JP2023507423A - 新規診断用分子プローブとしての抗ｈｅｒ２ポリペプチド誘導体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に結合する新規ポリペプチド誘導体およびそのコンジュゲート、ならびに特にＨＥＲ２の過剰発現によって特徴づけられる癌の形態の早期発見、患者の層別化および治療モニタリングのための、診断剤としてのそれらの使用を提供する。
Description
本発明は、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に結合する新規ポリペプチド誘導体およびそのコンジュゲート、ならびに診断薬、特にＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする癌の早期発見、患者の層別化および治療モニタリングのためのそれらの使用に関する。
近年、バイオマーカーの探索は、診断および治療の両分野において、病気の初期段階を特定できる可能性があることから、ダイナミックかつ強力なアプローチとして注目されている。また、病態の分子経路に関与する標的を認識するプローブの開発は、非常にやりがいのあるものとなってきている。これらのプローブは、現在の治療法をより良く適用するための診断手順を改善し、治療効果を向上させ、患者の過剰な治療を減らすことができるものでなければならない。
癌原遺伝子ＨＥＲ２またはＨＥＲ２／ｎｅｕ（Human Epidermal Growth Factor Receptor 2）は、ＨＥＲ２タンパク質または受容体と呼ばれる細胞表面受容体の産生をコードしており、正常細胞の増殖および分化を制御するシグナルの伝達に関与するチロシンキナーゼ受容体のＥｒｂＢファミリーのメンバーである。腫瘍細胞では、ＤＮＡ複製システムのエラーにより、ＨＥＲ２遺伝子が増幅され、細胞表面にＨＥＲ２タンパク質が過剰に発現することがある。特に、ＨＥＲ２受容体の過剰発現は、ヒトの原発性乳癌１の２５～３０％に認められ、頭頸部癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、消化器系の癌など、他の多くのＨＥＲ２陽性腫瘍との相関が報告されている。
このような理由から、ＨＥＲ２は多くの癌の治療法および診断法において重要な分子標的となっている。腫瘍細胞表面のＨＥＲ２タンパク質を阻害するアプローチのうち、ヒト化モノクローナル抗体の変異体、例えばトラスツズマブやペルツズマブを用いたいくつかの治療法は、ＨＥＲ２陽性腫瘍の治療のために近年商業的に利用可能となった。しかしながら、臨床的成功にもかかわらず、これらの使用はいくつかの毒性効果や健康な組織への望ましくない副作用を伴い、懸念の理由になっている。
一般に、多くの抗体は、腫瘍への浸透が遅く非効率的で、生体内分布時間が長く、血液からのクリアランスが遅いという特徴があり、診断用途では、長寿命の放射性同位元素の使用と遅い時点でのイメージングが必要となり、患者が高い放射線被爆を受けることになる。さらに、モノクローナル抗体は免疫原性があるため、日常的な診断処置に繰り返し投与することができない。
そのため、ＨＥＲ２型と相互作用する新しい分子を継続的に提供する必要性が高い。
これらの問題は、例えば低分子の使用によって回避することができる。
近年、アフィボディ、フィブロネクチン、ＤＡＲＰｉｎなどの小さな結合ポリペプチド（４～２０ｋＤａ）が報告され、非侵襲的イメージング法において、抗体の代替となる可能性があるとして注目されている。一般に、このようなペプチドは、生体適合性があり、生体内で免疫原性が低く、選択性が高く、特定のターゲットに結合して認識することができ、抗体よりも低いナノモル範囲の親和定数（Ｋｄ）を示し、後者は一般にミリ／マイクロモル範囲のＫｄを有することが実証されている。また、低分子ポリペプチドは分子量が著しく低いため、組織への浸透速度が速く、効率的であり、抗体では区別できないタンパク質の細胞外ドメインや細胞内ドメインを区別することが可能である。
さらに、抗体や他の巨大な分子（Mw～150kDa）とは異なり、低分子は循環から速やかに排出されるため、投与後早い時点でイメージングに適した腫瘍/血液比率に到達することができる。そのため、抗体ベースのイメージング剤に比べて、より迅速に診断情報を得ることができる。
特に、ＨＥＲ２受容体に結合する新しいイメージングプローブの開発は、患者の層別化、特定の抗癌治療に対する反応の予測やモニタリング、さらには光イメージング、磁気共鳴イメージング、核イメージング、コンピュータ断層撮影、超音波、マルチモダリティ画像法による腫瘍の画像誘導手術に特定のイメージング剤として大きな価値を提供することが可能である。
特に、抗体模倣分子のクラスのうち、アフィチンは、小さな一本鎖の親和性タンパク質（７ｋＤａ、一般に６６アミノ酸）からなる化合物で、その高い組織浸透性のために研究が進められている。このようなペプチドの既知の例は、Nanofitins（登録商標）(Affilogic S.A.S., France)である。これらのポリペプチドは、好熱性古細菌Sulfolobus acidocaldariusの超安定ＤＮＡ結合タンパク質Ｓａｃ７ｄに由来し、温度（９０℃まで）およびｐＨ（０～１３）に対する耐性などの有利な生物物理的特徴の大部分を保持している。特に、高親和性アフィチンは、Ｓａｃ７ｄのＤＮＡ結合部位の１０～１４アミノ酸残基の完全ランダム化によりリボソームディスプレイを数回行い、好熱・好酸性であるという本来の安定性の特徴を保ちつつ、癌細胞表面に発現する特定の標的に対して高い親和性を有するようチューニングすることが可能である２，３。
さらに、アフィチンポリペプチドは非常に安定で堅牢であることに加え、抗体よりもイメージングにおける薬物動態プロファイルが優れており、細菌の組換え技術により容易に大量に生産することが可能である。
例えば、Goux M. et al., Bioconjugated Chem.2017, 28, 2361－23714は、18F－FBEMで放射性標識した場合の、イメージング剤、特に標的PET放射性トレーサーとしての抗EGFRナノフィチンB10の使用を開示している。しかし、標的ＨＥＲ２を結合するアフィチンの特定の配列は記載されていない。
既知の抗体模倣ポリペプチドの中で、ＨＥＲ２に結合するアフィボディのいくつかの配列が研究されており、例えば、Affibody ABの名でＷＯ２００９／０８０８１０5に記載され、Orlova A. et al., Cancer Res. 2006, 66(8), 4339－43486に記載されているものが挙げられる。
このようなＨＥＲ２結合ポリペプチドを、放射性核種およびキレート剤とコンジュゲートした後にイメージング剤として応用した例が、GE Healthcare LtdおよびAffibody ABの名前で、ＷＯ２０１２／０９６７６０7に報告されている。
ＷＯ２０１７／１６１０９６8（Tarveda Therapeutics Inc）には、例えばナノフィチンなどの標的部位、リンカーおよび活性剤を有する、一般的なコンジュゲートを含むナノおよびマイクロ粒子が開示されているが、そのようなコンジュゲートの具体例は記載されていない。
したがって、このような努力にもかかわらず、ＨＥＲ２陽性腫瘍の診断薬、特にＨＥＲ２陽性腫瘍の治療のモニタリングに使用するために、標的に対する高い特異性と親和性を特徴とする、上記のＨＥＲ２結合剤を同定し開発する必要性が依然として存在する。
本発明は、ＨＥＲ２受容体を高い親和性で特異的に標的とする、アフィチン構造を特徴とする新規ポリペプチド配列に関する。
特に、本発明は、アミノ酸配列：
VKVKFWGAGVEKEVDTSKITWVTRSGKYVIFTYDDNGKAGPGRVPEKDAPKELLDMLARAEREK（配列番号１）
を含んでなるＨＥＲ２結合ポリペプチドに関する。
VKVKFWGAGVEKEVDTSKITWVTRSGKYVIFTYDDNGKAGPGRVPEKDAPKELLDMLARAEREK（配列番号１）
を含んでなるＨＥＲ２結合ポリペプチドに関する。
ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現が乳癌や他の多くの種類の腫瘍に関与しており、病的状態のマーカーであることを考慮すると、本発明のＨＥＲ２結合性アフィチンは、画像部位で標識されると、より効果的な治療法および／または患者の過剰治療を減らす観点から、癌の早期診断とステージの判定に有用であると考えられる。
この目的のために、それらは標識部位に効率的に結合させることができ、in vitroおよび/またはin vivoの分析中に容易に認識および評価することができる。このようなコンジュゲートまたは複合体もまた、本発明の対象である。
本発明のアフィチンは、標的であるＨＥＲ２に対してナノモルの親和性を有し、アルブミンに結合せず、予測される免疫原性が低く、ＨＥＲ２陽性細胞において良好な内在化を示し、発現収率が高いなど、診断ツールへの使用に適した特性を備えていることが認められた。特に、本発明のアフィチンおよびそのコンジュゲートは、生理的に存在する部位、すなわちＨＥＲ２が発現している細胞表面で標的を特異的に認識することができるため、in vivoでの応用が可能である。
さらに、本発明のアフィチンは、現在ＨＥＲ２陽性腫瘍の臨床治療に用いられているモノクローナル抗体であるトラスツズマブやペルツズマブが認識するエピトープとは異なる特定のエピトープで標的ＨＥＲ２を認識できることが判明しており、例えば、トラスツズマブおよびペルツズマブ治療に対するＨＥＲ２受容体の発現変化を調べる薬剤として本発明のアフィチンの使用が可能である。
本発明の特徴は、以下の詳細な説明および添付の図を参照することにより、よりよく理解することができる。
図１は、精製したIRDye800CW-Aff02コンジュゲートのＳＥ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
図２は、トラスツズマブ－ビオチンまたはペルツズマブ－ビオチン対Aff02ポリペプチドの競合ＥＬＩＳＡ試験の結果を示す。
図３は、トラスツズマブ－ビオチン対Aff02ポリペプチド（ａ）またはペルツズマブ－ビオチン対Aff02ポリペプチド（ｂ）による異なる競合ＥＬＩＳＡ試験の結果を示す。
図４は、Aff02の存在下または非存在下でのトラスツズマブ（ａ）またはペルツズマブ（ｂ）の曲線を示す。
図５は、IRDye800CW-Aff02コンジュゲートをBalb/c nu/nuマウスに投与（用量：１０ｎｍｏｌ／マウス）したときの蛍光シグナル曲線を示す（平均、標準偏差、ｎ＝３）。
図６は，健康なマウスにIRDye800CW-Aff02を注射（用量：１０ｎｍｏｌ／マウス）してから４８時間後の生体外分布を示している．
配列表の簡単な説明
配列番号１は、Ａｆｆ０１と称する、本発明のアフィチンの６４アミノ酸配列：VKVKFWGAGVEKEVDTSKITWVTRSGKYVIFTYDDNGKAGPGRVPEKDAPKELLDMLARAEREK
を示す。
配列番号２は、アフィチンＡｆｆ０２と称する、Ｃ末端にＣｙｓ、Ｎ末端にヘキサヒスチジンタグを有する配列番号１の誘導体化変異体に相当する７７アミノ酸配列：
MRGSHHHHHHGSVKVKFWGAGVEKEVDTSKITWVTRSGKYVIFTYDDNGKAGPGRVPEKDAPKELLDMLARAEREKC
を示す。
配列番号３は、アフィチンＡｆｆ０２およびＡｆｆ０２－０のＮ末端に連結されたＨｉｓ６－ｔａｇ誘導体：
MRGSHHHHHHGS
を示す。
配列番号４は、Ａｆｆ０２－０と称する、Ｃ末端システインを含まないＡｆｆ０２（配列番号２）に対応する操作されたポリペプチド：
MRGSHHHHHHGSVKVKFWGAGVEKEVDTSKITWVTRSGKYVIFTYDDNGKAGPGRVPEKDAPKELLDMLARAEREK
を示す。
配列番号５は、配列Ａｆｆ０２－０（配列番号４）とPseudomonas exotoxin A（Pe38）のトランケートされた部分との融合によって形成される操作されたポリペプチド：
MRGSHHHHHHGSVKVKFWGAGVEKEVDTSKITWVTRSGKYVIFTYDDNGKAGPGRVPEKDAPKELLDMLARAEREKKLGSAGSAAGSGEFGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAASGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTGLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPKDEL
を示す。
配列番号１は、Ａｆｆ０１と称する、本発明のアフィチンの６４アミノ酸配列：VKVKFWGAGVEKEVDTSKITWVTRSGKYVIFTYDDNGKAGPGRVPEKDAPKELLDMLARAEREK
を示す。
配列番号２は、アフィチンＡｆｆ０２と称する、Ｃ末端にＣｙｓ、Ｎ末端にヘキサヒスチジンタグを有する配列番号１の誘導体化変異体に相当する７７アミノ酸配列：
MRGSHHHHHHGSVKVKFWGAGVEKEVDTSKITWVTRSGKYVIFTYDDNGKAGPGRVPEKDAPKELLDMLARAEREKC
を示す。
配列番号３は、アフィチンＡｆｆ０２およびＡｆｆ０２－０のＮ末端に連結されたＨｉｓ６－ｔａｇ誘導体：
MRGSHHHHHHGS
を示す。
配列番号４は、Ａｆｆ０２－０と称する、Ｃ末端システインを含まないＡｆｆ０２（配列番号２）に対応する操作されたポリペプチド：
MRGSHHHHHHGSVKVKFWGAGVEKEVDTSKITWVTRSGKYVIFTYDDNGKAGPGRVPEKDAPKELLDMLARAEREK
を示す。
配列番号５は、配列Ａｆｆ０２－０（配列番号４）とPseudomonas exotoxin A（Pe38）のトランケートされた部分との融合によって形成される操作されたポリペプチド：
MRGSHHHHHHGSVKVKFWGAGVEKEVDTSKITWVTRSGKYVIFTYDDNGKAGPGRVPEKDAPKELLDMLARAEREKKLGSAGSAAGSGEFGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAASGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTGLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPKDEL
を示す。
本発明の目的は、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に対して親和性を有する新規薬剤、特にＨＥＲ２に特異的に結合することを特徴とするポリペプチド、その誘導体およびコンジュゲートを提供することである。
したがって、第1の態様において、本発明は、アミノ酸配列VKVKFWGAGVEKEVDTSKITWVTRSGKYVIFTYDDNGKAGPGRVPEKDAPKELLDMLARAEREK（配列番号１）を含む、ＨＥＲ２と特異的に結合するポリペプチドを提供する。好ましくは、かかる配列は、最大１００アミノ酸の長さを有する。より好ましくは、８０アミノ酸までの長さを有する。
好ましい具体的な実施形態において、本発明は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを提供する。
上記で定義したポリペプチドの種々の改変、および／または付加は、例えば、配列へのさらなるアミノ酸の付加、任意のリンカーまたはスペーサーによる誘導体化、または以下にさらに詳細に記載するように、特定の標識またはイメージング部位とのコンジュゲーションなどを含め、本発明の範囲から逸脱することなく実施することができる。
例えば、本発明は、上記のＨＥＲ２結合ポリペプチドが、前記ペプチドの生物学的機能を変更しないことを条件に、一方または両方の末端位置に追加されたアミノ酸残基を有するポリペプチドも包含する。これらの追加のアミノ酸残基は、ポリペプチドによるＨＥＲ２の結合において役割を果たし得るものであが、例えばポリペプチドの生産、精製、安定化、結合および／または検出に関連する他の目的も同様に果たし得る。好ましくは、そのような追加のアミノ酸残基は、化学的カップリングの目的で追加された１つ以上のアミノ酸残基から構成されてもよい。好ましい実施形態は、システインまたはホモシステインのようなチオール基を含む、または側鎖にリジンのような一級アミノ基、またはグルタミン酸またはアスパラギン酸のようなカルボン酸基を含む少なくとも一つのアミノ酸の、ポリペプチド鎖の最初または最後の位置、すなわちＮまたはＣ末端での付加に関する。
別の実施形態では、化学結合に使用するそのような残基は、タンパク質ドメインの表面、好ましくは標的結合に関与しない表面の部分上の別のアミノ酸の置換によって導入されることもできる。
いくつかの実施形態では、結合に適した前記残基はまた、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する合成アミノ酸又は非天然アミノ酸又はアミノ酸模倣物によって示されるものでもよい。非限定的な例は、β2－またはβ3－アミノ酸；γ－アミノ酸；ｐ－アセトフェニルアラニンまたはｐ－アジドフェニルアラニンなどの置換されたグリシンまたはアラニン；6－アミノヘキサン酸や当分野で既知の他の誘導体から選択され、カップリング戦略を調節するためにまたはコンジュゲートへの安定性を付与するために有用である。
付加されるアミノ酸残基はまた、ポリペプチドの精製、単離または検出に有用な「タグ」、例えばヘキサヒスチジルタグ、またはタグに特異的な抗体との相互作用のための「myc」タグまたは「FLAG」タグ、または単独でまたは結合ターゲットとカップリングさせることができる当業者によく知られている他の代替物を含んでもよい。
したがって、別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１のペプチドに対応する、Ｃ末端でのＣｙｓの付加およびＮ末端でのＨｉｓ６－タグのアミノ酸配列MRGSHHHHHHGS（配列番号３）の付加によって修飾されたアミノ酸配列MRGSHHHHHHGSVKVKFWGAGVEKEVDTSKITWVTRSGKYVIFTYDDNGKAGPGRVPEKDAPKELLDMLARAEREKC（配列番号２）
を含む、ＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供する。
を含む、ＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなるＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１のペプチドに対応する、Ｎ末端でのＨｉｓ６－タグのアミノ酸配列MRGSHHHHHHGS（配列番号３）の付加によって修飾されたアミノ酸配列MRGSHHHHHHGSVKVKFWGAGVEKEVDTSKITWVTRSGKYVIFTYDDNGKAGPGRVPEKDAPKELLDMLARAEREK（配列番号４）
を含む、ＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供する。
を含む、ＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供する。
特に、ペプチドのＮ末端における追加のヘキサヒスチジンタグは、例えばBornhorst J.A. et al, Methods Enzymol. 2000, 326, 245－2549に記載されているように、既知の手順に従って、Ｎｉ－ＮＴＡカラムによるタンパク質の精製に有用である。
本発明はまた、配列番号１を含んでなるポリペプチドの多量体、例えば二量体を包含する。例えば、一実施形態において、本発明は、いくつかのバイオテクノロジー用途で使用され得る多特異性試薬を作成するために、配列番号１のアミノ酸を含む２つのポリペプチドを含むホモ二量体分子、または配列番号１のアミノ酸を含むポリペプチドとＨＥＲ２または他の標的分子に対して高い結合親和性の異なるポリペプチドを含むヘテロ二量体分子を提供する。
本発明によるこのような多量体の連結されたポリペプチド「単位」は、公知の有機化学的方法を用いた共有結合によって連結されてもよいし、ポリペプチドの組換え発現のための系において１つ以上の融合ポリペプチドとして発現してもよいし、直接またはリンカー、例えばアミノ酸リンカーを介して任意の他の方法で接合されてもよい。
上記の定義されたポリペプチドはすべて、いくつかの用途において、ＨＥＲ２に対する抗体の適切な代替物として考えることができる。したがって、本発明の一態様は、ＨＥＲ２の過剰発現に起因するおよび／または関連する癌疾患の診断または画像化に使用するのに適したレポーター部分を形成するために化合物とコンジュゲートさせたまたは標識された上記のＨＥＲ２結合ポリペプチドに関する。
「レポーター部分」とは、イメージング技術によって直接的または間接的に検出することができる分子を指し、本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチドは、少なくとも１つの検出可能な標識または材料（例えば、光学的特性が測定可能な色素；磁性粒子を含んでなる造影剤；またはガスを含む小胞）と連結している。レポーター部分は、例えば、環境またはその検出性を修飾するさらなる材料との相互作用によってのみ検出可能となる場合、非直接的に検出可能である。
このようなレポーター部分の検出のための適切なイメージング技術には、例えば、磁気共鳴、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波（ＵＳ）、光音響イメージング（ＰＡＩ）、近赤外線蛍光（ＮＩＲＦ）および単一光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）または光学イメージング（ＯＩ）と相関する技術などが含まれる。
特に、ＰＥＴイメージング技術には、抗体や抗体模倣分子などを用いて目的の受容体を直接標的にすることで、疾患に関する特定のバイオマーカー情報を取得するイムノＰＥＴも含まれる。
イメージングの用途に関して、本発明のポリペプチドは、一般に以下から選択される標識に連結される：フルオレセイン、ＦＩＴＣ、Alexa色素、シアニン色素、DyLight色素、IRDye色素またはVivoTag色素などの蛍光シグナルを生成できる蛍光体部分；光学イメージングを用いてコントラストまたはシグナルを生成するために使用され得る薬剤を含む光学部分；例えばＧｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｐｒ（ＩＩＩ）、Ｎｄ（ＩＩＩ）、Ｓｍ（ＩＩＩ）、Ｔｂ（ＩＩＩ）、Ｙｂ（ＩＩＩ）、Ｄｙ（ＩＩＩ）、Ｈｏ（ＩＩＩ）およびＥｒ（ＩＩＩ）などの常磁性金属イオンと安定した錯体を形成できる磁気共鳴用キレート剤などを含む、磁気または常磁性部分；例えば１８Ｆ，１２４Ｉ，１１Ｃ，６４Ｃｕ，６８Ｇａ，８９Ｚｒ，４４Ｓｃ，９９ｍＴｃやインジウム、ガリウム、イットリウム、ビスマス、ラジオアクチニド、ラジオランタニドの他の放射性同位体を含む、放射性同位体；ビオチンなどのアフィニティー標識；ヨウ素化有機分子や重金属イオンのキレートなどの、Ｘ線イメージングでコントラストやシグナルを生成するために使用されるＸ線反応性部分；コントラスト増強超音波イメージングのための超音波応答性部分またはアセンブリ、好ましくはガス充填マイクロバブルの形態；光音響イメージングに適した薬剤を含む光音響応答性イメージング部分；およびナノ粒子をベースとする部分。
好ましくは、放射性核種による標識の場合、このような錯体形成は、キレート剤または多座配位子を用いて行われ、特に放射性金属とキレートを形成する。そのようなキレーターの非限定的な例としては、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）；２，２’，２’’－（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－トリイル）三酢酸（ＮＯＴＡ）；２－［ビス［２－［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル］アミノ］酢酸（ＤＴＰＡ）；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１０－（２－ヒドロキシプロピル）－１，４，７－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリ酢酸（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）； １，４－ビス（カルボキシメチル）－６－［ビス（カルボキシメチル）］アミノ－６－メチルペルヒドロ－１，４－ジアゼピン（ＡＡＺＴＡ）及びそれらの誘導体が挙げられる。
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、上記のＨＥＲ２結合ポリペプチドと放射性金属のような放射性核種とのキレートを含んでなる放射性標識ポリペプチドを包含する。より好ましくは、放射性金属は、６８Ｇａ、４４Ｓｃまたは９９ｍＴｃである。
別の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、例えば、IRDye800CW、IRDye650、IRDye680、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、ZW800－1、AlexaFluor 750 AlexaFluor 790、およびそれらの類似体および誘導体のようなシアニン色素から選択される蛍光体部分とコンジュゲートさせる。
さらに、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／ノイトラビジンなどのタグ系を用いてポリペプチドと標識を結合させてもよい。
したがって、さらなる好ましい態様において、本発明は、ビオチンなどのアフィニティー標識に連結された、上記で定義したポリペプチドを提供する。
本発明の標的化ポリペプチドと標識またはイメージング部分との間の結合は、本明細書の実施例に記載の方法または当業者によく知られている他の方法によって行うことができる。例えば、それらは、共有または非共有的に、任意選択で標識化に有用な適切なリンカーまたはスペーサーの介在によって、連結され得る。
一般に、このようなリンカーまたはスペーサーは、アミノ酸または核酸配列、あるいは例えばアミノキシ基、アジド基、アルキン基、チオール基またはマレイミド基を含む反応性部分を単独または組み合わせて構成することができる。
このようなリンカーは、好ましくは２つの官能基部分からなり、１つは迅速かつ効率的な標識を提供し、もう１つは、例えばアミン基を介して、または好ましくはシステインのチオール基を介して、本発明のポリペプチドに迅速かつ効率的に結合することを可能にする。例えば、マレイミド基はチオール基と反応し、安定なチオエーテル結合を形成する。好ましくは、最終的な複合体は、最初に標識をリンカーと反応させ、その後、ポリペプチドのチオール基と反応させることにより形成される。
本発明のポリペプチドは、好ましくは標識と結合させてレポーター部分を形成し、ＨＥＲ２関連状態、障害、機能不全、状態または疾患の診断およびステージング、ならびにそのような状態における治療応答のモニタリング、特にＨＥＲ２タンパク質の過剰発現によって特徴付けられる癌疾患の臨床設定における標的化に用いることが可能である。適用例としては、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、消化器系の癌など、ＨＥＲ２の発現に相関する癌疾患の診断が例示される。
したがって、さらなる態様において、本発明は、ＨＥＲ２の過剰発現によって引き起こされる及び／又は関連する癌疾患の診断又は可視化、すなわち、患者の病歴の評価、検査及び実験データの検討を通じてＨＥＲ２関連疾患の性質及び原因を特定又は決定するプロセスにおける使用のための、上記に定義したポリペプチドコンジュゲートを提供する。特に、かかるポリペプチドコンジュゲートは、ＨＥＲ２を過剰発現している身体組織または器官系の画像化に使用することができる。より好ましくは、治療前後のＨＥＲ２発現を決定するために使用することができ、これは、治療前後に画像を得ることによって達成することができ、ＨＥＲ２発現の範囲または解剖学的内容を決定するために、例えば、外科的目的のために、または患者の層別化のために、使用することができる。
さらに別の態様において、本発明は、ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする癌組織または臓器を検出するためのイメージング剤の調製における、上記のポリペプチドコンジュゲートの使用を提供する。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義されるポリペプチド又はポリペプチドコンジュゲートと、１つ以上の適切な薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤及び／又は添加剤とを含む、組成物を提供する。組成物の成分は、診断用途または画像化用途によって、意図された用途に応じて変更させることができる。このような組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤から選択される１つ以上のアジュバントも含むことができる。
組成物は、１つ以上の異なるイメージング剤をさらに含むことができる。
一実施形態において、本発明は、ＨＥＲ２を有する標的組織のイメージングに使用するための上記組成物を提供し、この組成物は、上記で定義したイメージング部分とコンジュゲートまたは標識された本発明のポリペプチドを含んでいる。この組成物は、例えば、リポソーム又はナノ粒子の形態でもあり得、異なるタイプの投与に適することができる。好ましくは、この画像化は、磁気共鳴、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波（ＵＳ）、光音響画像（ＰＡＩ）、近赤外線蛍光（ＮＩＲＦ）及び単一光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）から選択される画像化技術で行われ、又は光イメージング（ＯＩ）と相関させることができる。
一実施形態では、組成物は、非経口投与、好ましくは静脈内または皮下投与に適している、例えば、滅菌注射液、分散液または乳剤の調製のための粉末の形態である。別の実施形態では、上記組成物は、局所的にまたは吸入によって投与され得る。
前記組成物は、乳癌などのＨＥＲ２発現腫瘍を可視化するためのイメージング技術に使用するために提供される。
別の態様では、本発明は、好ましくは標識された、またはイメージング部分とコンジュゲートされた、少なくとも１つの本発明のポリペプチドを１つ以上の容器に含むキットと、使用説明書とを提供する。
本発明はまた、ＨＥＲ２の過剰発現によって特徴付けられる癌を有する哺乳類対象、好ましくはヒトの少なくとも一部のインビボ画像化のための方法を提供し、かかる方法は、以下のステップ：
上記の組成物を対象に投与すること；
任意選択で、対象への組成物の送達をモニターすること；
診断装置で対象を画像化すること；および
任意選択で、ＨＥＲ－２関連疾患を有する対象を診断すること
を含んでなる。
上記の組成物を対象に投与すること；
任意選択で、対象への組成物の送達をモニターすること；
診断装置で対象を画像化すること；および
任意選択で、ＨＥＲ－２関連疾患を有する対象を診断すること
を含んでなる。
本発明のポリペプチドは、組換え発現、すなわち、例えば大腸菌で発現させることができる発現プラスミドにおける配列クローニング、およびアフィニティクロマトグラフィーによる精製（例えばHuet S. et al, PLoS ONE 2015, 10(11): e014230410に記載の手順に従う）によって得ることができる。
例えば、前培養物を、グルコースおよび抗生物質を含む培地中で３７℃にて一晩培養することができる。前培養物をグルコースおよび抗生物質を含む培地で希釈し、３７℃でログ相中期まで増殖させることができる。その後、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシドを添加し、３０℃で一晩振盪培養することにより、タンパク質の発現を誘導することができる。遠心分離により菌体をペレット化し、溶菌バッファーに再懸濁することができる。細胞溶解は室温で１時間行い、懸濁液を遠心分離して細胞の残骸を除去することができる。その後、ニッケル樹脂と２５０ｍＭイミダゾールを含む溶出バッファーを用いた固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により、上清からHisタグ－タンパク質を精製することができる。
本発明の別の態様は、上記のポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
さらなる実施形態において、本発明は、上記の核酸分子、および任意選択で核酸分子の発現を通じて本発明によるポリペプチドの生産を可能にする他の核酸成分、を含む発現ベクターに関する。
さらに、本発明は、前記発現ベクターを含む宿主細胞（例えば、真核生物細胞、原核生物細胞または植物細胞）に関する。
上記の態様は、当業者によく知られている本発明のポリペプチドを製造するための組換え技術に相当するものである。
あるいは、本発明のポリペプチドは、例えば標準的な固相合成技術を用いた化学合成、または例えば植物およびトランスジェニック動物などの異なる宿主における発現を含む他の既知の手段によっても製造することができる。
本発明を、これに基づいて実施された実施例の説明を通じて詳細に説明する。
実験セクション
以下の実施例は、説明のために記載するものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
以下の実施例は、説明のために記載するものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
装置
以下の実施例に従って調製した本発明の配列およびそのコンジュゲートを、以下の方法のいずれかを用いて、ＵＶ／ＶＩＳ（光学密度）、ＳＥ－ＨＰＬＣおよびＲＰ－ＨＰＬＣ分析データにより特性を評価した。
ＳＥ－ＨＰＬＣ：サイズ排除ＨＰＬＣ分析は、Sepax Zenix SEC-80 4.6 x 300 mm カラム（注入量：１０μＬ）を用いて、３０℃、流速１ｍＬ／分で行った。装置には２８０／７８０ｎｍのＵＶ／ＶＩＳ検出器を装着した。移動相は１５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０とした。
ＲＰ－ＨＰＬＣ：ＨＰＬＣ分析は、Jupiter Proteo（Phenomenex）4.6 x 250 mm カラム（注入量：１０μＬ）を用いて、４０℃、流速１．２ｍＬ／分で実施した。装置には２８０／７８０ｎｍのＵＶ／ＶＩＳ検出器を装着した。移動相Ａは０．１％ＴＦＡ（水中）、移動相Ｂは０．１％ＴＦＡ（アセトニトリル中）とした。グラジェントを以下に示す。
アフィニティ実験は、Octet System と Protein A biosensors（ForteBio）を用いた Biolayer Interferometry（BLI）アッセイによって行った。組換えヒト蛋白質ｈＨＥＲ２はR&D Systems社（米国、ミネアポリス）から購入した。
in vivoイメージング実験は、IVIS Spectrum In Vivo Imaging System（Perkin Elmer Inc.）を用い、４３０～８５０ｎｍの１０種類の狭帯域励起フィルター（３０ｎｍ帯域）と１８種類の狭帯域発光フィルター（２０ｎｍ帯域）を装着して実施した。
以下の実施例に従って調製した本発明の配列およびそのコンジュゲートを、以下の方法のいずれかを用いて、ＵＶ／ＶＩＳ（光学密度）、ＳＥ－ＨＰＬＣおよびＲＰ－ＨＰＬＣ分析データにより特性を評価した。
ＳＥ－ＨＰＬＣ：サイズ排除ＨＰＬＣ分析は、Sepax Zenix SEC-80 4.6 x 300 mm カラム（注入量：１０μＬ）を用いて、３０℃、流速１ｍＬ／分で行った。装置には２８０／７８０ｎｍのＵＶ／ＶＩＳ検出器を装着した。移動相は１５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０とした。
ＲＰ－ＨＰＬＣ：ＨＰＬＣ分析は、Jupiter Proteo（Phenomenex）4.6 x 250 mm カラム（注入量：１０μＬ）を用いて、４０℃、流速１．２ｍＬ／分で実施した。装置には２８０／７８０ｎｍのＵＶ／ＶＩＳ検出器を装着した。移動相Ａは０．１％ＴＦＡ（水中）、移動相Ｂは０．１％ＴＦＡ（アセトニトリル中）とした。グラジェントを以下に示す。
in vivoイメージング実験は、IVIS Spectrum In Vivo Imaging System（Perkin Elmer Inc.）を用い、４３０～８５０ｎｍの１０種類の狭帯域励起フィルター（３０ｎｍ帯域）と１８種類の狭帯域発光フィルター（２０ｎｍ帯域）を装着して実施した。
実施例１：本発明のアフィチンの調製
ＨＥＲ２受容体を選択的に標的化するため、アフィチンのライブラリーを、数回の連続したスクリーニング（最大６回）により、標的に対して豊富化した。抗ＨＥＲ２アフィチンの豊富化は、選択ラウンドの後に、ヒト（ＨＳＡ）、マウス（ＭＳＡ）およびウシ（ＢＳＡ）血清アルブミンとの結合が無視できる条件を制御しながら、ＥＬＩＳＡアッセイでモニターした。その結果、Ａｆｆ０１（配列番号１）と名付けたアフィチンが、ＨＥＲ２に対してナノモルの親和性を持ち、アルブミンに結合せず、in silicoの免疫原性が低いことが判った。
ポリペプチドＡｆｆ０２は、スクリーニング工程で同定された選択されたクローンを配列決定することにより得られた。Ｎ末端Ｈｉｓ6－タグ（MRGSHHHHHHGS、配列番号３）およびＣ末端Ｃｙｓ－タグを含む配列を、Huet S. et al, PLoS ONE 2015, 10(11): e014230410に記載の手順に従って大腸菌DH5α LacIq株、にサブクローニングした。簡潔には、配列番号１をコードするＤＮＡアンプリコンを、pQE-30（Qiagen）由来のプラスミドにギブソンアセンブリによりサブクローニングして配列番号２をコードし、ライゲーション混合物を大腸菌DH5α LacIq株（Invitrogen）にトランスフォームさせた。クローンを単離し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含む２ｘＹＴ培地プレート上で選択した。プラスミド構築は、サンガー配列決定により確認した。形質転換した大腸菌DH5α LacIqからの前培養物を、１％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含む２ｘＹＴ培地で３７℃にて一晩増殖させた。前培養物を０．１％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含む２ｘＹＴ培地で１：２０に希釈し、３７℃でログ相中期（ＯＤ６００＝０．８－１．０）まで増殖させた。その後、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシドを終濃度０．５ｍＭになるように添加し、３０℃で一晩振盪培養することにより、タンパク質の発現を誘導した。細菌を３２２０ｇで４５分間の遠心分離によってペレット化した。細胞ペレットを1X BugBuster Protein Extraction Reagent、５μｇ/mL DNaseI、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾールを含んでなるｐＨ７．４の溶菌バッファーに再懸濁させた。細胞溶解は室温で１時間行い、懸濁液を３２２０ｇで４５分間遠心分離して細胞残屑を除去した。次に、His60 Nickel Superflow resin（Clontech）と２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ イミダゾールを含んでなるｐＨ７．４の溶出バッファーを用いた固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって上清からＨｉｓタグ蛋白質を精製した。セルベースアッセイに使用するサンプルについては、エンドトキシンの除去工程を追加した。まず、ＰＢＳ（10mMリン酸、2.7 mM KCl、137 mM NaCl、pH 7.4; Sigma-Aldrich）に対する透析によってサンプルをバッファー交換した。次に、サンプルをSartobind STIC PA陰イオン交換体（Sartorius）で濾過した。最後に、サンプルをＰＢＳに対して透析し，孔径0.2μmのMinisart親水性膜（Sartorius）で濾過し、無菌状態で保存した。
このようにして誘導体化されたアフィチンをＡｆｆ０２（配列番号２）と名付けた。
ＨＥＲ２受容体を選択的に標的化するため、アフィチンのライブラリーを、数回の連続したスクリーニング（最大６回）により、標的に対して豊富化した。抗ＨＥＲ２アフィチンの豊富化は、選択ラウンドの後に、ヒト（ＨＳＡ）、マウス（ＭＳＡ）およびウシ（ＢＳＡ）血清アルブミンとの結合が無視できる条件を制御しながら、ＥＬＩＳＡアッセイでモニターした。その結果、Ａｆｆ０１（配列番号１）と名付けたアフィチンが、ＨＥＲ２に対してナノモルの親和性を持ち、アルブミンに結合せず、in silicoの免疫原性が低いことが判った。
ポリペプチドＡｆｆ０２は、スクリーニング工程で同定された選択されたクローンを配列決定することにより得られた。Ｎ末端Ｈｉｓ6－タグ（MRGSHHHHHHGS、配列番号３）およびＣ末端Ｃｙｓ－タグを含む配列を、Huet S. et al, PLoS ONE 2015, 10(11): e014230410に記載の手順に従って大腸菌DH5α LacIq株、にサブクローニングした。簡潔には、配列番号１をコードするＤＮＡアンプリコンを、pQE-30（Qiagen）由来のプラスミドにギブソンアセンブリによりサブクローニングして配列番号２をコードし、ライゲーション混合物を大腸菌DH5α LacIq株（Invitrogen）にトランスフォームさせた。クローンを単離し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含む２ｘＹＴ培地プレート上で選択した。プラスミド構築は、サンガー配列決定により確認した。形質転換した大腸菌DH5α LacIqからの前培養物を、１％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含む２ｘＹＴ培地で３７℃にて一晩増殖させた。前培養物を０．１％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含む２ｘＹＴ培地で１：２０に希釈し、３７℃でログ相中期（ＯＤ６００＝０．８－１．０）まで増殖させた。その後、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシドを終濃度０．５ｍＭになるように添加し、３０℃で一晩振盪培養することにより、タンパク質の発現を誘導した。細菌を３２２０ｇで４５分間の遠心分離によってペレット化した。細胞ペレットを1X BugBuster Protein Extraction Reagent、５μｇ/mL DNaseI、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾールを含んでなるｐＨ７．４の溶菌バッファーに再懸濁させた。細胞溶解は室温で１時間行い、懸濁液を３２２０ｇで４５分間遠心分離して細胞残屑を除去した。次に、His60 Nickel Superflow resin（Clontech）と２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ イミダゾールを含んでなるｐＨ７．４の溶出バッファーを用いた固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって上清からＨｉｓタグ蛋白質を精製した。セルベースアッセイに使用するサンプルについては、エンドトキシンの除去工程を追加した。まず、ＰＢＳ（10mMリン酸、2.7 mM KCl、137 mM NaCl、pH 7.4; Sigma-Aldrich）に対する透析によってサンプルをバッファー交換した。次に、サンプルをSartobind STIC PA陰イオン交換体（Sartorius）で濾過した。最後に、サンプルをＰＢＳに対して透析し，孔径0.2μmのMinisart親水性膜（Sartorius）で濾過し、無菌状態で保存した。
このようにして誘導体化されたアフィチンをＡｆｆ０２（配列番号２）と名付けた。
実施例２．アフィチンＡｆｆ０１の細胞内在化の測定
Ａｆｆ０１の細胞内在化は、専用のセルベースアッセイを用いて評価した。簡単に言うと、Ａｆｆ０１を配列番号３でタグ付けし（すなわち配列Ａｆｆ０２－０を形成）、次にPseudomonas exotoxin Aのトランケート部分（毒素の細胞内在化ドメインを除去）と融合し、配列番号５に示される配列を有する最終ペプチドを形成した。かかるトランケート型（Ｐｅ３８）は、その細胞毒性作用を保持するにはＡｆｆ０１によって内在化することが必要である。
内在化を検証するため、乳腺癌細胞株SK-BR-3（ＨＥＲ２受容体を過剰発現）および乳癌細胞株 MCF-7（ＨＥＲ２受容体を低発現）の生存率を、種々のナノフィチン濃度で測定した。SK-BR-3細胞では、用量依存的な細胞毒性誘導が観察されたが、逆にMCF-7細胞では有意な変化は観察されなかった。細胞死誘導は、Ａｆｆ０１が内在化を引き起こし、ＨＥＲ２受容体を介してＰｅ３８が効果的にトランスポートされることを実証した。
Ａｆｆ０１の細胞内在化は、専用のセルベースアッセイを用いて評価した。簡単に言うと、Ａｆｆ０１を配列番号３でタグ付けし（すなわち配列Ａｆｆ０２－０を形成）、次にPseudomonas exotoxin Aのトランケート部分（毒素の細胞内在化ドメインを除去）と融合し、配列番号５に示される配列を有する最終ペプチドを形成した。かかるトランケート型（Ｐｅ３８）は、その細胞毒性作用を保持するにはＡｆｆ０１によって内在化することが必要である。
内在化を検証するため、乳腺癌細胞株SK-BR-3（ＨＥＲ２受容体を過剰発現）および乳癌細胞株 MCF-7（ＨＥＲ２受容体を低発現）の生存率を、種々のナノフィチン濃度で測定した。SK-BR-3細胞では、用量依存的な細胞毒性誘導が観察されたが、逆にMCF-7細胞では有意な変化は観察されなかった。細胞死誘導は、Ａｆｆ０１が内在化を引き起こし、ＨＥＲ２受容体を介してＰｅ３８が効果的にトランスポートされることを実証した。
実施例３：アフィチンＡｆｆ０２とIRDye800CW-マレイミドのカップリング
IRDye800CW-マレイミドは、この蛍光体IRDye800CWの活性化形態をアフィチンＡｆｆ０２（配列番号２）のＣ末端の反応性システインタグに結合させるために購入した（Li－Cor Inc.、米国）。
末端のフリーのシステインは反応性が高いため、ストック溶液中でのタンパク質の二量体形成につながる。２つのモノマーのＣｙｓ末端残基間のジスルフィド結合は、酸素の存在下で実際に形成される。そこで、コンジュゲーションに先立ち、Ａｆｆ０２ストック溶液を還元するステップを実施した。Ａｆｆ０２のストック溶液をリン酸緩衝液（0.02 M リン酸、0.054 M KCl、0.274 M NaCl、pH 7.4）中でマイルドな還元剤（ＴＣＥＰ）とインキュベーションすることにより還元した。具体的には、５ｍｇのアフィチンＡｆｆ０２に５０μＬの０．５ＭのＴＣＥＰを加え、室温で１～１６時間（好ましくは１６時間）インキュベートした。PD-10脱塩カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーでＴＣＥＰを除去した後、ＤＭＳＯ中のIRDye800CW-マレイミド（１０当量）を加えてカップリングを行った。室温で一晩振盪した後、粗生成物を、アフィチン上のヘキサヒスチジンタグの存在を利用するNi-NTA樹脂上の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製した。
コンジュゲートIRDye800CW-Aff02を含むフラクションを回収し、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計による２３０～８３０ｎｍの光学密度測定、ＳＥ－ＨＰＬＣ（図１参照）およびＲＰ－ＨＰＬＣによる特性評価を行った。IRDye800CW-Aff02は２．３４ｍｇ／ｍＬの濃度で得られた（モル消光係数：12051.52 M－1cm－1)。
また、二量体タンパク質の還元を確認するため、ＲＰ－ＨＰＬＣ分析を行った。IRDye800CWをコンジュゲートさせた二量体およびＡｆｆ０２のクロマトグラムから、コンジュゲート前にジスルフィド架橋の還元が効率的に行われていることが確認された。
IRDye800CW-マレイミドは、この蛍光体IRDye800CWの活性化形態をアフィチンＡｆｆ０２（配列番号２）のＣ末端の反応性システインタグに結合させるために購入した（Li－Cor Inc.、米国）。
末端のフリーのシステインは反応性が高いため、ストック溶液中でのタンパク質の二量体形成につながる。２つのモノマーのＣｙｓ末端残基間のジスルフィド結合は、酸素の存在下で実際に形成される。そこで、コンジュゲーションに先立ち、Ａｆｆ０２ストック溶液を還元するステップを実施した。Ａｆｆ０２のストック溶液をリン酸緩衝液（0.02 M リン酸、0.054 M KCl、0.274 M NaCl、pH 7.4）中でマイルドな還元剤（ＴＣＥＰ）とインキュベーションすることにより還元した。具体的には、５ｍｇのアフィチンＡｆｆ０２に５０μＬの０．５ＭのＴＣＥＰを加え、室温で１～１６時間（好ましくは１６時間）インキュベートした。PD-10脱塩カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーでＴＣＥＰを除去した後、ＤＭＳＯ中のIRDye800CW-マレイミド（１０当量）を加えてカップリングを行った。室温で一晩振盪した後、粗生成物を、アフィチン上のヘキサヒスチジンタグの存在を利用するNi-NTA樹脂上の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製した。
コンジュゲートIRDye800CW-Aff02を含むフラクションを回収し、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計による２３０～８３０ｎｍの光学密度測定、ＳＥ－ＨＰＬＣ（図１参照）およびＲＰ－ＨＰＬＣによる特性評価を行った。IRDye800CW-Aff02は２．３４ｍｇ／ｍＬの濃度で得られた（モル消光係数：12051.52 M－1cm－1)。
また、二量体タンパク質の還元を確認するため、ＲＰ－ＨＰＬＣ分析を行った。IRDye800CWをコンジュゲートさせた二量体およびＡｆｆ０２のクロマトグラムから、コンジュゲート前にジスルフィド架橋の還元が効率的に行われていることが確認された。
実施例４：ＨＥＲ２受容体に対する非標識アフィチンＡｆｆ０２－０のin vitroアフィニティーアッセイ
標的ＨＥＲ２に対する本発明のポリペプチドの親和性を、Biolayer interferometry assayにより測定した。この目的のために、プロテインＡバイオセンサー（ForteBio）を、ヒトＨＥＲ２（ｈＨＥＲ２）組換えタンパク質でコーティングした。ＰＢＳで簡単に洗浄した後、コーティングされたセンサーを、種々の濃度（すなわち、１００００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．３、１５．６および０ｎＭ）のアフィチンＡｆｆ０２－０に対しアッセイした。
次いで、解離平衡定数を決定するため曲線フィッティング解析を行った。センサーグラムを Octet Data Analysis ソフトウェア 8.2（ForteBio）を用いて１：１結合フィットモデルで解析し、解離平衡定数（Ｋｄ）と関連する会合および解離速度定数（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）を決定し、Ｒ２値でフィッティングの質を評価した。
その結果、以下の表１にまとめたように、Ａｆｆ０２－０アフィチンに関連するＫｄはナノモル領域、具体的には、Ｋｄは１．８±０．１ｘ１０－８Ｍであることを示した。
標的ＨＥＲ２に対する本発明のポリペプチドの親和性を、Biolayer interferometry assayにより測定した。この目的のために、プロテインＡバイオセンサー（ForteBio）を、ヒトＨＥＲ２（ｈＨＥＲ２）組換えタンパク質でコーティングした。ＰＢＳで簡単に洗浄した後、コーティングされたセンサーを、種々の濃度（すなわち、１００００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．３、１５．６および０ｎＭ）のアフィチンＡｆｆ０２－０に対しアッセイした。
次いで、解離平衡定数を決定するため曲線フィッティング解析を行った。センサーグラムを Octet Data Analysis ソフトウェア 8.2（ForteBio）を用いて１：１結合フィットモデルで解析し、解離平衡定数（Ｋｄ）と関連する会合および解離速度定数（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）を決定し、Ｒ２値でフィッティングの質を評価した。
その結果、以下の表１にまとめたように、Ａｆｆ０２－０アフィチンに関連するＫｄはナノモル領域、具体的には、Ｋｄは１．８±０．１ｘ１０－８Ｍであることを示した。
実施例５：IRDye800CW-Aff02コンジュゲートのＨＥＲ２受容体に対するin vitroアフィニティーアッセイ
IRDye800CW-Aff02コンジュゲートのターゲットＨＥＲ２への親和性を、Biolayer interferometry assayにより測定した。この目的のために、プロテインＡバイオセンサー（ForteBio）を、ヒトＨＥＲ２（ｈＨＥＲ２）組換えタンパク質でコーティングした。ＰＢＳで簡単に洗浄した後、コーティングされたセンサーを、種々の濃度（すなわち、１００００、１０００、１００、１０、１、０．１ｎｇ／ｍＬ）のIRDye800CW-Aff02コンジュゲートに対してアッセイを行った。
解離平衡定数を決定するために、定常解析を行った。センサーグラムを Octet Data Analysis ソフトウェア 8.2（ForteBio）を用いて１：１結合フィットモデルで解析し、解離平衡定数（Ｋｄ）を決定した。その結果、表２に示されるように、IRDye800CW-Aff02コンジュゲートに関連するＫｄがナノモル領域で示された。
これらのデータから、アフィチンＡｆｆ０２のＣ末端システインに蛍光体をカップリングしても、非標識のＡｆｆ０２－０と比較してＫｄは大きく変化しないことが示された。
IRDye800CW-Aff02コンジュゲートのターゲットＨＥＲ２への親和性を、Biolayer interferometry assayにより測定した。この目的のために、プロテインＡバイオセンサー（ForteBio）を、ヒトＨＥＲ２（ｈＨＥＲ２）組換えタンパク質でコーティングした。ＰＢＳで簡単に洗浄した後、コーティングされたセンサーを、種々の濃度（すなわち、１００００、１０００、１００、１０、１、０．１ｎｇ／ｍＬ）のIRDye800CW-Aff02コンジュゲートに対してアッセイを行った。
解離平衡定数を決定するために、定常解析を行った。センサーグラムを Octet Data Analysis ソフトウェア 8.2（ForteBio）を用いて１：１結合フィットモデルで解析し、解離平衡定数（Ｋｄ）を決定した。その結果、表２に示されるように、IRDye800CW-Aff02コンジュゲートに関連するＫｄがナノモル領域で示された。
これらのデータから、アフィチンＡｆｆ０２のＣ末端システインに蛍光体をカップリングしても、非標識のＡｆｆ０２－０と比較してＫｄは大きく変化しないことが示された。
実施例６：Ａｆｆ０２ポリペプチドとトラスツズマブまたはペルツズマブとの競合ＥＬＩＳＡ
ＨＥＲ２陽性腫瘍の治療薬として実際に使用されているヒト化モノクローナル抗体であるトラスツズマブおよびペルツズマブが認識するＨＥＲ２／Ｎｅｕ抗原のエピトープとＡｆｆ０２ポリペプチドが認識するエピトープが異なるかを調べるために、競合ＥＬＩＳＡアッセイを開発した。
アッセイの質を評価することを目的とした最初の実験は、トラスツズマブおよびトラスツズマブ－ビオチンとの間で実施した競合ＥＬＩＳＡアッセイであった。簡単に言えば、Medisorp透明プラスチックプレート（96ウェル、Thermo Scientific）に、ＴＢＳ ｐＨ７．４中の２．５μｇ／ｍＬのＨＥＲ２／Ｆｃキメラ蛋白質をコーティングした（64ウェル）（１時間、ＲＴ）。ウェルをＴＢＳ中の０．５％ＢＳＡでブロッキングした（１時間、ＲＴ）。
次に、種々の濃度のトラスツズマブ（１．６、０．８、０．４、０．２、０．１、０．０５、０．０２５、０μｇ／ｍＬ）を０．２μg／ｍＬのトラスツズマブ－ビオチンと共に、各ウェル３連で、ＴＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ－Ｔ）中でインキュベート（室温にて１時間）した。インキュベーションの最後に、プレートを２５０μＬのＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ＴＢＳ－Ｔ中のストレプトアビジン－ＨＲＰ １：１００００とインキュベートした（室温にて１時間）。プレートをＴＢＳ－Ｔで再度３回洗浄し、ＴＭＢ試薬（１００μＬ）で５分間展開した。反応を５０μＬの硫酸（２Ｍ）でブロッキングし、４５０ｎｍで読み取った。
次に、同じ実験を、Ａｆｆ０２対トラスツズマブ－ビオチンまたはペルツズマブ－ビオチンの３つの別のアッセイで行った。
アッセイａ）種々の濃度（１００００、１０００、１００、１０、１、０．１および０．０１ｎｇ／ｍＬ）のＡｆｆ０２を０．２μｇ／ｍＬのトラスツズマブ－ビオチンまたはペルツズマブ－ビオチンと共に各ウェルに３連でインキュベートした。陽性対照として、ストレプトアビジン－ＨＲＰの代わりに抗ＲＳＧＨ ＴＡＧ－ＨＲＰ（１：４０００）を用いて同じ実験を繰り返し、ＨＥＲ２受容体に対するＡｆｆ０２の曲線親和性を評価した。図２にプロットされたＥＬＩＳＡ結果から、トラスツズマブ－ビオチン、ペルツズマブ－ビオチン、Ａｆｆ０２はいずれもＨＥＲ２受容体に結合するが、トラスツズマブとペルツズマブが認識するエピトープは、Ａｆｆ０２アフィチンが認識するエピトープとは異なっていることが示唆された。
アッセイｂ）さらなる競合ＥＬＩＳＡ実験は、固定したＡｆｆ０２濃度の存在下でトラスツズマブ－ビオチンおよびペルツズマブ－ビオチンの可変濃度を用いて実施した。簡潔には、Medisorp透明プラスチックプレート（96ウェル、Thermo Scientific）を、TBS pH7.4中の2.5μg/mLのHer2/Fcキメラ蛋白でコーティングした（64ウェル）（1時間、RT）。このウェルをTBS中の0.5% BSAでブロッキングした（1時間、RT）。次に、各ウェルにて二重で、種々の濃度（２００００、２０００、２００、２０、２、０．２、０．０２およびｎｇ／ｍＬ）のトラスツズマブ－ビオチンを10μg/mLのAff02とともにTBS + 0.1% Tween 20（TBS－T）中でインキュベートした（1時間、RT）。インキュベーション終了後、プレートを３００μＬのＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ストレプトアビジン－HRP 1:10000 または抗RSGH TAG－HRP 1:4000（TBS－T中）とインキュベートした（1時間、RT）。プレートをＴＢＳ－Ｔで再度３回洗浄し、ＴＭＢ試薬（１００μＬ）で５分間展開した。反応を５０μＬの硫酸（２Ｍ）でブロッキングし、４５０ｎｍで読み取った。
ＥＬＩＳＡの結果から、抗ＲＳＧＨ－Ｔａｇ Ａｂで検出されたＡｆｆ０２の曲線は、トラスツズマブ－ビオチンまたはペルツズマブ－ビオチンが増加した場合、反応の減少は無視できるほどであることが明らかである（それぞれ図３ａおよび３ｂを参照）。
アッセイｃ）前回の競合ＥＬＩＳＡと同じ実験条件で、緩衝液（競合なし）及びＡｆｆ０２（競合）に対して、可変濃度のトラスツズマブ－ビオチン及びペルツズマブ－ビオチンを用いて、別の競合ＥＬＩＳＡアッセイを行った。
全体として、Ａｆｆ０２アフィチンの有無にかかわらず、トラスツズマブとペルツズマブの曲線は同等であったため、標的分子間の競合は見られなかった（それぞれ図４ａおよび４ｂを参照）。
図から明らかなように、Ａｆｆ０２はＨＥＲ２に対する結合特性を保持しており、その受容体に対する特異性は２つの参照抗体の存在によって影響を受けないことがわかった。実際、競合試験により、Ａｆｆ０２が認識するエピトープは、トラスツズマブおよびペルツズマブモノクローナル抗体が認識するエピトープとは別のものであり、ＨＥＲ２への結合を競合しないことが実証された。
ＨＥＲ２陽性腫瘍の治療薬として実際に使用されているヒト化モノクローナル抗体であるトラスツズマブおよびペルツズマブが認識するＨＥＲ２／Ｎｅｕ抗原のエピトープとＡｆｆ０２ポリペプチドが認識するエピトープが異なるかを調べるために、競合ＥＬＩＳＡアッセイを開発した。
アッセイの質を評価することを目的とした最初の実験は、トラスツズマブおよびトラスツズマブ－ビオチンとの間で実施した競合ＥＬＩＳＡアッセイであった。簡単に言えば、Medisorp透明プラスチックプレート（96ウェル、Thermo Scientific）に、ＴＢＳ ｐＨ７．４中の２．５μｇ／ｍＬのＨＥＲ２／Ｆｃキメラ蛋白質をコーティングした（64ウェル）（１時間、ＲＴ）。ウェルをＴＢＳ中の０．５％ＢＳＡでブロッキングした（１時間、ＲＴ）。
次に、種々の濃度のトラスツズマブ（１．６、０．８、０．４、０．２、０．１、０．０５、０．０２５、０μｇ／ｍＬ）を０．２μg／ｍＬのトラスツズマブ－ビオチンと共に、各ウェル３連で、ＴＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ－Ｔ）中でインキュベート（室温にて１時間）した。インキュベーションの最後に、プレートを２５０μＬのＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ＴＢＳ－Ｔ中のストレプトアビジン－ＨＲＰ １：１００００とインキュベートした（室温にて１時間）。プレートをＴＢＳ－Ｔで再度３回洗浄し、ＴＭＢ試薬（１００μＬ）で５分間展開した。反応を５０μＬの硫酸（２Ｍ）でブロッキングし、４５０ｎｍで読み取った。
次に、同じ実験を、Ａｆｆ０２対トラスツズマブ－ビオチンまたはペルツズマブ－ビオチンの３つの別のアッセイで行った。
アッセイａ）種々の濃度（１００００、１０００、１００、１０、１、０．１および０．０１ｎｇ／ｍＬ）のＡｆｆ０２を０．２μｇ／ｍＬのトラスツズマブ－ビオチンまたはペルツズマブ－ビオチンと共に各ウェルに３連でインキュベートした。陽性対照として、ストレプトアビジン－ＨＲＰの代わりに抗ＲＳＧＨ ＴＡＧ－ＨＲＰ（１：４０００）を用いて同じ実験を繰り返し、ＨＥＲ２受容体に対するＡｆｆ０２の曲線親和性を評価した。図２にプロットされたＥＬＩＳＡ結果から、トラスツズマブ－ビオチン、ペルツズマブ－ビオチン、Ａｆｆ０２はいずれもＨＥＲ２受容体に結合するが、トラスツズマブとペルツズマブが認識するエピトープは、Ａｆｆ０２アフィチンが認識するエピトープとは異なっていることが示唆された。
アッセイｂ）さらなる競合ＥＬＩＳＡ実験は、固定したＡｆｆ０２濃度の存在下でトラスツズマブ－ビオチンおよびペルツズマブ－ビオチンの可変濃度を用いて実施した。簡潔には、Medisorp透明プラスチックプレート（96ウェル、Thermo Scientific）を、TBS pH7.4中の2.5μg/mLのHer2/Fcキメラ蛋白でコーティングした（64ウェル）（1時間、RT）。このウェルをTBS中の0.5% BSAでブロッキングした（1時間、RT）。次に、各ウェルにて二重で、種々の濃度（２００００、２０００、２００、２０、２、０．２、０．０２およびｎｇ／ｍＬ）のトラスツズマブ－ビオチンを10μg/mLのAff02とともにTBS + 0.1% Tween 20（TBS－T）中でインキュベートした（1時間、RT）。インキュベーション終了後、プレートを３００μＬのＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ストレプトアビジン－HRP 1:10000 または抗RSGH TAG－HRP 1:4000（TBS－T中）とインキュベートした（1時間、RT）。プレートをＴＢＳ－Ｔで再度３回洗浄し、ＴＭＢ試薬（１００μＬ）で５分間展開した。反応を５０μＬの硫酸（２Ｍ）でブロッキングし、４５０ｎｍで読み取った。
ＥＬＩＳＡの結果から、抗ＲＳＧＨ－Ｔａｇ Ａｂで検出されたＡｆｆ０２の曲線は、トラスツズマブ－ビオチンまたはペルツズマブ－ビオチンが増加した場合、反応の減少は無視できるほどであることが明らかである（それぞれ図３ａおよび３ｂを参照）。
アッセイｃ）前回の競合ＥＬＩＳＡと同じ実験条件で、緩衝液（競合なし）及びＡｆｆ０２（競合）に対して、可変濃度のトラスツズマブ－ビオチン及びペルツズマブ－ビオチンを用いて、別の競合ＥＬＩＳＡアッセイを行った。
全体として、Ａｆｆ０２アフィチンの有無にかかわらず、トラスツズマブとペルツズマブの曲線は同等であったため、標的分子間の競合は見られなかった（それぞれ図４ａおよび４ｂを参照）。
図から明らかなように、Ａｆｆ０２はＨＥＲ２に対する結合特性を保持しており、その受容体に対する特異性は２つの参照抗体の存在によって影響を受けないことがわかった。実際、競合試験により、Ａｆｆ０２が認識するエピトープは、トラスツズマブおよびペルツズマブモノクローナル抗体が認識するエピトープとは別のものであり、ＨＥＲ２への結合を競合しないことが実証された。
実施例７：コンジュゲートIRDye800CW-Aff02のin vivo生体内分布
IRDye800CW-Aff02のin vivo光学イメージング生体内分布の評価を健常マウスで行った。IRDye800CW-Aff02を１０ｎｍｏｌ／マウスの用量で０．２ｍＬ投与し、IVIS Spectrumシステムを用いて３匹の健常マウスを用いた光イメージング実験を行った。実験は、コンジュゲートの静脈内投与後、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、２４時間、４８時間に実施した。
各時点の蛍光画像について、マウスの基準バックグラウンドである健常部分（後肢筋）および全身に関心領域（ＲＯＩ）を描き、平均放射効率で表した組織内の信号強度を評価した（図５参照、Balb/c nu/nuマウスに投与したIRDye800CW-Aff02（１０ｎｍｏｌ／マウス）の蛍光シグナル曲線を示した）。
信号の薬物動態解析は，単指数減衰モデルを用いて被験物質の半減期を評価し，結果をTable 3に示した。
こうして得られた２つの半減期計算値は一致し、平均値は2.16時間であった。得られた生物学的半減期の値から、Ａｆｆ０２コンジュゲートは、例えば光学イメージングなどの高速イメージングプロトコルに使用する代替ツールとして適している。
屠殺後、残存蛍光の測定のためにいくつかの器官を収集した（４８時間後）。蛍光信号強度の測定は、各サンプルの中心部にある関心領域（ＲＯＩ）を選択し、各臓器の分析から得られたものである。解析した臓器は、腎臓、肺、脾臓、肝臓、筋肉、心臓である。
図６は、１０ｎｍｏｌ／マウスの用量で注射した４８時間後の健康なマウスにおけるIRDye800CW-Aff02の生体外分布を示している。腎臓におけるIRDye800CW-Aff02の高い取り込みは、肝胆道系ではなく腎臓経路で好ましく排出されることを示している。
IRDye800CW-Aff02のin vivo光学イメージング生体内分布の評価を健常マウスで行った。IRDye800CW-Aff02を１０ｎｍｏｌ／マウスの用量で０．２ｍＬ投与し、IVIS Spectrumシステムを用いて３匹の健常マウスを用いた光イメージング実験を行った。実験は、コンジュゲートの静脈内投与後、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、２４時間、４８時間に実施した。
各時点の蛍光画像について、マウスの基準バックグラウンドである健常部分（後肢筋）および全身に関心領域（ＲＯＩ）を描き、平均放射効率で表した組織内の信号強度を評価した（図５参照、Balb/c nu/nuマウスに投与したIRDye800CW-Aff02（１０ｎｍｏｌ／マウス）の蛍光シグナル曲線を示した）。
信号の薬物動態解析は，単指数減衰モデルを用いて被験物質の半減期を評価し，結果をTable 3に示した。
こうして得られた２つの半減期計算値は一致し、平均値は2.16時間であった。得られた生物学的半減期の値から、Ａｆｆ０２コンジュゲートは、例えば光学イメージングなどの高速イメージングプロトコルに使用する代替ツールとして適している。
屠殺後、残存蛍光の測定のためにいくつかの器官を収集した（４８時間後）。蛍光信号強度の測定は、各サンプルの中心部にある関心領域（ＲＯＩ）を選択し、各臓器の分析から得られたものである。解析した臓器は、腎臓、肺、脾臓、肝臓、筋肉、心臓である。
図６は、１０ｎｍｏｌ／マウスの用量で注射した４８時間後の健康なマウスにおけるIRDye800CW-Aff02の生体外分布を示している。腎臓におけるIRDye800CW-Aff02の高い取り込みは、肝胆道系ではなく腎臓経路で好ましく排出されることを示している。
参考文献
1. Slamon D.J. et al., Science 1989, 244, 707-712
2. McAfee J.G. et al, Biochemistry 1995, 34, 10063-10077
3. Mouratou B. et al, PNAS 2007, 104(46), 17983-17988
4. Goux M. et al., Bioconjugated Chem. 2017, 28, 2361-2371
5. WO2009/080810 A1
6. Orlova A. et al., Cancer Res. 2006, 66(8), 4339-4348
7. WO2012/096760 A1
8. WO2017/161096 A1
9. Bornhorst J.A. et al, Methods Enzymol. 2000, 326, 245-254
10. Huet S. et al, PLoS ONE 2015, 10(11): e0142304
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9. Bornhorst J.A. et al, Methods Enzymol. 2000, 326, 245-254
10. Huet S. et al, PLoS ONE 2015, 10(11): e0142304
Claims (15)
- 配列番号１に記載のアミノ酸配列を含んでなる、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に特異的に結合するポリペプチド。
- 配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなる、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
- 配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる、請求項３に記載のポリペプチド。
- イメージング剤と結合している、請求項１～４のいずれかに記載のポリペプチド。
- イメージング剤が、フルオロフォア部分、磁性または常磁性部分、放射性標識同位体、アフィニティー標識、Ｘ線応答性部分、超音波応答性部分、光音響応答性イメージング部分およびナノ粒子ベースの部分からなる群から選択される、請求項５に記載のポリペプチド。
- 蛍光体部分がシアニン色素である、請求項６に記載のポリペプチド。
- 放射性標識同位体が、１８Ｆ，１２４Ｉ，１１Ｃ，６４Ｃｕ，６８Ｇａ，８９Ｚｒ，４４Ｓｃおよび９９ｍＴｃおよびインジウム、ガリウム、イットリウム、ビスマス、ラジオアクチニドおよびラジオランタニドの他の放射性同位体から選択される、請求項６に記載のポリペプチド。
- アフィニティー標識がビオチンである、請求項６に記載のポリペプチド。
- ＨＥＲ２の過剰発現に起因するおよび／または関連する癌疾患の診断または可視化に使用するための、請求項５～９のいずれかに記載のポリペプチド。
- 前記癌疾患が、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌及び消化器系の癌から選択される、請求項１０に記載の使用のためのポリペプチド。
- 前記診断または可視化が、ＨＥＲ２を発現する身体組織または器官系のイメージングを含む、請求項１０に記載の使用のためのポリペプチド。
- 請求項５～１２に記載のポリペプチドを、薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤および／または添加剤とともに含む診断用またはイメージング用組成物。
- ＨＥＲ２を過剰発現している臓器及び組織のイメージングに使用するための、請求項１３に記載の組成物。
- 前記イメージングが、磁気共鳴、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波（ＵＳ）、光音響イメージング（ＰＡＩ）、近赤外線蛍光（ＮＩＲＦ）及び単一光子放射コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）から選択されるイメージング技術に基づく、又は光イメージング（ＯＩ）と相関する、請求項１４に記載の組成物。
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|---|---|---|---|
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