JP2016528879A - タンパク質の同一性および安定性を評価する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2013年6月17日に出願された米国特許仮出願第61/836,034号の優先権の利益を主張するものであり、上記出願はその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示についてさらに説明する前に、本開示は本明細書に記載される特定の実施形態に限定されるものではないことが理解されるべきであり、また本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明するのが目的であって、限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。
生物学的製剤の生産には、望ましくないタンパク質修飾が起こる可能性があり、かつ生物学的製剤の汚染が起こる可能性が高いことから、極めて厳密な品質管理が必要である。例えば生産バッチ(「ロット」)毎に活性医薬品成分(API)のアミノ酸配列の整合性を評価し確実にするためには一般にロットリリース試験が用いられる。
特に明示されない限り、次に挙げる用語は以下に記載する意味を有するものとする。その他の用語については本明細書全体の他の箇所で定義する。
ヒトサイトカイン合成阻害因子(CSIF)としても知られる抗炎症性サイトカイン、IL−10は、2型(クラス2)サイトカインに分類され、このサイトカイン集団にはIL−19、IL−20、IL−22、IL−24(Mda−7)、およびIL−26、インターフェロン(IFN−α、−β、−γ、−δ、−ε、−κ、−Ω、および−τ)ならびにインターフェロン様分子(リミチン、IL−28A、IL−28B、およびIL−29)が含まれる。
本開示のポリペプチドは、非組換え法(例えば、化学合成)および組換え法を含む任意の適切な方法によって作製できる。
ポリペプチドを化学的に合成する場合、液相または固相を介して合成を進め得る。固相ペプチド合成(SPPS)では非天然のアミノ酸の組み込みおよび/またはペプチド/タンパク質主鎖の修飾が可能である。本開示のポリペプチドの合成には、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)およびt−ブチルオキシカルボニル(Boc)などの様々な形態のSPPSを用いることができる。化学合成の詳細は当該技術分野で公知である(例えば、Ganesan A.(2006)Mini Rev.Med.Chem.6:3−10;およびCamarero J.A.ら,(2005)Protein Pept Lett.12:723−8)。
ヒト(およびマウス)IL−10の調製について記載している方法が、例えば米国特許第5,231,012号にみることができ、この特許には組換えをはじめとする合成技術を含め、IL−10活性を有するタンパク質の作製方法が教示されている。IL−10はウイルス起源であってもよく、エプスタイン・バーウイルス由来のウイルスIL−10(BCRF1タンパク質)のクローン化および発現が、Mooreら,(1990)Science 248:1230に開示されている。IL−10は、本明細書に記載されるものなどの当該技術分野で公知の標準的な技術を用いた多数の方法で入手できる。組換えヒトIL−10もまた、例えばPeproTech社(ロッキーヒル、ニュージャージー州)から市販されている。
A.アミド結合置換
いくつかの場合には、IL−10はペプチド結合以外の1つまたは複数の結合を含み、例えば、少なくとも2つの隣接するアミノ酸がアミド結合以外の結合を介して連結されている。例えば、望ましくないタンパク質分解または他の分解の発生源を減少させる、もしくは除去するために、および/または血清中での安定性を増大させるために、および/または立体配座の柔軟性を制限する、もしくは増大させるために、IL−10主鎖内の1つまたは複数のアミド結合を置換し得る。
IL−10ポリペプチドに1つまたは複数のアミノ酸置換を実施できる。次に挙げるのは非限定的な例である:
a)アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、(S)−2−アミノ酪酸、(S)−シクロヘキシルアラニンまたは分岐状、環状および直鎖状のアルキル、アルケニルまたはアルキニル置換を含むC1〜C10炭素から脂肪族側鎖によって置換されたその他の単純アルファアミノ酸を含む、アルキル置換疎水性アミノ酸の置換;
b)フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、スルホチロシン、ビフェニルアラニン、1−ナフチルアラニン、2−ナフチルアラニン、2−ベンゾチエニルアラニン、3−ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジンを含み、上記芳香族アミノ酸のアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アザ、ハロゲン化(フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード)またはアルコキシ(C1〜C4から)置換型(その具体例には、2−、3−または4−アミノフェニルアラニン、2−、3−または4−クロロフェニルアラニン、2−、3−または4−メチルフェニルアラニン、2−、3−または4−メトキシフェニルアラニン、5−アミノ−、5−クロロ−、5−メチル−または5−メトキシトリプトファン、2’−、3’−または4’−アミノ−、2’−、3’−または4’−クロロ−、2、3または4−ビフェニルアラニン、2’−、3’−または4’−メチル−、2−、3−または4−ビフェニルアラニンおよび2−または3−ピリジルアラニンがある)を含む、芳香族置換疎水性アミノ酸の置換;
c)アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン、2,3−ジアミノプロピオン酸、ホモアルギニンを含み、置換基がヘテロ原子(アルファ窒素、または1つもしくは複数の遠位窒素)上にあるか、アルファ炭素上にあるのかを問わず、例えばプロR位にある、上記アミノ酸のアルキル、アルケニル、またはアリール置換(分岐状、直鎖状、または環状のC1〜C10から)誘導体を含む、塩基性側鎖を含むアミノ酸の置換。具体例となる化合物としては、N−イプシロン−イソプロピル−リジン、3−(4−テトラヒドロピリジル)−グリシン、3−(4−テトラヒドロピリジル)−アラニン、N,N−ガンマ、ガンマ’−ジエチル−ホモアルギニンが挙げられる。またアルキル基がアルファ炭素のプロR位を占めるアルファ−メチル−アルギニン、アルファ−メチル−2,3−ジアミノプロピオン酸、アルファ−メチル−ヒスチジン、アルファ−メチル−オルニチンなどが挙げられる。またアルキル、芳香族、ヘテロ芳香族(ヘテロ芳香族基が1つまたは複数の窒素、酸素または硫黄原子を単一で、または組み合わせて有する場合)、カルボン酸または酸塩化物、活性エステル、活性アゾリドおよび関連する誘導体などの多数の周知の活性化誘導体のいずれかと、リジン、オルニチン、または2,3−ジアミノプロピオン酸とから形成されるアミドが挙げられる;
d)アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、チロシン、2,4−ジアミノプリオピオン酸(diaminopriopionic acid)のアルキル、アリール、アリールアルキル、およびヘテロアリールスルホンアミド、オルニチンまたはリジンならびにテトラゾール−置換アルキルアミノ酸を含む、酸性アミノ酸の置換;
e)アスパラギン、グルタミン、およびアスパラギンもしくはグルタミンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を含む、側鎖アミド残基の置換;ならびに
f)セリン、トレオニン、ホモセリン、2,3−ジアミノプロピオン酸、およびセリンもしくはトレオニンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を含む、ヒドロキシル含有アミノ酸の置換。
IL−10ポリペプチドにシステイン残基またはシステイン類似体を導入して、ジスルフィド結合を介した別のペプチドとの結合を生じさせるか、IL−10ポリペプチドの環化を生じさせることができる。システインまたはシステイン類似体を導入する方法は当該技術分野で公知である(例えば、米国特許第8,067,532号を参照されたい)。
多くの場合、本明細書に開示される治療様式(例えば、IL−10分子)および/またはこれを投与する方法の1つまたは複数の物理学的特性を改善するのが有益であり、かつ不可欠な場合もある。物理学的特性の改善としては、例えば、免疫原性の調節;溶解性、バイオアベイラビリティ、血漿半減期を増大させる方法;および生物活性の調節が挙げられる。ある特定の修飾もまた、例えば、検出アッセイに使用する抗体を得る(例えば、エピトープタグ)ため、およびタンパク質精製を容易にするために有用であり得る。このような改善は一般に、治療様式の生物活性に悪影響を及ぼさず、かつ/またはその免疫原性を増大させずに得られるものでなければならない。本開示が企図するIL−10分子の修飾としては、特に限定されないが、PEG化、グリコシル化(N−およびO−結合);ポリシアル化;血清アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)、カニクイザル血清アルブミン、またはウシ血清アルブミン(BSA))を含むアルブミン融合分子;例えば共役脂肪酸鎖(アシル化)を介したアルブミン結合;およびFc−融合タンパク質が挙げられる。
生物学的作用物質は、その作製に用いる出発物質および製造工程の変化に対して感受性があるため、一貫して生産し特徴付けするのが困難であり得る。したがって、生物学的製剤には、一般に精密な化学的方法によって合成される小分子よりもさらに規制要件および監督が課せられる。各バッチまたは「ロット」内の生物学的製剤が、必要な効力(例えば、生体内安定性と関係がある効力)を有し、一貫して同じAPIを含有し、かつ人に使用するのに安全であることを確実にするため、ロットリリース評価を用いる。
生物学的製剤の生産には、望ましくないタンパク質修飾および汚染が起こる可能性があることから、極めて厳密な品質管理が必要である。この厳密な品質管理の要素には、タンパク質生物学的製剤の各生産バッチ(ロット)に対するアミノ酸配列の整合性の確認が必要である。ペプチドマッピング(「ペプチドマスフィンガープリンティング」とも呼ばれる)は、構造決定およびタンパク質生物学的製剤の配列同一性の確認のための有効な方法であり、組換えによって得られたタンパク質の品質管理に不可欠な分析方法である。
本明細書に示されるように、トリプシンによるタンパク質消化(「トリプシンマッピング」)はタンパク質の構造を決定するための(例えば、新たに発見されたタンパク質を含む)主要な方法である。トリプシンによる酵素的消化は、LysおよびArg残基のC末端側で切断し、適切な条件下では一般に定量的であり、4Mもの高濃度の尿素に耐え、ならびにグリコシル化部位およびジスルフィド結合の位置を特定するのに使用可能であることから有利である。トリプシンマッピングは、ロット間の製品の一貫性、発現エラー、変異および脱アミノ化部位に関する情報を提供し、組換えタンパク質の品質管理のためのバイオテクノロジーにおいてより頻繁に使用されている。
表1に記載されているように、エンドプロテイナーゼGlu−C(Endo Glu−C)はタンパク質消化の代替酵素である。Endo Glu−Cは組換えによって作製されるセリンプロテアーゼ(クローン化しバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)で発現させた黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)プロテアーゼV8遺伝子)であり、タンパク質を高い特異性でグルタミン酸およびアスパラギン酸残基のC末端で切断し、したがって質量分析に利用可能な独特のペプチド断片が得られる。Endo Glu−Cは数十年の間タンパク質の特徴付けに使用されているが、近年、質量分析技術の進歩により、その重要性が増している。Endo Glu−C試薬は、New England BioLabs社(イプスウィッチ、マサチューセッツ州)およびWorthington Biochemical社(レイクウッド、ニュージャージー州)を含む多数の供給業者から市販されている。
酵素的消化および化学的消化により、本明細書に記載されるIL−10、PEG−IL−10、およびその他のIL−10関連分子の断片化を実施し得る。上の表1に記載した薬剤を断片化の候補として評価し得る。その他の因子も適切であり得るが、異なる消化により得られるペプチドのメンバーと比べより少数の、より分離されたペプチドのメンバーを含むペプチドマップが得られるIL−10の消化が、様々なロットおよび条件にわたる解釈により容易である。
本開示は、様々な疾患、障害および/または病態、ならびに/あるいはその症状の治療または予防における本明細書に記載されるIL−10分子(例えば、PEG−IL−10)の使用を企図する。以下に特定の使用について詳細に記載するが、本開示はそれに限定されないことを理解するべきである。さらに、以下に特定の疾患、障害および病態の一般的なカテゴリーを記載するが、これらの疾患、障害および病態には2つ以上のカテゴリーのメンバーになり得るもの(例えば、癌関連障害および繊維関連障害)もあれば、本開示のいずれのカテゴリーのメンバーにもなり得ないものもある。
本開示に従って、本明細書に記載されるIL−10分子(例えば、PEG−IL−10)を、癌および癌関連疾患、障害または病態を含む、増殖性疾患、障害または病態の治療または予防に使用できる。本開示は、例えば、調節T細胞および/またはCD8+T細胞の活性を調節することによって、腫瘍細胞または癌細胞抗原に対する寛容性を低下させることを企図する(例えば、Ramirez−Montagutら(2003)Oncogene 22:3180−87;およびSawayaら(2003)New Engl.J.Med.349:1501−09を参照されたい)。特定の実施形態では、腫瘍または癌は、結腸癌、卵巣癌、乳癌、黒色腫、肺癌、膠芽腫、または白血病である。癌関連疾患、障害および病態という用語(1つまたは複数)の使用は、癌に直接的または間接的に関連する病態を広義に指すことを意図するものであり、例えば、異形成などの血管新生および前癌状態がこれに含まれる。
本開示はまた、ある特定の心血管疾患および/または関連する代謝関連疾患、障害および病態、ならびにこれに関連する障害の治療および/または予防のための本明細書に記載されるIL−10剤(PEG−IL−10)の使用を企図する。
循環系を流れる血流の閉塞をもたらす、血管内側での塞栓(血餅)の形成である血栓症は、以下の(ウィルヒョウの三徴):凝固能亢進、内皮細胞損傷、または血流障害(うっ血、乱流)のうち1つまたは複数に異常が生じることよって起こり得る。
本明細書で使用される「免疫疾患」、「免疫病態」、「免疫障害」、「炎症性疾患」、「炎症性病態」、「炎症性障害」などの用語は、任意の免疫関連または炎症関連病態(例えば、病理学的炎症および自己免疫疾患)を広義に包含するものとする。このような病態はしばしば他の疾患、障害および病態と密接に絡み合っている。例として、「免疫病態」は、感染症(急性および慢性)、腫瘍、および免疫系により除去に抵抗性のある癌を含む、癌、腫瘍、および血管新生などの増殖性病態を指し得る。
ウイルス性疾患におけるIL−10の役割が注目を集めつつある。IL−10は、例えば、その受容体結合活性に応じて、刺激作用と阻害作用の両方をもたらすと仮定されてきた。
本開示のIL−10分子(例えば、PEG−IL−10)は、対象への投与に適した組成物の形態であり得る。このような組成物は一般に、本明細書に記載されるIL−10剤と、1つまたは複数の薬学的または生理的に許容される希釈剤、担体または添加剤とを含む「医薬組成物」である。ある特定の実施形態では、IL−10剤は治療上許容される量で存在する。医薬組成物は本開示の方法で使用でき、したがって、例えば、本明細書に記載される治療および予防方法ならびに使用を実施するために、医薬組成物をex vivoまたはin vivoで対象に投与できる。
本開示は、本開示によって企図される疾患、障害および病態を治療または予防するために1つまたは複数の活性な治療剤(例えば、サイトカイン)またはその他の予防様式もしくは治療様式(例えば、放射線照射)と組み合わせたIL−10分子(例えば、PEG−IL−10)の使用を企図する。このような併用療法では、様々な活性な薬剤が異なる相補的な作用機序を有することが多い。このような併用療法は、1つまたは複数の薬剤の用量を低減でき、それにより1つまたは複数の薬剤に関連する有害作用を軽減または除去することによって、特に有利であり得る。さらに、このような併用療法は、基礎となる疾患、障害、または病態に対し相乗的な治療効果または予防効果を有し得る。
本開示のIL−10ポリペプチド(例えば、PEG−IL−10)は、例えば、投与の目標(例えば、所望の解消の程度);製剤を投与する対象の年齢、体重、性別、および健康状態;投与経路;ならびに疾患、障害、病態またはその症状の性状に応じた量で対象に投与し得る。投与レジメンはまた、投与する薬剤(1つまたは複数)に関連する何らかの有害作用の存在、性状、および程度を考慮してもよい。効果的な投与量および投与レジメンは、例えば、安全性および用量漸増試験、in vivo試験(例えば、動物モデル)をはじめとする当業者に公知の方法から容易に決定できる。
本開示はまた、IL−10(例えば、PEG−IL−10)、およびその医薬組成物を含むキットを企図する。キットは一般に、以下に記載するように様々な構成要素を収納する物理的構造の形態であり、例えば、上記の方法(例えば、コレステロールホメオスタシスを回復させる必要のある対象にIL−10分子を投与すること)を実施する際に使用され得るものである。
実施例
以下の実施例では、次のような一般的な材料および方法を用い得る。
本開示は、当業者に公知の任意の方法によるペグ化IL−10の合成を企図する。以下のモノ−ペグ化IL−10およびモノ/ジ−ペグ化IL−10混合物を作製するためのいくつかの代替合成スキームに関する記載は、単に例示を意図するものである。モノ−ペグ化IL−10およびモノ/ジ−ペグ化IL−10混合物はともに同じ特性を多く有するが、選択的にペグ化したモノ−およびジ−ペグ化IL−10の混合物では最終的なペグ化生成物の収率が向上する(例えば、米国特許第7,052,686号および米国特許出願公開第2011/0250163号を参照されたい)。
IL−10を10mMリン酸ナトリウムpH7.0、100mM NaClに対して透析し得る。次いで、透析したIL−10を、透析緩衝液を用いて3.2倍に希釈し4mg/mLの濃度にし得る。リンカー、SC−PEG−12K(Delmar Scientific研究所;メイウッド、イリノイ州)を加える前に、9体積の希釈したIL−10に1体積の100mM四ホウ酸Na(pH9.1)を加えて、IL−10溶液のpHを8.6に上げ得る。SC−PEG−12Kリンカーを透析緩衝液に溶かし、希釈したIL−10溶液にしかるべき体積のリンカー溶液(1モルのIL−10当たり1.8〜3.6モルのリンカー)を加えて、ペグ化反応を開始し得る。反応速度を制御するため、5℃で反応を実施し得る。ペグ化反応の間、反応溶液を穏やかに攪拌し得る。モノ−ペグ化IL−10の収率が、サイズ排除HPLC(SE−HPLC)により決定して、40%付近になったとき、1Mグリシン溶液を最終濃度30mMになるまで加えることによって反応を停止させる。HCl溶液を用いて反応溶液のpHを7.0になるまで徐々に調整し、次いで、0.2ミクロンフィルターを用いて反応溶液をろ過し、−80℃で保管する。
メトキシ−PEG−アルデヒド(PALD−PEG)(Inhale Therapeutic Systems社、ハンツビル、アラバマ州;このほか、NOF America社(アーバイン、カリフォルニア州)からも入手可能である)をリンカーとして用いてモノ−ペグ化IL−10を調製する。PALD−PEGは分子量が5KDa、12KDa、または20KDaであり得る。IL−10を上記のように透析して希釈するが、反応緩衝液のpHは6.3〜7.5にする。活性化したPALD−PEGリンカーを反応緩衝液に1:1のモル比で加える。反応混合物にシアノ水素化ホウ素を加えて最終濃度を0.5〜0.75mMにする。反応を室温(18〜25℃)で15〜20時間、穏やかに攪拌しながら実施する。1Mグリシンにより反応を停止させる。SE−HPLCにより収率を分析する。モノ−ペグ化IL−10をゲルろ過クロマトグラフィーにより未反応のIL−10、PEGリンカーおよびジ−ペグ化IL−10から分離し、RP−HPLCおよびバイオアッセイ(例えば、IL−10応答性の細胞または細胞系の刺激)によって特徴を明らかにする。
IL−10(例えば、げっ歯類または霊長類)を50mMリン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウム(pHの範囲は5〜7.4)に対して透析する。0.75〜30mMシアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下、モル比が1:1〜1:7の5K PEG−プロピルアデヒド(propyladehyde)を濃度1〜12mg/mLのIL−10と反応させる。あるいは、同様の方法によりピコリンボランで反応物を活性化してもよい。反応物を5〜30℃で3〜24時間インキュベートする。
IL−10を10mMリン酸ナトリウム(pH7.0)、100mM NaClに対して透析する。透析したIL−10を透析緩衝液を用いて3.2倍に希釈し約0.5〜12mg/mLの濃度にする。リンカー、SC−PEG−12K(Delmar Scientific研究所、メイウッド、イリノイ州)を加える前に、9体積の希釈したIL−10に1体積の100mM四ホウ酸Na(pH9.1)を加えて、IL−10溶液のpHを8.6に上げる。SC−PEG−12Kリンカーを透析緩衝液に溶かし、希釈したIL−10溶液にしかるべき体積のリンカー溶液(1モルのIL−10当たり1.8〜3.6モルのリンカー)を加えて、ペグ化反応を開始する。反応速度を制御するため、5℃で反応を実施し、反応溶液を穏やかに攪拌する。モノ−ペグ化IL−10の収率が、サイズ排除HPLC(SE−HPLC)により決定して、40%付近になったとき、1Mグリシン溶液を最終濃度30mMになるまで加えることによって反応を停止させる。HCl溶液を用いて反応溶液のpHを7.0になるまで徐々に調整し、反応物を0.2ミクロンでろ過し、−80℃で保管する。
本開示は、本明細書に記載されるIL−10分子(例えば、PEG−IL−10)の生物活性を決定するために当該技術分野で公知の任意のアッセイおよび方法論を用いることを企図する。以下に記載するMC/9細胞増殖アッセイは代表的なものであって、排他的なものではない。
MC/9細胞(肥満細胞の特徴を有するマウス細胞系で、Cell Signaling Technology社(ダンバーズ、マサチューセッツ州)から入手可能である)にIL−10を投与すると、用量依存性に細胞増殖が増大する。
ペグ化組換えヒトIL−10原薬(PEG−rhIL−10DS)の整合性を明らかにするため、PEG−rhIL−10DSをEndo Glu−Cで消化した後、DTTで還元し、RP−HPLCにUV検出を用いて分析した。PEG−rhIL−10DSは、モノ−ペグ化IL−10とジ−ペグ化IL−10の約1:1の比の混合物を含み、N末端にPEG化がみられる。PEG−IL−10分子のPEG成分は分子質量が約5kDaであった。
Claims (43)
- ペグ化インターロイキン−10の整合性を確認する方法であって、
a)試験用のPEG−IL−10を断片化して試験用の複数のペプチドを得ることと、
b)前記試験用の複数のペプチドを参照標準品と比較することと
を含み、
前記ペグ化インターロイキン−10の整合性が前記試験用の複数のペプチドと前記参照標準品との同等性を明らかにすることによって確認される、
方法。 - 前記ペグ化インターロイキン−10の整合性がそのアミノ酸配列を指す、請求項1に記載の方法。
- 前記参照標準品が参照PEG−IL−10または参照IL−10を断片化することから生成される複数の参照ペプチドを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記試験用のPEG−IL−10が前記参照PEG−IL−10と同じである、請求項3に記載の方法。
- 前記試験用のPEG−IL−10がPEG−hIL−10である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記断片化することが前記試験用のPEG−IL−10をタンパク質分解試薬と接触させることによって実施される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タンパク質分解試薬がペプチダーゼである、請求項6に記載の方法。
- 前記ペプチダーゼがトリプシンまたはグルタミルエンドペプチダーゼ(Endo Glu−C)である、請求項7に記載の方法。
- 前記試験用のPEG−IL−10のEndo Glu−Cによる断片化が前記試験用のPEG−IL−10のトリプシンによる断片化よりもより分離されたペプチド断片をもたらす、請求項8に記載の方法。
- 前記試験用の複数のペプチドのペプチドメンバーがクロマトグラフィーによって分離される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試験用の複数のペプチドのペプチドメンバーが電気泳動によって分離される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試験用の複数のペプチドの各メンバーの絶対質量を質量分析により決定することをさらに含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記質量分析がESI−MS、ESI−MS/MS、ESI−TOF MS、MALDI MSおよびMALDI−TOF MSからなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記参照用の複数のペプチドの各メンバーの絶対質量が質量分析により決定されている、請求項3または4に記載の方法。
- 前記参照用の複数のペプチドの各メンバーの絶対質量がデータベースに保管される、請求項14に記載の方法。
- 段階b)がコンピュータを用いて実施される、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試験用のPEG−IL−10がIL−10の少なくとも1つのサブユニットの少なくとも1つのアミノ酸残基に共有結合したPEG分子を少なくとも1つ含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試験用のPEG−IL−10がモノ−ペグ化IL−10とジ−ペグ化IL−10の混合物を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記試験用のPEG−IL−10のPEG成分が約5kDa〜約20kDaの分子質量を有する、請求項17または18に記載の方法。
- 前記試験用のPEG−IL−10のPEG成分が約20kDa超の分子質量を有する、請求項17または18に記載の方法。
- 前記試験用のPEG−IL−10のPEG成分が少なくとも約30kDの分子質量を有する、請求項17または18に記載の方法。
- 前記参照PEG−IL−10の断片化から生成される前記参照ペプチドが前記参照IL−10の断片化から生成される前記参照ペプチドとほぼ同等である、請求項3に記載の方法。
- 前記参照PEG−IL−10の断片化から生成される前記参照ペプチドがESI−MS、ESI−MS/MS、ESI−TOF MS、MALDI MSまたはMALDI−TOF MSに基づいて前記参照IL−10の断片化から生成される前記参照ペプチドとほぼ同等である、請求項22に記載の方法。
- ペグ化ヒトインターロイキン−10のアミノ酸配列を確認する方法であって、
a)試験用のhPEG−IL−10をEndo Glu−Cで消化して試験用の複数のペプチドを得ることと、
b)前記試験用の複数のペプチドを参照標準品と比較することと
を含み、
前記ペグ化ヒトインターロイキン−10のアミノ酸配列が前記試験用の複数のペプチドと前記参照標準品との同等性を明らかにすることによって確認される、
方法。 - 前記参照標準品が参照hPEG−IL−10または参照hIL−10を消化することから生成される複数の参照ペプチドを含む、請求項24に記載の方法。
- 前記試験用のPEG−hIL−10が前記参照PEG−hIL−10と同じである、請求項25に記載の方法。
- 前記試験用のPEG−hIL−10のEndo Glu−Cによる消化が前記試験用のPEG−hIL−10のトリプシンによる消化よりもより分離されたペプチド断片をもたらす、請求項24〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試験用の複数のペプチドのペプチドメンバーがクロマトグラフィーによって分離される、請求項24〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試験用の複数のペプチドのペプチドメンバーが電気泳動によって分離される、請求項24〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試験用の複数のペプチドの各メンバーの絶対質量を質量分析により決定することをさらに含む、請求項24〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記質量分析がESI−MS、ESI−MS/MS、ESI−TOF MS、MALDI MSおよびMALDI−TOF MSからなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記参照用の複数のペプチドの各メンバーの絶対質量が質量分析により決定されている、請求項30または31に記載の方法。
- 前記参照用の複数のペプチドの各メンバーの絶対質量がデータベースに保管される、請求項32に記載の方法。
- 段階b)がコンピュータを用いて実施される、請求項24〜33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試験用のPEG−hIL−10がhIL−10の少なくとも1つのサブユニットの少なくとも1つのアミノ酸残基に共有結合したPEG分子を少なくとも1つ含む、請求項24〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試験用のPEG−hIL−10がモノ−ペグ化IL−10とジ−ペグ化IL−10の混合物を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記試験用のPEG−hIL−10のPEG成分が約5kDa〜約20kDaの分子質量を有する、請求項35または36に記載の方法。
- 前記試験用のPEG−hIL−10のPEG成分が約20kDa超の分子質量を有する、請求項35または36に記載の方法。
- 前記試験用のPEG−hIL−10のPEG成分が少なくとも約30kDの分子質量を有する、請求項35または36に記載の方法。
- 前記参照PEG−hIL−10の消化から生成される前記参照ペプチドが前記参照hIL−10の消化から生成される前記参照ペプチドとほぼ同等である、請求項25に記載の方法。
- 前記参照PEG−hIL−10の消化から生成される前記参照ペプチドがESI−MS、ESI−MS/MS、ESI−TOF MS、MALDI MSまたはMALDI−TOF MSに基づいて前記参照IL−h10の消化から生成される前記参照ペプチドとほぼ同等である、請求項40に記載の方法。
- ペグ化ヒトインターロイキン−10のEndo Glu−C消化によって生成される複数のペプチドの同一性を確認する方法であって、前記複数のペプチドをPEG−hIL−10参照標準品と比較することを含み、前記複数のペプチドの同一性が参照標準品との同等性を明らかにすることによって確認される、方法。
- 前記参照標準品が参照hPEG−IL−10または参照hIL−10を消化することから生成される複数の参照ペプチドに対応する複数の参照ペプチドを含む、請求項42に記載の方法。
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