NO861491L

NO861491L - Antistoff, fremgangsmaate for dets fremstilling og anvendelse for deteksjon og diagnose av canser.

Info

Publication number: NO861491L
Application number: NO861491A
Authority: NO
Inventors: Karen Burnett; Esther Oh; Julia Leung
Original assignee: Hybritech Inc
Priority date: 1985-04-22
Filing date: 1986-04-16
Publication date: 1986-10-23
Also published as: EP0199586A2; JPS61282096A; AU5637086A; FI861691A; DK172686A; DK172686D0; EP0199586A3; FI861691A0; ES8800603A1; ES554206A0

Abstract

Oppfinnelsen vedrører et nytt tutnor-assosiert antigen uttrykt ved colon carcinoma. Antigenet, som erhjelp av det monoklonale antistoff Y010, er et O-bundet glycoprotein med en molekylvekt fra omkring 36000 til omkring 39000 og et isoelektrisk punkt fra omkring 5,1 til omkring 5,4. Antistoff rettet mot antigenet, metoder for deres fremstilling samt diagnostiske og terapentiske anvendelser, er derfor tilveiebragt.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører karakterisering av antigener, og i særdeleshet tumor-assosierte antigener. Oppfinnelsen vedrører også antistoff som har en spesifikk reaktivitet overfor slike antigener. Likeledes vedrører oppfinnelsen også metoder for fremstilling av slik antistoff såvel som diagnostisk og terapeutisk anvendelse.

Monoklonale antistoffers potensielle rolle i diagnostisering og behandling av canser hos mennesker har vært målet med en rekke undersøkelser i den senere tid. Av særlig interesse er deres anvendelse i immunoassayer for å måle sykdomsforløpet, dvs. under behandlingen. Av særlig interesse er også den mulige anvendelse av monoklonale antistoffer ved en eventuell tumor samt terapi, noe som skyldes antistoffenes evne til binde seg til tumor-assosierte antigener in vivo.

Utvikling av ny teknologi med hensyn på monoklonale antistoff har også gjort det mulig å undersøke de komplekse antigene forhold i humane tumorer. Spesielt tillater den nøyaktige immunoreaktiviteten hos monoklonale antistoff en identifisering og differensiering av celle-overflateantigenet uttrykt ved humane tumorer. Karakteriseringen av slike typiske tumor-assosierte antigener tilveiebringer et middel som gjør at man mere fullt ut kan utnytte anvendelsen av monoklonale antistoff ved diagnostisering av cancer og terapi samt gjøre fordelene ved monoklonal antistoffteknologi så store som mulig.

Opp til idag er bare et begrenset antall tumor-assosierte antigener skikkelig beskrevet. I tillegg vil ikke visse tumorassosierte antigener, som er nyttige som diagnostiske eller prognostiske markører, være tilstede i alle pasienter eller under alle utviklingstrinn og former av sykdommen. Følgelig har man et behov for videre identifisering og karakterisering av enestående tumor-assosierte antigener.

Foreliggende oppfinnelse vedrører oppdagelsen og karakteriseringen av et nytt antigen som er tilstede i humant vev, særlig i den normale colon og coloncarcinoma. Følgelig er oppfinnelsen rettet på et spesielt tumor-assosiert antigen som erkarakterisert vedsin reaktivitet overfor monoklonalt antistoff YCR010.

I overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse, tilveie-bringes antistoff som er spesifikke med hensyn på det ovennevnte antigen og fremgangsmåter for fremstilling av slike antistoff. I tillegg er oppfinnelsen rettet på anvendelse av slike antistoff ved i_n vi tro påvisning og diagnostisering av cancer ved hjelp av immunohistokjemiske og immunoayssay metoder. Oppfinnelsen er videre rettet på anvendelse av slike antistoff for in vivo diagnostisering og behandling av cancer i mennesker.

Som hentydet over, tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse et nytt tumor-assosiert antigen. I overensstemmelse med oppfinnelsen, anvendes det monoklonale antistoffYCR010, fremstilt ved hjelp av hybrid cellelinje ATCC med deponeringsbetegnelse HB8787, for karakterisering av dette antigenet som ikke tidligere er beskrevet.

De fysisk-kjemiske og immunologiske egenskaper hos antigenet i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse, og særlig antigenets reaktivitet med monoklonalt antistoff YCR010, tillater en karakterisering og differensiering fra andre antigener som er tilstede i normalt vev og tumorinfisert vev. Følgelig er karakteristika og egenskaper for identifisering av antiget som er tilveiebragt i den foreliggende oppfinnelse som følger: a) Antigenet er en membrankomponent av normalt vev fra colon og slimhinnen i colon carcinoma. ELISA-prosedyrer av standard type (enzymbundet immunoabsorberende bindingstest) som anvender monoklonalt antistoff YCR010, indikerer tilstedeværelsen av antigenet i plasmamembraner renfrem-stilt fra humant colonvev og slimhinnen i colon carcinoma. En sammenlikning viser at YCR010 ikke utvikler noen vesentlig reaktivitet overfor membraner som er renfrem-stilt fra andre godartede vevstyper slik som lever, nyrer, prostata, blære, hjerne og bukspyttkjertel. b) Immunohistokjemiske prosedyrer av standard type som viser tilstedeværelsen av antigenet i godartet colon og coloncarcinoma i form av en kraftig reaksjon med YCR010 ved hjelp av immunoperoksydase farging av slikt vev. En svak reaksjon eller ingen reaksjon i det hele tatt fremkommer ved anvendelse av andre godartede typer vev, omfattende prostata, lunge, lever, slimhinne, hud og bryst. c) SDS polyakrylamidgel elektroforese (SDS-PAGE) og immuno-gelavtrykk analyser av type Western viser at antigenet har en molekylvekt fra omkring 36000 til omkring 39000. Modifisering av antigenet ved behandling med proteinase K og med natriumperjodat før anvendelse av SDS-PAGE og immunogel avtrykkanalyser av type Western,ødelegger antigenets reaktivitet overfor YCR010, noe som indikerer at antigenet er av natur et glycoprotein.

d) Antigenet er et O-bundet glycoprotein. Behandling av antigenet med en svak base og behandling av antigenet med

N-glycanase bekrefter at antigenet er av glycoprotein-natur og viser at antigenet er et O-bundet glycoprotein. e) Isoelektrisk fokusering av antigenet ved anvendelse av standard metoder for isoelektrisk fokusering indikerer et isoelektrisk punkt i området fra omtrent 5,1 til omkring 5,4.

Som en oppsummering av det foregående, karakteriseres antigenet i overensstemmelse med oppfinnelsen, som kan fremstilles fra en kilde valgt fra normalt humant vev eller.humant tumorinfisert vev, som et O-bundet glycoprotein med en molekylvekt fra omkring 36000 til omkring 39000 og med et isoelektrisk punkt fra omkring 5,1 til omkring 5,4. Videre uttrykkes det tumorassosierte glycoprotein i den foreliggende oppfinnelse i normal colon og colon carcinoma.

Av særlig viktighet for å skille antigenet i den foreliggende oppfinnelse fra andre antigener, omfattende andre tumor-assosierte antigener, er spesifisiteten av det monoklonale antistoff YCR010 overfor minst en determinant av antigenet som er beskrevet i det foregående. I tillegg tilveiebringer den spesifikke reaktiviteten av YCR010 overfor antigenet i overensstemmelse med oppfinnelsen en metode for isolering og rensing av antigenet fra annet humant material, og til sist en karakterisering av antigene determinanter. Et slikt renset antigen og determinanter derav er nyttige i fremstillingen av monoklonale og polyklonale antistoff for diagnostisk og terapøy-tisk anvendelse ved hjelp av teknikker som er kjent for den fagkyndige på området. Man kan f.eks. oppnå muse-hybridoma som danner monoklonale antistoff. I andre tilfeller kan antigenet anvendes for å stimulere en immunreaksjon i en kanin, geit, eller et annet dyr fra hvis serum man oppnår polyklonale antistoff. Antigenet kan også anvendes for karakterisering av antistoffer av interesse, dvs. monoklonale antistoff, eller antistoffer tilstede i humnat vev, blod eller andre kroppsvæsker.

I overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse, tilveie-bringes monoklonale antistoff som er spesifikke med hensyn på det heri beskrevne antigen samt fremgangsmåter for deres fremstilling. Slike monoklonale antistoff er foretrukket av typen IGG og har en immuno-reaktivitet overfor det tumor-assosierte glycoprotein i den foreliggende oppfinnelse som i alt vesentlig er lik reaktiviteten av det monoklonale antistoff YCR010. Slike monoklonale antistoff er nyttige ved deteksjon, diagnose og behandling av cancer hos mennesker, og spesielt colorektal carcinoma. Slike antistoff kan også anvendes i en videre isolering og rensing av antigenet som er tilveiebragt ved den foreliggende oppfinnelse og i karakteriseringen av spesifikke

determinanter.

De ovennenvte monoklonale antistoff kan fremstilles ved hjelp av metoden etter Kohler og Milstein (Nature). I overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse, immuniseres en mus eller et annet passende vertsdyr med det rensede antigen eller med en membranfraksjon av humant tumorinfisert vev fremstilt fra en colon coarcinoma. Etter immunisering, blandes milt-cellene fra den immuniserte mus med cellene fra en passende muse-myelomalinje for å oppnå en blanding av hybride cellelinjer. De hybride cellelinjer dyrkes i et passende medium, hvorpå de hybride cellelinjer som danner et antistoff med spesifikk reaktivitet overfor det antigen som erkarakterisertheri, utvelges og klones, hvorpå man oppnår antistoffet.

Den foreliggende oppfinnelse foreslår fremgangsmåter for in vitro-påvisning og diagnostisering av cancer i mennesker, særlig colorektal carcinoma.Karakterisering av det spesielle tumor-assosierte glycoprotein i overensstemmelse med oppfin-elsen som vist heri, tillater dets påvisning i prøver fra pasientvev ved hjelp av immunohistokjemiske metoder og/eller i væskeprøver fra pasienten ved hjelp av _in vitro immunoassay-metoder. En bestemmelse av det foreliggende og/eller mengden av det tumor-assosierte antigen i overensstemmelse med oppfinnelsen i pasientprøver ved hjelp av immunohistokjemiske og/ eller immunoassay prosedyrer, er av diagnostisk nytte og kan indikere, eller være i overensstemmelse med utviklingen av sykdomstilstanden.

Immunohistokjemiske metoder for påvisning av antigener i prøver av pasientvev er vel kjent innen teknikkens stand og behøver ikke beskrives i detalj. Kort beskrevet, i sammenheng med den foreliggende oppfinnelse, bringes en vevsprøve som er oppnådd fra en mulig cancerpasient, i kontakt med et antistoff foretrukket et monoklonalt antistoff med spesifisitet overfor det tumor-assosierte glycoprotein som erkarakterisertheri. Det monoklonale antistoff YCR010 er spesielt foretrukket for anvendelse. Stedene hvortil antistoffet er bundet bestemmes deretter ved hjelp av selektiv farging av vevsprøven ved hjelp immunohistokjemiske prosedyrer.

Likeledes er metoder for _in vitro påvisning av antigensub-stanser i pasientprøver i flytende form ved hjelp av immuno-assayprosedyrer vel kjent for den fagkyndige på området og be-høver ingen gjentagelse. Med tanke på den foreliggende oppfinnelse, bringes en pasientprøve i flytende form i kontakt med minst ett antistoff, foretrukket et monoklonalt antistoff, som har en spesifikk reaktivitet overfor det tumor-assosierte glycoprotein i overensstemmelse med oppfinnelsen og antistoffet som er bundet til komponentene i prøven bestemmes. Kvalitative og/eller kvantitative bestemmelser av tilstedeværelsen av antigenet som er angitt i oppfinnelsen, kan gjenn-omføres ved konkurrerende eller ikke-konkurrerende immuno-assayprosedyrer. Monoklonale antistoff eller polyklonale antistoff kan passende benyttes, såfremt slike antistoff er i besittelse av den nødvendige spesifisitet overfor antigenet tilveiebragt ved den foreliggende oppfinnelse. Man benytter foretrukket det monoklonale antistoff YCR 010. I tillegg er de foretrukne anvendte immunoassay "Two-site" immunometrisk assay, som anvender monoklonale antistoff som er utvalgt for å binde seg til ikke-interfererende determinanter av det ovennevnte antigen. Den foreliggende oppfinnelse foreslår videre metoder for _in vivo diagnostisering og terapi av cancer, spesielt colorektal carcinoma. Metoder for lokalisering og påvisning av tumor kan utføres i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse, ved at den eventuelle cancerpasienten tilføres en forhåndsbestemt effektiv mengde av et antistoff som har en spesifikk reaktivitet overfor det tumor-assosierte glycoprotein i overensstemmelse med oppfinnelsen idet lokaliseringsstedene av antistoffet påvises ved hjelp av standard teknikker. Antistoffet, foretrukket YCR 010, tilføres til pasienten ved hjelp av en farmasøytisk tålbar bærer og er merket, foretrukket med en radioaktiv forbindelse som sender

ut gammastråler, slik at det kan påvises.

I overensstemmelse med metodene for terapi av cancer, tilføres en forhåndbestemt effektiv mengde av en antistoff, foretrukket et monoklonalt antistoff med en spesifisitet overfor det tumor-assosierte antigen som erkarakterisert vedden foreliggende oppfinnelse, til en cancerpasient. Antistoffet, foretrukket YCR010, tilføres til cancerpasienten ved hjelp av en farmasøytisk tålbar bærer og er konjugert med et passende terapentisk middel, dvs. radioaktive isotoper, foretrukket isotoper som sender ut betapartikler, medikamenter, toksiner eller biologiske proteiner, som er utvalgt for avgivelse ved tumor-stedet.

I tillegg i sammenheng med jLn vivo cancerdiagnose og terapi, vil den fagkyndige på området være klar over at antistoffpre-parater, omfattende blandinger av antistoff eller fragmenter derav med spesifisitet overfor det tumor-assosierte antigen i overensstemmelse med oppfinnelsen, kan anvendes i visse tilfeller for å øke påvisningen, lokaliseringen og behandlingen av tumorer.

Den foreliggende oppfinnelse kan bedre forståes ved hjelp av det følgende eksempel.

EKSEMPEL I

Fremstilling av monoklonalt antistoff YCR010.

Lymfeknutelymfosytter fra en pasient med colon carcinoma ble tint og dyrket over natten i RPM1-1640 (Flow Laboratories, Alexandria, VA) inneholdende 10% fetal bovin serum (PBS). 6 6 30 x 10 lymfosytter og 30 x 10<6>P3/HT, (en underlinje av P3x63Ag8.653) ble blandet med 35% polyetylenglycollOOO i serumfritt RPMl-7,5% dimetylsulfoksyd. Cellene ble platet ut med en tetthet på totalt 10 celler pr. brønn på plater med 96 brønner (Costar, Cambridge, MA) i RPMl-10% FBS HAT

(IO- M hypoksantin, 4 x 10~ M aminopterin og 1,6 x 10~

M tymidin). Kulturene ble holdt i 5% CO^ i 2 uker og

deretter ble supernatanten erstattet med friskt HAT medium en gang pr. uke. Supernatant fra brønnene med voksende kulturer ble utprøvd etter 40 døgn og undersøkt med hensyn på tilstedeværelsen av lg ved hjelp av enzym-bundet immunoabsorberende bindingstest-ELISA. Ig produserende kloner ble deretter undersøkt ved hjelp av ELISA med hensyn på spesifikk reaktivitet overfor membraner og cytosoler fra colontumorer. Det monoklonale antistoff betegnetYCR010, ble ytterligerekarakterisertog utvalgt for anvendelse ved karakteriseringen av antigenet som er tilveiebragt heri.

EKSEMPEL II

Antigenkarakterisering

Monoklonalt antistoff YCR010 ble anvendt for å karakterisere antigenet i overensstemmelse med oppfinnelsen, ved hjelp av fremgangsmåter fremsatt heri.

Membran- og cytosolfraks joner av humant vev ble anvendt for karakterisering av antigenet, såvel som for screening av reaktiviteten av det monoklonale antistoff YCT010, og fremstilt på følgende måte: Prøver fra operative inngrep og autopsi, innsamlet innen 10 timer etter inntruffet død, ble oppskåret i blokker og lagret ved -80°C. Vevsprøver ble homogenisert i 4 volumdeler av lOmM tris-HCl pH 7,5, 2mM kalsiumklorid, 2mM fenylsulfonat (homogeniserings-buffer) ved 4°C i en Dounce homogenisator. Alle de påfølgende trinn ble utført ved 4°C. Homogenisatet ble sentrifugert ved 100 xg i 5 minutter for å fjerne kjerner og intakte celler. Supernatanten ble fjernet og sentrifugert 130000 xg i en time. Den oppnådde supernantanten ble fjernet og fikk betegnelsen cytosol-fraksjonen. Pelleten ble oppløst i en volumdel av den homogeniserende buffer og avsatt på

en 40%/20% ikke-kontinuerlig sucrosegradient i 10 mM tris-HCl pH 7,2. Gradienten ble sentrifugert ved 130000 g i 17 timer. Materialet ved 40%/20% mellomfasen ble avpipettert og fortynnet fem ganger i homogeniseringsbuffer og sentrifugert i en time ved 25000xg. Pelleten ble oppløst på ny i den homogeniserende buffer, fordelt og lagret ved -80°C.

Membran/ cytosol ELISA

Tilstedeværelsen av antigen som omsettes med monoklonalt antistoff YCR 010 fra rensede membran- og cytosolfraksjoner fra normalt humant vev og humant tumorinfisert vev, ble bestemt ved hjelp av en enzym-bundet immunoabosrberende bindingstest (ELISA), idet absorbansen ved 490 nm ble målt.

For utførelse av membran/cytosol ELISA, ble lO^ug/brønn av cytosol eller 2^ug/brønn av membranen, fremstilt som beskrevet over, tørket på flatbunnede microtiter plater (Dynatech, Alexandria, VA) over natten ved 37°C. Platene ble vasket tre ganger med koldt vann. 50^1 av 20% hesteserum i PBS (fosfatbuffret saltoppløsning, 0,15 M NaCl, 20 mM natri-umfosfat pH 7,2) ble tilsatt etterfulgt av 50 p. 1 hybridoma supernatant og inkubert i en time ved romtemperatur. Etter vasking, ble brønnene inkubert med 100 pl av et monoklonalt muse-anti-humant IgM-HRP konjugat (ZSAG11, konjugert ved metoden etter Wilson & Nakane, 1978) fortynnet 1:1000 i 5% hesteserum-PBS i en time. Bundet enzym ble påvist ved inkubering i mørket med 100 ^ul l^ug/ml o-fenylendiamiin og 0,03% H202i 0,1M citrate-fosfatbuffer pH5,0 i 30

minutter. Reaksjonen stoppes ved at brønnene tilsettes 50^ul NH4S04pr. brønn. Abæorbansen ved 490nm ble målt i en Dynatech ELISA plate-avleser.

Som vist i tabell I under, var YCR010 reaktiv overfor membran-fraksjonen av mucincolon carcinoma og normal colon, noe som indikerer tilstedeværelsen av antigenet i overensstemmelse med oppfinnelsen i mucin colon carcinoma og normale colonmembraner YCR010 var ikke reaktiv overfor membranfraks joner av annet vev omfattende normalt lungevev, lever, prostata, blære, hjerne og bukspyttkjertel.

Immunohistokjemisk bestemmelse

Tilstedeværelsen av antigen som er reaktiv med YCR 010 i normal humant vev og humant tumorinfisert vev, ble bestemt ved immunoperoksydase-farging av humant vev.

Deler av frosne vevsprøver, oppnådd ved operativt inngrep og autopsi innen 10 timer etter inntrådt død og lagret ved -80°C, ble oppdelt i biter med størrelse 4 - 6^u ved hjelp av en mikrotom/cryostat. Bitene som var plassert på preparat-glassplater, ble forsiktig lufttørret og deretter dyppet i aceton. En indirekte immunoperoksydasetest i hovedsak som beskrevet hos Taylo, Arch. Pathol. Lab. Med., 102, 13 (1978), ble anvendt for å farge disse preparatglassene. Bitene ble re-hydratisert ved at de ble inkubert i en fosfatbuffret saltløsning (PBS) i 5 minutter. YCR010 antistoff ble plassert over bitene og inkubert i fuktekammer i 1 time. Antistoffet ble fjernet fra bitene ved vasking med PBS og bitene ble deretter nedsenket i PBS i 5 minutter. Bitene ble dekket med en 1:50 fortynning av peroksydase-konjugert geite-anti-humant IgM antistoff (Tago Chemicals, Burlingame, CA) og inkubert i 30 min. i et fuktekammer. Antistoff ble fjernet ved vasking med PBS. Fargereaksjonen ble utviklet med 1 mg/ml diaminobenzidin og 0,03% H2°-Preparatglassene ble farget en gang til med hematoksylin easin.

Etterfølgende tabell II indikerer at YCR 010 hadde en positiv reaksjon med normalt colon og colon carcinoma, idet reaksjonen ble målt ved intensiteten av fargeraksjonen i vevet, og en svak eller ingen reaksjon med annet vev, omfattende normal prostata, lunge, lever, nyre, slimavsondrende vev, hud og bryst.

Biokjemiske analyser av antigen

Proteinnaturen og molekylvekten av antigenet som varkarakterisertvel YCR 010, ble bestemt ved SDS-polyakrylamidgelelek-troforese (SDS-PAGE), Western immunogegel-avtrykk og immun-farging. 25 g colon membran-proteiner ble oppløst i gelprøv-ebuffer (0,125; Tris pH6,8, 4% SDS, 20% glycerol, 0,002% brom-fenol blått, 5% 2-merkaptometanol) og separert ved hjelp av diskontinuerlig SDS-PAGE (Laemmli, 1970) på en 7,5% eller 10% gel med en 3% lag-gel. De separerte proteinene ble elektro-foretisk overført til nitrocellulose (0,1^m, Schleicher & Schuell) ved 200 mA i 3 timer i overensstemmelse med metoden etter Towbin et al (1979). De oppnådde nitrocellulose-replica ble deretter inkubert med 3% bovin serumalbumin (BSA)-PBS i 30 minutter, hvoretter de ble inkubert med hybridom-supernatant fortynnet 1:1 med 5% skummet melk0,001% timerosal- 0,1% anti-skum A emulsjon (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) over natten, i forseglede beholdere. Nitrocellulose-strimlene ble vasket med PBS- 0,1% Tween i 30 minutter, idet bufferen ble byttet ut fem ganger, og inkubert med 125 I-merket geite antihumant IgM (Tago, Burlingame, CA), 500000 cpm/ml skummet melk reagens i 2 timer. Etter vasking med PBS-0,1% Tween ble nitro cellulosestrimlene lufttørket og fremkalt på røntgenfilm (Kodak XAR-5) i 18 - 72 timer med forsterket gjennomlysing (Cronex DuPont Lightning Plus) ved -70°C.

For videre å bestemme antigenets natur, ble membranene, fremstilt som beskrevet over, underlagt følgende behandling før SDS-PAGE og Western immunogel-avtrykkanalyser.

a) Metanol: membransuspensjonen ble inkubert med 5 volumdeler metanol i en time ved 4°C, sentrifugert i en

mikrosentrifuge og prespitatet ble vasket to ganger med etanol. Prespitatet ble oppløst i gel-prøvebuffer for

SDS-PAGE.

b) Natriumperjodat: membranen ble inkubert i 20 mM natrium perjodat i en time ved 4°c. c) Neuraminidase: membransuspensjonen ble instilt til pH 5-6 med eddiksyre og inkubert i en time ved 3 7°C med 10 mU

neuraminidase (160 enheter/mg., Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).

d) Proteinase K: membransuspensjonen ble inkubert med 1,25 mg/ml proteinas K (20 enheter/mg., Boehringer-mannheim) i

1 time ved 37°C.

Alle reaksjonene ble stanset ved tilsetting av gel-prøvebuffer

Ved hjelp av SDS-PAGE og Western Immunogel-avtrykkanalyser ble antigenets molekylvekt bestemt til å være fra omkring 36.000 - 39.000. Kjemisk og enzymatisk modifisering av antigenet etterfulgt av SDS-PAGE og Western immunogel-avtrykkanalyser viste antigenets glycoprotein-natur. Spesielt viste antigenets reaktivitet overfor YCR 010, å være utsatt for ødeleggelse ved behandling av antigenet med proteinase K såvel som natrium-perjodat som beskrevet over. Tapet av antigenets reaktivitet overfor YCR010 var ikke et resultat av den alter-native modifiseringen som er beskrevet over.

Bestemmelse av O- bundet glycoprotein

Antigenets natur ble viderekarakterisertvil å være et 0-bundet glycoprotein ved hjelp av mild alkalisk og N-glycanase behandling.

Mild alkalisk behandling:

membranene ble behandlet med 0,1N NaOH over natten ved romtemperatur, dialysert med PBS og sentrifugert ved 100000xg i 30 minutter. Pelleten ble oppløst i gel-prøvebuffer for SDS-PAGE og Western immunogel-avtrykk. Supernantanten ble påsatt i form av flekker på nitrocellulose og tørket og immunfarget som i Western immunogel-avtrykkanalyser.

N-glycanase behandling:

25^ug membranproteiner ble kokt i nærvær av 0,5% SDS-0,1M B-merkaptoetanol fortynnet med like volumdeler 0,2M natrium-fosfat pH 8,6-10mM EDTA-1% NP40 og inkubert med en enhet N-glycanase (260 enheter/ml., Genzyme Corporation, Boston, MA) over natten ved 30°C. Prøven ble oppløst i gel-prøvebuffer for SDS-PAGE og Western immunogel-avtrykkanalyser.

Isoelektrisk fokusering

Isoelektrisk fokusering av antigenet som erkarakterisert vedhjelp av YCR 010 ble bestemt ved hjelp av en standard "flat-sengs" isoelektrisk fokuseringsteknikk på polyakrylamidgel som beskrevet under.

Membranene ble ekstahert i 6M urea-0,5% NP40-0,05% SDS ved hjelp av sonisering (Heat Systems, Ultrasonics, Inc., modlel W-375) og underkastet horisontal isoelektrisk fokusering (Multiphor II, LKB) på PAGplater pH3,5-9,5 (LKB) i en 1-1/4 timer ved 5°C ved de foreslåtte innstillingene 30W, 50mA og 1500V. Etter innstilling ble de separerte proteinene passivt overført til nitrocellulose i Trisbufferet saltløsning (TBS, 0,02M Tris-0,15M NaCl pH8,0) over natten, immunfarget og synliggjort som i Wester immunogel-avtrykkanalyser.

Isoelektrisk fokusering av antigenet ved hjelp av denne tek-nikken viser at antigenets isoelektriske punkt er fra omkring 5,1 til omkring 5,4.

Claims

1. Et antigen, avledet fra en kilde valgt fra normalt humant vev eller humant tumorinfisert vev, karakterisert ved at antigenet er et glycoprotein med en molekylvekt fra omkring 36.000 til omkring 39.000 og med et isoelektrisk punkt fra omkring 5,1 til omkring 5,4.

2. Antigen som angitt i krav 1, karakterisert ved at antigenet er et 0-bundet glycoprotein.

3. Antigen som angitt i krav 1 til 2, karakterisert ved at antigenet har minst en antigen determinant som er reaktiv overfor det monklonale antistoff YCR010.

4. Antigen som angitt i krav 1 til 3, karakterisert ved at reaktiviteten av antigenet overfor det monoklonale antistoff YCR010 destrueres ved behandling av antigenet med proteinase K eller natrium-perjbdat.

5. Antigen som angitt i krav 1 til 4, karakterisert ved at antigenet er et tumor-assosiert antigen som uttrykkes ved hjelp av colorektal carcinoma.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av monoklonale antistoff for anvendelse ved deteksjon og diagnostisering av canser ved immunisering av mus eller passende vertsdyr med et antigen som angitt i krav 1 til 5 eller med en membranfraksjon av humant tumorinfisert vev fra human colon carcinoma, karakterisert ved at miltceller fra ovennevnte immuniserte mus eller annen passende vert kombineres med passende muse-myelomaceller og man oppnår en blanding av hybride cellelinjer som dyrkes i et passende medium, idet de hybride cellelinjer, som danner et antistoff som omsettes spesifikt med det ovennevnte antigen, utvelges og klones.

7. Monoklonalt antistoff, karakterisert ved at det fremstilles ved fremgangsmåten som angitt i krav 6.

8. Monoklonalt antistoff som angitt i krav 7, karakterisert ved at antistoffet er et Ig-antistoff.

9. Monoklonalt antistoff som angitt i krav 7, karakterisert ved at antistoffet er av type YCR010, fremstilt ved hjelp av hybrid cellelinje ATCC med deponeringsbetegnelse HB8787.

10. Monoklonalt antistoff av type IgM som omsettes spesifikt med et tumorassosiert glycoprotein, karakterisert ved at glycoproteinet har en molekylvekt fra omkring 36.000 til omkring 39.000, et isoelektrisk punkt fra omkring 5,1 til omkring 5,4 og en reaktivitet overfor nevnte monoklonale antistoff som destrueres ved behandling av nevnte glycoprotein med proteinas K eller natrium-perjodat.

11. Monoklonalt antistoff som angitt i krav 10, karakterisert ved at nevnte tumor-assosierte glycoprotein uttrykkes ved hjelp av colorektal carcinoma.

12. Monoklonalt antistoff som angitt i krav 11, karakterisert ved at antistoffet er av type YCR010.

13. Fremgangsmåte for deteksjon og diagnostisering av canser i en antatt canserpasient, karakterisert ved at en vevsprø ve fra pasienten bringes i kontakt med et antistoff som har en spesifikk reaktivitet overfor antigenet i krav 1, 2, 3, 4 eller 5 og bestemmelse av stedene på nevnte vevsprøve hvortil antistoffet bindes, ved hjelp av immunohistokjemiske metoder.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert ved at antistoffet som anvendes er et monoklonalt antistoff.

15. Fremgangsmpte som angitt i krav 14, karakterisert ved at antistoffet som anvendes er av typeY CR010.

16. Fremgangsmåte for in vitro deteksjon og diagnostisering av canser i en antatt canserpasient, karakterisert ved at en prøve i flytende form fra nevnte pasient bringes i kontakt med minst et antistoff med en spesifikk reaktivitet overfor antigenet som angitt i krav 1, 2, 3, 4 eller 5, og bestemmelse av bindingen av antistoffet til komponenter i nevnte prøve i flytende form ved hjelp av immunoassay.

17. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, karakterisert ved at antistoffet som anvendes er et monoklonalt antistoff.

18. Fremgangsmåte som angitt i krav 17, karakterisert ved at antistoffet som anvendes er av type YCR010.

19. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, karakterisert ved at nevnte immunoassay som anvendes er en "two-site" immunometrisk assay idet nevnte antistoff som anvendes er monoklonale antistoff som er ut-valgte til å bindes seg til.ikke-interfererende determinanter på nevnte antigen.

20. Fremgangsmåte for _in vivo deteksjon og diagnostisering av canser i en antatt canserpasient, karakterisert ved tilføring av en forhåndsbestemt effektiv mengde av et antistoff med en spesifikk reaktivitet overfor antigenet som angitt i krav 1, 2, 3, 4 eller 5, og tilføring av nevnte merkede antistoff ved hjelp av en færmasø ytisk tålbar bærer for å tillate deteksjon, idet lokaliseringsstedene på nevnte antistoff påvises.

21. Fremgangsmåte som angitt i krav 20, karakterisert ved at antistoffet som anvendes er et monoklonalt antistoff.

22. Fremgangsmåte som angitt i krav 21, karakterisert ved at antistoffet som anvendes er av type YCR010.

23. Fremgangsmåte for behandling av canser i en canserpasient, karakterisert ved tilføring av en forhåndsbestemt effektiv mengde av et antistoff med en spesifikk reaktivitet overfor antigenet som er angitt i krav 1, 2, 3, 4 eller 5, idet antistoffet tilføres ved hjelp av en farmasøyt-isk tålbar bærer og er konjugert med et passende terapentisk middel.

24. Fremgangsmåte som angitt i krav 23, karakterisert ved at antistoffet som anvendes er et monklonalt antistoff.

25. Fremgangsmåte som angitt i krav 24, karakterisert ved at antistoffet som anvendes er av type YCR010.

26. Monoklonalt antistoff, karakterisert ved at antistoffet er reak-tivt overfor antigenet som angitt i krav 1, 2, 3, 4 eller 5.

27. Monoklonalt antistoff som angitt i krav 26, karakterisert ved at antistoffet er et humant monoklonalt antistoff.

28. Monoklonalt antistoff som angitt k krav 26, karakterisert ved at antistoffet er et monoklonalt antistoff fra mus.

29. Polyklonale antistoff, karakterisert ved at antistoffene er reak-tive overfor antigenet som angitt i krav 1, 2, 3, 4 eller 5.