ES2540114T3 - Polipéptidos - Google Patents
Polipéptidos Download PDFInfo
- Publication number
- ES2540114T3 ES2540114T3 ES11743207.0T ES11743207T ES2540114T3 ES 2540114 T3 ES2540114 T3 ES 2540114T3 ES 11743207 T ES11743207 T ES 11743207T ES 2540114 T3 ES2540114 T3 ES 2540114T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- seq
- albumin
- polypeptide
- binding polypeptide
- albumin binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title abstract description 154
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title abstract description 149
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title abstract description 147
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 132
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 abstract description 129
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 abstract description 129
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 29
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 28
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 28
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 27
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 23
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N Tetraxetan Chemical compound OC(=O)CN1CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 12
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 10
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 210000002568 pbsc Anatomy 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 7
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 7
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 5
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 5
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 5
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 4
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 3
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 3
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 2
- QTQAWLPCGQOSGP-VKNBREQOSA-N [(3r,5r,6s,7r,8e,10r,11r,12z,14e)-6-hydroxy-5,11,21-trimethoxy-3,7,9,15-tetramethyl-16,20,22-trioxo-17-azabicyclo[16.3.1]docosa-1(21),8,12,14,18-pentaen-10-yl] carbamate Chemical compound N1C(=O)\C(C)=C\C=C/[C@@H](OC)[C@H](OC(N)=O)\C(C)=C\[C@@H](C)[C@H](O)[C@H](OC)C[C@H](C)CC2=C(OC)C(=O)C=C1C2=O QTQAWLPCGQOSGP-VKNBREQOSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 2
- 108010044540 auristatin Proteins 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- PKVRCIRHQMSYJX-AIFWHQITSA-N trabectedin Chemical compound C([C@@]1(C(OC2)=O)NCCC3=C1C=C(C(=C3)O)OC)S[C@@H]1C3=C(OC(C)=O)C(C)=C4OCOC4=C3[C@H]2N2[C@@H](O)[C@H](CC=3C4=C(O)C(OC)=C(C)C=3)N(C)[C@H]4[C@@H]21 PKVRCIRHQMSYJX-AIFWHQITSA-N 0.000 description 2
- 229960000977 trabectedin Drugs 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- AUTDIWAXETZSGJ-UHFFFAOYSA-N 2-[4,7-bis(carboxymethyl)-10-[2-[2-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)ethylamino]-2-oxoethyl]-1,4,7,10-tetrazacyclododec-1-yl]acetic acid Chemical compound C1CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CCN1CC(=O)NCCN1C(=O)C=CC1=O AUTDIWAXETZSGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000002090 Fibronectin type III Human genes 0.000 description 1
- 108050009401 Fibronectin type III Proteins 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101001024703 Homo sapiens Nck-associated protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000019298 Lipocalin Human genes 0.000 description 1
- 108050006654 Lipocalin Proteins 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010059724 Micrococcal Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102100036946 Nck-associated protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000000470 PDZ domains Human genes 0.000 description 1
- 108050008994 PDZ domains Proteins 0.000 description 1
- 108010079855 Peptide Aptamers Proteins 0.000 description 1
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102000000395 SH3 domains Human genes 0.000 description 1
- 108050008861 SH3 domains Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000008155 medical solution Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002500 microbody Anatomy 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 101710135378 pH 6 antigen Proteins 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005141 piperazine Drugs 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002600 positron emission tomography Methods 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- AIDBEARHLBRLMO-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecyl sulfate;2-morpholin-4-ylethanesulfonic acid Chemical compound [Na+].OS(=O)(=O)CCN1CCOCC1.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O AIDBEARHLBRLMO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- -1 tendastats Proteins 0.000 description 1
- JRMUNVKIHCOMHV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium bromide Chemical compound [Br-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC JRMUNVKIHCOMHV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000006200 vaporizer Substances 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
- A61K51/081—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins the protein being an albumin, e.g. human serum albumin [HSA], bovine serum albumin [BSA], ovalbumin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Polipéptido de unión a albúmina, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de i) LAX3AKEAANA ELDX14YGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP en donde, independientemente uno de otro X3 se selecciona de E y S; y X14 se selecciona de A, S, C y K; y ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad a la secuencia definida en i).
Description
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E11743207
22-06-2015
Como se describió anteriormente, un conjugado o una proteína de fusión según la presente descripción puede, en presencia de albúmina de suero, combinarse con albúmina y funcionar como una fusión indirecta con albúmina. Esto hace a un conjugado o una proteína de fusión que comprende un polipéptido de unión a albúmina según el primer aspecto útil en modelos de especies preclínicos, a condición de que el segundo resto sea biológicamente activo en las especies seleccionadas.
En una realización, se proporciona una proteína de fusión o conjugado que comprende un resto adicional que consiste en un polipéptido que tiene una actividad biológica deseada adicional, que puede ser la misma que o diferente de la del segundo resto. Un ejemplo específico de tal proteína de fusión o conjugado comprende un polipéptido terapéuticamente eficaz definido anteriormente como segundo resto y un polipéptido de unión definido anteriormente como resto adicional.
Con respecto a la descripción anterior de proteínas de fusión o conjugados que incorporan un polipéptido de unión a albúmina según el primer aspecto, es de advertir que la designación del primer, segundo y más restos se hace por razones de claridad para distinguir entre polipéptido o polipéptidos de unión a albúmina según la presente descripción por una parte, y restos que exhiben otras funciones por otra parte. Estas designaciones no pretenden hacer referencia al orden real de los diferentes dominios en la cadena polipeptídica de la proteína de fusión o conjugado. Así, por ejemplo, dicho primer resto puede, sin restricción, aparecer en el extremo N-terminal, en el centro, o en el extremo C-terminal de la proteína de fusión o conjugado.
En un aspecto relacionado, se proporciona un polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado definido en la presente descripción, que comprende además una molécula orgánica, tal como un agente citotóxico. Ejemplos no limitantes de agentes citotóxicos que se pueden fusionar o conjugar a un polipéptido de unión a albúmina según el primer aspecto, o combinar con una proteína de fusión o conjugado según el segundo aspecto, se seleccionan de calicheamicina, auristatina, doxorubicina, maitansinoide, taxol, ecteinascidina, geldanamicina, metotrexato y sus derivados, y combinaciones de los mismos. Previamente, se han hecho intentos para tratar diversos trastornos con conjugados de albúmina directos. Tales conjugados de albúmina directos han sido explotados p.ej. con doxorubicina en el cáncer (Kratz et al, J Med Chem 45: 5523-33, 2002) y metotrexato en la artritis reumatoide (Wunder et al, J Immunol 170:4793-801, 2003). Es de entender que el polipéptido de unión a albúmina, bien por sí mismo o bien como resto en una proteína de fusión o conjugado, mediante su alta capacidad de unión a la albúmina, proporciona medios indirectos para construir complejos de albúmina, y por tanto puede proporcionar un método de tratamiento alternativo en comparación con los intentos mencionados anteriormente.
Los aspectos anteriores abarcan además polipéptidos en los que el polipéptido de unión a albúmina según el primer aspecto, o el polipéptido de unión a albúmina comprendido en una proteína de fusión o conjugado según el segundo aspecto, ha sido dotado de un grupo marcador, tal como una etiqueta seleccionada del grupo que consiste en colorantes fluorescentes y metales, colorantes cromofóricos, compuestos quimioluminiscentes y proteínas bioluminiscentes, enzimas, radionúclidos y partículas, por ejemplo para fines de detección del polipéptido. En particular, la descripción abarca un polipéptido radiomarcado que consiste en un radioquelato de un polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado descrito en la presente memoria y un radionúclido, tal como un metal radioactivo.
En realizaciones donde el polipéptido de unión a albúmina marcado comprende un polipéptido de unión a albúmina según el primer aspecto de la descripción y una etiqueta, el polipéptido marcado se puede usar por ejemplo para marcar albúmina de suero indirectamente. Debido a la fuerte asociación entre el polipéptido marcado y la albúmina de suero, el polipéptido marcado se puede usar por ejemplo para estudiar la permeabilidad vascular y la acumulación de sangre.
En otras realizaciones, el polipéptido de unión a albúmina marcado está presente como un resto en una proteína de fusión o conjugado que comprende también un segundo resto que tiene una actividad biológica deseada. La etiqueta puede en algunos casos estar acoplada sólo al polipéptido de unión a albúmina, y en algunos casos tanto al polipéptido de unión a albúmina como al segundo resto del conjugado o proteína de fusión. Cuando se hace referencia a un polipéptido marcado, esto debe entenderse como una referencia a todos los aspectos de los polipéptidos descritos en la presente memoria, incluyendo proteínas de fusión y conjugados que comprenden un polipéptido de unión a albúmina y un segundo y opcionalmente adicionales restos. Por tanto, un polipéptido marcado puede contener sólo el polipéptido de unión a albúmina y p.ej. un radionúclido terapéutico, que puede estar quelado
o acoplado covalentemente al polipéptido de unión a albúmina, o contener el polipéptido de unión a albúmina, un radionúclido terapéutico y un segundo resto tal como una molécula pequeña que tiene una actividad biológica deseada tal como eficacia terapéutica.
En realizaciones donde el polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado esté radiomarcado, tal polipéptido radiomarcado puede comprender un radionúclido. Una mayoría de radionúclidos tienen una naturaleza metálica, y los metales son típicamente incapaces de formar enlaces covalentes estables con los elementos presentados en las proteínas y péptidos. Por esta razón, el marcado de proteínas y péptidos con metales radioactivos se realiza con el uso de queladores, es decir, ligandos multidentados, que forman compuestos no covalentes, llamados quelatos, con los iones del metal. En una realización del polipéptido de unión a albúmina,
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E11743207
22-06-2015
Así, se usan aminoácidos normales (p.ej. glicina, alanina, fenilalanina, isoleucina, leucina y valina) y derivados de aminoácidos preprotegidos para construir secuencialmente una secuencia de polipéptido, en disolución o sobre un soporte sólido en un disolvente orgánico. Se describe un ejemplo específico de síntesis de péptidos sobre soporte sólido en el Ejemplo 5. Cuando se construye una secuencia de polipéptido completa, los grupos protectores se retiran y se deja que el polipéptido se pliegue en una disolución acuosa. Cada polipéptido según la presente descripción se pliega de manera reversible en un dominio empaquetado de tres hélices sin factores añadidos, y por tanto se pliega espontáneamente.
El conjugado según el segundo aspecto se puede producir por un método que comprende producir un polipéptido de unión a albúmina según cualquiera de los métodos descritos anteriormente, tal como por síntesis peptídica no biológica, y conjugar el polipéptido de unión a albúmina producido con un segundo y/o más restos definidos en relación con el segundo aspecto.
En una realización de una proteína de fusión o conjugado, se proporciona además una proteína de fusión o conjugado definido en la presente memoria para uso en terapia, p.ej. para uso como medicamento. Tal proteína de fusión o conjugado puede exhibir una semivida in vivo que es más larga que la semivida in vivo del polipéptido que tiene una actividad biológica deseada per se. La proteína de fusión o conjugado puede incitar además una respuesta inmune reducida o ninguna tras su administración al mamífero, tal como un ser humano, en comparación con la respuesta inmune incitada tras la administración al mamífero del polipéptido que tiene una actividad biológica deseada per se. Hablando de manera alternativa, esto proporciona un método para disminuir la inmunogenicidad de un polipéptido que tiene una actividad biológica deseada, mediante la fusión o conjugación de tal polipéptido a un polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado según aspectos descritos en la presente memoria. Además, esto puede permitir la mejora de la actividad biológica de un segundo resto.
En otra realización, se proporciona una proteína de fusión o conjugado según la presente descripción, para uso en diagnosis, p.ej. para uso como agente diagnóstico.
La presente descripción también se refiere a diferentes aspectos del uso del polipéptido de unión a albúmina descrito anteriormente, así como diversos métodos para el tratamiento, diagnosis y detección en los que el polipéptido es útil debido a su unión y otras características. Cuando se hace referencia al "polipéptido de unión a albúmina" en la siguiente descripción de estos usos y métodos, este término pretende abarcar el polipéptido de unión a albúmina solo, pero también todas aquellas moléculas basadas en este polipéptido descrito anteriormente que p.ej. incorporen el polipéptido de unión a albúmina como resto en una proteína de fusión o conjugado, y/o esté conjugados a una etiqueta, un quelador, un agente terapéutico y/o diagnóstico y/o estén dotados de residuos de aminoácidos adicionales como una etiqueta o para otros fines. Como se explicó anteriormente, tales proteínas de fusión, derivados, etc. forman una parte de la presente descripción.
Otro conjunto de aspectos se refieren a la provisión de nuevos medios para aumentar la solubilidad en disolución acuosa de un compuesto escasamente soluble, mediante la conjugación del mismo a un polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado. El complejo resultante del compuesto escasamente soluble y un polipéptido de unión a albúmina, solo o incorporado como resto en una proteína de fusión o conjugado, es capaz de asociarse con albúmina in vivo o in vitro, asociación que aumenta la solubilidad en disolución acuosa. Por tanto, en una realización de este aspecto adicional, se proporciona una composición, que comprende
un compuesto que per se tiene una solubilidad en agua de no más que 100 µg/ml; acoplado a
un polipéptido de unión a albúmina, una proteína de fusión o conjugado descrito en la presente memoria, en donde el compuesto y el polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado están acoplados covalentemente.
En una realización, el compuesto per se tiene una solubilidad de no más que 10 µg/ml. En aún otra realización, dicha solubilidad es no más que 1 µg/ml.
En algunas realizaciones, el compuesto puede ser un compuesto farmacéuticamente activo, por ejemplo un agente citotóxico. Ejemplos no limitantes de agentes citotóxicos son los seleccionados de calicheamicina, auristatina, doxorubicina, maitansinoide, taxol, ecteinascidina, geldanamicina y sus derivados, y combinaciones de los mismos. Alternativamente, el agente citotóxico puede ser una quimiotoxina sintética preparada por síntesis orgánica y no derivada de un compuesto existente en la naturaleza.
Además del compuesto escasamente soluble y el polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado, la composición según este aspecto de la descripción puede comprender también, en algunas realizaciones, un polipéptido de unión con una afinidad por una diana clínicamente relevante. Este polipéptido de unión es adecuadamente diferente del polipéptido de unión a albúmina, y se puede acoplar no covalentemente o covalentemente a los otros componentes de la composición inventiva. Como ejemplos no limitantes, el polipéptido de unión con una afinidad por una diana clínicamente relevante se puede seleccionar del grupo que consiste en anticuerpos y fragmentos y dominios de los mismos que retengan sustancialmente actividad de unión de anticuerpo; microcuerpos, maxicuerpos, avímeros y otras proteínas pequeñas unidas a disulfuro; y proteínas de unión derivadas de un andamio seleccionado del grupo que consiste en proteína A de estafilococo y dominios de la misma, otros dominios de tres hélices, lipocalinas, dominios de repetición de anquirina, dominios de unión a celulosa, cristalinos γ,
10
15
20
25
30
35
40
45
50
E11743207
22-06-2015
proteína verde fluorescente, antígeno 4 citotóxico asociado con linfocitos T humanos, inhibidores de proteasa tales como dominios Kunitz, dominios PDZ, dominios SH3, aptámeros peptídicos, nucleasa estafilocócica, tendamistatos, dominio de fibronectina tipo III, transferrina, dedos de cinc y conotoxinas.
La composición según el aspecto anterior de la presente descripción tiene una capacidad para asociarse con albúmina in vivo o in vitro, mediante la provisión en la composición de un polipéptido de unión a albúmina, por sí mismo o presente en una proteína de fusión o conjugado. En ciertos casos, puede ser beneficioso formar un complejo de la composición con albúmina fuera de un organismo vivo, es decir, añadir albúmina exógena a la composición. Tal composición puede ser liofilizada, proporcionando una formulación que es adecuada para un almacenamiento a temperatura ambiente. Por tanto, la presente descripción también proporciona una composición definida anteriormente que comprende además albúmina, tal como albúmina de suero humano.
La presente descripción también proporciona la composición según el aspecto anterior para uso como medicamento, es decir, para uso en terapia, en los casos donde el compuesto sea un compuesto terapéuticamente activo. Adecuadamente, la provisión de un polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado y opcionalmente albúmina no afecta de manera perjudicial a la eficacia terapéutica del compuesto activo, con lo que la composición inventiva será útil en aquellos ajustes terapéuticos o profilácticos donde esté indicado el compuesto per se.
En otra realización, se proporciona la composición según el aspecto anterior para uso como agente diagnóstico, es decir, para uso en diagnosis.
Un aspecto relacionado de la presente descripción proporciona un método de preparación de una composición como la descrita inmediatamente antes. El método comprende
proporcionar un compuesto que per se tiene una solubilidad en agua de no más que 100 µg/ml; y
acoplar covalentemente el compuesto a un polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado según los aspectos descritos en la presente memoria, formando así una composición que comprende un complejo covalente de compuesto y polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado.
En realizaciones de la presente descripción donde se incluye albúmina en la composición, el método puede comprender la etapa adicional de mezclar dicho complejo de compuesto y polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado con albúmina, formando así una composición que comprende un complejo no covalente de i) el complejo covalente de compuesto y polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado , y ii) albúmina. Las proporciones relativas de los dos componentes de este complejo no covalente pueden ser por ejemplo 1:1, con lo que una unidad del complejo de compuesto escasamente soluble y polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado está asociada con una molécula de albúmina. En una realización, el método comprende adicionalmente liofilizar el complejo no covalente para obtener una composición liofilizada.
En otro aspecto estrechamente relacionado, la presente descripción proporciona un método para aumentar la solubilidad acuosa de un compuesto, que comprende
proporcionar un compuesto que per se tiene una solubilidad en agua de no más que 100 µg/ml;
acoplar covalentemente el compuesto a un polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado según los aspectos descritos en la presente memoria, formando así un complejo covalente de compuesto y polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado; y
mezclar dicho complejo de compuesto y polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado con albúmina bajo condiciones que promuevan la asociación no covalente del polipéptido de unión a albúmina con albúmina;
por lo que la solubilidad en agua del compuesto en dicho complejo es mayor que la solubilidad en agua del compuesto per se.
En estos aspectos del método concernientes a la solubilidad de un compuesto escasamente soluble, los rasgos opcionales de los diversos componentes son como se describen en relación con el aspecto de la composición inmediatamente precedente.
Aunque la invención ha sido descrita con referencia a diversas realizaciones ilustrativas, los expertos en la técnica entenderán que se pueden hacer diversos cambios, y los equivalentes pueden ser sustituidos por elementos de los mismos sin apartarse del alcance de la invención. Además, se pueden hacer muchas modificaciones para adaptar una situación o molécula particular a las enseñanzas de la invención sin apartarse del alcance esencial de la misma. Por lo tanto, se pretende que la invención no se limite a ninguna realización particular contemplada para llevar a cabo esta invención, sino que la invención incluya todas las realizaciones que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E11743207
22-06-2015
Figuras
La Figura 1 es un listado de las secuencias de aminoácidos de ejemplos de polipéptidos de unión a albúmina de la presente descripción (SEQ ID NO:1-152, SEQ ID NO:155-203), el dominio GA3 de la proteína G de la cepa de Streptococcus G148 extendido por un residuo de glicina N-terminal (SEQ ID NO:153) y un polipéptido de unión a albúmina derivado de G148-GA3 como describieron previamente Jonsson et al (arriba, SEQ ID NO:154).
La Figura 2 muestra el resultado del análisis de unión realizado en un instrumento Biacore para investigar la unión del polipéptido de unión a albúmina PEP07912 (SEQ ID NO:157) a albúmina de suero humano. Se inyectaron tres concentraciones diferentes de proteína purificada (40 nM, línea gris gruesa; 10 nM, línea negra; y 2,5 nM, línea gris) sobre una superficie con 955 UR de albúmina de suero humano inmovilizada.
Las Figuras 3A-C muestran el resultado del análisis de unión realizado por ELISA para investigar la unión de los polipéptidos de unión a albúmina PEP07913 (SEQ ID NO:153), PEP06923 (SEQ ID NO:154), PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07554 (SEQ ID NO:156), PEP07914 (SEQ ID NO:158), PEP07968 (PEP07911 conjugado con DOTA, SEQ ID NO:159) y PEP07844 (SEQ ID NO:161), a moléculas IgG presentes en sueros de 126 individuos humanos normales, donde A) muestra el valor OD medio, B) muestra el porcentaje de sueros negativos (definidos como OD < 0,15), y C) muestra el porcentaje de sueros positivos (definidos como OD > 1,0).
Las Figuras 4A-B son cromatogramas que muestran el análisis del polipéptido de unión a albúmina producido químicamente, purificado, PEP07834 (SEQ ID NO:160), donde A) muestra la señal de absorbancia a 220 nm, blanco restado, y B) muestra la señal de absorbancia a 280 nm, blanco restado. Aparecieron dos picos a ambas longitudes de onda.
Las Figuras 5A-B son espectrogramas que muestran el análisis espectrométrico de masas de los dos picos identificados en la Figura 4A) y B). A) es el espectrograma del primer pico, es decir, el monómero de PEP07834 (SEQ ID NO:160) y B) es el espectrograma del dímero de PEP07834.
Las Figuras 6A-C son diagramas que muestran una evaluación de inmunogenicidad de los polipéptidos de unión a albúmina PEP07913 (SEQ ID NO:153), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07914 (SEQ ID NO:158) y PEP07968 (PEP07911 conjugado con DOTA, SEQ ID NO:159) en un ensayo de proliferación de linfocitos T CD3+ CD4+. A) muestra el número de individuos que responden a los polipéptidos de unión a albúmina en comparación con albúmina humana recombinante en una cohorte de 52 donantes caucásicos. B) muestra los índices de estimulación medios (SI) para PEP07913, PEP07912, PEP07914 y PEP07968 en comparación con el control negativo que contiene albúmina humana recombinante. C) muestra el número de individuos que responden contra todas las proteínas en el estudio en comparación con el tampón de control.
Las Figuras 7A-C muestran el resultado del análisis de unión realizado en un instrumento Biacore para investigar la unión de los polipéptidos de unión a albúmina A) PEP07986 (SEQ ID NO:163), B) PEP08296 (PEP08185 conjugado con DOTA, SEQ ID NO:148) y C) PEP06923 (SEQ ID NO:154) a albúmina de diferentes especies. Los sensogramas mostrados corresponden a proteína inyectada a una concentración de 40 nM sobre superficies inmovilizadas con albúmina de ser humano (1130 UR), línea gris fina; mono cinomolgo (1046 UR), línea gris gruesa; rata (831 UR), línea gris claro gruesa; perro (1053 UR), línea negra fina; y ratón (858 UR), línea negra gruesa.
La Figura 8 muestra el efecto inhibitorio de ZX-PP013 (círculos abiertos), ZY-PP013 (cuadrados abiertos) y Zneg-PP013 (triángulos cerrados) sobre la proliferación de células TF-1 inducida por citocinas en presencia de un exceso molar de cinco veces de HSA.
La Figura 9 muestra las respuestas de unión máximas obtenidas por análisis en Biacore de PEP07986 (SEQ ID NO:163) almacenado a 4, 25 o 40 ºC durante una semana, dos semanas, un mes y tres meses como se indica, a una concentración de 2 mg/ml, inyectado sobre HSA inmovilizada (704 UR) a una concentración de 10 nM. Se muestran muestras no tratadas de tiempo = 0 como referencias.
La Figura 10 muestra el resultado del análisis de unión realizado en un instrumento Biacore para investigar la unión del polipéptido de unión a albúmina PEP08296 (PEP08185 conjugado con DOTA, SEQ ID NO:148) a albúmina de suero humano antes y después de un tratamiento con calor. Se inyectaron dos concentraciones de PEP08296 (0,8 nM, líneas grises; 4 nM, líneas negras) sobre una superficie con 724 UR de albúmina de suero humano inmovilizada. Las líneas sólidas son antes del tratamiento con calor y las líneas discontinuas después del tratamiento con calor durante 10 minutos a 90 ºC.
Las Figuras 11 A-B muestran el solapamiento de dos espectros CD de PEP08296 (PEP08185 conjugado con DOTA, SEQ ID NO:148) antes y después de un tratamiento con calor durante 12 min a 90 ºC. A) Muestra incubada en PBS pH 7,2. B) Muestra incubada en PBS pH 4,0.
La Figura 12 muestra la imagen de proyección de intensidad máxima (MIP) de la distribución en cuerpo entero de 68Ga-PEP08296 en una rata sana, sumada durante 1,5 h de recogida de datos inmediatamente después de la
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E11743207
22-06-2015
inyección intravenosa (vena de la cola). La radioactividad circulante en los vasos principales (p.ej. la yugular (flecha larga) y femoral (flecha corta)), el corazón (H), hígado (L), bazo (S), riñón (K) y vejiga (B) se delinea fácilmente.
La Figura 13 muestra un cromatograma de filtración en gel de PEP07986 (SEQ ID NO:163) inyectado a una concentración de 42 mg/ml, línea sólida negra. Se incluye para comparación un cromatograma de ovalbúmina (Mw 43 kDa) inyectada a una concentración de 5 mg/ml, línea rota gris, confirmando que el pico para PEP07986 no es un agregado, lo que se habría esperado en el volumen vacío eluido en un punto de tiempo anterior que la ovalbúmina.
La invención será ilustrada ahora adicionalmente mediante la descripción no limitante de experimentos realizados de acuerdo con la misma. A menos que se especifique lo contrario, se usaron en todos los experimentos métodos de química y biología molecular convencionales.
Ejemplos
Ejemplo 1:
Clonación, expresión, purificación y caracterización de polipéptidos de unión a albúmina
En este ejemplo, diez diferentes polipéptidos de unión a albúmina, PEP07913 (SEQ ID NO:153), PEP07912 (SEQ ID NO:156), PEP07914 (SEQ ID N0:158), PEP07968 (PEP07911 conjugado con DOTA, SEQ ID NO:159), PEP06923 (SEQ ID NO:154), PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07554 (SEQ ID NO:156), PEP07844 (SEQ ID NO:161), PEP07986 (SEQ ID NO:163) y PEP08296 (PEP08185 conjugado con DOTA, SEQ ID NO:148), cuyas secuencias de aminoácidos se exponen en la Figura 1 y en el listado de secuencias adjunto, se clonaron, purificaron y caracterizaron.
Material y métodos
Clonación de variantes de polipéptidos de unión a albúmina
Se generaron mutaciones en G148-GA3 usando mutagénesis dirigida al sitio con los oligonucleótidos apropiados para obtener las variantes de polipéptidos de unión a albúmina deseadas. Los fragmentos génicos fueron amplificados por PCR con cebadores que añadían sitios de endonucleasa específicos, así como una secuencia de MGSS N-terminal que precedía a las variantes de polipéptidos de unión a albúmina. Los fragmentos fueron escindidos con NdeI y NotI, purificados y ligados a un vector de clonación, el plásmido pAY02556 (que contenía un origen de replicación de pBR322, un gen de resistencia a la kanamicina y un promotor de T7 para la expresión del gen de interés), restringido con las mismas enzimas. Las ligaciones fueron transformadas en células E. coli TOP10 electrocompetentes. Las células transformadas fueron extendidas sobre placas TBAB (30 g/l de agar base de triptosa y sangre) suplementadas con 50 µg/ml de kanamicina, seguido de incubación a 37 ºC durante una noche. Las colonias fueron cribadas usando PCR, y la secuenciación de los fragmentos amplificados se realizó usando el oligonucleótido biotinilado y un kit de secuenciación de ciclos BigDye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems), usado de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las reacciones de secuenciación fueron purificadas por unión a perlas magnéticas revestidas con estreptavidina usando un Magnatrix 8000 (NorDiag AB), y analizadas en un Analizador Genético ABI PRISM® 3100 (PE Applied Biosystems). Todas las variantes de polipéptidos de unión a albúmina fueron subclonadas como monómeros, y los constructos codificados por los vectores de expresión fueron MGSS[PP###], donde PP### corresponde a los residuos de aminoácidos que constituyen la secuencia del polipéptido de unión a albúmina.
Además, los fragmentos génicos de G148-GA3, PP007 (SEQ ID NO:7), PP013 (SEQ ID NO:13) y PP037 (SEQ ID NO:37) fueron amplificados por PCR con cebadores que añadían sitios de endonucleasa específicos así como una secuencia de hexahistidina, un sitio de proteasa TEV y un residuo de glicina antes de los residuos de aminoácidos que constituyen la secuencia del polipéptido de unión a albúmina. Los polipéptidos PEP07913 (SEQ ID NO:153), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07914 (SEQ ID NO:158) y PEP07968 (SEQ ID NO:159) corresponden a los polipéptidos de unión a albúmina G148-GA3, PP007 (SEQ ID NO:7), PP013 (SEQ ID NO:13) y PP037 (SEQ ID NO:37) con residuos de glicina añadidos. Los fragmentos fueron escindidos con XbaI y NotI, purificados y ligados a un vector de clonación, el plásmido pAY02512 (que contenía un origen de replicación de pBR322, un gen de resistencia a la kanamicina y un promotor de T7 para la expresión del gen de interés. El sitio de clonación está precedido por una secuencia que codifica un péptido que contiene una etiqueta de hexahistidina seguido de un sitio de escisión para la proteasa TEV), restringido con las mismas enzimas. La ligación, transformación y verificación de secuencia se realizaron como se describió anteriormente. Las cuatro variantes de polipéptido de unión a albúmina G148-GA3, PP007, PP013 y PP037 fueron subclonadas como monómeros, y los constructos codificados por los vectores de expresión fueron MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQG-[PP###].
El vector de expresión que codifica MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLY-FQG-[PP013] fue modificado adicionalmente por mutagénesis dirigida al sitio usando oligonucleótidos, dando como resultado la inserción de un residuo de serina antes de los residuos de aminoácidos que constituyen la secuencia del polipéptido de unión a albúmina, para obtener el constructo MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQ-GS-[PP013]. Este constructo fue modificado adicionalmente por 1) mutagénesis dirigida al sitio para reemplazar el residuo de serina en la posición 14 (dentro de PP013) con un residuo de cisteína, generando MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQGS-[PP049], y 2)
10
15
20
25
30
35
40
45
50
E11743207
22-06-2015
Purificación de variantes de polipéptidos de unión a albúmina sin etiqueta His6
Gránulos de células congeladas que albergaban las variantes de polipéptidos de unión a albúmina solubles PEP06923 (SEQ ID NO:154), PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07554 (SEQ ID NO:156) y PEP07844 (SEQ ID NO:161) se suspendieron en Tris-HCl 20 mM, pH 8, y se disgregaron por ultrasonicación. Para cada una de las variantes de polipéptidos, la suspensión se aclaró por centrifugación (30 min, 32.000 × g, 4 ºC) y el sobrenadante se cargó sobre una columna HSA-Sepharose (GE Healthcare). Después de lavar con tampón TST (Tris-HCl 25 mM, EDTA 1 mM, NaCl 200 mM, Tween 20 al 0,05%, pH 8,0), seguido de NH4Ac 5 mM, pH 5,5, la variante de polipéptido de unión a albúmina unida se eluyó con HAc 0,5 M, pH 3,2.
Las variantes de polipéptidos de unión a albúmina fueron purificadas adicionalmente por cromatografía de fase inversa (RPC), como sigue. Para cada una de las variantes, el eluato de la etapa de purificación por afinidad a HSA se cargó en una columna Resource 15 RPC de 1 ml (GE Healthcare), equilibrada previamente con Tampón RPC A (TFA al 0,1 % en agua). Después del lavado de la columna con 10 VC de Tampón de RPC A, los polipéptidos unidos fueron eluidos con un gradiente lineal de 0-50 % de Tampón de RPC B (TFA al 0,1 % en acetonitrilo) durante 10 VC. El caudal fue 2 ml/min, y la absorbancia a 280 nm fue monitorizada. Las fracciones que contenían variantes de polipéptido de unión a albúmina puras fueron identificadas por análisis SDS-PAGE y reunidas. Finalmente, el tampón fue cambiado a 1xPBS (KCI 2,68 mM, NaCl 137 mM, KH2PO4 1,47 mM, Na2HPO4 8,1 mM, pH 7,4) usando una columna de desalación PD-10 desechable (GE Healthcare).
Caracterización de variantes de polipéptidos de unión a albúmina purificadas
La concentración fue evaluada midiendo la absorbancia a 280 nm usando un espectrofotómetro NanoDrop® ND1000. Las proteínas fueron analizadas adicionalmente con SDS-PAGE y LC-MS.
Para el análisis SDS-PAGE, se mezclaron aproximadamente 10 µg de cada variante de polipéptido de unión a albúmina con Tampón de Muestras NuPAGE LDS (Invitrogen), se incubaron a 70 ºC durante 15 min y se cargaron sobre geles NuPAGE 4-12 % Bis-Tris (Invitrogen). Los geles fueron procesados con tampón de ejecución NuPAGE MES SDS (Invitrogen) en una celda de electroforesis XCell II SureLock (Novex) empleando el Estándar Sharp Prestained (Invitrogen) como marcador del peso molecular y usando PhastGel BlueR (GE Healthcare) para la tinción.
Para verificar la identidad de las variantes de polipéptidos de unión a albúmina, se realizaron análisis LC/MS usando un sistema Agilent 1100 LC/MSD, equipado con API-ESI y un analizador de masas de cuadrupolo simple. Se cargaron aproximadamente 10 µg de cada una de las variantes de polipéptidos de unión a albúmina purificadas en una columna Zorbax 300SB-C8 Narrow-Bore (2,1 x 150 mm, 3,5 µm, Agilent Technologies) a un caudal de 0,5 ml/min. Los polipéptidos fueron eluidos usando un gradiente lineal de 10-70 % de disolución B durante 15 min a 0,5 ml/min. La separación se realizó a 30 °C. La señal iónica y la absorbancia a 280 y 220 nm fueron monitorizadas. Los pesos moleculares de las variantes de polipéptidos de unión a albúmina purificadas fueron confirmados por MS.
Resultados
Los niveles de expresión de las variantes de polipéptidos de unión a albúmina fueron 10-30 mg de producto/g de gránulo de células, estimado por análisis SDS-PAGE.
Para todas las variantes, la pureza, determinada por análisis SDS-PAGE, superó el 95 % y el análisis LC/MS verificó los correctos pesos moleculares. Después de la purificación, se obtuvieron entre 1 y 8 mg de polipéptido puro para cada una de las diez variantes de polipéptidos de unión a albúmina.
Ejemplo 2:
Determinación de la afinidad para polipéptidos de unión a albúmina
En este ejemplo, PEP06923 (SEQ ID NO:154), PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07844 (SEQ ID NO:161), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07913 (SEQ ID NO:153), PEP07914 (SEQ ID NO:158) y PEP07968, (PEP07911 conjugado con DOTA, SEQ ID NO:159), sintetizados o expresados y purificados en el Ejemplo 1, fueron caracterizados en cuanto a su afinidad a albúmina de suero humano (HSA) usando un instrumento Biacore. PEP07913 corresponde a la secuencia de aminoácidos de G148-GA3 con la adición de un residuo de glicina Nterminal, mientras que PEP07271, PEP07844, PEP07912, PEP07914 y PEP07968 corresponden a los polipéptidos de unión a albúmina de PP001 (SEQ ID NO:1), PP043 (SEQ ID NO:43), PP007 (SEQ ID NO:7), PP013 (SEQ ID NO:13) y PP037 (SEQ ID NO:37) con diferentes adiciones de aminoácido N-terminal.
Material y métodos
Se realizó un análisis Biosensor en un instrumento Biacore2000 (GE Healthcare) con HSA (Albucult®, Novozymes), inmovilizada por acoplamiento de amina sobre la capa de dextrano carboxilado de las superficies de chips CM-5 (calidad investigación; GE Healthcare) según las recomendaciones del fabricante. La superficie 1 del chip fue activada y desactivada y usada como celda de referencia (superficie blanco) durante las inyecciones, mientras que
E11743207
22-06-2015
Como se muestra en las Tablas 1 y 2, PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07844 (SEQ ID NO:161), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07914 (SEQ ID NO:158) y PEP07968 (PEP07911 conjugado con DOTA, SEQ ID NO:159) parecen tener todos aproximadamente la misma afinidad por HSA, superando ampliamente la afinidad del G148-GA3 parental (PEP07913; SEQ ID NO:153). La afinidad por HSA de estos polipéptidos es ligeramente más baja en
5 comparación con PEP06923 (SEQ ID NO:154), a pesar de una velocidad de reacción inversa similar.
Ejemplo 3:
Determinación de la temperatura de fusión (Tm) para polipéptidos de unión a albúmina
En este ejemplo, las variantes de polipéptidos de unión a albúmina PEP07913 (SEQ ID NO:153), PEP06923 (SEQ ID NO:154), PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07554 (SEQ ID NO:156), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07914 10 (SEQ ID NO:158), PEP07968 (PEP07911 conjugado con DOTA, SEQ ID NO:159), PEP07844 (SEQ ID NO:161) y PEP07986 (SEQ ID NO:163), expresadas y purificadas como se describe en el Ejemplo 1, y la variante de polipéptido de unión a albúmina PEP07975 (PEP07834 conjugado con DOTA, SEQ ID NO:160), producida como se describe en el Ejemplo 5, se analizaron por análisis CD. PEP07913 corresponde a la secuencia de G148-GA3 que tiene un residuo de glicina N-terminal, PEP06923 es un derivado de alta afinidad diseñado, descrito previamente por
15 Jonsson et al, arriba, mientras que PEP07271, PEP07554, PEP07912, PEP07914, PEP07968, PEP07844 y PEP07975 son ejemplos de los polipéptidos de unión a albúmina de PP001 (SEQ ID NO:1), PP007 (SEQ ID NO:7), PP013 (SEQ ID NO:13), PP037 (SEQ ID NO:37) y PP043 (SEQ ID NO:43) que tienen diferentes adiciones de aminoácido N-terminal según la presente descripción.
Material y métodos
20 Las variantes de polipéptidos de unión a albúmina purificadas fueron diluidas en 1xPBS, hasta concentraciones finales entre 0,4 y 0,5 mg/ml. Se realizó un análisis de dicroísmo circular (CD) en un espectropolarímetro Jasco J810, en una celda con una longitud de camino óptico de 1 mm. En las medidas a temperaturas variables, la absorbancia se midió a 221 nm de 20 ºC a 90 ºC, con una pendiente de temperatura de 5 ºC/min.
Resultados
25 Las temperaturas de fusión (Tm) de las diferentes variantes de polipéptidos de unión a albúmina se calcularon determinando el punto medio de la transición en la representación gráfica de CD frente a temperatura. Los resultados se resumen en la Tabla 3 a continuación.
Tabla 3. Valores determinados de Tm de las variantes de polipéptidos de unión a albúmina ensayadas
- Variante
- SEQ ID NO:# Secuencia N-terminal3 Tm (°C)
- PEP07913
- SEQ ID NO:153 GL 61
- PEP06923
- SEQ ID NO:154 GSSL 57
- PEP07271
- SEQ ID NO:155 GSSL 65
- PEP07554
- SEQ ID NO:156 GSSL 58
- PEP07912
- SEQ ID NO:157 GL 53
- PEP07914
- SEQ ID NO:158 GL 59
- PEP07968
- SEQ ID NO:1591 GL 53
- PEP07975
- SEQ ID NO:1601,2 AL 50
- PEP07844
- SEQ ID NO:161 GSSL 65
- PEP07986
- SEQ ID NO:163 GSL 61
- 1) El péptido está conjugado con maleimida-DOTA en la cisteína 2) El péptido está amidado en el término C 3) Leucina (subrayada) es el residuo en la posición 1 de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de unión a albúmina definido en el primer aspecto de la presente descripción
10
15
20
25
30
35
40
45
50
E11743207
22-06-2015
El polipéptido PEP07968 es idéntico a PEP07912, excepto en que el primero tiene un residuo de cisteína en la posición 14 conjugado con maleimida DOTA, y el segundo un residuo de serina. Por tanto, la modificación con DOTA no debe afectar a la temperatura de fusión. También PEP07975 está conjugado con DOTA usando C14, y es idéntico a PEP07968 excepto por la amida C-terminal (que resulta de la síntesis peptídica en el Ejemplo 5) y por tener una alanina N-terminal en lugar de una glicina. Además, la comparación de PEP07912 y PEP07554 revela que una serina N-terminal da una temperatura de fusión más alta que una glicina en la misma posición (5 ºC de diferencia en Tm). Por tanto, todas las variantes de polipéptidos de unión a albúmina según la presente descripción muestran una Tm por encima de 55 ºC, excepto PEP07912 y variantes conjugadas con DOTA. Tomando en consideración la importancia de la porción N-terminal, todos los polipéptidos de unión a albúmina ensayados son superiores al derivado de la técnica anterior de Jonsson et al, es decir, PEP06923.
Ejemplo 4:
Análisis de la respuesta del suero
El porcentaje de suero humano que contiene IgG, capaz de unirse a un juego de polipéptidos de unión a albúmina descritos en la presente memoria, se analizó por ELISA. En total, se cribaron 149 muestras de suero correspondientes a 127 individuos.
Material y métodos
Se revistieron placas de ELISA (placas de 96 pocillos, de media área (Costar, Nº de cat. 3690)) con 50 µl/pocillo de Albucult® (Novozymes) diluido hasta 8 µg/ml en tampón de revestimiento (Sigma, Nº de cat. 3041). Las placas fueron revestidas por la noche durante tres días a 4 ºC. En el día del análisis, las placas se lavaron dos veces con agua del grifo y se bloquearon durante 2 horas con 100 µl de suero salino tamponado con fosfato (PBS) que contenía caseína al 0,05 % (PBSC). Las placas fueron vaciadas y se añadieron 50 µl/pocillo de los polipéptidos de unión a albúmina PEP07913 (SEQ ID NO:153), PEP06923 (SEQ ID NO:154), PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07554 (SEQ ID NO:156), PEP07914 (SEQ ID NO:158), PEP07968 (PEP07911 conjugado con DOTA, SEQ ID NO:159) y PEP07844 (SEQ ID NO:161), diluidos a 2 µg/ml en PBSC, según una disposición de placa hecha previamente. Después de una incubación durante dos horas a temperatura ambiente (TA), las placas se lavaron en PBSC cuatro veces usando un lavador de ELISA automatizado. Las 149 muestras de suero de 129 individuos se diluyeron 50 veces en PBSC añadiendo 24 µl de suero a 1174 µl de PBSC. Se añadieron 50 µl de los sueros diluidos por pocillo según la disposición de placa hecha previamente. Cada muestra de suero se ensayó como singlete. Se incluyeron controles positivos y negativos en cada placa y para cada polipéptido de unión a albúmina. Se añadieron anticuerpos de unión a albúmina (50 µl, 0,5 µl/ml de solución de inmunoglobulina preparada en el laboratorio a partir de sueros de primates inmunizados con PEP06923) como control positivo, y se usaron 50 µl de PBSC como control negativo. Las placas fueron incubadas durante una hora a TA y posteriormente se lavaron cuatro veces en PBSC usando un lavador de ELISA automatizado. La IgG enlazada se detectó con 50 µl/pocillo de IgG anti-humana (Southern Biotech, nº de cat. 2040-05) diluida 10.000 veces en PBSC. Después de lavar cuatro veces en PBSC usando un lavador de ELISA automatizado, se añadieron 50 µl/pocillo de sustrato (Pierce Nº de cat. 34021). La reacción fue detenida después de 10-15 minutos mediante la adición de 50 µl de H2SO4 a cada pocillo, antes de medir la absorbancia usando un lector de placas multipocillo (Victor3, Perkin Elmer).
Resultados
De los 149 sueros cribados para la unión de IgG a los polipéptidos de unión a albúmina, 23 fueron negativos para los ocho polipéptidos (valor OD < 0,1), es decir, no mostraron IgG unida a los polipéptidos. El análisis se realizó con los 126 sueros que fueron positivos para uno o más polipéptidos de unión a albúmina. Se calculó la absorbancia media (Figura 3A) y el porcentaje de sueros con valores OD de < 0,15 (Figura 3B) o bien > 1,0 (Figura 3C). El valor OD medio más alto y el porcentaje más alto de suero con unión de IgG se obtuvieron con PEP07913 (SEQ ID NO:153), PEP06923 (SEQ ID NO:154) y PEP07844 (SEQ ID NO:161), mientras que se encontró la menor reactividad contra PEP07968 (PEP07911 conjugado con DOTA, SEQ ID NO:159), PEP07914 (SEQ ID NO:158) y PEP07954 (SEQ ID NO:156).
Por tanto, los polipéptidos de unión a albúmina más reactivos fueron el G148-GA3 parental (PEP07913, SEQ ID NO:153) y el derivado mejorado en afinidad previamente (PEP06923, SEQ ID NO:154), que tienen la hélice 1 retenida de G148-GA3. El tercero de los polipéptidos más reactivos (PEP07844, SEQ ID NO:161) contiene la lisina original en la posición 14 en la hélice 1. Este residuo está destinado a conjugación, y por lo tanto no será expuesto en el contexto final. La variante de polipéptido de unión a albúmina idéntica, excepto por tener una alanina en la posición 14 (PEP07554, SEQ ID NO:156), es una de las menos reactivas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
E11743207
22-06-2015
10%. La reacción de color fue monitorizada después de 4 horas usando un lector de placas de 96 pocillos (Victor3; PerkinElmer).
Resultados
Como se muestra en la Figura 8, tanto ZX-PP013 como ZY-PP013 inhibieron la proliferación inducida por citocina respectiva en presencia de HSA, mientras que Zneg-PP013, el control negativo, no afectó a la proliferación de TF-1. Por tanto, el experimento muestra que la función de las moléculas Z fue retenida cuando estaban incorporadas en una proteína de fusión que contenía el polipéptido de unión a albúmina, y también cuando las proteínas de fusión estaban unidas a albúmina.
Ejemplo 9:
Estabilidad a largo plazo de un polipéptido de unión a albúmina
En este ejemplo, la estabilidad de PEP07986 (SEQ ID NO:163), expresada y purificada como se describe en el Ejemplo 1, fue investigada después de un almacenamiento a 4, 25 y 40 ºC durante hasta tres meses. El estado del polipéptido después del almacenamiento fue investigado midiendo su unión a HSA usando un instrumento Biacore.
Material y métodos
Se disolvió PEP07986 liofilizado en tampón NaPi estéril (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,2) a una concentración de 2 mg/ml. Se retiró una muestra de referencia (tiempo = 0) y se almacenó a -80 ºC. Se almacenaron alícuotas de 105 µl en tubos eppendorf estériles con tapón de rosca sellados con parafilm a 4, 25 y 40 ºC. Después de una semana, dos semanas, un mes y tres meses, se enfrió una muestra almacenada a cada temperatura hasta 4 ºC, se centrifugó durante 5 min a 13.000 rpm y después se almacenó a -80 ºC esperando el análisis Biosensor.
El análisis biosensor se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 2 pero con HSA (Albucult®, Novozymes), inmovilizada a 704 unidades de resonancia (UR) y la variante de polipéptido de unión a albúmina se diluyó hasta 10 nM y se inyectó a un caudal constante de 20 µl/min durante 10 minutos, seguido de inyección de HBS-EP durante 10 minutos.
Resultados
La unión a HSA de PEP07986 (SEQ ID NO:163) fue retenida después de un almacenamiento a 4, 25 y 40 °C durante al menos tres meses. Las respuestas de unión a HSA máximas obtenidas para PEP07986 almacenado en las diversas condiciones se muestran en la Figura 9.
Ejemplo 10:
Estabilidad de un polipéptido de unión a albúmina bajo condiciones extremas
En este ejemplo, se describe un análisis biosensor y de dicroísmo circular (CD) del polipéptido de unión a albúmina PEP08296 (PEP08185 conjugado con DOTA, SEQ ID NO:148) después de un tratamiento con calor (90 ºC) en tampón de pH bajo (~4,0). Dado que tales condiciones de reacción extremas tienen que ser usadas por ejemplo para el marcado con 68Ga de proteínas modificadas con DOTA, la influencia del tratamiento con alto calor y bajo pH sobre la identidad estructural del polipéptido y su capacidad para unirse a HSA fue investigada midiendo la temperatura de fusión (Tm), las propiedades de replegado y la unión a HSA.
Material y métodos
Análisis biosensor de la estabilidad al calor
Se realizó un análisis biosensor en un instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare) con HSA (Albucult®, Novozymes) inmovilizada por acoplamiento de amina sobre la capa de dextrano carboxilado de las superficies del chip CM-5 (calidad investigación; GE Healthcare) según las recomendaciones del fabricante. La superficie 1 del chip fue activada y desactivada y usada como celda de referencia (superficie blanco) durante las inyecciones, mientras que la superficie 2 comprendió HSA inmovilizada a 724 unidades de resonancia (UR). Se diluyó PEP08296 (50 µl, 100 µg) en un tubo Falcon de 15 ml con 450 µl de acetato de sodio 0,2 M (NaAc) pH 5,5 hasta una concentración de péptido final de 0,2 mg/ml. Después de la adición de 1,5 ml de HCl 0,05 M (lo que es similar a las condiciones y volumen usados para eluir un generador de 68Ge/68Ga) la muestra se incubó durante 10 minutos a 90 °C o TA (control) y después se transfirió a TA. Se añadieron 6 ml de citrato de sodio 0,1 M para neutralizar el pH. El PEP08296 tratado con calor (0,8 y 4 nM) se inyectó a un caudal constante de 50 µl/min durante 5 minutos, seguido de disociación en HBS-EP durante 15 minutos. Las superficies fueron regeneradas con una inyección de 25 µl de HCl 10 mM. Los resultados se analizaron con un programa informático BIAevaluation (GE Healthcare). Las curvas de la superficie blanco se restaron de las curvas de las superficies de los ligandos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
E11743207
22-06-2015
Determinación de la temperatura de fusión (Tm)
Se disolvió PEP08296 en PBS hasta una concentración final de 0,5 mg/ml. Se preparó PBS con un pH de aproximadamente 4,0 añadiendo 9,5 µl de HCl 100 mM a 100 µl de PBS. El análisis de dicroísmo circular (CD) se realizó como se describe en el Ejemplo 3.
Análisis CD de estabilidad al calor
Para investigar la reversibilidad estructural de PEP08296 después del tratamiento con calor, se registraron dos espectros CD entre 195 y 250 por muestra a 20 ºC. Después del primer espectro, se ejecutó un ciclo VTM con calentamiento hasta 90 ºC como se describe anteriormente, seguido de la recogida del segundo espectro CD entre 195 y 250 nm a 20 ºC. Además, se incubó el PEP08296 en tampón PBS pH 4,0 o tampón PBS pH 7,2 durante 12 minutos a 90 ºC en un termomezclador (500 rpm, intervalo de mezcla 10 s encendido, 30 s apagado). Después de la incubación, las muestras fueron enfriadas en hielo, seguido de centrifugación a 13.000 rpm durante 1 minuto, y se registró un espectro CD entre 195 y 250 nm a 20 ºC.
Resultados
Se usó un análisis biosensor para investigar si el tratamiento con calor en combinación con pH bajo, es decir, las condiciones comunes necesitadas para el marcado con 68Ga del polipéptido, afectarían a la capacidad de PEP08296 de unirse a HSA. La Figura 10 muestra el resultado de este análisis de unión realizado con un instrumento Biacore 2000. Dos concentraciones diferentes de PEP08296, 0,8 nM y 4 nM, se inyectaron sobre una superficie con 724 UR de albúmina de suero humano inmovilizada. El tratamiento con calor durante 10 min a 90 ºC, pH 4,0, redujo ligeramente la capacidad de unión de PEP08296 a HSA, indicando un cambio estructural potencial de la molécula.
Se usó CD para investigar además el cambio estructural potencial de la molécula. Espectros CD similares antes y después del calentamiento probarían que una muestra es estructuralmente reversible. En el primer experimento, las muestras fueron calentadas con un gradiente de temperatura de 20 ºC a 90 ºC. Los espectros CD antes y después del tratamiento con calor fueron similares en el experimento de determinación de Tm con los mínimos típicos a 207 y 221 nm, indicando α-helicidad, es decir, el calentamiento de tiempo corto hasta 90 ºC en tampón de pH 4 o bien pH 7,2 no tuvo efecto sobre la estructura de PEP08296.
Sin embargo, el pretratamiento de PEP08296 durante 12 minutos a 90 ºC mostró un contenido de hélice alfa ligeramente reducido de PEP08296 si se incubó a pH 4,0, pero sin cambio en el contenido de hélice alfa si se incubó a pH 7,2. Las superposiciones típicas de los dos espectros CD antes y después del calentamiento se muestran en la Figura 11.
Los resultados de la determinación de la temperatura de fusión (Tm) se resumen en la Tabla 4.
Tabla 4. Tm de PEP08296
- Designación
- Tm (°C)
- PEP08296 a pH 7,2
- 59
- PEP08296 a pH 4,0
- 62
Ejemplo 11:
Obtención de imágenes de acumulación de sangre usando un polipéptido de unión a albúmina marcado con 68Ga
En los experimentos que constituyen este ejemplo, la distribución en cuerpo entero de PEP08296 marcado con 68Ga (PEP08185 conjugado con DOTA, SEQ ID NO:148) en ratas fue seguida por la obtención dinámica de imágenes a lo largo de 1,5 horas. Debido a la fuerte asociación entre el polipéptido marcado y la albúmina de suero, el polipéptido marcado se puede usar por ejemplo para estudiar la acumulación de sangre y la permeabilidad tisular.
Material y métodos
Marcado con 68Ga de PEP08296
Se eluyó 68Ga como 68GaCl3 del generador de 68Ge/68Ga (Obninsk, Rusia) con HCl 0,1 M, se convirtió en 68GaCl4con HCl concentrado, se atrapó en una columna de intercambio aniónico (Chromafix-HCO3) y posteriormente se eluyó con agua de 18 MΩ, como se describió previamente (Velikyan et al (2008), Nucl Med Biol 35:529-536).
El marcado se realizó esencialmente como se describe en Tolmachev et al. (EJNMMI 37:1356-1367, 2010). El eluato de 68Ga concentrado (150-200 µl) se añadió a PEP08296 (≥100 µg en tampón de acetato de sodio 0,2 M pH 5,5) y el
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E11743207
22-06-2015
pH se ajustó a 3,5-4 usando acetato de sodio (1,25 M) o HCl (0,1 M). La mezcla marcadora se incubó a 90 ºC durante 15 min antes de enfriar, y la proteína marcada se aisló por purificación de exclusión de tamaños en una columna NAP-5 eluida con suero salino tamponado fisiológicamente.
La pureza radioquímica e identidad de la proteína marcada con 68Ga fue evaluada por radio-HPLC usando detectores UV (210 nm) y de radioactividad en serie y una columna Superdex Peptide 10/300 GL (GE Healthcare) eluida con suero salino tamponado fisiológicamente.
PET de animales pequeños
Se anestesió una rata (277 g) con isoflurano (inicialmente 5 %, después 2 % mezclado con 7:3 aire/O2), controlado por un vaporizador E-Z usando máscaras no re-respiradoras Microflex de Euthanex Corporation, y se mantuvo en una almohadilla calefactora (37 ºC) mientras se tumbaba dentro de un sistema microPET Focus120 (Siemens, CTI Concorde Microsystems). Se dispensó en una jeringuilla 68Ga-PEP08296, 33 MBq, diluido con suero salino hasta 0,5 ml, y se inyectó por la vena de la cola. Se adquirieron datos del cuerpo entero moviendo el lecho en un protocolo de movimiento de lecho constante durante 1,5 h. Los datos fueron procesados con MicroPET Manager y corregidos para aleatorios, tiempo muerto y decaimiento. Se reconstruyeron imágenes por proyección de fondo filtrado 2D estándar usando un filtro rampa, y se evaluaron usando el programa informático Inveon Research Workplace (Siemens Medical Solutions).
Resultados
Los patrones de distribución básicos (Figura 12) para PEP08296 fueron muy similares al de la albúmina marcada con radioisótopos tales como 68Ga-DOTA, 64Cu-DOTA y 11C (véase p.ej. Hoffend et al (2005), Nucl Med Biol 32:287292 y Lu et al (2008), "[1-11C]Butanol and [Methyl-11C]Albumin for Blood Flow and Blood Pool Imaging", participante en el Xlth Turku PET Symposium, 24-27 de mayo de 2008). En breve, se observaron altas concentraciones de radioactividad en vasos sanguíneos principales en todo el barrido. Los órganos con grandes volúmenes de sangre (hígado, bazo y riñón) también estuvieron delineados claramente, como lo fue la radiactividad de la acumulación de sangre cardiaca. La radioactividad en la vejiga urinaria aumentó durante el periodo de observación, siendo esta observación de eliminación renal consistente con observaciones previas con trazadores basados en albúmina marcada y con la del metabolismo de albúmina en sí.
El patrón de distribución general de radioactividad y el muy lento aclaramiento en plasma después de la inyección intravenosa de 68Ga-PEP08296 es consistente con su esperada unión muy rápida y fuerte con la albúmina. Estos resultados por lo tanto apoyan aplicaciones adicionales del radiotrazador como agente de obtención de imágenes de acumulación de sangre in vivo para el uso con estudios de tomografía de emisión de positrones de permeabilidad tisular, tanto durante el desarrollo de enfermedad como durante intervención terapéutica.
Ejemplo 12:
Solubilidad de un polipéptido de unión a albúmina
La solubilidad de PEP07986 (SEQ ID NO:163) en tampón fisiológico fue investigada por concentraciones consecutivas de la muestra usando ultrafiltración, seguido de medida de concentración e investigación del estado de agregación. Las concentraciones determinadas por lecturas directas de absorbancia a 280 nm fueron consistentes con las concentraciones determinadas por filtración en gel, mostrando una solubilidad de no más que 42 mg/ml, sin agregados detectados.
Material y métodos
Se disolvió PEP07986 liofilizado en tampón NaPi (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,2) a una concentración de 3 mg/ml. Se pre-enjuagaron unidades filtradoras centrífugas Amicon Ultra, con corte de 3 kDa, (Millipore, Nº de Cat. UFC800324) con 2 ml de tampón NaPi por centrifugación a 4.000 g durante 20 min en una centrífuga de rotor de palas oscilantes (Multifuge, Heraeus). Se aplicaron 1.620 µl de 3 mg/ml de PEP07986 a una primera unidad filtradora centrífuga y se realizó la centrifugación a 4.000 g, 20 ºC, durante 7 min. Se retiró una muestra de 25 µl (muestra 1 UF) para análisis adicional, y el resto de la muestra se transfirió a una segunda unidad filtradora centrífuga. La centrifugación y retirada de muestra se repitió tres veces con tiempos de giro de 8, 9 y 20 min respectivamente (muestra UF 2, 3 y 4 respectivamente). Las lecturas de absorbancia se realizaron usando un espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000 y diluyendo las muestras UF 1-4 en tampón NaPi 2, 4, 6 y veces respectivamente. Las concentraciones se calcularon usando el coeficiente de extinción 1 Abs 280 = 1,955 mg/ml. La filtración en gel se realizó en un sistema 1100 HPLC (Agilent Technologies) usando una columna Superdex75 10/300 GL (GE Healthcare) que había sido equilibrada en tampón NaPi. Se aplicaron 10 µl de cada muestra UF a la columna; Se usó tampón NaPi como tampón de ejecución, y el caudal fue 0,5 ml/min. Se recogió también un cromatograma de la ovalbúmina de peso molecular estándar (GE Healthcare), inyectada a una concentración de 5 mg/ml. Las concentraciones se determinaron integrando el área bajo la curva.
Claims (1)
-
imagen1 imagen2
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US39928510P | 2010-07-09 | 2010-07-09 | |
US399285P | 2010-07-09 | ||
US40356110P | 2010-09-17 | 2010-09-17 | |
US403561P | 2010-09-17 | ||
PCT/EP2011/061623 WO2012004384A2 (en) | 2010-07-09 | 2011-07-08 | Polypeptides |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2540114T3 true ES2540114T3 (es) | 2015-07-08 |
Family
ID=44630120
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES11743207.0T Active ES2540114T3 (es) | 2010-07-09 | 2011-07-08 | Polipéptidos |
ES15165722.8T Active ES2676403T3 (es) | 2010-07-09 | 2011-07-08 | Polipéptidos |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES15165722.8T Active ES2676403T3 (es) | 2010-07-09 | 2011-07-08 | Polipéptidos |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US9211344B2 (es) |
EP (2) | EP2590993B1 (es) |
JP (2) | JP5827994B2 (es) |
KR (1) | KR101884654B1 (es) |
CN (3) | CN103003296A (es) |
AU (1) | AU2011275766B2 (es) |
BR (1) | BR112013000452A2 (es) |
CA (1) | CA2804002C (es) |
DK (2) | DK2590993T3 (es) |
ES (2) | ES2540114T3 (es) |
HK (2) | HK1182719A1 (es) |
IL (1) | IL223989B (es) |
LT (1) | LT2933262T (es) |
MX (1) | MX2013000314A (es) |
MY (1) | MY161679A (es) |
NO (1) | NO2933262T3 (es) |
NZ (1) | NZ604805A (es) |
PL (2) | PL2590993T3 (es) |
RU (1) | RU2577964C2 (es) |
TR (1) | TR201809437T4 (es) |
WO (1) | WO2012004384A2 (es) |
ZA (1) | ZA201300994B (es) |
Families Citing this family (48)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120165650A1 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | General Electric Company | Her2 binders |
MY161679A (en) * | 2010-07-09 | 2017-05-15 | Affibody Ab | Polypeptides |
DK2621519T3 (en) | 2010-09-28 | 2017-10-16 | Aegerion Pharmaceuticals Inc | Leptin-ABD fusion polypeptides with improved duration of action |
CA2836873C (en) | 2011-05-21 | 2019-10-22 | Macrogenics, Inc. | Deimmunized serum-binding domains and their use for extending serum half-life |
WO2013009539A1 (en) | 2011-07-08 | 2013-01-17 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Engineered polypeptides having enhanced duration of action and reduced immunogenicity |
WO2013009545A1 (en) | 2011-07-08 | 2013-01-17 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Engineered polypeptides having enhanced duration of action with reduced immunogenicity |
AU2013222836B2 (en) | 2012-02-20 | 2017-07-20 | Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) | Polypeptides binding to human complement C5 |
KR20210075191A (ko) * | 2012-03-28 | 2021-06-22 | 애피바디 에이비 | 경구투여 |
JP2020033372A (ja) * | 2012-03-28 | 2020-03-05 | アフィボディ・アーベー | 経口投与 |
WO2014048977A1 (en) * | 2012-09-25 | 2014-04-03 | Affibody Ab | Albumin binding polzpeptide |
KR102191655B1 (ko) | 2012-10-05 | 2020-12-16 | 애피바디 에이비 | Her3 결합 폴리펩티드 |
AU2013336646B2 (en) * | 2012-10-25 | 2016-07-14 | Affibody Ab | ABD binding polypeptide |
ES2674983T3 (es) | 2012-10-25 | 2018-07-05 | Affibody Ab | Método para la separación de proteínas que contienen un dominio que se une a albúmina |
WO2014076177A1 (en) * | 2012-11-14 | 2014-05-22 | Affibody Ab | New polypeptide |
WO2014076179A1 (en) | 2012-11-14 | 2014-05-22 | Affibody Ab | New polypeptide |
EP2935335B1 (en) * | 2012-12-19 | 2020-10-28 | Affibody AB | New polypeptides |
MX2015012420A (es) | 2013-03-14 | 2016-06-02 | Daiichi Sankyo Co Ltd | Nuevas proteinas de union para pcsk9. |
ES2660912T3 (es) * | 2013-03-15 | 2018-03-26 | Affibody Ab | Nuevos polipéptidos |
EP2986306A4 (en) | 2013-04-18 | 2016-12-07 | Armo Biosciences Inc | METHOD FOR USE OF INTERLEUKIN-10 FOR THE TREATMENT OF ILLNESSES AND SUFFERING |
JP2016528879A (ja) | 2013-06-17 | 2016-09-23 | アルモ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド | タンパク質の同一性および安定性を評価する方法 |
PL3038633T3 (pl) * | 2013-08-28 | 2021-07-19 | Ipc Research, Llc | Stabilne polipeptydy wiążące się z ludzkim dopełniaczem c5 |
PT3039033T (pt) | 2013-08-28 | 2019-09-06 | Affibody Ab | Polipéptidos de ligação com um scaffold mutado |
US10010588B2 (en) | 2013-08-30 | 2018-07-03 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using pegylated interleukin-10 for treating hyperlipidemia |
CA2928710A1 (en) | 2013-11-11 | 2015-05-14 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders |
US10167322B2 (en) | 2013-12-20 | 2019-01-01 | Affibody Ab | Engineered albumin binding polypeptide |
CN106573964B (zh) | 2014-05-22 | 2021-07-16 | 皮里斯制药有限公司 | 新型特异性结合多肽及其用途 |
WO2015187295A2 (en) | 2014-06-02 | 2015-12-10 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of lowering serum cholesterol |
WO2016054101A1 (en) | 2014-09-29 | 2016-04-07 | Duke University | Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm |
AU2015333827A1 (en) | 2014-10-14 | 2017-04-20 | Armo Biosciences, Inc. | Interleukin-15 compositions and uses thereof |
US10143726B2 (en) | 2014-10-22 | 2018-12-04 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders |
MX2017008660A (es) | 2015-01-12 | 2017-11-17 | Affibody Ab | Polipeptidos enlazados a il-17a. |
WO2016126615A1 (en) | 2015-02-03 | 2016-08-11 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders |
KR102427117B1 (ko) * | 2015-04-02 | 2022-07-29 | 몰리큘라 파트너스 아게 | 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인 |
US20160361415A1 (en) | 2015-05-28 | 2016-12-15 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of Using Interleukin-10 for Treating Diseases and Disorders |
US10398761B2 (en) | 2015-08-25 | 2019-09-03 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using combinations of PEG-IL-10 and IL-15 for treating cancers |
EP3665202A1 (en) | 2017-08-09 | 2020-06-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Albumin binding peptide conjugates and methods thereof |
CN108362873B (zh) * | 2018-02-13 | 2021-06-01 | 苏州仁端生物医药科技有限公司 | 一种镉离子检测试剂盒及其应用 |
JP7545894B2 (ja) * | 2018-03-13 | 2024-09-05 | アフィボディ アクティエボラーグ | 新規足場に基づくポリペプチド |
JP2022546525A (ja) | 2019-09-02 | 2022-11-04 | ビオテスト・アクチエンゲゼルシャフト | 延長された半減期を有する第viii因子タンパク質 |
EP3785726A1 (en) | 2019-09-02 | 2021-03-03 | Biotest AG | Factor viii protein with increased half-life |
WO2021089695A1 (en) | 2019-11-05 | 2021-05-14 | Affibody Ab | Polypeptides |
CN114929261A (zh) | 2020-02-17 | 2022-08-19 | 生物测试股份公司 | 凝血因子viii的皮下施用 |
EP3878515A1 (en) | 2020-03-09 | 2021-09-15 | Hober Biotech AB | Therapeutic agent targeting her2 |
AU2021405360A1 (en) | 2020-12-21 | 2023-06-22 | Affibody Ab | New polypeptide |
US20240124533A1 (en) | 2021-02-15 | 2024-04-18 | Affibody Ab | New her2-binding polypeptide |
CN113416683B (zh) * | 2021-06-01 | 2023-05-02 | 南昌大学 | 一种大肠杆菌Nissle 1917基因工程菌及其制备方法和应用 |
CN118632866A (zh) | 2022-02-08 | 2024-09-10 | 阿菲博迪公司 | 结合胸腺基质淋巴细胞生成素的蛋白质z变体及其医疗用途 |
WO2024170756A1 (en) | 2023-02-17 | 2024-08-22 | Ablynx N.V. | Polypeptides binding to the neonatal fc receptor |
Family Cites Families (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE509359C2 (sv) | 1989-08-01 | 1999-01-18 | Cemu Bioteknik Ab | Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel |
SE9400088D0 (sv) | 1994-01-14 | 1994-01-14 | Kabi Pharmacia Ab | Bacterial receptor structures |
US6362225B1 (en) | 1999-01-21 | 2002-03-26 | George Andreakos | Target therapies for treating common viral infections |
PT1240337E (pt) | 1999-12-24 | 2007-01-31 | Genentech Inc | Métodos e composições para prolongar as meias-vidas de eliminação de compostos bioactivos |
US20040001827A1 (en) | 2002-06-28 | 2004-01-01 | Dennis Mark S. | Serum albumin binding peptides for tumor targeting |
US7288265B1 (en) | 2000-10-16 | 2007-10-30 | Lectec Corporation | Treating viral infection at smallpox vaccination site |
AU2002246737B2 (en) * | 2000-12-29 | 2007-03-01 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | Specific human antibodies for selective cancer therapy |
US7316819B2 (en) | 2001-03-08 | 2008-01-08 | Unigene Laboratories, Inc. | Oral peptide pharmaceutical dosage form and method of production |
US7772188B2 (en) * | 2003-01-28 | 2010-08-10 | Ironwood Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders |
WO2005000222A2 (en) | 2003-05-30 | 2005-01-06 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Novel methods and compositions for enhanced transmucosal delivery of peptides and proteins |
EP2380594B1 (en) * | 2004-04-06 | 2019-12-04 | Affibody AB | Use of a serum albumin binding peptide to reduce the immunogenicity of a protein |
US20050282756A1 (en) | 2004-06-18 | 2005-12-22 | Mehta Nozer M | Oral delivery of peptide pharmaceutical compositions |
SG157423A1 (en) * | 2004-12-02 | 2009-12-29 | Domantis Ltd | Bispecific domain antibodies targeting serum albumin and glp-1 or pyy |
US8093207B2 (en) | 2005-12-09 | 2012-01-10 | Unigene Laboratories, Inc. | Fast-acting oral peptide pharmaceutical products |
JP2009537158A (ja) * | 2006-05-24 | 2009-10-29 | バイエル・シエーリング・ファーマ アクチエンゲゼルシャフト | 免疫原性の減少を伴った高親和性ヒトおよびヒト化抗−α5β1インテグリン機能阻害抗体 |
EP2049137A4 (en) | 2006-08-08 | 2013-05-01 | Univ California | SALICYLANILIDES AS AMPLIFIERS OF THE ORAL RELEASE OF THERAPEUTIC PEPTIDES |
US20100113339A1 (en) * | 2006-09-08 | 2010-05-06 | Ablynx N. V. | Serum albumin binding proteins with long half-lives |
ATE536369T1 (de) * | 2006-10-11 | 2011-12-15 | Ablynx Nv | Im wesentlichen ph-wert-unabhängigerweise an serumproteine bindende aminosäuresequenzen, verbindungen, die diese enthalten, und deren verwendung |
DE08786222T1 (de) * | 2007-07-31 | 2010-11-25 | Affibody Ab | Neue albuminbindende zusammensetzungen, verfahren und anwendungen |
EP2077272A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-07-08 | Affibody AB | Polypeptide libraries with a predetermined scaffold |
EP2279244B1 (en) | 2008-03-26 | 2020-07-01 | Oramed Ltd. | Methods and compositions for oral administration of proteins |
CN101294178A (zh) | 2008-05-26 | 2008-10-29 | 江南大学 | 一种用两阶段培养法提高发酵生产透明质酸产量的方法 |
CN101294187B (zh) * | 2008-06-06 | 2013-07-31 | 暨南大学 | 一种缓释生物活性多肽的方法与应用 |
EP2331072B8 (en) | 2008-08-18 | 2020-08-26 | Entera Bio Ltd. | Methods and compositions for oral administration of proteins |
WO2010054699A1 (en) | 2008-11-17 | 2010-05-20 | Affibody Ab | Conjugates of albumin binding domain |
ES2548030T3 (es) | 2009-06-01 | 2015-10-13 | Medimmune, Llc | Moléculas con semividas prolongadas y usos de las mismas |
MY161679A (en) | 2010-07-09 | 2017-05-15 | Affibody Ab | Polypeptides |
US20120027058A1 (en) | 2010-07-29 | 2012-02-02 | The Regents Of The University Of Michigan | Portable, wireless multi-channel impedance analyzer |
DK2621519T3 (en) | 2010-09-28 | 2017-10-16 | Aegerion Pharmaceuticals Inc | Leptin-ABD fusion polypeptides with improved duration of action |
WO2012112319A1 (en) | 2011-02-04 | 2012-08-23 | Aegis Therapeutics, Llc | Orally bioavailable peptide drug compositions and methods thereof |
WO2013009539A1 (en) | 2011-07-08 | 2013-01-17 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Engineered polypeptides having enhanced duration of action and reduced immunogenicity |
KR20210075191A (ko) | 2012-03-28 | 2021-06-22 | 애피바디 에이비 | 경구투여 |
WO2014048977A1 (en) | 2012-09-25 | 2014-04-03 | Affibody Ab | Albumin binding polzpeptide |
US10167322B2 (en) | 2013-12-20 | 2019-01-01 | Affibody Ab | Engineered albumin binding polypeptide |
-
2011
- 2011-07-08 MY MYPI2012005497A patent/MY161679A/en unknown
- 2011-07-08 NZ NZ604805A patent/NZ604805A/en unknown
- 2011-07-08 DK DK11743207.0T patent/DK2590993T3/en active
- 2011-07-08 US US13/808,713 patent/US9211344B2/en active Active
- 2011-07-08 WO PCT/EP2011/061623 patent/WO2012004384A2/en active Application Filing
- 2011-07-08 EP EP20110743207 patent/EP2590993B1/en active Active
- 2011-07-08 PL PL11743207T patent/PL2590993T3/pl unknown
- 2011-07-08 LT LTEP15165722.8T patent/LT2933262T/lt unknown
- 2011-07-08 CN CN2011800330970A patent/CN103003296A/zh active Pending
- 2011-07-08 BR BR112013000452-5A patent/BR112013000452A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2011-07-08 PL PL15165722T patent/PL2933262T3/pl unknown
- 2011-07-08 TR TR2018/09437T patent/TR201809437T4/tr unknown
- 2011-07-08 ES ES11743207.0T patent/ES2540114T3/es active Active
- 2011-07-08 NO NO15165722A patent/NO2933262T3/no unknown
- 2011-07-08 JP JP2013517402A patent/JP5827994B2/ja active Active
- 2011-07-08 CN CN201910770466.2A patent/CN110437321A/zh active Pending
- 2011-07-08 RU RU2013102953/10A patent/RU2577964C2/ru active
- 2011-07-08 MX MX2013000314A patent/MX2013000314A/es active IP Right Grant
- 2011-07-08 EP EP15165722.8A patent/EP2933262B1/en active Active
- 2011-07-08 AU AU2011275766A patent/AU2011275766B2/en active Active
- 2011-07-08 CA CA2804002A patent/CA2804002C/en active Active
- 2011-07-08 ES ES15165722.8T patent/ES2676403T3/es active Active
- 2011-07-08 CN CN201910770209.9A patent/CN110437320B/zh active Active
- 2011-07-08 DK DK15165722.8T patent/DK2933262T3/en active
- 2011-07-08 KR KR1020137003270A patent/KR101884654B1/ko active IP Right Grant
-
2012
- 2012-12-30 IL IL223989A patent/IL223989B/en active IP Right Grant
-
2013
- 2013-02-06 ZA ZA2013/00994A patent/ZA201300994B/en unknown
- 2013-08-23 HK HK13109912.1A patent/HK1182719A1/xx unknown
- 2013-08-23 HK HK15110388.2A patent/HK1209761A1/xx unknown
-
2015
- 2015-10-16 JP JP2015204395A patent/JP6486810B2/ja active Active
- 2015-12-01 US US14/955,647 patent/US10329331B2/en active Active
-
2019
- 2019-05-08 US US16/406,415 patent/US20190375799A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2540114T3 (es) | Polipéptidos | |
JP6959616B2 (ja) | IgG結合ペプチドによる部位特異的RI標識抗体 | |
ES2440919T3 (es) | Nuevos polipéptidos con afinidad por HER2 | |
WO2017210302A1 (en) | Pet imaging with pd-l1 binding polypeptides | |
KR20150083840A (ko) | Her3 결합 폴리펩티드 | |
WO2019142800A1 (ja) | 金属結合ペプチドおよびその使用 | |
CN114829388A (zh) | 抗her2多肽衍生物作为新的诊断分子探针 | |
CN115397516A (zh) | 靶向her2的治疗剂 | |
JP7511647B2 (ja) | 新規診断用分子プローブとしての抗her2ポリペプチド誘導体 | |
WO2021033638A1 (ja) | 金属結合ペプチドおよびその使用 | |
WO2022211051A1 (ja) | 抗egfr抗体の放射性複合体、及び、放射性医薬 | |
JP5801196B2 (ja) | 放射標識アネキシン | |
JP2024506070A (ja) | 新規her2結合ポリペプチド | |
CN117327192A (zh) | 结合cd206的笼状蛋白及其应用 | |
BR112016020492B1 (pt) | Proteína compreendendo domínio de fibronectina tipo iii |