BR112013000452A2

BR112013000452A2 - Polipeptídeo de ligação de albumina, proteína de fusão ou conjugado, polinucleotídeo, método para produzir um polipeptídeo, composição, método para a preparação de uma composição, e, método para aumentar a solubilidade de um composto

Info

Publication number: BR112013000452A2
Application number: BR112013000452-5A
Authority: BR
Inventors: Ekblad Caroline; Abrahmsen Lars
Original assignee: Affibody Ab
Priority date: 2010-07-09
Filing date: 2011-07-08
Publication date: 2020-02-11
Also published as: CN110437320B; MY161679A; ES2540114T3; US20160108095A1; CA2804002C; JP2016053047A; NO2933262T3; PL2590993T3; JP6486810B2; LT2933262T; CN110437320A; KR20130034043A; CN103003296A; IL223989B; US10329331B2; JP2013534421A; EP2590993A2; EP2590993B1; PL2933262T3; HK1182719A1

Abstract

polipeptídeo de ligação de albumina, proteína de fusão ou conjugado, polinucleotídeo, método para produzir um polipeptídeo, composição, método para a preparação de uma composição, e, método para aumentar a solubilidade de um composto trata-se de uma classe de polipeptídeos modificados que têm uma afinidade de ligação para albumina. trata-setambém de novos métodos e usos que exploram a ligação por esses e outros compostos à albumina em diferentes contextos, alguns dos quais têm significância para o tratamento ou diagnósticos de doenças em mamíferos, incluindo humanos.

Description

POLIPEPTÍDEO DE LIGAÇÃO DE ALBUMINA, PROTEÍNA DE FUSÃO OU CONJUGADO, POLINUCLEOTÍDEO, MÉTODO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO, COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO, E, MÉTODO PARA AUMENTAR A SOLUBILIDADE DE UM COMPOSTO

CAMPO DA TÉCNICA

A presente revelação refere-se a uma classe de polipeptídeos modificados que têm uma afinidade de ligação para albumina. Também se refere a novos métodos e usos que exploram a ligação por esses e outros compostos à albumina em diferentes contextos, alguns dos quais têm significância para o tratamento de doença em mamíferos, incluindo humanos.

FUNDAMENTOS

Albumina sérica

A albumina sérica é a proteína mais abundante nos soros de mamíferos (40 g/1; aproximadamente 0,7 mM em humanos) e uma de suas funções é ligar moléculas como lipídeos e bilirrubina (Peters, Advances in Protein Chemistry 37:161, 1985) . A albumina sérica é destituída de qualquer função enzimática ou imunológica. Além disso, albumina sérica humana (HSA) é um carreador natural envolvido no transporte endógeno e entrega de inúmeras moléculas naturais bem como terapêuticas (Sellers e KochWeser, Albumin Structure, Function and Uses, eds Rosenoer et al, Pergamon, Oxford, p 159, 1977) . A meia-vida de albumina sérica é diretamente proporcional ao tamanho do animal, em que, por exemplo, a albumina sérica humana tem uma meia-vida de 19 dias e a albumina sérica de coelho tem uma meia-vida de cerca de 5 dias (McCurdy et al, J Lab Clin Med 143:115, 2004). A HSA é amplamente distribuída pelo corpo, em particular, nos compartimentos intersticiais e sanguíneos, onde é envolvida principalmente na manutenção de osmolaridade.

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Estruturalmente, as albuminas são proteínas de cadeia simples que compreendem três domínios homólogos e no total 584 ou 585 aminoácidos (Dugaiczyk et al, Proc Natl Acad Sei USA 79:71, 1982) . As albuminas contêm 17 pontes de dissulfeto e uma cisteína tiol reativa simples na posição 34, mas carecem de metades de carboidratos ligados a N e ligados a O (Peters, 1985, supra-, Nicholson et al, Br J Anaesth 85:599, 2000).

Fusão ou associação com resultados de HSA em meiavida de proteínas in vivo aumentada

Várias estratégias foram relatadas para acoplar de modo covalente proteínas diretamente a albuminas séricas ou a um peptídeo ou proteína que permitirão associação in vivo a albuminas séricas. Exemplos dessa última abordagem foram descritos, por exemplo, no documento n° WO 91/01743, no documento n° WO 01/45746 e em Dennis et al (J Biol Chem 277:35035-43, 2002). 0 primeiro documento descreve, entre outros, o uso de peptídeos ou proteínas de ligação de albumina derivados de proteína G estreptocócica (SpG) para aumentar a meia-vida de outras proteínas. A ideia é fundir a peptídeo/proteína de ligação de albumina derivada de modo bacteriano a um peptídeo/proteína de interesse terapêutico, que mostrou ter uma rápida eliminação a partir do sangue. A assim gerada proteína de fusão se liga a albumina sérica in vivo, e se beneficia de sua meia-vida mais longa, que aumenta a meia-vida de rede do peptídeo/proteína de interesse terapêutico fundido. 0 documento n° WO 01/45746 e Dennis et al se referem ao mesmo conceito, mas aqui, os autores utilizam peptídeos relativamente curtos para ligar albumina sérica. Os peptídeos foram selecionados a partir de uma biblioteca de peptídeos exibidos em fago. Em Dennis et al, trabalho inicial é mencionado em que a intensificação de uma resposta imunológica a uma fusão recombinante da albumina que liga o domínio da proteína G estreptocócica ao receptor de

3/74 complemento humano do Tipo 1 foi encontrada. O pedido de patente n° U.S. 2004/0001827 (Dennis) também revela o uso de construtos que compreende ligantes de peptídeos, novamente identificados por tecnologia de exibição de fago, que se ligam à albumina sérica e que são conjugados a compostos bioativos para alvej amento de tumor.

Domínios de ligação de albumina de proteínas receptoras bacterianas

A proteína G estreptocócica (SpG) é um receptor bifuncional presente na superfície de certos filamentos de estreptococos e com capacidade de se ligar tanto a IgG quanto à albumina sérica (Bjôrck et al, Mol Immunol 24:1113, 1987). A estrutura é altamente repetitiva com vários domínios diferentes estruturalmente e de modo funcional (Guss et al, EMBO J 5:1567, 1986), mais precisamente, três domínios de ligação de Ig e três domínios de ligação de albumina sérica (Olsson et al, Eur J Biochem 168:319, 1987). A estrutura de um dos três domínios de ligação de albumina sérica em SpG foi determinada, mostrando uma dobra de agrupamento de três hélices (Kraulis et al, FEBS Lett 378:190, 1996, Johansson et al, J. Biol. Chem. 277:8114-20, 2002). Um arquétipo de 46 aminoácidos foi definido como ABD (domínio de ligação de albumina) e foi subsequentemente também designado como G148GA3 (GA para ligação de albumina relacionada à proteína G) . Em, por exemplo, documento n° WO 09/016043, variantes de ligação de albumina do arquétipo de 46 aminoácidos ABD são revelados.

Outros domínios de ligação de albumina bacteriana além daqueles em proteína G também foram identificados, alguns dos quais são estruturalmente similares àqueles da proteína G. Exemplos de proteínas que contêm tais domínios de ligação de albumina são as proteínas PAB, PPL, MAG e ZAG (Rozak et al, Biochemistry 45:3263-3271, 2006). Estudos de estrutura e

4/74 função de tais domínios de ligação de albumina foram realizados e relatados, por exemplo, por Johansson e colaboradores (Johansson et al, J Mol Biol 266:859-865, 1997) . Além disso, Rozak et al relatou a criação de variantes artificiais de G148-GA3, que foram selecionados e estudados em relação à especificidade e à estabilidade de diferentes espécies (Rozak et al, Biochemistry 45:3263-3271, 2006), ao passo que Jonsson et al desenvolveram variantes artificiais de G148-GA3 que tem afinidade bastante aprimorada para albumina sérica humana (Jonsson et al, Prot Eng Des Sei 21:515-27, 2008) . Para alguns dos variantes uma afinidade mais alta foi alcançada a custo de estabilidade térmica reduzida.

Em adição às proteínas que contêm três hélices descritas acima, também existem outras proteínas bacterianas não relacionadas que ligam albumina.

ABD e imunização

Recentemente, poucos epítopos de células B e T foram identificados de modo experimental dentro da região de ligação de albumina de filamento de proteína G estreptocócica 148 (G148) (Goetsch etal, Clin Diagn Lab Immunol 10:125-32, 2003). Os autores por trás do estudo estavam interessados em utilizar os epítopos de célula T de G14 8 em vacinas, isto é, para utilizar a propriedade imunoestimulante inerente da região de ligação de albumina. Goetsch et al adicionalmente encontrado em um epí topo de célula B, isto é, uma região ligada por anticorpos após imunização, na sequência de G148.

Em composições farmacêuticas para administração humana, nenhuma imunorresposta é desejada. Portanto, o domínio de ligação de albumina G148 é, desse modo, inadequado para uso em tais composições devido a suas propriedades imunoestimulantes mencionadas acima.

DESCRIÇÃO

As desvantagens e deficiências acima da técnica

5/74 antecedente são superadas ou aliviadas por, em um primeiro aspecto, um polipeptídeo de ligação de albumina que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de

i) LAX₃AKX₆X₇ANXio eldx₁₄ygvsdf

YKRLIX₂₆KAKTVEGVEALKX₃₉X₄o ILX₄₃X₄₄LP em que independentemente um do outro

X₃ é selecionado a partir de E, S, Q e C;

X_e é selecionado a partir de E, S e C;

X₇ é selecionado a partir de A e S;

Xio é selecionado a partir de A, S e R;

X14 é selecionado a partir de A, S, Ce K;

X₂₆ é selecionado a partir de D eE;

X₃₉ é selecionado a partir de D eE;

X₄₀ é selecionado a partir de A eE;

X₄₃ é selecionado a partir de A eK;

X₄₄ é selecionado a partir de A, S e E; L na posição 45 está presentee ou ausente; e P na posição 46 está presentee ou ausente; e ii) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade para a sequência definida em i).

A classe de polipeptídeos relacionados à sequência definida acima que tem uma afinidade de ligação para albumina é derivada a partir de uma sequência de polipeptídeos parentais comum, que se dobra em um domínio de agrupamento de três hélices alfa. Mais especificamente, os polipeptídeos, conforme descrito acima, são derivados a partir de uma construção modelo baseada em uma estrutura de um complexo entre a albumina sérica e o domínio de ligação de albumina G148-GA3 (Lejon et al, J Biol Chem 279:42924-8, 2004), bem como análises de propriedades de ligação e estruturais de várias variantes mutacionais da sequência de polipeptídeos parentais comum. A sequência de aminoácidos i) definida acima

6/74 compreende substituições de aminoácido quando comparada à sequência de polipeptídeos parentais que resultam em uma classe de polipeptídeos que é esperada de se dobrar em domínio de agrupamento de três hélices quase idêntico. Embora a sequência de polipeptídeos parentais já compreenda uma superfície de ligação para interação com albumina, essa superfície de ligação é modificada por algumas das substituições, de acordo com a definição acima. As substituições de acordo com a definição acima fornecem uma habilidade de ligação de albumina aprimorada quando comparada à sequência de polipeptídeos parentais.

Os polipeptídeos de ligação de acordo com o primeiro aspecto da revelação exibem um conjunto de características que, por exemplo, os torna adequados para uso como parceiros de fusão ou conjugados para moléculas terapêuticas para administração humana. Os polipeptídeos de ligação de acordo com a presente revelação demonstram, por exemplo, em comparação com polipeptídeos de ligação de albumina relacionados como o domínio de ligação de albumina G148-GA3 e os polipeptídeos de ligação de albumina revelados no documento n° WO 09/016043, pelo menos cinco das seguintes seis características:

• Os polipeptídeos exibem uma superfície diferente comparada com, por exemplo, G148-GA3 e outros domínios de ligação de albumina derivada de modo bacteriano. A diferença pode diminuir ou eliminar qualquer risco de reações de anticorpos em um sujeito, como um ser humano, que foi previamente exposto a tais proteínas bacterianas.

• Os polipeptídeos compreendem um número menor de epítopos de célula T em potencial que, por exemplo, G148-GA3 e outras variantes mutacionais relacionadas, mas diferentes, da sequência de polipeptídeos parentais comum, e por isso exibem baixa imunogenicidade quando administrados a um sujeito, como

7/74 um ser humano.

• Os polipeptídeos exibem uma reatividade mais baixa com anticorpos de circulação quando administrados a um sujeito, como um ser humano. Assim, através de substituições de aminoácido na superfície dos polipeptídeos expostos a anticorpos de circulação, isto é, na superfície do polipeptídeo não envolvida na interação de ligação com albumina, reatividade cruzada de anticorpos é reduzida quando comparada com, por exemplo, reatividade cruzada de anticorpos causada por G148-GA3 conforme medida em um conjunto de testes de soros humanos.

• Os polipeptídeos têm uma alta habilidade de ligação de albumina, seja em termos de uma afinidade de ligação mais alta, conforme definido por um valor de K_Dz ou em termos de uma taxa de dissociação mais lenta, conforme definido por um valor de k_Off/ que, por exemplo, conhecidos polipeptídeos de ligação de albumina de ocorrência natural, como os domínios de ligação de albumina derivados a partir de proteínas bacterianas.

• Os polipeptídeos compreendem uma quantidade menor de resíduos de aminoácidos que são associados aos problemas de estabilidade de polipeptídeos, por exemplo, conhecidos polipeptídeos de ligação de albumina de ocorrência natural, como os domínios de ligação de albumina derivados a partir de proteínas bacterianas. Desse modo, os polipeptídeos compreendem, por exemplo, nenhuma metionina ou triptofano suscetíveis à oxidação e somente uma asparagina.

• Os polipeptídeos têm uma estabilidade estrutural mais alta, conforme definido por um ponto de derretimento de cerca de 55°C, que os polipeptídeos de ligação de albumina anteriores, como aqueles revelados no documento n° WO 09/016043.

Em uma modalidade, o polipeptídeo de ligação de

8/74 albumina de acordo com o primeiro aspecto exibe todas as seis características das listadas acima. Em outra modalidade, o polipeptídeo de ligação de albumina de acordo com o primeiro aspecto exibe, quando ligado à albumina, um perfil mais hidrofílico que, por exemplo, os polipeptídeos de ligação de albumina anteriores, como aqueles revelados no documento n° WO 09/016043. A superfície do polipeptídeo de ligação de albumina que é exposta ao ambiente quando o polipeptídeo interage com albumina compreende uma quantidade menor resíduos de aminoácidos que conferem hidrofobicidade de superfície.

Como a pessoa versada perceberá, a função de qualquer polipeptídeo, como a capacidade de ligação de albumina dos polipeptídeos de acordo com o primeiro aspecto, é dependente da estrutura terciária do polipeptídeo. Entretanto, é possível fazer mudanças na sequência de aminoácidos em um polipeptídeo α-helicoidal sem afetar a estrutura do mesmo (Taverna e Goldstein, J Mol Biol 315(3):479-84, 2002; He et al, Proc Natl Acad Sci USA 105(38):14412-17, 2008). Desse modo, as variantes modificadas de i) , que são tais de modo que a sequência resultante é pelo menos 95% idêntica à sequência pertencente à classe definida por i) , também são englobadas pelo primeiro aspecto. Por exemplo, é possível que um resíduo de aminoácido pertencente a certos grupamentos funcionais de resíduos de aminoácidos (por exemplo, hidrofóbico, hidrofílico, polar etc.) podería ser trocado por outro resíduo de aminoácido do mesmo grupo funcional.

O termo % idêntica ou % de identidade, conforme usado na especificação e nas reivindicações, é calculado conforme se segue. A sequência de consulta é alinhada à sequência alvo com uso do algoritmo CLUSTAL W (Thompson, J.D., Higgins, D.G. e Gibson, T.J., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680(1994)). Uma comparação é feita sobre a janela que corresponde à mais curta das sequências alinhadas. A mais

9/74 curta das sequências alinhadas pode em alguns casos ser a sequência alvo, como o polipeptídeo de ligação de albumina revelado no presente documento. Em outros casos, a sequência de consulta pode constituir na mais curta das sequências alinhadas. A sequência de consulta pode, por exemplo, consistir em pelo menos 10 resíduos de aminoácidos, como pelo menos 20 resíduos de aminoácidos, como pelo menos 30 resíduos de aminoácidos, como pelo menos 40 resíduos de aminoácidos, por exemplo, 45 resíduos de aminoácidos. Os resíduos de aminoácidos em cada posição são comparados e o percentual de posições na sequência de consulta que tem correspondências idênticas na sequência alvo é relatado como % de identidade.

	Em uma r	nodalidade do polipeptídeo	de	ligação	de
albumina	de acordo Em outra	com o primeiro aspecto, X₆ é modalidade do polipeptídeo	E. de	ligação	de
albumina	de acordo Em outra	com esse aspecto, X₃ é S. modalidade do polipeptídeo	de	ligação	de
albumina	de acordo Em outra	com esse aspecto, X₃ é E. modalidade do polipeptídeo	de	ligação	de
albumina	de acordo Em outra	com esse aspecto, X₇ é A. modalidade do polipeptídeo	de	ligação	de
albumina	de acordo Em outra	com esse aspecto, X_i4 é S. modalidade do polipeptídeo	de	ligação	de
albumina	de acordo Em outra	com esse aspecto, X₁₄ é C. modalidade do polipeptídeo	de	ligação	de
albumina	de acordo Em outra	com esse aspecto, Χ_χ0 é A. modalidade do polipeptídeo	de	ligação	de
albumina	de acordo Em outra	com esse aspecto, Χ_ϊ0 é S. modalidade do polipeptídeo	de	ligação	de
albumina	de acordo Em outra	com esse aspecto, X₂6 é D. modalidade do polipeptídeo	de	ligação	de
albumina	de acordo Em outra	com esse aspecto, X₂6 é E. modalidade do polipeptídeo	de	ligação	de

10/74

albumina de acordo com esse aspecto, X39 é D.	de	ligação	de
Em outra	modalidade do polipeptídeo
albumina de acordo Em outra	com esse aspecto, X₃₉ é E. modalidade do polipeptídeo	de	ligação	de
albumina de acordo Em outra	com esse aspecto, X₄o é A. modalidade do polipeptídeo	de	ligação	de
albumina de acordo Em outra	com esse aspecto, X₄₃ é A. modalidade do polipeptídeo	de	ligação	de
albumina de acordo Em outra	com esse aspecto, X₄₄ é A. modalidade do polipeptídeo	de	ligação	de
albumina de acordo Em outra	com esse aspecto, X₄₄ é S. modalidade do polipeptídeo	de	ligação	de
albumina de acordo	com esse aspecto, 0 resíduo	L na	posição	45
está presente. Em outra	modalidade do polipeptídeo	de	ligação	de
albumina de acordo	com esse aspecto, 0 resíduo	P na	posição	46
está presente. Em outra	modalidade do polipeptídeo	de	ligação	de
albumina de acordo	com esse aspecto, 0 resíduo	P na	posição	46
está ausente. Em outra	modalidade, 0 polipeptídeo	de	ligação	de
albumina de acordo	com esse aspecto está sujeito à	condição	de

que X₇ não é L, E nem D.

O polipeptídeo de ligação de albumina de acordo com o primeiro aspecto pode ser preparado para conjugação com um parceiro de conjugação adequado pela substituição de resíduos de aminoácidos expostos de superfície por, por exemplo, ou uma cisteína ou uma lisina. Essas substituições podem ser introduzidas na Hélice terminal N, isto é hélice um, do polipeptídeo, que é a hélice mais afastada da albumina sérica quando o polipeptídeo de ligação de albumina é ligado à albumina sérica. Desse modo, um resíduo de lisina na posição X₁₄ da sequência definida em i) pode ser usado para

11/74 possibilitar conjugação direcionada para sítio. Isso pode, além disso, ser vantajoso quando a molécula é produzida por síntese química de peptídeo, desde que a proteção ortogonal do grupo épsilon-amina da dita lisina pode ser utilizado. Além disso, um resíduo de cisteína pode ser introduzido na sequência de aminoácidos para possibilitar a conjugação direcionada para sítio. Por exemplo, um resíduo de cisteína pode ser introduzido em qualquer uma das posições X₃, X₆ e/ou X₁₄ de acordo com a definição acima.

O acoplamento de um parceiro de conjugação ao épsilon-amina de uma lisina ou ao grupo tiol de uma cisteína representa duas alternativas quimicamente diferentes para obter a conjugação direcionada para sítio com uso de um resíduo de aminoácido dentro da sequência de aminoácidos i). Como a pessoa versada entende, existem outras alternativas químicas para preparar uma sequência de aminoácidos para conjugação e como tal também estão dentro do âmbito da presente revelação. Um exemplo de tal química é uma química do tipo clic (click-like chemistry) possibilitada pela introdução de uma tirosina conforme apresentado por Ban et al (J Am Chem SOC 132:1523 a 5, 2009).

Os termos ligação de albumina e afinidade de ligação para albumina conforme usado nesta especificação refere-se a uma propriedade de um polipeptídeo que pode ser testada, por exemplo, pelo uso de uma tecnologia de ressonância de plásmon de superfície, como em um instrumento de Biacore. Por exemplo, conforme descrito nos exemplos abaixo, afinidade de ligação de albumina pode ser testada em um experimento em que a albumina ou um fragmento da mesma é imobilizada em um chip de sensor do instrumento, e a amostra que contém o polipeptídeo a ser testado é passada para o chip. Alternativamente, o polipeptídeo a ser testado é imobilizado

12/74 em um chip de sensor do instrumento, e uma amostra que contém a albumina ou um fragmento da mesma é passada para o chip. A albumina pode, nesse sentido, ser uma albumina sérica de um mamífero, como a albumina sérica humana. A pessoa versada pode então interpretar os resultados obtidos por tais experimentos para estabelecer pelo menos uma medida qualitativa da afinidade de ligação do polipeptídeo para albumina. Se uma medida quantitativa é desejada, por exemplo, para determinar um valor de K_D para a interação, métodos de ressonância de plãsmon de superfície podem também ser usados. Valores de ligação podem, por exemplo, podem ser definidos em um instrumento Biacore2000 (GE Healthcare). A albumina é imobilizada de modo adequado em um chip de sensor da medição e amostras do polipeptídeo, cuja afinidade é para ser determinada, são preparadas por diluição em série e injetadas. Valores de K_D podem então ser calculados a partir dos resultados com uso, por exemplo, do modelo de ligação de Langmuir 1:1 do software BIAevaluation 4.1 fornecido pelo fabricante do instrumento (GE Healthcare).

Em uma modalidade, o polipeptídeo de ligação de albumina de acordo com esse aspecto se liga à albumina de modo que o valor de k_off da interação é no máximo 5 x 10 ⁵ s ¹, como no máximo 5 x 10'⁶ s’¹.

Conforme descrito acima, os polipeptídeos de ligação de albumina, conforme definido pela sequência de aminoácidos i) , são derivados a partir de uma sequência de polipeptídeos parentais comum que se dobra em um domínio de agrupamento de três hélices alfa. Em uma modalidade, o domínio de três hélices dessa sequência de polipeptídeos parentais forma parte da proteína G a partir do filamento G148 de Streptococcus, em particular, o domínio GA3.

Em outra modalidade, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de ligação de albumina é selecionado a partir de

13/74 qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1-144 e SEQ ID NO: 164-203, como selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NO:1-144. Mais especificamente, a sequência de aminoácidos é selecionada a partir de SEQ ID NO :4-5, SEQ ID NO:7-8, SEQ ID NO:10-11, SEQ ID NO:13-14, SEQ ID NO:16-17, SEQ ID NO:19-20, SEQ ID NO:2223, SEQ ID NO:25-26, SEQ ID NO:28-29, SEQ ID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35, SEQ ID NO:37-38, SEQ ID NO:41-42, SEQ ID NO:49-50, SEQ ID NO:164-170 e SEQ ID NO:192-203. Desse modo, a sequência de aminoácidos pode ser selecionada a partir de SEQ ID NO :4-5, SEQ ID NO:7-8, SEQ ID NO:10-11, SEQ ID NO:13-14, SEQ ID NO:1617, SEQ ID NO:19-20, SEQ ID NO:22-23, SEQ ID NO:25-26, SEQ ID NO:28-29, SEQ ID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35, SEQ ID NO:37-38, SEQ ID NO:41-42 e SEQ ID NO:49-50.

Em uma modalidade, o polipeptídeo de ligação de albumina de acordo com esse aspecto compreende adicionalmente um ou mais resíduos de aminoácidos adicionais posicionados no terminal N e/ou C da sequência definida em i). Esses resíduos de aminoácidos adicionais podem ter um papel na intensificação da ligação de albumina pelo polipeptídeo e no aprimoramento da estabilidade conformacional do domínio de ligação de albumina dobrada, mas pode servir de forma igualmente satisfatória a outros propósitos, relacionados, por exemplo, a um ou mais dentre produção, purificação, estabilização in vivo ou in vitro, acoplamento, identificação ou detecção do polipeptídeo, bem como qualquer combinação dos mesmos. Tais resíduos de aminoácidos adicionais podem compreender um ou mais resíduos de aminoácido adicionados com propósitos de acoplamento químico, por exemplo, a uma resina cromatográfica para obter uma matriz de afinidade ou a uma metade de quelação para complexação com um radiometal.

Os aminoácidos que precedem ou seguem diretamente a hélice alfa no término N ou C da sequência de aminoácidos i) pode, desse modo, em uma modalidade afetar a estabilidade

14/74 conformacional. Um exemplo de um resíduo de aminoácido que pode contribuir para estabilidade conformacional aprimorada é um resíduo de serina posicionado no terminal N da sequência de aminoácidos i) conforme definido acima. O resíduo de serina de terminal N pode em alguns casos formar uma caixa de cobertura S-X-X-E canônica, pelo envolvimento de aglutinação de hidrogênio entre o oxigênio gama da cadeia lateral de serina e o NH da cadeia principal de polipeptídeo do resíduo de ácido glutâmico. Essa cobertura de terminal N pode contribuir para estabilização da primeira hélice alfa do domínio de três hélices que constitui o polipeptídeo de ligação de albumina de acordo com o primeiro aspecto da revelação.

Desse modo, em uma modalidade, os aminoácidos adicionais compreendem pelo menos um resíduo de serina no terminal N do polipeptídeo. A sequência de aminoácidos é, em outras palavras, por um ou mais resíduos de serina. Em outra modalidade do polipeptídeo de ligação de albumina, os aminoácidos adicionais compreendem um resíduo de glicina no terminal N do polipeptídeo. Ê entendido que a sequência de aminoácidos i) pode ser precedida por um, dois, três, quatro ou qualquer número adequado de resíduos de aminoácidos. Desse modo, a sequência de aminoácidos pode ser precedida por um único resíduo de serina, um único resíduo de glicina ou uma combinação dos dois, como uma combinação glicina-serina (GS) ou uma combinação glicina-serina-serina (GSS). Exemplos de polipeptídeos de ligação de albumina que compreendem resíduos de amina adicionais no terminal N são apresentados em SEQ ID NO:145-163, como em SEQ ID NO:145-148 e SEQ ID NO:162-163. Em ainda outra modalidade, os resíduos de aminoácidos adicionais compreendem um ácido glutâmico no terminal N do polipeptídeo conforme definido pela sequência i).

De modo similar, cobertura de terminal C pode ser explorada para aprimorar estabilidade da terceira hélice alfa

15/74 do domínio de três helices que constituem o polipeptídeo de ligação de albumina. Um resíduo de prolina, quando presente no terminal C da sequência de aminoácidos definida em i) , pode, pelo menos parcialmente, funcionar como um resíduo de cobertura. Em tal caso, um resíduo de lisina que segue o resíduo de prolina no terminal C pode contribuir para estabilização adicional da terceira hélice do polipeptídeo de ligação de albumina, pela aglutinação de hidrogênio entre o grupo épsilon amina do resíduo de lisina e os grupos carbonila dos aminoácidos localizados dois e três resíduos antes da lisina na cadeia principal de polipeptídeo, por exemplo, quando tanto o L45 quanto ο P46 estão presentes, os grupos carbonila dos resíduos de leucina e alanina da sequência de aminoácidos definida em i). Desse modo, em uma modalidade, os aminoácidos adicionais compreendem um resíduo de lisina no terminal C do polipeptídeo.

Conforme discutido acima, os aminoácidos adicionais podem ser relacionados à produção do polipeptídeo de ligação de albumina. Em particular, quando um polipeptídeo de ligação de albumina de acordo com uma modalidade em que ο P4 6 está presente é produzido por síntese química de peptídeo, um ou mais resíduos de aminoácidos opcionais que seguem a prolina de terminal C pode fornecer vantagens. Tais resíduos de aminoácidos adicionais podem, por exemplo, evitar a formação de substâncias indesejadas, como dicetopiperazina no estágio de dipeptídeo da síntese. Um exemplo de tal resíduo de aminoácido é a glicina. Desse modo, em uma modalidade, os aminoácidos adicionais compreendem um resíduo de glicina no terminal C do polipeptídeo, que segue diretamente o resíduo de prolina ou que segue um resíduo de glicina e/ou lisina conforme considerado acima. Alternativamente, produção de polipeptídeo pode se beneficiar da amidação do terminal C resíduo de prolina da sequência de aminoácidos i) , quando

16/74 presente. Nesse caso, a prolina de terminal C compreende um grupo amina adicional no carbono carboxílico. Em uma modalidade dos polipeptldeos descrita no presente documento, em particular, que finalizam em seu término C com prolina ou outro aminoácido conhecido por racemizar durante síntese de peptídeo, a adição mencionada acima de uma glicina ao término C ou amidação da prolina, quando presente, pode também opor-se a problemas em potencial com a racemização do terminal C resíduo de aminoácido. Se o polipeptídeo, amidado desse modo, é projetado para ser produzido por meios recombinantes, em vez de por síntese química, amidação do terminal C aminoácido pode ser executada por vários métodos conhecidos na técnica, por exemplo, através do uso de enzima PAM de amidação.

Os exemplos de polipeptídeos de ligação de albumina que compreendem resíduos de aminoácidos adicionais no terminal C são apresentados em SEQ ID NO: 145-152, como em SEQ ID NO:148-150. A pessoa versada está ciente de métodos para conseguir a modificação de terminal C, como por diferentes tipos de matrizes pré-produzidas para síntese de peptídeo.

Em outra modalidade, os resíduos de aminoácidos adicionais compreendem o resíduo de cisteína no terminal C e/ou N do polipeptídeo. Tal resíduo de cisteína pode preceder e/ou seguir diretamente a sequência de aminoácidos conforme definido em i) ou pode preceder e/ou seguir quaisquer outros resíduos de aminoácidos adicionais conforme descrito acima. Os exemplos de polipeptídeos de ligação de albumina que compreendem um resíduo de cisteína no terminal C e/ou N da cadeia de polipeptídeo são apresentados em SEQ ID NO:149-150 (terminal C) e SEQ ID NO: 151-152 (terminal N) . Pela adição de um resíduo de cisteína à cadeia de polipeptídeo, um grupo tiol para conjugação direcionada para sítio do polipeptídeo de ligação de albumina pode ser obtido. Alternativamente, um resíduo de selenocisteína pode ser introduzido no terminal C

17/74 da cadeia de polipeptídeo, de uma maneira similar a da introdução de um resíduo de cisteína, para facilitar a conjugação específica de sítio (Cheng et al, Nat Prot 1:2, 2006) .

Em uma modalidade, o polipeptídeo de ligação de albumina compreende não mais que dois resíduos de cisteína. Em outra modalidade, o polipeptídeo de ligação de albumina compreende não mais que um resíduo de cisteína.

Em outra modalidade, os resíduos de aminoácidos adicionais do polipeptídeo de ligação de albumina compreendem uma etiqueta para purificação ou detecção do polipeptídeo, como uma etiqueta de hexaistidila (Hisg) ou uma etiqueta myc (c-Myc) ou uma etiqueta FLAG para interação com anticorpos específicos para etiqueta e/ou para serem usados em purificação. A pessoa versada está ciente de outras alternativas.

Em ainda outra modalidade, o polipeptídeo de ligação de albumina de acordo com esse aspecto se liga à albumina sérica humana. Em outras modalidades, o polipeptídeo de ligação de albumina se liga à albumina a partir de outras espécies além da espécie humana, como albumina a partir de camundongo, rato, cachorro e macacos cinomolgos.

Os resíduos de aminoácidos adicionais discutidos acima pode também constituir um ou mais domínios de polipeptídeo com qualquer função desejada, como a mesma função de ligação que a primeira, domínio de ligação de albumina ou outra função de ligação ou uma função terapêutica ou uma função enzimática ou uma função fluorescente ou misturas das mesmas.

Consequentemente é, em outro aspecto relacionado, fornecido um conjugado ou proteína de fusão que compreende

i) uma primeira metade que consiste em um polipeptídeo de ligação de acordo com o primeiro aspecto

18/74 conforme descrito no presente documento; e ii) uma segunda metade que consiste em um polipeptídeo que tem uma atividade biológica desejada.

Um conjugado ou proteína de fusão que compreende um polipeptídeo de ligação de acordo com o primeiro aspecto da revelação e uma segunda metade pode aumentar a meia-vida in vitro e/ou a in vivo da segunda metade, quando comparado à meia-vida in vivo da segunda metade por si só. Como consequência, quando um conjugado ou proteína de fusão de acordo com esse aspecto é administrado a um sujeito, como um sujeito humano, a exposição in vivo à segunda metade pode aumentar, o que pode levar à potência aprimorada da atividade biológica da segunda metade, quando comparada à potência da exposição in vivo da segunda metade quando administrada por si só.

A atividade biológica desejada pode, por exemplo, ser uma atividade terapêutica, uma atividade de ligação ou uma atividade enzimática. Quando a atividade biológica desejada é a atividade terapêutica, a segunda metade que mostra essa atividade pode ser um polipeptídeo ativo de modo terapêutico. Exemplos não limitantes de polipeptídeos ativos de modo terapêutico são biomoléculas, como as moléculas selecionadas do grupo que consiste em enzimas endógenas humanas, hormônios, fatores de crescimento, quimiocinas, citocinas e linfocinas, e proteínas não humanas ativas biologicamente, como as proteínas do grupo que consiste em toxinas bacterianas (por exemplo, superantígenos estafilocócicos e estreptocócicos e exotoxina de pseudomonas), enzimas (por exemplo, RNase e beta-lactamase) e proteínas de ativação (por exemplo, estreptocinase). Exemplos não limitantes de biomoléculas ativas de modo terapêutico que podem ser úteis em uma fusão ou conjugado com o polipeptídeo de ligação de albumina são selecionadas a partir do grupo que consiste em IL-2, GLP-1, BNP (peptídeo

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Alb-beta-natriurético), IL-l-RA (interleucin-1 antagonista receptor), KGF (fator de crescimento de queratinócito), Stemgen®, hormônio de crescimento (GH), G-CSF, CTLA-4, miostatina, Fator VII, Fator VIII e Fator IX.

Os vasos sanguíneos defeituosos perfurados de tecido tumoral tornam sua vasculatura (barreira endotelial) permeável a macromoléculas, ao passo em que, em vasos sanguíneos de tecido saudável, somente moléculas pequenas podem passar pela barreira endotelial. Da mesma forma, a permeabilidade da barreira hematoarticular para albumina em articulações inflamadas de pacientes com artrite reumatoide é aumentada de modo marcante. Desse modo, as proteínas de fusão ou conjugados de acordo com esse aspecto provavelmente permeiam os vasos sanguíneos em tecido tumoral e a barreira hematoarticular em articulações inflamadas.

Quando a dita atividade biológica desejada da segunda metade é a atividade de ligação, a dita segunda metade pode ser um polipeptídeo de ligação com capacidade de interação seletiva com uma molécula alvo. Tal polipeptídeo de ligação pode, por exemplo, ser selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpos e fragmentos e domínios dos mesmos que substancialmente retêm atividade de ligação de anticorpo; microcorpos, maxicorpos, multímeros de avidez (avimers) e outras pequenas proteínas ligadas por dissulfeto; e proteínas de ligação derivadas de um arcabouço selecionadas a partir do grupo que consiste em proteína A estafilocócica e domínios da mesma, outros domínios de três hélices, lipocalinas, domínios repetidores de anquirina, domínios de ligação de celulose, cristalinos γ, proteína verde fluorescente, antígeno 4 associado ao linfócito citotóxico humano T, inibidores de protease como domínios Kunitz, domínios PDZ, domínios SH3, aptâmeros de peptídeo, nuclease estafilocócica, tendamistatos, domínio tipo III de fibronectina, transferina, dedos de zinco

20/74 e conotoxinas.

Em algumas modalidades, a molécula alvo para ligação do polipeptídeo alvo de ligação pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em peptídeo de amiloide β (Αβ) de doença de Alzheimer; outros peptídeos de amiloide associados a doenças; toxinas, como toxinas bacterianas e veneno de cobra; fatores de coagulação sanguínea, como fator von Willebrand; interleucina, como IL-13; miostatina; fatores próinflamatórios, como TNF-oí, receptor TNF-oí, IL-1, IL-8 e IL-23; fatores de complemento, como C3 e C5; mediadores de hipersensibilidade, como histamina e IgE; antígenos relacionados a tumor, como CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD40, CD52, CD70, cMet, HER1, HER2, HER3, HER4, CAIX (anidrase carbônica IX), CEA, receptor IL-2, MUC1, PSMA, TAG-72; e outras moléculas biológicas como G-CSF, GM-CSF, hormônio de crescimento (GH), insulina e somatostatina.

Como uma pessoa versada entende, o polipeptídeo de ligação de albumina de acordo com o primeiro aspecto pode ser útil em uma proteína de fusão ou como um parceiro conjugado a qualquer outra metade. Portanto, as listas acima de polipeptídeos ativo de modo terapêutico, polipeptídeos de ligação e moléculas alvo não deveríam ser construídos como limitantes de forma alguma.

Em uma modalidade de uma proteína de fusão ou conjugado de acordo com a presente revelação, a segunda metade é conjugada ao polipeptídeo de ligação de albumina por meio de uma lisina ou resíduo de cisteína adicionado ao terminal C ou N do polipeptídeo de ligação de albumina ou por meio de uma lisina ou resíduo de cisteína na posição dentro do polipeptídeo de ligação de albumina, como em uma posição selecionada a partir de X₃, X₆ e X₁₄. Se o sítio de conjugação é um dentro da sequência de aminoácidos i) do polipeptídeo de ligação de albumina, como uma cisteína na posição X_i4, nenhum

21/74 aminoácido adicional necessita ser adicionado ao polipeptídeo de ligação de albumina com o propósito de possibilitar a conjugação à segunda metade. Um sítio de conjugação dentro da cadeia de polipeptídeo conforme definido por i) pode além do mais proteger o polipeptídeo contra anticorpos de reação cruzada, em particular, a porção do polipeptídeo próxima ao sítio de conjugação. Sem querer ficar preso à teoria, quando o conjugado, por meio do polipeptídeo de ligação de albumina, é ligado à albumina sérica in vivo, isto é, situado no bolso de ligação de albumina sérica, a segunda metade, conjugada na posição dentro da, por exemplo, hélice um do domínio de três hélices que constituem o polipeptídeo de ligação de albumina, aponta para fora da albumina sérica a qual o polipeptídeo de ligação de albumina está ligado. Além disso, um sítio de conjugação dentro do polipeptídeo de ligação de albumina pode prejudicar a apresentação da porção dos peptídeos de outra forma derivados dessa porção do polipeptídeo para células T devido a, por exemplo, efeitos no processamento no antígeno que apresenta a célula, encaixe prejudicado de peptídeo potencial no sulco de ligação de peptídeo da molécula MCH de classe II, e superfície de peptídeo remodelado disponível para o receptor de célula T (devido à porção conjugada ressaltada). Desse modo, a imunogenicidade da porção do conjugado próximo ao sítio de conjugação é esperada de ficar ainda mais reduzida após conjugação.

Devido à alta afinidade entre o polipeptídeo de ligação de albumina da presente revelação e albumina sérica, um conjugado ou proteína de fusão que compreende tal polipeptídeo de ligação de albumina pode ser considerado como um complexo indireto com albumina sérica. Um conjugado ou uma proteína de fusão de acordo com a presente revelação desse modo fornece uma alternativa ao método frequentemente usado de explorar fusões ou conjugados diretos com albumina sérica.

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Tais conjugados diretos com albumina sérica são frequentemente heterogêneos, independente de qual método é usado para acoplamento. Quando uma molécula específica é acoplada à albumina sérica por meio de um grupo amina de um resíduo de lisina, qualquer uma dentre um grande número de lisinas sobre a superfície da molécula de albumina sérica pode ser alvejada, o que confere um sítio de conjugação aleatório e um produto aleatório. Embora o acoplamento de tiol por meio da cisteína não pareada única em albumina sérica humana (na posição 34, Peters, 1985, supra) pareça oferecer um método alternativo para obter um conjugado direto, tal metodologia frequentemente não leva a um produto homogêneo. Somente 20% a 60% das moléculas em albumina sérica (humana) comercialmente disponível exibem um grupo tiol livre, ao passo em que o resto é bloqueado por compostos tiol como cisteína, homocisteína ou glutationa. Em contraste, a conjugação do domínio de três hélices do polipeptídeo de ligação de acordo com a presente revelação pode ser executada de modo específico para sítio. Isso pode ser conseguido, conforme discutido acima, ou por acoplamento a uma ou mais cisteínas, a uma selenocisteína ou a uma lisina designada (protegida ortogonalmente durante a síntese).

De acordo com esse aspecto da presente revelação, a segunda metade que tem a atividade biológica desejada pode ser ou conjugada ao domínio de três hélices do polipeptídeo de ligação de albumina ou produzida como uma proteína de fusão com a mesma. Um exemplo não limitante de um conjugado de acordo com a presente revelação é dado abaixo. Peptídeo similar a glucagon 1 (GLP-1) , ou um derivado do mesmo, é um pequeno polipeptídeo que pode adequadamente estar presente como uma segunda metade em um conjugado com o polipeptídeo de ligação de albumina. A conjugação de GLP-1 ao polipeptídeo de ligação de albumina pode ser executada em qualquer uma das

23/74 posições da sequência de polipeptídeos, conforme descrito acima. 0 conjugado pode assim ser produzido em um processo não biológico e é esperado de exibir uma potência significantemente intensificada quando comparada à potência de GLP-1 por si só. A conjugação pode ser empregada tanto com pequenos polipeptídeos quanto com pequenas proteínas, como GLP-1, ou com grandes polipeptídeos ou proteínas. Um conjugado, de acordo com a presente revelação, pode tipicamente compreender uma metade espaçadora de não aminoácido, como polietilenoglicol (PEG).

Outros polipeptídeos ou proteínas podem ser combinados com uma sequência de aminoácidos do polipeptídeo de ligação de albumina na forma de uma proteína de fusão. Tal proteína de fusão pode, além disso, compreender um ou mais resíduos de aminoácidos espaçadores entre a primeira e a segunda metades.

Conforme descrito acima, o polipeptídeo de ligação de albumina, de acordo com o primeiro aspecto, liga albumina sérica a partir de várias espécies, incluindo camundongo, rato, cachorro e macacos cinomolgos. Desse modo, um conjugado ou proteína de fusão, de acordo com a presente revelação, pode contribuir para intensificar o efeito biológico de uma segunda metade, não somente em um sujeito humano, mas também em modelos animais. Várias proteínas endógenas têm sido produzidas como fusões diretas com albumina sérica humana, exemplos de tais proteínas incluem G-CSF, GH, interferons, CD4, IL-2, insulina, glucagon, GLP-1, fragmentos Fab de anticorpo e inibidores de protease como proteínas derivadas de domínio Kunitz. Entretanto, tais fusões diretas podem não ser totalmente avaliadas em modelos animais. Isso é devido ao fato de que a albumina sérica humana não interage apropriadamente com o receptor neonatal Fc endógeno (FcRn), por exemplo, nos modelos animais comumente usados, camundongo e rato, e que

24/74 essa interação é um fator importante que contribui para tempo longo de circulação de albumina sérica. Conforme descrito acima, um conjugado ou uma proteína de fusão, de acordo com a presente revelação pode, na presença de albumina sérica, combinar com a albumina e funcionar como uma fusão indireta com a albumina. Isso torna um conjugado ou a proteína de fusão que compreende um polipeptídeo de ligação, de acordo com o primeiro aspecto, útil em espécies de modelo pré-clínico, contanto que a segunda metade seja ativa biologicamente nas espécies selecionadas.

Em uma modalidade, é fornecida uma proteína de fusão ou conjugado que compreende uma porção adicional que consiste em um polipeptídeo que tem uma atividade biológica desejada adicional, que pode ser a mesma ou diferente daquela da segunda porção. Um exemplo específico de tal conjugado ou proteína de fusão compreende um polipeptídeo terapeuticamente ativo conforme definido acima como uma segunda porção e um polipeptídeo de ligação conforme definido acima como uma porção adicional.

Em relação à descrição acima de conjugados ou proteínas de fusão que incorporam um polipeptídeo de ligação de albumina de acordo com o primeiro aspecto, deve ser observado que a designação de primeira, segunda e porções adicionais é feita por propósitos de evidência para distinguir entre polipeptídeo ou polipeptídeos de ligação de albumina de acordo com a presente descrição por um lado, e porções que exibem outras funções por outro lado. Essas designações não se destinam a se referir à ordem real dos diferentes domínios na cadeia de polipeptídeo do conjugado ou proteína de fusão. Dessa forma, por exemplo, a dita primeira porção pode, sem restrição, aparecer na extremidade N-terminal, no meio, ou na extremidade C-terminal do conjugado ou proteína de fusão.

Em um aspecto relacionado, é fornecido um

25/74 polipeptídeo de ligação de albumina, conjugado ou proteína de fusão conforme definido na presente descrição, que compreendem adicionalmente uma molécula orgânica, como um agente citotóxico. Exemplos não limitadores de agentes citotóxicos que podem ser fundidos ou conjugados em um polipeptídeo de ligação de albumina de acordo com o primeiro aspecto, ou combinados a um conjugado ou proteína de fusão de acordo com o segundo aspecto, são selecionados de caliqueamicina, auristatina, doxorubicina, maitansinoide, taxol, ecteinascidina, geldanamicina, metotrexato e seus derivados, e combinações dos mesmos. Anteriormente, foram realizadas tentativas para tratar vários transtornos com conjugados de albumina direta. Tais conjugados de albumina direta foram explorados, por exemplo, com doxorubicina contra o câncer (Kratz et al, J Med Chem 45: 5.523 a 33, 2002) e metotrexato contra artrite reumatoide (Wunder et al, J Immunol 170:4.793 a 4.801, 2003). Deve ser compreendido que o polipeptídeo de ligação de albumina, quer sozinho ou como uma porção em um conjugado ou proteína de fusão, através de sua elevada capacidade de ligação de albumina, fornece meios indiretos de construção de complexos de albumina, e, dessa forma, pode fornecer um método de tratamento alternativo comparado às tentativas mencionadas acima.

Os aspectos acima abrangem, além disso, polipeptídeos nos quais o polipeptídeo de ligação de albumina de acordo com o primeiro aspecto, ou o polipeptídeo de ligação de albumina conforme compreendido em um conjugado ou proteína de fusão de acordo com o segundo aspecto, dotados de um grupo de identificação, como uma identificação selecionada do grupo que consiste em metais e corantes fluorescentes, corantes cromofóricos, compostos quimioluminescentes e proteínas bioluminescentes, enzimas, radionuclídeos e partículas, por exemplo, para propósitos de detecção do polipeptídeo. Em

26/74 particular, a descrição abrange um polipeptídeo radioetiquetado que consiste em um radioquelato de um polipeptídeo de ligação de albumina, conjugado ou proteína de fusão conforme descrito no presente documento e um radionuclídeo, como um metal radioativo.

Em modalidades nas quais o polipeptídeo de ligação de albumina etiquetado compreende um polipeptídeo de ligação de albumina de acordo com o primeiro aspecto da descrição e uma identificação, o polipeptídeo etiquetado pode ser, por exemplo, usado para etiquetação de albumina sérica indiretamente. Devido à forte associação entre o polipeptídeo etiquetado e a albumina sérica, o polipeptídeo etiquetado pode ser usado, por exemplo, para estudar permeabilidade vascular e acúmulo sanguíneo.

Em outras modalidades, o polipeptídeo de ligação de albumina etiquetado está presente como uma porção em um conjugado ou proteína de fusão que também compreende uma segunda porção que tem uma atividade biológica desejada. A identificação pode, em alguns casos, estar acoplada apenas ao polipeptídeo de ligação de albumina, e, em alguns casos, ao polipeptídeo de ligação de albumina e à segunda porção do conjugado ou proteína de fusão. Quando é feita referência a um polipeptídeo etiquetado, isso deve ser compreendido como uma referência a todos os aspectos de polipeptídeos conforme descrito no presente documento, incluindo proteínas e conjugados de fusão que compreendem um polipeptídeo de ligação de albumina e uma segunda e, opcionalmente, porções adicionais. Dessa forma, um polipeptídeo etiquetado pode conter apenas o polipeptídeo de ligação de albumina e, por exemplo, um radionuclídeo terapêutico, que pode ser quelado ou acoplado de modo covalente ao polipeptídeo de ligação de albumina, ou conter o polipeptídeo de ligação de albumina, um radionuclídeo terapêutico e uma segunda porção como uma

27/74 pequena molécula que tem uma atividade biológica desejada como eficácia terapêutica.

Em modalidades nas quais o polipeptídeo de ligação de albumina, o conjugado ou proteína de fusão é radioetiquetado, tal polipeptídeo radioetiquetado pode compreender um radionuclídeo. Uma maioria de radionuclídeos tem uma natureza metálica e os metais não têm, tipicamente, a capacidade de formar ligações covalentes estáveis com elementos apresentados em proteínas e peptídeos. Por esta razão, a etiquetação de proteínas e peptídeos com metais radioativos é realizada com o uso de quelantes, isto é, ligantes multidentados, que formam compostos não covalentes, denominados quelatos, com os íons metálicos. Em uma modalidade do polipeptídeo de ligação de albumina, conjugado ou proteína de fusão, a incorporação de um radionuclídeo é possível através do fornecimento de um ambiente de quelação, através do qual o radionuclídeo pode ser coordenado, quelado ou complexado em relação ao polipeptídeo.

Um exemplo de um quelante é o tipo poliaminopolicarboxilado de quelante. Duas classes de tais quelantes poliaminopolicarboxilados podem ser distinguidas: quelantes macrocíclicos e acíclicos. Em uma modalidade, o polipeptídeo de ligação de albumina, conjugado ou proteína de fusão compreende um ambiente de quelação fornecido por um quelante poliaminopolicarboxilado conjugado ao polipeptídeo de ligação de albumina através de um grupo tiol de um resíduo de cistina ou um grupo amina ípsilon de um resíduo de lisina.

Os quelantes macrocíclicos mais comumente usados para radioisótopos de índio, gálio, ítrio, bismuto, radioaactinídeo e radiolantanídeo são diferentes derivados de DOTA (ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-l,4,7,10tetraacético). Em uma modalidade, o ambiente de quelação do polipeptídeo de ligação de albumina, conjugado ou proteína de

28/74 fusão é fornecido por DOTA ou um derivado do mesmo. Mais especificamente, um grupo de polipeptídeos de quelação abrangido pela presente descrição é produzido através da reação do ácido-10-maleimidoetilacetamida 1,4,7,10tetraazaciclododecano-1,4,7-tris-acético derivado de DOTA (maleimidomonoamida-DOTA) com, por exemplo, um grupo tiol do polipeptídeo de ligação de albumina, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 5.

A elevada inércia cinética, isto é, a lenta taxa de dissociação de metal de DOTA, favorece fixação estável de um radionuclídeo. No entanto, elevadas temperaturas são necessárias para etiquetação devido a uma lenta taxa de associação. Por esta razão, os derivados de DOTA são amplamente usados para etiquetação de peptídeos curtos, como os polipeptídeos de ligação de albumina da presente descrição, que exibem funcionalidade de ligação após incubação a temperaturas exigidas para a reação de etiquetação.

Os quelantes poliaminopolicarboxilados acíclicos mais comumente usados são diferentes derivados de DTPA (ácido dietilenotriamina-pentaacético). Por conseguinte, os polipeptídeos que têm’ um ambiente de quelação fornecido pelo ácido dietilenotriaminapentaacético ou derivados do mesmo também são abrangidos pela presente descrição.

Verificou-se que variantes semirrígidos de estrutura principal modificada de DTPA fornece estabilidade adequada para etiquetação com ⁹⁰Y de, por exemplo, Zevalin®. Embora quelantes acíclicos sejam menos inertes, e, consequentemente, menos estáveis que os macrocíclicos, sua etiquetação é rápida o suficiente mesmo à temperatura ambiente. Por esta razão, os mesmos podem ser usados para etiquetação de conjugados ou proteínas de fusão de acordo com a presente descrição. Protocolos detalhados para acoplamento de quelantes poliaminopolicarboxilados a proteínas e peptídeos de

29/74 direcionamento foram publicados por Cooper et al (Nat Prot 1: 314 a 7, 2006) e por Sosabowski and Mather (Nat Prot 1:972 a 6, 2006).

Um polipeptídeo de ligação de albumina, um conjugado ou proteína de fusão de acordo com os aspectos descritos no presente documento acoplado a um quelante poliaminopolicarboxilado pode ser usado para fornecer um polipeptídeo radioetiquetado que consiste em um radioquelato do polipeptídeo de ligação de albumina, conjugado ou proteína de fusão acoplado ao quelante e um radionuclídeo adequado para formação de imagem médica, em que o radionuclídeo é selecionado do grupo que consiste em ⁶¹Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁶Ga, ^Ê7Ga, ⁶⁸Ga, ^110mIn, ^11:LIn, ⁴⁴Sc e ⁸⁶Y, ou com um radionuclídeo adequado para terapia, em que o radionuclídeo é selecionado do grupo que consiste em ²²⁵Ac, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ⁶⁷Cu, ^16SHo, ¹⁷⁷Lu, ²¹²Pb, ¹⁴⁹Pm, ¹⁵³Sm, ²²⁷Th e ⁹⁰Y, sendo que o radionuclídeo é complexado com o polipeptídeo de ligação de albumina através de um quelante.

Em modalidades do mesmo, o polipeptídeo também pode ser radioetiquetado com radioisótopos não metálicos com o uso da denominada etiquetação indireta. Dessa forma, para etiquetação com, por exemplo, ¹⁸F, ⁷⁶Br, diferentes isótopos de iodo e ²¹¹At, moléculas ligantes intermediárias são usadas para etiquetação. Tal molécula ligante deveria conter duas porções funcionais, uma que fornece radioetiquetação rápida e eficaz, e outra que permite acoplamento rápido e eficiente às proteínas, por exemplo, a grupos amina, ou, de preferência, ao grupo tiol de uma cistina exclusiva, como na posição Χ_ϊ4 do polipeptídeo de ligação de albumina. Por exemplo, um grupo malemida reage com grupos tiol para formar uma ligação de tioéter estável. A molécula ligante pode, em primeiro lugar, ser reagida com a radioidentificação e, subsequentemente, com o grupo tiol ou selenotiol da proteína.

Em outro aspecto, é fornecido um polinucleotídeo que

30/74 codifica um polipeptídeo de ligação de albumina ou uma proteína de fusão conforme descrito no presente documento. Também é abrangido um método de produção de um polipeptídeo de ligação de albumina ou uma proteína de fusão conforme descrito acima, que compreendem expressar o polinucleotídeo, um vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo e uma célula hospedeira que compreende o vetor de expressão.

O polipeptídeo de ligação de albumina da presente descrição pode ser alternativamente produzido por síntese de peptídeo não biológico com o uso de aminoácidos e/ou derivados de aminoácido que têm cadeias laterais reativas protegidas, em que a síntese de peptídeo não biológico compreende acoplar, gradualmente, os aminoácidos e/ou os derivados de aminoácido para formar um polipeptídeo de acordo com o primeiro aspecto que tem cadeias laterais reativas protegidas, remover os grupos de proteção das cadeias laterais reativas do polipeptídeo, e envolver o polipeptídeo em solução aquosa.

Dessa forma, aminoácidos normais (por exemplo, glicina, alanina, fenilalanina, isoleucina, leucina e valina) e derivados de aminoácido pré-protegido são usados para construir sequencialmente uma sequência de polipeptídeos, em solução ou em um suporte sólido em um solvente orgânico. Um exemplo específico de síntese de peptídeo em suporte sólido está descrito no Exemplo 5. Quando uma sequência de polipeptídeos completa é construída, os grupos de proteção são removidos e é permitido que o polipeptídeo seja dobrado em uma solução aquosa. Cada polipeptídeo de acordo com a presente descrição dobra de modo reversível em um domínio de agrupamento de três hélices sem fatores adicionados, e, por conseguinte, se dobra de maneira espontânea.

O conjugado de acordo com o segundo aspecto pode ser

31/74 produzido através de um método que compreende produzir um polipeptídeo de ligação de albumina de acordo com qualquer um dos métodos descritos acima, como através de síntese de peptídeo não biológico, e conjugar o polipeptídeo de ligação 5 de albumina produzido com uma segunda e/ou porção adicional conforme definido em conexão com o segundo aspecto.

Em uma modalidade de um conjugado ou proteína de fusão, é adicionalmente fornecido um conjugado ou proteína de fusão conforme definido no presente documento para uso em 10 terapia, por exemplo, para uso como um medicamento. Tal conjugado ou proteína de fusão pode exibir uma meia vida in vivo que é mais longa que a meia vida in vivo do polipeptídeo que tem uma atividade biológica desejada per se. 0 conjugado ou proteína de fusão pode, além disso, extrair nenhuma ou uma 15 imunorresposta reduzida mediante administração no mamífero, como um ser humano, conforme comparado à imunorresposta extraída mediante administração no mamífero do polipeptídeo que tem uma atividade biológica desejada per se. Expressando de forma alternativa, isso fornece um método para diminuir a 20 imunogenicidade de um polipeptídeo que tem uma atividade biológica desejada, através da fusão ou conjugação de tal polipeptídeo em um polipeptídeo de ligação de albumina, conjugado ou proteína de fusão de acordo com aspectos revelados no presente documento. Além disso, isso pode 25 permitir intensificação da atividade biológica de uma segunda porção.

Em outra modalidade, é fornecido um conjugado ou proteína de fusão de acordo com a presente descrição, para uso em diagnóstico, por exemplo, para uso como um agente 30 diagnóstico.

A presente descrição também está relacionada a diferentes aspectos do uso do polipeptídeo de ligação de albumina descrito acima, bem como vários métodos para

32/74 tratamento, diagnose e detecção nos quais o polipeptídeo é útil devido a sua, dentre outras, característica de ligação. Ao referir-se ao polipeptídeo de ligação de albumina na seguinte descrição desses usos e métodos, entende-se que esse 5 termo abrange o polipeptídeo de ligação de albumina sozinho, mas também todas aquelas moléculas baseadas nesse polipeptídeo descrito acima que, por exemplo, incorpora o polipeptídeo de ligação de albumina como uma porção em um conjugado ou proteína de fusão, e/ou são conjugadas em uma identificação, 10 um quelante, um agente terapêutico e/ou de diagnóstico e/ou são dotadas de resíduos de aminoácido adicionais como uma etiqueta ou para outros propósitos. Conforme explicado acima, tais proteínas de fusão, derivados, etc., formam uma parte da presente descrição.

Outro conjunto de aspectos está relacionado ao fornecimento de novos meios para aumentar a solubilidade em solução aquosa de um composto insatisfatoriamente solúvel, através da conjugação do mesmo em um polipeptídeo de ligação de albumina, conjugado ou proteína de fusão. O seguinte 20 complexo de composto insatisfatoriamente solúvel e um polipeptídeo de ligação de albumina, sozinho ou incorporado como uma porção em um conjugado ou proteína de fusão, tem a capacidade de se associar à albumina in vivo ou in vitro, cuja associação aumenta a solubilidade em solução aquosa. Dessa 25 forma, em uma modalidade desse aspecto adicional, é fornecida uma composição, que compreende um composto que tem, per se, uma solubilidade em água não maior que 100 pg/ml; acoplado a um polipeptídeo de ligação de albumina, um conjugado 30 ou proteína de fusão conforme descrito no presente documento, sendo que o composto e o polipeptídeo de ligação de albumina, conjugado ou proteína de fusão estão acoplados de modo covalente.

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Em uma modalidade, o composto tem, per se, uma solubilidade não maior que 10 pg/ml. Em ainda outra modalidade, a dita solubilidade não é maior que 1 pg/ml.

Em algumas modalidades, o composto pode ser um 5 composto farmaceuticamente ativo, por exemplo, um agente citotóxico. Exemplos não limitadores de agentes citotóxicos são aqueles selecionados de caliqueamicina, auristatina, doxorubicina, maitansinoide, taxol, ecteinascidina, geldanamicina e seus derivados, e combinações dos mesmos. 10 Alternativamente, o agente citotóxico pode ser uma quimiotoxina sintética produzida por síntese orgânica e não derivada de um composto de ocorrência natural.

Além do composto insatisfatoriamente solúvel e do polipeptídeo de ligação de albumina, conjugado ou proteína de 15 fusão, a composição de acordo com esse aspecto da descrição pode, em algumas modalidades, compreender também um polipeptídeo de ligação com uma afinidade por um alvo clinicamente relevante. Esse polipeptídeo de ligação é adequadamente diferente do polipeptídeo de ligação de 2 0 albumina, e pode ser acoplado de modo covalente ou não covalente aos outros componentes da composição da invenção. Como exemplos não limitadores, o polipeptídeo de ligação com uma afinidade por um alvo clinicamente relevante pode ser selecionado do grupo que consiste em anticorpos e fragmentos e 25 domínios dos mesmos que retêm, substancialmente, atividade de ligação de anticorpo; microcorpos, maxicorpos, avímeros e outras pequenas proteínas ligadas a bissulfeto; e proteínas de ligação derivadas de um arcabouço selecionado do grupo que consiste em proteína A estafilocócica e domínios da mesma, 30 outros domínios de três hélices, lipocalinas, anquirina domínios de repetição, domínios de ligação de celulose, cristalinos γ, proteína fluorescente verde, antígeno 4 associado ao linfócito T citotóxico humano, inibidores de

34/74 protease como domínios Kunitz, domínios PDZ, domínios SH3, peptídeos aptâmeros, nucleasse estafilocócica, tendamistats, domínio tipo III de fibronectina, transferrina, dedos de zinco e conotoxinas.

A composição de acordo com o aspecto acima da presente descrição tem uma capacidade de se associar à albumina in vivo ou in vitro, mediante fornecimento na composição de um polipeptídeo de ligação de albumina, por si só ou como presente em um conjugado ou proteína de fusão. Em 10 determinados casos, pode ser benéfico formar um complexo da composição com albumina fora de um organismo vivo, isto é, adicionar albumina exógena à composição. Tal composição pode ser liofilizada, fornecendo uma formulação que é adequada para armazenamento à temperatura ambiente. Dessa forma, a presente 15 descrição também fornece uma composição conforme definido acima que compreende adicionalmente albumina, como albumina sérica humana.

A presente descrição também fornece a composição de acordo com o aspecto acima para uso como um medicamento, isto 2 0 é, para uso em terapia, em casos nos quais o composto é um composto terapeuticamente ativo. De forma adequada, o fornecimento de um polipeptídeo de ligação de albumina, conjugado ou proteína de fusão e, opcionalmente, albumina, não afeta, de forma prejudicial, a eficácia terapêutica do 25 composto ativo, então a composição da invenção será útil naqueles cenários terapêuticos ou profiláticos nos quais o composto per se é indicado.

Em outra modalidade, é fornecida a composição de acordo com o aspecto acima para uso como um agente 30 diagnóstico, isto é, para uso em diagnóstico.

Um aspecto relacionado da presente descrição fornece um método de preparação de uma composição conforme descrito imediatamente acima. O método compreende

35/74 fornecer um composto que per se tem uma solubilidade em água não maior que 100 pg/ml; e acoplar, de modo covalente, o composto a um polipeptídeo de ligação de albumina, conjugado ou proteína de 5 fusão de acordo com os aspectos conforme descrito no presente documento, formando, assim, uma composição que compreende um complexo covalente de composto e polipeptídeo de ligação de albumina, conjugado ou proteína de fusão.

Em modalidades da presente descrição nas quais a 10 albumina está incluída na composição, o método pode compreender a etapa adicional de mistura do dito complexo de composto e polipeptídeo de ligação de albumina, conjugado ou proteína de fusão à albumina, formando, assim, uma composição que compreende um complexo não covalente i) do complexo 15 covalente de composto e polipeptídeo de ligação de albumina, conjugado ou proteína de fusão, e ii) da albumina. As proporções relativas dos dois componentes desse complexo não covalente podem, por exemplo, ser 1:1, de modo que uma unidade do complexo de composto insatisfatoriamente solúvel e 20 polipeptídeo de ligação de albumina, conjugado ou proteína de fusão esteja associada a uma molécula de albumina. Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente liofilizar o complexo não covalente para obter uma composição liofilizada.

Em outro aspecto aproximadamente relacionado, a 25 presente descrição fornece um método de aumento da solubilidade aquosa de um composto, que compreende fornecer um composto que, per se, tem uma solubilidade em água não maior que 100 pg/ml;

acoplar, de modo covalente, o composto a um 30 polipeptídeo de ligação de albumina, conjugado ou proteína de fusão de acordo com os aspectos conforme descrito no presente documento, formando, assim, um complexo covalente de composto e polipeptídeo de ligação de albumina, conjugado ou proteína

36/74 de fusão; e misturar o dito complexo de composto e polipeptídeo de ligação de albumina, conjugado ou proteína de fusão à albumina sob condições que promovam a associação não covalente 5 do polipeptídeo de ligação de albumina à albumina;

sendo que a solubilidade em água do composto no dito complexo é superior à solubilidade em água do composto per se.

Nestes aspectos do método relacionados à solubilidade de um composto insatisfatoriamente solúvel, os 10 recursos opcionais dos vários componentes são conforme descrito em conexão com o aspecto da composição imediatamente precedente.

Embora a invenção tenha sido descrita com referência a várias modalidades exemplificadoras, será compreendido pelo 15 versado na técnica que várias mudanças podem ser realizadas e equivalentes podem ser substituídos por elementos dos mesmos sem que se desvie do escopo da invenção. Além disso, muitas modificações podem ser realizar a fim de adaptar uma situação particular ou molécula aos ensinamentos da invenção sem que se 20 desvie do escopo essencial da mesma. Portanto, pretende-se que a invenção não se limite a qualquer modalidade particular contemplada para executar essa invenção, mas que a invenção incluirá todas as modalidades que se situam dentro do escopo das reivindicações anexas.

FIGURAS

A Figura 1 é uma listagem das sequências de aminoácido de exemplos de polipeptídeos de ligação de albumina da presente descrição (SEQ ID NO:1-152, SEQ ID NO:155-203), o domínio GA3 de proteína G de cepa G148 de Streptococcus 30 estendida por um resíduo de glicina N-terminal (SEQ ID NO:153) e um polipeptídeo de ligação de albumina derivado de G148-GA3 conforme previamente descrito por Jonsson et al (supra., SEQ ID N0:154).

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A Figura 2 mostra o resultado da análise de ligação realizada em um instrumento Biacore para investigar a ligação do polipeptídeo de ligação de albumina PEP07912 (SEQ ID NO:157) à albumina sérica humana. Três concentrações diferentes de proteína purificada (40 nM, linha cinza de gordura; 10 nM, linha negra; e 2,5 nM, linha cinza) foram injetadas em uma superfície com 955 RU de albumina sérica humana imobilizada.

As Figuras 3A a C mostram o resultado de análise de * 10 ligação realizada por ELISA para investigar a ligação do polipeptídeos de ligação de albumina PEP07913 (SEQ ID NO:153),

PEP06923 (SEQ ID NO:154), PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07554 (SEQ ID NO:156), PEP07914 (SEQ ID NO:158), PEP07968 (PEP07911 DOTA conjugado, SEQ ID NO:159) e 15 PEP07844 (SEQ ID NO:161), a moléculas de IgG presentes em soro humano normal individual 126, onde A) mostra o valor OD mediano, B) mostra a porcentagem de soro negativo (definido como OD < 0,15), e C) mostra a porcentagem de soro positivo (definido como OD > 1,0).

0 As Figuras 4A a B são cromatogramas que mostram a análise de polipeptídeo de ligação de albumina PEP07834 quimicamente produzido purificado (SEQ ID NO:160), onde A) mostra o sinal de absorbância a 220 nm, em branco subtraído, e B) mostra o sinal de absorbância a 280 nm, em branco * 25 subtraído. Os dois picos apareceram em ambos os comprimentos _ de onda.

▼

As Figuras 5A a B são espectrogramas que mostram a análise massaespectrométrica dos dois picos identificados na Figura 4A) e B) . A) é o espectrograma do primeiro pico, isto 30 é, o monômero de PEP07834 (SEQ ID NO: 160) , e B) é o espectrograma do dímero de PEP07834.

As Figuras 6A a C são diagramas que mostram uma avaliação de imunogenicidade de polipeptídeos de ligação de

38/74 albumina PEP07913 (SEQ ID NO:153), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07914 (SEQ ID NO:158) e PEP07968 (PEP07911 DOTA conjugado, SEQ ID NO: 159) em um ensaio de proliferação de célula T CD3 ⁺CD4⁺. A) mostra o número de indivíduos que respondem ao polipeptídeos de ligação de albumina comparado à albumina humana recombinante em um coorte de 52 doadores caucasianos. B) mostra os índices de estímulo medianos (SI) para PEP07913, PEP07912, PEP07914 e PEP07968 comparado ao controle negativo contendo albumina humana recombinante. C) mostra o número de indivíduos que respondem contra todas as proteínas no estudo conforme comparado ao controle tampão.

As Figuras 7A a C mostram o resultado de análise de ligação realizada em um instrumento Biacore para investigar a ligação do polipeptídeos de ligação de albumina A) PEP07986 (SEQ ID NO:163), B) PEP08296 (PEP08185 DOTA conjugado, SEQ ID NO:148) e 0) PEP06923 (SEQ ID NO:154) à albumina de diferentes espécies. Os sensogramas mostrados correspondem à proteína injetada a uma concentração de 4 0 nM em superfícies imobilizadas com albumina de ser humano (113 0 RU) , linha cinza delgada; macaco cinomolgo (1046 RU) , linha cinza espessa; rato (831 RU) , linha cinza claro espessa; cão (1053 RU) , linha negra delgada; e camundongo (858 RU), linha negra espessa.

A Figura 8 mostra o efeito inibitório de Z_x-PP013 (círculos abertos), Z_Y-PP013 (quadrados abertos) e Z_neg-PP013 (triângulos fechados) na proliferação de célula TF-1 induzida por citoquina na presença de excesso molar de cinco vezes de HSA.

A Figura 9 mostra as respostas de ligação máxima obtidas por análise Biacore de PEP07986 (SEQ ID NO:163) armazenada a 4, 25 ou 40°C por uma semana, duas semanas, um mês e três meses conforme indicado, a uma concentração de 2 mg/ml, injetada em HSA imobilizada (704 RU) a uma concentração de 10 nM. As amostras não tratadas do tempo time = 0 são

39/74 mostradas como referências.

A Figura 10 mostra o resultado de análise de ligação realizada em um instrumento Biacore para investigar a ligação do polipeptídeo de ligação de albumina PEP08296 (PEP08185 DOTA conjugado, SEQ ID NO:148) à albumina sérica humana antes e após tratamento térmico. Duas concentrações de PEP08296 (0,8 nM, linhas cinzas; 4 nM, linhas negras) foram injetadas em uma superfície com 724 RU de albumina sérica humana imobilizada. As linhas sólidas são tratamento térmico anterior e linhas pontilhadas, tratamento térmico posterior por 10 minutos a 90°C.

As Figuras 11A a B mostram a sobreposição de dois espectros de CD de PEP08296 (PEP08185 DOTA conjugado, SEQ ID NO:148) antes e após tratamento térmico por 12 minutos a 90°C. A) Amostra incubada em PBS pH 7,2. B) Amostra incubada em PBS pH 4,0.

A Figura 12 mostra a imagem de projeção de intensidade máxima (MIP) de toda a distribuição de corpo de ⁶⁸Ga-PEP08296 em um camundongo saudável, somada durante 1,5 hora de coleta de dados imediatamente após injeção intravenosa (veia da cauda). A radioatividade circulante nos vasos principais (por exemplo, a jugular (seta longa) e femoral (seta curta)), o coração (H), fígado (L) , baço (S), rim (K) e bexiga (B) estão prontamente delineados.

A Figura 13 mostra um cromatograma de filtração de gel de PEP07986 (SEQ ID NO:163) injetado a uma concentração de 42 mg/ml, linha sólida negra. Um cromatograma de ovalbumina (Mw 43 kDa) injetada a uma concentração de 5 mg/ml, linha partida cinza, está incluído para comparação, confirmando que o pico para PEP07986 não é um agregado, o que seria esperado no volume de espaço vazio eluído em um instante de tempo anterior à ovalbumina.

A invenção será, nesse instante, ilustrada

40/74 adicionalmente através da descrição não limitadora de experimentos conduzidos de acordo com a mesma. A menos onde especificado em contrário, métodos convencionais de química e biologia molecular foram usados ao longo da mesma. EXEMPLOS

Exemplo 1:

Clonagem, expressão, purificação e caracterização de polipeptídeos de ligação de albumina

Neste exemplo, dez diferentes polipeptídeos de ligação de albumina, PEP07913 (SEQ ID NO:153), PEP07912 (SEQ ID NO:156), PEP07914 (SEQ ID NO:158), PEP07968 (PEP07911 DOTA conjugado, SEQ ID NO:159), PEP06923 (SEQ ID NO:154), PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07554 (SEQ ID NO:156), PEP07844 (SEQ ID NO:161), PEP07986 (SEQ ID NO:163) e PEP08296 (PEP08185 DOTA conjugado, SEQ ID NO:148), as sequências de aminoácido dos mesmos são apresentadas na Figura 1 e na listagem de sequência anexada, foram clonados, purificados e caracterizados.

Material e métodos

Clonagem de variantes de polipeptídeo de ligação de albumina

Mutações em G148-GA3 foram geradas com o uso de mutagênese sítio-direcionada com os oligonucleotídeos apropriados para obter as variantes de polipeptídeo de ligação de albumina desejadas. Os fragmentos de gene foram amplificados por PCR com iniciadores adicionando sítios de endonuclease específica bem como uma sequência de MGSS Nterminal que precede as variantes de polipeptídeo de ligação de albumina. Os fragmentos foram clivados com Ndel e Notl, purificados e ligados a um vetor de clonagem, o plasmídeo pAY02556 (contendo uma origem de replicação de pBR322, um gene de resistência à canamicina e um promotor T7 para expressão do gene de interesse), restringidos com as mesmas enzimas. AS ligações foram transformadas em células TOPIO de E. coli

41/74 eletrocompetentes. As células transformadas foram estendidas sobre placas de TBAB (30 g/1 de ágar base sangue triptose) suplementadas com 50 pg/ml de canamicina, seguido por incubação a 37°C de um dia para o outro. As colônias foram varridas com o uso de PCR e o sequenciamento de fragmentos amplificados foi realizado com o uso de oligonucleotídeo biotinilado e um Kit de Sequenciamento de Ciclo Terminator v3.1 BigDye® (Applied Biosystems), usado de acordo com o protocolo do fabricante. As reações de sequenciamento foram purificadas através da ligação a esferas revestidas com estreptavidina magnética com o uso de um Magnatrix 8000 (NorDiag AB) , e analisadas em um Analisador Genético ABI PRISM® 3100 (PE Applied Biosystems). Todas as variantes de polipeptídeo de ligação de albumina foram subclonadas como monômeros e os construtos codificados pelos vetores de expressão foram MGSS-[PP###], onde PP### corresponde aos resíduos de aminoácido que constituem a sequência do polipeptídeo de ligação de albumina.

Além disso, os fragmentos de gene de G148-GA3, PP007 (SEQ ID NO:7), PP013 (SEQ ID NO:13) e PP037 (SEQ ID NO:37) foram amplificados por PCR com iniciadores adicionando sítios de endonuclease específica bem como uma sequência de hexahistidina, um sítios de TEV protease e um resíduo de glicina antes de os resíduos de aminoácido que constituem a sequência do polipeptídeo de ligação de albumina. Os polipeptídeos PEP07913 (SEQ ID NO:153), PEP07912 (SEQ ID

NO:157), PEP07914 (SEQ ID NO:158) e PEP07968 (SEQ ID NO:159) correspondem aos polipeptídeos de ligação de albumina G148GA3, PP007 (SEQ ID NO:7), PP013 (SEQ ID NO:13) e PP037 (SEQ ID NO:37) com resíduos de glicina adicionados. Os fragmentos foram clivados com XbaT e NotT, purificados e ligados a um vetor de clonagem, o plasmídeo pAY02512 (contendo uma origem de replicação de pBR322, um gene de resistência à canamicina e

42/74 um promotor T7 para expressão do gene de interesse. O sítio de clonagem é precedido por uma sequência que codifica um peptídeo contendo uma etiqueta de hexahistidina seguido por um sítio de divagem para a TEV protease) , restringido com as mesmas enzimas. A ligação, a transformação e a verificação de sequência foram realizadas conforme descrito acima. As quatro variantes de polipeptídeo de ligação de albumina G148-GA3, PP007, PP013 e PP037 foram subclonadas como monômeros e os construtos codificados pelos vetores de expressão foram MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQG-[PP###].

O vetor de expressão que codifica MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQG-[PP013] foi adicionalmente modificado por mutagênese sítio-direcionada com o uso de oligonucleotídeos, resultando na inserção de um resíduo de serina antes de os resíduos de aminoácido que constituem a sequência do polipeptídeo de ligação de albumina, para obter o construto MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQGS-[PP013]. Esse construto foi adicionalmente modificado por 1) mutagênese sítiodirecionada para substituir o resíduo de serina na posição 14 (em PP013) por um resíduo de cistina, gerando MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQGS-[PP049] , e 2) adição de um resíduo de glicina C-terminal, gerando MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQGS-[PP049] -G. A adição de glicina Cterminal foi realizada por amplificação PCR com iniciadores incluindo nucleotídeos que codificam o resíduo de glicina e sítios de endonuclease específica. O fragmento foi clivado com Xbal e Notl, purificado e ligado a um vetor de clonagem, o plasmídeo pAY02641 (contendo uma origem de replicação de pBR322, um gene de resistência à canamicina e um promotor T7 para expressão do gene de interesse), restringido com as mesmas enzimas. A ligação, a transformação e a verificação de sequência foram realizadas conforme descrito acima.

Expressão de proteína

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As variantes de polipeptídeo de ligação de albumina foram expressas em E. coli BL21 (DE3) com uma extensão MGSS Nterminal ou com uma etiqueta His₆ N-terminal seguido por um sítio de reconhecimento de TEV-protease e um resíduo de glicina. Uma colônia de cada variante de polipeptídeo de ligação de albumina foi usada para inocular 4 ml de meio de TSB+YE suplementado com canamicina a uma concentração de 50 pg/ml. As culturas foram cultivadas a 37°C por aproximadamente 5 horas. 3 ml de cada uma das culturas foram usados para inocular 800 ml de TSB+YE suplementado com canamicina a uma concentração de 50 pg/ml em biorreatores paralelos (Greta system, Belach Bioteknik AB) . Os cultivos foram realizados a 37°C, com aeração a 800 ml/minuto e um perfil de agitação para manter os níveis de oxigênio dissolvido acima de 3 0%, a um OD600 de 2, que foi seguido pela adição de IPTG a uma concentração final de 0,5 mM. O cultivo foi continuado por cinco horas, após o qual o cultivo foi resfriado a 10°C, a aeração foi interrompida e a agitação diminuída para 300 rpm. Os péletes de célula foram colhidos por centrifugação (15.600 x g, 4°C, 20 minutos) e armazenados a -20°C até purificação.

Purificação de variantes de polipeptídeo de ligação de albumina com uma etiqueta His₆ e um sítio de TEV-protease

Os péletes de célula congelados que armazenam polipeptídeos com etiqueta de hexahistidina solúveis PEP07913 (SEQ ID NO:153), PEP07912 (SEQ ID NO:156), PEP07914 (SEQ ID NO:158), PEP07968 (SEQ ID NO:159), PEP07986 (SEQ ID NO:163) e PEP08185 (SEQ ID NO:148) foram suspensos em 35 ml de tampão de ligação (20 mM de fosfato de sódio, 0,5 M de NaCl, 20 mM de imidazol, pH 7,4) com uma adição de 1000 U de Benzonase® (1.01654.001, Merck) e rompidos por ultrassonicação. Para cada um dos polipeptídeos, a suspensão ultrassonicada foi clarificada por centrifugação (1 hora, 37.000 x g, 4°C) e o i · TM sobrenadante foi carregado sobre uma coluna His GraviTrap

44/74 (11-0033-99, GE Healthcare) . A coluna foi lavada com 10 ml de tampão de lavagem (20 mM de fosfato de sódio, 0,5 de 14 NaCl, 60 mH de imidazol, pH 7,4), antes da eluição do polipeptídeo com 3 ml tampão de eluição (20 ml4 de fosfato de sódio, 0,5 M de NaCl, 0,5 M de imidazol, pH 7,4). 0 tampão foi trocado para um tampão de divagem (50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, pH 8) com o uso de uma coluna de dessalinização PD-10 (17-085101, GE Healthcare) . A quantidade de produto de polipeptídeo foi determinada através da medição da absorbância a 280 nm antes da adição de DTT a uma concentração final de 5 mM. TEV protease com etiqueta His_s foi adicionada ao tampão de divagem a uma razão de massa de 1:10 em relação ao produto de polipeptídeo. A divagem foi realizada de um dia para o outro sob mistura lenta a 4°C. Foi adicionado imidazol à mistura de divagem, a uma concentração de 20 mM, antes do carregamento da mistura sobre uma coluna His GraviTrap™ (11-0033-99, GE Healthcare) para remover etiquetas His_s clivadas, TEV protease com etiqueta His₆ e produto não clivado com etiqueta Hisg.

Para cada variante, o fluxo, contendo a variante de polipeptídeo de ligação de albumina, foi adicionalmente purificado por cromatografia de fase reversa (RPC), como segue. A fração de fluxo foi carregada em 1 ml de coluna de RPC Resource 15 (GE Healthcare), previamente equilibrada com Tampão RPC A (0,1% de TFA em água). Após a lavagem da coluna com Tampão RPC A de 10 volumes de coluna (CV), polipeptídeos ligados foram eluídos com um gradiente linear de 0 a 50% de Tampão RPC B (0,1% de TFA em acetonitrila) durante 10 CV. A taxa de fluxo foi 2 ml/minuto e a absorbância a 280 nm foi monitorada. As frações contendo variante de polipeptídeo de ligação de albumina foram identificadas por análise SDS-PAGE e aglomeradas.

As variantes de polipeptídeo de ligação de albumina purificadas por RPC foram adicionalmente purificadas por

45/74 filtração de gel em 120 ml Superdex 75 (GE Healthcare) embaladas em uma coluna XK16 (GE Healthcare). 0 tampão corrente foi IxPBS, e a taxa de fluxo 2 ml/minuto. As frações contendo variante de polipeptídeo de ligação de albumina pura foram aglomeradas e concentradas em aproximadamente 1,3 mg/ml. Finalmente, o concentrado foi purificado a partir de quantidades traço de endotoxinas remanescentes através do uso de colunas de 1 ml de gel de remoção de Endotoxina AffinityPak Detoxi-Gel (Pierce, prod#20344), de acordo com as recomendações do fabricante.

As variantes de polipeptídeo de ligação de albumina PEP07911 e PEP08185 foram conjugadas com Mal-DOTA antes da etapa de purificação de RPC, conforme segue. O tampão da fração de fluxo passante da etapa de purificação de IMAC-FT foi trocado para NaAc a 0,2 M , pH 5,5, com o uso de uma coluna de dessalinização PD-10 descartável (GE Healthcare). Maleimido-mono-amida-DOTA (Macrocíclicos, cat. n° B-272) foi adicionado em excesso molar de 5 vezes e incubado por 60 minutos a 3 0 °C sob agitação contínua. Os polipeptídeos resultantes foram denotados PEP07968 e PEP08296, respectivamente.

Purificação de variantes de polipeptídeo de ligação de albumina sem etiqueta His₆

	OS	péletes de	células congeladas que	abrigam
variantes	de	polipeptídeo	de ligação de albumina	solúveis
PEP06923	(SEQ	ID NO:154),	PEP07271 (SEQ ID NO:155),	PEP07554

(SEQ ID NO:156) e PEP07844 (SEQ ID NO:161) foram suspensos em Tris-HCl a 2 0 mN , pH 8 e rompidos por ultrassonicação. Para cada uma das variantes de polipeptídeo, a suspensão ultrassonicada foi clarificada por centrifugação (30 min, 32.000 x g, 4°C) e o sobrenadante foi carregado em uma coluna HSA-Sepharose (GE Healthcare). Após a lavagem com tampão TST (Tris-HCl a 25 mM, EDTA a 1 mM, NaCl a 200 mH, Tween 20 a

46/74

0,05%, pH 8,0), seguido por NH₄Ac a 5 mN, pH 5,5, a variante de polipeptídeo de ligação de albumina ligada foi eluída com HAc a 0,5 M, pH 3,2.

As variantes de polipeptídeo de ligação de albumina foram ainda purificadas por cromatografia de fase reversa (RPC), conforme segue. Para cada uma das variantes, o eluato da etapa de purificação de afinidade de HSA foi carregado em coluna Resource 15 RPC de 1 ml (GE Healthcare), previamente equilibrada com Tampão RPC A (TFA a 0,1% em água) . Após a lavagem de coluna com Tampão 10 CV RPC A, os polipeptídeos ligados foram eluídos com um gradiente linear de Tampão RPC B a 0 a 50% (TFA a 0,1% em acetonitrila) durante 10 CV. A taxa de fluxo foi 2 ml/min e a absorbância a 280 nm foi monitorada. As frações que continham variantes de polipeptídeo de ligação de albumina puras foram identificadas por análise de SDS-PAGE e agrupadas. Finalmente, o tampão foi trocado para IxPBS (KC1 a 2,68 mM, NaCl a 137 mM, KH₂PO₄ a 1,47 mM, Na₂HPO₄ a 8,1 mM, pH 7,4) com o uso de uma coluna de dessalinização PD-10 descartável (GE Healthcare).

Caracterização de variantes de polipeptídeo de ligação de albumina purificadas

A concentração foi avaliada por medição da /s ® absorbância a 28 0 nm com o uso de um Espectrometro NanoDrop ND-1000. As proteínas foram ainda analisadas com SDS-PAGE e LC-MS.

Para a análise de SDS-PAGE, aproximadamente 10 pg de cada variante de polipeptídeo de ligação de albumina foram misturados com Tampão de Amostra NuPAGE LDS (Invitrogen), incubados a 70°C por 15 minutos e carregados em Géis NuPAGE 4 a 12% Bis-Tris (Invitrogen). Os géis foram ativados com Tampão Contínuo NuPAGE MES SDS (Invitrogen) Em uma Célula de Eletroforese XCell II SureLock (Novex) que empregou o Padrão de Pré-manchamento Rígido (Invitrogen) como marcador de peso

47/74 molecular e que usou PhastGel BlueR (GE Healthcare) para manchamento.

Para verificar a identidade das variantes de polipeptídeo de ligação de albumina, análises de LC/MS foram realizadas com o uso do sistema Agilent 1100 LC/MSD, equipado com API-ESI e um único analisador de massa quádruplo. Aproximadamente 10 pg de cada uma das variantes de polipeptídeo de ligação de albumina purificadas foram carregados em uma coluna de Furo Estreito Zorbax 300SB-C8 (2,1 x 150 mm, 3,5 pm, Agilent Technologies) a uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min. Os polipeptídeos foram eluídos com o uso de um gradiente linear de solução B a 10 a 70% por 15 minutos a 0,5 ml/min. A separação foi realizada a 30°C. O sinal de ion e a absorbância a 280 e 220 nm foram monitorados. Os pesos moleculares das variantes de polipeptídeo de ligação de albumina purificadas foram confirmados por MS.

Resultados

Os níveis de expressão das variantes de polipeptídeo de ligação de albumina foram 10 a 30 mg de produto/g de pélete de célula, conforme estimado a partir da análise de SDS-PAGE.

Para todas as variantes, a pureza, conforme determinada por análise de SDS-PAGE, excedeu 95% e a análise de LC/MS verificou os pesos moleculares corretos. Após a purificação, entre 1 e 8 mg de polipeptídeo puro foram obtidos para cada uma das dez variantes de polipeptídeo de ligação de albumina.

Exemplo 2: Determinação de afinidade para polipeptídeos de ligação de albumina

Neste exemplo, PEP06923 (SEQ ID NO:154), PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07844 (SEQ ID NO:161), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07913 (SEQ ID NO:153), PEP07914 (SEQ ID NO:158) e PEP07968, (PEP07911 conjugado com DOTA, SEQ ID NO:159),

48/74 sintetizados ou expressos e purificados no Exemplo 1, foram caracterizados por afinidade à albumina sérica humana (HSA) com o uso de um instrumento Biacore. PEP07913 corresponde à sequência de aminoácidos de G148-GA3 com a adição de um resíduo de glicina de N-terminal, enquanto PEP07271, PEP07844, PEP07912, PEP07914 e PEP07968 correspondem aos polipeptídeos de ligação de albumina de PP001 (SEQ ID NO:1), PP043 (SEQ ID NO:43), PP007 (SEQ ID NO:7), PP013 (SEQ ID NO:13) e PP037 (SEQ ID NO:37) com diferentes adições de aminoácidos de N-terminal.

Material e métodos

A análise de biossensor em um instrumento Biacore2000 (GE Healthcare) foi realizada com HSA (Albucult®, Novozymes), imobilizada por acoplamento de amina na camada de dextrano carboxilada das superfícies de fragmentos CM-5 (grau de pesquisa; GE Healthcare) de acordo com as recomendações do fabricante. A superfície 1 do fragmento foi ativadae desativada como uma célula de referência (superfícieem branco) durante as injeções, e enquanto a superfície2 compreendeu HSA imobilizado a 731 unidades de ressonância (RU) e a superfície 4 compreendeu HSA imobilizado a 955 RU. As variantes de polipeptídeo de ligação de albumina purificadas foram diluídas em tampão contínuo HBS-EP (GE Healthcare) a 2,5 nM, 10nMe40nMe injetadas em uma taxa de fluxo constante de 50 μΐ/min por 5 minutos, seguido por injeção de HBS-EP por 60 minutos. As superfícies foram regeneradas com uma injeção de 25 μΐ de HC1, 10 mM. As medições de afinidade foram realizadas em dois conjuntos; no primeiro conjunto HBS-EP, PEP06923, PEP07271, PEP07912, PEP07913, PEP07914 e PEP07968 foram injetados (superfície 2 de fragmento) e no segundo conjunto HBS-EP, PEP06923, PEP07844, PEP07912 e PEP07914 foram injetados (superfície 4 de fragmento). PEP06923 foi injetado duas vezes em cada ciclo como um controle. Os resultados foram analisados com um software BiaEvaluation (GE Healthcare). As

49/74 curvas da superfície em branco foram subtraídas das curvas das superfícies de ligante.

Resultados

O instrumento Biacore 2000 tem uma limitação técnica, atrapalhando as medições de afinidade muito alta. Portanto, o propósito do estudo Biacore não foi determinar os parâmetros cinéticos exatos da afinidade de variantes de polipeptídeo de ligação de albumina para HSA. No entanto, os resultados fornecem uma estimativa quantitativa das afinidades relativas desses polipeptídeos para albumina. Após a subtração da superfície de referência e injeção de tampão, as curvas foram ajustadas a um modelo de ligação 1:1 (Langmuir) com o uso do software BIAevaluation com correção para a transferência de massa e com o conjunto RUmax como um parâmetro local. As curvas foram mostradas na Figura 2. Ao valores relativos K_Dz k_a (k_on) e k_d (k_off) foram estimados e são apresentados nas Tabelas abaixo.

Tabela 1:

Parâmetros cinéticos (k_a, k_d e K_D) de polipeptídeos de ligação de albumina para HSA, I^o conjunto

	k_a (Ms’¹)	k_d (s’¹)	K_D (M)
PEP07913	5,7 x 10⁵	9,3 x IO’⁴	1,6 x IO’⁹
PEP06923 (1)	2,9 x 10⁷	2,9 x 10'⁵	9,9 x IO’¹³
PEP06923 (2)	2,6 x 10⁷	2,8 x IO’⁵	1,1 x IO’¹²
PEP07271	3,9 x 10⁶	2,9 x IO’⁵	7,5 x IO’¹²
PEP07912	4,6 X 10⁶	2,8 X IO’⁵	6,2 x IO’¹²
PEP07914	3,5 x 10⁶	2,5 x IO’⁵	7,2 x 10’¹²
PEP07968	3,0 x 10⁶	2,7 x IO’⁵	9,0 x IO’¹²
Tabe:	La 2:

Parâmetros cinéticos (k_a, k_d e K_D) de polipeptídeos de ligação de albumina para HSA, 2^o conjunto

	k_a (Ms’¹)	k_d (s’¹)	K_D (M)
PEP06923 (1)	2,0 x 10⁷	2,6 X IO’⁵	1,3 x IO’¹²
PEP06923 (2)	2,1 x 10⁷	2,5 x IO’⁵	1,2 x IO’¹²
PEP07912	5,4 X 10^s	2,8 X IO’⁵	5,2 x IO’¹²
PEP07914	3,8 X 10⁵	2,6 x IO’⁵	6,9 x 10’¹²

50/74

PEP07844

5,4 x 10^s

2,3 x 10‘⁵

4,4 x IO'¹²

Conforme mostrado nas Tabelas 1 e 2, PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07844 (SEQ ID NO:161), PEP07912 (SEQ ID

NO:157), PEP07914 (SEQ ID NO:158) e PEP07968 (PEP07911 conjugado com DOTA, SEQ ID NO:159) todos parecem ter aproximadamente a mesma afinidade para HSA, excedendo amplamente a afinidade do progenitor G148-GA3 (PEP07913; SEQ ID NO :153). A afinidade a HSA desses polipeptídeos é ligeiramente mais baixa em comparação ao PEP06923 (SEQ ID NO:154), a despeito da dissociação similar.

Exemplo 3: Determinação da temperatura de fusão (Tm) para polipeptídeos de ligação de albumina

Neste exemplo, as variantes de polipeptídeo de ligação de albumina PEP07913 (SEQ ID NO:153), PEP06923 (SEQ ID NO:154), PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07554 (SEQ ID NO:156), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07914 (SEQ ID NO:158), PEP07968 (PEP07911 conjugado com DOTA, SEQ ID NO:159), PEP07844 (SEQ ID NO:161) e PEP07986 (SEQ ID NO:163), expressas e purificadas conforme descrito no Exemplo 1, e a variante de polipeptídeo albumina PEP07975 (PEP07834 conjugado com DOTA, SEQ ID

NO:160), produzida conforme descrito no Exemplo 5, foram analisadas por análise de CD. PEP07913 corresponde à sequência de G148-GA3 que tem um resíduo de glicina de N-terminal, PEP06923 é um derivado de afinidade alta projetado descrito por Jonsson et al, supra, enquanto PEP07271, PEP07554,

PEP07912, PEP07914, PEP07968, PEP07844 e PEP07975 são Exemplos dos polipeptídeos de ligação de albumina de PP001 (SEQ ID NO:1), PP007 (SEQ ID NO:7), PP013 (SEQ ID NO:13), PP037 (SEQ ID NO:37) e PP043 (SEQ ID NO:43) que têm diferentes adições de aminoácidos de N-terminal amino de acordo com a presente revelação.

Material e métodos

51/74

As variantes de polipeptídeo de ligação de albumina purificadas foram diluídas em IxPBS, até as concentrações finais entre 0,4 e 0,5 mg/ml. A análise de dicroísmo circular (CD) foi realizada em um espectropolarímetro Jasco J-810 em 5 uma célula com um comprimento de trajeto óptico de 1 mm. Nas medições de temperatura variável, a absorbância foi medida a 221 nm de 20°C a 90°C, com um declive de temperatura de 5°C/min.

Resultados

As temperaturas de fusão (Tm) das diferentes variantes de polipeptídeo de ligação de albumina foram calculadas para determinar o ponto médio da transição no CD vs. plotagem de temperatura. Os resultados são sumarizados na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3. Valores de Tm determinados de variantes de polipeptídeo de ligação de albumina testadas

Variante	SEQ ID NO	n°	Sequência³ de N-terminal	Tm (°C)
PEP07913	SEQ NO:153	ID	GL	61
PEP06923	SEQ NO:154	ID	GSSL	57
PEP07271	SEQ NO:155	ID	GSSL	65
PEP07554	SEQ NO:156	ID	GSSL	58
PEP07912	SEQ NO:157	ID	GL	53
PEP07914	SEQ NO:158	ID	GL	59
PEP07968	SEQ NO:159¹	ID	GL	53
PEP07975	SEQ ΝΟ^όΟ¹' ²	ID	AL	50
PEP07844	SEQ NO:161	ID	GSSL	65
PEP07986	SEQ NO:163	ID	GSL	61

⁷⁷ Õ peptídeo é con j ugado com maleimida-DOTA na cisteína

52/74 ²⁾ 0 peptideo é amidado no C-terminal ³⁾ Leucina (sublinhada) é o resíduo na posição 1 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo de ligação de albumina conforme definido no primeiro aspecto da presente revelação

O polipeptídeo PEP07968 é idêntico a PEP07912, exceto pelo primeiro ter um resíduo de cisteína na posição 14 conjugado com maleimida DOTA e o último um resíduo de serina. Assim, a modificação de DOTA não deve afetar a temperatura de fusão. Além disso, PEP07975 é conjugado com DOTA com o uso de Ci4 e é idêntico a PEP07968 exceto pela amida de C-terminal (resultante da síntese de peptídeo no Exemplo 5) e por ter uma alanina de N-terminal ao invés de uma glicina. Além disso, comparar PEP07912 e PEP07554 revela que uma serina de Nterminal gera uma temperatura de fusão mais alta que uma glicina na mesma posição (diferença de 5°C em Tm) . Assim, todas as variantes de polipeptídeo de ligação de albumina de acordo com a presente revelação mostram Tm acima de 55°C, exceto por PEP07912 e variantes conjugadas com DOTA. Levandose em consideração a importância da porção de N-terminal, todos os polipeptídeos de ligação de albumina testados são superiores ao derivado da técnica anterior de Jonsson et al, isto é, PEP06923.

Exemplo 4:

Análise de resposta sérica

A porcentagem de IgG que contém soro humano, que pode se ligar a um conjunto de polipeptídeos de ligação de albumina conforme revelados na presente invenção foi analisada por ELISA. No total, 149 amostras de soro que correspondem a 127 indivíduos foram tríadas.

Material e métodos

Placas ELISA (placas de meia área, 96 poços (Costar, cat. n° 3690)) foram revestidas com 50 μΐ/poço de Albucult®

53/74 (Novozymes) diluídos a 8 pg/ml em tampão de revestimento(Sigma, cat. n° 3041). As placas foram revestidas de um dia para o outro por três dias a 4°C. No dia de análise, as placas foram lavadas duas vezes com água de torneira e bloqueadas por 2 horas com 100 μΐ de solução salina tamponada por fosfato (PBS) contendo caseína a 0,05% (PBSC). As placas foram esvaziadas e 50 μΐ/poço dos polipeptídeos de ligação de albumina PEP07913 (SEQ ID NO:153), PEP06923 (SEQ ID NO:154), PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07554 (SEQ ID NO:156), PEP07914 (SEQ ID NO:158), PEP07968 (PEP07911 conjugado com DOTA, SEQ ID NO:159) e PEP07844 (SEQ ID NO:161), diluídos a 2 pg/ml em PBSC, foram adicionados de acordo com um desenho de placa pré-produzido. Após a incubação por duas horas à temperatura ambiente (TA), as placas foram lavadas em PBSC quatro vezes com o uso de um lavador ELISA automático. As 149 amostras de soro de 129 indivíduos foram diluídas 50 vezes em PBSC por adição de 24 μΐ de soro a 1174 μΐ de PBSC. 50 μΐ do soro diluído foram adicionados por poço de acordo com o desenho de placa pré-produzido. Cada amostra de soro foi testada como um singleto. Controles positivos e negativos foram incluídos em cada placa e para cada polipeptídeo de ligação de albumina. Anticorpos de ligação de albumina (50 μΐ, 0,5 μΐ/ml de solução de imunoglobulina preparados internamente a partir de soro de primatas imunizados com PEP06923) foram adicionados como um controle positivo as e 50 μΐ de PBSC foram usados como um controle negativo. A placas foram incubadas por uma hora à TA e subsequentemente lavadas quatro vezes em PBSC com o uso de um lavador ELISA automático. A IgG ligada foi detectada com 50 μΐ/poço de IgG anti-humana (Southern Biotech, cat n° 2040-05) diluídos 10.000 vezes em PBSC. Após a lavagem quatro vezes em PBSC com o uso de um lavador ELISA automático, 50 μΐ/poço de substrato foram adicionados (Pierce cat. n° 34021) . A reação foi interrompida após 10 a 15 minutos pela

54/74 adição de 50 μΐ de H₂SO₄ a cada poço, antes de medir a absorbância com o uso de um leitor de placa de múltiplos poços (Victor3, Perkin Elmer).

Resultados

Dos 149 soros triados por ligação de IgG aos polipeptídeos de ligação de albumina, 23 foram negativos para todos os oito polipeptídeos (valor OD < 0,1), isto é, não mostraram IgG ligada aos polipeptídeos. A análise foi realizada com os 126 soros que foram positivos para um ou mais polipeptídeos de ligação de albumina. A absorbância média foi calculada (Figura 3A) e a porcentagem de soros com valore OD ou < 0,15 (Figura 3B) ou > 1,0 (Figura 3C) . O valor OD médio mais alto e a porcentagem mais alta de soro com ligação de IgG foram obtidos com PEP07913 (SEQ ID NO:153), PEP06923 (SEQ ID N0:154) e PEP07844 (SEQ ID NO:161), enquanto a menor reatividade foi encontrada contra PEP07968 (PEP07911 conjugado com DOTA, SEQ ID NO:159), PEP07914 (SEQ ID NO:158) e PEP07954 (SEQ ID NO:156).

Assim, os polipeptídeos de ligação de albumina mais reativos foram o G14 8-GA3 parental (PEP07 913, SEQ ID NO:153) e o derivado de afinidade previamente aprimorada (PEP06923, SEQ ID NO:154), que tem hélice 1 retida de G148-GA3. 0 terceiro dos polipeptídeos mais reativos (PEP07844, SEQ ID NO:161) contém a lisina original na posição 14 na hélice 1. O resíduo é destinado à conjugação e não será, portanto, exposto no contexto. A variante de polipeptídeo de ligação de albumina idêntica, exceto por ter uma alanina na posição 14 (PEP07554, SEQ ID NO:156), é uma das menos reativa.

Exemplo 5:

Síntese química de um polipeptídeo de ligação de albumina conjugado com DOTA Material e métodos

O polipeptídeo de ligação de albumina PEP07834 (SEQ

55/74

ID NO:160) foi sintetizado por síntese de peptídeo de fase sólida (SPPS, conforme descrito por Quibell, M. & Johnson, T., em Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis-A Practical Approach, W.C. Chan, P.D. White Eds, Oxford University Press 2000, 115 a 135) em um reator Sintetizador de Peptídeo 433 A (Applied Biosystems, Foster City, CA) em uma escala de 0,1 mmol, isto é, com um rendimento teórico possível de 0,1 mmol de peptídeo, com o uso de química Fmoc padrão. Uma resina de amida Fmoc de ácido fraco foi usada como suporte sólido por toda a síntese (Rink Amide MBHA Resin LL (100 a 200 mesh) , carregando 0,39 mmol de amida/g de resina (Novabiochem)).

De acordo com a sequência abaixo, 47 resíduos de aminoácido foram acoplados à resina de amida pelas reações de acilação no reator por 10 minutos à temperatura ambiente (TA) e mistura. As reações de acilação foram realizadas com um excesso molecular de 10 vezes de aminoácidos protegidos Fmoc em NMP (N-metilpirrolidona, Merck), ativado com 1 eq de hexafluorofosfato de 2-(IH-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3tetrametilamínio (HBTU, IRIS Biotech), 1 eq de 1hidroxibenzotriazol (HOBt, IRIS Biotech) e 2 eq de diisopropiletilamina (DIEA, Applied Biosystems). Adicionalmente, todas as cadeias laterais de aminoácido reativas foram protegidas com grupos protetores de cadeia lateral padrão (terc-butila (tBu) para Asp, Glu, Ser, Tr e Tir, terc-butiloxicarbonila (Boc) para Lis, 2,2,4,6,7pentametildiidrobenzofurano-5-sulfonila (Pbf) para Arg, e tritila (Trt) para Asn e Cis) antes da ativação e acoplamento. A fim de diminuir a quantidade de acoplamentos incompletos que levam a peptídeos truncados, uma quantidade menor de resíduos de aminoácido selecionado foram submetidos ao acoplamento por acilação duas vezes, sem desproteção de Fmoc conforme descrito abaixo entre o primeiro e o segundo acoplamentos. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de ligação de albumina

56/74 sintetizado PEP07834 foi

ALASAKEAAN AELDCYGVSD FYKRLIDKAK TVEGVEALKD AILAALPNH₂ (SEQ ID NO: I6O-NH2) .

Os resíduos de aminoácido sublinhados foram duplamente acoplados. Quaisquer grupos amino não reagidos remanescentes nos peptídeos ligados a resina foram cobertos com anidrido acético (anidrido acético a 0,5 M (AlfaAesar), DIEA a 0,125 M, HOBt a 0,015 M em NMP) por 5 minutos. Após cada acoplamento, a desproteção do grupo Fmoc de N-terminal nos peptídeo ligados a resina foi realizada por tratamento com piperidina a 20% (Sigma-Aldrich) em NMP por 10 minutos.

Após a síntese concluída, os peptídeos foram clivados do suporte sólido e simultaneamente os grupos de proteção de cadeia lateral foram clivados pelo tratamento com TFA/EDT/H2O/TIS (94:2.5:2.5:1) (TFA: ácido trifluoroacético (Apollo), EDT: 1,2-etanoditiol (Aldrich), TIS: triisopropilsilano (Aldrich)) a TA por 2 horas com mistura ocasional. Após o tratamento de TFA, os peptídeos foram extraídos três vezes com o uso de acetonitrila a 20% (Merck) em água e terc-butil metil éter (Merck). As fases aquosas foram combinadas, filtradas e liofilizadas.

Os peptídeos brutos foram analisados e purificados por RP-HPLC semipreparativa (Reprosil GOLD Cl8 300, 250*10 mm, tamanho de partícula de 5 pm) e um gradiente de 32 a 55% B (A: TFA-H2O a 0,1%; B: TFA-CH3CN a 0.1%) durante 25 minutos a uma taxa de fluxo de 2,5 ml min'¹, seguido por liofilização.

O rendimento sintético foi determinado por cálculo das áreas integradas sob os picos do sinal de 220 nm a partir de análise bruta em RP-HPLC. O peso molecular correto foi verificado com o uso de espectrometria de massa por ionização de eletroaspersão de cromatografia líquida (LC-ESI-MS) em um LC/MS 6520 Accurate Mass Q-TOF (Agilent Technologies). A

57/74 pureza do produto foi verificada com o uso de RP-HPLC (Reprosil GOLD C18 300, 250*4,6 mm, tamanho de partícula de 3 pm) com o uso de um gradiente de 35 a 55% B por 25 minutos a uma taxa de fluxo de 1,0 ml min'¹.

Conjugação com DOTA mg de PEP07834-amida (SEQ ID NO:160-amide) foram reduzidos com DTT a 20 mM a 40°C por 30 minutos. O DTT em excesso foi removido por troca de tampão em uma coluna PD-10 (GE Healthcare) para acetato de amônio a 0,2 M, pH 5,5. O acoplamento foi realizado com um excesso molar de 5 vezes de quelador, maleimida-mono-amida-DOTA (Macrocíclicos, Cat. n° B-

72) solução em água (1 mg/ml) . A mistura foi incubada por 1 hora a 30°C sob agitação contínua. A purificação de quelatores não conjugados foi feita em uma coluna RPC semipreparativa (Zorbax 300SB C18, 9,4x250 mm, 5 μτη) .0 grau de acoplamento do material purificado foi analisado por HPLC-MS em um Zorbax

00SB C8 150 x 2,1 mm, 3,5 pm de coluna analítica. Apenas PEP07834 conjugado com maleimida-DOTA, denotado PEP07975, foi detectado pelo método.

Resultados

Com base no perfil de eluição do material bruto, o rendimento sintético do polipeptídeo de ligação de albumina PEP07834-amida (SEQ ID NO:160-amida) foi determinado como sendo 8%. 0 peso molecular encontrado foi 4.952,9 Da, que está em bom acordo com o peso molecular teórico calculados para 4.952,6 Da. Quando se analisa o produto purificado, aproximadamente 10 a 15% da proteína foram revelados como sendo um homodímero ligado a bissulfeto (Figura 4 e 5) . A atividade de ligação do peptídeo conjugado com DOTA (PEP07975) foi confirmada conforme descrito no Exemplo 2 (dados não mostrados) e a temperatura de fusão determinada conforme descrito no Exemplo 3.

Exemplo 6:

58/74

Testagem de imunogeneticidade de polipeptídeos de ligação de albumina

PEP07913 (SEQ ID NO:153), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07914 (SEQ ID NO:158), e PEP07968 (PEP07911 conjugado do DOTA, SEQ ID NO: 159) foram triados por sua capacidade de induzir a proliferação de células T em células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) de 52 indivíduos humanos caucasianos (obtidos junto à CRI-Labo Medische Analyse, Gent, Bélgica). PEP07913 corresponde à sequência de G148-GA3 que tem um resíduo de glicina de N-terminal, enquanto PEP07912, PEP07914 e PEP07968 são Exemplos dos polipeptídeos de ligação de albumina de PP007 (SEQ ID NO:7), PP013 (SEQ ID NO:13) e PP037 (SEQ ID NO:37) que têm diferentes adições de aminoácidos de N-terminal amino de acordo com a presente revelação.

Materiais e métodos

PBMCs, preparados de acordo com os métodos biológicos celulares padrão, foram adicionados a uma placa de fundo redondo de 96 poços (Falcon) tratada com cultura de tecido (TC) em uma quantidade de 300.000 PBMCs/ poço. As células foram estimuladas por adição de 100 μΐ/poço de polipeptídeos de ligação de albumina PEP07913, PEP07912, PEP07914 e PEP07968 em meio AIMV (Invitrogen) contendo adicionalmente 900 pg/ml (excesso molar de 3 vezes) de albumina humana recombinante (Albucult®, Novozymes). Isso correspondeu a uma concentração final de polipeptídeo de ligação de albumina de 30 pg/ml. A estimulação foi feita em oito vezes, isto é, o mesmo polipeptídeo de ligação de albumina foi adicionado a oito poços em quantidades idênticas e sob as mesmas condições. Nos poços de controle positivo, as células foram estimuladas ou com 30 pg/ml de Hemocianina de Lapa Californiana (KLH, Calbiochem) ou 30 pg/ml toxoide de tétano (TT, Statens Serum Institut). Nos poços de controle negativo, apenas meio AIMV com ou sem 900 pg/ml de albumina

59/74 foi adicionado.

A proliferação celular foi avaliada após sete dias de cultura com o uso do kit de ensaio de citometria de fluxo Alexa Fluor 488 Click-iT EdU (Invitrogen). 1 μΜ/poço de marcador de incorporação de EdU foi adicionado no dia seis. No dia sete, as células foram lavadas, dissociadas da placa, lavadas novamente e manchadas por 30 minutos com o reagente anti-CD3-PerCP (Becton Dickinson) e o reagente anti-CD4Alexa647 (Becton Dickinson). Após o manchamento, as células foram lavadas, fixadas (BD cellfix, BD biosciences), permeabilizadas (com o uso de saponina) e manchadas para EdU por adição do reagente Click-iT de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen). Após o manchamento concluído, as células foram lavadas novamente e analisadas com o uso de citometria de fluxo (FACSCantoII, BD Biosciences). Para avaliar o número de células em proliferação, um número fixo de fluosferas (Invitrogen) foi adicionado a cada poço antes da análise. Todos os procedimentos de manchamento e lavagens foram realizados diretamente na placa de 96 poços.

Os dados FACSCantoII brutos foram sincronizados hierarquicamente em células T CD3⁺ CD4⁺ e o número de células sincronizadas assim como sua intensidade de fluorescência de marcador de incorporação EdU-Alexa Flour 488 foram registrados. Os valores médios do número de células em proliferação/octuplicado de poços tratados com proteína forma comparados aos controles positivos e negativos e as razões resultantes, descritas como índices de estimulação (SI), foram calculadas. Com base no SI e a variação entre as réplicas, os valores de SI limite foram definidos em 2,0 e 0,5 para estimulação e inibição, respectivamente.

Resultados

Os polipeptídeos de ligação de albumina PEP07913, PEP07912, PEP07914 e PEP07968 foram avaliados por seu

60/74 potencial imunogênico na presença de excesso de 3 vezes de albumina humana recombinante em uma população humana alvo com o uso de um ensaio de proliferação de PBMC in vitro. Com comparação com o controle de albumina, PEP07913 induziu a proliferação de células CD3⁺CD4⁺ em 6 de 52 doadores, PEP07 912 em 5 de 52 doadores e PEP07914 e PEP07968 em 1 de 52 doadores (Figura 6A).

O índice de estimulação médio (SI) para todos os 52 doadores não foi significativamente diferente para PEP07914 e PEP07968 em comparação com o controle negativo que continha albumina humana recombinante (p = 0,79 e 0,48 respectivamente, Figura 6B). 0 SI para PEP07913 foi significantemente mais alto (p = 0,002) enquanto o SI para PEP07912 foi mais alto, mas não significante (p=0,03, Figura 6B).

Conforme comparado ao tampão apenas, o número de indivíduos que responderam foi 10 para PEP07912, 7 para

PEP07912, 2 para PEP07914, 1 para PEP07968, 2 para albumina humana recombinante, e 49 e 51 para os dois controles positivos TT e KLH, respectivamente (Figura 6C) . Os polipeptídeos de ligação de albumina foram classificados de acordo com sua imunogenicidade na seguinte ordem: PEP07913 > PEP07912 > PEP07914 > PEP07968. Both PEP07914 e PEP07968 foram definidos como não imunogênicos. Os resultados acima assim demonstram que o potencial imunogênico dos polipeptídeos de ligação de albumina da presente revelação é baixo, em comparação com os controles positivos.

Exemplo 7: Afinidade dos polipeptídeos de ligação de albumina à albumina de diferentes espécies

Neste exemplo, PEP06923 (SEQ ID NO:154), PEP07986 (SEQ ID NO:163) e PEP08296, (PEP08185 conjugado com DOTA, SEQ ID NO:148), expressos e purificados conforme descrito no Exemplo 1, foram caracterizados por afinidade à albumina de

61/74 humanos (HSA), macaco cynomolgus (CSA), rato (RSA), camundongo (MSA) e cachorro (DSA) com o uso de um instrumento Biacore.

Material e métodos

A análise de biossensor em um instrumento Biacore2000 (GE Healthcare) foi realizada com HSA (Albucult®, Novozymes), CSA (purificado internamente de soro de cynomolgus), RSA (Sigma-Aldrich, Cat. n° A6272), MSA (SigmaAldrich, Cat. n° A3559) e DSA (MP Biomedicals, Cat. n° 55925), imobilizada por acoplamento de amina na camada de dextrano carboxilada das superfícies de fragmentos CM-5 (grau de pesquisa; GE Healthcare) de acordo com as recomendações do fabricante.

No fragmento 1, a superfície 1 foi ativada e desativada e usada como uma célula de referência (superfície em branco) durante as injeções, enquanto a superfície 2 compreendeu HSA imobilizado a 1.130 unidades de ressonância (RU), a superfície 3 compreender CSA imobilizado a 1.046 RU, a superfície 4 compreendeu RSA imobilizado a 831 RU. No fragmento 2, a superfície 1 foi usada como superfície em branco, enquanto a superfície 3 compreendeu MSA imobilizado a 858 RU. No fragmento 3, a superfície 1 foi usada como superfície em branco, enquanto a superfície 2 compreendeu DSA imobilizado a 1.053 RU.

Para a análise de afinidade para HSA, CSA, e RSA (fragmento 1) , as variantes de polipeptídeo de ligação de albumina purificadas foram diluídas em tampão contínuo HBS-EP (GE Healthcare) a 40 nM, 10 nM e 2,5 nM; para análise de afinidade para MSA (fragmento 2) as variantes de polipeptídeo de ligação de albumina foram diluídas a 1.280 nM, 640 nM, 160 nM e 40 nM e para análise de afinidade para DSA (fragmento 3) as variantes de polipeptídeo de ligação de albumina foram diluídas a 1.280 nM, 640 nM, 160 nM, 40 nM e 10 nM. Os polipeptídeos de ligação de albumina foram injetados em uma

62/74 taxa de fluxo constante de 50 μΐ/min por 5 minutos, seguido por injeção de HBS-EP por 60 minutos. As superfícies foram regeneradas com uma injeção de 25 μΐ de HC1, 10 mM. Todas as amostras foram executadas em duplicatas.

Os resultados foram analisados com um software BiaEvaluation (GE Healthcare). As curvas da superfície branca foram subtraídas das curvas das superfícies de ligante.

Resultados instrumento Biacore 2000 tem uma limitação técnica, atrapalhando as medições de afinidade muito alta. Portanto, o propósito do estudo Biacore não foi determinar os parâmetros cinéticos exatos da afinidade de variantes de polipeptídeo de ligação de albumina para HSA, CSA, RSA, MSA e DSA respectivamente. No entanto, os resultados fornecem uma estimativa quantitativa das afinidades relativas desses polipeptídeos fechados para albumina de diferentes espécies. Após a subtração da superfície de referência e injeção de tampão, as curvas foram ajustadas a um modelo de ligação 1:1 (Langmuir) com o uso do software BIAevaluation com correção para a transferência de massa e com o conjunto RUmax como um parâmetro local. As curvas de ligação representativas são mostradas na Figura 7.

PEP07986 e PEP08296 (PEP08185 conjugado com DOTA) se ligam com alta afinidade (K_D na faixa de abaixo picomolar a abaixo nanomolar) à albumina sérica humana assim como à albumina das espécies de modelo pré-clínico frequentes rato, macaco cynomolgus, camundongo e cachorro. As afinidades relativas para as diferentes espécies podem ser classificadas como RSA > HSA/CSA > MSA/DSA, isto é, os valores de K_Dclassificados como K_d.r_Sa K_d-_Hsa/K_d-csa < K_d__MSa/K_d-_DSa· As afinidades em termos de valores de K_D são as mesmas ou ligeiramente mais baixas (mas na mesma ordem de magnitude) como a afinidade obtida para PEP06923 (polipeptídeo não

63/74 inventivo).

Exemplo 8: Atividade in vitro de variantes de proteína Z fundidas a um polipeptídeo de ligação de albumina

Neste exemplo, as variantes de proteína Z citocinaespecífica que compreende polipeptídeos (derivadas do domínio B de proteína A estafilocócica) geneticamente fundidas à variante de polipeptídeo de ligação de albumina PP013 (SEQ ID NO:13) foram testadas por sua funcionalidade, esta sendo bloquear a proliferação induzida por citocina de células TF-1 na presença de albumina sérica humana. A proliferação de células TF-1 é dependente da presença de qualquer um de diversos tipos diferentes de citocinas e a resposta proliferativa pode ser inibida por reagentes de bloqueamento tais como a variante de proteína Z citocina-específica correspondente. PP013 fundido a uma variante de proteína Z com especificidade para uma proteína irrelevante foi usado como controle negativo.

Materiais e métodos

Clonagem de Z - proteínas de fusão de PP013

Os fragmentos de gene de variantes de proteína Z com especificidade para citocina X ou Y respectivamente, ou para uma proteína irrelevante (controle negativo), foram amplificados por PCR com o uso de iniciadores que adicionam sítios de endonuclease específicos PstI e AccT. Os fragmentos foram clivados com PstI e Accl, purificados e ligados em um vetor de expressão, o plasmídeo pAY02747, restrito com as mesmas enzimas. pAY02747 contém uma origem de replicação de pBR322, um gene de resistência à canamicina e um promotor T7 para a expressão do gene de interesse. O sítio de clonagem é precedido por uma sequência que codifica os aminoácidos MGSSLQ e sucedido por uma sequência que codifica VDSS-PP013, em que PP013 é o polipeptídeo de ligação de albumina revelado com a

64/74

SEQ ID NO :13. A ligação, transformação e verificação de sequência foram realizadas conforme descrito acima. As proteínas codificadas foram:

1) MGSSLQ-Z_x-VDSS-PP013 (denotada Z_x-PP013)

2) MGSSLQ-ZY-VDSS-PP013 (denotada ZY-PP013)

3) MGSSLQ-Zneg-VDSS-PP013 (denotada Zneg-PP013) Expressão de proteína

Z_x-PP013, Zy-PP013 e Zneg-PP013 foram expressas em células BL21 (DE3) de E. coli. As colônias das transformações de cada variante de fusão foram usadas para inocular as culturas de partida de 5 0 ml de meio TSB+YE suplementado com canamicina até uma concentração de 50 pg/ml. As culturas foram cultivadas a 37°C de um dia para o outro com agitação, 100 rpm. As culturas de partida foram então usadas para inocular de 900 ml de meio TSB+YE suplementado com canamicina até uma concentração de 50 pg/ml. As culturas foram cultivadas por aproximadamente 1,5 h a um OD600 de >1.1, mediante o qual IPTG foi adicionado até uma concentração final de 0,2 mM. 0 cultivo continuou por cinco horas. Os péletes de célula foram colhidos por centrifugação (15.600 g, 4°C, 20 minutos) e armazenados a -20°C até a purificação.

Purificação de proteína

Os péletes de célula congelados que abrigam variantes de proteína de fusão solúveis Z_x-PP013, Z_Y-PP013 e Z_neg-PP013 fora ressuspensos em Tris-HCl a 50 mM, NaCl a 150 mM, pH 8 e 1000 U Benzonase* (Merck Cat. n° 1.01654.0001) foi adicionado. As células foram rompidas por ultrassonicação e paca cada uma das variantes de proteína de fusão, a suspensão ultrassonicada foi clarificada por centrifugação (15 min, 37.000 g, 4°C). 20x tampão TST (20x [Tris-HCl a 25 mM, EDTA a 1 mM, NaCl a 200 mM, Tween 20 a 0,05%, pH 8,0]) foi adicionado a um volume resultante em 1 x tampão TST na suspensão clarificada. Cada amostra de variante de proteína de fusão foi

65/74 carregada em uma coluna HSA-Sepharose (GE Healthcare) . Após a lavagem com tampão TST, seguida por NH₄Ac a 5 mM, pH 5,5, a variante de proteína de fusão ligada foi eluída com HAc a 0,5 M, pH 2,5.

As variantes de proteína de fusão foram ainda purificadas por cromatografia de fase reversa (RPC), conforme segue. Para cada uma das variantes, o eluato da etapa de purificação de afinidade de HSA foi carregado em coluna Resource 15 RPC de 1 ml (GE Healthcare) , previamente equilibrada com Tampão RPC A (TFA a 0,1% em água) . Após a lavagem de coluna com 10 CV de Tampão RPC A e 5 CV de Tampão RPC B (TFA a 0,1% em acetonitrila), as proteínas de fusão ligadas foram eluídas com um gradiente linear de 10 a 50% de Tampão RPC B por 20 CV. A taxa de fluxo foi 2 ml/min e a absorbância a 280 nm foi monitorada. As frações que continham variantes de proteína de fusão puras foram identificadas por análise de SDS-PAGE e agrupadas. Finalmente, o tampão foi trocado para IxPBS (KC1 a 2,68 mM, NaCl a 137 mM, KH₂PO4 a 1,47 mM, Na₂HPO4 a 8,1 mM, pH 7,4) com o uso de uma coluna de dessalinização PD-10 descartável (GE Healthcare). Para verificar a identidade das variantes de proteína de fusão, análises de SDS-PAGE e LC/MS foram realizadas conforme descrito no Exemplo 1.

Ensaio celular in vitro de Z - proteínas de fusão de PP013

A linhagem celular TF-1 (CLS Cat. n° 300434) foi propagada conforme recomendado pelo fornecedor em meio RPMI 1640 + soro de bezerro fetal a 10% (Gibco) com a adição de 2 ng/ml de rhGM-CSF (Miltenyi) . No dia do experimento, as células foram lavadas em meio RPMI 1640 + soro de bezerro fetal a 10% para remover GM-CSF.

A capacidade de Z_x-PP013 e Zy-PP013 de bloquear a proliferação induzida por citocina foi analisada por mistura

66/74 das moléculas Z_x-PP013, Z_Y-PP013 e Z_neg-PP013 com citocinas X e Y respectivamente e com um excesso molar de cinco vezes de HSA (Albucult®, Novozymes). As moléculas foram tituladas em uma série de diluições de duas vezes com uma concentração fixa de citocina (4,9 pM) e um excesso molar de cinco vezes de HSA. A titulação foi realizada em placas de 96 poços em um volume de 100 μΐ. 25.000 células foram adicionadas por poço (100 μΐ) e as placas foram incubadas a 37°C, CO₂ a 5% por três dias. Para medir a proliferação, 19 μΐ de reagente de proliferação de célula CCK-8 (Sigma) diluídos duas vezes em meio RPMI 1640 + soro de bezerro fetal a 10%, foram adicionados por poço. A reação de cor foi monitorada após 4 horas com o uso do leitor de placa de 96 poços (Victor3; PerkinElmer).

Resultados

Conforme mostrado na Figura 8, tanto a Z_x-PP013 quanto a Z_Y-PP013 inibiram a respectiva proliferação induzida por citocina na presença de HSA enquanto Z_neg-PP013, o controle negativo, não afetou a proliferação de TF-1. Assim, o experimento mostra que a função das moléculas Z foi mantida quando incorporadas em uma proteína de fusão que contém o polipeptídeo de ligação de albumina e também quando as proteínas de fusão foram ligadas à albumina.

Exemplo 9

Estabilidade a longo prazo de um polipeptídeo de ligação de albumina

Neste exemplo, a estabilidade de PEP07986 (SEQ ID NO: 163), expresso e purificado conforme descrito no Exemplo 1, foi investigada após o armazenamento a 4, 25, e 40°C por até três meses. 0 estado do polipeptídeo após o armazenamento foi investigado medindo-se sua ligação a HSA com o uso de um instrumento Biacore.

Material e métodos

PEP07986 liofilizado foi dissolvido no tampão de

67/74

NaPi esterilizado (fosfato de sódio a 20 mM, cloreto de sódio a 150 mM, pH 7,2) a uma concentração de 2 mg/ml. Uma amostra de referência (tempo=0) foi removida e armazenada a -80°C. As partes alíquotas de 105 μΐ foram armazenadas em tubos eppendorf de tampa 330 roscada esterilizados vedados com parafilme a 4, 25 e 40°C. Após uma semana, duas semanas, um mês e três meses, uma amostra armazenada em cada temperatura foi resfriada a 4°C, centrifugada por 5 minutos a 13.000 rpm e, então, armazenada a -80°C aguardando a análise de Biossensor.

A análise de Biossensor foi realizada essencialmente conforme descrito no Exemplo 2, mas com HSA (Albucult®, Novozymes), imobilizada a 704 unidades de ressonância (RU) e o variante de polipeptídeo de ligação de albumina foi diluído a 10 nM e injetado a uma taxa de fluxo constante de 20 μΐ/minuto por 10 minutos, seguido pela injeção de HBS-EP por 10 minutos.

Resultados

A ligação à HSA de PEP07986 (SEQ ID NO: 163) foi retida após o armazenamento a 4, 25, e 40°C por pelo menos três meses. As respostas de ligação máximas para HSA obtidas para ο PEP07986 armazenado nas várias condições são mostradas na Figura 9.

Exemplo 10:

Estabilidade de um polipeptídeo de ligação de albumina sob condições extremas

Neste exemplo, a análise de biossensor e dicroísmo circular (CD) do polipeptídeo de ligação de albumina PEP08296 (PEP08185 conjugado por DOTA, SEQ ID NO:148) após o tratamento de calor (90°C) em tampão de pH baixo (~4,0) é descrita. Já que tais condições de reação extremas têm que ser usadas, por exemplo, para etiquetagem de ⁶⁸Ga das proteínas modificadas por DOTA, a influência do tratamento de pH baixo e calor alto na identidade estrutural do polipeptídeo e sua capacidade de

68/74 ligar a HSA foi investigada medindo-se a temperatura de fusão (Tm), propriedades de redobragem e ligação à HSA.

Material e métodos

Análise de biossensor da estabilidade de calor

A análise de biossensor em um instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare) foi realizada com HSA (Albucult , Novozymes) imobilizada pelo acoplamento de amina na camada de dextrano carboxilado da superfície do fragmento CM-5 (grau de pesquisa; GE Healthcare) de acordo com as recomendações do fabricante. A superfície 1 do fragmento foi ativada e desativada e usada como uma célula de referência (superfície em branco) durante injeções, enquanto que a superfície 2 compreendia HSA imobilizada a 724 unidades de ressonância (RU) . Ο PEP08296 (50 μΐ, 100 μg) em um tubo de 15 ml Falcon foi diluído com 450 μΐ de acetato de sódio a 0,2 M (NaAc) pH 5,5 a uma concentração de peptídeo final de 0,2 mg/ml. Após a adição de 1,5 ml de HC1 a 0,05 M (assemelhando-se às condições e volume usados para eluir um gerador de ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga) a amostra foi incubada por 10 minutos a 90°C ou RT (controle) e então transferida para RT. 6 ml de citrato de sódio a 0,1 M foi adicionado para neutralizar o pH. 0 PEP08296 tratado com calor (0,8 e 4 nM) foi injetado a uma taxa de fluxo constante de 50 μΐ/minuto por 5 minutos, seguido pela dissociação em HBS-EP por 15 minutos. As superfícies foram regeneradas com uma injeção de 25 μΐ de HC1 a 10 mM. Os resultados foram analisados com o software BIAevaluation (GE Healthcare). As curvas da superfície em branco foram subtraídas das curvas das superfícies ligantes.

Determinação da temperatura de fusão (Tm)

Ο PEP08296 foi dissolvido em PBS a uma concentração final de 0,5 mg/ml. PBS com um pH de aproximadamente 4,0 foi preparado adicionando-se 9,5 μΐ de HC1 a 100 mM a 100 μΐ de PBS. A análise de dicroísmo circular (CD) foi realizada

69/74 conforme descrita no Exemplo 3.

Análise CD da estabilidade de calor

Para investigar a reversibilidade estrutural do PEP08296 após o tratamento de calor, dois espectros CD entre 195 e 250 foram gravados por amostra a 20°C. Após o primeiro espectro, um ciclo VTM com aquecimento a 90°C foi executado conforme descrito acima seguido pela coleta do segundo espectro CD entre 195 e 250 nm a 20°C. Adicionalmente, o PEP08296 foi incubado em tampão de PBS pH 4,0 ou tampão de PBS pH 7,2 por 12 minutos a 90°C em um termomisturador (500 rpm, intervalo de mistura 10 s ligado, 30 s desligado) . Após a incubação, as amostras foram resfriadas em gelo seguido pela centrifugação a 13.000 rpm por 1 minuto e um espectro CD entre 195 e 250 nm foi gravado a 20°C

Resultados

A análise de biossensor foi usada para investigar se o tratamento de calor em combinação com o pH baixo, isto é, condições comuns necessárias para a etiquetagem de ⁶⁸Ga do polipeptídeo, afetaria a capacidade do PEP08296 de se ligar à HSA. A Figura 10 mostra o resultado dessa análise de ligação realizada com um instrumento Biacore 2000. Duas concentrações diferentes de PEP08296, 0,8 nM e 4 nM, foram injetadas sobre uma superfície com724 RU de albumina sérica humana imobilizada O tratamento de calor por 10 minutos a 90°C, pH 4,0, reduziu levemente a capacidade de ligação do PEP08296 a HSA, indicando uma alteração estrutural potencial da molécula.

CD foi usado para investigar adicionalmente a alteração estrutural potencial da molécula. Os espectros CD similares antes e após o aquecimento provariam que uma amostra é estruturalmente reversível. No primeiro experimento, as amostras foram aquecidas com um gradiente de temperatura de 20°C a 90°C. Os espectros CD antes e após o tratamento de calor foram similares no experimento de determinação de Tm com

70/74 os mínimos típicos a 207 e 221 nm indicando que a ahelicidade, isto é, aquecimento de tempo curto a 90°C no tampão de ou pH 4 ou pH 7,2 não teve nenhum efeito na estrutura do PEP08296.

Entretanto, o pré-tratamento do PEP08296 por 12 minutos a 90 °C mostrou um teor de hélice alfa levemente reduzido do PEP08296 se incubado a pH 4,0, mas nenhuma alteração no teor de hélice alfa se incubado a pH 7,2. As sobreposições típicas dos dois espectros CD antes e após o aquecimento são mostradas na Figura 11.

Os resultados da determinação de temperatura de fusão (Tm) são resumidos na Tabela 4.

Tabela 4. Tm de PEP08296

Designação	Tm (°C)
PEP08296 a pH 7,2	59
PEP08296 a pH 4,0	62

Exemplo 11:

Imageamento de ventriculografia radioisotópica com o uso de um 68 polipeptídeo de ligação de albumina etiquetado com Ga

Nos experimentos que constituem esse exemplo, a distribuição corporal inteira do PEP08296 etiquetado com Ga (PEP08185 conjugado por DOTA, SEQ ID NO:148) em ratos foi seguida pelo imageamento dinâmico ao longo de 1,5 horas. Devido à associação forte entre o polipeptídeo etiquetado e a albumina sérica, o polipeptídeo etiquetado pode ser usado, por exemplo, para estudar a permeabilidade de tecido e ventriculografia radioisotópica.

Material e métodos

Etiquetagem por ⁶⁸Ga do PEP08296 ⁶⁸Ga foi eluído como ⁶⁸GaCl3 a partir do gerador de ⁶⁸Ge/^S8Ga (Obninsk, Rússia) com a HC1 0,1 M, convertido em ^S8GaCl4- com HC1 concentrado, coletado em uma coluna de troca aniônica (Chromafix-HCO₃) e subsequentemente eluído como água a 18 ΜΩ, conforme descrito anteriormente (Velikyan et al

71/74 (2008), Nucl Med Biol 35:529 a 536).

A etiquetagem foi realizada essencialmente conforme descrito em Tolmachev et al. (EJNMMI 37:1356 a 1367, 2010). O eluato ⁶⁸Ga concentrado (150 a 200 μΐ) foi adicionado ao PEP08296 (£100 pg em tampão de acetato de sódio a 0,2 M pH 5,5) e o pH foi ajustado para 3,5 a 4 com o uso de acetato de sódio (1,25 M) ou HC1 (0,1 M) . A mistura de etiquetagem foi incubada a 90 °C por 15 minutos antes do resfriamento e a proteína etiquetada foi isolada por purificação de exclusão de tamanho em uma coluna NAP-5 eluída com salino fisiologicamente tamponado.

A identidade e pureza radioquímica da proteína etiquetada com ⁶⁸Ga foi avaliada por radio-HPLC com o uso de UV (210 nm) e detectores de radioatividade em séria em uma coluna Superdex Peptide 10/300 GL (GE Healthcare) eluída com salino fisiologicamente tamponado.

Animal pequeno PET

Um rato (277 g) foi anestesiado com isoflurano (incialmente 5%, então 2% mesclado com ar/O₂7:3), controlado por um vaporizador E-Z com o uso de máscaras de não reinalação Microflex da Euthanex Corporation e foi mantido em uma almofada de aquecimento (37°C) enquanto se situa dentro de um sistema de microPET Focusl20 (Siemens, CTI Concorde Microsystems) . ⁶⁸Ga-PEP08296, 33 MBq, foi dispensado em uma seringa, diluído com salino a 0,5 ml e injetado por meio da veia da cauda. Dados foram adquiridos a partir do corpo inteiro movendo-se o leito em um protocolo de movimento de leito constante por 1,5 hora. Os dados foram processados com Gerenciador de MicroPET e corrigidos para decadência e tempo morto aleatórios. As imagens foram reconstruídas pela retroprojeção filtrada 2D padrão com o uso de um filtro de rampa e avaliadas com o uso do software Research Workplace (Siemens Medicai Solutions).

72/74

Resultados

Os padrões de distribuição básicos (Figura 12) para PEP08296 foram muito similares a esses da albumina etiquetada com radioisótopos tal como ⁶⁸Ga-DOTA, ⁶⁴Cu-D0TA e ^1:LC (consulte, por exemplo, Hoffend et al (2005), Nucl Med Biol 32:287 a 292 e Lu et al (2008), [1-^1:LC] Butanol e [Methyl-^1:LC] Albumin for Blood Flow and Blood Pool Imaging, publicado no XIth Turku PET Symposium, 24 a 27 de maio de 2008) . Em resumo, as concentrações de radioatividade altas foram observadas em vasos sanguíneos principais por toda a varredura. Os órgãos com grandes volumes de sangue (fígado, baço e rim) foram também claramente delineados, conforme foi a radioatividade de ventriculografia radioisotópica cardíaca A radioatividade na bexiga urinária aumentou durante o período de observação, essa observação da eliminação renal sendo consistente com as observações anteriores com rastreadores com base em albumina etiquetados e com esse do metabolismo da própria albumina.

O padrão de distribuição geral da radioatividade e depuração plasmática muito lenta após a injeção intravenosa de ⁶⁸Ga-PEP08296 é consistente com sua ligação forte e muito rápida esperada à albumina. Esses resultados, portanto, suportam aplicações adicionais do radiorastreador como um agente de imageamento de ventriculografia radioisotópica in vivo para o uso com estudos de tomografia de emissão de positron da permeabilidade de tecido, ambos durante o desenvolvimento da doença e durante a intervenção terapêutica.

Exemplo 12: Solubilidade de um polipeptídeo de ligação de albumina

A solubilidade do PEP07986 (SEQ ID NO:163) no tampão fisiológico foi investigada por concentrações consecutivas da amostra usando ultrafiltração, seguida pela medição de concentração e investigação do estado de agregação. Concentrações determinadas pelas leituras de absorbancia

73/74 direta a 280 ntn foram consistentes com as concentrações determinadas pela filtração de gel, mostrando uma solubilidade de mais que 42 mg/ml sem nenhum agregado detectado. Material e métodos

PEP07986 liofilizado foi dissolvido no tampão de NaPi (fosfato de sódio a 20 mM, cloreto de sódio a 150 mM, pH 7,2) a uma concentração de 3 mg/ml. As unidades de filtro de centrífuga Amicon Ultra, cortes de 3 kDa, (Millipore, Cat. nUFC800324) foram pré-enxaguadas com 2 ml de tampão de NaPi por centrifugação a 4.000 g por 20 minutos em uma centrífuga de rotor de caçamba móvel (Multifuge, Heraeus). 1.620 μΐ de PEP07986 a 3 mg/ml foram aplicados a uma primeira unidade de filtro centrífugo e a centrifugação foi realizada a 4.000 g, 2 0 °C, por 7 minutos. Uma amostra de 25 μΐ foi removida (amostra UF 1) para a análise adicional e o resto da amostra foi transferido para uma segunda unidade de filtro centrífugo. A centrifugação e a remoção de amostra foram repetidas três vezes com tempos de giro de 8, 9 e 20 minutos respectivamente (amostra UF 2, 3 e 4 respectivamente). As leituras de absorbância foram realizadas com o uso de um Espectrofotômetro NanoDrop® ND-1000 e diluindo as amostras UF 1 a 4 em tampão de NaPi 2, 4, 6 e 12 vezes respectivamente. As concentrações foram calculadas com o uso do coeficiente de extinção 1 Abs 280 = 1,955 mg/ml. A filtração de gel foi realizada em um sistema 1100 HPLC (Agilent Technologies) com o uso de uma coluna Superdex75 10/300 GL (GE Healthcare) que foi equilibrada no tampão de NaPi. 10 μΐ de cada amostra UF foram aplicados à coluna; o tampão de NaPi foi usado como tampão contínuo e a taxa de fluxo foi 0,5 ml/minuto. Um cromatograma da ovalbumina padrão de peso molecular (GE Healthcare), injetada a uma concentração de 5 mg/ml foi coletado também. As concentrações foram determinas integrando-se a área sob a curva.

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Resultados

As concentrações determinadas pelas leituras de absorbância direta a 280 nm e as concentrações determinadas pela filtração de gel são mostradas na Tabela 5. A 5 solubilidade de PEP07986 (SEQ ID NO:163) é pelo menos 42 mg/ml no tampão fisiológico (fosfato de sódio a 20 mM, cloreto de sódio a 150 mW, pH 7,2) . Nenhum agregado foi detectado pela filtração de gel, conforme mostrado pela Figura 13.

Tabela 5. Concentrações determinadas após a 10 concentração consecutiva de PEP07986 (SEQ ID NO:163)

Concentrações (mg/ml) determinadas por Amostra

	Espectrofotômetro	Filtração de gel
UF2	12,1	12,4
UF3	22,2	22,1
UF4	42,7	42,6

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1 . POLIPEPTÍDEO DE LIGAÇÃO DE ALBUMINA, caracterizado por compreender uma sequência de aminoácidos selecionada dentre

i) LAX₃AKX₆X7ANX₁₀ eldx₁₄ygvsdf ykrlix₂₆kakt VEGVEALKX39X40 ILX43X44LP em que independentemente um do outro

X3 é selecionado dentre E, S, Q e C; x₆ é selecionado dentre E, S e C; X7 é selecionado dentre A e S; X10 é selecionado dentre A, S e R; X14 é selecionado dentre A, S, C e K; X26 é selecionado dentre D e E; X39 é selecionado dentre D e E; X40 é selecionado dentre A e E; X43 é selecionado dentre A e K; X44 é selecionado dentre A, S e E;

L na posição 45 está presente ou ausente; e

P na posição 46 está presente ou ausente; e ii) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade para a sequência definida em i).

2 . POLIPEPTÍDEO DE LIGAÇÃO DE ALBUMINA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se ligar à albumina de tal modo que o valor k_off da interação é no máximo 5 x 10 ⁵s \ por exemplo, no máximo 5 x 10 ⁶ s¹.
3. POLIPEPTÍDEO DE LIGAÇÃO DE ALBUMINA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência de aminoácidos ser selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NO:1 a 144 e SEQ ID NO:164 a 203, por exemplo, selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NO:1 a 144.
4 . POLIPEPTÍDEO DE LIGAÇÃO DE ALBUMINA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a sequência de

2/4 aminoácidos ser selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 4 a 5, SEQ ID NO: 7 a 8, SEQ ID NO: 10 a 11, SEQ ID NO:13 a 14, SEQ ID NO:16 a 17, SEQ ID NO:19 a 20, SEQ ID NO:22 a 23, SEQ ID NO:25 a 26, SEQ ID NO:28 a 29, SEQ ID NO:31 a 32, SEQ ID NO:34 a 35, SEQ ID NO:37 a 38, SEQ ID NO:41 a 42 e SEQ ID NO:49 a 50.
5. POLIPEPTÍDEO DE LIGAÇÃO DE ALBUMINA, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado em que se liga à albumina de soro humana.
6. PROTEÍNA DE FUSÃO OU CONJUGADO, caracterizado por compreender

i) uma primeira porção química que consiste em um polipeptídeo de ligação de albumina, conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores; e ii) uma segunda porção química que consiste em um polipeptídeo que tem uma atividade biológica desejada.
7. POLIPEPTÍDEO DE LIGAÇÃO DE ALBUMINA, PROTEÍNA DE FUSÃO OU CONJUGADO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender uma identificação.
8 . POLINUCLEOTÍDEO, caracterizado por codificar um polipeptídeo de ligação de albumina ou uma proteína de fusão, conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores.
9. MÉTODO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender a expressão de um polinucleotideo conforme definido na reivindicação 8.
10. MÉTODO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela síntese de peptídeo não biológica que usa e/ou derivados de aminoácidos amino que têm cadeias laterais reativas protegidas, sendo que a síntese

3/4 de peptídeo não biológica compreende acoplamento em etapas dos aminoácidos e/ou os derivados de aminoácido para formar um polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, que tem cadeias laterais reativas protegidas, remoção dos grupos protetores das cadeias laterais reativas do polipeptídeo, e dobramento do polipeptídeo em solução aquosa.
11. PROTEÍNA DE FUSÃO OU CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 6, ou conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo uso como um medicamento.
12. PROTEÍNA DE FUSÃO OU CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 11, ou conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo uso em diagnóstico.
13. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender um composto que por si só tem uma solubilidade em água de não mais que 100 pg/ml; acoplado a um polipeptídeo de ligação de albumina, uma proteína de fusão ou conjugado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o composto e o polipeptídeo de ligação de albumina, proteína de fusão ou conjugado são ligados de modo covalente.
14. MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO, conforme definido na reivindicação 13, caracterizado por compreender

a) fornecer um composto que por si só tem uma solubilidade em água de não mais que 100 pg/ml; e

b) acoplar de modo covalente o composto a um polipeptídeo de ligação de albumina, proteína de fusão ou conjugado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, formando assim uma composição que

4/4 compreende um complexo covalente do composto e um polipeptídeo de ligação de albumina, proteína de fusão ou conjugado.
15. MÉTODO PARA AUMENTAR A SOLUBILIDADE DE UM COMPOSTO, caracterizado por compreender fornecer um composto que por si só tem uma solubilidade em água de não mais que 100 pg/ml;

acoplar de modo covalente o composto a um polipeptídeo de ligação de albumina, proteína de fusão ou conjugado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, formando assim um complexo covalente de composto e polipeptídeo de ligação de albumina; e misturar o dito complexo de composto e polipeptídeo de ligação de albumina, proteína de fusão ou conjugado com albumina sob condições que promovem a associação não covalente

do polipeptídeo de ligação de albumina com albumina sérica humana; através do qual a solubilidade em água do composto no dito complexo é composto por si só. maior que a solubilidade em água do

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SEQ ID NO: I δ z O 0 U » SEQ ID N02 I SEQ ID NO:3 I I tON OI O3S SEQ ID NO:5 | I 9=ON OI Q3S 1 1 hON 01 03S I I SEQ ID NOt8 1 Tl Õ 2 Q 0 UI m SEQIDNO:10 | SEQ ID NO:11 | SEQ ID NO:12 | 1 εμοΝ οι oas | | SEQ ID NO:14 | 1 SEQ ID N0:1S | SEQIDNOrie j | SEQ ID NO:17 | | SEQ ID N0:18 | I SEQ ID NO:19 | I SEQ ID NO :20 | I SEQ ID NO21 | CU Tl o 2 a o UI ω » n o z g 5 uu 40 T1 o 2 a σ ui Ci) I «ON 0103S 1 1 SEQ ID NO^6 | 1 SEQ ID NO:27 | | SEQ ID N0â8 | I 6K-0N 01D3S 1 OC ON ai DIG <r? Õ 2 O σ U1 <0 ¢4 m Ô 2 Q 0 UI co | SEQ ID NO:33 | | SEQ ID NO:34 | I SEQ ID NO:35 1 | SEQ ID NO:36 | S e quência de aminoácidos_______________________________ EASAKEAAHA EU>AYGVSDF XKIÜrXDKftKT VEGVEALEDA IIAALP____________________________ 6 i I LASAKESANS ELDAYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP | T.ARAKEEAHA ELDAYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP____________________________ i 1 LASAKSAANS ELDAYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP____________________ j LASAKEAANA ELDSYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALEDA ILAALP | LASAKEAANS ELDSYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALEDA ILAALP_____________________________1 LASAKESANS ELDSYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALEDA ILAALP___________________________ LASAKESANA ELDSYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP _____________________________________________________ ___________| t I i LASAK3AANS ELDSYGVSDF YKRLIDKAKT VEGYEALEDA IIAAU_____________________________j LAEAKEAANA ELDSYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP___________________________ i LAEAKEAANS ELDSYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP I I LAEAKESANS ELDSYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP____________________________J | LAEAKESANA ELDSYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP | 1 LAEAKSÀANA ELDSYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP_____________________________ I LAEAKSAANS ELDSYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALEDA ILAALP_____________________! | T. AR ACT! IANS ELDAYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP 1 LAEAKESANS ELDAYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP___________________________ j 0 I ,a*rmti νατπ?3ΑΡ3Λ amoi'mi .aasASXWts vNvvswavi | | LAEAKSÀANS ELDAYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP | 1 LAQAKEAANA ELDAYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALEDA ILAALP_____________________________1 I LAOAKEAANS EMAYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP___________________________ I LAQAKESANS ELDAYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP ............ 1 I LAQAKESANA ELDAYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALEDA ILAALP____________________________I [ LAQAKSAANA ELDAYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALEDA ILAALP____________________________ I mii vaynraADSA jawagrraax josadasctih wmsreDn I I T.EQRCTiaNS ELDSYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALEDA ILAALP____________________________ I LAQAKESANS ELDSYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALEDA ILAALP____________________________1 1 LAQAKESANA ELDSYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALEDA ILAALP____________________________I I LAQAKSÀANA ELDSYGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALEDA ILAALP _ 1 | dTHfll WÍTV3AD3A. JDíTMaiTEXA dGSADASOTa SNVYSEttOri] o 0) 75 ^sH P cu (D Λ -H □ I PP0O1 I I PP002 I I 600dd | ã £ Q_ I PPD05 1 1 CL PP007 I ppnns 1 1 Q_ 1 OlOdd | I PP011 1 CXJ Í I PP0I3 I I PP014 1 1 PP015 1 PP016 £ CL PP018 PP019 £ £L & £ CL SI g ppuaa £ a. & PPD2Ô 1 I PP027 I 8 £ £L I PPD29 ! 1 CL. PP031 1 PPQ32 I PP033 PPD34 PPD35 secHd 1