LT4029B - Alpha-amidating enzyme compositions and process for their production - Google Patents

Alpha-amidating enzyme compositions and process for their production Download PDF

Info

Publication number
LT4029B
LT4029B LTIP1656A LTIP1656A LT4029B LT 4029 B LT4029 B LT 4029B LT IP1656 A LTIP1656 A LT IP1656A LT IP1656 A LTIP1656 A LT IP1656A LT 4029 B LT4029 B LT 4029B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
enzyme
alpha
amidating
activity
oligonucleotide probe
Prior art date
Application number
LTIP1656A
Other languages
English (en)
Inventor
James P Gilligan
Barry N Jones
Arthur H Bertelsen
Nozer M Mehta
Original Assignee
Unigene Lab Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22196693&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=LT4029(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Unigene Lab Inc filed Critical Unigene Lab Inc
Publication of LTIP1656A publication Critical patent/LTIP1656A/xx
Publication of LT4029B publication Critical patent/LT4029B/lt

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88Lyases (4.)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575Hormones
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67General methods for enhancing the expression
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y114/00Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/17Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced ascorbate as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.17)
    • C12Y114/17003Peptidylglycine monooxygenase (1.14.17.3)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Materials Applied To Surfaces To Minimize Adherence Of Mist Or Water (AREA)

Description

Ši paraiška yra dalis paraiškos JAV patentui, reg. Nr.655366, paduotos 1984 m. rugsėjo 27 d., ir į kurią bus nurodoma šioje pateikiamoje paraiškoje.
Šis išradimas skirtas alfa-amidinantiems fermentams, jų gavimui ir panaudojimui alfa-amidintiems produktams gauti, veikiant šiais fermentais glicinu pailgintus substratus. Tam tikrais realizavimo atvejais alfa-amidinantis fermentas pagal išradimą gali būti panaudojamas naudingų alfa-amidintų hormonų ir produktų, naudojamų žemės ūkyje ir medicinoje, gamyboje, įskaitant kalcitoninus, augimo reguliavimo hormono faktorius, kalcitonininius peptidus ir kitus alfa-amidintus produktus.
Viduląstelinis apdorojimas (gamtinių baltymų skaidymas ir/arba jų pradinių formų, gautų po transliacijos ribonukleino rūgštyse, funkcinis pakeitimas) yra aprašytas įvairiuose dokumentuose.
Paprastai žinduolių ir kitų eukariotų ląstelėse galimos tam tikros potransliacinės operacijos su baltymais, tuo tarpu kai prokariotuose tas nevyksta. Kai kurie prokariotai, kaip pavyzdžiui, E.coli, plačiai naudojami kaip šeimininkai žinduolių baltymams gauti, naudojant rekombinantinės DNR (rDNR) metodą, kadangi jie gali būti lengvai išauginami parcialinės fermentacijos eigoje ir yra genetiškai tiksliai aprašyti. Tačiau daugeliui žinduolių baltymų, gautų genų inžinerijos būdu, reikia atitinkamo potransliacinio apdorojimo, kuris paprastai būna realizuojamas in vitro, panaudojant sudėtingas chemines reakcijas, kurių didelė kaina neleidžia jų pritaikyti pramoninėje gamyboje.
Į vieną iš apdorojimo būdų įeina baltymų karboksilinio galo aminorūgšties amidinimas. Daugelis gamtoje sutinkamų peptidų ir hormonų turi šitokį pakeitimą, kuris yra labai svarbus, kad baltymas būtų biologiškai aktyvus. Kaip pavyzdys yra kalcitoninas, kai, pakeitus amidintą prolino liekaną į neamidintą, biologinis aktyvumas sumažėja 3000 kartų.
Agentas, veikiantis C-galo amidinimą (alfa), atpažįsta glicino liekaną, kuri eina tuoj pat po amidinamos aminorūgšties (R-X-Gly, kur R yra pagrindinė baltymo seka, X amidinama liekana ir Gly - glicino liekana). Glicinas yra skaldomas ir faktiškai atiduoda aminogrupę priešpaskutinei aminorūgščiai, ir taip ją amidina.
Pirmieji autoriai, paskelbę apytikslę alfa-amidinančio fermento molekulinę masę, buvo Bradbury A.F. et ai., Nature, 298 , 686-688 (1982). Panaudoję Sephadex G-100, jie išreiškė prielaidą, kas minimali molekulinė masė yra apie 60000 daltonų (1 daltonas = l,6601xl0'27 kg).
Tolimesni tyrimai parodė, kad tokio fermento molekulinė masė yra nuo 60000 iki 70000 daltonų (matuota gel-filtracinės chromatografijos metodu). Šie tyrimai atspindėti tokiuose darbuose: Husain I. ir Tate S.S., FEBS Letters, 152, Nr.2, 277-281 (1983); Eipper et ai., PNAS, 80, 5144-5148 (1983); Gomez et ai., FEBS Letters, 167, Nr.l, 160-164 (1984) ir Kizer J.S. et ai., PNAS, 81, 3228-3232 (1984).
Eipper et ai., PNAS, 80, 5144-5148 (1983) paskelbė, kad maksimaliam amidinimo fermento aktyvumui pasiekti, be molekulinio deguonies, yra reikalingi du kofaktoriai askorbino rūgštis ir vario(II) jonai.
Cheminė peptido karboksilinio galo amidinimo reakcijai reikia aminogrupės šaltinio. Bradbury A.F. et ai., Nature, 298, 686-688 (1982) parodė, kad glicinas skyla ir atiduoda aminogrupę priešpaskutinei aminorūgščiai, kuri tokiu būdu yra amidinama. Glicino, kaip aminogrupės donoro, reikalingumas buvo parodytas ir kitų autorių darbuose.
Landymore A.E.N et ai., BBRC, 117, 283-293 (1983) parodė, kad D-alaninas taip pat gali būti aminogrupės donoriumi amidinimo reakcijoje. Kizer ir kt., PNAS, 81, 32283232 (1984) atliktas darbas parodė du skirtingus fermentinius aktyvumus žiurkės smegenyse, kurie gali katalizuoti alfa-amidinimo reakcijas. Didesnės molekulinės masės forma (70000 daltonų) pasižymi specifiškumu tik glicinui, esančiam substrato karboksilo gale. Fermentas su mažesne molekuline mase veikia substratą su β-alaninu, kuris yra karboksilo galo aminorūgštimi.
Optimali pH reikšmė alfa-amidinančiam fermentui, išskirtam iš kiaulės hipofizio ir dalinai išvalytam, pagal Bradbury A.F. ir Smythe D.G., BBRC, 112, Nr.2, 372-377 (1983) yra apie 7,0. Eipper B.A. et ai., PNAS, 80, 5144-5178 (1983) patvirtino šią reikšmę, paskelbdami duomenis apie optimalų pH 7,0 alfa-amidinančiam fermentui, išskirtam iš žiurkės hipofizio. Jie taip pat pažymėjo, kad aktyvumas greitai krenta, kai pH mažesnis nei 6,5 arba didesnis nei 7,5.
Aukščiau paminėtose publikacijose ekstraktai ir dalinai išvalyti fermentiniai mišiniai turi dar ir proteolitinių fermentų, kurie gali skaldyti potencialius substratus ir produktus, o taip pat ir pačius alfa-amidinančius fermentus, tokiu būdu sumažindami peptidų ir polipeptidų, gautų iš gamtinių šaltinių arba naudojant rekombinantinės DNR metodą, amidinįmo efektyvumą.
Bendrai paėmus, visi amidinimo aktyvumo matavimai buvo paremti virsmais Dsubstratų, tokių kaip tripeptidai, pvz., D-Tyr-Val-Gly-COOH j D-Tyr-Val-CONH?. Iš dviejų galimų konfigūracijų (D arba L) gamtoje biologiškai svarbios aminorūgštys sutinkamos tik L-formoje. Tačiau D-formos naudojimas buvo sąlygotas tuo, kad reikėjo neutralizuoti pašalinių proteolitinių fermentų buvimą užterštuose amidinančių fermentų preparatuose, kurie buvo naudojami šiuose eksperimentuose. Šie pašaliniai fermentai gali turėti išreikštą proteolitinį poveikį į substratus su L-aminorūgštimi ir silpnai veikti Dsubstratus. Todėl eksperimentatoriai naudojo nenatūralų D-substratą. Iki pastarojo laiko niekas negalėjo parodyti, kad jų fermentiniai preparatai gali amidinti atitinkamus fiziologiškai svarbius substratus, t.y. L-substratus pakeisti į biologiškai aktyvius alfaamidintus L-produktus.
Šiame išradime parodyta, kad šio išradimo preparatai gali efektyviai amidinti Lsubstratus, o D-substratams turėti nuo 60 iki 1000 kartų didesnį aktyvumą negu didžiausias aktyvumas, parodytas anksčiau pateiktuose išradėjams žinomuose darbuose.
Fermentiniai preparatai, kurie gali amidinti peptidų ir baltymų karboksilines grupes, aprašyti daugelyje literatūros šaltinių. Pvz., Bradbury A.F. et ai., Nature, 298, 686688 (1982) rašoma, kad alfa-amidinimo aktyvumas surandamas kiaulių hipofizyje. Fermentą turintis preparatas iš kiaulės hipofizio gali pakeisti peptidus, kurie baigiasi glicinu, į atitinkamus deglicininius amidopeptidus. Tačiau, Bradbury et ai. teigia, kad preparatai neamidina peptidų ar polipeptidų, išskirtų iš gamtinės kilmės šaltinių:
“Amidinimo aktyvumo aptikimo ir įvertinimo tyrimo sistema buvo sukurta, tiriant fermentinių preparatų galimybes pakeisti sintetinį D-tirozilvalilgliciną į atitinkamą dipeptidą - D-tirozilvalinamidą... D-tirozino liekana apsaugo nuo suskaldymo amino-peptidazėmis, kurios buvo audinių homogenatuose... Kontroliniai eksperimentai parodė, kad iš lėto skyla ir sintetinis D-tirozilvalinamidas, inkubuojamas tokiose sąlygose. Tokiu būdu, tripeptido amido pagaminimas hipofizio fermento pagalba buvo lydimas jo skaidymo kitais fermentais, esančiais hipofizio ekstrakte.” (686 psl.).
Taigi, Bradbury et ai., pripažįsta, kad aprašytuose preparatuose yra kiti proteolitiniai fermentai, kurie skaldo peptidus arba polipeptidus, ir kad naudojama negamtinio D-tirozino liekana, siekiant minimizuoti šį skaldymą.
Be to, Bradbury et ai. siūlo amidinančio fermento išvalymui naudoti homogenizaciją arba subląstelinį frakcionavimą, o po to gel-filtracinę chromatografiją, tačiau šis fermentas, pagal bendrą nuomonę, vistiek lieka užterštas proteolitiniais fermentais.
Husain I. ir Tate S.S., FEBS Letters, 152, Nr.2, 277-281 (1983) aprašo alfaamidinantį aktyvumą jaučio hipofizio neuroskrecinėse granulėse..
Eipper et ak, PNAS, 80, 5144-5148 (1983) paskelbė, kad alfa-amidinantis fermentinis aktyvumas stebimas ir priekinėse, vidurinėse ir užpakalinėse žiurkės hipofizio liaukos dalyse bei jaučio tarpiniame hipofizyje. Tačiau čia nurodoma, kad alfaamidinančio aktyvumo tyrimui naudojamas sintetinis D-Tyr-Val-Gly substratas, ir pripažįstama, kad naudoti preparatai yra nešvarūs.
Gomez ir kt., FEBS Letters, 167, Nr.l, 160-164 (1984) nustatė, kad žiurkių hipotalamas taip pat pasižymi alfa-amidinančiu fermentiniu aktyvumu.
Bradbury A.F. ir Smythe D.G. “Peptides Structure and Function”: Proceedings of the Eighth American Peptide Symposium; p.249-252 (1983). Eds. Hruby V.J. and Rich
D.H. aprašo alfa-amidinančio aktyvumo buvimą žiurkių skydliaukėje.
Mainės R.E. et ai., Endocrinology, 114, 1522-1530 (1984) paskelbė, kad žiurkių arba pelių ląstelių linija, gauta iš priekinės hipofizio dalies (ATT-20), turi alfa-amidinantį fermentinį aktyvumą, kuris, laikui bėgant, mažėja.
Liaukos arba organai, apie kuriuos žinoma, kad jie turi amidintus peptidus, gali turėti fermentą, sugebantį katalizuoti amidinimo reakciją. Pavyzdžiui, žemesnės formos, tokios kaip jūros šuo (Sąualus acanthias), pagal O’Donohue T.L. et ai., Peptides 3, 393-395 (1982) pranešimą, turi amidintus peptidus hipofizio ekstrakte. Scheller R.H et ai., Cell, 32, 7-22 (1983) paskelbė apie signalinių amidintų peptidų buvimą jūros sraigėse Aplysia. Nežiūrint į lyg ir platų šio aktyvumo tipo paplitimą gamtoje, informacijos apie fermento fizikines-chemines savybes nėra daug. Tai gali būti susiję su tuo, kad neuroendokrininiuose organuose yra mažas peptido kiekis.
Amidintų peptidų buvimas tam tikruose audiniuose nebūtinai surištas su alfaamidinančio fermento dideliais kiekiais. Pvz., priekinė žiurkių hipofizio dalis pasižymi dideliu alfa-amidinančiu aktyvumu, bet neturi žinomų substratų (Eipper et ai., PNAS, 80, 5144-5148 (1983)). Žiurkių hipofizio užpakalinėje dalyje yra amidintų peptidų (oksitocino ir vazopresino), bet ji pasižymi nedideliu alfa-amidinančiu aktyvumu (Eipper et ak, Endo, 116, 2497-2504 (1985)). Todėl tol, kol nebus ištirtas atskirų audinių alfa-amidinantis aktyvumas, esančių arba potencialių fermento kiekių numatyti negalima.
Šio išradimo tikslas yra alfa-amidinančių kompozicijų sukūrimas, kurios galėtų būti efektyviai naudojamos, gaminant naudingus alfa-amidintus produktus net iš Laminorūgštis turinčių substratų, tokių kaip peptidiniai ir polipeptidiniai substratai tiek gamtinės kilmės, tiek ir gauti rekombinantinės DNR technologijos būdu.
Papildomas šio išradimo tikslas yra efektyvaus ir ekonomiško fermentinių kompozicijų gamybos būdo sukūrimas.
Kitas papildomas šio išradimo tikslas yra monokloninių antikūnų, specifinių alfaamidinančiam fermentui, ir imobilizuotų antikūnų, valymo dervų, imuninės chromatografijos arba į jas panašių kolonėlių, kurios, naudojant minėtus antikūnus, efektyviai išvalytų alfa-amidinantį fermentą, sukūrimas.
Kitas papildomas tikslas yra šeimininko ląstelių sukūrimas genų inžinerijos būdu, kurios galėtų užtikrinti aukštą alfa-amidinančio fermento ekspresijos lygį.
Kitas papildomas išradimo tikslas yra alfa-amidintų produktų gavimas iš substratų, turinčių glicino liekaną C-gale, naudojant reakcijoje substratą ir fermentinę kompoziciją.
Šie ir kiti tikslai paaiškės iš toliau duodamo aprašymo. Pagal šį išradimą, pareiškėjai pateikia naujas pakankamai švarias alfa-amidinančias fermentines kompozicijas, kurių santykinis alfa-amidinantis aktyvumas yra mažiausiai 25 mE/mg , geriau 50 mE/mg arba daugiau nei 150 mE/mg baltymo, esančio minėtoje kompozicijoje. Visos čia pateiktos santykinio aktyvumo reikšmės yra duotos pagal Dansil-D-Tyr-Val-Gly-COOH virsmo į Dansil-Tyr-Val-CONH2 reakciją. Vienu mE laikomas toks aktyvumo dydis, kurio reikia paversti 1 nanomoliui Dansil-Tyr-Val-Gly-COOH į vieną nanomolį Dansil-Tyr-ValCONH2 37 °C temperatūroje per 1 minutę, esant pH 7,0, askorbato jonų koncentracijai - 3 mM (skaičiuojant sumariniam reakcijos mišiniui, įskaitant fermentą, substratą, kofaktorius ir t.t.), molekulinio deguonies pertekliui ir pakankamam kiekiui vario jonų (paprastai apie μΜ, priklausomai nuo fermento švarumo).
Pagal išradimą, alfa-amidinantys fermentai yra fermentai, tokie kaip peptidil-glicinalfa-amidinanti monooksigenazė, gali katalizuoti peptidilinio junginio, turinčio glicino liekaną bent jau peptidinės grandinės C-gale, virsmą atitinkamu peptidil-amidiniu junginiu, turinčiu aminogrupę vietoj C-gale buvusio glicino. Terminas “peptidinė grandinė” čia reiškia bet kokį polipeptidą, turintį mažiausiai dvi aminorūgštis, sujungtas tarpusavyje peptidine jungtimi. Terminas “peptidinis junginys” reiškia bet kokį junginį, turintį peptidinę grandinę. Terminas “atitinkamas peptidil-amidas” reiškia bet kurį reakcijos produktą, kuriame peptidinės grandinės C-gale esantis glicinas yra pakeistas aminogrupė.
Alfa-amidinimo reakciją tikslinga vykdyti esant deguoniui ir redukuojančiam agentui. Tokiais reduktoriais gali būti (bet neapsiriboti) askorbino rūgštis, askorbino rūgšties druskos, dihidroksifumaratas, metalų cianidai, tetrahidropterinas. Buvo nustatyta, kad tam tikri kofaktoriai skatina reakciją ir/arba lėtina fermento skilimą, bei jo aktyvumo mažėjimą. Tokiais kofaktoriais gali būti (bet neapsiriboti) katalazė, etanolis, kalio jodidas ir vario jonai. Išvalytos fermentinės kompozicijos pagal šį išradimą neturi proteolitinio aktyvumo, galinčio suardyti alfa-amidinantį fermentą, alfa-amidinimo reakcijos produktus arba reagentus, todėl šios kompozicijos gali katalizuoti alfa-amidinimo reakcijas ir tais atvejais, kai substratas ir produktas susideda iš L-aminorūgščių. Proteolitinis aktyvumas amidinimo reakcijos mišinyje gali tiesiogiai neatitikti proteazės koncentracijos. Aktyvumas, netgi esant didelėms proteazės koncentracijoms, gali būti užslopintas, pavyzdžiui, veikiant įvairiems inhibitoriams. Proteolitinio aktyvumo nebuvimas, padidinantis fermentinės kompozicijos panaudojamumą pramonėje ir praktkoje, kai naudojami substratai sudaryti iš L-aminorūgščių, jokiu būdu nesumažina šios kompozicijos naudingumo substratams, kuriuose nėra L-aminorūgščių.
Kaip toliau aprašyta, pareiškėjai išvalė labai daug specifinių baltymų, pasižyminčių alfa-amidinančiu aktyvumu, pavyzdžių. Čia naudojamas terminas “alfa-amidinantis aktyvumas” reiškia bet kokį aktyvumą, turintį tendenciją peptidinio substrato C-gale, kuriame yra glicino liekana, palikti tik aminogrupę. Tokio pakeitimo metu glicinas, išskyrus aminogrupę, gali būti suardomas, ir toje vietoje, kur pirma buvo glicinas, lieka tik
Ί aminogrupė. “Alfa-amidinantis fermentas” čia naudojama prasme yra bet kokia kompozicija arba junginys, jo aktyvus homologas arba fragmentas, pasižymintys alfaamidinančiu aktyvumu.
Fermentinės kompozicijos, išgrynintos pagal šį išradimą, gali būti valomos tol, kol jos taps vienalytėmis . Čia naudojamas terminas “vienalytis” reiškia fermentinį preparatą, kuris duoda vienintelę ryškią juostą natrio dodecilsulfato/poliakrilamido gelio elektroforezėje ir parodo vienintelę aminorugščių seką, nustatant ją įprastais sekų nustatymo būdais.
Atitinkami alfa-amidinantys fermentai, išgryninti iki vienalytės būsenos pagal šį išradimą, turėjo santykinį aktyvumą, didesnį nei 1500 mE/mg baltymo.
Fermentinės kompozicijos, pagamintos pagal šį išradimą, gali būti panaudotos alfaamidinimo reakcijų katalizei, gaminant naudingus alfa-amidintus peptidinius produktus. Substratu naudojamas toks peptidinis junginys, turintis glicino liekaną bent jau peptidinės grandinės gale, kuriame pakeitus C-galo gliciną, gaunamas norimas produktas. Substratas reaguoja, esant deguoniui ir redukuojančiam agentui bei fermentinei kompozicijai, gautai pagal šį išradimą, ir reakcija vykdoma tol, kol peptidas pavirsta į atitinkamą peptidilamidą. Virsmas prasideda tuoj pat, kai tik substratas sueina į kontaktą su fermentu, bet reakcijos greitis labai priklauso nuo pH, temperatūros, substrato specifiškumo, kofaktorių koncentracijos bei kitų parametrų, kuriuos galima keisti, norint optimizuoti procesą. Paprastai reakcija turi būti vykdoma tol, kol pasiekiamas norimas virsmo (substrato į produktą) procentas. Tinkamiausiuose išradimo realizavimo variantuose, siekiant pagreitinti reakciją ir/arba padidinti arba palaikyti fermento aktyvumą, naudojami aukščiau minėti kofaktoriai.
Daug naudingų produktų, įskaitant gamtinius hormonus ir panašius junginius, kuriems reikalingas arba pageidautinas alfa-amidinimas, gali būti gaunami iš peptidinių junginių, besibaigiančių glicinu, kai reakcijoje dalyvauja šio išradimo alfa-amidinančios fermentinės kompozicijos. Tokie produktai, kurie gali būti panaudoti, pavyzdžiui, žemės ūkyje arba medicinoje, gydant hormonų trūkumu charakterizuojamas ligas, apima (bet neapsiriboja) įvairius kalcitoninus, augimo hormonų faktorius, kalcitonininius peptidus ir panašius. Čia minimi hormonai, kuriems priklauso įvairūs kalcitoninai, augimo hormonų faktoriai ir kalcitonininiai peptidai, yra įvairūs baltymai, turintys C-gale amidogrupę, pasižymintys charakteringu minėtų hormonų aktyvumu, žinomu šios srities specialistams. Pavyzdžiui, kalcitoninai apima visokias jų atmainas, kurios sugeba reguliuoti kalcio įsisavinimą kauluose, kas būdinga kalcitoninams.. Įvairių baltymų homologai taip pat priklauso šiam išradimui, o taip pat ir nukleotidų sekos, koduojančios baltymų sekas bei jų homologus, modifikuotus taip, kad sekos atliekamos funkcijos nepasikeičia. Pageidautina, kad 40 %, o dar geriau 50 % aminorūgščių atitiktų išradime pateiktoms aminorūgštims. Nukleotidų sekose kodonai gali būti pakeisti ekvivalentiniais kodonais, koduojančiais tas pačias aminorūgštis.
Šio išradimo fermentinės kompozicijos gali katalizuoti netgi substratų, turinčių Laminorūgštis, alfa-amidinimo reakciją, realizuoti efektyvią ir ekonomišką amidinimo produktų gamybą, panaudojant substratus, gaunamus išvalant gamtinius baltymus, arba rekombinantinės DNR technologijos pagalba gaunamus substratus.
Kai kuriuose tinkamiausiuose šio išradimo realizavimo variantuose alfa-amidinimo reakcija gali būti palengvinta, imobilizuojant fermentą ant kieto nešiklio, kuris netirpsta vandeninėje terpėje ir nesuyra reakcijos sąlygomis, leidžiant substratą per imobilizuotą fermentą, geriausia esant kofaktoriams. Terminas “imobilizacija” čia suprantamas kaip fermento surišimas su pagrindu arba nešikliu. Tokio tipo nešikliams priklauso (bet neapsiriboja) kontroliuojamo porėtumo stiklas arba aktyvuotas adsorbentas, pavyzdžiui, sefarozė, aktyvuota bromcianu. Tokiu būdu imobilizuoti fermentai gali būti daug kartų panaudojami, atskiriant reakcijos mišinį nuo kieto nešiklio, prie kurio yra prikibęs fermentas.
Pareiškėjai atrado, kad fermentinės kompozicijos pagal išradimą gali būti gautos ir išvalytos daugeliu būdų. Nustatyta, kad geriausi pradiniai alfa-amidinančio fermento šaltiniai yra žiurkių karcinomos pažeistos skydliaukės šerdies audinys, jo ląstelių linijos ir/arba ląstelių kultūros iš minėtos ląstelių linijos terpė. Nešvarus alfa-amidinantis fermentas gali būti valomas tiek išstūmimo chromatografija, tiek ir anijonų mainų chromatografija, ypatingai stipria anijonų mainų chromatografija. Terminas “stipri anijonų mainų chromatografija” čia suprantamas kaip anijonų mainų chromatografija, vykdoma bet kokioje dervoje, kuri išsaugo pastovų teigiamą krūvį pH ribose 2-12. Tam tikrais išradimo realizavimo atvejais po išstūmimo chromatografijos naudojama stipri anijonų mainų chromatografija, o taip pat ir prieš išstūmimo chromatografiją gali būti vykdoma stipri anijonų mainų chromatografija. Tam tikrais atvejais gali būti reikalinga antroji stipri anijonų mainų chromatografija, einanti po pirmojo etapo. Viename iš tinkamiausių realizavimo variantų arba pirmoji stipri anijonų mainų chromatografija arba antroji stipri anijonų mainų chromatografija vykdoma, esant šarminiam pH, o kita - esant rūgštiniam pH.
Naudojant gerai išvalytus vienalyčius šio išradimo fermentų mėginius, kaip antigeną siekiant iššaukti imuninį atsaką pelėse ir viščiukuose, buvo gauti atitinkamai monokloniniai ir polikloniniai antikūnai. Taip gauti antikūnai gali būti išvalyti ir imobilizuoti ant kieto nešiklio, siekiant gauti kolonėlę fermento imuninei chromatografijai realizuoti. Ši kolonėlė gali būti panaudota pradinės fermentinės medžiagos valymui, padidinant fermento efektyvumą ir sudarant jo pakartotino panaudojimo galimybę.
Fermentas, išvalytas pagal šį išradimą, bei jo skaidymo tripsinu fragmentai, buvo sekvenuojami žinomais būdais ir sekų analizės duomenys panaudoti oligonukleotidiniams zondams gauti. Naudodami žymėtus oligonukleotidinius zondus, pareiškėjai išskyrė alfaamidinantj fermentą koduojantį geną iš kDNR bibliotekos, kurią sintezavo iš išskirtos iš žiurkės karcinominės skydliaukės poli-A RNR. Šis genas, kuris bus smulkiai aprašytas toliau, gali būti įstatytas į atitinkamą ekspresijos vektorių ir transformuotas į bet kurią ląstelę-šeimininką, galinčią ekspresuoti geną. Tokiais šeimininkais gali būti (bet neapsiriboja) E. colli, mielių štamai, tokie kaip 5. cerevisiae arba aukštesniųjų eukariotų ląstelės, tokios kaip ląstelių linija, iš kurios buvo gautas fermentas. Galima manyti, kad dideliems alfa-amidinančio fermento kiekiams gauti pramoninėje gamyboje bus naudojami mikroorganizmai, sukurti genų inžinerijos būdu.
Pramoninėje gamyboje galima naudoti gamtinius fermentus, juos išvalant išstūmimo chromatografijos arba anijonų mainų chromatografijos metodais, kur kolonėlėje sulaikyti fermentai eliuuojami valgomosios druskos tirpalu, kurio koncentracija didesnė nei 250 mM, pageidautina apie 350 mM arba 500 mM. Didelės koncentracijos druskos tirpalas eliuuoja labiausiai sulaikytus kolonėlėje fermentus. Išstūmimo chromatografija naudojama fermentų rūšims, kurių molekulinė masė 58000-67000, geriau apytikriai nuo 60000 iki apytikriai 65000 daltonų, atskirti. Išvalytas preparatas gali amidinti peptidinį junginį, gautą išskiriant jį iš gamtinių šaltinių arba naudojant rekombinantines DNR metodą, t.y. peptidus turinčius L-aminorūgštis.
Trumpas figunj aprašymas
Fig.1 - Fig.5 paaiškina 1 pavyzdį.
Fig.6 - Fig.12 paaiškina 2 pavyzdį.
Fig. 13 - Fig. 16 paaiškina 3 pavyzdį.
Fig.17 -Fig.21 paaiškina 4 pavyzdį.
Fig.22 paaiškina 5 pavyzdį.
Fig.23 paaiškina 6 pavyzdį.
Buvo rasta, kad vienalytis alfa-amidinantis fermentas gali būti gautas daugiaetapiu metodu, naudojant išstūmimo ir jonų mainų chromatografiją, iš auglių kietų audinių ekstraktų, auglių ląstelių linijų ir tokių ląstelių linijų audinių kultūrų terpių.
Fermentas buvo ekstrahuojamas iš žiurkių skydliaukės karcinomos (MTC), sukeltos WAG/Rij Wistar žiurkėms, kurią aprašė Roos B.A et ai., Endocrinology, 150, Nr.l, 27-32 (1979). Šis audinys deponuotas kaip eksponatas Nr.IVI-10028. Fermentas buvo išskirtas ir iš kitų šaltinių, būtent iš žmogaus ir žiurkės skydliaukės karcinomos ląstelių linijos. Žiurkių ląstelių linija (CA-77) buvo gauta iš žiurkės skydliaukės karcinomos auglio, kaip aprašė Muszynski M. et ai., J. Biol. Chem., 258, 11678-11683 (1983). Ši ląstelių linija buvo deponuota kaip eksponatas IVI-10029. Žmogaus ląstelių linija (HTT 54/34) buvo išvesta
B.A. Roos (VA Medical Center of Cleveland, Ohajo), pradine kultūra naudojant žmogaus skydliaukės karcinomos ląsteles. Žmogaus ląstelių linija (HTT 54/34) buvo deponuota kaip eksponatas IVI-10031. (Žr. “Recognition of the Deposit of Micro-Organisms for the Purposes of Patent Procedure” ir “Budapest Notification” Nr.34, 1983.11.03)
Buvo nustatyta, kad tam tikros tiek žmogaus, tiek ir žiurkės ląstelių linijų audinių terpės, pasižymi nemažu alfa-amidinančio fermento aktyvumu, kas rodo, kad dalis fermento išsiskyrė iš ląstelių. Fermentas gali būti gautas ir išvalytas, apdorojant pradinę medžiagą (įskaitant kultūros terpę, fermentus ir priedus) anijonų mainų chromatografijos būdu. Mėginys gali būti patalpinamas į patroną, tokį kaip CUNO-250 (CUNO Corp.). su dietilaminoetilu (“DEAE”).
Eliuuota iš šio patrono kompozicija, pasižyminti alfa-amidinančiu aktyvumu, toliau apdorojama išstūmimo chromatografijos būdu, panaudojant tam tikros skiriamosios gebos dervą, pvz., Sephacryl S-200 (firma Pharmacia Fine Chemicals).
Po to aktyvi frakcija chromatografuojama jonų mainų metodu, naudojant stiprią anijonų mainų matricą. Šiuo atveju naudojama derva - stipri anijoninė derva Mono Q
HR5/5 (Pharmacia Fine Chemicals). Norint gerai išgryninti fermentą, gali reikėti vieno arba kelių valymų. Kolonėlė Mono Q HR5/5 turi 10 μπι dydžio daleles, porėtumas - 40 %, joninė gelio grupė - CH2N+(CH3)3, jonų mainų talpa - 0,28-0,36 mmol/ml.
Kiekvienas valymo etapas gali būti kontroliuojamas tiek pagal baltymo kiekį, tiek ir pagal alfa-amidančio aktyvumo lygį. Si informacija naudojama specifinio fermento aktyvumo, kuris yra fermento santykinio švarumo rodiklis, nustatymui.
Peptidil-glicin-alfa-amidinanti monooksigenazė, išvalyta pagal išradimą (fermentas, gautas iš žiurkių ląstelių, depozito Nr.IVI-10032; fermentas, gautas iš žmogaus ląstelių, depozito Nr.IVI-10033), turi molekulinę masę apie 60000-65000 daltonų, kas buvo nustatyta gel-filtracijos metodu.
Fermentas buvo išvalytas taip, kad jo santykinis fermentinis aktyvumas buvo mažiausiai apie 25 mE/mg baltymo, pageidautina - mažiausiai 50 mE/mg baltymo. Santykinis fermento aktyvumas, didesnis nei 150 mE/mg baltymo, yra ypač tinkamas. Alfaamidinantis fermentas buvo išvalytas taip, kad dodecilsulfato/poliakrilamido gelio elektroforezėje (SDS-PAGE) rodė vienintelę ryškią juostą.
Išvalyta peptidil-glicin-alfa-amidinanti monooksigenazė naudojama polipeptido, kurio C-gale yra glicinas, karboksilo grupės amidinimui, kur glicino liekana yra kaip aminogrupes donoras. Substratinis peptidas arba polipeptidas gali būti išskirtas iš gamtinių produktų, sintezuotas iš jį sudarančių aminorūgščių arba gautas, naudojant rekombinantinės DNR technologiją. Polipeptidas su glicino galu jungiasi su deguonimi, esant efektyviam fermento kiekiui. Reikalingas fermento kiekis priklauso nuo kelių šioje srityje žinomų faktorių, tokių kaip santykinis fermentinio preparato aktyvumas, reaguojančio substrato prigimtis ir kiekis, reakcijos laikas, reakcijos mišinio temperatūra ir pH. Šios srities specialistams žinomi ir kiti veikiantys faktoriai. Paprastai būna deguonies perteklius, lyginant su substrato koncentracija. Reikalingą vario jonų koncentraciją galima palaikyti, panaudojus bet kurią druską, kuri nekenkia reakcijos eigai. Fermentui, kurio santykinis fermentinis aktyvumas yra tik apie 1 mE/mg baltymo, maksimalus alfaamidinimas pasiekiamas tik esant didelei vario jonų koncentracijai (apie 4μΜ). Didėjant fermento grynumui, egzogeninių (išorinių) vario jonų poreikis sumažėja. Fermentinį aktyvumą taip pat galima padidinti askorbato jonais, gaunamais iš askorbino rūgšties druskų, kurių katijonas netrukdo reakcijos eigai. Išvalytam fermentui, kurio santykinis aktyvumas yra 50 mE/mg, maksimalus alfa-amidinimas pasiekiamas, esant 50mM askorbato koncentracijai. Alfa-amidinimo aktyvumas taip pat gali būti padidintas, pridedant katalazės. Optimalus alfa-amidinimo reakcijos biologiškai svarbiems substratams pH yra nuo 6,5 iki 7,5.
Monokloniniai ir polikloniniai antikūnai, nukreipti prieš fermentą, buvo gauti, naudojant švarų fermentą, kaip antigeną, siekiant atitinkamai gauti pelių ir viščiukų imunines reakcijas. Tiek monokloninius, tiek ir polikloninius antikūnus pareiškėjai gavo ir išvalė pagal metodiką, aprašytą 8 pavyzdyje. Specifiškų alfa-amidinančiam fermentui antikūnų sukūrimo išradimas laikomas išradėjų laboratorijose.
Antikūnai gali būti imobilizuoti ant kietos matricos, netirpstančios naudojamoje terpėje. Pageidautina, kad matrica būtų atspari irimui. Matricoje yra funkcinė grupė, sugebanti surišti baltymus, kuriuose funkcinės grupės po to kovalentiškai susiriša su antikūnais. Tokia antikūnų imobilizacija palengvins alfa-amidinančio fermento išskyrimą iš gamtinių ir/arba rekombinantinių šaltinių. Tai padaroma, sumaišant imobilizuotus antikūnus su pradiniais fermento preparatais. Antikūnai specifiškai suriša alfaamidinančio fermento molekules. Pašaliniai baltymai nesusiriša su antikūnais ir lengvai pašalinami eliuuojant arba centrifuguojant. Pašalinus priemaišas, alfa-amidinantis fermentas gali būti atskirtas nuo imobilizuotų antikūnų, pakeičiant joninę jėgą, pH arba pridedant atskiriančių jonų (“Affinity Chromatography: Principles and Methods”, Manual, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) ir išskiriamas labai švariame pavidale.
Fermentas buvo išvalytas taip, kad buvo galima nustatyti jo aminorūgščių seką. Ši informacija buvo panaudota, siekiant išskirti nukleino rūgštį, koduojančią fermentą.
Tolimesnis įvedimas į atitinkamą vienaląstį organizmą arba šeimininko ląstelę vykdomas, naudojant standartinius rekombinantinės DNR gavimo būdus (Maniatis et ai., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor, 1982 arba Wu R., ed.,“Methods in Enzymology”, Vol.68, Academic Press, 1979). Gautos ląstelės, turinčios heterologinę, koduojančią alfa-amidinantį fermentą DNR, gamina pakankamus fermento kiekius, kad būtų galima vykdyti in vitro potransliacinį alfa-amidinimą ir teoriškai leidžia šioms ląstelėms vykdyti peptido ar polipeptido modifikaciją in vivo.
Nors šis išradimas ir aprašomas pagal pageidautinus jo realizavimo variantus, šios srities specialistams bus suprantami ir įvairūs galimi pakeitimai. Tinkamiausi šio išradimo realizavimo variantai pateikti pavyzdžiuose.
pavyzdys
Alfa-amidinančio fermento, gauto iš skydliaukės karcinomos, išvalymo metodika
Užšaldyti žiurkių MTC augliai buvo susmulkinti į mažyčius fragmentus ir homogenizuoti 150 mM Tris (pH 7,5) su 250 mM sacharozės, 0,25 % Nacetilglikopiranozido, 0,1 mM PMSF, 20 /ig/ml pepstatino ir 100 μ-g/ml tripsino inhibitoriaus iš sojos pupelių. Paprastai 25 g auglio audinio buvo homogenizuojama 200 ml ledu šaldomo minėto buferio. Homogenizacija buvo atlikta Poltyron (Brinkman) homogenizatoriumi, 7-je padėtyje, naudojant 4 impulsus po 20 sek.. Homogenatas centrifuguojamas 15 min. rotoriniame įrenginyje JA-20 (Beckman), esant 9000g, ir supernatantas nupilamas. Nuosėdos vėl homogenizuojamos 60 ml homogenizacijos buferio 3 impulsais po 20 sek. 7-je padėtyje. Šis antrasis homogenatas centrifuguojamas 15 min., esant 9000g. Šio centrifugavimo supernatantas sumaišomas su pirmuoju supernatantu. Gautas mišinys centrifuguojamas 30 min. SW-28 (Beckman) rotoriumi 4 °C temperatūroje, esant lOOOOOg. Į nuskaidrintą homogenatą buvo dedama amonio sulfato kristalų iki 25 % koncentracijos. Kristalai dedami palaipsniui per 15 min., maišant homogenatą 4 °C temperatūroje. Pamaišius 30 min. šioje temperatūroje, mišinys centrifuguojamas 15 min., esant 27000g, JA-20 (Beckman) rotoriumi 4 °C temperatūroje. Supernatantas nupiltas ir į jį pridėta amonio sulfato iki 40 % koncentracijos. Pamaišius 30 min., mišinys vėl centrifuguotas 15 min., esant 27000g. Po to supernatantas buvo atskirtas, ir nuosėdos, kurios turėjo bent 50 % bendro fermentinio aktyvumo homogenate, buvo vėl suspenduotos 50 mM Tris-HCl (pH 7,0) bandinių suformavimui. Aktyvumas sudarė 8,2 mE/mg baltymo.
Gelio filtracinė išskyrimo pagal dydi chromatografija per Sephacryl S-300
Sephacryl S-300 (Pharmacia) buvo stabilizuotas 50 mM Tris-HCl (pH 7,0) ir supiltas į kolonėlę K 50/100 pagal gamintojo instrukciją. Kolonėlės sluoksnio tūris - apie 1,3 litro. Pakrautas bandinys sudarė 3 % kolonėlės sluoksnio tūrio. Baltymai buvo eliuuoti iš kolonėlės 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), esant 20 ml/min. srautui. Surinktos frakcijos po 10 ml, ir ištirtas jų alfa-amidinantis aktyvumas, kaip substratą naudojant Dansil-D-Tyr-ValGly. Eliuuotas iš kolonėlės fermentas, kurio vienintelis aktyvumo maksimumas parodytas Fig.l, turėjo molekulinę masę 60000-65000 daltonų. Jo aktyvumas buvo mažiausiai 50 mE/mg baltymo.
Mono-Q chromatografija, esant pH 6,0 (stipri anijonų mainų chromatografija)
Frakcijos iš kolonėlės Sephacryl S-300 su maksimaliu alfa-amidinančiu aktyvumu buvo surinktos ir dializuotos 4 litruose 20 mM bis-Tris buferio (pH 6,0). Gautas tirpalas supiltas į kolonėlę mono-Q HR 5/5, kuri buvo paruošta pagal gamintojo instrukcijas ir stabilizuota 20 mM bis-Tris, pH 6,0. Surinkus nesusijungusį su kolonėlės adsorbentu baltymą eliuente, surišti baltymai buvo eliuuojami tiesiniu druskų gradientu nuo 0 iki 300 mM NaCl 20 mM bis-Tris, pFl 6,0, buferyje. Srautas per kolonėlę buvo 0,5 ml/min., ir buvo frakcionuojama po 2 ml. Baltymų tirpalas, ištekantis iš mono-Q kolonėlės esant pH 6,0, buvo tuoj pat neutralizuotas, renkant į mėgintuvėlius, turinčius po 200 ųl 1,0 M Tris (pH 7,0). Frakcijos buvo testuojamos pagal alfa-amidinimo aktyvumą, ir aktyvumo pikas buvo pastebimas, eliuuojant 160 mM NaCl (Fig.2). Aktyvumas buvo 161 mE/mg baltymo.
Mono-Q chromatografija, esant pH 8,0
Frakcijos su maksimaliu alfa-amidinančiu aktyvumu po mono-Q chromatografijos, esant pH 6,0, buvo dializuojamos du kartus keičiant po 4 litrus 5 mM Tris-HCl (pH 8,0). Fermentas buvo supiltas į Mono-Q HR 5/5 kolonėlę (Pharmacia), stabilizuotą 50 mM Tris-HCį pH 8,0. Baltymai buvo eliuuoti druskų gradientu 0-300 mM NaCl 50 mM TrisHCl (pH 8,0). Srautas buvo 0,5 ml/min., ir buvo frakcionuojama po 2 ml. Kiekviena frakcija buvo neutralizuojama, pridedant 200 μ\ 1,0 M Tris, pH 7,0. Pastebėti du fermento aktyvumo maksimumai: eliuojant 190 mM NaCl ir 220 mM NaCl (Fig.3). Fermento aktyvumai buvo atitinkamai 80 mE/mg ir 400 mE/mg baltymo.
Aktyviausių fermento frakcijų iš Mono-Q (pH 8,0) chromatografijos gel-elektroforezė
Vienodos maksmumo frakcijos dalys (eliuuotos 220 mM NaCl, aktyvumas 408 mE/mg baltymo) po šiluminės denatūracijos buferyje su SDS ir β-merkaptoetanoliu uždėtos ant 10 % SDS-poliakrilamidinio gelio. Stebima vienintelė juosta iš 220 mM NaCl frakcijos (Fig.4), ir šią juostą atitinkanti molekulinė masė yra 73000-75000 daltonų.
73000-75000 daltonų juostos, kaip alfa-amidnančio fermento, patvirtinimas
Išvalyto alfa-amidinančio fermento vienodos dalys buvo analizuotos elektroforeze nedenatūruojančiame 10 % akrilamidiniame gelyje. 50 μΐ mėginiai buvo suleisti į vieną iš dviejų takelių. Po elektroforezės, baltymas iš vienos juostelės buvo eksponuotas nudažant sidabru. Iš kitos juostelės išpjautos 3 mm dydžio gabaliukai ir kiekvienas iš jų patalpintas j mikrotitravimo plokštelės lizdus. Į kiekvieną lizdą buvo pridėta po 100 μ\ mišinio, kuriame yra dansil-substrato, katalazės, askorbino rūgšties ir 150 mM Tris, pH 7,0. Inkubacija buvo vykdoma 16 valandų 37 °C temperatūroje ir pastoviai kratant. Po to, patalpintos į kiekvieną lizdą dalys buvo analizuojamos pagal sugebėjimą paversti substratą į amidintą produktą. Fermentinis aktyvumas buvo aptiktas dviejose gelio išpjovose. Aktyviausias buvo tas, kuris atitiko stipriai nudažytą baltymą atitinkamoje gelio juostelėje (Fig.5).
pavyzdys
Rekombinantinio žmogaus kalcitonino gavimo metodikos
Žmogaus kalcitoninas - tai 32 aminorūgščių sekos hormonas, C-gale turintis amidintą prolino liekaną. Mikroorganizmas buvo gautas genų inžinierijos būdu, norint gauti rekombinantinį sulietą baltymą, turintį aminorūgščių seką, atitinkančią žmogaus kalcitoniną. Sulieto baltymo genas buvo parinktas tokiu būdu, kad žmogaus kalcitonino seka būtų apribota arginino liekana N-gale, o C-gale būtų glicino liekana, kuri užbaigtų rekombinantinį dirbtinį baltymą (Fig.7). Patalpinus žmogaus kalcitonino geną į plazmidę, mikroorganizmas buvo transformuotas šios plazmidės pagalba ir gauta geno ekspresija (Fig.6). Šis baltymas, turintis žmogaus kalcitoniną, buvo gautas iš rekombinantinių ląstelių lizatų nusodinant. Cisteino liekanos buvo paverstos S-sulfonatais , o lizino liekanos buvo grįžtamai blokuotos citrakonio anhidridu. Kadangi žmogaus kalcitoninas neturi arginino, tai rekombinantinį dirbtinį baltymą apdorojus tripsinu, gaunamas peptidas su žmogaus kalcitonino seka, kuri C-gale yra pailginta glicinu. Šis peptidas buvo išskirtas atvirkščių fazių HPLC arba jonų mainų chromatografijos būdu, o jo struktūra (Fig.7) nustatyta aminorūgščių analizės ir mikrosekų analizės metodais.
Peptido glicino liekana pašalinta ir priešpaskutinė prolino liekana pakeista į prolinamidą, panaudojant šio išradimo alfa-amidinantj fermentą. Šio peptido pusiau preparatyvinio alfa-amidinimo sąlygos buvo tokios: liofilizuotas peptidas (200-300 nanomolių) (substratas) buvo ištirpintas 200 μΐ 150 mM Tris-HCl buferio (pH 7,0), turinčio apie 750 μΕ alfa-amidinančio fermento. Fermentas buvo gautas arba iš žiurkių karcinomos audinio arba iš žiurkių MTC ląstelių linijos SA-77. Fermentas buvo išvalytas iki proteolitinio aktyvumo pašalinimo. Tai buvo padaryta, naudojant jonų mainų chromatografiją ir išskyrimo chromatografiją (žr. aukščiau aprašytą metodiką). Švarus homogenizuotas fermentas nėra būtinas. Į šį mišinį pridėta askorbino rūgšties ir vario sulfato atitinkamai iki 3 mM ir 2 μΜ. Gautas tirpalas sumaišytas ir inkubuotas 37 °C temperatūroje 5-6 vai. Paprastai 70-90 % substrato virsdavo produktu. Pašalinus Ssulfonatines grupes, rekombinantinis žmogaus kalcitoninas (rkCT) valomas atvirkščių fazių chromatografijos metodu (žr. Fig.9). Galutinis produktas buvo charakterizuotas jo sulaikymu atvirkščių fazių HPLC chromatografijoje (Fig. 10), tripsininzacijos fragmentų kiekybiniu vaizdu (Fig.l 1), aminorūgščių analize (I lentelė) ir jo biologiniu aktyvumu (Fig.12). Visuose pavyzdžiuose rekombinantinis žmogaus kalcitoninas buvo identiškas sintetiniam žmogaus kaicitoninui.
Aukščiau pateikta medžiaga rodo, kad šio išradimo preparatai gali amidinti fiziologiškai tinkamus substratus, pvz., žmogaus kalcitoniną, gautą naudojant rekombinantinės DNR technologiją, t.y. turintį tik L-aminorūgštis.
PALYGINIMO EKSPERIMENTAI Pateikiamo preparato aktyvumo palyginimas su žinomais preparatais Bandymo sistemų pateikiamų preparatų santykiniam aktyvumui nustatyti palyginimas
Jau anksčiau buvo naudojamos kelios aktyvumo nustatymo sistemos. Daugelyje žinomų darbų buvo naudota metodika, paremta D-Tyr-Val-Gly pavertimu į D-TyrValNH2. Ši metodika yra kiekybinė, jei naudojamas žymėtas atomas (12;>I-D-Tyr-Val-Gly), kuris sumaišomas su nežymėtos medžiagos pertekliumi (D-Tyr-Val-Gly). Išmatuotas žymėtos medžiagos pakeitimas leidžia ekstrapoliuoti į nežymėtą medžiagą ir taip išskaičiuoti aktyvumą
Nors pareiškėjai naudojo ir tokio tipo aktyvumo nustatymo metodiką, pateikiamų preparatų aktyvumo nustatymas paremtas tiesioginiu Dansil-Tyr-Val-Gly pavertimo į Dansil-Tyr-ValNH2 matavimu.
Norint nustatyti ir palyginti žinomų preparatų ir pateikiamų preparatų santykinį aktyvumą, buvo atliktas metodikų palyginimo testas.
Eksperimentiniai protokolai buvo sugrupuoti taip:
I. Monodansil-L-Tyr-Val-Gly
Alfa-amidinantis fermentinis preparatas, gautas iš žiurkių skydliaukės karcinomos ir iš audinių kultūros terpės, surinktos iš iš CA-77 ląstelių, buvo naudojamas kaip fermento šaltinis. Naudojama pastovi fermento koncentracija, išskyrus kai kuriuos nurodytus atvejus.
Reakcijos mišinys, skirtas monodansilo pakaito pakeitimui, susidėjo iš:
μΐ fermento, μϊ 30 mM askorbato, μΐ 20 μΜ CuSC>4, μΐ 100 ųg/ml jaučio kepenų katalazės, μΐ tirpalo, turinčio 2 nanomolius substrato, μΐ 150 mM TĘS, pH 7,0.
Buvo paruošti du bandiniai ir inkubuoti 37 °C temperatūroje 10, 20 ir 30 min. Fermentinė reakcija nutraukiama, pridedant 10 μΐ 500 mM EDTA. Substratas atskiriamas nuo produkto atvirkščių fazių RP E1PLC chromatografijos metodu, naudojant skysčių chromatografijos įrangą (Hewlett Packard-1090), o kiekybiniai rodikliai buvo gauti, naudojant integratorių HP-3392. Monodansil-L-Tyr-Val-Gly virsmo į alfa-amidintą produktą priklausomybė nuo laiko buvo tiesinė.
II. 125I D-Tyr-Val-Gly
D-Tyr-Val-Gly ir D-Tyr-ValNFE buvo pažymimi jodu, naudojant Pierce Chemical Company firmos jodo preparatą. Gauti junginiai buvo panaudoti jonų mainų kolonėlės su sulfopropilu kalibracijai. !2T D-Tyr-Val-Gly buvo pridėtas prie 650 μΜ D-Tyr-Val-Gly, ir naudotas kaip substratas. Reakcijos mišinys monodansilo substratui pakeisti susidėjo iš:
μΐ fermento, μΐ 30 mM askorbato (30 mM), μΐ 20 μΜ CuSCL, μΐ 100 μg/ml katalazės, μΐ substrato, 600 μΜ koncentracija, μΐ 150 mM TĘS, pH 7,0.
Bandiniai buvo inkubuoti 37 °C temperatūroje 10, 20 ir 30 min. Fermentinė reakcija buvo nutraukiama, pridedant 500 mM EDTA. Bandinys buvo praskiestas 10 mM natrio fosfato buferiu (pH 5,2) ir patalpintas į sulfopropilo katijonitinę kolonėlę. Substratas neprisijungdavo prie kolonėlės; amidintas produktas buvo eliuuojamas 500 mM NaCl. Žymėto substrato amidinimo priklausomybė nuo laiko buvo tiesiška.
III. D-Tyr-Val-Gly
Reakcijos sąlygos, naudojamos D-Tyr-Val-Gly amidinimui, yra identiškos kaip ir dansilinio bei žymėto jodu substratų atveju. Substratų koncentracija reakcijos mišinyje buvo 650 μΜ. Substratas atskiriamas nuo produkto, naudojant gradientinį eliuavimą atvirkščių fazių RP-HPLC chromatografijos būdu, naudojant skysčių chromatografijos įrangą HP-1090. Ištekantis iš kolonėlės skystis buvo kontroliuojamas pagal absorbciją ties 280 nm. Šio tyrimo jautrumas yra daug mažesnis negu tiriant dansilinius ar jodintus substratus. Norint pasiekti tokį patį jautrumą, alfa-amidinimo reakcija buvo vykdoma ilgesnį laiką ir/arba padidinamas alfa-amidinančio fermento kiekis.
Frakcijų analizės duomenys, paverčiant Ι-D-Tyr-Val-Gly į I-D-Tyr-ValNH2 ir Dansil-Tyr-Val Gly į Dansil-Tyr-ValNFE , rodo, kad bet kokiu laiko momentu jodinto substrato buvo paversta maždaug 1,55 karto daugiau, negu dansilinio substrato. Taigi, lyginant ankstesnių tyrimų sistemas su žinoma pareiškėjų naudojama sistema, nustatant akytvumą pagal dansilinio substrato metodiką, turi būti taikomas koeficientas 1,5.
Be to, buvo panaudota griežtesnė kinetinė analizė, siekiant sulyginti tyrimus su Dansil-Tyr-Val-Gly (pareiškėjų) ir D-Tyr-Val-Gly (žinomas anksčiau) substratais:
Substratas Km Vmax
D-Tyr-Val-Gly 37 31
Dansil-Tyr-Val-Gly 1,7 21
Galima matyti, kad lyginant dviejų substratų maksimalų greitį (Vmax = produkto pmol/min/μΐ), D-Tyr-Val-Gly (žinomas anksčiau) yra maždaug 1,48 Dansil-Tyr-Val-Gly (pareiškėjų) aktyvumo. Tai patvirtina ir atitinka anksčiau pateiktus duomenis.
Aktyvumo palyginimas
Eipper et ai. (PNAS) psl.5147, fig.4. duoda Vmax = 39 pmoVjug/val. Tai atitinka santykinį aktyvumą 0,65 mE/mg baltymo per minutę. Tai didžiausias aprašytas aktyvumas. Padalinus šį dydį iš minėto koeficiento 1,5, gausime santykinį aktyvumą 0,4 mE/mg baltymo per minutę. Šį gautą dydį galima sulyginti su aukščiau minėtu pareiškėjų gautu aktyvumu. Aukščiau buvo minėta, kad pareiškėjai pasiekė mažiausiai 25 mE/mg baltymo ir daugiau kaip 1500 mE/mg baltymo. Taigi pareiškėjai gavo 60-3750 kartų didesnį aktyvumą, negu Eipper (PNAS) minimas aktyvumas.
pavyzdys
Alfa-amidinančin fermentų, gautų iš žiurkės skydliaukės karcinomos, išvalymas ir tyrimas
Užšaldytą žiurkės skydliaukės karcinomos audinį susmulkindavo į mažyčius gabaliukus ir homogenizuodavo vandeniniame buferyje, naudodami Polytron homogenizatorių. Nucentrifugavus, nupilamas supernatantas, o nuosėdos vėl ekstrahuojamos nauju buferiu. Antrasis homogenatas buvo centrifuguojamas ir šis supernatantas sumaišomas su pirmuoju. Mišinys buvo centrifuguojamas dideliu greičiu, ir gautas supernatantas naudojamas kaip pradinė medžiaga išvalytam fermentui gauti.
Frakcionuojama amonio sulfatu. Nustatyta, kad esant 26-40 % amonio sulfato, nusėda didelė dalis aktyvaus fermento, ir tokios nuosėdos buvo vėl valomos pagal aukščiau aprašytą metodiką..
Išskyrimo chromatografija buvo atliekama Sephacryl S-300 kolonėlėje. Čia pateiktame 1 pavyzdyje visas iš kolonėlės eliuuotas fermentas turėjo vieną aktyvumo maksimumą. Šiame pavyzdyje kolonėlė buvo pailginta, o pratekantis srauto greitis sumažintas. Šiose naujose eliuavimo sąlygose, kaip ir 1 pavyzdyje, stebimas pagrindinis aktyvumo maksimumas, o po jo buvo nedidelis šalutinis pikas, kuris gali atitikti fermentą su mažesne molekuline mase. Neaišku, ar egzistuoja fermentas su mažesne molekuline mase in vivo, ar jis susidaro dėl dalinio proteolitinio suskaldymo ekstrahavimo ir valymo metu.
Pagrindinis aktyvumo pikas iš S-300 kolonėlės buvo chromatografuotas Mono-Q kolonėlėje, esant pH 6,0. Šiame pavyzdyje buvo panaudota didesnė kolonėlė negu 1 pavyzdyje (Mono-Q HR 10/10) ir eliuuojama naudojant lėkštesnį druskų gradientą. Šiuose matavimuose buvo rasti keturi alfa-amidinančio fermento pikai, eliuuojant su NaCl 160 mM, 200 mM, 220 mM ir 240 mM (atitinkamai I, II, III ir IV pikai, Fig.13). Tai rodo, kad egzistuoja daug fermento formų, ir kad šios formos pasižymi nevienodu krūviu. Atskirų pikų baltymų analizė poliakrilamidiniame gelyje parodė, kad II, III ir IV pikų alfaamidinantys fermentai turi maždaug tą pačią molekulinę masę (73000-75000 daltonų), o I aktyvumo pikas atitinka fermentą su kitokia, tikriausiai mažesne, molekuline mase. III piko fermentas buvo paverstas j vienalytę medžiagą tokiu būdu:
III piko fermentas buvo surinktas ir chromatografuotas Mono-Q HR kolonėlėje 10/10, esant pH 8,0 (Fig. 14). Iš šios kolonėlės fermentas eliuuotas kaip vienas pikas, esant 250 mM NaCl, ir analizė gelyje parodė, kad šis fermentas yra vienalytis (Fig. 15a, 6 juostelė). Tolimesni eksperimentai atlikti su išvalytu III piko fermentu.
1. III piko fermento molekulinė masė, nustatyta analizuojant 7 % poliakrilamido gelyje, yra apie 75000 daltonų (Fig. 15b).
2. Optimalus fermento aktyvumo pH yra 5,0-5,5, naudojant N-dansil-Tyr-Val-Gly kaip substratą (Fig.16), bet kadangi fermentas pastovesnis neutraliame pH, amidinimo reakcijas galima vykdyti ir tokiomis sąlygomis.
3. Nustatyta, kad vario jonų , reikalingų kaip kofaktoriaus fermento aktyvumui pasireikšti, kiekis yra atvirkščiai proporcingas fermento švarumui. Norint pasiekti maksimalų gerai išvalyto fermento aktyvumą, reikėjo 0,1 μΜ ar mažiau Cu2+ jonų, tuo tarpu kai pradinių preparatų atveju - 2 μΜ.
3.Fermento izoelektrinis taškas (pi) yra 4,8.
5. Santykinis homogeninio fermento aktyvumas buvo 2100 mE/mg baltymo.
II piko fermentas taip pat buvo išvalytas iki homogeninio stovio. Pasirodė, kad norint gauti šį homogeninį fermentą, nepakanka Mono-Q chromatografijos esant pH 8,0. Todėl, perleidus per Mono-Q (pH 6,0) kolonėlę, II piko (Fig. 13) fermentas buvo dializuotas 1M Tris pH 7,0 ir suleistas į kolonėlę su fenilsefaroze, buferinta tuo pačiu buferiu. Didžioji dalis pašalinių baltymų pašalinama šioje kolonėlėje, o amidinantis fermentas, gautas paskutinėje stadijoje, buvo gana švarus. Išvalius surinktą fermentą Mono-Q HR 10/10 (pH 8,0) kolonėlėje), gautas homogeninis II piko fermento preparatas, eliuuojamas iš kolonėlės, esant 220 mM arba daugiau NaCl.
II piko fermento tyrimai parodė, kad:
1. II piko fermento molekulinė masė, nustatyta analizuojant 7 % poliakrilamido gelyje, yra apie 73000-75000 daltonų. Taigi, pagal molekulines mases II ir III pikų fermentai yra vienodi.
2. Optimalus fermento aktyvumo pH yra 5,0-5,5, t.y. sutampa su analogiška III piko fermento charakteristika.
3. Fermento izoelektrinis taškas (pi) yra 5,8.
pavyzdys
Alfa-amidinančio fermento, gauto iš ląstelių CA-77 kultūros, išvalymas ir tyrimas
Žiurkės MTC ląstelių CA-77 kultūra buvo išauginta kaip monosluoksninė kultūra 150 cm2 T-kolbose (Corning), esant 8 % CO2. Kultūra laikoma terpėje iš Dulbecco Modified Eagle Medium:F-10 (1:1), 3,7 g/1 NaHCCb, 5 ųg/ml transferino, 10 ųg/ml insulino, 30 nM seleno, 4 ųg/ml gentamicino sulfato. Taip išaugintas kultūras buvo galima laikyti ilgą laiką, keičiant terpę kas 48 valandas. Norint gauti didesnę ląstelių išeigą, ląstelės buvo augintos terpėje su kraujo serumu (5 % arklio ir 2,5 % veršelio fetalinio serumo) tris dienas. Po to, ląstelės buvo perplautos fiziologiniu tirpalu su fosfatiniu buferiu ir užpilamos minėta terpe..
Audinio kultūros terpė buvo pagaminta aseptinėmis sąlygomis ir laikoma -20 °C. Ji praskiedžiama 2 litrais dejonizuoto vandens (3:1) ir 50 ml/min greičiu paduodama į silpnų anijonų mainų kolonėlę DEAE (Cuno 250), kuri buvo buferinta 1,0 litru 20 mM bis-TrisHC1 (pH 6,0) 4 °C temperatūroje. Alfa-amidinantis fermentas (“alfa-AE”) eliuuojamas iš kolonėlės laipsnišku būdu 50 mM Tris-HCl (pH 7,0) su 500 mM NaCI tirpalu 50 ml/min. greičiu. Frakcijos, pasižyminčios alfa-AE aktyvumu (santykinis aktyvumas -10-15 mE/mg), surenkamos ir koncentruojamos sumažintame slėgyje kol tūris sumažėja 4-5 kartus, naudojant preparatyvinį rotorių Savant RH-100.
Ši medžiaga tiesiogiai leidžiama j 5x50 cm Sephacryl 300-SF (Pharmacia) kolonėlę. Mobili fazė buvo 100 mM Tris-HCl (pH 7,0), srauto greitis - 1,0 ml/min. Chromatografuojama 4 °C temperatūroje (Fig.17).
Šioje išvalymo stadijoje fermentas nerodo proteolitinio aktyvumo, o jo alfaamidinantis aktyvumas yra mažiausiai 50 mE/mg baltymo. Šios stadijos fermentinis preparatas buvo sėkmingai panaudotas glicinu pailgintų žmogaus rekombinantinio kalcitonino ir augimo hormono atlaisvinimo faktoriaus amidinimui. Pradedant nuo ląstelių tankio 1-1,5 χ 106 ląstelių/ml (iš T-kolbų), paprastai buvo gaunama 200-350 mE fermento aktyvumo 1 sunaudotos litrui terpės, kuri praeidavo šiuos du valymo etapus. Fermentas yra stabilus ir tinkamas naudoti tirpale, arba, jį imobilizavus, ant kieto pagrindo.
Kolonėlės frakcijos, turinčios aktyvų alfa-AE, buvo surinktos ir dializuotos 6 litruose 20 mM bis-Tris-HCl (pH 6,0). Fermentas buvo suleistas į stiprių anijonų mainų Mono-Q HR 10/10 kolonėlę (Pharmacia), kuri prieš tai buvo išlyginta 20mM bis-Tris-HCl, pH 6,0. Po to, iš šios kolonėlės eliuuojamas fermentas, naudojant tiesinį 0-300 mM NaCl gradientą per tris valandas, esant 2,5 ml/min. srautui. Šiuose valymo etapuose būvu išskirti keturi chromatografiškai skirtingi alfa-amidinantys fermentai. Maksimumai sunumeruoti pagal eliuavimo eilę (Fig.13). III ir IV pikai priklauso fermento formoms su didele molekuline mase ir atitinka fermento, gauto iš žiurkių skydliaukės karcinomos, II ir III pikus. I ir II pikai priklauso mažesnės molekulinės masės fermento formoms, kurios gali susidaryti dėl proteolitinio aktyvumo.
Keturios mūsų laboratorijoje identifikuotos alfa-amidinančio fermento formos skiriasi paviršiaus krūviu, ką rodo jų skirtingas sulaikymo laikas chromatografijos metu (Fig.18). Optimali pH reikšmė šioms formoms taip pat skirtinga. Fig.19 pateikti rezultatai rodo, kad III ir IV pikai turi tą patį pH optimumą tarp 5,0 ir 5,5. Šie rezultatai atitinka pH, nustatytą II ir III pikų fermentams, gautiems iš žiurkės skydliaukės karcinomos. I ir II pikai turi platesnį pH diapazoną - nuo 5 iki 8,5 (Fig.19). Šie rezultatai atitinka Eipper et ai, “Peptides”, vol.4, p.921-928, 1983 bei Murthy et ai, J. Biol. Chem., 261, 1815-1822 (1986) nurodytą pH optimumo reikšmę.
Pažymėjus Na’23I izotopais II ir IV pikų fermentus ir po to atlikus jų SDS-PAGE, gauta, kad IV aktyvumo piko fermentas turi molekulinę masę 73-75 kDal, o II piko mažesnė už 55 kDal. Tiksli II piko molekulinė masė nežinoma, nes jis nebuvo išvalytas iki homogeninės būsenos (45-55 kDal diapazone yra keletas baltymų juostelių).
III ir IV pikų fermentai buvo išvalyti iki homogeninės būsenos, naudojant hidrofobinę chromatografiją ir stiprią anijonų mainų chromatografiją, esant pH 8,0. IV piko (Fig.18) fermentas surinktas, koncentruotas vakuume iki 2 ml ir tuoj pat suleistas į 1,3x8 cm kolonėlę su fenilsefaroze (Pharmacia), buferinta 500 mM Tris-HCl, pH 7,0. Frakcijos, rodančios alfa-amidinantį aktyvumą, eliuuotos 0,5 ml/min. buferio srautu (Fig.20). Surinktos aktyvumą turinčių pikų frakcijos, dializuotos 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), po to jos suleistos į Mono-Q HR 10/10 kolonėlę, subalansuotą 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. Fermentas buvo eliuuotas iš kolonėlės, naudojant 0-300 mM NaCl tiesinį gradientą 3 valandas 2,0 ml/min. greičiu (Fig. 21). Alfa-amidinančiu aktyvumu pasižyminčios frakcijos buvo eliuuotos, esant 240 mM NaCl ir daugiau, surinktos, nustatoma 0,001 % (pagal tūrį) koncentracija Tritone Χ-100 ir laikomos 4 °C temperatūroje. Pagal matavimų duomenis santykinis išvalyto fermento aktyvumas buvo apie 1500 mE/mg baltymo, esant pH 7,0. III piko alfa-amidinančio aktyvumo fermentas buvo išvalytas iki homogeninės būsenos taip pat kaip ir IV piko fermentas.
Auglio piko (3 pavyzdys) ir audinių kultūros IV piko (4 pavyzdys) fermentų fizikocheminiai tyrimai, lyginant molekulines mases (73-75 kDal), pH optimumus (5,05,5), aminorūgščių sekas ir eliuavimo eigą (stiprioje anijonų mainų chromatografijoje, pH 8,0, eliuavimas vyksta esant daugiau nei 240 mM NaCl) rodo, kad šie du pikai gali atitikti vieną ir tą patį fermentą.
pavyzdys
Biologiškai svarbių peptidinių hormonų alfa-amidinimas, naudojant alfa-amidinantj fermentą
Buvo gauta ir sėkmingai alfa-amidinta, naudojant šio išradimo alfa-amidinantį fermentą, keletas rekombinantiniu peptidinių hormonų substratų, įskaitant lašišos ir žmogaus kalcitoninus, žmogaus augimo hormono atpalaidavimo faktorių ir žmogaus kalcitonino giminingą genui peptidą. Kaip iliustraciją galima pateikti rekombinantinio lašišos ir žmogaus kalcitoninų bei žmogaus augimo hormono atpalaidavimo faktoriaus gavimą. Tie patys gavimo principai gali būti panaudoti ir kitiems rekombinantiniams peptidams.
Lašišos kalcitoninas yra 32 aminorūgščių sekos peptidas, kurio C-gale yra alfaamidinta prolino liekana. Siekiant gauti dirbtinį rekombinantinį baltymą, kuris turėtų aminorūgščių seką, atitinkančią lašišos kalcitoninui, genų inžinerijos būdu buvo sukurtas mikroorganizmas. Dirbtinio baltymo genas buvo sukonstruotas taip, kad lašišos kalcitonino seka būtų apribota iš N-galo metionino liekana, o C-gale būtų glicino liekana, kuria baigusi dirbtinis rekombinantinis baltymas. Įjungus kalcitonino geną į plazmidę, mikroorganizmo genas buvo transformuotas šia plazmidė ir vyko dirbtinio baltymo ekspresija. Šis kalcitoniną turintis baltymas buvo išskirtas iš rekombinantiniu mikroorganizmų lizato, jį nusodinant, o cisteino liekanos buvo paverstos S-sulfonatais. Kadangi lašišos kalcitoninas neturi metionino, skaldant bromeianu, buvo galima gauti peptidą, turintį lašišos kalcitonino seką, kurios C-gale yra glicinas. Šis peptidas buvo išskirtas atvirkščios fazės aukšto slėgio skysčių (RF-HPLC) arba jonų mainų chromatografijos būdu, o jo struktūra buvo nustatyta analizuojant aminorūgščių sudėtį ir seką.
Priešpaskutinė prolino liekana buvo paversta j prolinamidą, veikiant alfaamidinančiu fermentu. Šio alfa-amidinančio fermento reakcijos sąlygos buvo tokios: liofilizuotas peptidinis substratas (lašišos kalcitonino pirmtakas, C-gale turintis gliciną,
200-300 nanomolių) buvo ištirpintas 200 μ\ 150 mM Tris-HCl buferio, pH 7,0, kuriame buvo 750 μΕ alfa-amidinančio fermento. Fermentas buvo gautas iš žiurkių skydliaukės karcinomos auglio arba ląstelių linijos CA-77. Jis turi būti išvalytas taip, kad neturėtų proteolitinio aktyvumo. To galima pasiekti, panaudojus išstūmimo ir jonų mainų chromatografijas (žr. 4 pavyzdį). Švarus vienalytis fermentas nėra būtinas. Į šį mišinį buvo pridėta askorbino rūgšties ir vario sulfato, kad jų koncentracijos mišinyje būtų atitinkamai 3 mM ir 2 μΜ. Norint padidinti kalcitonino išeigą, į mišinį galima pridėti katalazės (7,5 gg/ml), etanolio (1 % pagal tūrį) ir kalio jodido (50 mM). Gautas mišinys sumaišomas ir inkubuojamas 37 °C temperatūroje 5-6 valandas.
Pašalinus S-sulfonatines grupes veikiant β-merkaptoetanoliu, lašišos kalcitonino rekombinantas išvalomas aukšto slėgio skysčių su atvirkščiomis fazėmis chromatografijos būdu. Galutinis produktas charakterizuojamas jo sulaikymu atvirkščių fazių HPLC chromatografijoje, skaidymo tripsinu produktų kiekybiniu pasiskirstymu ir aminorūgščių analize. Visuose pavyzdžiuose rekombinantinis lašišos kalcitoninas buvo identiškas sintetiniam lašišos kalcitoninui.
Žmogaus kalcitoninas yra 37 aminorūgščių sekos ilgio hormonas, C-gale turintis alfa-amidintą fenilalanino liekaną. Buvo sukonstruotas dirbtinio baltymo genas analogiškai lašišos genui, kuris apribotas metionino liekana N-gale ir glicino liekana C-gale, kuria ir baigiasi rekombinantinis dirbtinis baltymas. Išskyrimas, išvalymas, alfa-amidinimas ir tyrimas buvo tokie patys, kaip ir lašišos kalcitonino rekombinanto atveju.
Žmogaus augimo hormono atpalaidavimo faktorius (hGHRF) - tai 44 narių peptidinis hormonas, kurio C-gale yra alfa-amidinta leucino liekana. Dirbtinio baltymo hGHRF genas buvo sukonstruotas taip, kad peptidinio hormono aminorūgščių seka buvo apribota triptofano liekana N-gale ir glicino liekana - C-gale, kuria ir baigiasi dirbtinis baltymas.. hGHRF turintis dirbtinis baltymas buvo išskirtas iš ląstelių lizato nusodinant. Neturinti hGHRF baltymo dalis buvo denatūruota, paverčiant cisteino liekanas į Ssulfonato darinius. Kadangi hGHRF neturi triptofano, paveikus baltymą BNPS-skatolu, įvyksta oksidacinio skaldymo reakcija, ir gaunamas ncamidintas hGHRF, pailgintas glicinu C-gale. Tuo pačiu metu oksidinama 27 padėties metionino liekana į metionino sulfoksidą. Šis pailgintas glicinu peptidas išskirtas, panaudojant gel-filtracinės ir atvirkščių fazių skysčių chromatografijos metodus. Jo struktūra nustatyta, naudojant peptidų fragmentų, gautų skaldant tripsinu, aminorugščių analizės metodą.
Priešpaskutinė leucino liekana buvo paversta į leucino amidą, paveikus alfaamidinančiu fermentu pagal išradimą. Alfa-amidinto hGHRF gavimo sąlygos yra tokios: Liofilizuotas peptidinis substratas (20-40 nanomolių) buvo ištirpintas 150 μΐ dejonizuoto vandens ir sumaišytas su 90 μ\ (500 μΕ) (pH 7,0) alfa-amidinančio fermento preparato, išskirto arba iš žiurkės MTC auglio arba C-77 ląstelių linijos terpės. Fermentas valytas tol, kol neliko proteolitinio aktyvumo; tai galima pasiekti, naudojant išstūmimo ir jonų mainų chromatografiją. Į mišinį pridedama askorbino rūgšties ir vario sulfato, kad jų koncentracijos būtų atitinkamai 3 mM ir 2 μΜ. Gautas tirpalas sumaišytas ir inkubuotas 37 °C temperatūroje 4-6 valandas. Paprastai 95 % substrato virsdavo produktu (pagal tripsinu suskaidytos medžiagos aminorugščių analizės duomenis). Metionino sulfoksidinė liekana buvo redukuota iki metionino, naudojant 4 M beta-merkaptoetanolio tirpalą buferyje (pH 4,0) iš 10 mM natrio acetato, 80 °C temperatūroje 1 valandą. Galutinis produktas buvo išvalytas aukšto slėgio chromatografijos su atvirkščiomis fazėmis būdu ir identifikuotas pagal skaidymo tripsinu produktų kiekybinį pasiskirstymą ir aminorugščių analizę. Taip pat buvo patikrintas jo biologinis aktyvumas. Visuose pavyzdžiuose rekombinantinis hGHRF buvo identiškas sintetiniam hGHRF.
Be aukščiau aprašytų tyrimų, buvo įvertinti du pramoniniu būdu gaminami pailginti glicinu peptidiniai hormonai pagal jų galimybę būti substratu alfa-amidinančiam fermentui. Šios medžiagos buvo alfa-melanocitą stimuliuojančio hormono ir P-mcdžiagos pirmtakai. Abiem atvejais pasirodė, kad šie preparatai yra tinkami substratai alfaamidinančiam fermentui.
pavyzdys
Išvalyto alfa-amidinančio fermento seku analizė Frakcijos, turinčios alfa-amidinantį fermentą, buvo surinktos arba iš žiurkių skydliaukės karcinomos audinio, arba iš ląstelių kultūros CA-77 supernatantų, redukuotos fermento sulfhidrilinės grupės, o po to karboksimetilinta. Gautas reakcijos mišinys suleistas į Vydac C4 atvirkščių fazių skysčių chromatografijos kolonėlę (dalelių dydis 5 gm, porų dydis 33 nm), kuri buvo subalansuota 0,4 % trifluoracto rūgšties tirpalu. Buferio druskoms pašalinti kolonėlė plaunama šiuo tirpalu. Nudruskintas fermentas eliuuojamas iš kolonėlės 80 % acetonitrilu, turinčiu 0,08 % trifluoracto rūgšties. Iš kolonėlės ištekantis srautas kontroliuojamas, matuojant absorbciją ties 220 nm. Gautos baltymų frakcijos surinktos, sumaišytos ir liofilizuotos. Po to ši medžiaga tirpinama 100 gi 0,1 % SDS ir patalpinta į baltymų sekų analizės įrenginį (Applied Biosystems, Model 470 A).
Atliekamos operacijos buvo tokios, kokios nurodytos Applied Biosystems instrukcijoje.
Gauti aminorūgščių feniltiohidantoino dariniai analizuoti skysčių chromatografijos būdu, naudojant Hypersil C18 kolonėlę (dalelių dydis 5 μτη, porų dydis 10 nm). Naudojamas
Hehvett Packard 1090 skysčių chromatografas, ir matuojama absorbcija ties 269 ir 313 nm.
Pagrindinio fermentą turinčio piko (III piko) iš auglio audinio N-galo seka buvo tokia:
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
NH2-Ser-Phe-Ser-Asn-Glu-Cys-Leu-Gly-Thr-Ile-Gly-Pro-Val-Thr-Pro-Leu-Asp-Ala-Ser20 21 22 23 24 25 26 27 28 -Asp-Phe-Ala-Leu- Asp- Ile-Arg-Met- Pro
Fermento, gauto iš ląstelių kulūros CA-77 (IV piko) N-galo aminorūgščių seka yra identiška fermento, gauto iš auglio audinio (III piko) aminorūgščių sekai. Tačiau analizuojant šio fermento seką, buvo rasta nedidelė papildoma komponentė, kuri, matyt, yra šio fermento sekos N-galo tęsinys. Ji galėjo atsirasti potransliacinio apdorojimo metu. Šios komponentės seka yra tokia:
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
NH2-Phe-Lys-Gly-Thr-Thr-Arg-Ser-Phe-Ser-Asn-Gly-Cys-Leu-GlyPapildomi duomenys apie alfa-amidinančio fermento, išskirto iš žiurkių skydliaukės karcinomos, aminorūgščių seką, gauti atliekant tokias operacijas: Maždaug 400 gg išvalyto fermento buvo redukuota ir karboksimetilinta. Po to 18 valandų vykdoma šio tirpalo ekstruzinė dializė, naudojant 25 mM Tris-HCl (pH 8,0) ir 0,5 mM karbamido. Liekana buvo patalpinta į 1,5 ml talpos centrifūgos mėgintuvėlį ir koncentruojama iki 600 gi sumažintame slėgyje. Į fermento tirpalą pridedama 2 μΐ (2 μ-g) tripsino, ir mišinys buvo inkubuojamas 1 valandą 37 °C temperatūroje. Tada pridedama antra tripsino porcija (2 pg) ir inkubuojama 37 °C temperatūroje dar 2 valandas. Reakcija nutraukiama, pridedant 200 μΐ 4 M karbamido/10 % acto rūgštyje. Gautas produktas skirstomas Vydac 08 skysčių chromatografijos kolonėlėje (dalelių dydis 5 gm, porų dydis 33 nm), kuri buvo stabilizuota 0,1 % trifluoracto rūgšties tirpalu. Kolonėlė buvo eliuuojama tiesiniu acetonitrilo gradientu iki 50 % koncentracijos 4 valandas; frakcijos renkamos kas 2 min. Fermento, suskaldyto tripsinu, eliuavimo pikai skysčių chromatografijoje su atvirkščiomis fazėmis parodyti Fig.23. Nustatytos trijų gautų peptidų aminorūgščių sekos. Rezultatai parodyti žemiau (peptidai pažymėti pagal frakcijos numerį).
Peptidas Nr.65: Ser-Met-Gln-Pro-Gly-Ser-Asp-Gln-Asn-His-Phe-Ser-Gln-Pro-Thr Peptidas Nr.58: Asn-Gly-Gln-Trp-Thr-Leu-Ile-Gly-Arg Peptidas Nr.86: Phe-Val-Thr-Gln-Trp-Gly-Glu.
pavyzdys
Alfa-amidinančio fermento geno arba DNR sekos, koduojančios žiurkės MTC arba CA-77 alfa-amidinantį fermentą, molekulinis klonavimas Norint klonuoti geną arba koduojančią alfa-amidinantį fermentą DNR seką, reikia turėti atitinkamą informaciją ir reagentus. Reikia surasti patikimą fermentinio baltymo šaltinį, kuris savo ruožtu bus fermento signalinės RNR (mRNR) šaltiniu ir galų gale komplementarios DNR (kDNR) šaltiniu. Fermento geno arba kDNR išskyrimas reikalauja molekulinio zondo, specifiško duotam fermentui. Paprastai jis gali būti arba oligonukleotidas, kurio seka yra komplementari daliai fermento geno, arba antikūno molekulė (arba antikūno molekulių kolekcija), kuri specifiškai atpažįsta fermento baltymą. Tokiems molekuliniams zondams gauti reikia tokios fermento išvalymo metodikos, kad būtų galima gauti specifinius fermentui antikūnus, arba būtų nustatyta fermento aminorūgščių seka, kad būtų galima konstruoti oliginukleotidinius zondus. Tokia metodika buvo surasta šio išradimo alfa-amidinančiam fermentui.
Alfa-amidinantis fermentas buvo išskirtas iš žiurkės skydliaukės karcinomos auglio audinio arba iš ląstelių CA-77 kultūros. Buvo priimta, kad šios ląstelės turi koduojančią fermento baltymą mRNR. Metodai, pagal kuriuos buvo gauta kDNR alfa-amidinančiam fermentui, yra gerai žinomi molekulinėje biologijoje.
Šių metodų aprašymai gali būti rasti laboratoriniuose žinynuose, pvz., “Molecular Cloning” (1982), “DNR Cloning” vol.I a Practical Approach (1985), arba pirminiuose literatūros šaltiniuose, pvz., Gubler V., Hoffman B.J., Gene, 25, 262-269 (1983) arba Young R.A., Davis R.W., PNAS, 80, 1194-1198 (1983). Minėtos metodikos yra bendros, jas taikant reikia atsižvelgti į naudojamos mRNR šaltinį. Specifinės amidinančio fermento kDNR gavimui mes panaudojome žiurkės skydliaukės karcinomos ir ląstelių linijos CA-77 mRNR. Dvigrandės kDNR pavyzdžiai, kurie buvo sintezuoti, buvo savo ruožtu panaudoti atskirų genų kolekcijos sukūrimui pagal žinomas metodikas.
Kaip aprašyta aukščiau, tam tikrų kDNR alfa-amidinančiam fermentui identifikacija reikalauja molekulinių zondų, kuriais galima atskirti tuos rekombinantus nuo kitų rekombinantų. 3 ir 4 pavyzdžiuose duotos metodikos, naudojamos fermento, reikalingo molekulinių zondų sukūrimui, išvalymui. 6 pavyzdyje aprašytas šio baltymo panaudojimas, nustatant aminorūgščių sekas, o 8 pavyzdyje aprašoma išvalyto baltymo panaudojimas, gaminant specifinius fermentui antikūnus.
Aminorūgščių sekos, duotos 6 pavyzdyje, yra specifinės sudarant selektyvias oligonukleotidų sekas. Gaminant oligonukleotidinius zondus, yra svarbu atsižvelgti į keletą faktorių. Pilną šios problemos išaiškinimą galima rasti Lathe R.J., J.Mol. Biol., 183, 1-12 (1985). Kadangi tą pačią aminorūgščių seką gali koduoti daugiau kaip viena nukleotidų seka (genetinio kodo išsigimimo principas), bet kuri atskira nukleotidų seka įeis į potencialių nukleotidinių sekų aibę. Norint užsitikrinti, kad nukleotidinis zondas identifikuos dominantį geną, galima pagaminti visų galimų sekų, kurios gali koduoti specifinę amidinančio fermento aminorūgščių seką, ekvimolinį mišinį. Tokių mišinių sudėtingumas daro juos mažiau selektyviais, ir reikia naudoti oligonukleotidų mišinius daugiau negu vienai aminorūgščių sekos sričiai, kad būtų gaunamas absoliutus selektyvumas duotam genui.
Iš kitos pusės, oligonukleotidas, selektyvus dominančiam genui, gali būti gautas pagaminant unikalią pakankamo ilgio nukleotidų seką, kuri sudaro stabilų hibridą. Tikimybė, kad ši seka sudarys stabilų hibridą su kitomis genų sekomis, yra labai maža (priklauso nuo ilgio). Unikali seka yra sudaryta iš labiausiai naudojamo aminorūgščių sekos kodono. Kodono naudojimo dažnis gali būti nustatytas iš žinomų genetinių sekų ir atitinkamų aminorūgščių sekų kompiliacijos. Tai yra gerai žinoma molekulinės biologijos specialistams.
Dar vienas būdas, kuris gali būti panaudotas gaminant specifinius oligonukleotidinius zondus, yra deoksiinozino liekanų įjungimas į oligonukleotidus maksimalios degeneracijos padėtyse. Šis nukleotidinis pakeitimas tarnauja zondo degeneracijos sumažinimui, ir tokiu būdu gali teigiamai veikti selekcijos procesą. (Apie deoksiinozino panaudojimą oligonukleotidiniuose zonduose žr. Ohtsuka et ai, J. Biol. Chem., 260, 2605-2608 (1985)).
Mes naudojome alfa-amidinančio fermento sekas įvairių oligonukleotidinių zondų projektavimui, kurie yra reikalingi amidinančio fermento kDNR išskyrimui. Naudotos sekos ir paruošti zondai parodyti II lentelėje. Reikia pažymėti, kad molekulinės biologijos specialistas gali panaudoti ir alternatyvias genų išskyrimo strategijas.
Tokiu būdu pagaminti oligonukleotidiniai zondai buvo panaudoti gerai žinomais metodais (žr. “Molecular Cloning”, 1982) plazmidžių ir bakteriofagų kDNR klonavimui ir alfa-amidinančio fermento kDNR išskyrimui.
II lentelė
N-galo sekos
AA# 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
seka: Ser Phe Ser Asn Glu Cys Leu Gly Thr Ile Gly Pro Vai Thr
Suprojek- 5’TCC TTC TCC AAT GAG TGC CTG GGC ACC ATT GGC CCT GTG ACC
tuoto geno AGT T AGT C A TTT A T C A A C T
sekos A A A G A A G C T A
G G C T G T G A G
Oligo-zondas
AE1 3’ TTA CTC ACG GAC CCG TGG TAA CCG GGA CAC TGG
T G
Oligo-zondas
AE8 3’ AC CCG TGG TAA CCG GGA CAC TG5’
I I I I I I I
AA# 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
seka: Pro Leu Asp Ala Ser Asp Phe Ala Leu Asp Ile Arg Met Pro
Suprojek- CCC CTG GAT GCC TCT GAC TTT GCC CTG GAC ATC CGG ATG CCT
tuoto geno TT T C T AGC T C TTT T T A A A
sekos A A A G A A A C C
G C G G C T G
Skaidymo tripsinu maksimumas Nr.58
AA# 1 2 3 4 5 6 7 8 9
seka: Asn Gly Gln Trp Thr Leu lle Gly Arg
Suprojek- 5’AAT GGC CAG TGG ACC CTG ATT GGC CGG 3
tuoto geno C A A T T C C A A A
sekos G A T A G C
T G G T T
Oligo-zondas 3’ TTA CCG GTC ACC TG 5’
AE4 GTT
Oligo-zondas 3’ TTA CCG GTC ACC TG 5’
AE5 GTT
Skaidymo tripsinu maksimumas Nr.65
AA# 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 seka: Ser Met Gln Pro Gly Ser Asp Gln Asn His Phe Ser Gln Pro Thr
Supro- 5’TCC ATG CAG CCT GGC TCT GAC CAG AAC CAC TTC TCC CAG CCC ACT 3’
jektuo- AGT A A A AGC T A T T T AGT A T A
to geno A C G A A A C
sekos G G T G G G G
Oligo-zon- 3’ TAC GTC GGI CCI AGI CTG GTC TT 5’ das AE6 T AT
Oligo-zon- 3’ TAC GTC GGI CCI TCA CTG GTC TT 5’ das AE7 Oligo-zondas AE10 Oligo-zondas AE11
AA# seka:
Suprojektuoto geno seka
Oligo-zondas
AE9
T GAT
3’ CTG GTC TTG GTG AA 5’
A A A
3’ CTG GTC TTG GTG AA 5’
A A A
Skaidymo tripsinu maksimumas Nr.86
2 3 4 5 6 7
Phe Vai Thr Gln Trp Gly Glu
5’ TTT GTG ACC CAG TGG GGA GAG 3’
C C T A TA
TA G
AG C
3’ AAA CAC TGC GTC ACC CCC CT 5’
G I I T I
Ši lentelė parodo visas galimas genų sekas, atitinkančias alfa-amidinančio fermento baltymo sritims. Po suprojektuotomis sekomis parodyti kai kurie komplementarūs genui zondai, kurie yra naudingi kDNR identifikacijai ir išskyrimui.
pavyzdys
A. Specifinių alfa-amidinančiam fermentui monokloninių antikūnų pelėse sudarymas
Vienuolika Balb/cJ pelių buvo imunizuota ir reimunizuota išvalytu amiclinančiu fermentu. Paimta šių pelių kraujo, serumas apdorotas, ir titruota išvalyto fermento atžvilgiu ELISA metodu. Analizė atlikta (ši metodika yra gerai žinoma), adsorbuojant išvalytą fermentą ant polistirolo plokštelės, kuri po to buvo perplauta ir blokuota jaučio serumo albuminu (BSA) pašalinių antikūnų prikibimui prie plokštelės išvengti. Po to ant padengtos amidinančiu fermentu plokštelės buvo inkubuotas praskiestas pelių serumas (kuriame, kaip manoma, yra antikūnų prieš amidinantį fermentą), ir perplauta. Po to, lizduose buvo inkubuoti antrieji antikūnai, pažymėti šarmine fosfataze, kas palengvina nustatyti, ar pirmasis antikūnas susirišo su plokštele. Perplovus ir pridėjus substrato tirpalo, išmatuotas kalorimetrinis signalas spektrofotometriniu įrenginiu. “Teigiami” serumai rodė signalo ir triukšmo santykį mažiausiai 2:1.
Pelė Nr.7, kuri parodė didelį titrą ELISA teste, buvo papjauta po 4 dienų, aseptiškai pašalinta blužnis, mechaniškai supjaustyta, norint gauti blužnies ląsteles (132,6xl06), kurios buvo sumaišytos su 122,8xl06 mielomos NS-1 ląstelių 1,28 ml PEG (polietilenglikolio) 4000. Ląstelės buvo išdalintos po lygiai į penkias 24 lizdų plokšteles, kurios prieš tai buvo padengtos Balb/cJ pelių timocitais ir splenocitais, kurie tarnavo kaip maitinančios ląstelės. Ląstelės buvo laikomos selektyvinėje HAT terpėje, kurioje galėjo išgyventi tik hibridinės ląstelės.
116 lizdų supernatantai, kurie parodė kloninį augimą, buvo atrinkti radioimuniniu ir ELISA metodais antikūnams gauti. Radioimuninės analizės metodikos buvo analogiškos ELISA analizei, aprašytai aukščiau, tik antrieji antikūnai buvo pažymėti 123I, ir radioaktyvumas matuojamas gama-skaičiuokliu.
iš 116 lizdų parodė teigiamą rezultatą antikūno gavimo atžvilgiu; buvo ištirtas jų reaktyvumas alfa-amidinančiam fermentui. Tokiu būdu atrinkti 25 klonai, parodę teigiamą reakciją j alfa-amidinančius fermentus, buvo išskirti laipsniško praskiedimo metodu. Pirminiai klonai buvo atrinkti pagal alfa-amidinančius fermentus ir BSA (kadangi polistirolo plokštelės buvo blokuotos BSA, antikūnai, kurie buvo prilipdyti prie plokštelės, tikriausiai prikibdavo, arba juos adsorbuodavo BSA nespecifiškai), norint nustatyti ar tikrai jie yra specifiški amidinančiam fermentui. Klonai, kurie parodė signalą alfaamidinančiam fermentui, kuris buvo mažiausiai dvigubai didesnis, negu BSA, buvo klonuoti pasiskirstymo santykiu 2 ląstelės/l akutė.
teigiama hibridoma (žr. III lentelę) buvo pernešta į tretinio klonavimo stadiją ir dvidešimt iš jų buvo charakterizuota pagal Ouchterlony ir ELISA metodikas. Septyniolika klonų turėjo sunkias grandines IgG2a, ir trys - sunkias grandines IgG|. Visi 20 klonų parodė sekreto antikūnus su kapa lengvomis grandinėmis.
III lentelė
Alfa-amidinantčio fermento monokloninių ląstelių linijos
Ląstelių linija Sunkioji grandinė Titras*
4-1-4 20-3 IgG2a - 1:5000
4-1-4-18-1 IgG2a
4-5-7-3 IgG2a - 1:5000
4-2-3-17-7 IgG2a
3-7-1-20-24 IgG2a - 1:10000
4-8-18-5-2-6 IgG2a
4-7-21-14-9 IgGla
4-10-45-1-16 IgG2a
54-2-1-39-2 IgG2a - 1:10000
4-6-12-1-3-17 IgG2a
52-1-31-24-2 IgG2a
4-3-11-46-1 IgG2a
3-7-9-9-3 IgG2a
86-1-38-15 IgG, - 1:1000
4-5-6-1 IgG, - 1:1000
4-4-24-3-5 IgG2a - 1:5000
4-11-3-1-8 IgG,
8-9-94-4-2 IgG2a
4-10-30-3-1 IgG2a
75-10-17-14-4 IgG2a
92-10-26-32-39 nesuklasifikuota
*Ascitiniai skysčiai buvo titruoti su 100 ng išvalyto fermento ELISA metodu.
Kiekviena linija buvo individualiai išauginta kultūroje, ir vienodi kiekiai ląstelių buvo užšaldyti skystame azote. Pristane-primed Balb/cJ pelėms į pilvą buvo suleista 5xl06 hibridomos ląstelių. Po savaitės, pelėms, kurioms nebuvo stebimas ascitinis auglys, injekcija pakartota. Po 1-2 savaičių paimtas ascitinis skystis ir kraujas. Po apdorojimo atrinkti ascitai ir kraujo serumas ir nustatomas alfa-amidinantis fermentas bei neigiami antigenai (pavyzdžiui, jaučio serumo albumino, kiaušinio albumino, anglies anhidrazės ir augimo hormono išlaisvinimo faktoriaus), norint užtikrinti antikūnų specifiškumą
B. Monokloninių antikūnų, Kautų pelėse, išvalymo metodika
Monokloniniai antikūnai, specifiniai alfa-amidinančiam fermentui, gauti pagal aukščiau aprašytas metodikas, buvo valomi taip. Ascitinis skystis, surinktas iš kelių pelių, kurioms įskiepytas tas pats klonas, buvo panaudotas kaip antikūnų šaltinis. Skystis praskiestas 5 kartus 10 mM MES, pH 5,6. Praskiestas skystis supiltas į 1,5x20 cm kolonėlę, užpildytą 40 gm sumaišytos ΑΒΧ režime silikagelio dervos (J.T. Baker), iš anksto subalansuotos 10 mM MES (pH 5,6) buferiu. Monokloniniai antikūnai eliuuojami iš kolonėlės, naudojant 0-500 mM natrio acetato gradientą (pH 7,0). Frakcijos su išvalytais antikūnais sumaišomos, tikrinamas jų santykinis aktyvumas ir laikomos 4 °C temperatūroje iki kito panaudojimo.
C. Specifiniu alfa-amidinančiam fermentui polikloninių antikūnų generavimas vištose
Dviems dėdeklėms į veną, į raumenis ir po oda suleista iš viso maždaug po 50 pg išvalyto alfa-amidinančio fermento Ribi adjuvante. Ribi adjuvantas yra pilnai metabolizuota riebalinė emulsinė sistema, kuri susideda iš viščiuko limfocitų mitogeno ir adjuvanto antikūno reakcijai į antigeną naminiuose paukščiuose sustiprinti (Ribi Imunochem Research, Montana). Po pradinės imunizacijos buvo padarytos dar dvi injekcijos, maždaug po 30 ^g/vištai, su dviejų savaičių pertrauka. Po 21 ir 35 dienų iš vištų buvo paimtas kraujas, gautas serumas buvo apdorotas ir atrinktas pagal specifiką antigenams pagal tokią metodiką: abiejų vištų serumai, gauti 0 dieną (prieš imunizaciją), 21 dieną ir 35 dieną buvo analizuoti ELISA metodu, naudojant 100 ng išvalyto alfaamidinančio fermento. Antikūnų specifinio sukibimo neigiamai kontrolei buvo panaudotas jaučio serumo albuminas. Fermentui specifinis antikūnas buvo detektuotas šarmine fosfataze žymėtu triušio prieš vištos IgG serumu.
Aukščiau aprašytų tyrimų rezultatai parodė, kad specifiniai antikūnai gali būti aptikti vištos 257 serume po 35 dienų. Praskiestas 1:10000 serumas davė signalo santykį su triukšmu apie 4:1. Višta 258 parodė specifinius fermentui antikūnus po 21 ir 35 dienų. Abiejų kraujo mėginių praskiestas 1:10000 serumas davė signalo santykį su triukšmu apie 4:1. Abiejų vištų kiaušiniai pradėti rinkti po 56 dienų. Išskirti, nusodinant polietilenglikoliu (PEG), preimunizuotų ir postimunizuotų vištų kiaušinių IgY buvo ištirti Ouchterlony metodu, ir fermentui specifiniai antikūnai buvo atrinkti ELISA metodu.
D, Vištą antikūnu IgY išvalymas
Polikloniniai paukščių antikūnai, specifiniai alfa-amidinančiam fermentui, buvo generuoti vištose taip, kaip aprašyta aukščiau. Imunizuotų vištų kiaušiniai surinkti ir panardinti j parafiną arba užšaldomi iki tol, kol bus naudojami IgY išskyrimui. Kiaušinių baltymai atskiriami nuo trynių, kuriuose yra alfa-amidinančiam fermentui specifiniai antikūnai. Tryniai praskiedžiami 3 kartus 10 mM natrio fosfatu (pH 7,5), kuriame yra 0,1 M NaCl ir 0,01 % natrio azido. Pradinis nusodinimas PEG’u atliktas, naudojant 3,5 % galutinę PEG 8000 koncentraciją. Nusodinimas vykdytas 30 min. kambario temperatūroje, po to centrifuguojama ir atskiriamas supernatantas (jame yra IgY). Į supernatantą vėl pridedama PEG, kad jo koncentracija būtų 12,5 %. IgY antikūnai, nusodinti polietilenglikoliu, atskirti centrifuguojant. IgY antikūnai toliau valomi tokiais dviem būdais:
1) Nusodinti IgY antikūnai vėl suspenduoti 10 mM MES (pH 5,6), po to dializuoti per naktį 4 °C temperatūroje tame pačiame buferyje. Po to mėginys supilamas į 1,5x20 cm kolonėlę, turinčią 40 μπι sumaišytos ΑΒΧ silkagelio dervos (J.T. Baker). Tolimesnės valymo procedūros buvo tokios pačios, kaip ir ascitinio skysčio valymo metodikoje.
2) Nuosėdos, turinčios IgY, vėl suspenduotos pradiniame buferyje ir vėl nusodintos, naudojant sotų amonio sulfato tirpalą (3:1, tūris/tūris). Nuosėdos su IgY vėl suspenduotos nedideliame distiliuoto vandens kiekyje ir laikomos 4 °C temperatūroje. Vištų IgY imobilizacijos metodika aprašyta 12 pavyzdyje.
pavyzdys
Alfa-amidinančio fermento aktyvumo kinetiniai tyrimai
Alfa-amidinantis fermentas, išvalytas iki homogeniškumo, tiek iš CA-77 kultūros, tiek ir iš žiurkės skydliaukės karcinomos audinio) paverčia neaktyvius glicin-peptidinius prohormonus į bioaktyvius C-terminalinius amidus. Tyrimais buvo nustatyta, kad prohormono C-galinė aminorugštis turi būti glicino liekana, kad fermentas galėtų ją atpažinti ir amidinti taip:
amidinantis fermentas
R-X-Gly-COOH + O2-> R-X-CONH2 + HCO-COOH + H2O
Šio aktyvumo realizavimas in vitro reikalauja be substrato dar ir deguonies bei redukuojančio agento (L-askorbino rūgšties). Mes nustatėme, kad fermentinis aktyvumas gali būti padidintas, pridedant Cu2+ jonų (vario sulfato) ir katalazės. Šis cgzogeninį varį suriša fermentas; jo reikia surišti molekuliniam deguoniui ir aktyvacijai. Iš antros pusės, katalazė yra reikalinga vandenilio peroksidui suardyti, kuris priešingu atveju susikauptų ir vyktų šalutinės reakcijos, dalyvaujant deguoniui, askorbatui, variui, ir ardytų alfaamidinantį fermentą.
Alfa-amidinančio fermento aktyvumui nustatyti mes radome jautrius neradiometrinius metodus. Šiuose metoduose, kaip substratai, naudojami sintetiniai tripeptidai. Šių peptidų amidinimą patogu kontroliuoti, atskiriant ir nustatant produkto kiekį (amidintą dipeptidą nuo substrato-tripeptido) HPLC metodu. Jautriausiame iš sukurtų metodų substratu naudojamas monodansil-L-Tyr-Val-Gly. Galima nustatyti labai mažus šio junginio kiekius, kadangi dansilo grupė fluorescuoja. Šio metodo jautrumas prilygsta panašaus radiometrinio metodo, sukurto kitose laboratorijose, jautrumui.
Mes naudojome šį metodą alfa-amidinančio fermento kinetinių savybių tyrimui. Kinetiniai parametrai Km ir Vmax buvo nustatyti, matuojant fermento aktyvumo priklausomybę nuo substrato koncentracijos. K™ yra giminingumo tarp fermento ir substrato matas. Kuo mažesnis Km, tuo didesnis giminingumas. Vmax yra maksimalus greitis, kuriuo fermentas paverčia substratą produktu, ir stebimas, esant substrato prisotinimo koncentracijoms (t.y. fermento atžvilgiu yra didelis substrato perteklius).
Tipiškas amidinančio fermento mėginio reakcijos mišinys (50 μΐ) susidės iš fermento (apie 7 μg), dansil-L-Tyr-Val-Gly (iki 40 μΜ), askorbino rūgšties (3 mM), katalazės (nuo 0 iki 100 μg/ml) ir vario sulfato (nuo 0 iki 2 μΜ), ištirpintų 60 mM TĘS buferyje (pH 7,0). Reakcija inicijuojama 37 °C temperatūroje, pridedant fermentą, ir nutraukiama po tam tikro laiko tarpo, pridedant 0,1 M EDTA, kuri suriša varį, padarydama jį neprieinamą fermentui.
Alfa-amidinantis fermentas turi didelį giminingumą fermentiniam dansil-L-TyrVal-Gly amidinimui, kurio Km yra 1-2 μΜ ribose. Atrodo, kad šis dydis yra pastovus, nepriklausomai nuo fermento išvalymo laipsnio. Pavyzdžiui, fermento mėginys, gautas chromatografuojant per Sephacryl S-300, turi tą patį Km kaip ir elektroforetiškai švarūs fermento preparatai, gauti iš MonoQ pH 8,0 arba mažesnės molekulinės masės formos iš MonoQ pH 6,0 chromatografijos. Iš antros pusės, kaip ir galima laukti, Vmax reikšmės (išreikštos mg baltymo) labai priklauso nuo išvalymo laipsnio. Pavyzdžiui, Vmax. gauto po
Sephacryl S-300 fermento, yra nuo 50 iki 100 nmol produkto/min/mg baltymo, tuo tarpu kai švaraus fermento yra apie 5000 nmol/min/mg baltymo.
Mes nustatėme, kad askorbatas ir substratas gali konkuruoti tarpusavyje dėl sąveikos su fermentu tam tikromis sąlygomis. Pavyzdžiui, jeigu substrato koncentracija labai daug viršija įsisotinimo lygį, fermento aktyvumas mažėja dėl jo sąveikos su askorbino rūgštimi. Taigi, kiekvienam konkrečiam substratui, matyt, egzistuoja tam tikras balansas tarp optimalių substrato/askorbato kiekių priklausomai nuo fermento giminingumo šiam substratui.
Amidinančio fermento giminingumas glicinu pailgintiems peptidams
Reakcijai tarp amidinančio peptido ir keleto glicin-prohormoninių peptidų identifikuoti buvo naudotas monodansil-L-Tyr-Val-Gly amidinimas. Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti fermento santykinį giminingumą įvairių tipų peptidiniams substratams. Nors anksčiau parodėme, kad fermentas sėkmingai amidina žmogaus kalcitonino ir žmogaus augimo hormono išlaisvinimo faktoriaus glicinu pailgintus substratus, tai dar nieko nepasako, kuris iš šių peptidiniu substratų turi didesnį giminingumą fermentui.
Mes nustatėms, kad glicinu pailgintas alfa-melanocito stimuliuojantis hormonas, substancija P, vazopresino analogai ir augimo hormono išlaisvinimo faktorius pasižymi dideliu giminingumu amidinančiam fermentui, ir fermentas nemetabolizuoja dansil-L-TyrVal-Gly. Be to, žmogaus kalcitoninas, neuropeptidas Y, cholecitokinas, kortikotropiną išskiriantis faktorius ir kalcitonininis peptidas, kurių C-gale yra papildoma glicino liekana, rodo konkurenciją šiame bandyme. Kitaip sakant, fermentas gali surišti ir tikriausiai amidinti visus šiuos glicinu pailgintus peptidinius substratus.
Atvirkščiai, amidinti šių substratų produktai daug blogiau sąveikavo su fermentu. Šio fermento katalitinio centro savybė atpažinti daugelį glicinu pailgintų peptidiniu substratų daro jį labai naudingą peptido prohormono, gauto rekombinantinės DNR technologijos būdu, amidinimui.
pavyzdys
DNR SEKOS, KODUOJANČIOS III PIKO α-AMIDINANTJ FERMENTĄ,
IŠSKYRIMAS
RNR gavimas
RNR buvo gauta iš žiurkės skydliaukės karcinomos, naudojant guanidino tiocianatą. Poli-A-RNR buvo išskirta, panaudojant oligo dT celiuliozę.
kDNR sintezė
Dvigrandė kDNR buvo gauta žinomais metodais. Naudojant žiurkės skydliaukės karcinomos A RNR kaip matricą ir oligo dT^-is kaip pradmenį, pirmos grandinės sintezė buvo atlikta, panaudojant atvirkštinės transkriptazės fermentinę reakciją. kDNR ir RNR atskirtos, ir RNR suskaldoma šarmais. Antros kDNR grandinės sintezė buvo vykdoma, naudojant E.coli DNR polimerazę I. Norint pašalinti kDNR kilpas ir viengrandes kDNR sritis, panaudotas skaldymas nukleaze SI. Po raekcijos su DNR polimeraze I dvigrandė kDNR apdorota EcoRI metilaze ir S-adenozilmetioninu EcoRI saitų metilinimui, apsaugant juos nuo fermentinio skaldymo. EcoRI linkeriai liguoti į kDNR. Po skaldymo EcoRI papildomi linkeriai atskirti nuo kDNR, ir kDNR buvo frakcionuota pagal dydį Sepharose 4B kolonėlėje. Vienos tokios molekulės sintezėje panaudota daugiau nei 500 bazių porų, kitoje - buvo įjungta daugiau nei 1000 bazių porų.
kDNR Zgt 11 kolekcijos konstravimas
Susintetinta dvigrandė kDNR buvo panaudota vektoriuje Xgt II kDNR kolekcijos konstravimui. Tai realizuojama, prijungiant kDNR prie λgt II DNR, kuri buvo suskaldyta EcoRI pagalba ir paveikta fosfatu, siekiant sutrukdyti DNR vektoriaus savaiminiam susirišimui. Po to, iš rekombinantiniu DNR in vitro buvo gaminamos infekuotos bakteriofago dalelės (ekstraktus dalelių sudarymui galima gauti iš Promega Biotech arba Clontech laboratorijų arba pasigaminti standartiniais metodais).
Buvo patikrintos gautos DNR alikvotos, norint nustatyti rekombinantų skaičių kolekcijose. Rasta, kad vienoje iš kolekcijų buvo apie 2,57xlOfi infekcinių dalelių, iš kurių maždaug 78 % buvo rekombinantai (duoda aiškias dėmes ant X-Gal plokštelių, auginant su IPTG). Kitoje kolekcijoje buvo apie 2,75xl06 dalelių, ir maždaug 81 % iš jų yra rekombinantai.
Kolekcijos atrinkimas
Norint identifikuoti rekombinantinį bakteriofagą, kuris turi alfa-amidinančio fermento kDNR, fagas buvo atrinktas panaudojant radiožymėtus oligonukleotidus, sukonstruotus pagal alfa-amidinančio fermento aminorūgščių seką (7 pavyzdys, II lentelė). Atranka buvo vykdoma, užsėjant bakteriofagą ir pernešant jį ant nitroceliuliozės filtrų diskų. Fago imobilizacijos metodikos ant nitroceliuliozės diskų yra gerai žinomos. Dvigubi filtrai buvo hibridizuoti žymėtu 32P oligonukleotidu AE 9. Hibridizacija buvo vykdoma 37 °C temperatūrojr 20-24 vai. 6xNET, 0,5 % NP40, 5x Denhardt tirpale, 100 Mg/ml lašišos spermos DNR, esant oligotidinio zondo koncentracijai 0,3-0,4 pmol/ml. Po hibridizacijos filtrai buvo plauti 6x SCC 44-45 °C temperatūroje kelias valandas ir eksponuoti į rentgeno plėvelę. Teigiamai hibridizuotas fagas buvo identifikuojamas pagal sutampančias dėmes dvigubuose filtruose. Tokie fagai buvo išvalyti per kelis užsėjimo ir hibridizacijos etapus. Iš maždaug 4-5xl04 atrenkamų fagų 18 buvo identifikuota AE 9 pagalba.
Selekcijos specifiškumo nustatymui buvo hibridizuojama su antru alfa-amidinančio fermento oligonukleotidu AE 8. Šis bandymas parodė, kad mažiausiai 4 iš 18 fagų turėjo alfa-amidinančio fermento kDNR. Šis faktas buvo patvirtintas papildoma specifine oligonukleotido hibridizacija (AE 4 ir AE 5 pagalba), o taip pat DNR sekos analize. Alfa-amidinančio fermento ekspresija
Alfa-amidinančio fermento aktyvumo pikas III atitinka junginį, kurio molekulinis svoris yra 75000 daltonų. Laikant, kad aminorūgšties vidutinis molekulinis svoris yra 120 daltonų, gaunama, kad amidinantis fermentas turi daugiausiai 625 aminorūgštis. Genas, atitinkantis tokią aminorūgščių seką, turi turėti mažiausiai 1875 bazių poras. Visos keturios kDNR, kurios buvo išskirtos kaip specifinės alfa-amidinančiam fermentui, yra pakankamai ilgos, kad galėtų koduoti alfa-amidinantį fermentą. Vieno iš kDNR klonų, λΑΕΙ, ilgis yra 2200 nukleotidų. Pirmų 50 nukleotidų ribose prasideda N-galo aminorūgščių sekos, atitinkančios III piko fermento seką, kodavimas. Todėl galima teigti, kad ši kDNR turi visą koduojančią III piko fermento seką; tai žinant, galima naudoti kDNR atitinkamuose prokariotiniuose organizmuose, tokiuose kaip E.coli.
Viena iš potencialių metodikų, kuri gali būti pritaikyta kDNR λΑΕΙ, duota Fig.22. Pavyzdžiui, 2200 bp kDNR λΑΕΙ išskiriama po rekombinantinio bakteriofago DNR skaldymo EcoRI ir elektroforezės agarozės gelyje. Ji klonuojama į EcoRI saitą pBR 322 susidarant plazmidei pAE8-l, kuri turi unikalų KpnI skilimo saitą kDNR sekose ir unikalų saitą Hind III sekose pBR 322. Apdorojus pAE8-l su KpnI ir Hind III, gaunamas apie 2,14 Kb fragmentas, praradęs 62 kDNR bazių poras (N-gale). Pilnam sekos atstatymui fragmentas, besibaigiantis Kpn I-Hind III, liguojamas su oligotidinių linkerių adapteriais.
Duotame pavyzdyje naudota E.coli ekspresijos plazmidė pKK233-2, gauta iš Pharmacia. kDNR 2,15 Kb fragmentas liguojamas su dvigrandžiu linkeriu-adapteriu, susidedančio iš
AE 17( + )305 C ATGTCATTTTCC AATG AATGCCTTGCTAC3 ir
AE18(-)225 CAAGGCATTCATTGGAAAATGA3'.
Adaptuotas fragmentas liguojamas su plazmidės pKK233-2 DNR, kuri buvo suskaidyta su Ncol ir Hind III, ir gaunamas 4,6 Kb linijinis vektorius. Liguotas produktas, pAE12, turi alfa-amidinančio fermento kDNR, prasidedančią ATG startiniu kodonų ir ribosomą jungiančiu saitu, bei turi hibrido kontroliuojamą IPTG iniciatorių trc. Po šio geno eina RNR 5S genas ir transkripcijos pabaigos saitas. IPTG indukuojama pAE12 ekspresija gaunama po plazmidės DNR transformacijos j laciq genotipo E. coli grandinę.
2,2 kb λΑΕΙ kDNR intarpo sekos fragmentas
2,2 Kb ilgio intarpas buvo iškirptas, apdorojant λΑΕΙ su EcoRI, ir intarpas buvo pažymėtas 32P. Po antrinio apdorojimo Hind II, gauti 1,6 Kb ir 0,6 Kb ilgio fragmentai buvo sekvenuoti cheminio skaldymo būdu pagal Maxam ir Gilbert metodą.
Šiuo metodu gauta DNR seka sekvenuojant 600 bp λΑΕΙ fragmentą nuo Eco Rl galo yra:
v v v v 50v
AATTCCGGTCTTTAAGAGGTTTAAAGAAACTACCAGATCATTTTCCAATG v v v v lOOv
AATGCCTTGGTAC CATTGGACCAGTCACCCCTCTTGATGCATCAGATTTT v v v v 150v
GCGCTGGATATTCGCATGCCTGGGGTTACACCTAAGGAGTCTGACACATA v v
CTTTCTGCACCGTCCATGCGTCTACCT
DNR seka, gauta sekvenuojant 1600 bp fragmentą λΑΕΙ nuo Eco Rl galo yra:
v v v v 50v
AATTCCGTCTCAGTTTCTGTTTCTCTTGCATCTTCTGCAATTCTGAGGAG v v v v lOOv
GTGGGTTTGTTCTCCACTTTGGGTTCGACAACTGCCTCGGCTTCTTTGAT v v v v 150v
TTCGTGGACTTCGATGCCAGCCTTTTTAACTGACGCATGCTCCATTTTTT v v v v 200v
CGGTCAGGGTGAACTTCCACACGGTGTTGTGTGTGCGCTCGAAGACCG Oligonukleotidinio zondo AE8(-)33 sekos homologijos paieškos
Buvo atliktas kompiuteriniai tyrimai homologijai tarp aminorūgščių, panaudotų sudarant AE8 zondą (Leu-Gly-Thr-Gly-Pro-Val-Thr) ir λΑΕΙ DNR fragmento 600 bp nustatyti.
Buvo gauta homologinę sritis, kuri išskirta Aminorūgštys, identifikuojančios NH2 galą, duotos skliausteliuose. Aminorūgštys, kurios skiriasi nuo DNR seka koduojamų aminorūgščių, pažymėtos
AATTCCGGTCTTTAAGAGGTTTAAAGAAACTACCAGATCATTTTCCAATG ---------+---------+---------+---------+---------+ 50 ipv fkr f ket tr (sfsne * * * * ** * ** * * ** ** ** * * * **
AATGCCTTGGTACCATTGGACCAGTCACCCCTCTTGATGCATCAGATTTT ---------+.........+ - -.......+---------+.........+ 100
CLGTIGPVTpldas df
GCGCTGGATATTCGCATGCCTGGGGTTACACCTAAAGAGTCTGACACATA
.........+---------+---------+---------+---------+150 aldlrmp)gvt pkesdty
CTTTCTGCACGTCCATGCGTCTACCT
.........+......- - - +------176 f 1 h v h a s t .
pavyzdys Fermento imobilizacija
Alfa-amidinančio fermento išvalymas.
Prieš imobilizaciją alfa-amidinantis fermentas buvo išvalytas silpnos anijonų mainų ir gelio filtracijos chromatografijos metodais (4 pavyzdys). Tam tikrais atvejais į fermento valymo procedūrą gali įeiti ir papildomas valymas, naudojant arba imuninę chromatografiją, arba fenilsefarozės chromatografiją. Imobilizacijos metodika nepriklauso nuo valymo metodikos, tačiau specifinis fermento aktyvumas turi būti ne mažesnis negu 25 mE, o geriau 50 mE arba daugiau.
Alfa-amidinančio fermento imobilizacija.
Alfa-amidinančio fermento imobilizacija gali būti paremta vienalaike reakcija tarp trijų komponentų: fermento, vandenyje tirpaus akrilamido kopolimero (PAN) ir nedidelio molekulinio svorio skersines jungtis sudarančio reagento (TET). Iš anksto paruoštas polimeras (PAN) susideda iš akrilamido ir N-akriloksisukcinimido, kuris polimerizuotas
THF tirpale, naudojant terminę inicijaciją su azobis (izobutironitrilu). Skersines jungtis sudarantis reagentas gali būti α,ω-diaminas, trietilentetraminas (TET), cistaminas. Diamino reakcija su aktyviomis esterinėmis PAN grupėmis sukuria skersinį polimero grandinių susijungimą per amidinės jungtis ir suformuoja netirpstantį gelį. Fermento aminogrupės (geriausia lizino ε-aminogrupė) tuo pačiu metu reaguoja su likusiomis gelio esterinėmis grupėmis ir sudaro stabilias kovalentines amidinės jungtis. Imobilizacija vykdoma, esant substratui ir kofaktoriams. Didelio giminingumo laipsnio substratas ir kofaktoriai, kurių koncentracijos didesnės už Km, neleidžia reaguoti PAN ir nukleofilinėms grupėms arti katalitinio fermento centro, ir taip fermentas apsaugomas nuo cheminės in aktyvacijos.
Imobilizacijos sąlygos.
Dalinai išvalytas alfa-amidinantis fermentas ištirpinamas 30 mM HEPES buferyje (pH 7,0). PAN ir TET santykis yra toks, kad 15 % aktyvių esterinių grupių lieka nesureagavusios, kurios lieka ryšiams su alfa-amidinančiu fermentu sudaryti. Standartinis PAN tirpalas yra 20 % (pagal svorį). Alfa-amidinančio fermento reakcijos mišinys susideda iš 0,2 μΜ CuSC>4, 40 μΜ dansil-His-Phe-Gly, 10 mM askorbato ir 0,5-2,0 mg aAE gramui PAN. TET koncentracija lygi 0,85 pirminio amino ekvivalento/aktyvaus esterio ekvivalentui. Paprastai parenkant optimalias reakcijos sąlygas, reakcija vykdoma be fermento, norint nustatyti gelio susidarymo laiką, tai yra laiką praėjusį nuo TET pridėjimo iki gelio susidarymo. Optimalios alfa-amidinančio fermento imobilizavimo išeigos gaunamos tada, kai fermentas pridedamas netoli gelio susidarymo taško. Bendra taisyklė yra tokia, kad kuo mažiau fermentas būna sąveikoje su PAN, tuo didesnis jo aktyvumas. Daugelyje reakcijų alfa-amidinantis fermentas (apie 2,0 mg/PAN gramui) pridedamas, praėjus 45-60 sek. po TET pridėjimo. Kad pilnai įvyktų reakcija, fermentą prisijungęs gelis laikomas kambario temperatūroje 1 valandą. Po to gelis susmulkinamas, padarant 100 μ dydžio fragmentus. Šios dalelės plaunamos amonio sulfatu, norint pašalinti nesureagavusias medžiagas ir pakeisti aktyvias esterines grupes amidinėmis. Laukiama, kad aktyvaus fermento išeiga po imobilizacijos bus mažesnė nei 60 %. Nuoplovose gali likti nuo 30 iki 40 % pradinio aktyvumo. Iš nuoplovų galima regeneruoti alfa-amidinantį fermentą, didinant amonio sulfato koncentraciją iki 45 %, kuris skatina alfa-amidinančio fermento nusėdimą.
Gelio su imobilizuotu fermentu dalelės yra tinkamos porcijiniam alfa-amidinimui, kur dalelės yra suspenduotos, maišant mechanine maišykle. Pasibaigus fermentinei reakcijai, dalelės nusėda, o supernatantas, kuriame yra produktas -amidintas peptidas nupilamas. Gelio dalelės nėra pakankamai tvirtos, todėl jomis negalima užpildyti kolonėlės, per kurią būtų galima leisti substratą tinkamais greičiais. Šios problemos sprendimui galimi du alternatyvūs keliai:
1. Gelis polimerizuojamas, esant terpėje stiklo granulėms (pridedama likus minutei iki galutinio gelio susiformavimo ir maišoma mechanine maišykle, kol granulės pasidengia PAN tirpalo sluoksniu). Gautos kompozicinės medžiagos savybės pratekėjimo atžvilgiu yra daug geresnės, negu gelio dalelių.
2. PAN dalelės sumaišomos su Celitu 545, skirtu filtracijai. PAN ir Celito mišinyje PAN yra mažiau nei 8 % nuo bendro mišinio svorio. Tokiai kolonėlei pagamnti gelio dalelės suspenduojamos 50 mM Tris-HCl, pH 7,0, maišant pridedama Celite 545 ir maišoma dvi valandas. Kolonėlė užpildoma gautu mišiniu (3x40 cm), ir temperatūra joje palaikoma apie 37 °C, siekiant sudaryti optimalias amidinimo sąlygas. Tokioje kolonėlėje galima pasiekti 8-10 litrų per dieną srauto greitį.
Patrauklia alternatyva kolonėlių chromatografijai gali būti tangentinio srauto sistemos panaudojimas. PAN polimeras prieš gelio susidarymo tašką užpilamas ant porėto (0,45 μιη poringumo) polisulfono lapo. Susidarius geliui, lapai gali būti supjaustomi ir naudojami ultrafiltracijos su tangentiniu srautu Millipore arba New Brunswick sistemos įrenginiuse. Šioje sistemoje kompleksiniai polisulfono-PAN lapai su imobilizuotu fermentu dedami sluoksniais, ir taip labai padidėja paviršiaus plotas. Toks variantas leidžia pasiekti apytikriai iki litrų per minutę srauto greitį. Šio tipo sistemos leidžia patogiai reciklinti reakcijos mišinį ir pasiekti maksimalų amidinimą.
Alfa-amidinto fermento imobilizacija leidžia regeneruoti ir vėl panaudoti fermentą. Be to, imobilizuotas ant matricos fermentas yra stabilesnis; tokia fermento forma tinka stambaus masto (nuo gramo iki kilogramų) amidinimui ir gali būti naudojama ilgą laiką.
pavyzdys
Imuninės kolonėlės gaminimas užterštoms alfa-amidinančio fermento kompozicijoms valyti
A. Imobilizacijos metodika
Imobilizacijos matrica buvo bromcianu aktyvuota Sepharose 4B (Pharmacia). Iš pradžių sausas gelis perplaunamas 1 mM HCI (200 ml/g dervos), išbrinkinant ir išplaunant kietą nešiklį. Apie 10 mg išvalytų polikloninių antikūnų, išskirtų iš vištos kiaušinių trynių, dializuojama, naudojant 100 mM NaHCCh, pH 8,3, pridėjus 0,5 M NaCl. Surišama, naudojant 8 ml kieto išbrinkinto ir išplauto nešiklio. Reakcija buvo vykdoma tris valandas kambario temperatūroje natrio bikarbonato buferyje (lOOmM, pH 8,3) su 500 mM NaCl, kuris buvo pridėtas, norint sutrukdyti nespecifinio ryšio su nešikliu susiformavimą. Likusios aktyvios gelio grupės buvo blokuotos 0,2 M glicinu. Po to gelis buvo plaunamas 45 kartus, naudojant didelio ir mažo pH buferius (100 mM NaHCCb pH 8,3 + 500 mM NaCl buferį, 100 mM acetato, pH 4,0, + 500 mM NaCl buferį). Taip plaunant pašalinami nesurišti baltymai ir blokuojantis reagentas (glicinas). Gauta derva pamerkiama j bazinio pH buferį, turintį mertiolato, kaip bakteriostatinio agento, ir laikoma 4 °C temperatūroje. Analogišku būdu galima imobilizuoti ir išvalytus monokloninius antikūnus.
B, Imunogeninė chromatografija
Kaip alternatyva geram alfa-amidinančio fermento išvalymo laipsniui pasiekti naudojama imuninė kolonėlė. CA-77 (4 pavyzdys) ląstelės praskiedžiamos distiliuotu vandeniu ir perleidžiamos per DEAE anijonų mainų įrenginį, subalansuotą 20 mM bisTris-HCl, pH 6,0. Alfa-amidinantis fermentas eliuuojamas iš įrenginio 50 mM Tris-HCl (pH 7,0) su 500 mM NaCl. Frakcijos, kuriose yra amidinančio fermento, prieš imunogeninę chromatografiją arba dializuojamos Tris-HCl (pH 7,0) buferyje arba valomos, panaudojant gel-filtracijos chromatografiją (4 pavyzdys). Mėginiai, kuriuose yra amidinančio fermento, perleidžiami per imunoadsorbcinę kolonėlę su neutraliu pH. Antikūnai specifiškai suriša fermentą, o pašaliniai baltymai nesurišami ir patenka į ištekantį tirpalą. Alfa-amidinantis fermentas gali būti eliuuotas iš kolonėlės 100 mM glicino-HCl buferiu, kurio pH 3,0 (gali būti panaudoti ir kiti desorbcijos agentai, įskaitant karbamidą, dioksaną, etilenglikolį ir NaI). Frakcijos renkamos į 1,0 M Tris-HCl (pH 7,0) buferį, kad būtų neutralizuojama buferinė sistema ir išlaikomas alfa-amidinančio fermento aktyvumas.

Claims (4)

  1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS
    1. Izoliuota DNR seka, besiskirianti tuo, kad ji turi šias charakteristikas:
    A. Ši DNR seka koduoja peptidilglicino alfa-amidinančią monooksigenazę;
    B. Šios DNR sekos molekulės sudėtyje yra bent viena sudedamoji dalis, pasirinkta iš grupės, kurią sudaro:
    a) v v v v 50v
    AATTCCGGTCTTTAAGAGGTTTAAAGAAACTACCAGATCATTTTCCAATG v v v v lOOv
    AATGCCTTGGTACCATTGGACCAGTCACCCCTCTTGATGCATCAGATTTT v v v v 150v
    GCGCTGGATATTCGCATGCCTGGGGTTACACCTAAGGAGTCTG ACACATA v v v v 200v
    CTTTCTGCACGTCCATGCGTCTACCT, ir
    b) v v v v 50v
    AATTCCGTCTCAGTTTCTGTTTCTCTTGCATCTTCTGCAATTCTGAGGAG v v v v lOOv
    GTGGGTTTGTTCTCCACTTTGGGTTCGACAACTGCCTCGGCTTCTTTGAT v v v v 150v
    TTCGTGGACTTCGATGCCAGCCTTTTTAACTGACGCATGCTCCATTTTTT v v v v 200v
    CGGTCAGGGTGAACTTCCACACGGTGTTGTGTGTGCGCTCGAAGACCG, ir
    C. Ši DNR seka hibridizuojasi su bent dviem oligonukleotidiniais zondais, pasirinktais iš grupės, kurią sudaro:
    oligonukleotidinis zondas AE1 oligonukleotidinis zondas AE4 oligonukleotidinis zondas AE5 oligonukleotidinis
    3’ TTA CTC ACG GAC CCG TGG TAA CCG GGA CAC T G
    TGG GGG GAC CTA CG 5’;
    3’ TTA CCG GTC ACC TG 5’ ;
    G T T
    3’ TTA CCG GTC ACC TG 5’ ;
    GAT
    3’ TAC GTC GGI CCI AGI CTG GTC TT 5’ ;
    zondas AE6 oligonukleotidinis zondas AE7 oligonukleotidinis zondas AE8 oligonukleotidinis zondas AE9 oligonukleotidinis zondas AE10 oligonukleotidinis zondas AE11
    3’ TAC GTC GGI CCI TCA CTG GTC TT 5’ ;
    T GAT
    3’ AC CCG TGG TAA CCG GGA CAC TG 5’ ; III I I I I
    3’ AAA CAC TGC GTC ACC CCC CT 5’ ; Gili I
    3’ CTG GTC TTC GTG AA 5’ ;
    A A A
    3’ CTG GTT TTG GTG AA 5’
    A A A.
  2. 2. Šeimininko ląstelė, besiskirianti tuo, kad ji yra transformuota arba transfekuotą ekspresijos vektoriumi, turinčiu DNR seką pagal 1 punktą.
  3. 3. Peptidilglicino alfa-amidinančios monooksigenazės (PAM) rekombinantinės ekspresijos būdas, besiskiriantis tuo, kad jis apima šeimininko ląstelių pagal 2 punktą kultivavimą tokį laiką, kurio pakanka minėtos PAM ekspresijai, ir minėtos PAM išskyrimą.
  4. 4. Amidinto peptido gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad į jį įeina pradinio peptido, turinčio C-gale gliciną, veikimas peptidilglicino alfa-amidinančia monooksigenaze, pagaminta pagal 3 punktą.
LTIP1656A 1987-08-14 1993-12-21 Alpha-amidating enzyme compositions and process for their production LT4029B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/086,161 US6319685B1 (en) 1984-09-27 1987-08-14 Alpha-amidating enzyme compositions and processes for their production and use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LTIP1656A LTIP1656A (en) 1995-07-25
LT4029B true LT4029B (en) 1996-08-26

Family

ID=22196693

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LTIP1656A LT4029B (en) 1987-08-14 1993-12-21 Alpha-amidating enzyme compositions and process for their production

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6319685B1 (lt)
EP (2) EP0308067A3 (lt)
JP (1) JP2979172B2 (lt)
KR (1) KR0136611B1 (lt)
AT (1) ATE198355T1 (lt)
CA (1) CA1341454C (lt)
DE (1) DE3856446T2 (lt)
DK (1) DK175538B1 (lt)
FI (1) FI883722A (lt)
HU (3) HU213227B (lt)
LT (1) LT4029B (lt)
NO (1) NO883592L (lt)
RU (2) RU2080385C1 (lt)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6319685B1 (en) 1984-09-27 2001-11-20 Unigene Laboratories, Inc. Alpha-amidating enzyme compositions and processes for their production and use
US4708934A (en) * 1984-09-27 1987-11-24 Unigene Laboratories, Inc. α-amidation enzyme
US5789234A (en) * 1987-08-14 1998-08-04 Unigene Laboratories, Inc. Expression systems for amidating enzyme
US5871995A (en) * 1989-08-15 1999-02-16 Shiseido Company, Ltd. Purified enzymes participating in C-terminal amidation
EP0465404B1 (en) * 1990-06-01 1995-11-15 Ciba-Geigy Ag Peptdidylhydroxylglycine N-C lyase and DNA coding therefor
US5580751A (en) * 1990-09-14 1996-12-03 Carlsberg A/S Process for the preparation of C-terminally amidated peptides
DK67691D0 (da) * 1991-03-01 1991-04-15 Carlbiotech Ltd As Enzymatisk fremgangsmaade til c-terminal modificering af peptider og mellemprodukter til brug ved fremgangsmaaden
AU4415796A (en) * 1994-12-07 1996-06-26 Bionebraska, Inc. Production of c-terminal amidated peptides from recombinant protein constructs
US5912014A (en) * 1996-03-15 1999-06-15 Unigene Laboratories, Inc. Oral salmon calcitonin pharmaceutical products
AU742270B2 (en) 1997-04-16 2001-12-20 Enteris Biopharma, Inc. Direct expression of peptides into culture media
JP4483579B2 (ja) 2002-07-26 2010-06-16 味の素株式会社 トリペプチド以上のペプチドの製造方法
US8088734B2 (en) 2003-01-21 2012-01-03 Unigene Laboratories Inc. Oral delivery of peptides
US7531518B2 (en) 2004-05-14 2009-05-12 Unigene Laboratories Inc. Method for fostering bone formation and preservation
US7648965B2 (en) * 2004-05-14 2010-01-19 Unigene Laboratories Inc. Method for fostering bone formation and preservation
US20060089723A1 (en) * 2004-10-25 2006-04-27 Murphy Kieran P Method for bone augmentation
US7445911B2 (en) 2004-11-24 2008-11-04 Unigene Laboratories Inc. Enzymatic reactions in the presence of keto acids
PA8660701A1 (es) 2005-02-04 2006-09-22 Pfizer Prod Inc Agonistas de pyy y sus usos
US20060293667A1 (en) * 2005-05-19 2006-12-28 Agnes Vignery Bone implant device and methods of using same
US8377863B2 (en) 2007-05-29 2013-02-19 Unigene Laboratories Inc. Peptide pharmaceutical for oral delivery
AU2010206614B2 (en) 2009-01-22 2015-03-26 Keybioscience Ag Treatment for obesity
MX2012005912A (es) 2009-11-23 2012-10-05 Amylin Pharmaceuticals Inc Conjugado de polipeptido.
TW201138808A (en) 2010-05-03 2011-11-16 Bristol Myers Squibb Co Serum albumin binding molecules
MX345245B (es) 2010-09-28 2017-01-23 Amylin Pharmaceuticals Llc Polipeptidos manipulados que tienen duracion de accion incrementada.
DK3241558T3 (da) 2010-09-28 2021-04-26 Aegerion Pharmaceuticals Inc Højopløselige leptiner
ES2712805T3 (es) 2011-06-15 2019-05-14 Resother Pharma Aps Næsseslottet Productos farmacéuticos antiinflamatorios
JP6040464B2 (ja) 2011-07-08 2016-12-07 アエゲリオン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドAegerion Pharmaceuticals, Inc. 作用持続期間が増大し、免疫原性が減少した操作されたポリペプチド
WO2013009545A1 (en) 2011-07-08 2013-01-17 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Engineered polypeptides having enhanced duration of action with reduced immunogenicity
EP3357540A1 (en) 2011-11-02 2018-08-08 KeyBioscience AG Combination of calcitonin mimetic and insulin sensitizer
US9533022B2 (en) 2011-11-02 2017-01-03 KeyBioscience A/S Peptide analogs for treating diseases and disorders
AU2012332265B2 (en) 2011-11-02 2016-11-10 Keybioscience Ag Peptide analogs for treating diseases and disorders
PL3068796T3 (pl) 2013-11-14 2018-07-31 Keybioscience Ag Mimetyki kalcytoniny do leczenia chorób i zaburzeń
CN105939759B (zh) 2013-12-02 2020-01-17 康德生物医疗技术公司 用于治疗白癜风的组合物和方法
EP3148565A4 (en) 2014-05-28 2018-06-06 Stealth Biotherapeutics Corp Therapeutic compositions including frataxin, lactoferrin, and mitochondrial energy generating enzymes, and uses thereof
WO2015183988A1 (en) 2014-05-28 2015-12-03 Stealth Peptides International, Inc. Therapeutic compositions including therapeutic small molecules and uses thereof
WO2015195737A1 (en) 2014-06-17 2015-12-23 Stealth Peptides International, Inc. Methods of identifying and monitoring mitochondrial dysfunction using monocyte screening
GB201500263D0 (en) 2015-01-08 2015-02-25 Keybioscience Ag Calcitonin analogues for treating diseases and disorders
AU2016206950B2 (en) 2015-01-12 2021-05-06 Enteris Biopharma, Inc. Solid oral dosage forms
GB201704429D0 (en) 2017-03-21 2017-05-03 Keybioscience Ag Calcitonin mimetics for treating diseases and disorders
GB201707955D0 (en) 2017-05-18 2017-07-05 Keybioscience Ag Dual amylin and calcitonin receptor agonists for treating diseases and disorders
GB201813677D0 (en) 2018-08-22 2018-10-03 Keybioscience Ag Calcitonin mimetics for treating diseases and disorders
GB201813678D0 (en) 2018-08-22 2018-10-03 Keybioscience Ag Acylated calcitonin mimetics
GB202001024D0 (en) 2020-01-24 2020-03-11 Key Bioscience Ag Oxyntomodulin mimetics
WO2022266467A2 (en) 2021-06-17 2022-12-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Recombinant histone polypeptide and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US655366A (en) 1900-05-16 1900-08-07 Simeon C Lawlor Window-cleaner.

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4518693A (en) * 1982-11-01 1985-05-21 Research Corporation Immobilized biocatalysts
GB2141430B (en) 1983-06-15 1987-01-21 Kingdon Craig R Peptides, pharmaceutical compositions, genes, vectors, host organisms, processes for their production and diagnostic reagents
WO1985000043A1 (en) 1983-06-15 1985-01-03 Kingdon Craig R Peptides, pharmaceutical compositions, genes, vectors, host organisms, processes for their production and diagnostic reagents
US4549986A (en) 1983-12-23 1985-10-29 The Salk Institute For Biological Studies Human CGRP
US4708934A (en) 1984-09-27 1987-11-24 Unigene Laboratories, Inc. α-amidation enzyme
US6319685B1 (en) 1984-09-27 2001-11-20 Unigene Laboratories, Inc. Alpha-amidating enzyme compositions and processes for their production and use
JPS6229997A (ja) 1985-04-08 1987-02-07 Sankyo Co Ltd C末端にプロリンアミドを有するペプチドの製法
GB8523156D0 (en) 1985-09-19 1985-10-23 Celltech Ltd Polypeptide production
JPS62177184A (ja) 1986-01-29 1987-08-04 Toyota Motor Corp 鋳鉄製内燃機関用シリンダヘツドおよびその製造方法
JPH0775541B2 (ja) 1986-06-07 1995-08-16 壽之 松尾 C末端アミド化酵素及びその製造方法
EP0249477A3 (en) 1986-06-12 1988-01-20 Immunex Corporation Functional recombinant analog polypeptides devoid of hydrophobic amino acids
JP2598050B2 (ja) 1987-07-17 1997-04-09 サントリー株式会社 C−末端α−アミド化酵素
US6255067B1 (en) 1987-09-15 2001-07-03 The Johns Hopkins University cDNA encoding peptidyl-glycine alpha-amidating monooxygenase (PAM)
JP2845468B2 (ja) 1989-01-17 1999-01-13 サントリー株式会社 ヒト甲状腺由来C―末端α―アミド化酵素

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US655366A (en) 1900-05-16 1900-08-07 Simeon C Lawlor Window-cleaner.

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B A EIPPER, R E MAINS, AND C C GLEMBOTSKI: "Identification in pituitary tissue of a peptide alpha-amidation activity that acts on glycine-extended peptides and requires molecular oxygen, copper, and ascorbic acid", PROC. NATI. ACAD. SCI. USA, 1983, pages 5144 - 5148
BRADBURY, A.F. ET AL.: "Mechanism of C-terminal amide formation by pituitary enzymes.", NATURE (LOND.), 1982, pages 686 - 688
HUSAIN, I., TATE, S.S.: "Formation of the COOH-terminal amide group of thyrotropin-releasing-factor", FEBS, LETT., 1983, pages 277 - 281, XP025593533, DOI: doi:10.1016/0014-5793(83)80395-0
LATHE R.: "Synthetic oligonucleotide probes deduced from amino acid sequence data. Theoretical and practical considerations", J. MOL. BIOL., 1985, pages 1 - 12, XP024013356, DOI: doi:10.1016/0022-2836(85)90276-1
MAINS RE ET AL.: "Peptide alpha-amidation activity in mouse anterior pituitary AtT-20 cell granules: properties and secretion", ENDOCRINOLOGY, 1984, pages 1522 - 1530
MANIATIS T, ET AL.: "Molecular cloning"

Also Published As

Publication number Publication date
EP0529742B1 (en) 2000-12-27
HU00552A9 (en) 1995-10-30
EP0529742A1 (en) 1993-03-03
HU212071A9 (en) 1996-02-28
DK448988D0 (da) 1988-08-11
JP2979172B2 (ja) 1999-11-15
FI883722A0 (fi) 1988-08-10
EP0308067A2 (en) 1989-03-22
FI883722A (fi) 1989-02-15
ATE198355T1 (de) 2001-01-15
US6319685B1 (en) 2001-11-20
RU2252961C2 (ru) 2005-05-27
AU629795B2 (en) 1992-10-15
DK448988A (da) 1989-02-15
DK175538B1 (da) 2004-11-29
CA1341454C (en) 2004-04-20
DE3856446D1 (de) 2001-02-01
JPH02104281A (ja) 1990-04-17
AU2057688A (en) 1989-02-16
NO883592L (no) 1989-02-15
KR0136611B1 (ko) 1998-04-25
DE3856446T2 (de) 2001-07-12
NO883592D0 (no) 1988-08-12
RU2080385C1 (ru) 1997-05-27
LTIP1656A (en) 1995-07-25
EP0308067A3 (en) 1989-07-26
HU213227B (en) 1997-07-28
KR890003947A (ko) 1989-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
LT4029B (en) Alpha-amidating enzyme compositions and process for their production
Strydom et al. Amino acid sequence of human tumor derived angiogenin
Smit-McBride et al. Sequence determination and cDNA cloning of eukaryotic initiation factor 4D, the hypusine-containing protein
Muta et al. Proclotting enzyme from horseshoe crab hemocytes. cDNA cloning, disulfide locations, and subcellular localization.
Aggarwal et al. Primary structure of human lymphotoxin derived from 1788 lymphoblastoid cell line.
Ishibashi et al. Structures of tremerogens A-9291-I and A-9291-VIII: peptidal sex hormones of Tremella brasiliensis
Miyata et al. Primary structure of hemorrhagic protein, HR2a, isolated from the venom of Trimeresurus flavoviridis
JPH02501112A (ja) 免疫親和性による精製方法
CA2189774A1 (en) Recombinant hk2 polypeptide
US20030017504A1 (en) Antibodies specific for poly(ethylene glycol)
EP0204527A1 (en) Removal of the N-terminal methionine from methionylproteins
US5830860A (en) Peptides with bactericidal activity and endotoxin neutralizing activity for gram negative bacteria and methods for their use
JP3472587B2 (ja) 骨関連カルボキシペプチダーゼ様タンパク質およびその製造法
Gram et al. A novel approach for high level production of a recombinant human parathyroid hormone fragment in Escherichia coli
EP0587541B1 (en) Process to purify the big-endothelin protein
Goto et al. Interleukin-1 receptor antagonist in inflammatory exudate cells of rabbits. Production, purification and determination of primary structure
NO844123L (no) Fremgangsmaate for fremstilling av nonapeptider og dodekopeptider
US5194592A (en) Monoclonal antibodies to novel polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
EP0527778A1 (en) IMPROVED PROCESS FOR PURIFYING RECOMBINANT PROTEINS AND METHODS USEFUL THEREIN.
HU197939B (en) Process for producing deoxyribonucleic acid, or its precursor, determining human growth hormone releasing factor
JPH03501205A (ja) ペプチジル‐グリシンアルファ‐アミド化モノオキシゲナーゼ(PAM)をコードするcDNA
FI110433B (fi) Alfa-amidointientsyymiä koodaava DNA-sekvenssi, isäntäsolu ja menetelmä amidoidun peptidien valmistamiseksi
US7365173B2 (en) Method for the production of pure virally inactivated butyrylcholinesterase
HAYASHI et al. Calf Thymus Lysine-and Serine-rich Histone: II. Chymotryptic and Thermolysin Peptides
Maeshima et al. Cell-free synthesis of alkaline lipase, a glyoxysomal membrane protein, from castor bean endosperm

Legal Events

Date Code Title Description
MM9A Lapsed patents

Effective date: 20111221