞の塗まつ標本についてC-OU1を分析して
得られた結果を示す。

反応性が選択的であることは明らかである。別に、生
細胞類を、４℃でハイブリドーマ抗体と共に、ついで酵
素で標識した抗Ig抗体と共に培養し、ついで細胞類をス
ライドグラス上に塗沫され、グルタルアルデヒド（PBS
中0.17％）で固定し、基質と共に培養した。第1A図は、
生COLO 201細胞類（結腸腺癌腫細胞類）のC-OU1による
染色を示し、一方、第1B図は、第１層に非反応性ヒトハ
イブリドーマIgMを用いた際の染色の欠如を示す。用い
られる方法は、細胞表面に露出された分子を標識するた
めの受容な標準方法であり、第１図に示す標識化は、こ
の方法によるものである。

ｂ）免疫組織化学的分析免疫組織化学的分析はアセトンの中に固定した冷凍組
織切片について行われた。内在性IgMを、抗μ鎖抗体のF
ab′片（ダコパッツ、デンマーク、コペンハーゲンより
購入）との培養により遮断され、次いでハイブリドーマ
抗体C-OU1（0.5μg/ml）と共に培養した（Fab′片はB.N
ielsen et al.,Hybridoma 6（１）巻,1987年,103〜109
頁に従って作製した）（ハイブリドーマ抗体を2M硫酸ア
ンモニウムで沈澱させて濃縮した）。ついで得られた結
合ハイブリドーマ抗体は、免疫細胞化学的分析用に上記
のようにして目視できるようにした。この場合に、Fa
b′片の産生に用いられたのと同じ抗体製剤をペルオキ
シダーゼで標識した。第2A図は、C-OU1の適当後、結腸
腺癌の切片中、腫瘍細胞だけが染用されることを示す。
第2B図は扁桃腺組織が染色欠除していることを示す。第
IIA及びIIB表は、多種の組織について分析された反応性
を要約するものであり、第IIA表は悪性腫瘍組織からの
結果を示し、第IIB表は、非悪性腫瘍組織からの結果を
示す。

正常な結腸上皮は、ヒトIgM、モノクロナール抗体、
骨髄腫IgM並びに正常なポリクロナールヒトIgMの分析さ
れた全部と結合することを示した。したがって正常な結
腸上皮に対するIgMのこの一般的結合は非特異的である
と判断され、この説明は、電子顕微鏡及び等電点電気泳
動法による分析によって裏付けられた（下記参照）。抗
体のこの非特異的結合は、当業者の知識とも一致するも
のである。

ｃ）電子顕微鏡電子顕微鏡用に、腺癌細胞10⁵/mlを、単層が得られる
まで、プラスチックカバースリップをつけた管中、10％
FCSのRPMI-1640培地内で３日間培養した。この細胞類
を、0.1％（V/V）グルタールアルデヒドの0.1M生理食塩
水溶液（PBS、pH7.2）中４℃で30〜60分間固定し、つい
でウシ血清アルブミン（BSA）とリジン−HClとを補った
PBSで４℃にて１液洗浄した。この細胞類を、−20℃ま
で漸次低温にして、30％から90％エタノールで脱水し、
ついで−35℃でロウィクリルK4M（Lowicryl,ヘミッシェ
・ベルト・コウィ社、西ドイツ）に浸し、−35℃で１
液、紫外線下で重合させ、ついでさらに２日間常温で重
合させた。

被覆ニッケルグリッド（格子）上に載せた細胞含有ロ
ウィクリルの超薄切片（50〜60nm）が用いられた。下側
に切片を有する格子を種々の溶液に浮遊させることから
なる免疫マーキング法は、次の工程からなる:1）グリッ
ドを１％（W/V）水素化ホウ素ナトリウム滴の上に10分
間置き;2）0.1％（W/V）BSA−トリス液中で５分間ずつ
２回洗浄後、グリッドを３％BSA−トリス滴の上に移し
（15分）;3）グリッドをC-OU1の抗体滴の上に室温で１
時間置き;4）グリッドを0.1％BSA−トリス中で５分間ず
つ２回洗浄し;5）グリッドをウサギ抗ヒトIgMの３％BSA
−トリス溶液の滴上に移して室温で１時間置き、;6）0.
1％BSA−トリスで５分間ずつ２回洗浄後、グリッドを、
15nmの金プローブ（Jansen Pharmaceuticals）で標識し
たヤギ抗ウサギIgGの３％BSA−トリス溶液の滴上におい
て、室温で30分間培養し;7）グリッドを、0.1％BSA−ト
リスで５分間ずつ２回及び再蒸留水で５分間づつ２回洗
浄して、乾燥し；および８）超薄切片を室温で、10分間
１％酢酸ウラニルで、染色し次に２分間0.4％クエン酸
鉛で染色する工程である。

ツゥイーン20及び0.5M食塩液を、抗体と洗液全体に加
えた。

超薄切片は、80kVで作動するJEOL 100-CX電子顕微鏡
で検査した。

免疫細胞化学的反応の特異性を評価する実験では、第
１抗体を除き、第１抗体をヒトIgM（Cappel）で置換し
た。

第3A図は細胞質フィラメントの末端周辺領域における
結腸腺癌細胞類（Colon 137）の標識の明確なパターン
を示し、第3B図は（同様な方法による）十二指腸腺癌細
胞類（HUTU 80）の標識の欠除を示す。結腸腺癌の癌組
織切片は、細胞質フィラメント（図示せず）に関連する
腫瘍細胞のみ標識していることを示した。正常な結腸上
皮は標識を全く示さなかった。このように、電子顕微鏡
は細胞質構造に関連する標的抗原の存在を示す。

ｄ）等電点電気泳動法標的抗原分子の特性決定を、等電点電気泳動法によっ
て行った。腫瘍細胞類または癌組織及び正常組織を抽出
緩衝液（75mM NaCl,75mM KCl,10mM Hepes（グッドの緩
衝用試薬）,5mM EDTA,5％ 2−メルカプトメタノール、5
mg/lトラシロール、0.01mMレンペプチン、0.01mMペプス
タチン）中で超音波処理（氷上で30秒、４回）して可溶
化した。超音波処理後、尿素を6Mまでショ糖80mgととも
に加え、得られたホモジネートを37℃で30分間培養し
た。遠心分離（15000×g,5分間）により不溶物質を除去
した。

等電点電気泳動法を、6M尿素、３％（V/V）サーバラ
イツ3-10（servalytes 3-10）及び１％（W/V）サーバラ
イツ4-6（Serva）含有の１％アガロース薄層ゲル（アガ
ロースIEF、Pharmacia）上に塗布した抽出物で行なっ
た。支持体としてゲルをベースにしたフィルム（LKB）
を用いた。ニトロセルロースの上へ蛋白質を電気泳動的
に移す前にフォーカシング（focusing）は1500v/hで行
なった。残っている結合部位は、0.1M塩化ナトリウム、
2mM塩化マグネシウム及び0.05％ツウィーン20を含有す
る0.1Mトリス−塩酸、pH7.5中でニトロセルロースを培
養することにより遮断された。ニトロセルロースを、ス
トリップに切断し、PBS−ツゥイーンで約200ng/mlに希
釈したハイプリドーマ抗体C-OU1と共に室温で２時間培
養した。PBS−ツゥイーンで洗浄後、ニトロセルロース
ストリップを、アルカリホスファターゼをコンジュゲー
トしたＦ（ab′）₂−抗IgM抗体（Jackson Immuno reser
ch）と共に培養し、続いて基質（５−ブロモ−４−クロ
ロインドキシルホスフェートとニトロブルーテトラゾリ
ウムとの溶液）と共に培養された。

第４図の左パネルは、結腸腺癌腫瘍抽出物の染色を示
し、第４図右パネルは正常な結腸上皮の抽出物であり、
Ｉはインディア・インクによる全蛋白質の染色;IIはC-O
U1による染色；及びIIIは異なるハイブリドーマIgMによ
る染色である。結局、C-OU1は、腫瘍抽出物の酸性蛋白
質（等電点5.4〜6.2）が明確に染色されていることを示
しているが、正常結腸抽出物については染色を示してい
ない。

ｅ）SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAG
E）及びウェスタンブロット法 Colon137（結腸腺癌細胞類）及びHUTU 80（十二指腸
腺癌細胞類）の抽出物は、界面活性剤（２％SDS,4M尿
素、10mMヨードアセトアミド）により可溶化して製造さ
れ、５〜20％の勾配のゲル上でPAGE処理する前に、15分
間培養した。次いで、蛋白質をニトロセルロースシート
上に電気泳動的に移動した。得られたこのニトロセルロ
ースシートを3mmのストリップに切断し、C-OU1と共に４
℃で１夜培養し、ついでAP−ウサギ抗ヒトIgM（シグマ
社）と共に２時間培養した。得られたブロットを、PBS
で洗浄し、0.2％グルタールアルデヒド含有のPBS溶液と
共に15分間培養して固定した。アルカリホスファターゼ
を基質、ニトロブルーテトラゾリウム及び５−ブロモ−
４−クロロインドキシホスファターゼ、と共に37℃で１
時間培養すると、目視できるようになった。その分子量
は、次の予め着色された分子量マーカーの移動度から計
算した。すなわちβ−ガラクトシダーゼ（116K）、フル
クトース−６−リン酸キナーゼ（84K）、ピルビン酸キ
ナーゼ（58K）、フラマーゼ（48.5K）、乳酸デヒドロゲ
ナーゼ（36.5K）およびトリオースリン酸イソメラーゼ
（26.6K）である。

第５図の結果は、結腸腺癌抽出物に見出されたが十二
指腸腺癌抽出物には見出されなかった分子量43,000の蛋
白質と、C-OU1が反応することを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ジェンセニウス，ジェンスクリスチャンデンマーク、ディケィ‐5230 オデンセエム、フィンセンスアレ 28 (72)発明者ボゥラップークリスチャンセン，ペールデンマーク、ディケィ‐5792 アースレーヴ、クリスチャンランドスヴェイ１ (72)発明者エルブ，カリンデンマーク、ディケィ‐5700 スヴェントボルグ、ベルヴェデレ 11

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アセトンに固定された冷凍組織切片の免疫
組織化学的分析において、結腸腺癌腫、卵巣腺癌腫、腎
臓腺癌腫、乳癌腫、肺腺癌腫、非精上皮の睾丸癌腫、乳
細管、乳小管及び前立腺上皮と結合するが、肺上皮癌
腫、肉腫、悪性黒色腫、Ｂ−リンパ腫、胸腺腫、卵巣支
質、卵巣上皮、腎臓糸球体、腎細管、肺胞、気管支上
皮、睾丸、表皮、扁桃腺上皮、平滑筋または血管と結合
しない抗体で、約43,000の見掛けの分子量及び約5.4〜
6.2の範囲の等電点を有し、ヒトハイブリドーマ細胞系B
9165（ECACC 87040201）より産生されたモノクロナール
抗体に反応性のヒト癌腫関連の細胞質抗原と結合する抗
体。
【請求項２】モノクロナール抗体である請求項１の抗
体。
【請求項３】ヒトリンパ球から誘導される請求項１の抗
体。
【請求項４】ポリクロナール抗体である請求項１の抗
体。
【請求項５】ヒト−ヒトハイブリドーマ細胞系により産
生された抗体である請求項３の抗体。
【請求項６】ヒト−ヒトハイブリドーマ細胞系がB9165
（ECACC 87040201）である請求項５の抗体。
【請求項７】請求項１と同じ結合特性を示す請求項１の
抗体の抗原結合性フラグメント。
【請求項８】結腸腺癌腫、卵巣腺癌腫、腎臓腺癌腫、乳
癌腫、肺腺癌腫、非精上皮の睾丸癌腫、乳細管、乳小管
及び前立腺上皮のアセトン中に固定した冷凍組織切片に
おいて、ヒト−ヒトハイブリドーマ細胞系B9165（ECACC
87040201）により産生されるモノクロナール抗体と結
合するために露出され、かつ肺上皮癌腫、肉腫、悪性黒
色腫、Ｂ−リンパ腫、胸腺腫、卵巣支質、卵巣上皮、腎
臓糸球体、腎細管、肺胞、気管支上皮、睾丸、表皮、扁
桃腺のリンパ管組織、扁桃腺上皮、平滑筋または血管の
冷凍組織切片では露出されない、約43,000の見掛けの分
子量及びpI約5.4〜6.2の範囲の等電点を有するヒト癌腫
関連抗原。
【請求項９】実質的に純粋な形態の請求項８の抗原。
【請求項１０】請求項９の抗原に反応性の抗体に対応す
る抗イディオタイプ抗体。
【請求項１１】請求項１〜６のいずれか１つの抗体、請
求項７の抗体フラグメントまたは、請求項10の抗イディ
オタイプ抗体からなる診断用薬剤。
【請求項１２】抗体または抗体のフラグメントが標識を
備えている請求項11の診断用薬剤。
【請求項１３】抗体又は抗体のフラグメントが直接また
はスペーサーを介して固形担体と結合している請求項11
の診断用薬剤。
【請求項１４】請求項９の抗原からなる診断用薬剤。
【請求項１５】抗原が標識を備えている請求項14の診断
用薬剤。
【請求項１６】抗原が直接またはスペーサを介して固形
担体と結合している請求項14の診断用薬剤。