KR20130034043A - 폴리펩타이드 - Google Patents

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KR20130034043A
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Abstract

본 발명은 알부민에 대해 결합친화성을 갖는 일종의 조작형 폴리펩타이드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 폴리펩타이드 및 기타 화합물을 다양한 조건에서 알부민에 결합시키는 것을 활용하는 신규 방법 및 용도에 관한 것으로, 이들 중 일부는 인간을 비롯한 포유동물의 질병 치료 또는 진단용으로 중요하다.

Description

폴리펩타이드{POLYPEPTIDES}
본 발명은 알부민에 대해 결합친화성을 갖는 일종의 조작형 폴리펩타이드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 폴리펩타이드 및 기타 화합물을 다양한 조건에서 알부민에 결합시키는 것을 활용하는 신규 방법 및 용도에 관한 것으로, 이들 중 일부는 인간을 비롯한 포유동물의 질병 치료용으로 중요하다.
혈청 알부민
혈청 알부민은 포유동물 혈청 내에서 가장 풍부한 단백질(40 g/l; 인간의 경우 대략 0.7 mM)이며, 그 기능 중 하나는 지질 및 빌리루빈과 같은 분자와 결합하는 것이다(Peters, Advances in Protein Chemistry 37:161, 1985). 혈청 알부민에는 효소 기능이나 면역적 기능이 없다. 또한, 인간 혈청 알부민(HSA)은 수많은 자연 분자는 물론 치료 분자를 내인성 수송하고 전달시키는데 관여하는 자연 운반체이다(Sellers and Koch-Weser, Albumin Structure, Function and Uses, eds Rosenoer et al, Pergamon, Oxford, p 159, 1977). 혈청 알부민의 반감기는 동물 크기에 정비례하며, 예를 들어 인간의 혈청 알부민의 반감기는 19일이고, 토끼의 혈청 알부민의 반감기는 약 5일이다(McCurdy et al, J Lab Clin Med 143:115, 2004). HSA는 몸 전체에 걸쳐 넓게, 특히는 간질분획 및 혈액구획에 분포되어 삼투압의 유지에 주로 관여한다. 구조적으로, 알부민은 3개의 상동 도메인을 포함하며, 총 584개 또는 585개의 아미노산으로 된 단일사슬 단백질이다(Dugaiczyk et al, Proc Natl Acad Sci USA 79:71, 1982). 알부민은 17개의 디설파이드 브릿지, 및 34번 위치에 단일 반응성 티올, 시스테인을 함유하지만, N-연결 및 O-연결 카보하이드레이트 잔기가 결여되어 있다(Peters, 1985, supra; Nicholson et al, Br J Anaesth 85:599, 2000).
HSA와의 융합 또는 조합은 단백질의 체내 반감기를 증가시킴
단백질을 혈청 알부민에 직접 공유결합시키거나, 또는 혈청 알부민으로의 체내 조합을 허용하는 펩타이드 또는 단백질에 직접 공유결합시키는 여러 가지 방안이 보고되었다. 후자 기법의 예가 WO 91/01743, WO 01/45746 및 Dennis et al (J Biol Chem 277:35035-43, 2002)에 기재되어 있다. 첫 번째 문헌은, 그 중에서도, 다른 단백질의 반감기를 증가시키기 위한, 연쇄상구균성 단백질 G(SpG)로부터 유도된 알부민 결합 펩타이드 또는 단백질의 용도를 기재한다. 이의 발상은 박테리아에서 유래한 알부민 결합 펩타이드/단백질을 혈액으로부터 빠르게 제거되는 것으로 밝혀진 치료상 유리한 펩타이드/단백질로 융합시키는 것이다. 이렇게 생성된 융합 단백질은 체내 혈청 알부민에 결합되어, 상기 단백질의 반감기를 증가시키는 이점을 제공하며, 이는 치료상 유리한 융합 펩타이드/단백질의 순 반감기를 증가시킨다. WO 01/45746 및 Dennis et al의 문헌은 동일한 개념에 관한 것이지만, 이들 문헌에서 저자들은 혈청 알부민에 결합시키기 위해 상대적으로 짧은 펩타이드를 활용한다. 이러한 펩타이드는 파지 디스플레이된 펩타이드 라이브러리에서 선택한다. Dennis et al의 문헌에서는, 인간의 보체 수용체 유형 1로 연쇄상구균성 단백질 G의 알부민 결합 도메인이 재조합 융합되는 것에 대한 면역반응이 향상되었음이 밝혀진 이전의 연구를 언급하였다. 또한 US 2004/0001827(Dennis)로 공개된 미국특허출원은, 역시 파지 디스플레이 기술로 확인된, 혈청 알부민에 결합되며 종양 표적을 위한 생리활성 물질에 접합되는 펩타이드 리간드를 포함한 구조의 용도를 개시한다.
박테리아성 수용체 단백질의 알부민 결합 도메인
연쇄상구균성 단백질 G(SpG)는 연쇄상구균의 특정 스트레인의 표면에 존재하는 2관능성 수용체이며, IgG 및 혈청 알부민 모두에 결합될 수 있다(Bjorck et al, Mol Immunol 24:1113, 1987). SpG는 구조적, 관능적으로 상이한 몇몇 도메인이 매우 반복적으로 이루어진(Guss et al, EMBO J 5:1567, 1986), 더 정확하게는 3개의 Ig-결합 도메인과 3개의 혈청 알부민 결합 도메인으로 이루어진(Olsson et al, Eur J Biochem 168:319, 1987) 구조를 가진다. SpG 내 3개의 혈청 알부민 결합 도메인 중 하나의 구조는 3중 나선 번들 접힘 상태를 나타내는 것으로 정해졌다(Kraulis et al, FEBS Lett 378:190, 1996, Johansson et al, J. Biol. Chem. 277:8114-20, 2002). 46번 아미노산 모티프는 ABD(알부민 결합 도메인)로 정의되었으며, 추후에 G148-GA3(단백질 G-관련 알부민 결합을 위한 GA)으로도 지칭되어 왔다. 예를 들어 WO 09/016043에는, 46번 아미노산 모티프 ABD의 알부민 결합 변이체들이 개시되어 있다.
단백질 G에 있는 것들 이외의 다른 박테리아성 알부민 결합 도메인도 확인되었으며, 이들 중 일부는 단백질 G의 것과 구조적으로 비슷하다. 이러한 알부민 결합 도메인을 함유한 단백질의 예로 PAB, PPL, MAG 및 ZAG 단백질이 있다(Rozak et al., Biochemistry 45:3263-3271, 2006). 가령 Johansson과 그의 동료들은 이러한 알부민 결합 도메인의 구조와 기능에 대한 연구를 수행하여 보고하였다(Johansson et al, J Mol Biol 266:859-865, 1997). 또한, Rozak et al은 G148-GA3의 인위적 변이체 생성에 대해 보고하였으며, 이들 인위적 변이체를 선택한 후 다양한 종들의 특이성 및 안정성에 관해 연구(Rozak et al, Biochemistry 45:3263-3271, 2006)한 반면에; Jonsson et al은 인간 혈청 알부민에 대한 친화성이 매우 향상된 G148-GA3의 인위적 변이체를 개발하였다(Jonsson et al, Prot Eng Des Sel 21:515-27, 2008). 일부 변이체의 경우, 열 안정성을 낮춤으로써 더 높은 친화성을 얻었다.
전술된 3중 나선-함유 단백질 외에도, 알부민과 결합되는 기타 관련없는 박테리아성 단백질도 있다.
ABD 및 면역
최근, 연쇄상구균성 단백질 G 스트레인 148(G148)의 알부민 결합 부위 내에서 몇몇의 T- 및 B-세포 에피토프(항원결정자)가 실험을 통해 확인되었다(Goetsch et al, Clin Diagn Lab Immunol 10:125-32, 2003). 이 연구의 배후에 있는 저자들은 백신 내 G148의 T-세포 에피토프를 활용하는 것, 즉, 알부민 결합 부위의 고유 면역 증진 특성을 활용하는 것에 흥미가 있었다. Goetsch et al은 또한 G148의 서열에서, B-세포 에피토프, 즉, 면역요법 후 항체가 결합되는 부위를 추가로 발견하였다.
인간에게 투여되는 약학적 조성물에서는 면역반응이 전혀 바람직하지 않다. 따라서, 알부민 결합 도메인 G148은 상기 언급한 면역증진 특성으로 인해 그 자체로 상기 조성물에 사용하기에 적합하지 않다.
본 발명은 폴리펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 선행 기술의 단점 및 결함은 하기 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 알부민 결합 폴리펩타이드인 제1 양태에 의해 극복되거나 경감된다:
i) LAX3AKX6X7ANX10 ELDX14YGVSDF YKRLIX26KAKT VEGVEALKX39X40 ILX43X44LP
(서로 독립적인
X3은 E, S, Q 및 C 중에서 선택되고;
X6은 E, S 및 C 중에서 선택되고;
X7은 A 및 S 중에서 선택되고;
X10은 A, S 및 R 중에서 선택되고;
X14는 A, S, C 및 K 중에서 선택되고;
X26은 D 및 E 중에서 선택되고;
X39는 D 및 E 중에서 선택되고;
X40은 A 및 E 중에서 선택되고;
X43은 A 및 K 중에서 선택되고;
X44는 A, S 및 E 중에서 선택되고;
45번 위치에 있는 L은 존재하거나 부재하고;
46번 위치에 있는 P는 존재하거나 부재함); 및
ii) i)에 정의된 서열과 적어도 95% 상동성을 갖는 아미노산 서열.
알부민에 대한 결합친화성을 갖는 상기 정의된 종류의 서열과 관련된 폴리펩타이드는, 3중 알파 나선 번들 도메인으로 접히는 공통 모체(parent) 폴리펩타이드 서열로부터 유도된다. 더 구체적으로, 전술된 바와 같은 폴리펩타이드는 혈청 알부민과 알부민 결합 도메인 G148-GA3 사이의 착물의 구조에 근거한 모델 빌딩으로부터 유도(Lejon et al, J Biol Chem 279:42924-8, 2004)될뿐만 아니라, 상기 공통 모체 폴리펩타이드 서열의 많은 돌연변이성 변이체의 결합 및 구조적 특성의 분석에 근거한 모델 빌딩으로부터 유도된다. 거의 동일한 3중 나선 번들 도메인으로 접힐 것으로 예상되는 일종의 폴리펩타이드를 생성시키는 모체 폴리펩타이드 서열에 비해, 상기 정의된 아미노산 서열 i)은 아미노산 치환기들을 포함한다. 모체 폴리펩타이드 서열이 알부민과의 상호작용을 위한 결합표면을 이미 포함하고 있지만, 이러한 결합표면은 상기 정의에 따른 치환기들 중 일부에 의해 변이된다. 상기 정의에 따른 치환기는 모체 폴리펩타이드 서열에 비해 알부민 결합 능력을 향상시킨다.
본 발명의 제1 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드는 예를 들어 인간 투여용 치료 분자에 대한 융합 또는 접합 파트너로 사용하기에 적합한 일련의 특성을 나타낸다. 본 발명에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드는, 예를 들어 알부민 결합 도메인 G148-GA3과 같은 관련 알부민 결합 도메인 및 WO 09/016043에 개시된 알부민 결합 폴리펩타이드와 비교해 볼 때, 하기의 6가지 특성들 중 적어도 5가지를 나타낸다.
·폴리펩타이드는 예를 들어 G148-GA3 및 기타 박테리아에서 유래된 알부민 결합 도메인과 비교하여 상이한 표면을 나타낸다. 이 차이는 상기 박테리아성 단백질에 이전에 노출된 적이 있는 인간과 같은 대상 내 항체 반응에 대한 모든 위험을 줄이거나 제거할 수 있다.
·폴리펩타이드는 예를 들어 G148-GA3, 및 공통 모체 폴리펩타이드 서열의 기타 관련되었지만 상이한 돌연변이성 변이체보다 적은 수의 잠재성 T-세포 에피토프를 포함하며, 이에 따라 인간과 같은 대상에 투여되면 낮은 면역원성을 나타낸다.
·폴리펩타이드는 인간과 같은 대상에 투여되면 혈중항체와의 반응성이 더 낮아진다. 따라서, 혈중항체에 노출된 폴리펩타이드의 표면, 즉 알부민과의 결합 상호작용에 관여되지 않은 폴리펩타이드 표면에 있는 아미노산 치환기들에 의해, 항체 교차-반응성은, 예를 들어 인간 혈청의 시험 세트에서 측정한 경우, G148-GA3에 의해 야기된 항체 교차-반응성에 비해 감소된다.
·폴리펩타이드는, 예를 들어 박테리아성 단백질로부터 유도되는 알부민 결합 도메인과 같은 공지된 천연유래 알부민 결합 폴리펩타이드보다, KD값으로 정의되는 결합친화성이 더 높고, koff값으로 정의되는 오프-레이트(off-rate)가 더 낮다는 면에서, 높은 알부민 결합 능력을 가진다.
·폴리펩타이드에는, 예를 들어 박테리아성 단백질로부터 유도되는 알부민 결합 도메인과 같은 공지된 천연유래 알부민 결합 폴리펩타이드보다, 폴리펩타이드의 안정성 문제점과 관련이 있는 아미노산 잔기가 더 적은 개수로 포함된다. 따라서, 폴리펩타이드에는 예를 들어 산화되기 쉬운 메티오닌이나 트립토판이 없고, 아스파라긴 하나만 포함된다.
·폴리펩타이드는 WO 09/016043에 개시된 것과 같은 이전의 알부민 결합 폴리펩타이드보다 높은 구조적 안정성(융점이 55℃가 넘는 것을 특징으로 함)을 가진다.
일 구현예에서, 제1 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드는 위에 나열한 6가지 특성 모두를 나타낸다. 다른 구현예에서, 제1 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드는 알부민에 결합되면, 예를 들어 WO 09/016043에 개시된 것과 같은 이전의 알부민 결합 폴리펩타이드보다 더 강한 친수성의 프로파일을 나타낸다. 폴리펩타이드가 알부민과 상호작용할 때 주변에 노출되는 알부민 결합 폴리펩타이드의 표면은 더 적은 수의 아미노산 잔기를 포함하여, 표면에 소수성을 부여한다.
숙련자라면, 제1 양태에 따른 폴리펩타이드의 알부민 결합 능력과 같은 모든 폴리펩타이드의 기능이 폴리펩타이드의 3차 구조에 좌우된다는 것을 이해할 것이다. 그러나, 알파-나선 폴리펩타이드의 구조에 영향을 미치지 않으면서, 상기 폴리펩타이드 내 아미노산의 서열을 변경하는 것이 가능하다(Taverna and Goldstein, J Mol Biol 315(3):479-84, 2002; He et al, Proc Natl Acad Sci USA 105(38):14412-17, 2008). 따라서, i)로 정의된 종류에 속하는 서열과 적어도 95% 상동한 서열을 얻도록 변이된 i)의 변이체 역시 제1 양태에 포함된다. 예를 들어, 아미노산 잔기의 특정 관능기(예컨대, 소수성, 친수성, 극성 등)에 속하는 아미노산 잔기를 동일한 관능기로부터의 또 다른 아미노산 잔기와 치환할 수 있다.
본 명세서 및 청구항에 사용되는 바와 같은"% 상동한" 또는 "% 상동성"이란 용어는 다음과 같이 산출된다. CLUSTAL W 알고리즘을 이용하여 검색 대상 서열(query sequence)을 표적 서열에 정렬시킨다(Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)). 정렬된 서열들 중 가장 짧은 서열에 해당되는 창(window)과 비교한다. 일부 예에 의하면 정렬된 서열들 중 가장 짧은 서열은 본원에 기술되는 알부민 결합 폴리펩타이드와 같은 표적 서열일 수 있다. 다른 예에 의하면, 검색 대상 서열은 정렬된 서열들 중 가장 짧은 서열을 구성할 수 있다. 검색 대상 서열은 예를 들어 10개 이상의 아미노산 잔기, 이를테면 20개 이상의 아미노산 잔기, 30개 이상의 아미노산 잔기, 40개 이상의 아미노산 잔기, 45개 이상의 아미노산 잔기로 구성될 수 있다. 각 위치의 아미노산 잔기들을 비교하고, 표적 서열에서 동일한 일치성을 갖는 검색 대상 서열 내 위치들의 퍼센트를 % 상동성으로 보고한다.
제1 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드의 일 구현예에서, X6은 E이다.
본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드의 다른 구현예에서, X3은 S이다.
본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, X3은 E이다.
본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, X7은 A이다.
본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, X14는 S이다.
본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, X14는 C이다.
본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, X10은 A이다.
본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, X10은 S이다.
본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, X26은 D이다.
본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, X26은 E이다.
본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, X39는 D이다.
본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, X39는 E이다.
본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, X40은 A이다.
본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, X43은 A이다.
본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, X44는 A이다.
본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, X44는 S이다.
본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, 45번 위치에 L 잔기가 존재한다.
본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, 46번 위치에 P 잔기가 존재한다.
본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드의 또 다른 구현예에서, 46번 위치에 P 잔기가 존재하지 않는다
또 다른 구현예에서, 본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드는 X7이 L도, E도, D도 아니다라는 조건에 따른다.
제1 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드는, 표면이 노출된 아미노산 잔기를, 예를 들면 시스테인 또는 라이신으로 치환하는 방식으로, 적합한 접합 파트너와의 접합을 통해 제조될 수 있다. 이러한 치환은, 알부민 결합 폴리펩타이드가 혈청 알부민에 결합된 경우 혈청 알부민으로부터 가장 멀리 위치하는 나선인, 폴리펩타이드의 N-말단 나선(즉, 1번 나선)에 도입될 수 있다. 따라서, 부위특이적(site-directed) 접합이 가능해지도록 i)에 정의된 서열의 X14 위치에 있는 라이신 잔기를 이용할 수 있다. 더욱이 이는, 상기 라이신의 엡실론-아미노기의 직교성 보호를 활용할 수 있기 때문에, 분자를 펩타이드의 화학적 합성에 의해 제조한 경우에 유리할 수 있다. 또한, 부위특이적 접합이 가능해지도록 시스테인 잔기를 아미노산 서열에 도입하여도 된다. 예를 들면, 시스테인 잔기를 상기 정의에 따라 X3, X6 및/또는 X14 위치 중 임의의 한 위치에 도입할 수 있다.
접합 파트너를 라이신의 엡실론-아민, 또는 시스테인의 티올기에 커플링하는 것은, 아미노산 서열 i) 내의 아미노산 잔기를 이용하여 부위특이적 접합을 이루기 위한 두 가지 화학적으로 상이한 대안을 나타낸다. 숙련자라면 이해하듯이, 접합용 아미노산 서열을 마련하기 위한 기타 화학적 대안들이 존재하며, 본 발명의 범주 내에도 그대로 적용된다. 이러한 화학의 한 예는, Ban et al (J Am Chem Soc 132:1523-5, 2009)가 발표한 바와 같이 티로신의 도입을 통해 가능한 클릭형 화학(click-like chemistry)이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "알부민 결합" 및 "알부민에 대한 결합친화성"이란 용어들은, 가령, Biacore 기기에서와 같은 표면 플라스몬 공명 기술을 이용하여 시험가능한 폴리펩타이드의 한 특성을 가리킨다. 예를 들어 아래 실시예에서 기술되는 바와 같이, 알부민 결합친화성을 실험을 통해 시험할 수 있는데, 상기 실험에서는 알부민, 또는 알부민 조각(fragment)을 상기 기기의 센서 칩 상에 고정시킨 후에, 시험 대상 폴리펩타이드가 함유된 샘플을 칩 위로 통과시킨다. 대안으로는, 시험 대상 폴리펩타이드를 상기 기기의 센서 칩 상에 고정시킨 후, 알부민 또는 알부민 조각이 함유된 샘플을 칩 위로 통과시킨다. 이와 관련하여, 알부민은 인간의 혈청 알부민과 같이 포유동물로부터 유래된 혈청 알부민일 수 있다. 그러면 숙련자는 이러한 실험들에 의해 얻어진 결과를 해석하여, 알부민에 대한 폴리펩타이드의 결합친화성의 적어도 한 정성적 척도를 정립할 수 있게 된다. 예를 들어 상호작용에 대한 KD값을 구하기 위해 정량적 척도를 원한다면, 표면 플라스몬 공명법을 이용할 수도 있다. 결합값들이 예를 들면 Biacore 2000 기기(GE Healthcare사)에 정의되어 있을 수 있다. 이러한 측정기기의 센서 칩 상에 알부민을 적절하게 고정시킨 후, 연속희석법(serial dilution)을 통해 친화성 측정 대상인 폴리펩타이드의 샘플들을 마련하여 주입시킨다. 그런 후에는 KD값들을 예를 들면 상기 기기의 제조사(GE Healthcare사)에 의해 제공된 BIAevaluation 4.1 소프트웨어의 1:1 Langmuir 결합 모델을 이용한 결과로부터 산출할 수 있다.
일 구현예에서, 본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드는 알부민에 결합하되, 상호작용의 koff값이 5x10-5s-1 이하, 이를테면 5x10-6s- 1이하가 되도록 결합한다.
전술된 바와 같이, 아미노산 서열 i)로 정의된 바와 같은 알부민 결합 폴리펩타이드는 3중 알파 나선 번들 도메인으로 접히는 공통 모체 폴리펩타이드 서열로부터 유도된다. 일 구현예에서, 이러한 모체 폴리펩타이드 서열의 3중 나선 도메인은 연쇄상구균성 스트레인 G148, 특히 도메인 GA3으로부터의 단백질 G의 일부를 형성한다.
다른 구현예에서, 알부민 결합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1-144 및 SEQ ID NO:164-203 중에서 선택되며, 이를테면 SEQ ID NO:1-144 중 임의의 하나 중에서 선택된다. 더 구체적으로, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:4-5, SEQ ID NO:7-8, SEQ ID NO:10-11, SEQ ID NO:13-14, SEQ ID NO:16-17, SEQ ID NO:19-20, SEQ ID NO:22-23, SEQ ID NO:25-26, SEQ ID NO:28-29, SEQ ID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35, SEQ ID NO:37-38, SEQ ID NO:41-42, SEQ ID NO:49-50, SEQ ID NO:164-170 및 SEQ ID NO:192-203 중에서 선택된다. 이와 같이, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:4-5, SEQ ID NO:7-8, SEQ ID NO:10-11, SEQ ID NO:13-14, SEQ ID NO:16-17, SEQ ID NO:19-20, SEQ ID NO:22-23, SEQ ID NO:25-26, SEQ ID NO:28-29, SEQ ID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35, SEQ ID NO:37-38, SEQ ID NO:41-42 및 SEQ ID NO:49-50 중에서 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드는 i)에 정의된 서열의 N- 및/또는 C-말단에 위치되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 더 포함한다. 이들 추가 아미노산 잔기는 폴리펩타이드가 알부민에 결합하는 것을 개선하고, 접힌 알부민 결합 도메인의 배좌 안정성을 향상시키는 데에 있어서 역할을 담당할 수 있지만, 예를 들어 폴리펩타이드의 제조, 정제, 체내 또는 체외 안정화, 커플링, 표지(화)(labeling) 또는 검출뿐만 아니라 이들의 임의의 조합 중 하나 이상과 관련된 다른 목적에도 이용될 수 있다. 이러한 추가 아미노산 잔기들은 화학 결합 목적용으로, 예컨대, 친화성 기질(matrix)을 얻기 위해 크로마토그래피 수지(chromatographic resin)에 첨가되거나, 또는 방사금속과의 착화를 위한 킬레이트 모이어티에 첨가된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)을 포함할 수 있다.
따라서, 일 구현예에 의하면, 아미노산 서열 i)의 N- 또는 C-말단에서의 알파 나선 바로 앞 또는 바로 뒤에 있는 아미노산들은 배좌 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 배좌 안정성 향상에 기여할 수 있는 아미노산 잔기의 한 예는 위에 정의된 바와 같은 아미노산 서열 i)의 N-말단에 위치된 세린 잔기이다. 일부 경우에 N-말단 세린 잔기는 세린 측쇄의 감마 산소 및 글루탐산 잔기의 폴리펩타이드 주쇄 NH 사이의 수소 결합을 이용하여, 기본형(canonical) S-X-X-E 캡핑 박스를 형성할 수 있다. 이러한 N-말단 캡핑은 본 발명의 제1 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드를 구성하는 3중 나선 도메인의 제1 알파 나선을 안정화시키는데 기여할 수 있다.
이와 같이, 일 구현예에 의하면, 추가 아미노산은 폴리펩타이드의 N-말단에 적어도 하나의 세린 잔기를 포함한다. 다시 말해, 아미노산 서열 다음에는 하나 이상의 세린 잔기(들)가 위치한다. 알부민 결합 폴리펩타이드의 다른 구현예에 의하면, 추가 아미노산은 폴리펩타이드의 N-말단에 글리신 잔기를 포함한다. 아미노산 서열 i) 다음에는 하나, 둘, 셋, 넷 또는 임의의 적합한 수의 아미노산 잔기가 위치할 수 있다. 따라서, 아미노산 서열 다음에는 단일 세린 잔기, 단일 글리신 잔기 또는 이들의 조합, 이를테면 글리신-세린(GS) 조합 또는 글리신-세린-세린(GSS) 조합이 위치할 수 있는 것으로 이해된다. N-말단에 추가 아미노산 잔기를 포함하는 알부민 결합 폴리펩타이드의 예로 SEQ ID NO:145-163, 이를테면 SEQ ID NO:145-148 및 SEQ ID NO:162-163이 있다. 또 다른 구현예에 의하면, 추가 아미노산 잔기는 i) 서열로 정의된 바와 같은 폴리펩타이드의 N-말단에 글루탐산을 포함한다.
유사하게, C-말단 캡핑을 활용하여, 알부민 결합 폴리펩타이드를 구성하는 3중 나선 도메인의 제3 알파 나선의 안정성을 향상시킬 수 있다. 프롤린 잔기가 i)에 정의된 아미노산 서열의 C-말단에 존재하는 경우, 프롤린 잔기는 적어도 부분적으로는 캡핑 잔기로 기능할 수 있다. 이러한 경우, C-말단에 있는 프롤린 잔기 다음의 라이신 잔기는, 라이신 잔기의 엡실론 아미노기, 및 예컨대 L45와 P46이 모두 존재하는 경우 폴리펩타이드 주쇄 내 라이신 앞의 2번과 3번 잔기에 위치한 아미노산의 카보닐기 (즉, i)에 정의된 아미노산 서열의 류신 잔기 및 알라닌 잔기의 카보닐기) 사이의 수소 결합을 통해, 알부민 결합 폴리펩타이드의 제3 나선을 한층 더 안정화시키는데 기여할 수 있다. 이와 같이, 일 구현예에서, 추가 아미노산은 폴리펩타이드의 C-말단에 라이신 잔기를 포함한다.
위에서 논의한 바와 같이, 추가 아미노산은 알부민 결합 폴리펩타이드의 생성에 관련이 있을 수 있다. 특히, P46이 존재하는 일 구현예에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드가 펩타이드의 화학적 합성법으로 생성될 때, C-말단 프롤린 다음의 하나 이상의 선택적 아미노산 잔기가 이점을 제공할 수 있다. 이러한 추가 아미노산 잔기는 예를 들어 합성 중 디펩타이드 단계(stage)에서 디케토피페라진과 같은 바람직하지 않은 물질이 생성되는 것을 막을 수 있다. 이러한 아미노산 잔기의 한 예는 글리신이다. 따라서, 일 구현예에 의하면, 추가 아미노산은, 전술된 바와 같은 프롤린 잔기 바로 뒤 또는 추가 라이신 및/또는 글리신 잔기 바로 뒤인, 폴리펩타이드의 C-말단에 글리신 잔기를 포함한다. 대안으로, 폴리펩타이드의 생성은 아미노산 서열 i)의 C-말단 프롤린 잔기(존재하는 경우)의 아미드화 반응에 의해 이루어질 수 있다. 이 경우, C-말단 프롤린은 카복실 탄소 위치에 추가 아민기를 포함한다. 본원에 기술된 폴리펩타이드, 특히 펩타이드 합성 동안에 라세미화(racemize)되는 것으로 알려진 프롤린 또는 기타 아미노산이 C-말단에 있는 폴리펩타이드의 일 구현예에서, 상기 언급한 C-말단으로의 글리신 첨가 또는 (존재하는 경우) 프롤린의 아미드화 반응 역시 C-말단 아미노산 잔기의 라세미화와 관련하여 잠재적인 문제점에 직면할 수 있다. 만일 이러한 방식으로 아미드화된 폴리펩타이드를 화학적 합성을 통해서 보다는 재조합 수단에 의해 생성하고자 한다면, 당해 기술분야에 공지된 여러가지의 방법, 예컨대 아미드화 PAM 효소를 사용하여, C-말단 아미노산을 아미드화시킬 수 있다.
C-말단에 추가 아미노산 잔기들을 포함하는 알부민 결합 폴리펩타이드의 예로 SEQ ID NO:145-152, 이를테면 SEQ ID NO:148-150이 있다. 숙련자는 이를테면 펩타이드 합성을 위한 다양한 종류의 예비제조된 기질에 의해 C-말단을 변이시키는 방법들을 숙지하고 있다.
다른 구현예에서, 상기 추가 아미노산 잔기는 폴리펩타이드의 N- 및/또는 C-말단에 시스테인 잔기를 포함한다. 이러한 시스테인 잔기는 i)에 정의된 바와 같은 아미노산 서열 바로 앞 및/또는 바로 뒤에 있거나, 전술된 바와 같은 기타 다른 추가 아미노산 잔기들 앞 및/또는 뒤에 있을 수 있다. 폴리펩타이드 사슬의 N- 및/또는 C-말단에 시스테인 잔기를 포함하는 알부민 결합 폴리펩타이드의 예로 SEQ ID NO:149-150(C-말단) 및 SEQ ID NO:151-152(N-말단)가 있다. 시스테인 잔기를 폴리펩타이드 사슬에 첨가함으로써, 알부민 결합 폴리펩타이드의 부위특이적 접합을 위한 티올기를 얻을 수 있다. 대안으로는, 부위-특이적 접합을 용이하게 하기 위해, 시스테인 잔기를 도입시키는 것과 비슷한 방식으로, 셀레노시스테인 잔기를 폴리펩타이드 사슬의 C-말단에 도입시킬 수 있다(Cheng et al, Nat Prot 1:2, 2006).
일 구현예에서, 알부민 결합 폴리펩타이드는 2개 이하의 시스테인 잔기를 포함한다. 다른 구현예에서, 알부민 결합 폴리펩타이드는 1개 이하의 시스테인 잔기를 포함한다.
다른 구현예에서, 알부민 결합 폴리펩타이드의 추가 아미노산 잔기는 폴리펩타이드의 정제 또는 검출용 "태그(tag)"(이를테면, 헥사히스티딜(His6) 태그), 또는 해당 태그 특이적 항체와의 상호작용 및/또는 정제용 "myc"("c-Myc")태그 또는 "FLAG" 태그를 포함한다. 숙련자는 기타 대안들을 숙지하고 있다.
또 다른 구현예에 의하면, 본 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드는 인간 혈청 알부민에 결합된다. 다른 구현예에 의하면, 알부민 결합 폴리펩타이드는 인간이 아닌 다른 종에서 유래된 알부민, 이를테면 마우스, 랫트(rat), 개 및 필리핀 원숭이(cynomolgus macaque)에서 유래된 알부민에 결합된다.
위에 논의된 "추가 아미노산 잔기"는 임의의 원하는 기능, 이를테면 제1 알부민 결합 도메인과 동일한 결합 기능, 또는 다른 결합 기능, 또는 치료 기능, 또는 효소 기능, 또는 형광 기능, 또는 이들의 조합된 기능을 가진 하나 이상의 폴리펩타이드 도메인(들)을 구성할 수도 있다.
따라서, 또 다른 관련된 양태에서는
i) 본원에 기술된 바와 같은 제1 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드로 구성된 제1 모이어티; 및
ii) 원하는 생물학적 활성을 가진 폴리펩타이드로 구성된 제2 모이어티
를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 제공한다.
본 발명의 제1 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드와, 제2 모이어티를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체는 제2 모이어티 자체의 체내 반감기에 비해 제2 모이어티의 체외 및/또는 체내 반감기를 증가시킬 수 있다. 결과적으로, 본 양태에 따른 융합 단백질 또는 접합체를 인간과 같은 대상에 투여하면, 제2 모이어티에 대한 체내 노출이 증가될 수 있어, 제2 모이어티 자체만 투여하였을 때 제2 모이어티에 대한 체내 노출의 효능과 비교하여, 제2 모이어티의 생물학적 활성의 효능이 향상될 수 있다.
원하는 생물학적 활성은, 예를 들면, 치료적 활성, 결합 활성 또는 효소적 활성일 수 있다. 원하는 생물학적 활성이 치료적 활성인 경우, 이러한 활성을 나타내는 제2 모이어티는 치료 활성 폴리펩타이드일 수 있다. 치료 활성 폴리펩타이드의 비제한적 예로, 생분자(biomolecule), 이를테면 인간의 내인성 효소, 호르몬, 성장 인자, 케모킨, 시토킨 및 림포킨으로 구성된 군에서 선택된 분자; 및 비(非)-인간의 생물학적으로 활성인 단백질, 이를테면 박테리아성 독소(예컨대, 슈도모나스 균체외독소(pseudomonas exotoxin) 및 포도상구균- 및 연쇄상구균 초항원), 효소(예컨대, RNase 및 베타-락타마아제) 및 활성화 단백질(예컨대, 스트렙토키나아제)로 구성된 군에서 선택된 단백질이 있다. 알부민 결합 폴리펩타이드와의 융합 또는 접합에 유용한 것으로 증명될 수 있는 치료 활성 생분자의 비제한적 예는 IL-2, GLP-1, BNP(Alb-베타-나트륨이뇨 펩타이드), IL-1-RA(인터류킨-1 수용체 길항제), KGF(케라틴세포 성장 인자), Stemgen?, 성장 호르몬(GH), G-CSF, CTLA-4, 미오스타틴, VII 인자, VIII 인자 및 IX 인자로 구성된 군에서 선택된다.
종양 조직의 유출 손상된 혈관은 거대분자가 맥관구조(내피 장벽)를 투과하게 야기시키는 반면에, 건강한 조직의 혈관에서는 소입자만 내피 장벽을 통과할 수 있다. 마찬가지로, 류마티스성 관절염 환자의 염증성 관절에서 알부민에 대한 혈관-관절 장벽의 투과성은 눈에 띄게 증가된다. 따라서, 본 양태에 따른 융합 단백질 또는 접합체는 종양 조직 내 혈관과 염증성 관절에서의 혈관-관절 장벽을 투과할 가능성이 크다.
상기 제2 모이어티의 원하는 생물학적 활성이 결합 활성인 경우, 상기 제2 모이어티는 표적 분자와 선택적으로 상호작용할 수 있는 결합 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 결합 폴리펩타이드는, 예를 들어, 항체, 및 항체 결합 활성을 실질적으로 보유한 항체의 조각 및 도메인; 미소체, 맥시바디(maxybody), 아비머(avimer) 및 기타 소(小) 디설파이드-결합 단백질; 및 포도상구균 단백질 A 및 그의 도메인, 기타 3중 나선 도메인, 리포칼린, 안키린 반복 도메인, 셀룰로오스 결합 도메인, γ 결정, 녹색 형광 단백질, 인간 세포독성 T 림프구-관련 항원 4, 프로테아제(단백질 분해 효소) 억제제들, 이를테면, Kunitz 도메인, PDZ 도메인, SH3 도메인, 펩타이드 앱타머, 포도상구균 뉴클레아제(핵산 분해 효소), 텐다미스타트(tendamistat), 파이브로넥틴 타입 III 도메인, 트랜스페린, 아연 집게(zinc finger) 및 코노톡신으로 구성된 군에서 선택된 골격(scaffold)으로부터 유도된 결합 단백질로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 표적 결합 폴리펩타이드의 결합을 위한 표적 분자는
알츠하이머 질환의 아밀로이드 ß (Aß) 펩타이드; 기타 질환과 관련된 아밀로이드 펩타이드; 독소, 이를테면 박테리아성 독소 및 사독(蛇毒); 혈액 응고 인자, 이를테면 von Willebrand 인자; 인터류킨, 이를테면 IL-13; 미오스타틴; 전염증성 인자, 이를테면 TNF-α, TNF-α 수용체, IL-1, IL-8 및 IL-23; 보체 인자, 이를테면 C3 및 C5; 과민증 매개체, 이를테면 히스타민 및 IgE; 종량-관련 항원, 이를테면 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD40, CD52, CD70, cMet, HER1, HER2, HER3, HER4, CAIX(탄산 탈수효소 IX), CEA, IL-2 수용체, MUC1, PSMA, TAG-72; 및 기타 생물학적 분자, 이를테면 G-CSF, GM-CSF, 성장 호르몬(GH), 인슐린 및 소마토스타틴으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
숙련자가 이해하는 바와 같이, 제1 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드는 융합 단백질에 유용하거나, 기타 다른 모이어티에 대한 접합 파트너로 유용할 수 있다. 따라서, 치료 활성 폴리펩타이드, 결합 폴리펩타이드 및 표적 분자에 대한 상기 목록을 어떠한 방식으로든 제한하기 위한 것으로 이해해서는 안된다.
본 발명에 따른 융합 단백질 또는 접합체의 일 구현예에서, 제2 모이어티는 알부민 결합 폴리펩타이드의 N- 또는 C-말단에 첨가된 라이신 또는 시스테인 잔기를 통해, 또는 알부민 결합 폴리펩타이드 내 한 위치(이를테면, X3, X6 및 X14 중에서 선택된 한 위치)에 있는 라이신 또는 시스테인 잔기를 통해 알부민 결합 폴리펩타이드에 접합된다. 접합 부위가 알부민 결합 폴리펩타이드의 아미노산 서열 i) 내의 하나(이를테면, X14번 위치에 있는 시스테인)라면, 제2 모이어티로의 접합을 가능하게 할 목적으로 알부민 결합 폴리펩타이드에 어떠한 추가 아미노산도 첨가할 필요가 없다. 또한 i)에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드 사슬 내의 접합 부위는 교차반응 항체에 맞서 폴리펩타이드를, 구체적으로는 접합 부위에 근접한 폴리펩타이드 부분을 가릴(shield) 수 있다. 이론으로 구속되고자 함은 아니지만, 알부민 결합 폴리펩타이드를 통해 접합체가 체내 혈청 알부민에 결합하는 경우, 즉, 혈청 알부민의 결합 포켓에 위치하는 경우, 예를 들어 알부민 결합 폴리펩타이드를 구성하는 3중 나선 도메인 중 하나인 나선 내의 위치에 접합된 제2 모이어티는 알부민 결합 폴리펩타이드가 결합되어 있는 혈청 알부민의 반대측을 가리킬 가능성이 크다. 게다가, 알부민 결합 폴리펩타이드 내의 접합 부위는 예를 들어 항원 제공 셀에서의 처리에 미치는 영향, MCH 클래스 II 분자의 펩타이드 결합 그로브(grove)에 잠재적 펩타이드가 적절하지 못하게 고정된 상태(impaired fit), 그리고 (돌출된 접합 부분 때문에) T-세포 수용체에 존재하는 펩타이드 표면을 개조(remodel)하는 것으로 인해, 상기 폴리펩타이드 부분으로부터 유도되었을 펩타이드들 부분을 T-세포에 제공하는 것에 장애가 될 수 있다. 따라서, 접합 부위에 근접한 접합 부분의 면역원성이 접합 후 더 감소될 것으로 예상된다.
본 발명의 알부민 결합 폴리펩타이드, 및 혈청 알부민 사이의 높은 친화성 때문에, 이러한 알부민 결합 폴리펩타이드를 포함하는 접합체 또는 융합 단백질은 혈청 알부민과의 간접형 착물로 간주될 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 접합체 또는 융합 단백질은 혈청 알부민과의 직접형 접합체 또는 융합체를 활용하기 위해 흔히 사용되는 방법에 대한 대안을 제시한다. 혈청 알부민과의 이러한 직접형 접합체는 커플링에 어떤 방법을 사용하는 지와 무관하게 흔히 비균질성이다. 특정 분자가 라이신 잔기의 아미노기를 통해 혈청 알부민에 커플링된 경우에는, 혈청 알부민 분자의 표면에 있는 다수의 라이신 중 어떠한 라이신도 표적이 될 수 있으며, 이로써 임의의 접합 부위와 임의의 생성물이 생긴다. 인간 혈청 알부민 내의 짝 없는(unpaired) 단일 시스테인을 통한 티올 커플링(34번 위치, Peters, 1985, supra)이 직접형 접합체를 수득하기 위한 대안적 방법을 제공하는 것으로 보이지만, 흔히 이러한 방법론은 균질한 생성물로 이어지지 않는다. 시판 중인 (인간) 혈청 알부민의 분자 중 20 내지 60%만이 유리 티올기를 나타내는 한편, 그 나머지는 시스테인, 호모시스테인 또는 글루타티온과 같은 티올 화합물에 의해 차단(block)된다. 이와는 대조적으로, 본 발명에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드는 부위특이적으로 3중 나선 도메인에 접합될 수 있다. 이는 위에 논의된 바와 같이 하나 이상의 시스테인, 셀레노시스테인 또는 (합성 동안에 직교방향으로 보호되는) 소정의 라이신에 커플링함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 상기 양태에 따르면, 원하는 생물학적 활성을 가진 제2 모이어티는 알부민 결합 폴리펩타이드의 3중 나선 도메인에 접합되거나, 상기 도메인과 함께 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 본 발명에 따른 접합체의 비제한적 예를 아래와 같이 제공한다. 글루카곤-유사 펩타이드 1(GLP-1) 또는 그의 유도체는 알부민 결합 폴리펩타이드와의 접합체에서 제2 모이어티로서 적합하게 존재할 수 있는 작은 폴리펩타이드이다. GLP-1은 전술된 바와 같이 폴리펩타이드 서열의 위치들 중 임의의 한 위치에서 알부민 결합 폴리펩타이드에 접합될 수 있다. 접합체는 그 상태 그대로 비-생물학적 과정에서 생성될 수 있으며, GLP-1 자체의 효능에 비해 현저하게 향상된 효능을 나타낼 것으로 예상된다. 접합은 작은 폴리펩타이드 또는 단백질(이를테면, GLP-1)과, 큰 폴리펩타이드 또는 단백질 모두에 이용될 수 있다. 통상, 본 발명에 따른 접합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비-아미노산 스페이서 모이어티를 포함할 수 있다.
기타 폴리펩타이드 또는 단백질을 융합 단백질 형태로 알부민 결합 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 함께 조합할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 제1 모이어티와 제2 모이어티 사이에 하나 이상의 스페이서 아미노산 잔기를 더 포함할 수 있다.
전술된 바와 같이, 제1 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드는 마우스, 랫트, 개 및 필리핀 원숭이를 비롯한 여러가지의 종들로부터 유래된 혈청 알부민에 결합된다. 따라서, 본 발명에 따른 융합 단백질 또는 접합체는 인간 대상뿐만 아니라 동물 모델에서의 제2 모이어티의 생물학적 효과를 상승시키는데 기여할 수 있다. 인간 혈청 알부민과의 직접적인 융합으로 다수의 내인성 단백질이 생성되었으며, 이러한 단백질의 예로 G-CSF, GH, 인터페론, CD-4, IL-2, 인슐린, 글루카곤, GLP-1, 항체 Fab 조각, 및 Kunitz-도메인 유도 단백질과 같은 프로테아제 억제제가 있다. 그러나 이러한 직접적인 융합을 동물 모델을 통해 완전히 평가할 수는 없다. 이는 예컨대 흔히 사용되는 동물 모델인 마우스 및 랫트에서의 내인성 Fc 신생아 수용체(FcRn)와 인간 혈청 알부민이 제대로 상호작용하지 않는다는 것과, 이러한 상호작용은 혈청 알부민의 장기 순환에 기여하는 주요 요인이라는 사실 때문이다. 전술된 바와 같이, 혈청 알부민의 존재 하에, 본 발명에 따른 접합체 또는 융합 단백질은 알부민과 결합하여, 알부민과의 간접형 융합체로서 기능한다. 이로써 제1 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드를 포함한 접합체 또는 융합 단백질은 잠복기에 있는 모델 종에 유용하게 되되, 단 선택된 종에 제2 모이어티가 생물학적으로 활성이라는 조건이다.
일 구현예에서는, 제2 모이어티의 생물학적 활성과 동일하거나 상이할 수 있는 추가의 원하는 생물학적 활성을 가진 폴리펩타이드로 구성된 추가 모이어티를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 제공한다. 이러한 융합 단백질 또는 접합체의 한 가지 구체적인 예는 제2 모이어티로서 위에 정의된 바와 같은 치료 활성 폴리펩타이드 및 추가 모이어티로서 위에 정의된 바와 같은 결합 폴리펩타이드로 이루어진다.
제1 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체의 상기 설명과 관련하여, 제1, 제2 및 추가 모이어티로 표시한 이유는 한편으로는 본 발명에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드와, 다른 한편으로는 기타 기능을 나타내는 모이어티들 사이를 구별하기 위한 명확성 때문이다. 이들 표시는 융합 단백질 또는 접합체의 폴리펩타이드 사슬 내 상이한 도메인들의 실제 순서를 가리키고자 함이 아니다. 따라서, 예를 들어, 상기 제1 모이어티는, 제약없이, 융합 단백질 또는 접합체의 N-말단, 중간 또는 C-말단에 있을 수 있다.
관련된 한 양태에서는, 본 발명에 정의된 바와 같되, 세포살상제와 같은 유기 분자를 더 포함하는 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체를 제공한다. 제1 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드에 융합되거나 접착될 수 있는 세포살상제, 또는 제2 양태에 따른 융합 단백질 또는 접합체와 결합될 수 있는 세포살상제의 비제한적 예는, 칼리치마이신(calicheamycin), 아우리스타틴(auristatin), 독소루비신(doxorubicin), 메이탄시노이드(maytansinoid), 탁솔(taxol), 엑티나시딘(ecteinascidin), 겔다나마이신(geldanamycin), 메토트렉세이트(methotrexate) 및 이들의 유도체, 및 이들의 조합물 중에서 선택된다. 이전에는 각종 질환을 직접형 알부민 접합체로 치료하려는 시도가 있었다. 상기 직접형 알부민 접합체와 예컨대 독소루비신을 함께 암에 활용하고(Kratz et al, J Med Chem 45: 5523-33, 2002), 상기 직접형 알부민 접합체와 메토트렉세이트를 함께 류마티스성 관절염에 활용하였다(Wunder et al, J Immunol 170:4793-4801, 2003). 그 자체로든, 융합 단백질 또는 접합체 내 모이어티로서든, 알부민 결합 폴리펩타이드의 높은 알부민 결합 능력은 알부민 착물을 구성하는 간접적인 수단을 제공하며, 이에 따라 위에 언급한 시도와 비교해 대안적 치료법을 제공할 수 있다고 여겨진다.
더 나아가 상기 양태들은 제1 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드, 또는 제2 양태에 따른 융합 단백질 또는 접합체에 포함된 상태의 알부민 결합 폴리펩타이드에, 예를 들면 폴리펩타이드를 검출하기 위한 목적의 표지 기, 이를테면 형광 염료 및 형광 금속, 발색단 염료, 화학발광성 화합물 및 생발광성 단백질, 효소, 방사성 핵종 및 입자로 구성된 군에서 선택된 표지가 제공된, 폴리펩타이드를 포함한다. 특히 본 발명은, 본원에 기술된 바와 같은 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체의 방사성 킬레이트(radiochelate), 및 방사성 핵종(이를테면, 방사성 금속)으로 구성되는, 방사표지된 (radiolabeled) 폴리펩타이드를 포함한다.
표지된 알부민 결합 폴리펩타이드가 본 발명의 제1 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드, 및 표지를 포함하는 구현예에서, 표지된 폴리펩타이드를 예를 들면 간접적으로 혈청 알부민을 표지하는데 사용할 수 있다. 표지된 폴리펩타이드 및 혈청 알부민 사이의 강한 연관성 때문에, 표지된 폴리펩타이드를 예를 들면 혈관 투과성 및 혈액 풀(blood pool)을 연구하는데 사용할 수 있다.
다른 구현예에서, 표지된 알부민 결합 폴리펩타이드는 원하는 생물학적 활성을 가진 제2 모이어티를 또한 포함하는 융합 단백질 또는 접합체 내의 한 모이어티로서 존재한다. 일부 경우에 표지는 알부민 결합 폴리펩타이드에만 커플링될 수 있고, 일부 경우에서는 알부민 결합 폴리펩타이드에, 그리고 접합체 또는 융합 단백질의 제2 모이어티 둘 다에 커플링될 수 있다. 표지된 폴리펩타이드를 언급할 때, 이는 알부민 결합 폴리펩타이드와, 제2 모이어티와, 선택적으로 추가 모이어티를 포함하는 융합 단백질 및 접합체를 비롯하여, 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩타이드의 모든 양태를 가리키는 것으로 이해해야 한다. 따라서, 표지된 폴리펩타이드는 알부민 결합 폴리펩타이드, 및 상기 알부민 결합 폴리펩타이드에 킬레이트되거나 공유결합할 수 있는 예컨대 치료용 방사성 핵종만 함유하거나; 알부민 결합 폴리펩타이드, 치료용 방사성 핵종, 및 원하는 생물학적 활성(이를테면, 치료 효능)을 가진 소분자와 같은 제2 모이어티를 함유할 수 있다.
알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체가 방사표지된 구현예에서, 이러한 방사표지된 폴리펩타이드는 방사성 핵종을 포함할 수 있다. 대부분의 방사성 핵종은 금속 성질을 가지고 있으며, 전형적으로 금속은 단백질과 펩타이드 내에 존재하는 원소와 안정적인 공유결합을 형성할 수 없다. 이러한 이유로, 방사성 금속으로 단백질과 펩타이드를 표지하는 일은 금속 이온과 비-공유 화합물(킬레이트라 불림)을 형성하는 킬레이터, 즉, 다좌배위형 리간드를 사용하여 수행한다. 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체의 일 구현예에서는, 킬레이트화 환경을 제공함으로써 방사성 핵종을 혼입할 수 있으며, 이를 통해 방사성 핵종은 폴리펩타이드에 배위, 킬레이트화 또는 착화될 수 있다.
킬레이터의 한 예로, 폴리아미노폴리카복실레이트 종류의 킬레이터가 있다. 이러한 폴리아미노폴리카복실레이트 킬레이터를 두 종류, 즉 거대환형 킬레이터 및 비환형(acyclic) 킬레이터로 구분할 수 있다. 일 구현예에서, 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체는 시스테인 잔기의 티올기 또는 라이신 잔기의 엡실론 아민기를 통해 알부민 결합 폴리펩타이드에 접합된 폴리아미노폴리카복실레이트 킬레이터에 의해 제공되는 킬레이트화 환경을 포함한다.
인듐, 갈륨, 이트륨, 비스무스, 라디오악티늄족 원소 및 라디오란탄족 원소의 방사성 동위원소에 대해 가장 흔히 사용되는 거대환형 킬레이터는 DOTA(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산)의 다양한 유도체이다. 일 구현예에서, 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체의 킬레이트화 환경은 DOTA 또는 이의 유도체에 의해 제공된다. 더 구체적으로, 본 발명에 포함되는 킬레이트화 폴리펩타이드의 한 기는, 예를 들어 실시예 5에 기술된 바와 같이, DOTA 유도체인 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리스-아세트산-10-말레이미도에틸아세타미드(말레이미도모노아미드-DOTA)를 알부민 결합 폴리펩타이드의 티올기와 반응시켜 생성한다.
높은 동역학적 비활성도(kinetic inertness), 즉 DOTA로부터의 낮은 금속 해리속도(상수)를 위해서는 방사성 핵종의 안정적인 부착이 유리하다. 그러나, 낮은 회합속도(association rate)로 인해 표지 작업을 위해서는 고온이 요구된다. 이러한 이유 때문에, DOTA 유도체는, 표지 반응에 요구되는 온도에서의 배양 이후 결합 관능성을 나타내는, 본 발명의 알부민 결합 폴리펩타이드와 같은 짧은 펩타이드의 표지용으로 광범위하게 사용되고 있다.
가장 흔히 사용되는 비환형 폴리아미노폴리카복실레이트 킬레이터로는, DTPA(디에틸렌트리아민-펜타아세트산)의 다양한 유도체가 있다. 그러므로, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 또는 이의 유도체에 의해 제공된 킬레이트화 환경을 가진 폴리펩타이드 역시 본 발명에 포함된다.
예컨대 Zevalin?의 90Y로 표지하는데 있어서 DTPA의 주쇄-변이된 반강성(semi-rigid) 변이체가 적절한 안정성을 제공한다는 것이 밝혀졌다. 비록 비환형 킬레이터가 덜 비활성이고, 이에 따라 종종 거대환형 킬레이터보다 덜 안정적이지만, 비환형 킬레이터의 표지화는 대기 온도에서도 충분히 빠르다. 이러한 이유 때문에, 비환형 킬레이터를 본 발명에 따른 융합 단백질 또는 접합체의 표지화에 사용할 수 있다. 표적 단백질 및 펩타이드에 폴리아미노폴리카복실레이트 킬레이터를 커플링하는 것에 대한 상세한 원칙이 Cooper et al(Nat Prot 1: 314-7, 2006) 및 Sosabowski and Mather(Nat Prot 1:972-6, 2006)에 의해 공개된 적이 있다.
폴리아미노폴리카복실레이트 킬레이터에 커플링된, 본원에 기술된 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체는 킬레이터에 커플링된 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체의 방사성 킬레이트, 및 의학 화상 작성(medical imaging)에 적합한 방사성 핵종으로 구성되는, 방사표지된 폴리펩타이드를 제공하는데 사용될 수 있다. 이때 치료에 적합한 방사성 핵종은 61Cu, 64Cu, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 110 mIn, 111In, 44Sc 및 86Y로 구성된 군에서 선택되며, 킬레이터를 통해 알부민 결합 폴리펩타이드와 착화되는 방사성 핵종은 225Ac, 212Bi, 213Bi, 67Cu, 166Ho, 177Lu, 212Pb, 149Pm, 153Sm, 227Th 및 90Y로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 구현예에 의하면, 소위 간접 표지법을 이용하여 비-금속 방사성 동위원소로 폴리펩타이드를 방사표지할 수도 있다. 따라서, 가령 18F, 76Br, 다양한 요오드 동위원소들 및 211At를 사용한 표지화에는, 중간 "연결기 분자"를 표지하는데 사용한다. 이러한 연결기 분자는 두 개의 관능성 모이어티를 함유해야 하는데, 이들 모이어티 중 하나는 신속하고 효율적인 방사표지를 제공하고; 또 하나는 단백질(예컨대, 아민기)로의, 또는 바람직하게는 특정 시스테인의 티올기 (이를테면, 알부민 결합 폴리펩타이드의 X14번 위치에)로의 신속하고 효율적인 커플링을 가능하게 한다. 예를 들어, 말레이미드기는 티올기와 반응하여 안정적인 티오에테르 결합을 형성한다. "연결기 분자"는 우선 방사표지와 반응한 후, 단백질의 티올기 또는 셀레노티올기와 반응할 수 있다.
다른 양태에서는, 본원에 기술된 바와 같은 알부민 결합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또한, 본원은 전술된 바와 같은 알부민 결합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질의 제조 방법을 포함하며, 상기 방법은 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 발현하는 단계를 포함한다.
대안으로, 본 발명의 알부민 결합 폴리펩타이드는 아미노산 및/또는 반응성 측쇄가 보호된 아미노산 유도체를 사용하는 비-생물학적 펩타이드 합성법에 의해 제조될 수 있으며, 상기 비-생물학적 펩타이드 합성법은
아미노산 및/또는 아미노산 유도체를 단계적 커플링시켜, 반응성 측쇄가 보호된 제1 양태에 따른 폴리펩타이드를 형성하는 단계;
폴리펩타이드의 반응성 측쇄로부터 보호기를 제거하는 단계; 및
폴리펩타이드를 수용액 내에서 접는 단계를 포함한다.
이와 같이, 정상 아미노산(예컨대, 글리신, 알라닌, 페닐알라닌, 이소류신, 류신 및 발린) 및 예비-보호된 아미노산 유도체를 사용하여 폴리펩타이드 서열을 용액 내에 또는 유기 용매 중의 고상 담체(solid support) 상에 순차적으로 만든다. 고상 담체 상에 펩타이드를 합성하는 한 가지 구체적인 예를 실시예 5에 기술하였다. 완전한 폴리펩타이드 서열이 만들어지면, 보호기를 제거하고, 폴리펩타이드가 수용액 내에서 접혀지도록 한다. 본 발명에 따른 각 폴리펩타이드는 부가 인자들 없이 3중 나선 번들 도메인으로 역으로 접혀지면서, 이에 따라 자연스럽게 접혀진다.
제2 양태에 따른 접합체는 전술된 방법들 중 임의의 방법(이를테면, 이를테면 비-생물학적 펩타이드 합성)에 따라 알부민 결합 폴리펩타이드를 제조하는 단계, 및 상기 제조된 알부민 결합 폴리펩타이드를 제2 양태와 관련하여 정의된 바와 같은 제2 및/또는 추가 모이어티와 접합시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다.
융합 단백질 또는 접합체의 일 구현예에서는, 치료에 사용되는(예컨대, 약물로 사용되는) 본원에 정의된 바와 같은 융합 단백질 또는 접합체를 또한 제공한다. 이러한 융합 단백질 또는 접합체는 원하는 생물학적 활성을 자체적으로 가진 폴리펩타이드의 체내 반감기보다 긴 체내 반감기를 나타낼 수 있다. 원하는 생물학적 활성을 자체적으로 가진 폴리펩타이드를 포유동물에 투여시 유도되는 면역반응과 비교하여, 융합 단백질 또는 접합체는 또한 인간과 같은 포유동물에 투여시 면역반응을 전혀 이끌어내지 못하거나 감소된 면역반응을 이끌어 낼 수 있다. 달리 말하면, 원하는 생물학적 활성을 가진 폴리펩타이드를 본원에 기술된 양태들에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체에 융합 또는 접합시킴으로써, 폴리펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법을 제공한다. 또한, 제2 모이어티의 생물학적 활성을 증강시킬 수 있다.
다른 구현예에서는, 진단에 사용되는(예컨대, 진단제(진단약)로 사용되는), 본 발명에 따른 융합 단백질 또는 접합체를 제공한다.
본 발명은 또한 전술된 알부민 결합 폴리펩타이드 용도의 여러가지 양태뿐만 아니라, 폴리펩타이드의 결합 및 기타 특성 덕분에 폴리펩타이드가 유용한 다양한 치료, 진단 및 검출 방법에 관한 것이다. 상기 용도 및 방법에 대한 이하 설명에서 "알부민 결합 폴리펩타이드"를 언급하는 경우, 이 용어는 알부민 결합 폴리펩타이드 자체는 물론, 전술된 상기 폴리펩타이드에 기초한 모든 분자, 예컨대 알부민 결합 폴리펩타이드를 융합 단백질 또는 접합체 내 모이어티로서 통합하고/하거나, 표지, 킬레이터, 치료제 및/또는 진단제에 접합되었고/되었거나, 태그로서 또는 기타 목적을 위해 추가 아미노산 잔기가 제공된, 모든 분자를 포함하고자 한다. 위에 설명하였듯이, 이러한 융합 단백질, 유도체 등은 본 발명의 일부를 구성한다.
또 다른 일련의 양태는 난용성(용해도가 낮음) 화합물을 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체에 접합시킴으로써 수용액에서의 상기 화합물의 용해도를 증가시키는 신규 방식을 제공하는 것에 관한 것이다. 그 결과 생성된, 난용성 화합물 및 (단독으로, 혹은 융합 단백질 또는 접합체 내의 모이어티로서 통합되어) 알부민 결합 폴리펩타이드의 착물은 체내 또는 체외 알부민과 회합할 수 있으며, 이러한 회합은 수용액에 대한 용해도를 높인다. 따라서, 이러한 추가 양태의 일 구현예에서는 본원에 기술된 바와 같은 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체에 공유결합되며, 자체 수용해도가 100 μg/ml 이하인 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 화합물 자체의 용해도는 10 μg/ml 이하이다. 또 다른 구현예에서, 상기 용해도는 1 μg/ml 이하이다.
일부 구현예에서, 상기 화합물은 약학적으로 활성인 화합물, 예를 들면 세포살상제일 수 있다. 세포살상제의 비제한적 예는, 칼리치마이신, 아우리스타틴, 독소루비신, 메이탄시노이드, 탁솔, 엑티나시딘, 겔다나마이신 및 이들의 유도체, 및 이들의 조합물 중에서 선택되는 것이다. 대안으로, 세포살상제는 유기합성에 의해 제조되는 합성 케모톡신(chemotoxin)일 수 있으며, 천연유래 화합물로부터 유도되지 않는다.
난용성 화합물, 및 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체 외에, 본원의 상기 양태에 따른 조성물은, 일부 구현예에 의하면, 임상적으로 관련된 표적에 대해 친화성을 갖는 결합 폴리펩타이드를 또한 포함할 수 있다. 이러한 결합 폴리펩타이드는 적절하게는 알부민 결합 폴리펩타이드와 상이하며, 본 발명의 조성물의 기타 성분들에 비공유 결합되거나 공유결합될 수 있다. 임상적으로 관련된 표적에 대해 친환성을 갖는 결합 폴리펩타이드의 비제한적 예는, 항체, 및 항체 결합 활성을 실질적으로 보유한 항체의 조각 및 도메인; 미소체, 맥시바디, 아비머 및 기타 소(小) 디설파이드-결합 단백질; 및 포도상구균 단백질 A 및 그의 도메인, 기타 3중 나선 도메인, 리포칼린, 안키린 반복 도메인, 셀룰로오스 결합 도메인, γ 결정, 녹색 형광 단백질, 인간 세포독성 T 림프구-관련 항원 4, 프로테아제 억제제들, 이를테면, Kunitz 도메인, PDZ 도메인, SH3 도메인, 펩타이드 앱타머, 포도상구균 뉴클레아제, 텐다미스타트, 파이브로넥틴 타입 III 도메인, 트랜스페린, 아연 집게 및 코노톡신으로 구성된 군에서 선택된 골격으로부터 유도된 결합 단백질로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 상기 양태에 따른 조성물은, 알부민 결합 폴리펩타이드가 그 자체로, 혹은 융합 단백질 또는 접합체 내에 함유된 상태로 상기 조성물에 제공됨에 따라, 체내 또는 체외 알부민과 회합하는 능력을 가진다. 특정한 경우, 조성물이 생물체(living organism) 밖의 알부민과 착물을 형성하는 것, 즉 외인성 알부민을 조성물에 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 조성물을 동결 건조(lyophilize)시켜, 대기 온도에 보관하기에 적합한 제제로 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 인간 혈청 알부민과 같은 알부민을 더 포함하는, 위에 정의된 바와 같은 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 화합물이 치료 활성 화합물인 경우에, 약물로 사용되는(즉, 치료에 사용되는) 상기 양태에 따른 조성물을 제공한다. 적합하게는, 제공되는 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체, 그리고 선택적으로 알부민은 활성 화합물의 치료 효능에 유해한 영향을 미치지 않으므로, 본 발명의 조성물은 상기 화합물 자체가 나타나는 이러한 치료학적 또는 예방적 상황에 유용할 것이다.
다른 구현예에서는, 진단제로 사용되는(즉, 진단에 사용되는) 상기 양태에 따른 조성물을 제공한다.
본 발명의 한 관련된 양태는 바로 위에 기재한 바와 같은 조성물의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은
자체 수용해도가 100 μg/ml 이하인 화합물을 제공하는 단계; 및
상기 화합물을 본원에 기술된 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체에 공유결합시킴으로써, 화합물 및 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체의 공유 착물을 포함하는 조성물을 형성하는 단계를 포함한다.
알부민이 조성물 내에 포함되는 본 발명의 구현예에서, 상기 방법은 화합물 및 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체를 포함하는 상기 착물을 알부민과 혼합함으로써, i) 화합물 및 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체의 공유 착물과, ii) 알부민의 비-공유 착물을 포함한 조성물을 형성하는 추가 단계를 포함할 수 있다. 난용성 화합물 및 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체를 포함하는 착물의 한 단위가 알부민 한 분자와 회합하도록, 상기 비-공유 착물 중 두 성분들의 상대비를 예를 들면 1:1로 할 수 있다. 일 구현예에 의하면, 상기 방법은 비-공유 착물을 동결 건조시켜, 동결 건조된 상태의 조성물을 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
매우 밀접한 또 다른 양태에서, 본 발명은 화합물의 수성용해도를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은
자체 수용해도가 100 μg/ml 이하인 화합물을 제공하는 단계;
상기 화합물을 본원에 기술된 양태에 따른 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체에 공유결합시킴으로써, 화합물 및 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체의 공유 착물을 형성하는 단계; 및
화합물 및 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체를 포함하는 상기 착물을, 알부민 결합 폴리펩타이드와 알부민의 비-공유성 회합을 촉진하는 조건 하에서, 알부민과 혼합시키는 단계를 포함하며,
상기 착물 중 화합물의 수용해도는 화합물 자체의 수용해도보다 높다.
난용성 화합물의 용해도에 관한 이들 방법 양태에서, 다양한 성분의 선택적 특성은 바로 이전의 조성물 양태와 관련하여 기술한 바와 같다.
본 발명은 다양한 바람직한 구현예를 참조로 설명하였지만, 당해 기술분야의 숙련자라면 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변경을 할 수 있고, 구성요소를 대등물로 대체할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 본 발명의 본질적 범주를 벗어나지 않으면서, 본 발명의 교시내용에 맞추어 특정 상황이나 분자를 조정하도록 많은 수정이 이루어질 수 있다. 그러므로, 본 발명을 수행하기 위해 고려되는 임의의 특정 구현예에 본 발명을 국한하고자 함이 아니라, 첨부된 청구항의 범주 내에 속하는 모든 구현예를 포함하고자 함이다.
도 1a 내지 1f은 본 발명의 알부민 결합 폴리펩타이드의 예(SEQ ID NO:1-152, SEQ ID NO:155-203), N-말단 글리신 잔기에 의해 연장된 연쇄상구균 스트레인 G148의 단백질 G로부터의 GA3 도메인(SEQ ID NO:153) 및 Jonsson et al이 이전에 기재한 바와 같이 G148-GA3으로부터 유도된 알부민 결합 폴리펩타이드(supra, SEQ ID NO:154)의 아미노산 서열 리스트이다.
도 2는 인간 혈청 알부민에 대한 알부민 결합 폴리펩타이드 PEP07912 (SEQ ID NO:157)의 결합을 조사하기 위해 Biacore 기기에서 수행된 결합 분석의 결과를 나타낸다. 955 RU까지 고정된 인간 혈청 알부민의 표면 상으로 세 가지 상이한 농도(40 nM, 두꺼운 회색선; 10 nM, 검정색선; 및 2.5 nM, 회색선)의 정제된 단백질을 주입하였다.
도 3의 A 내지 C는 126개의 각 정상 인간 혈청에 존재하는 IgG 분자에 대한 알부민 결합 폴리펩타이드 PEP07913(SEQ ID NO:153), PEP06923(SEQ ID NO:154), PEP07271(SEQ ID NO:155), PEP07912(SEQ ID NO:157), PEP07554(SEQ ID NO:156), PEP07914(SEQ ID NO:158), PEP07968(DOTA-접합형 PEP07911, SEQ ID NO:159) 및 PEP07844(SEQ ID NO:161)의 결합을 조사하기 위해 ELISA에서 수행된 결합 분석의 결과를 나타내며, 여기서 A)는 평균 OD값을 나타내고, B)는 (OD < 0.15로 정의된) 음성 혈청 백분율을 나타내고, C)는 (OD > 1.0으로 정의된) 양성 혈청 백분율을 나타낸다.
도 4의 A 내지 B는 정제된, 화학적으로 제조된 결합 폴리펩타이드 PEP07834(SEQ ID NO:160)의 분석 결과를 나타내는 크로마토그램이며, 여기서 A)는 블랭크를 뺀, 220nm에서의 흡광 신호를 나타내고, B)는 블랭크를 뺀, 280nm에서의 흡광 신호를 나타낸다. 두 개의 피크가 양쪽 파장에서 나타났다.
도 5의 A 내지 B는 도 4의 A 내지 B에서 확인된 두 개의 피크에 대한 질량분석 결과를 나타내는 스펙트로그램이다. A)는 제1 피크, 즉 PEP07834(SEQ ID NO:160)의 단량체의 스펙트로그램이고, B)는 PEP07834의 이량체의 스펙트로그램이다.
도 6의 A 내지 C는 CD3+ CD4+ T 세포 증식(proliferation) 분석에서 알부민 결합 폴리펩타이드 PEP07913(SEQ ID NO:153), PEP07912(SEQ ID NO:157), PEP07914(SEQ ID NO:158) 및 PEP07968(DOTA-접합형 PEP07911, SEQ ID NO:159)의 면역원성 평가 결과를 나타내는 다이어그램이다. A)는 52명의 백인 기증자 집단(cohort)에서의 재조합 인간 알부민과 비교해 알부민 결합 폴리펩타이드에 반응하는 개인들의 명수(名數)를 나타낸다. B)는 재조합 인간 알부민을 함유하는 음성 대조군과 비교해 PEP07913, PEP07912, PEP07914 및 PEP07968에 대한 평균 자극지수(SI)를 나타낸다. C)는 완충액 대조군과 비교해 본 연구에서의 모든 단백질에 대해 반응하는 개인들의 명수를 나타낸다.
도 7의 A 내지 C는 다양한 종으로부터의 알부민에 대한 알부민 결합 폴리펩타이드 A) PEP07986(SEQ ID NO:163), B) PEP08296(DOTA-접합형 PEP08185, SEQ ID NO:148) 및 C)PEP06923(SEQ ID NO:154)의 결합을 조사하기 위해 Biacore 기기에서 수행된 결합 분석의 결과를 나타낸다. 제공된 센서그램은 다음과 같이 각각 유래된 알부민으로 고정된 표면 위에 40nM 농도로 주입된 단백질에 해당된다: 인간(1130 RU, 가는 회색선); 필리핀 원숭이(1046 RU, 굵은 회색선); 랫트(831 RU, 굵은 옅은 회색선); 개(1053 RU, 가는 검정색선); 및 마우스(858 RU, 굵은 검정색선).
도 8은 5배 과잉몰의 HSA의 존재 하에서 시토킨 유도 TF-1 세포 증식에 대한 ZX-PP013(개방 원), ZY-PP013(개방 정사각형) 및 Zneg-PP013(폐쇄 삼각형)의 억제 효과를 나타낸다.
도 9는 10nM의 농도로 고정된 HSA(704 RU) 위에 2 mg/ml의 농도로 주입한 후 표시된 바와 같이 1주일, 2주일, 1개월 및 3개월 동안 4℃, 25℃ 또는 40℃에 보관한 PEP07986(SEQ ID NO:163)을 Biacore 분석하여 얻은 최대 결합 반응을 나타낸다. 시간 = 0에서의 비처리 샘플들을 기준샘플로 나타내었다.
도 10은 열처리되기 이전과 이후의 인간 혈청 알부민에 대한 알부민 결합 폴리펩타이드 PEP08296 (DOTA-접합된 PEP08185, SEQ ID NO:148)의 결합을 조사하기 위해 Biacore 기기에서 수행된 결합 분석의 결과를 나타낸다. 724 RU까지 고정된 인간 혈청 알부민의 표면 위에 두 가지 농도의 PEP08296(0.8nM, 회색선; 4nM, 검정색선)을 주입하였다. 실선은 90℃에서 10분간 열처리되기 이전이고, 점선은 90℃에서 10분간 열처리된 이후에 해당된다.
도 11의 A 내지 B는 90℃에서 12분간 열처리되기 이전과 이후의 PEP08296(DOTA-접합된 PEP08185, SEQ ID NO:148)의 두 CD 스펙트럼의 오버레이를 나타낸다. A)는 PBS pH 7.2에서 배양된 샘플이고, B)는 PBS pH 4.0에서 배양된 샘플이다.
도 12는 건강한 랫트에서 68Ga-PEP08296이 전신 분포된 최대 강도 투사(MIP) 이미지로서, 정맥 주사(꼬리 정맥) 직후 1.5 시간 동안 모아서 합친 자료를 나타낸다. 주요 혈관들(예컨대, 경정맥(긴 화살표) 및 고동맥(짧은 화살표), 심장(H), 간(L), 비장(S), 신장(K) 및 방광(B))의 순환 방사능성을 알아보기 쉽게 표현하였다.
도 13은 42 mg/ml의 농도로 주입된 PEP07986(SEQ ID NO:163)의 겔 여과 크로마토그램(검정색 실선)을 나타낸다. 5 mg/ml의 농도로 주입된 난백 알부민(MW 43 kDa)의 크로마토그램(회색 점선)을 비교 목적으로 포함시킨 결과, PEP07986에 대한 피크가 합계가 아니라는 것이 확인되었는데, 이는 난백 알부민보다 빠른 시점에서 용출된 보이드 부피(void volume)에서 예상된 바다.
이하, 본 발명에 따라 수행된 실험들의 비-제한적 설명을 통해 본 발명을 더 기술하기로 한다. 달리 명시되지 않는 한, 전체 실험에 걸쳐 종래의 화학 및 분자생물학 방법들을 사용하였다.
실시예
실시예 1:
알부민 결합 폴리펩타이드의 클로닝, 발현, 정제 및 특성파악
본 실시예에서는, 도 1a 내지 1f와 첨부된 서열 리스트에 아미노산 서열이 도시된, 10개의 상이한 알부민 결합 폴리펩타이드 PEP07913(SEQ ID NO:153), PEP07912(SEQ ID NO:156), PEP07914(SEQ ID NO:158), PEP07968(DOTA-접합된 PEP07911, SEQ ID NO:159), PEP06923(SEQ ID NO:154), PEP07271(SEQ ID NO:155), PEP07554(SEQ ID NO:156), PEP07844(SEQ ID NO:161), PEP07986(SEQ ID NO:163) 및 PEP08296(DOTA-접합된 PEP08185, SEQ ID NO:148)을 복제하고 정제시킨 후 특성을 파악하였다.
재료 및 방법
알부민 결합 폴리펩타이드 변이체의 클로닝
원하는 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체를 얻기 위해, 적당한 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 부위특이적 돌연변이 육종법으로 G148-GA3에 돌연변이를 생성하였다. 유전자 조각들을 PCR에 의해 증폭시키되, 특정 엔도뉴클레아제 부위뿐만 아니라, 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체 이전의 N-말단 MGSS 서열에 프라이머를 부착하였다. 이들 조각을 NdeI 및 NotI로 절단하고, 정제시킨 후, 클로닝 벡터인 플라스미드 pAY02556(pBR322의 복제기원, 카나마이신(kanamycin) 저항유전자, 및 목적 유전자(gene of interest)의 발현을 위한 T7 프로모터를 함유함)에 부착시켜, 동일한 효소로 잘랐다(restrict). 부착부들이 electrocompetent E.coli TOP10 세포들로 형질전환되었다. 이렇게 형질전환된 세포를 50 μg/ml로 카나마이신이 보충된 TBAB 플레이트(30 g/l tryptose 혈액한천배지) 상에 퍼뜨리고 나서, 밤새 37℃에서 배양시켰다. PCR을 사용하여 이들 콜로니(집락)를 스크린하고, 비오틴화된 올리고뉴클레오타이드 및 BigDye? Terminator v3.1 사이클 서열분석 키트(Applied Biosystems)를 제조업자의 지침에 따라 사용하여, 증폭된 조각들의 서열분석을 수행하였다. 서열분석 반응물을 Magnatrix 8000(NorDiag AB)을 사용하여 자성 streptavidin 코팅된 비드에 결합시킴으로써 정제시키고, ABI PRISM? 3100 염기서열 분석기(PE Applied Biosystems)에서 분석하였다. 모든 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체를 단량체로서 서브클로닝한 후, 발현벡터에 의해 구성체 MGSS-[PP###]를 인코딩하였으며, 이때 PP###은 알부민 결합 폴리펩타이드의 서열을 구성하는 아미노산 잔기들에 해당된다.
또한, G148-GA3, PP007(SEQ ID NO:7), PP013(SEQ ID NO:13) 및 PP037(SEQ ID NO:37)의 유전자 조각들을 PCR에 의해 증폭시키되, 특정 엔도뉴클레아제 부위뿐만 아니라, 헥사히스티딘 서열, TEV 프로테아제 부위, 및 알부민 결합 폴리펩타이드의 서열을 구성하는 아미노산 잔기들 이전의 글리신 잔기에 프라이머를 부착하였다. 폴리펩타이드 PEP07913(SEQ ID NO:153), PEP07912(SEQ ID NO:157), PEP07914(SEQ ID NO:158) 및 PEP07968(SEQ ID NO:159)은, 글리신 잔기가 더해진, 알부민 결합 폴리펩타이드 G148-GA3, PP007(SEQ ID NO:7), PP013(SEQ ID NO:13) 및 PP037(SEQ ID NO:37)에 해당된다. 이들 조각을 XbaI 및 NotI로 절단하고, 정제시킨 후, 클로닝 벡터인 플라스미드 pAY02512(pBR322의 복제기원, 카나마이신 저항유전자, 및 목표 유전자의 발현을 위한 T7 프로모터를 함유함)에 부착시켰다. 클로닝 부위 앞에는, 헥사히스티딘 태그를 포함하는 펩타이드를 인코딩하는 서열이 있고, 그 다음에는 동일한 효소로 잘라지는 TEV 프로테아제 절단부위가 있다. 부착, 형질전환 및 서열 확인은 전술한 바와 같이 수행하였다. 4 가지 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체 G148-GA3, PP007, PP013 및 PP037을 단량체로 서브클로닝한 후, 발현벡터에 의해 구조체 MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQG-[PP###]를 인코딩하였다.
MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLY-FQG-[PP013]를 인코딩하는 발현벡터를 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 부위특이적 돌연변이 육종법으로 더 변이시킴으로써, 알부민 결합 폴리펩타이드의 서열을 구성하는 아미노산 잔기들 이전에 세린 잔기를 삽입하여, 구조체 MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQ-GS-[PP013]를 얻었다. 이 구조체를 1) 부위특이적 돌연변이 육종법으로 더 변이시켜 (PP013 내) 14번 위치에 있는 세린 잔기를 시스테인 잔기로 대체함으로써, MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQGS-[PP049]를 생성하고, 2) C-말단에 글리신 잔기를 첨가함으로써 MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQGS-[PP049]-G를 생성하였다. C-말단에 글리신을 첨가하는 일은 글리신 잔기와 특정 엔도뉴클레아제 부위들을 엔코딩하는 뉴클레오타이드가 포함된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킴으로써 달성하였다. 해당 조각을 XbaI 및 NotI로 절단하고, 정제시킨 후, 클로닝 벡터인 플라스미드 pAY02641(pBR322의 복제기원, 카나마이신(kanamycin) 저항유전자, 및 목적 유전자의 발현을 위한 T7 프로모터를 함유함)에 부착시켜, 동일한 효소로 잘랐다. 부착, 형질전환 및 서열 확인은 전술된 바와 같이 수행되었다.
단백질 발현
N-말단 MGSS-연장 또는 N-말단 His6-태그에 이은 TEV-프로테아제 인식 부위 및 글리신 잔기로 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체를 E. coli BL21 (DE3)로 발현하였다. 카나마이신을 보충하여 50 μg/ml로 농축시킨 4ml TSB+YE 배지에 각 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체의 콜로니를 사용하여 접종하였다. 배양물을 약 5 시간 동안 37℃에서 성숙시켰다. 생물반응기(Greta system, Belach Bioteknik AB)와 대등해지도록 카나마이신을 보충하여 50 μg/ml로 농축시킨 800ml TSB+YE에 각 배양물의 3ml를 사용하여 접종하였다. 800 ml/분으로 공기를 공급하고, 용존산소 수준을 30%보다 높게 OD600 2까지 유지시키는 교반 프로파일로 37℃에서 배양시킨 후, IPTG를 첨가하여 최종 농도를 0.5mM으로 만들었다. 5 시간 동안 계속 배양한 후, 배양물을 10℃까지 냉각시키고, 공기 공급을 중단하고 교반 조작을 300rpm까지 낮추었다. 원심분리(15600g, 4℃, 20분)시켜 세포 펠렛을 모은(채집) 후 정제 때까지 -20℃에 보관하였다.
His6-태그 및 TEV-프로테아제 부위를 가진 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체의 정제
가용성 헥사히스티딘-태그형 폴리펩타이드 PEP07913(SEQ ID NO:153), PEP07912(SEQ ID NO:156), PEP07914(SEQ ID NO:158), PEP07968(SEQ ID NO:159), PEP07986(SEQ ID NO:163) 및 PEP08185(SEQ ID NO:148)가 들어 있는 동결 상태의 세포 펠렛을 35ml 결합 완충액(20mM 인산나트륨, 0.5M NaCl, 20mM 이미다졸, pH 7.4)에 현탁시키고, 여기에 1000 U Benzonase?(1.01654.001, Merck)를 첨가한 후, 초음파로 분쇄하였다. 각 폴리펩타이드에 대해, 초음파처리된 현탁액을 원심분리(1 시간, 37000g, 4℃)시켜 상청액을 맑게 만든 후, 상청액을 His GraviTrapTM 컬럼 (11-0033-99, GE Healthcare)에 넣었다. 컬럼을 10ml 세척 완충액(20mM 인산나트륨, 0.5M NaCl, 60mM 이미다졸, pH 7.4)으로 세척시킨 다음, 3ml 용리 완충액(20mM 인산나트륨, 0.5M NaCl, 0.5M 이미다졸, pH 7.4)으로 폴리펩타이드를 용출시켰다. PD-10 탈염용 컬럼(17-0851-01, GE Healthcare)을 사용하여 상기 완충액을 절단 완충액(cleavage buffer)(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 8)으로 변경하였다. 280nm에서의 흡광도를 측정함으로써 폴리펩타이드 생성물의 양을 구한 후, DTT를 첨가하여 최종 농도를 5mM으로 만들었다. 상기 절단 완충액에 His6-태그형 TEV 프로테아제를 폴리펩타이드 생성물에 대해 1:10의 질량비로 첨가하였다. 4℃에서 천천히 혼합하면서 밤새 절단시켰다. 농도 20nM를 얻을 때까지 절단 혼합물에 이미다졸을 첨가한 후, 상기 혼합물을 His GraviTrapTM 컬럼(11-0033-99, GE Healthcare)에 넣어, 절단된 His6-태그, His6-태그형 TEV 프로테아제, 및 미절단된 His6-태그형 생성물을 제거하였다.
각 변이체에 대해, 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체를 함유한 부분유량(flow-through)을 다음과 같이 역상 크로마토그래피(RPC)에 의해 추가 정제하였다. RPC A 완충액(수 중의 0.1% TFA)을 사용하여 미리 평형상태로 만든 1ml Resource 15 RPC 컬럼(GE Healthcare)에 상기 부분유량 분획을 넣었다. 컬럼 부피의 10배 부피의 (CV) RPC A 완충액으로 상기 컬럼을 세척한 다음, 결합된 폴리펩타이드를 10 CV 동안 선형구배 0-50% RPC B 완충액(아세토니트릴 중의 0.1% TFA)으로 용출시켰다. 유량을 2 ml/분으로 설정하고, 280nm에서의 흡광도를 모니터링하였다. 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체를 함유한 분획을 SDS-PAGE 분석으로 확인한 후, 풀(pool)처리 하였다.
RPC-정제된 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체들을 XK16 컬럼(GE Healthcare)에 충전된 120ml Superdex 75(GE Healthcare)에서 겔 여과법으로 추가 정제시켰다. 러닝 완충액(running buffer)은 2 ml/분 유량의 1xPBS로 하였다. 순수 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체를 함유하는 분획들을 풀처리하고, 약 1.3 mg/ml로 농축시켰다. 마지막으로, 제조업자의 권고에 따라 AffinityPak Detoxi-Gel 내독소 제거 겔(Pierce, prod#20344)의 1ml 컬럼들을 사용하여, 농축물을 미량의 잔류 내독소로부터 정제시켰다.
RPC-정제 단계에 앞서, 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체 PEP07911 및 PEP08185를 Mal-DOTA와 다음과 같이 접합하였다. 일회용 PD-10 탈염용 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 IMAC-FT 정제 단계로부터의 부분유량 분획의 완충액을 0.2M NaCl, pH 5.5로 변경하였다. 5배 과잉몰의 말레이미도-모노-아미드-DOTA(Macrocyclics, cat. No. B-272)를 첨가하고, 지속적으로 흔들면서 30℃에서 60분 동안 배양하였다. 이렇게 얻은 폴리펩타이드를 PEP07968 및 PEP08296으로 각각 표시하였다.
His6-태그가 없는 알부민 결합 폴리펩타이드-변이체의 정제
가용성 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체 PEP06923(SEQ ID NO:154), PEP07271(SEQ ID NO:155), PEP07554(SEQ ID NO:156) 및 PEP07844(SEQ ID NO:161)가 들어 있는 동결 상태의 세포 펠렛을 20 mM Tris-HCl, pH 8에 현탁시킨 후 초음파로 분쇄하였다. 각 폴리펩타이드 변이체에 대해, 초음파처리된 현탁액을 원심분리(30분, 32000g, 4℃)시켜 상청액을 맑게 만든 후, 상청액을 HSA-Sepharose column(GE Healthcare)에 넣었다. TST-완충액(25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 200 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 8.0)에 이어 5mM NH4Ac, pH 5.5로 세척한 후, 결합된 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체를 0.5 M HAc, pH 3.2로 용출시켰다.
알부민 결합 폴리펩타이드 변이체를 다음과 같이 역상 크로마토그래피(RPC)에 의해 추가 정제하였다. 각 변이체에 대해, RPC A 완충액(수 중의 0.1% TFA)을 사용하여 미리 평형상태로 만든 1ml Resource 15 RPC 컬럼(GE Healthcare)에, HSA-친화 정제 단계로부터의 용출액을 넣었다. 상기 컬럼을 10 CV RPC A 완충액으로 세척한 다음, 결합된 폴리펩타이드를 10 CV 동안 선형구배 0-50% RPC B 완충액(아세토니트릴 중의 0.1% TFA)으로 용출시켰다. 유량을 2 ml/분으로 설정하고, 280nm에서의 흡광도를 모니터링하였다. 순수 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체를 함유한 분획을 SDS-PAGE 분석으로 확인한 후, 풀처리 하였다. 마지막으로, 일회용 PD-10 탈염용 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 상기 완충액을 1xPBS(2.68 mM KCl, 137 mM NaCl, 1.47 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4, pH 7.4)로 변경하였다.
정제된 알부민 결합 폴리펩타이드-변이체의 특성 파악
NanoDrop? ND-1000 분광 광도계를 사용하여 280nm에서의 흡광도를 측정함으로써 농도를 분석하였다. SDS-PAGE 및 LC-MS로 단백질을 추가 분석하였다.
SDS-PAGE 분석을 위해, 각 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체의 약 10μg을 NuPAGE LDS Sample Buffer(Invitrogen)와 혼합하고, 15분 동안 70℃에서 배양한 후, NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gels(Invitrogen)에 넣었다. Sharp Prestained Standard (Invitrogen)를 분자량 마커로 이용하고, PhastGel BlueR(GE Healthcare)을 염색용으로 사용하는 XCell II SureLock 전기영동 셀(Novex)에서 NuPAGE MES SDS Running Buffer(Invitrogen)를 상기 겔들에 적용(run)하였다.
알부민 결합 폴리펩타이드 변이체의 정체성(identity)을 확인하기 위해, API-ESI 및 단일 4중 질량 분석기가 구비된 Agilent 1100 LC/MSD 시스템을 이용하여 LC/MS 분석을 수행하였다. 각각의 정제된 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체의 약 10μg을 Zorbax 300SB-C8 Narrow-Bore 컬럼(2.1 x 150 mm, 3.5 μm, Agilent Technologies)에 0.5 ml/분의 유량으로 제공하였다. 0.5 ml/분으로 선형구배 10-70% 용액 B를 15분 동안 사용하여 폴리펩타이드를 용출시켰다. 30℃에서 분리 조작을 수행하였다. 280nm 및 220nm에서의 이온 신호와 흡광도를 모니터링하였다. 정제된 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체의 분자량을 MS로 확인하였다.
결과
SDS-PAGE 분석을 통해 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체의 발현 수준은 세포 펠렛 1g 당 생성물 10~30 mg으로 예측되었다.
모든 변이체에 대해, SDS-PAGE 분석으로 구해진 순도는 95%를 넘었으며, LC/MS 분석으로 정확한 분자량을 확인하였다. 정제 후, 10개의 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체 각각에 대해 1 내지 8mg의 순수한 폴리펩타이드를 수득하였다.
실시예 2:
알부민 결합 폴리펩타이드에 대한 친화성 측정
본 실시예에서는, 실시예 1에서 합성 또는 발현하여 정제시킨 PEP06923(SEQ ID NO:154), PEP07271(SEQ ID NO:155), PEP07844(SEQ ID NO:161), PEP07912(SEQ ID NO:157), PEP07913(SEQ ID NO:153), PEP07914(SEQ ID NO:158) 및 PEP07968(DOTA-접합형 PEP07911, SEQ ID NO:159)의 인간 혈청 알부민(HSA)에 대한 친화성 특성을 Biacore 기기로 파악하였다. PEP07913은 N-말단 글리신 잔기가 첨가된 G148-GA3의 아미노산 서열에 해당되는 한편, PEP07271, PEP07844, PEP07912, PEP07914 및 PEP07968은 상이한 N-말단 아미노산이 첨가된 PP001(SEQ ID NO:1), PP043(SEQ ID NO:43), PP007(SEQ ID NO:7), PP013(SEQ ID NO:13) 및 PP037(SEQ ID NO:37)의 알부민 결합 폴리펩타이드에 해당된다.
재료 및 방법
제조업자의 권고에 따라 CM-5 칩(연구 등급; GE Healthcare) 표면의 카복실화된 덱스트란층에 아민 커플링시켜 고정시킨 HSA(Albucult?, Novozymes)를 Biacore 2000 기기(GE Healthcare) 상에서 바이오센서 분석하였다. 칩의 표면(1)을 활성화시킨 후 비활성화시켜, 주입시 기준세포(블랭크 표면)로 사용한 반면에; 표면(2)은 731 RU(공명단위)까지 고정된 HSA로 구성하고, 표면(4)은 955 RU까지 고정된 HSA로 구성하였다. 정제된 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체를 러닝 완충액 HBS-EP (GE Healthcare)로 2.5nM, 10nM 및 40nM까지 희석하고, 5분 동안 50 μl/분의 일정 유량으로 주입한 후에, 60분 동안 HBS-EP를 주입하였다. 25μl 10mM HCl를 한 번 주입시켜 표면들을 재생시켰다. 친화성을 두 세트로 측정하였다: 첫째 세트에서는 HBS-EP, PEP06923, PEP07271, PEP07912, PEP07913, PEP07914 및 PEP07968을 주입하였고(칩 표면 2), 둘째 세트에서는 HBS-EP, PEP06923, PEP07844, PEP07912 및 PEP07914를 주입하였다(칩 표면 4). 각 시행시 PEP06923을 대조군으로서 두번 주입하였다. 이에 따른 결과를 BiaEvaluation 소프트웨어(GE Healthcare)로 분석하였다. 리간드 표면의 곡선에서 블랭크 표면의 곡선을 뺐다.
결과
Biacore 2000 기기는 기술적 한계를 가져, 매우 높은 친화성 측정에 지장을 준다. 따라서, Biacore 연구의 목적은 HSA에 대한 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체의 친화성의 정확한 동역학적 변수들을 구하고자 하는 것이 아니었다. 하지만, 이로 인한 결과는 알부민에 대한 이들 폴리펩타이드의 상대적 친화성의 정량적 예측값을 제공한다. 기준 표면과 완충액 주입을 뺀 후, 질량 이동의 보정 기능과 국소적 변수로서 RUmax 세트를 가진 BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 1:1(Langmuir) 결합 모델에 곡선들을 맞추었다. 이들 곡선을 도 2에 나타내었다. 상대적 KD, ka (kon) 및 kd (koff) 값들을 예측하여, 아래의 표에 제공하였다.
[표 1]
HSA에 대한 알부민 결합 폴리펩타이드의 동역학적 변수(ka, kd 및 KD),
첫째 세트
Figure pct00001
[표 2]
HSA에 대한 알부민 결합 폴리펩타이드의 동역학적 변수(ka, kd 및 KD), 둘째 세트
Figure pct00002
표 1과 표 2에 보여진 바와 같이, PEP07271(SEQ ID NO:155), PEP07844(SEQ ID NO:161), PEP07912(SEQ ID NO:157), PEP07914(SEQ ID NO:158) 및 PEP07968(DOTA-접합형 PEP07911 , SEQ ID NO:159) 모두는 HSA에 대해 거의 동일한 친화성을 가진 것으로 보이며, 이는 모체 G148-GA3(PEP07913; SEQ ID NO:153)의 친화성을 크게 뛰어넘는 것이다. 이들 폴리펩타이드의 HSA 친화성은, 비슷한 오프-레이트에도 불구하고, PEP06923(SEQ ID NO:154)과 비교해 약간 낮았다.
실시예 3:
알부민 결합 폴리펩타이드의 융점(Tm) 측정
본 실시예에서는, 실시예 1에서 발현하여 정제시킨 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체 PEP07913(SEQ ID NO:153), PEP06923(SEQ ID NO:154), PEP07271(SEQ ID NO:155), PEP07554(SEQ ID NO:156), PEP07912(SEQ ID NO:157), PEP07914(SEQ ID NO:158), PEP07968(DOTA-접합형 PEP07911, SEQ ID NO:159), PEP07844(SEQ ID NO:161) 및 PEP07986(SEQ ID NO:163), 그리고 실시예 5에서 기술된 바와 같이 생성된 알부민 폴리펩타이드 변이체 PEP07975(DOTA-접합형 PEP07834, SEQ ID NO:160)를 CD 분석법으로 분석하였다. PEP07913은 N-말단 글리신 잔기를 가진 G148-GA3의 서열에 해당되고, PEP06923은 이전에 Jonsson et al, supra에서 전술된 조작형 고친화성 유도체인 한편, PEP07271, PEP07554, PEP07912, PEP07914, PEP07968, PEP07844 및 PEP07975는 본 발명에 따라 상이한 N-말단 아미노산이 첨가된 PP001(SEQ ID NO:1), PP007(SEQ ID NO:7), PP013(SEQ ID NO:13), PP037(SEQ ID NO:37) 및 PP043(SEQ ID NO:43)의 알부민 결합 폴리펩타이드의 예들이다.
재료 및 방법
정제된 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체들의 최종 농도가 0.4 내지 0.5 mg/ml가 되도록 1xPBS로 희석하였다. 광경로 길이가 1 mm인 세포를 Jasco J-810 분광 편광계에서 원편광 이색성(CD)을 분석하였다. 가변 온도 측정에 있어서, 온도구배를 5℃/분으로 하고, 221nm에서의 흡광도를 20℃ 내지 90℃ 범위에서 측정하였다.
결과
여러가지 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체의 융점(Tm)은 CD vs 온도 그래프에서 전이 중간점을 구함으로써 산출하였다. 이들 결과를 아래의 표 3에 정리하였다.
[표 3]
시험한 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체의 Tm 측정값
Figure pct00003
1) 해당 펩타이드는 시스테인 위치에서 말레이미드-DOTA와 접합한다.
2) 해당 펩타이드는 C-말단에서 아미드화된다.
3) (밑줄 친) 류이신은 본 발명의 제1 양태에 정의된 바와 같은 알부민 결합 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 1번 위치에 있는 잔기이다.
폴리펩타이드 PEP07968은 14번 위치에 말레이미드-DOTA와 접합된 시스테인 잔기를 가지며, PEP07912는 세린 잔기를 가진다는 것을 제외하면, PEP07968은 PEP07912와 동일하다. 이와 같이, DOTA 변이는 융점에 영향을 미치지 않아야 한다. 또한 PEP07975는 C14를 사용하여 DOTA와 접합되며; (실시예 5의 펩타이드 합성으로부터 생성된) C-말단 아미드와, 글리신 대신에 N-말단 알라닌을 가졌다는 것을 제외하면 PEP07968과 동일하다. 더 나아가, PEP07912와 PEP07554를 비교한 결과, N-말단 세린이 같은 위치에서의 글리신 보다 높은 융점(Tm 5℃ 차이남)을 제공한다는 것이 드러났다. 따라서, PEP07912 및 DOTA-접합형 변이체를 제외한, 본 발명에 따른 모든 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체는 55℃보다 높은 Tm을 나타내었다. N-말단 부분의 중요성을 고려해 볼 때, 시험된 모든 알부민 결합 폴리펩타이드는 Jonsson et al의 선행기술 유도체, 즉 PEP06923보다 월등하다.
실시예 4:
혈청 반응 분석
본원에 기술된 바와 같이 일련의 알부민 결합 폴리펩타이드에 결합될 수 있는 인간 혈청 함유 IgG의 비율을 ELISA로 분석하였다. 127명의 개인에 해당되는 총 149개의 혈청 샘플을 스크린하였다.
재료 및 방법
ELISA 플레이트(96-웰, half area plates (Costar, cat. No. 3690))를, 코팅 완충액(Sigma, cat. No. 3041) 중에 8 μg/ml로 희석시킨 50 μl/웰의 Albucult? (Novozymes)로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 3일 동안 밤새 코팅하였다. 분석하는 날에, 플레이트를 수돗물로 두 번 세척하고, 0.05% 카세인을 함유한 100 μl의 PBS(인산완충식염수)(PBSC)로 2 시간 동안 블로킹하였다. 플레이트를 비운 다음에는, PBSC 중에 2 μl/ml로 희석시킨 50 μl/웰의 알부민 결합 폴리펩타이드 PEP07913(SEQ ID NO:153), PEP06923(SEQ ID NO:154), PEP07271(SEQ ID NO:155), PEP07912(SEQ ID NO:157), PEP07554(SEQ ID NO:156), PEP07914(SEQ ID NO:158), PEP07968(DOTA-접합형 PEP07911, SEQ ID NO:159) 및 PEP07844(SEQ ID NO:161)를 미리 정해진 플레이트 레이아웃에 따라 첨가하였다. 플레이트를 실온(RT)에서 2 시간 동안 배양시킨 후, 자동 ELISA 세척기를 사용하여 PBSC로 4번 세척하였다. 129명의 개인으로부터 얻은 149개의 혈청 샘플은, 24μl의 혈청을 1174μl의 PBSC에 첨가하는 방식으로, PBSC로 50번 희석되었다. 50μl의 희석된 혈청을 상기 미리 정해진 플레이트 레이아웃에 따라 각 웰에 투입하였다. 각각의 혈청 샘플을 단일항 상태(singlet)로 시험하였다. 양성 대조군과 음성 대조군을 각각의 플레이트와 각각의 알부민 결합 폴리펩타이드에 포함시켰다. 알부민 결합 항체(50μl, PEP06923으로 면역된 영장류로부터 얻은 혈청으로부터 in house 방식으로 마련된 0.5 μl/ml 면역글로블린 용액)를 양성 대조군에 투입하고, 50μl PBSC를 음성 대조군으로 사용하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 배양시킨 후, 자동 ELISA 세척기를 사용하여 PBSC로 4번 세척하였다. PBSC 중에 10000배 희석시킨 50 μl/웰의 anti-human IgG(Southern Biotech, cat no 2040-05)를 사용하여, 결합된 IgG를 검출하였다. 자동 ELISA 세척기를 사용하여 PBSC로 4번 세척한 후, 50 μl/웰의 기질을 첨가하였다(Pierce cat. No. 34021). 각 웰에 50μl H2SO4를 첨가함으로써 10분 내지 15분 후에 반응을 중단시킨 후, 멀티-웰 플레이트 판독기((Victor3, Perkin Elmer)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
결과
알부민 결합 폴리펩타이드로의 IgG 결합에 대해 스크린된 149개의 혈청 중, 23개는 8개 폴리펩타이드(OD값 < 0.1) 모두에 대해 음성이었다. 즉, 폴리펩타이드에 IgG가 전혀 결합하지 않았다. 하나 이상의 알부민 결합 폴리펩타이드에 대해 양성이었던 126개의 혈청을 분석하였다. 평균 흡광도를 산출하고(도 3의 A), OD값이 0.15 미만(도 3의 B)이거나 1.0 초과(도 3의 C)인 혈청의 비율을 산출하였다. PEP07913(SEQ ID NO:153), PEP06923(SEQ ID NO:154) 및 PEP07844(SEQ ID NO:161)가 가장 높은 평균 OD값과 가장 높은 IgG과의 혈청 결합 비율을 가진 반면에, PEP07968(DOTA-접합형 PEP07911, SEQ ID NO:159), PEP07914(SEQ ID NO:158) 및 PEP07954(SEQ ID NO:156)는 가장 낮은 반응도를 보였다.
따라서, 가장 반응성이 좋은 알부민 결합 폴리펩타이드는 모체 G148-GA3(PEP07913, SEQ ID NO:153)과, G148-GA3로부터의 나선 (1)을 가지며 이전의 친화성이 향상된 유도체(PEP06923, SEQ ID NO:154)였다. 반응성이 더 좋은 폴리펩타이드(PEP07844, SEQ ID NO:161)의 세번째는 나선(1)의 14번 위치에 원래의 라이신을 함유한다. 이 잔기는 접합을 위한 것이므로, 최종 상황(final context)에 노출되지 않는다. 14번 위치(PEP07554, SEQ ID NO:156)에 알라닌을 가진 것을 제외하면, 상기 동일한 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체는 반응성이 가장 낮은 것들 중 하나이다.
실시예 5:
DOTA-접합형 알부민 결합 폴리펩타이드의 화학적 합성
재료 및 방법
고상 펩타이드 합성법(SPPS, Quibell, M. & Johnson, T., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis-A Practical Approach, W.C. Chan, P.D. White Eds, Oxford University Press 2000, 115-135에 기재된 바와 같음)에 의해 알부민 결합 폴리펩타이드 PEP07834(SEQ ID NO:160)를 433 A Peptide Synthesizer 반응기(Applied Biosystems, Foster City, CA)에서 0.1 mmol 스케일로, 즉, 0.1 mmol 펩타이드에 대한 이론적으로 가능한 수율로, 표준 Fmoc 화학을 이용하여 합성하였다. 산에 불안정한(acid-labile) Fmoc 아미드 수지를 합성 과정 내내 고체 담체로 사용하였다(Rink Amide MBHA Resin LL (100-200 mesh), 수지 1g 당 0.39 mmol 아미드를 투입함 (Novabiochem)).
반응기에서, 아래 서열에 따른 47개의 아미노산 잔기를 10분 동안 실온(RT)에서 혼합하면서 아실화 반응시켜 아미드 수지에 커플링시켰다. 아실화 반응은, 1 당량의 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU, IRIS Biotech), 1 당량의 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBt, IRIS Biotech) 및 2 당량의 디이소프로필에틸아민(DIEA, Applied Biosystems)으로 활성화된, NMP(N 메틸피롤리돈, Merck) 중에 10배 과잉몰로 용해된 Fmoc-보호형 아미노산을 사용하여 수행하였다. 또한, 활성화 및 커플링에 앞서, 모든 반응성 아미노산 측쇄를 표준 측쇄 보호기로 보호하였다(Asp, Glu, Ser, Thr 및 Tyr은 tert-부틸(tBu)로, Lys는 tert-부틸옥시카보닐(Boc)로, Arg는 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조퓨란-5-설포닐 (Pbf)로, 그리고 Asn 및 Cys는 트리틸(Trt)로 보호함). 절두형(truncated) 펩타이드를 유발시키는 미완료 커플링의 양을 줄이기 위해, 소량의 선택된 아미노산 잔기를 두 번의 아실화 반응으로 커플링시키되, 제1 및 제2 커플링 사이에는 후술되는 바와 같은 Fmoc 탈보호화 반응 없이 행한다. 합성된 알부민 결합 폴리펩타이드 PEP07834의 아미노산 서열은 ALASAKEAAN AELDCYGVSD FYKRLIDKAK TVEGVEALKD AILAALP-NH2 (SEQ ID NO:160-NH2)였다.
밑줄이 쳐진 아미노산 잔기들은 이중 커플링시켰다. 수지 결합된 펩타이드 상에 남아있는 모든 미반응 아미노기를 5분 동안 아세트산 무수물(0.5M 아세트산 무수물 (AlfaAesar), 0.125M DIEA, 0.015M HOBt in NMP)로 캡핑하였다. 모든 커플링이 끝나면, NMP 중의 20% 피페리딘(Sigma-Aldrich)으로 10분 동안 처리하여, 수지 결합 펩타이드 상의 N-말단 Fmoc기를 탈보호시켰다.
합성 과정이 완료된 후, 펩타이드를 고체 담체로부터 절단시키고, 동시에 TFA/EDT/H2O/TIS (94:2.5:2.5:1) (TFA: 트리플루오로아세트산(Apollo), EDT: 1,2-에탄디티올(Aldrich), TIS: 트리이소프로필실란(Aldrich), 2 시간 동안 실온에서 가끔씩 혼합시킴)로 처리하여 측쇄 보호기를 절단하였다. TFA 처리가 끝나면, 펩타이드를 물 중의 20% 아세토니트릴(Merck), 및 tert-부틸 메틸 에테르(Merck)를 사용하여 3번 추출하였다. 수용액층을 합쳐 여과시킨 후, 동결 건조시켰다.
미정제(crude) 펩타이드를 반제조용 RP-HPLC (Reprosil GOLD C18 300, 250*10 mm, 5μm 입도) 및 2.5 ml min-1의 유량으로 25분 동안 구배 32-55% B (A: 0.1 % TFA-H2O; B: 0.1 % TFA-CH3CN)로 분석 및 정제한 후, 동결 건조시켰다.
RP-HPLC에서의 미정제 생성물 분석결과로부터, 200nm 신호로부터의 피크들 아래의 통합면적을 산출하여 합성 수율을 구하였다. 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 질량 분광계(LC-ESI-MS)를 사용하여 6520 Accurate Mass Q-TOF LC/MS (Agilent Technologies)에서 정확한 분자량을 확인하였다. 생성물의 순도는 1.0 ml min-1의 유량으로 25분에 걸쳐 구배 35-55% B로 RP-HPLC(Reprosil GOLD C18 300, 250*4.6 mm, 3μm 입도)를 사용하여 확인하였다.
DOTA 접합
3mg의 PEP07834-아미드(SEQ ID NO:160-아미드)를 40℃에서 30분 동안 20mM DTT로 환원시켰다. 초과량의 DTT는, PD-10 컬럼(GE Healthcare)에서, 0.2M 암모늄 아세테이트, pH 5.5로의 완충액 변경 조작을 통해 제거하였다. 물 중에 5배 과잉몰로 용해된 킬레이터, 말레이미도-모노-아미드-DOTA(Macrocyclics, Cat. No. B-272) 용액(1 mg/ml)을 사용하여 커플링을 수행하였다. 혼합물을 계속 흔들면서 30℃에서 1 시간 동안 배양시켰다. 비-접합된 킬레이터로부터의 정제 조작은 반제조용 RPC 컬럼(Zorbax 300SB C18, 9.4x250 mm, 5μm)에서 행해졌다. 정제된 재료의 커플링도를 Zorbax 300SB C8 150 x 2.1 mm, 3.5μm 분석용 컬럼에서 HPLC-MS로 분석하였다. PEP07975로 표시된 말레이미드-DOTA-접합형 PEP07834만이 상기 방법에 의해 검출되었다.
결과
미정제 재료의 용출 프로파일에 근거하여, 알부민 결합 폴리펩타이드 PEP07834-아미드(SEQ ID NO:160-아미드)의 합성 수율이 8%인 것으로 결정하였다. 분자량은 4952.9 Da인 것으로 밝혀졌으며, 이는 이론적 분자량 산출치인 4952.6 Da과 잘 일치한다. 정제된 생성물을 분석한 결과, 약 10 내지 15%의 단백질이 디설파이드 연결된 동종이량체(homodimer)(도 4 및 도 5)인 것으로 밝혀졌다. DOTA-접합형 펩타이드 (PEP07975)의 결합 활성은 실시예 2에 기술된 바와 같이 확인하였으며(자료 미도시), 융점은 실시예 3에 기술된 바와 같이 구하였다.
실시예 6:
알부민 결합 폴리펩타이드의 면역원성 시험
52명 백인으로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)(CRI-Labo Medische Analyse, Gent, 벨기에로부터 얻음)에 T 세포 증식성을 유도하는 능력에 대해, PEP07913(SEQ ID NO:153), PEP07912(SEQ ID NO:157), PEP07914(SEQ ID NO:158), 및 PEP07968(DOTA-접합형 PEP07911, SEQ ID NO:159)을 스크린하였다. PEP07913은 N-말단 글리신 잔기를 가진 G148-GA3의 서열에 해당되는 한편, PEP07912, PEP07914 및 PEP07968은 본 발명에 따라 상이한 N-말단 아미노산이 첨가된 PP007(SEQ ID NO:7), PP013(SEQ ID NO:13) 및 PP037(SEQ ID NO:37)의 알부민 결합 폴리펩타이드의 예이다.
재료 및 방법
표준 세포 생물학적 방법에 따라 제조된 PBMC를 300000 PBMCs/웰의 양으로 조직 배양액(TC) 처리된 96-웰 환저형 플레이트(Falcon)에 첨가하였다. 900 μg/ml (3배 과잉몰)의 재조합 인간 알부민(Albucult?, Novozymes)을 추가로 함유한 AIMV 배지(Invitrogen)에 100 μl/웰의 알부민 결합 폴리펩타이드 PEP07913, PEP07912, PEP07914 및 PEP07968을 첨가시켜 세포를 자극시켰다. 이는 알부민 결합 폴리펩타이드의 최종 농도 30 μg/ml과 일치한다. 이러한 자극 조작은 8중 중복 방식으로, 즉, 같은 조건 하에서 동일한 알부민 결합 폴리펩타이드를 동일한 양으로 8개의 웰에 첨가시켰다. 양성 대조군 웰에서는, 세포를 30 μg/ml의 Keyhole Limpet 헤모시아닌(KLH, Calbiochem) 또는 30 μg/ml의 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid) (TT, Statens Serum Institut)로 자극하였다. 음성 대조군 웰에서는, 900 μg/ml의 알부민을 함유하거나 함유하지 않은 AIMV 배지만 첨가시켰다.
7일간의 배양이 끝나면 Alexa Fluor 488 Click-iT EdU 유동세포 분석기 키트(Invitrogen)를 사용하여 세포 증식을 분석하였다. 1 μM/웰의 EdU 통합 마커를 6일 째에 첨가하였다. 7일 째에는 세포를 세척시키고, 플레이트로부터 분리시킨 후, 다시 세척시키고, anti-CD3-PerCP 시약(Becton Dickinson) 및 anti-CD4-Alexa647 시약(Becton Dickinson)으로 30분 동안 염색하였다. 염색과정이 끝나면, 제조업자의 지침(Invitrogen)에 따라, 세포를 세척시키고, 고정(BD cellfix, BD biosciences)시키고 나서, (사포닌을 사용하여) 투과시키고, Click-iT 시약을 첨가시킴으로써 EdU를 위해 염색하였다. 염색 조작이 완료되면, 세포를 다시 세척시키고, 유동세포 분석기(FACSCantoII, BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다. 증식 세포들의 개수를 분석하기 위해, 정해진 수의 fluospheres(Invitrogen)를 각 웰에 첨가시킨 후에 분석한다. 모든 염색 과정과 세척은 96-웰 플레이트에 직접 수행되었다.
FACSCantoII 원자료를 CD3+ CD4+ T 세포 상에서 계층적으로 게이트처리(gate)하고, 게이트처리된 세포의 개수뿐만 아니라, EdU-Alexa Flour 488 통합 마커의 형광세기를 기록하였다. 증식 세포의 개수/단백질로 처리한 웰들의 8중-중복체들의 개수의 평균값을 양성 대조군 및 음성 대조군과 비교하고, 이에 따른 비(자극 지수(SI)로 표현됨)를 산출하였다. SI 및 복제물 사이의 차이(variation)에 근거하여, SI 문턱값을 2.0으로, 자극 및 저해에 대해서는 0.5로 각각 설정하였다.
결과
체외 PBMC 증식 분석법을 이용하여, 3배 초과량의 재조합 인간 알부민의 존재 하에 표적 인간 집단에서의 알부민 결합 폴리펩타이드 PEP07913, PEP07912, PEP07914 및 PEP07968의 면역원성 잠재성을 분석하였다. 알부민 대조군과 비교하여, PEP07913는 52명의 기증자 중 6명에, PEP07912는 52명의 기증자 중 5명에, PEP07914 및 PEP07968은 52명의 기증자 중 1명에 CD3+CD4+ T 세포 증식을 유도하였다(도 6의 A).
52명 기증자 모두에 대한 평균 자극지수(SI)는, 재조합 인간 알부민을 함유한 음성 대조군과 비교하여, PEP07914 및 PEP07968의 SI(각각, p = 0.79 및 0.48, 도 6의 B)는 눈에 띄게 다르지 않았다. PEP07913의 SI는 현저하게 더 높았던 반면에(p = 0.002), PEP07912에 대한 SI는 더 높기는 해도 현저하게 더 높지는 않았다(p = 0.03, 도 6의 B).
완충액과만 비교하였을 때, 반응을 보이는 개인들의 명수는 PEP07913의 경우는 10명, PEP07912의 경우는 7명, PEP07914의 경우는 2명, PEP07968의 경우는 1명, 재조합 인간 알부민의 경우는 2명, 두 가지 양성 대조군인 TT 및 KLH의 경우는 각각 49명 및 51명이었다(도 6의 C). 알부민 결합 폴리펩타이드는 그 면역원성에 따라 다음과 같은 순서로 순위가 매겨졌다: PEP07913 > PEP07912 > PEP07914 > PEP07968. PEP07914 및 PEP07968 모두는 비-면역원성인 것으로 확정되었다. 따라서 위 결과들은 본 발명의 알부민 결합 폴리펩타이드의 면역원성 잠재성이 양성 대조군과 비교해 낮다는 것을 증명한다.
실시예 7:
다양한 종으로부터 유래된 알부민에 대한 알부민 결합 폴리펩타이드의 친화성
본 실시예에서는, 실시예 1에서 발현하여 정제시킨 PEP06923(SEQ ID NO:154), PEP07986(SEQ ID NO:163) 및 PEP08296, (DOTA-접합형 PEP08185, SEQ ID NO:148)의 인간 혈청 알부민(HSA), 필리핀 원숭이(CSA), 랫트(RSA), 마우스(MSA) 및 개(DSA)에 대한 친화성 특성을 Biacore 기기로 파악하였다.
재료 및 방법
제조업자의 권고에 따라 CM-5 칩(연구 등급; GE Healthcare) 표면의 카복실화된 덱스트란층에 아민 커플링시켜 고정시킨 HSA(Albucult?, Novozymes), CSA(cynomolgus 혈청으로부터 얻어 in-house 정제시킴), RSA(Sigma-Aldrich, Cat. No. A6272), MSA (Sigma-Aldrich, Cat. No. A3559) 및 DSA(MP Biomedicals, Cat. No. 55925)를 Biacore 2000 기기(GE Healthcare) 상에서 바이오센서 분석하였다.
제1 칩에서, 표면(1)은 활성화시킨 후 비활성화시켜, 주입시 기준세포(블랭크 표면)로 사용한 반면에; 표면(2)은 1130 RU(공명단위)까지 고정된 HSA로 구성하고; 표면(3)은 1046 RU까지 고정된 CSA로 구성하고; 표면(4)은 831 RU까지 고정된 RSA로 구성하였다. 제2 칩에서, 표면(1)은 블랭크 표면으로 사용한 반면에, 표면(3)은 858 RU까지 고정된 MSA로 구성하였다. 제3 칩에서, 표면(1)은 블랭크 표면으로 사용한 반면에, 표면(2)은 1053 RU까지 고정된 DSA로 구성하였다.
HSA, CSA, 및 RSA(제1 칩)에 대한 친화성 분석을 위해, 정제된 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체를 러닝 완충액 HBS-EP(GE Healthcare)로 40nM, 10nM 및 2.5nM까지 희석하였고; MSA(제2 칩)에 대한 친화성 분석을 위해, 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체를 1280nM, 640nM, 160nM 및 40nM까지 희석하였으며; DSA(제3 칩)에 대한 친화성 분석을 위해, 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체를 1280nM, 640nM, 160nM, 40nM 및 10nM까지 희석하였다. 알부민 결합 폴리펩타이드를 5분 동안 50 μl/분의 일정 유량으로 주입한 후에, 여기에 60분 동안 HBS-EP를 주입하였다. 25μl 10mM HCl를 한 번 주입시켜 표면들을 재생시켰다. 모든 샘플에 두 번 반복 시행하였다.
이에 따른 결과를 BIAevaluation 소프트웨어(GE Healthcare)로 분석하였다. 리간드 표면의 곡선에서 블랭크 표면의 곡선을 뺐다.
결과
Biacore 2000 기기는 기술적 한계를 가져, 매우 높은 친화성 측정에 지장을 준다. 따라서, Biacore 연구의 목적은 HSA, CSA, RSA, MSA 및 DSA에 대한 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체의 친화성의 정확한 동역학적 변수들을 각각 구하고자 하는 것이 아니었다. 하지만, 이로 인한 결과는 본 폴리펩타이드의, 다양한 종으로부터의 알부민에 대한 상대적 친화성의 정량적 예측값을 제공한다. 기준 표면과 완충액 주입을 뺀 후, 질량 이동의 보정 기능과 국소적 변수로서 RUmax 세트를 가진 BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 1:1(Langmuir) 결합 모델에 곡선들을 맞추었다. 대표적 결합 곡선들을 도 7에 나타내었다.
PEP07986 및 PEP08296(DOTA-접합형 PEP08185)은 인간 혈청 알부민뿐만 아니라, 흔히 잠복기에 있는 모델 종들인 랫트, 필리핀 원숭이, 마우스 및 개로부터의 알부민에도 높은 친화성(KD가 피코몰 미만으로부터 나노몰 미만까지의 범위에 속함)으로 결합된다. 이러한 다양한 종들에 대한 상대적 친화도의 순위는 RSA ≥ HSA/CSA > MSA/DSA로 매겨질 수 있으며, 즉, KD값의 순위는 KD - RSA ≤ KD - HSA/KD - CSA < KD-MSA/KD-DSA로 매겨질 수 있다. KD값의 관점에서 친화도는 PEP06923(본 발명에 속하지 않는 폴리펩타이드) 경우에서 얻은 친화성과 같거나 약간 낮다(그러나, 버금가는 크기임).
실시예 8:
알부민 결합 폴리펩타이드에 융합된 단백질 Z 변이체의 체외 활성
본 실시예에서는, 인간 혈청 알부민의 존재 하에 TF-1 세포의 시토킨-유도성 증식을 차단하고자, 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체 PP013(SEQ ID NO:13)에 유전적으로 융합된 시토킨-특이 단백질 Z(포도상구균성 단백질 A의 도메인 B의 유도체) 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 관능성을 시험하였다. TF-1 세포의 증식은 여러종류의 시토킨 중 임의의 시토킨의 존재에 좌우되며, 상기 해당되는 시토킨-특이 단백질 Z 변이체와 같은 시약을 차단시킴으로써 증식성 반응을 억제시킬 수 있다. 관련없는 단백질에 대한 특이성을 가진 단백질 Z 변이체에 융합된 PP013을 음성 대조군으로 사용하였다.
재료 및 방법
Z의 클로닝 - PP013 융합 단백질
시토킨 X 또는 Y 각각에 대한 특이성을 갖거나, 또는 관련없는 단백질(음성 대조군)에 대한 특이성을 갖는 단백질 Z 변이체의 유전자 조각을, PstI 및 AccI 특이적 엔도뉴클레아제 부위들을 포함시키는 프라이머를 사용한 PCR에 의해 증폭시켰다. 이들 조각을 PstI 및 AccI로 절단하고, 정제시킨 후, 발현벡터인 플라스미드 pAY02747에 부착시켜, 동일한 효소로 잘랐다(restrict). pAY02747은 pBR322의 복제기원, 카나마이신 저항유전자, 및 목적 유전자의 발현을 위한 T7 프로모터를 함유한다. 클로닝 부위는 아미노산 MGSSLO를 인코딩하는 서열 앞에, 그리고 VDSS-PP013을 인코딩하는 서열 다음에 위치하며, 여기서 PP013은 SEQ ID NO:13인 노출된 알부민 결합 폴리펩타이드이다. 부착, 형질전환 및 서열 확인은 전술한 바와 같이 수행하였다.
인코딩된 단백질은:
1) MGSSLQ-ZX-VDSS-PP013 (ZX-PP013을 표시함)
2) MGSSLQ-ZY-VDSS-PP013 (ZY-PP013을 표시함)
3) MGSSLQ-Zneg-VDSS-PP013 (Zneg-PP013을 표시함)
단백질 발현
Zx-PP013,,ZY-PP013 및 Zneg-PP013을 E. coli BL21 (DE3) 세포에서 발현시켰다. 카나마이신을 보충하여 50 μg/ml로 농축시킨 50ml TSB+YE 배지에 각 융합 변이체를 형질변환시켜 얻은 콜로니를 사용하여 첫 배양액에 접종하였다. 배양물을 100rpm으로 교반하면서 밤새 37℃에서 성숙시켰다. 그런 후에는 카나마이신을 보충하여 50 μg/ml로 농축시킨 900ml TSB+YE 배지에 상기 첫 배양물을 사용하여 접종하였다. 배양액을 OD600 > 1.1이 될 때까지 약 1.5 시간 동안 성숙시켰으며, 여기에 IPTG를 첨가시켜 최종 농도를 0.2mM로 만들었다. 5 시간 동안 계속 배양시켰다. 원심분리(15600g, 4℃, 20분)시켜 세포 펠렛을 모은 후 정제 때까지 -20℃에 보관하였다.
단백질 정제
가용성 융합 단백질 변이체 ZX-PP013, ZY-PP013 및 Zneg-PP013이 들어 있는 동결 상태의 세포 펠렛을 50mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8에 재현탁시키고, 여기에 1000 U Benzonase?(1.01654.001, Merck)를 첨가하였다. 세포들을 초음파로 분쇄하였으며, 각 융합 단백질 변이체에 대해, 초음파처리된 현탁액을 원심분리(15분, 37000g, 4℃)시켜 맑게 만들었다. 상기 맑아진 현탁액 중에 1 x TST 완충액이 생성되도록 하는 부피의 20x TST-완충액 (20x [25mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 200mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 8.0])을 첨가하였다. 융합 단백질 변이체의 각 샘플을 HSA-Sepharose 칼럼(GE Healthcare)에 넣었다. TST-완충액에 이어, 5 mM NH4Ac, pH5.5로 세척한 후, 결합된 융합 단백질 변이체를 0.5M HAc, pH2.5로 용출시켰다.
융합 단백질 변이체를 다음과 같이 역상 크로마토그래피(RPC)로 더 정제시켰다. 각 변이체에 대해, RPC A 완충액 (수 중의 0.1% TFA)로 미리 평형상태로 만든 1ml Resource 15 RPC 컬럼(GE Healthcare)에, HSA-친화성 정제 단계로부터의 용출액을 넣었다. 컬럼 부피의 10 CV RPC A 완충액 및 5 CV RPC B 완충액(아세토니트릴 중의 0.1% TFA)으로 상기 컬럼을 세척한 다음, 결합된 융합 단백질을 20 CV가 넘는 선형구배 10-50% RPC B 완충액으로 용출시켰다. 유량을 2 ml/분으로 설정하고, 280nm에서의 흡광도를 모니터링하였다. 순수한 융합 단백질 변이체를 함유한 분획을 SDS-PAGE 분석으로 확인한 후, 풀 처리 하였다. 마지막으로, 일회용 PD-10 탈염용 컬럼(GE Health)을 사용하여 상기 완충액을 1xPBS(2.68mM KCl, 137mM NaCl, 1.47mM KH2PO4, 8.1mM Na2HPO4, pH 7.4) 완충액으로 변경하였다. 융합 단백질 변이체의 정체성을 확인하기 위해, 실시예 1에 기재한 바와 같이 SDS-PAGE 및 LC/MS 분석을 수행하였다.
Z-PP013 융합 단백질의 체외 세포 분석
공급업자가 권고한 대로 세포라인 TF-1(CLS Cat. No 300434)을 2 ng/ml rhGM-CSF(Miltenyi)가 첨가된 RPMI 1640 배지 + 10% 소 태아혈청(Gibco)에서 증식시켰다. 실험 당일에, 세포를 RPMI 1640 배지 + 10% 소 태아혈청으로 세척시켜 GM-CSF를 제거하였다.
ZX-PP013, ZY-PP013 및 Zneg-PP013 분자들을 시토킨 X 및 Y 각각과 혼합시키고, 5배 과잉몰의 HSA(Albucult?, Novozymes)와 혼합시킴으로써, 시토킨-유도성 증식을 차단시키는 ZX-PP013 및 ZY-PP013의 능력을 분석하였다. 일정 농도의 시토킨(4.9 pM)과 5배 과잉몰의 HSA를 사용하여 상기 분자들을 2배 희석 시리즈로 적정시켰다. 이러한 적정 처리는 100μl 부피의 96-웰 플레이트에서 수행되었다. 웰(100μl) 당 25000 세포들을 투입한 후, 플레이트를 3일 동안 37℃, 5% CO2에서 배양시켰다. 증식 측정을 위해, RPMI 1640 배지 + 10% 소 태아혈청에 두 배 희석시킨 19μl의 세포 증식 시약(Sigma) CCK-8을 각 웰에 첨가하였다. 4 시간이 지난 후에, 96-웰 플레이트 판독기(Victor3; PerkinElmer)를 이용하여 발색반응을 모니터링하였다.
결과
도 8에서 나타낸 바와같이, Zx-PP013, ZY-PP013 모두 HSA 존재 하에서의 각 시토킨-유도성 증식을 억제한 반면, 음성 대조군인 Zneg-PP013은 TF-1의 증식에 영향을 미치지 않았다. 이와 같이, 본 실험은 알부민 결합 폴리펩타이드를 포함한 융합 단백질과 결합되는 경우와, 또한 상기 융합 단백질이 알부민에 결합된 경우에, Z 분자의 관능성이 유지되었다는 것을 보여 준다.
실시예 9:
알부민 결합 폴리펩타이드의 장기 안정성
본 실시예에서는, 실시예 1에 기술된 바와 같이 발현하여 정제시킨 PEP07986(SEQ ID NO:163)을 4℃, 25℃ 및 40℃에서 3개월 동안 보관한 후 그 안정성을 조사하였다. Biacore 기기를 사용하여 HSA에 대한 폴리펩타이드의 결합성을 측정함으로써, 보관 후 폴리펩타이드의 상태를 조사하였다.
재료 및 방법
동결건조된 PEP07986을 멸균 NaPi 완충액(20mM 인산나트륨, 150mM 염화나트륨, pH 7.2)에 2 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 기준샘플(시간 = 0)을 꺼내 -80℃에 보관했다. 105μl의 일정부분(aliquot)을 파라필름으로 밀봉된 멸균 스크류캡 에펜도프 튜브에 담아 4℃, 25℃ 및 40℃에 보관하였다. 1주일, 2주일, 1개월 및 3개월 후에, 각 온도에 보관되어 있었던 샘플을 4℃까지 냉각시키고, 5분 동안 13000rpm으로 원심분리 시킨 다음 바이오센서 분석을 위해 -80℃에 보관하였다.
실시예 2에 전술된 바와 같이 기본적으로 바이오센서 분석을 수행하되, 704 RU(공명단위)까지 고정된 HSA(Albucult?, Novozymes)를 사용하였으며, 알부민 결합 폴리펩타이드 변이체를 10nM까지 희석하여 20 μl/분의 일정한 유량으로 10분 동안 주입한 후, HBS-EP를 10분 동안 주입하였다.
결과
4℃, 25℃ 및 40℃에 보관된 후 PEP07986(SEQ ID NO:163)은 HSA에 대한 결합성을 적어도 3개월 동안 유지하였다. 다양한 조건으로 보관된 PEP07986의 HSA에 대한 최대 결합 반응을 도 9에 나타내었다.
실시예 10:
극한 조건 하에서의 알부민 결합 폴리펩타이드의 안정성
본 실시예에서는, 낮은 pH(약 4.0) 완충액에서 열처리(90℃)된 후의 알부민 결합 폴리펩타이드 PEP08296(DOTA-접합형 PEP08185, SEQ ID NO:148)에 대한 바이오센서 및 원편광 이색성(CD) 분석을 기술한다. 이러한 극한 반응조건을 예를 들어 DOTA-변이형(modified) 단백질의 68Ga 표지용으로 이용해야 하기 때문에, 융점(Tm), 재접힘 특성 및 HSA로의 결합성을 측정함으로써, 높은 열과 낮은 pH 처리가 폴리펩타이드의 구조적 정체성 및 HSA로의 결합 능력에 미치는 영향을 조사하였다.
재료 및 방법
열 안정성에 대한 바이오센서 분석
제조업자의 권고에 따라 CM-5 칩(연구 등급; GE Healthcare) 표면의 카복실화된 덱스트란층에 아민 커플링시켜 고정시킨 HSA(Albucult?, Novozymes)를 Biacore 2000 기기(GE Healthcare) 상에서 바이오센서 분석하였다. 칩의 표면(1)은 활성화시킨 후 비활성화시켜, 주입시 기준세포(블랭크 표면)로 사용한 반면에; 표면(2)은 724 RU(공명단위)까지 고정된 HSA로 구성하였다.
15ml Falcon 튜브 안에 있는 PEP08296(50μl, 100μg)을 450μl 0.2M 아세트산나트륨(NaAc) pH 5.5로 희석시켜, 최종 펩타이드 농도를 0.2 mg/mL로 만들었다. 1.5ml 0.05M HCl(68Ge/68Ga 생성자를 용출시키는데 사용되는 조건 및 부피와 유사함)을 첨가시키고 나서, 샘플을 90℃ 또는 실온에서 10분 동안 배양시킨 후(대조군), 실온 환경으로 옮겼다. 6ml 0.1M 구연산나트륨을 첨가하여 pH를 중성화시켰다. 열처리된 PEP08296(0.8nM 및 4nM)을 5분 동안 50 μl/분의 일정 유량으로 주입한 다음, 15분 동안 HBS-EP 중에서 분리시켰다. 25μl 10mM HCl을 한 번 주입시켜 표면들을 재생시켰다. 이에 따른 결과를 BIAevaluation 소프트웨어(GE Healthcare)로 분석하였다. 리간드 표면의 곡선에서 블랭크 표면의 곡선을 뺐다.
융점(Tm) 측정
PEP08296을 PBS에 용해시켜 최종 농도를 0.5 mg/ml로 만들었다. 9.5μl 100mM HCl을 100μl PBS에 첨가시킴으로써, pH가 약 4인 PBS를 제조하였다. 실시예 3에 기술된 바와 같이 원편광 이색성(CD) 분석을 수행하였다.
열안정성에 대한 CD 분석
열처리된 후의 PEP08296의 구조적 가역성을 조사하기 위해, 20℃에서 195nm 및 250nm 사이의 CD 스펙트럼을 샘플 당 두 차례 기록하였다. 첫 번째 스펙트럼 이후, 전술된 바와 같이 90℃까지 가열하는 VTM 사이클을 시행하고 나서, 20℃에서 195nm 및 250nm 사이의 두 번째 CD 스펙트럼을 수집하였다. 또한, PEP08296을 90℃ 써모믹서(thermomixer)(500rpm, 간격을 두고 혼합시키는 방식 - 10초간 ON, 30초간 OFF) 내 PBS pH 4.0 완충액 또는 PBS pH 7.2 완충액에서 12분 동안 배양시켰다. 배양이 끝나면, 샘플을 얼음 상에서 냉각시키고, 이어서 1분 동안 13000rpm으로 원심분리시키고, 20℃에서 195nm 및 250nm 사이의 CD 스펙트럼을 기록하였다.
결과
낮은 pH와 열처리의 병용(즉, 폴리펩타이드의 68Ga-표지에 필요한 보편적인 조건)이 HSA에 결합되는 PEP08296의 능력에 영향을 미치는지 조사하기 위해 바이오센서 분석을 이용하였다. 도 10은 Biacore 2000 기기를 이용하여 수행된 상기 결합 분석의 결과를 나타낸다. 724 RU까지 고정시킨 인간 혈청 알부민이 포함된 표면 위에 두 가지 상이한 농도, 0.8nM 및 4Nm의 PEP08296을 주입하였다. 90℃에서 10분 동안 수행된 열처리와, pH 4.0의 조건은 HSA에 대한 PEP08296의 결합 능력을 약간 떨어뜨렸다. 이는 분자의 구조적 변화 가능성을 시사한다.
분자의 구조적 변화 가능성을 더 조사히기 위해 CD를 사용하였다. 열처리 전후로 CD 스펙트럼이 유사하다면 해당 샘플이 구조적으로 가역적임을 증명하는 것이다. 첫 번째 실험에서는, 샘플을 20℃ 내지 90℃의 온도구배로 가열하였다. 열처리 전후의 CD 스펙트럼은 Tm 측정 실험면에서 유사하였으며, 이때 207nm 및 221nm에서의 전형적인 최소값은 알파-나선도를 나타낸다. 즉, pH 4 또는 pH 7.2 완충액에서 90℃까지 짧은 시간 가열시키는 방식은 PEP08296의 구조에 전혀 영향을 미치지 않았다.
그러나, PEP08296을 90℃에서 12분 동안 미리처리한 후 pH 4.0에서 배양시킨 경우에는 PEP08296의 알파 나선 함량이 약간 감소하였지만, pH 7.2에서 배양시킨 경우에는 알파 나선 함량에 어떠한 변화도 없었다. 열처리 전후의 두 CD 스펙트럼에 대한 전형적인 오버레이(overlay)를 도 11에 나타내었다.
융점(Tm) 측정 결과를 표 4에 정리하였다
[표 4]
PEP08296의 Tm
Figure pct00004
실시예 11:
68 Ga - 표지된 알부민 결합 폴리펩타이드를 이용한 혈액 풀( pool ) 화상 작성
본 실시예를 구성하는 실험에서는, 68Ga-표지된 PEP08296(DOTA-접합형 PEP08185, SEQ ID NO:148)을 랫트에 전신 분포시킨 다음, 1.5 시간에 걸쳐 동적 화상을 작성하였다. 표지된 폴리펩타이드와 혈청 알부민 사이의 강한 회합(association) 덕분에, 표지된 폴리펩타이드는 예를 들어 혈액 풀 및 조직 투과성을 연구하는데 사용될 수 있다.
재료 및 방법
PEP08296의 68Ga-표지화
이전에 기술된 바와 같이, 0.1M HCl를 사용하여 68Ge/68Ga 생성자(Obninsk, 러시아)로부터 68Ga을 68GaCl3로서 용출시킨 후, 고농도의 HCl로 68Ga을 68GaCl4-로 전환시켜, 음이온 교환 컬럼(Chromafix-HCO3)에 트랩(trap)한 다음, 18 MΩ 물로 용출시켰다(Velikyan et al (2008), Nucl Med Biol 35:529-536).
표지화 작업은 기본적으로 Tolmachev et al.(EJNMMI 37:1356-1367, 2010)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 고농도의 68Ga-용출액(150-200μl)을 PEP08296 (≥100μg in 0.2M 아세트산나트륨 완충액 pH 5.5)에 첨가하고, 아세트산나트륨(1.25M) 또는 HCl(0.1M)을 사용하여 pH를 3.5 내지 4로 조절하였다. 이렇게 얻은 표지 혼합물(labeling mixture)을 15분 동안 90℃에서 배양시킨 다음 냉각시키고, 표지된 단백질을 생리적-완충 식염수로 용출된 NAP-5 컬럼 상에서 크기별 배제 정제법(size exclusion purification)을 통해 단리시켰다.
UV(210nm)를 사용하는 radio-HPL, 일련의 방사능 검출기, 및 생리적-완충 식염수로 용출된 Superdex Peptide 10/300 GL 컬럼(GE Healthcare)을 이용하여, 68Ga-표지된 단백질의 방사화학적 순도 및 정체성을 분석하였다.
작은 동물 PET
Euthanex사로부터의 Microflex 재호흡 방지 마스크를 사용하는 E-Z 기화기에 의한 제어 하에, 이소플루란(isoflurane)(7:3 비율의 공기/산소와 초기에는 5%, 다음에는 2% 혼합)으로 랫트(277g)를 마취시킨 후 microPET Focus 120 시스템(Siemens, CTI Concorde Microsystems) 안에 눕혀 놓되, 랫트를 가열 패드(37℃) 위에 계속 두었다. 68Ga-PEP08296, 33 MBq를 주사기에 정량주입하고, 식염수로 0.5ml까지 희석한 다음, 이를 꼬리 정맥을 통해 랫트에 주사하였다. 일정한 침대 모션 규칙(bed motion protocol)에 따라 1.5 시간 동안 침대를 움직여 전신으로부터 관련 자료를 얻었다. 이들 자료를 MicroPET Manager로 처리하고, 랜덤사항(random), 계수불능시간(dead time) 및 감쇠(decay)에 대해 자료를 보정하였다. 램프 필터를 이용하여 표준 2D-필터 역사영 기법으로 이미지들을 재구성하고, Inveon Research Workplace(Siemens Medical Solutions) 소프트웨어를 사용하여 평가하였다.
결과
PEP08296에 대한 기본적인 분포 유형(도 12)은, 68Ga-DOTA, 64Cu-DOTA 및 11C와 같은 방사성 동위 원소로 표지된 알부민의 기본 분포 유형과 매우 유사하였다(예컨대, Hoffend et al (2005), Nucl Med Biol 32:287-292 및 Lu et al (2008), "[1-11C] Butanol and [Methyl-11C] Albumin for Blood Flow and Blood Pool Imaging", XIth Turku PET 심포지엄에서의 포스터, 24-27 May, 2008 참고). 간단히 말해, 전체 스캔을 보았을 때, 높은 방사능 농도가 주요 혈관들에서 관찰되었다. 심장 혈액 풀 방사성 경우와 마찬가지로, 혈액량이 많은 기관(간, 비장, 및 신장)의 경우에도 분명하게 묘사되었다. 관찰 기간 동안 방광 내 방사성이 증가되었다. 이러한 신장 청소(renal elimination)에 대한 관찰사항은, 표지된 알부민계 트레이서 및 알부민 자체의 신진대사와 관련하여 관찰된 사항들과 일관성이 있다.
68Ga-PEP08296을 정맥내주사한 후의 방사능의 일반적 분포 유형과 매우 느린 혈장 청소율은, 68Ga-PEP08296이 알부민에 매우 빠르고 강하게 결합할 것이라는 예측과 일치한다. 따라서 이들 결과는, 질환이 발달되는 동안과 치료적 개입이 이루어지는 동안에, 조직 투과성의 양전자 방사 단층촬영 연구에 사용하기 위한 체내 혈액 풀 화상 작성제로서, 방사성 트레이서를 또한 적용할 수 있음을 뒷받침해 준다.
실시예 12:
알부민 결합 폴리펩타이드의 용해도
생리완충액에 대한 PEP07986(SEQ ID NO: 163)의 용해도 조사는, 한외여과법(ultrafiltration)을 이용하여 샘플을 연속하여 농축시킨 후, 농도를 측정하고, 응집 상태를 조사함으로써 수행되었다. 280nm에서의 흡광도를 직접 판독하여 구한 농도는 겔여과법으로 구한 농도와 일치하였으며, 이는 응집체가 전혀 검출되지 않는 용해도가 42 mg/ml보다 높다는 것을 나타낸다.
재료 및 방법
동결 건조된 PEP07986을 NaPi 완충액(20mM 인산나트륨, 150mM 염화나트륨, pH 7.2) 중에 3 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 컷오프가 3 kDa인 Amicon Ultra 원심분리 장치(Millipore, Cat. No. UFC800324)를 2ml NaPi 완충액으로 스윙식 버켓 로터 원심분리기(Multifuge, Heraeus)에서 원심분리(4000g, 20분)시킴으로써 예비세정하였다. 1620μl의 3 mg/ml PEP07986을 첫 번째 원심분리 여과기에 넣고 원심분리(4000g, 20℃, 7분)시켰다. 추가 분석을 위해 샘플의 25μl(UF 샘플 1)을 분리하고, 샘플의 나머지는 두 번째 원심분리 장치에 전달하였다. 이러한 원심분리 및 샘플 분리 조작을 각각 8분, 9분 및 20분(각각 UF 샘플 2, 3 및 4) 동안 회전시키면서 세 차례 반복하였다. UF 샘플 1-4를 NaPi 완충액 중에 각각 2배, 4배, 6배 및 12배로 희석시키고, NanoDrop? ND-1000 분광 광도계를 사용하여 흡광도를 판독하였다. 흡광계수 1 Abs 280=1.955 mg/ml를 적용하여 농도를 산출하였다. NaPi 완충액 내에서 평형상태로 만든 Superdex75 10/300 GL 칼럼(GE Healthcare)을 사용하여 1100 HPLC 시스템(Agilent Technologies) 상에서 젤 여과법을 수행하였다. 각 UF 샘플의 10μl를 칼럼에 투입하고; NaPi 완충액을 러닝완충액으로 사용하였으며, 이때 유량은 0.5 ml/분으로 설정하였다. 5 mg/ml의 농도로 주입된 분자량 표준 난백 알부민(GE Healthcare)의 크로마토그램도 수집하였다. 곡선 아래의 면적을 합쳐 농도를 구하였다.
결과
280nm에서의 흡광도를 직접 판독하여 측정된 농도, 및 겔 여과법에 의해 측정된 농도를 표 5에 나타내었다. 생리완충액(20mM 인산나트륨, 150mM 염화나트륨, pH 7.2)에 대한 PEP07986(SEQ ID NO: 163)의 용해도는 적어도 42mg/ml였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 겔 여과법의 경우에서는 어떠한 응집체도 검출되지 않았다.
[표 5]
PEP07986(SEQ ID NO: 163)을 연속적으로 농축시킨 후 측정된 농도
Figure pct00005
SEQUENCE LISTING <110> AFFIBODY AB <120> POLYPEPTIDES <130> 21052821 <150> US 61/399,285 <151> 2010-07-09 <150> US 61/403,561 <151> 2010-09-17 <160> 203 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 1 Leu Ala Ser Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 2 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 2 Leu Ala Ser Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ser Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 3 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 3 Leu Ala Ser Ala Lys Glu Ser Ala Asn Ser Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp 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Engineered albumin-binding polypeptide <400> 57 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ser Ala Asn Ser Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 58 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 58 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ser Ala Asn Ala Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 59 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 59 Leu Ala Glu Ala Lys Ser Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 60 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 60 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albumin-binding polypeptide <400> 163 Gly Ser Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser 1 5 10 15 Tyr Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr 20 25 30 Val Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 164 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 164 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Arg Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 165 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 165 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 166 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 166 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 167 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 167 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 168 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 168 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Arg Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 169 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 169 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Lys Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 170 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 170 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ser Leu Pro 35 40 45 <210> 171 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 171 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Arg Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 172 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 172 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 173 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 173 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 174 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 174 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 175 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 175 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Arg Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 176 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 176 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Lys Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 177 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 177 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ser Leu Pro 35 40 45 <210> 178 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 178 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Arg Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 179 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 179 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 180 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 180 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 181 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 181 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 182 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 182 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Arg Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 183 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 183 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Lys Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 184 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 184 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ser Leu Pro 35 40 45 <210> 185 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 185 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Arg Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 186 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 186 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 187 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 187 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 188 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 188 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 189 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 189 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Arg Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 190 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 190 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Lys Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 191 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 191 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ser Leu Pro 35 40 45 <210> 192 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 192 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Arg Glu Leu Asp Cys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 193 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 193 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Cys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 194 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 194 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Cys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 195 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 195 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Cys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 196 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 196 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Arg Glu Leu Asp Cys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 197 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 197 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Cys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Lys Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 198 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin-binding polypeptide <400> 198 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Cys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ser Leu Pro 35 40 45 <210> 199 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin binding polypeptide <400> 199 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu 35 40 45 <210> 200 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin binding polypeptide <400> 200 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu 35 40 45 <210> 201 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin binding polypeptide <400> 201 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu 35 40 45 <210> 202 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin binding polypeptide <400> 202 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu 35 40 45 <210> 203 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered albumin binding polypeptide <400> 203 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Cys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu 35 40 45

Claims (84)

  1. i) LAX3AKX6X7ANX10 ELDX14YGVSDF YKRLIX26KAKT VEGVEALKX39X40 ILX43X44LP
    (서로 독립적인
    X3은 E, S, Q 및 C 중에서 선택되고;
    X6은 E, S 및 C 중에서 선택되고;
    X7은 A 및 S 중에서 선택되고;
    X10은 A, S 및 R 중에서 선택되고;
    X14는 A, S, C 및 K 중에서 선택되고;
    X26은 D 및 E 중에서 선택되고;
    X39는 D 및 E 중에서 선택되고;
    X40은 A 및 E 중에서 선택되고;
    X43은 A 및 K 중에서 선택되고;
    X44는 A, S 및 E 중에서 선택되고;
    45번 위치에 있는 L은 존재하거나 부재하고;
    46번 위치에 있는 P는 존재하거나 부재함); 및
    ii) i)에 정의된 서열과 적어도 95% 상동성을 갖는 아미노산 서열 중에서 선택된 아미노산 서열
    을 포함하는 알부민 결합 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, X6이 E인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, X3이 S인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, X3이 E인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, X7이 A인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, X14가 S인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, X14가 C인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, X10이 A인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, X10이 S인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, X26이 D인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, X26이 E인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, X39가 D인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, X39가 E인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, X40이 A인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, X43이 A인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, X44가 A인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, X44가 S인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 45번 위치에 L이 존재하는 것인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 46번 위치에 P가 존재하는 것인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상호작용의 koff값이 5x10-5s-1 이하가 되도록 알부민에 결합되는, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  21. 제20항에 있어서, 상호작용의 koff값이 5x10-6s-1 이하가 되도록 알부민에 결합되는, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  22. 제1항에 있어서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1-144 및 SEQ ID NO:164-203 중 임의의 하나로 선택되는 것인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  23. 제22항에 있어서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:4-5, SEQ ID NO:7-8, SEQ ID NO:10-11, SEQ ID NO:13-14, SEQ ID NO:16-17, SEQ ID NO:19-20, SEQ ID NO:22-23, SEQ ID NO:25-26, SEQ ID NO:28-29, SEQ ID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35, SEQ ID NO:37-38, SEQ ID NO:41-42, SEQ ID NO:49-50, SEQ ID NO:164-170 및 SEQ ID NO:192-203 중 임의의 하나로 선택되는 것인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  24. 제22항에 있어서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1-144 중 임의의 하나로 선택되는 것인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  25. 제24항에 있어서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:4-5, SEQ ID NO:7-8, SEQ ID NO:10-11, SEQ ID NO:13-14, SEQ ID NO:16-17, SEQ ID NO:19-20, SEQ ID NO:22-23, SEQ ID NO:25-26, SEQ ID NO:28-29, SEQ ID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35, SEQ ID NO:37-38, SEQ ID NO:41-42 및 SEQ ID NO:49-50 중 임의의 하나로 선택되는 것인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, i)에 정의된 서열의 N- 및/또는 C-말단에 위치되는 하나 이상의 추가 아미노산 잔기를 더 포함하는, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  27. 제26항에 있어서, 추가 아미노산은 폴리펩타이드의 N-말단에 위치되는 하나 이상의 세린 잔기를 포함하는 것인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 추가 아미노산은 폴리펩타이드의 N-말단에 위치되는 글리신 잔기를 포함하는 것인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 아미노산은 폴리펩타이드의 N-말단에 위치되는 시스테인 잔기를 포함하는 것인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 아미노산은 폴리펩타이드의 C-말단에 위치되는 라이신 잔기를 포함하는 것인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 아미노산은 폴리펩타이드의 C-말단에 위치되는 글리신 잔기를 포함하는 것인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 아미노산은 폴리펩타이드의 C-말단에 위치되는 시스테인 잔기를 포함하는 것인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:145-150 및 SEQ ID NO:162-163 중 임의의 하나로 선택되는 것인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이하의 시스테인 잔기를 포함하는, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  35. 제34항에 있어서, 1개 이하의 시스테인 잔기를 포함하는, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합되는 것인, 알부민 결합 폴리펩타이드.
  37. i) 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 기재된 알부민 결합 폴리펩타이드로 구성된 제1 모이어티; 및
    ii) 원하는 생물학적 활성을 가진 폴리펩타이드로 구성된 제2 모이어티
    를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체.
  38. 제37항에 있어서, 원하는 생물학적 활성을 갖는 제2 모이어티는 치료 활성 폴리펩타이드인 것인, 융합 단백질 또는 접합체.
  39. 제38항에 있어서, 원하는 생물학적 활성을 갖는 제2 모이어티는 인간의 내인성 효소, 호르몬, 성장 인자, 케모킨, 시토킨 및 림포킨으로 구성된 군에서 선택되는 것인, 융합 단백질 또는 접합체.
  40. 제39항에 있어서, 제2 모이어티는 IL-2, GLP-1, BNP, IL-1-RA, KGF, Stemgen?, GH, G-CSF, CTLA-4, 미오스타틴, VII 인자, VIII 인자 및 IX 인자로 구성된 군에서 선택되는 것인, 융합 단백질 또는 접합체.
  41. 제38항에 있어서, 원하는 생물학적 활성을 갖는 제2 모이어티는 박테리아성 독소, 효소 및 활성화 단백질로 구성된 군에서 선택된, 비(非)-인간의 생물학적으로 활성인 단백질인 것인, 융합 단백질 또는 접합체.
  42. 제37항에 있어서, 원하는 생물학적 활성을 갖는 제2 모이어티는 표적 분자와 선택적으로 상호작용할 수 있는 결합 폴리펩타이드인 것인, 융합 단백질 또는 접합체.
  43. 제42항에 있어서, 결합 폴리펩타이드는 항체, 및 항체 결합 활성을 실질적으로 보유한 항체의 조각 및 도메인; 미소체, 맥시바디(maxybody), 아비머(avimer) 및 기타 소(小) 디설파이드-결합 단백질; 및 포도상구균 단백질 A 및 그의 도메인, 기타 3중 나선 도메인, 리포칼린, 안키린 반복 도메인, 셀룰로오스 결합 도메인, γ 결정, 녹색 형광 단백질, 인간 세포독성 T 림프구-관련 항원 4, 프로테아제(단백질 분해 효소) 억제제들, 이를테면, Kunitz 도메인, PDZ 도메인, SH3 도메인, 펩타이드 앱타머, 포도상구균 뉴클레아제(핵산 분해 효소), 텐다미스타트(tendamistat), 파이브로넥틴 타입 III 도메인, 트랜스페린, 아연 집게(zinc finger) 및 코노톡신으로 구성된 군에서 선택된 골격(scaffold)으로부터 유도된 결합 단백질로 구성된 군에서 선택되는 것인, 융합 단백질 또는 접합체.
  44. 제43항에 있어서, 상기 표적 분자는 알츠하이머 질환의 아밀로이드 Aß 펩타이드; 기타 질환과 관련된 아밀로이드 펩타이드; 독소, 이를테면 박테리아성 독소 및 사독(蛇毒); 혈액 응고 인자, 이를테면 von Willebrand 인자; 인터류킨, 이를테면 IL-13; 미오스타틴; 전염증성 인자, 이를테면 TNF-α, TNF-α 수용체, IL-1, IL-8 및 IL-23; 보체 인자, 이를테면 C3 및 C5; 과민증 매개체, 이를테면 히스타민 및 IgE; 종량-관련 항원, 이를테면 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD40, CD52, CD70, cMet, HER1, HER2, HER3, HER4, CAIX(탄산 탈수효소 IX), CEA, IL-2 수용체, MUC1, PSMA, TAG-72; 및 기타 생물학적 분자, 이를테면 G-CSF, GM-CSF, GH, 인슐린 및 소마토스타틴으로 구성된 군에서 선택되는 것인, 융합 단백질 또는 접합체.
  45. 제37항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 모이어티의 생물학적 활성과 동일하거나 상이할 수 있는 추가의 원하는 생물학적 활성을 가진 폴리펩타이드로 구성된 추가 모이어티를 포함하는, 융합 단백질 또는 접합체.
  46. 제45항에 있어서, 제2 모이어티는 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같고, 추가 모이어티는 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 것인, 융합 단백질 또는 접합체.
  47. 제37항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 모이어티는 폴리펩타이드의 X14 위치에 있는 임의의 시스테인 잔기의 티올기를 통해 제1항 내지 제36항의 어느 한 항에 기재된 알부민 결합 폴리펩타이드에 접합되는 것인, 접합체.
  48. 세포살상제(cytotoxic agent)를 더 포함하는, 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 기재된 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체.
  49. 제48항에 있어서, 세포살상제는 칼리치마이신(calicheamycin), 아우리스타틴(auristatin), 독소루비신(doxorubicin), 메이탄시노이드(maytansinoid), 탁솔(taxol), 엑티나시딘(ecteinascidin), 겔다나마이신(geldanamycin), 메토트렉세이트(methotrexate) 및 이들의 유도체, 및 이들의 조합물 중에서 선택되는 것인, 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체.
  50. 표지를 더 포함하는, 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 기재된 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체.
  51. 제50항에 있어서, 상기 표지는 형광 염료 및 형광 금속, 발색단 염료, 화학발광성 화합물 및 생발광성 단백질, 효소, 방사성 핵종 및 입자로 구성된 군에서 선택되는 것인, 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체.
  52. 제51항에 있어서, 시스테인 잔기의 티올기 또는 라이신 잔기의 아민기를 통해 알부민 결합 폴리펩타이드에 접합된 폴리아미노폴리카복실레이트 킬레이터에 의해 제공되는 킬레이트화 환경을 포함하는, 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체.
  53. 제52항에 있어서, 폴리아미노폴리카복실레이트 킬레이터는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 또는 이의 유도체인, 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체.
  54. 제53항에 있어서, 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 유도체는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리스-아세트산-10-말레이미도에틸아세타미드인, 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체.
  55. 제52항에 있어서, 폴리아미노폴리카복실레이트 킬레이터는디에틸렌트리아민펜타아세트산 또는 이의 유도체인, 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체.
  56. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 기재된 알부민 결합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  57. 제56항에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩타이드의 제조 방법.
  58. 제56항에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  59. 제58항에 기재된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  60. 아미노산 및/또는 아미노산 유도체를 단계적 커플링시켜, 반응성 측쇄가 보호된, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩타이드를 형성하는 단계;
    폴리펩타이드의 반응성 측쇄로부터 보호기를 제거하는 단계; 및
    폴리펩타이드를 수용액 내에서 접는 단계를 포함하는 아미노산 및/또는 반응성 측쇄가 보호된 아미노산 유도체를 사용하는 비-생물학적 펩타이드 합성법에 의해,
    제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩타이드의 제조 방법.
  61. 제60항에 기재된 방법에 의해 알부민 결합 폴리펩타이드를 생성하는 단계; 및
    생성된 알부민 결합 폴리펩타이드를 제38항 내지 제48항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제2 모이어티 및/또는 추가 모이어티와 접합하는 단계를 포함하는,
    제37항 내지 제48항 중 어느 한 항에 기재된 접합체의 제조 방법.
  62. 약물로 사용되는, 제37항 내지 제55항 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질 또는 접합체.
  63. 제62항에 있어서, 원하는 생물학적 활성을 자체적으로 가진 폴리펩타이드를 포유동물에 투여시 유도되는 면역반응과 비교하여, 포유동물에 투여시 면역반응을 전혀 이끌어내지 못하거나 감소된 면역반응을 이끌어 내는, 융합 단백질 또는 접합체.
  64. 제37항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 진단에 사용되는 융합 단백질 또는 접합체.
  65. 자체 수용해도가 100 μg/ml 이하이고,
    제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 기재된 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체에 공유결합되는 화합물
    을 포함하는 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 상기 용해도는 10 μg/ml 이하인, 조성물.
  67. 제66항에 있어서, 상기 용해도는 1 μg/ml 이하인, 조성물.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 약학적으로 활성인 화합물인, 조성물.
  69. 제68항에 있어서, 상기 약학적으로 활성인 화합물은 세포살상제인, 조성물.
  70. 제69항에 있어서, 상기 세포살상제는 제49항에 정의된 바와 같은 것인, 조성물.
  71. 제69항에 있어서, 상기 세포살상제는 천연유래 화합물로부터 유도되지 않는 합성 케모톡신인, 조성물.
  72. 제65항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 임상적으로 관련된 표적에 대해 결합 친화성을 갖는 결합 폴리펩타이드를 더 포함하는, 조성물.
  73. 제72항에 있어서, 상기 결합 폴리펩타이드는 제43항에 정의된 바와 같은, 조성물.
  74. 제65항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 혈청 알부민을 더 포함하는, 조성물.
  75. 제65항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 약물로 사용되는, 조성물.
  76. 제65항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 진단에 사용되는, 조성물.
  77. a) 자체 수용해도가 100 μg/ml 이하인 화합물을 제공하는 단계; 및
    b) 상기 화합물을 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 기재된 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체에 공유결합시킴으로써, 화합물 및 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체의 공유 착물을 포함하는 조성물을 형성하는 단계를 포함하는,
    제65항 내지 제76항 중 어느 한 항에 기재된 조성물의 제조 방법.
  78. 제77항에 있어서, c) 화합물 및 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체를 포함하는 상기 착물을 알부민과 혼합함으로써, i) 화합물 및 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체의 공유 착물과, ii) 알부민의 비-공유 착물을 포함하는 조성물을 형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 비-공유 착물을 포함하는 상기 조성물을 동결 건조시켜, 동결 건조된 상태의 조성물을 수득하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  80. 자체 수용해도가 100 μg/ml 이하인 화합물을 제공하는 단계;
    상기 화합물을 제1항 내지 제47항 중 어느 한 하에 기재된 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체에 공유결합시킴으로써, 화합물 및 알부민 결합 폴리펩타이드의 공유 착물을 형성하는 단계; 및
    화합물 및 알부민 결합 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 접합체를 포함하는 상기 착물을, 알부민 결합 폴리펩타이드와 인간 혈청 알부민의 비-공유성 회합을 촉진하는 조건 하에서, 알부민과 혼합시키는 단계를 포함하며,
    상기 착물 중 화합물의 수용해도는 화합물 자체의 수용해도보다 높은 것인, 화합물의 수성용해도를 증가시키는 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 용해도는 제66항 또는 제67항에 정의된 바와 같은 것인, 방법.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서, 상기 화합물은 제68항 내지 제71항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 것인, 방법.
  83. 제80항 내지 제82항에 중 어느 한 항에 있어서, 상기 착물은 임상적으로 관련된 표적에 대해 결합 친화성을 갖는 폴리펩타이드를 더 포함하는 것인, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 결합 폴리펩타이드는 제43항에 정의된 바와 같은 것인, 방법.
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