DK175538B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af et alfa-amiderende enzym, genmanipuleret mikroorganisme eller værtscelle og rekombinant DNA-molekyle,............. - Google Patents

Description

DK 175538 B1 i

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et α-amiderende enzym med trin omfattende at tilvejebringe en DNA-sekvens der kan kode for et a-amiderende enzym, ligere denne DNA-sekvens i en ekspres-5 sionsvektor, inducere transformation af en værtscelle der kan eksprimere DNA-sekvensen med ekspressionsvektoren, især ved valg af værtsceller med og eksprimerende DNA-sekvensen, og eksprimere enzymet. Opfindelsen angår også en genmanipuleret mikroorganisme, især en værtscelle; et 10 rekombinant DNA-molekyle; en fremgangsmåde til fremstilling af ot-amiderede produkter og endeligt et rekombinant a-amiderende enzym.

Ved visse foretrukne udførelsesformer kan det α-amiderende enzym ifølge opfindelsen bruges ved frem-15 stilling af nyttige ot-amiderede hormoner og produkter til landbrugs- eller medicinsk anvendelse, herunder cal-citoniner, faktorer der frigiver væksthormoner, peptider der har relation til calcitonin-genet og andre a-amiderede produkter.

2Q Den intracellulære behandling (spaltning og/eller modificering af funktionelle grupper) af prækursor-for-mer for native proteiner efter at de er blevet translateret fra nukleinsyrekodende sekvenser er dokumenteret klart.

I almindelighed kan pattedyrceller og andre eu-25 karyoter gennemføre visse ·eftertranslaterings-behand-lingsprocesser mens prokaryoter ikke kan. Visse prokary-oter, fx Escherichia coli, anvendes vidt og bredt som værter til produktion af pattedyrproteiner via rekombi-nant-DNA-teknologi (rDNA-teknologi) fordi de let kan dyr-30 kes ved portionsvise gæringsprocesser og fordi de er genetisk velkarakteriserede. Imidlertid behøver mange pattedyrproteiner frembragt ved genmanipuleringsteknologi en eller anden type eftertranslaterings-behandling, I DK 175538 B1

I I

og den må ofte gennemføres ved hjælp af komplicerede ke- I

H miske processer in vitro, der er omkostningsmæssigt pro- ]

hibitive for anvendelse i produktion i stor målestok. I

En type behandlingsaktivitet indebærer specifik

5 amidering af den karboxylterminale aminosyre i et pro- I

tein. Mange naturligt forekomne hormoner og peptider in- deholder en sådan modifikation, der ofte er essentiel H for at proteinet kan være biologisk aktivt. Et eksempel er calcitonin, hvor udskiftning af det amiderede prolin i den native form med en ikke-amideret prolinrest resul- 10 terer i en 3000. ganges nedsættelse af den biologiske ak- tivitet.

Et middel som bevirker denne C-terminale amidering (α-amidering) genkender en glycinrest som følger umiddel- I bart efter den aminosyre som skal amideres (R-X-Gly, hvor 15 r er proteinets hovedpart, X er resten som amideres og I Gly er glycinresten). Glycinet spaltes og donerer fak- | tisk aminodelen til den næstsidste aminosyre der derved bliver amideret.

I De første forfattere til at rapportere en tilnær- 20 met m°l®kylvægt for et α-amiderende enzym var A.P. Brad- bury et al. Nature, bind 298, 1982, side 686-688. Ved an- /S\ vendelse af "Sephadex,wy G-100 foreslog de en mindste tilsy- I neladede molekylmasse på ca. 60.000 dalton.

I Senere undersøgelser har tydet på' at molekylmas- sen af et sådan enzym ér mellem 60.000 og 70.000 dal-· I 25 ton, målt ved gelfiltreringskromatografen. Disse under- søgelser er blandt andet I. Husain, S.S. Tate, FEBS Let- I ters, bind 152 nr. 2, 1983, side 277-281, Eipper et al.

I PNAS, bind 80, 1983, side 5144-5148; Gomez et al., FEBS

I Letters, bind 167 nr, 1, 1984, side 160-164 og J.S. Kizer I 30 et al., PNAS, bind 81, 1984, side 3228-3232.

I Eipper et al. har i PNAS, bind 80, 1983, side I 5144-5148 rapporteret at der foruden molekylært oxygen I behøves to co-faktorer for at opnå enzym-amideringsakti- I vitet; det er askorbinsyre og kobber (II)-ioner.

3 DK 175538 B1

Den kemiske reaktion der resulterer i amideringen af karboxylenden af et peptid fordrer en kilde til amino-gruppen. A.F. Bradbury et al. påviste i Nature, bind 298, 1982, side 686-688, at glycin spaltes og donerer amino- delen til den næstsidste aminosyre, hvilket fører til 5 amidering af sidstnævnte. Behovet for glycin som amino-gruppedonor er bekræftet af andre forfattere.

A.E.N. Landymore et al. påviste i BBRC bind 117, nr. 1, 1983, side 289-293 at D-alanin også kunne tjene som aminodonor i amideringsreaktionen. Efterfølgende ar-10 bejde af Kizer et al. i PNAS, bind 81, 1984, side 3228-3232 viste to distinkte enzymaktiviter i rottehjernen, der var i stand til at katalyserer den α-amiderende reaktion. Formen med den højere molekylmasse (70.000 dalton) har en specificitet der er begrænset for glycin ved substratets karboxylende. Enzymet med den lavere molekylmasse accepterer et substrat med Ø-alanin som karbo-xylterminal aminosyre.

Skriftet WO 86/02099 anviser en rotte peptidylgly-cin α-amiderende monooxygenase med en molekylvægt på ca.

20 60.000 til 65.000 dalton.

pH-optimum for det α-amiderende enzym ekstraheret og delvist renset fra svinehypofyse blev af A.F. Bradbury og D.G. Smythe, BBRC, bind 112, nr. 3, 1983, side 372-377 oplyst at være ca. 7,0. B.A. Eipper et al. be-25 kræftede i PNAS, bind 80, 1983, side 5144-5148 disse resultater ved at oplyse et pH-optimum på 7 for et a-ami-derende enzym som var delvis renset fra rottehypofyser.

De meddelte også at enzymaktiviteten gik hurtigt ned ved pH-værdier under 6,5 og over 7,5.

I alle de foran nævnte publikationer (der hermed 30 inkorporeres i nærværende beskrivelse pr. reference) indeholder de beskrevne ekstrakter og delvis rensede enzymblandinger yderligere proteolytiske enzymer med evne til I DK 175538 B1 I 4

at nedbryde potentielle substrater og produkter; såvel I

I som de α-amiderende enzymer selv, hvilket medfører for- I

I sinkelse af amideringen ved hjælp af sådanne enzymer af peptider og polypeptider renset fra naturlige kilder el-

I 5 ler fremstillet ved rekombinant DNA-teknikker. I

I Stort set har.alle tidligere målte amideringsakti- viteter være baseret på omdannelse af D-substrater såsom I et tripeptid, D-Tyr-Val-Gly-COOH til D-Tyr-Val-CONH2.

Blandt de to mulige konfigurationer (D og L) optræder 1 naturligt forekommende, biologisk betydningsfulde amino- syrer i L-formen. Imidlertid blev anvendelse af D-formen nødvendiggjort for disse andre forskere for at modvirke tilstedeværelse af uvedkommende proteolytiske enzymer i I de urene amideringsenzym-præparater der anvendtes af I disse forskere. Disse uvedkommende enzymer kan have en I ^ udtalt proteolytisk virkning på L-aminosyresubstratet mens de har ringe virkning på et D-substrat. Bebyrdet med proteolytiske og andre urenheder i deres enzym brug- te forskerne det unaturlige D-substrat for at undgå nog- I le af virkningerne af urenhederne. Ingen har hidtil væ-

H o a I

ret i stand til at påvise at deres enzympræparater ef- I fektivt kan amidere et hvilken som helst fysiologisk re- I levant substrat, dvs. L-substrater til omdannelse til I bioaktive α-amiderede L-produkter.

Som påvist i nærværende beskrivelse har præpara- 25 terne ifølge nærværende opfindelse evne til effektivt at I amidere L-substrater, og på D-substrater har de en akti- I vitet som er fra 60 til over 1000 gange så stor som den højeste aktivitet der er konstateret i nogen som I helst kendt teknik som nærværende opfindere er bekendt med.

I 2o Enzymatiske præparater med evne til at amidere I karboxylenden af peptider og proteiner er beskrevet fle- re forskellige steder. Fx rapporterer A.F. Bradbury et I al. i Nature, bind 298, 1982, side 686-688 (er i sin I helhed herved inkorporeret i nærværende beskrivelse pr.

DK 175538 B1 I 5 I reference) at der er en α-amiderende enzymaktivitet til I stede i svinehypofysen. Et præparat af svinehypofyse in- I deholdende enzymet har evne til at omdanne peptider som I slutter i en glycinrest til det tilsvarende desglycin- I 5 peptidamid. Bradbury et al. anerkender imidlertid at I præpaterne ikke kan amidere peptider eller polypeptider I som er renset for naturlige kilder: I "Et prøvesystem til detektering og bedøm- I melse af den aroiderende aktivitet i hypo- I fysen blev opnået ved undersøgelse af en- I zympræparaters evne til at omdanne det syn- I tiske tripeptid D-tyrosylvalylglycin til I det tilsvarende peptidamid D-tyrosylvalinamid I ... D-tyrosinresten gav stabilitet mod ned- I brydning bevirket af aminopeptidaser til I 15 stede i vævshomogenisater ... Kontrolforsøg I viste at når syntetisk ... D-tyrosylvalin- I amid inkuberedes under samme betingelser, I blev det langsomt nedbrudt. Hypofyseenzymets I dannelse af dipeptidamidet følges således at I 20 dets ødelæggelse af andre enzymer som er I til stede i hypofyseekstrakten”. (side 686) I Bradbury et al. anerkender således at de be- I skrevne præparater indeholder andre proteolytiske enzy- I mer som nedbryder peptidet eller polypeptidet og at den I ikke-naturligt forekommende D-tyrosinrest blev udnyttet I til at nedbringe en sådan nedbrydning til et minimum.

I Desuden angiver Bradbury et al. anvendelse af homogeni- I sering eller sub-cellulær fraktionering efterfulgt af I gelfiltreringskromatografering til rensning af et ami- I deringsenzym der, indrømmet, forbliver forurenet med I 30 proteolytisk enzym.

I I. Husain og S.S. Tate beskriver i FEBS Letters I bind 152, nr. 2, 1983, side 277-281, at der er a-amide- I rende aktivitet til stede i neuroseærnerende granuler i I oksehypofyser.

I DK 175538 B1

Eipper et al. meddelte i PNAS bind 80, 1983, side I

5144-5148 at der var en α-amiderende enzymaktivitet til I

stede i rottehypofysers forlab, mellemlab og baglab og I

I oksehypofysers mellemlab. Denne reference angiver imid- I

I 5 lertid blot udnyttelse af et syntetisk D-Tyr-Val-Gly- I

I substrat til undersøgelse for σ-amiderende aktivitet, I

en genkendelse af urenheden i de frembragte præparater. I

Gomez et al. bestemte ifølge FEBS Letters bind I

I 167, nr. 1, 1984, side 160-164 at rotters hypothalamus I

I 10 °9S^ indeholdt en σ-amiderende enzymaktivitet. I

A.F. Bradbury og D.G. Smythe beskriver i Peptides I

Structure and Function: Proceedings of the Eighth Ameri- I

I can Peptide Symposium; side 249-252 (1983), redaktør I

V.J. Hruby og D.H. Rich, tilstedeværelse af en α-amide- I

H rende enzymaktivitet i rotters skjoldbruskkirtler. I

I R.E. Mains et al. rapporterede i Endocrinology I

bind 114, 1984, side 1522-1530 at en musecellelinie stam- I

I mende fra hypofyseforlabben (ATT-20) indeholdt en a-ami- I

H derende enzymaktivitet som åbenbart gik ned i kultur som I

funktion af tiden. I

I 20 Kirtler eller organer der vides at indeholde ami- I

derede peptider kan indeholde et enzym som har evne til I

I at katalysere amideringsreaktionen. Fx har T.L. O’Dono- I

I hue et al. rapporteret i Peptides 3, 1982, side 353-395 I

I at lavere livsformer såsom hajen Squalus acanthias in- I

I deholder amiderede peptider i hypofyseekstrakter. R.H. I

25“ I

I Scheller et al. rapporterede i Cell bind 32, 1983, si-τ. I

I de 7-22 tilstedeværelse af amiderings-signalpeptider i I

I havsneglen Aplysia. Trods den næsten allestedsnærværende I

I tilstedeværelse af denne aktivitet i naturen er der kun I

offenliggjort meget få oplysninger om enzymets fysisk- I

30 kemiske egenskaber. Dette kan tilskrives de meget lave I

I koncentrationer af enzymet som er tilstede i disse neu- I

I roendokrine organer. I

7 - DK 175538 B1

Tilstedeværelse af amiderede peptider i et givet væv er ikke nødvendigvis synonym med høje koncentrationer af a-amiderende enzymer. Fx indeholder vævet fra rotters hypofyseforlap høj α-amiderende aktivitet men ingen 5 kendte substrater (Eipper et al., PNAS 80, 5144-5148 (1983)). Væv fra rotters hypofysebaglap indeholder amiderede peptider (oxytocin og vasopressin) men har meget ringe α-amiderende aktivitet (Eipper et al., Endo 116, 297-2504 (1985)). Derfor kan man ikke forudse tilstede-værelse af potentielle koncentrationer af enzymet før de enkelte væv er afprøvet for α-amiderende aktivitet.

Formål med og resume af opfindelsen

Det er den foreliggende opfindelses formål at 15 tilvejebringe α-amiderende enzympræparater som effektivt kan producere nyttige α-amiderede produkter selv fra substrater som indeholder L-aminosyrer såsom peptid- eller polypeptid-substrater som er renset fra naturlige kilder eller frembragt ved rekombinant DNA-teknikker.

Det er yderligere et formål for opfindelsen at 20 tilvejebringe en effektiv og omkostningseffektiv metode til fremstilling af enzympræparatet.

Endnu et formål er at tilvejebringe monoklonale antistoffer der er specifikke for det α-amiderende enzym, og immobiliserede antistoffer, rensningsharpikser, immun-25 affinitetskolonner og lignende hjælpemidler som under udnyttelse af disse antistoffer bevirker effektiv rensning af det α-amiderende enzym.

Endvidere er det et formål for opfindelsen at tilvejebringe gensplejsede værtsceller med evne til ekspres-30 sion i et højt udbytte af det α-amiderende enzym. Yderligere tilsigter opfindelsen at muliggøre fremstilling af α-amiderede produkter ud fra substrater indeholdende en C-terminal glycinrest ved omsætning af substratet i nærværelse af en2ympræparatet.

I DK 175538 B1 I

I I

Disse og andre formål vil forstås ud fra en grun- I

I dig læsning af nærværende beskrivelse, idet specielt det I

I for opfindelsen ejendommelige vil blive opregnet senere. I

I De bl. a. ifølge opfindelsen tilvejebragte hidtil ukendte I

I 5 a-amiderende enzympræparater besidder tilstrækkelig ren- I

I hed til at udvise en specifik α-amiderende aktivitet på I

I mindst 25 mU pr. mg protein som er til stede i enzympræ- I

paratet og fortrinsvis over 50 eller over 150 mU/mg pro- I

tein. Alle specifikke aktivitetsenheder (U) som er op- I

lyst i nærværende beskrivelse er baseret på omdannelse I

I af Dansyl-D-Try-Val-Gly-COOH til Dansyl-D-Tyr-Val-CONI^. I

I En mU er defineret som den mængde aktivitet der behøves I

I til at omdanne ét nanomol (nmol) af Dansyl-D-Tyr-Val- I

I Gly-COOH til ét nmol Dansyl-D-Tyr-Val-CONH2 pr. minut I

I ved 37°C og pH 7,0 i nærværelse af askorbationer i en I

I koncentration på 3 mM (baseret på den samlede reaktions- I

I blanding indbefattet enzym, substrat, co-faktorer etc.), I

I molekylært oxygen i et polært overskud ud over substra- I

I tet og en koncentration af kupriioner som er effektiv· I

I til at maksimere aktiviten (som regel ca. 2 pH i afhæn- I

I 20 gighed af enzymets renhedsgrad). I

I α-amiderende enzymer ifølge opfindelsen såsom I

I peptidylglycin-a-amiderende monooxygeriase har evne til I

at katalysere omdannelse af en peptidylforbindelse med I

en glycinrest i det mindste i C-enden af en peptidkæde I

25 til en tilsvarende peptidylamidforbindelse med en amino- I

gruppe i stedet for det C-terminale glycin. Med beteg- I

nelsen "peptidkæde" menes der i nærværende beskrivelse I

et hvilket som helst polypeptid med mindst to aminosy- I

rer forbundet med hinanden med en peptidbinding. Beteg- I

nelsen "peptidylforbindelse" indbefatter en hvilken som I

helst forbindelse der indeholder en peptidkæde. Med be- I

tegneisen "tilsvarende peptidylamid" sigtes der til et I

hvilket som helst produkt af en reaktion som indsætter I

9 DK 175538 B1 en aminogruppe i stedet for en C-terminal glycinrest i en peptidkæde.

Det foretrækkes at α-amideringsreaktiorten finder sted i nærværelse af oxygen og et reduktionsmiddel. Eg-5 nede reduktionsmidler indbefatter, men er ikke begrænset til askorbinsyre, askorbinsyresalte, dihydroxyfuma-rat, metalcyanidforbindelser og tetrahydropterin. Visse co-faktorer har vist sig at understøtte reaktionens fremadskriden og/eller forsinke nedbrydning eller inak-10 tivering af enzymet. Sådanne co-faktorer indbefatter, men er ikke begrænset til katalase, ætanol, kaliumjodid og kupriioner. De rensede enzympræparater ifølge opfindelsen er fortrinsvis tilstrækkeligt fri for proteoly-tisk aktivitet med evne til at nedbryde enten det a-ami-derende enzym eller produkterne eller reaktanterne for Ί c α-amideringsreaktionen så at enzympræparatet kan katalysere α-amideringsreaktionen selv når substratet og produktet er sammensat af L-aminosyrer. Proteolytisk aktivitet i reaktionsblandingen til amideringen afspejler ikke nødvendigvis direkte koncentrationen af prote-20 ase. Aktivitet, selv ved høje proteasekoricentrationer, kan fx være undertrykket af indvirkning af forskellige inhibitorer. Manglen på proteolytisk aktivitet som forøger den kommercielle og praktiske anvendelighed af enzympræparatet til anvendelse med substrater som indeholder L- aminosyrer nedsætter ikke på nogen måde præparatets 2 5 nytte til anvendelse med substrater som ikke indeholder L-aminosyrer.

Som beskrevet nærmere i den detaljerede beskrivelse er det lykkedes nærværende opfindere at rense talrige specifikke proteinarter som har væsentlig a-amide- rende aktivitet. Udtrykket "α-amiderende aktivitet” anvendes i nærværende beskrivelse til at angive en hvilken som helst aktivitet der har tendens til kun at efterlade 30 I DK 175538 B1 I 10 ' en aminogruppe i en position der i forvejen var optaget . af en C-terminal glycinrest i en substrat-peptidylfor- bindelse. En sådan udskiftning kan indebære spaltning af alt andet i glycinresten end aminogruppen så at kun en amino- 5 gruppe er tilbage i den position der i forvejen var op- taget af hele glycinresten. Med betegnelsen "a-amideren- de enzym" menes i nærværende beskrivelse en hvilken som helst sammensætning eller forbindelse som udviser a-ami- derende aktivitet samt aktive homologer og fragmenter deraf.

10

Enzympræparater som renses i overensstemmelse med

den foreliggende opfindelse kan renses indtil de er ho- I

mogene. I nærværende beskrivelse menes med "homogen" en- I zympræparater som udviser et enkelt, veldefineret bånd ved elektroforese på en natriumdodecylsulfat/polyakry1- I 15 amidgel og udviser data for en enkelt aminosyre ved sæd- I vanlige sekvenseringsmetoder.

Visse α-amiderende enzymer som er renset til ho- mogenitet i overensstemmelse med den foreliggende opfin- I delse har udvist specifik enzymaktivitet på over ca.

I 20 1500 mU/ra9 protein.

Enzympræparater fremstillet i overensstemmelse I med den foreliggende opfindelse kan bruges ved fremstil- ling af nyttige α-amiderede peptidylprodukter ved anven- I delse af enzympræparaterne til at katalysere a-amidering I af sådanne produkter. Der tilvejebringes et substrat som er en peptidylforbindelse med en glycinrest i det mind- I ste i C-enden af en peptidkæde, hvor udskiftning af den C-terminale glycinrest med en aminogruppe resulterer i I det ønskede produkt. Substratet omsættes, fortrinsvis i I nærværelse af oxygen og et reduktionsmiddel, i nærværelse I ^ af et enzympræparat fremstillet i overensstemmelse med I opfindelsen i tilstrækkelig tid til at omdanne peptidyl- I forbindelsen til et tilsvarende peptidylamid. Omdannel- I sen begynder i det væsentlige ved den første kontakt 11 - DK 175538 B1 mellem substratet og enzymet, reaktionshastigheder varierer i betydelig grad ved pH, temperatur, substratets identitet, koncentration af co-faktorer og andre parametre som kan reguleres på kendt måde for at optimere g reaktionen. Man lader i almindelighed reaktionen skride frem i en tidsperiode som vælges under hensyn til den ønskede omdannelsesgrad (af substrat til produkt). I de foretrukne udførelsesformer bruges sådanne co-faktorer som de foran nævnte til at understøtte reaktionens frem-adskriden og/eller forøge eller understøtte enzymets ak-10 tivitet.

Der kan fremstilles talrige nyttige produkter, herunder naturlige hormoner og lignende stoffer, for hvilke α-amideringen foretrækkes eller er nødvendig ved omsætning af glycin-forlængede peptidylforbindelser i 15 nærværelse af α-amiderende enzympræparater i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse. Disse produkter, der fx kan bruges i landbruget eller ved behandling af sygdomme som er karakteriseret ved hormondeficienser, kan blandt andet være, men er ikke begrænset til for-2Q skellige calcitoniner, faktorer der frigiver væksthormon, peptider er som gen-relaterede til calcitonin og lignende stoffer. Hormoner som er omtalt i nærværende beskrivelse såsom de foran nævnte calcitoniner, vækst- -hormon-frigivende faktorer og calcitonin gen-relaterede peptider er blandt andet proteinarter med C-terminalt o 5 amid, som udviser den karakteristiske aktivitet af det nævnte hormon, som det vil være kendt for de sagkyndige.

Fx indbefatter calcitonin alle de former som udviser den regulering af kalciumoptagelse i knoglerne, der er karakterisk for kendte calcitoniner. Homologer til de 30 i nærværende beskrivelse omtalte forskellige proteinarter er indbefattet i definitionen af arterne, og en hvilken som helst nukleotidsekvens eller aminosyresekvens som er angivet heri skal forstås som omfattende homologe

I DK 175538 B1 I

I .12 I

I sekvenser i hvilke substitueringer, additioner eller de- I

I letioner ikke væsentligt påvirker den funktion som ud- I

I øves af den konkrete angivende sekvens. Fortrinsvis sva- I

I rer mindst ca. 40% og navnlig 50% af aminosyrerne i et I

I 5 peptid til dem der er oplyst. Hvad angår nukleotidse- I

I kvenser kan kodoner selvsagt udskiftes med ækvivalente I

I kodoner som koder for de samme aminosyrer. I

I Evnen hos enzympræparatet ifølge opfindelsen til I

I at katalysere: α-amideringsreaktionen selv på substrater I

I som indeholder L-aminosyrer»muliggør effektiv og omkost- I

10 I

ningseffektiv produktion af disse produkter ved hjælp af I

I substrater der er renset fra naturkilder eller fremstil- I

I let ved rekombinant DNA-teknikker. I

I Ved visse foretrukne udførelsesformer kan α-ami- I

I deringsreaktionen lettes ved immobilisering af enzymet I

I 15 på en fast bærer som er uopløselig i vandige medier og I

I modstandsdygtig mod nedbrydning under reaktionsbetin- I

I gelser, og således at substratet føres over det immobi- I

liserede enzym fortrinsvis i nærværelse af passende co- I

I faktorer. Med betegnelsen "immobilisering" menes i nær- I

I 20 v®ren^e beskrivelse binding af enzymet til en bærer. Bæ- I

I rerer som er nyttige til dette formål indbefatter, men I

I er ikke begrænset til glas med kontrolleret porestørrel- I

I se og aktiverede absorbenter såsom cyanogenbromid-akti- I

I I

veret "Sepharose"· . Enzymer scm er immobi li seret på denne I

I måde kan genanvendes ved fjernelse af reaktionsblandingen I

I 25 I

fra den faste bærer,som fortsætter med at tilbageholde I

I enzymet til fremtidig anvendelse. I

I Det har vist sig at enzympræparater i overens- I

I stemmelse med opfindelsen kan fremstilles og renses ved I

I et antal fremgangsmåder. Det har vist sig at carcinom- I

30 væv fra skjoldbruskkirtlens marv, fortrinsvis stammende · I

fra en rotte, cellelinier deraf og/eller dyrkningsmedier I

fra disse cellelinier, er særlig hensigtsmæssige kilder I

til råt a-amiderende enzym. Urent α-amiderende enzym kan I

13 DK 175538 B1 renses ved at man underkaster det rå præparat både stør-relsesudelukkelseskromatografering og anionbytterkromatografering, fortrinsvis kromatografering med en stærk anionbytter. Med udtrykket "stærk" anionbytterkromato-5 grafering menes der her anionbytterkromatografering som udføres på en hvilken som helst harpiks som opretholder en konstant netto positiv ladning i området pH 2-12. I visse foretrukne udførelsesformer for opfindelsen foretages der størrelsesudelukkelseskromatografering forud for den stærke anionbytterkromatografering, og forud for trinnet med størrelsesudelukkelseskromatografering kan der eventuelt gå endnu et trin med anionbytterkromatografering. Et yderligere kromatograferingstrin på en stærk anionbytter efter det første trin kan være ønskelig, og ved en foretrukken udførelseform gennemføres en-15 ten den første stærke anionbytterkromatografering eller den anden stærke anionbytterkromatografering ved en basisk pH-værdi, mens den anden deraf gennemføres ved sur pH-værdi.

Ved anvendelse af enzympræparater som er blevet 2Q renset i det væsentlige til homogenitet i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse er der blevet fremstillet monoklonale og polyklonale antistoffer som er specifikke for enzymet ved anvendelse af renset enzym som antigen for at fremkalde immunreaktion hos henholdsvis mus og høns. Antistoffer afledet på denne måde fra 25 en hvilken som helst art kan renses og immobiliseres på en fast bærer med henblik på at fremstille en immunoaf-finitétskolonne som er specifik for enzymet. Denne kolonne kan bruges til rensning af råt enzymatisk materiale, hvilket fører til forøget effektivitet og genan-30 vendelighed af enzymet.

Enzym som er renset i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse er sammen med ved trypsinbe-handling dannede fragmenter deraf sekvensbestemt ved I DK 175538 B1

I 14' I

I kendte metoder, og de opnåede sekvensdata er blevet an- I

I vendt til fremstilling af oligonukleotid-prober. Ved I

hjælp af mærkede oligonukleotid-prober fremstillet på I

denne måde er det lykkedes at isolere et gen som koder I

5 for et α-amiderende enzym fra et cDNA-bibliotek synteti- I

seret fra polyA RNA stammende fra karcinomvæv fra rot- I

ters skjoldbruskkirtelmarv. Genet, der vil blive nærmere I

karakteriseret i den detaljerede del af nærværende be- I

I skrivelse, kan ligateres ind i en passende ekspressions- I

vektor og omdannes til en hvilken som helst værtscelle I

ίο I

med evne til at udtrykke (express) genet. Egnede værter I

I indbefatter blandt andet, men er ikke begrænset til Escheri- I

chia coli, gærstammer såsom Saccharomyces cerevisiae og I

højere eurokaryotiske celler såsom den cellelinie fra I

hvilken enzymet oprindeligt blev renset. Kommerciel mas- I

I 15 seproduktion kan forventes at blive lettet af en mikro- I

I organisme som er gensplejset som nævnt ovenfor til at I

H udtrykke (express) store mængder α-amiderende enzym. I

I Den ovenfor definerede fremgangsmåde ifølge opfin- I

I delsen til fremstilling af et a-amiderende enzym er ejen- I

I 20 dommelig ved at den deri definerede DNA-sekvens hybridi- I

I serer med mindst en sekvens fra mindst to af følgende I

I prober: I

AE1: 3'-TTACTCACGG ACCCGTGGTA ACCGGGA/TCAC/G TGGGGGGAC I

TACG-5' I

25 AE8 : 3'-AC/ICCG/ITGG/ITA A/ICCG/IGGA/ICAC/I TG-5' I

I AE4: 3'-TTAGCCG/TGTC/TA CCTG-5' I

I AE5: 3'-TTA/GCCG/AGTC/TA CCTG-5' I

I AE6: 3'-TACGTC/TGGIC CIAGICTG/AGT C/TTT-5' I

I AE7: 3'-TACGTC/TGGIC CITCA/GCTG/AGT C/TTT-5' I

I 30 AE10: 3'-CTG/AGTCTTG/AG TG/AAA-5' I

I AE11: 3'-CTG/AGTTTTG/AG TG/AAa-5' I

I AE9: 3'-AAA/GCAC/ITGC/IG TC/TACCCCC/ICT-5 ' I

DK 175538 B1 I 15 I der kan benyttes til at identificere denne sekvens hvor I hver probe omfatter en blanding af sekvenser.

I Den genmanipulerede mikroorganisme og specielt I værtscellen ifølge opfindelsen er ejendommelig ved at den I 5 er fremstillet ved den ovenfor givne fremgangsmåde ifølge I opfindelsen. Det rekombinante DNA-molekyle ifølge opfin- I delsen er ejendommeligt ved at omfatte en nucleotidse- I kvens med evne til at kode for et a-amide rende enzym, I hvor sekvensen er som defineret i de ovenfor givne aspek- I 10 ter af opfindelsen. Dernæst er fremgangsmåden ifølge op- I findelsen til fremstilling af or-amiderede produkter ejen- I dommelig ved at omfatte at bringe et substrat med en ΟΙ terminal glycinrest i kontakt med et a-amiderende enzym I fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen eller I 15 ud fra værtsceller ifølge opfindelsen, og derefter udvin- I de det α-amiderede produkt. Endelig er det rekombinante I α-amiderende enzym ifølge opfindelsen ejendommeligt ved I at være fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen I til dette formål, hvor DNA-sekvensen er som defineret i I 20 forbindelse med opfindelsen.

I Foretrukne udføreIsesformer af disse forskellige I aspekter ved opfindelsen ses i underkravene.

I Kommerciel masseproduktion af enzymerne fra na- I turlige kilder kan lettes ved rensningsmetoder som om- I 25 fatter størrelsesudelukkelseskromatografering og anion- I bytterkromatografering hvorved enzymatiske materialer I som tilbageholdes på anionbytter-kromatograferingskolon- I nen elueres ved hjælp af en saltopløsning med en koncen- I tration på over ca. 250 mM og fortrinsvis så høj som 350 I mM eller 500 mM.

I 30 I Ved hø^e saltkoncentrationer vil det meste af det I tilbageholdte enzymmateriale blive elueret. Størrelses- I udelukkelseskromatografering bør udformes til at isolere I enzymformer med en tilsyneladende molekylvægt på mellem I DK 175538 B1 I 16

ca.>. 58.000 og 67.000 dalton og fortrinsvis mellem 60.000 I

og 65.000 dalton. Det rensede præparat har evne til at

H amidere en peptidylforbindelse som er renset ud fra na- I

I turlige kilder eller frembragt ved rekombinant DNA-tek- 5 nikker# dvs. peptider bestående af L-aminosyrer.

På tegningen har

fig. I-fig. V relation til eksempel 1 og forkla- I

I res i dette# I

10 Fig. VI-XII relation til eksempel 2 og er forkla- I

ret i det, fig. XIII-XVI relation til eksempel 3 og er for- klaret i det,

H fig. XVII-XXI relation til eksempel 4 og er for- I

klaret i det,

15 I

fig. XXII relation til eksempel 10 og er forkla- I

ret i det, og

I fig. XXIII relation til eksempel 6 og er forkla- I

I ret i det.

17 DK 175538 B1

Udførlig beskrivelse af foretrukne udførelsesformer for opfindelsen_._

Det har nu vist sig at der kan vindes et homogent α-amiderende enzym ved en mangetrinsproces som ud-5 nytter en kombination af størrelsesudelukkelses- og ion-bytterkromatografering fra faste svulstvævsekstrakter, svulst-cellelinier og vævskulturmedium fra sådanne cellelinier.

Enzymet er blevet ekstraheret fra karcinomer fra skjoldbruskkirtlen fra rotter ("MTCs") udviklet i rotter 10 af stammen WAG/Rij Wistar som beskrevet af B.A. Roos et al. i Endocrinology, 1979, bind 150, nr. 1, side 27-32.

Dette væv er deponeret som IVI-10028. Enzymet er også blevet ekstraheret fra andre kilder, navnlig karcinom-cellelinier fra skjoldbruskkirtlen var fra rotter. Rot-15 tecellelinien ("CA-77") var fremkommet ved seriepassager af karcinom-svulster fra skjoldbruskkirtelmarv fra rotter som beskrevet af M. Myszynski et al., JBC 1983, bind 258, side 11678-11683. Denne cellelinie er blevet deponeret som 1VI-10029. En human cellelinie ("HTT 54(34)") 20 blev udviklet af B.A. Roos på VA Medical Center i Cleveland, Ohio, USA, under anvendelse af karcinomceller fra skjoldbruskkirtelmarv fra mennesker til den primære kultur. Denne humane cellelinie HTT 54(34) er blevet deponeret som IVI-10031. (Se Recognition of the Deposit of Micro-Organismen for the Purposes of Patent Procedure",

I DK 175538 B1 I

I 18 I

I der er bevis for disse deponeringer, og "Budapest Noti- I

I fication" nr. 34 af 3. november 1983; alle disse oplys- I

I ninger indgår herved i nærværende beskrivelse pr. refe- I

I rence. I

I 5 Definerede vævskulturmedier fra både den humane I

I cellelinie og rottecellelinien er påvist at indeholde I

I signifikante koncentrationer af a-amideringsenzym-akti- I

I vitet hvilket viser at en del af enzymet udskilles fra I

I cellerne. Enzymet kan vindes og renses ved at man for- I

I 10 trinsvis først underkaster det rå materiale (herunder I

I brugte dyrkningsmedier, enzym og urenheder)-anionbytter- I

I kromatografering. Prøven kan fx overføres i bulk på en I

I ionbytter i præparativ målestok såsom en diætylaminoætyl- I

_(d)

patron ("DEAE”) såsom "Cuno1^ 250 som kan fås fra Cuno I

I 15 Corp. I

I Det fra patronen eluerede præparat indeholdende I

I α-amideringsaktivitet underkastes derefter størrelsesude- I

I lukkelseskromatografering på en harpiks med passende re- I

I solveringsevne, fx en "Sephacryl"® S-200 superfin ko- I

I 20 lonne som kan fås fra Phamacia Fine Chemicals. I

I Den aktivitets-indeholdende eluentfraktion under- I

I kastes derefter ionbytterkromatografering ved hjælp af I

I en stærk anionbyttermatrix. En harpiks som kan bruges er I

I den stærke anionbytterharpiks "Mono"® Q HR5/5 fra Pharma- I

I 25 cia Fine Chemicals, og der kan behøves en eller flere I

I passager gennem kolonnen for at opnå homogen rensning I

I af enzymet. "Mono"® Q HR5/5 kolonnen har en partikel- I

I størrelse på 10 pm, mellemrumsrumfang på 40% og en gel I

I hvis ladede gruppe er CH2-N+(CH3)3 og hvis ionkapacitet I

I 30 er 0,28-0,36 mmol/ml. I

I Hvert rensningstrin kan overvåges for både pro- I

I teinindhold og grad af a-amideringsaktivitet. Disse op- I

I lysninger bruges til at beregne den specifikke aktivitet I

I af enzymet, der tjener som indikator for enzymets rela- I

I 35 tive renhed. I

I Peptidyl-glycin-a-amiderende monooxygenase renset I

I i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse (de- I

19 DK 175538 B1 poneret enzym stammende fra rotter IVI-10032; deponeret enzym stammende fra mennesker IVI-10033) har en tilsyneladende molekylmasse på ca. 60.000-65.000 dalton bestemt ved gelfiltrering.

5 Enzymet er blevet renset på en sådan måde at det udviser en specifik enzymatisk aktivitet mindst 25 mU pr. mg protein og fortrinsvis mindst 50 mU/mg protein.

Især foretrækkes en specifik aktivitet på over ca. 150 mU/mg. protein. Det α-amiderende enzym er også blevet 10 renset så det udviser et enkelt, homogent, veldefineret bånd efter elektroforese på natriumdodecylsulfat/poly-akrylamid-geler (SDS-PAGE).

Den rensede peptidyl-glycin-a-amiderende monooxy-genase bruges til at amidere a-karboxylgruppen i et po-15 lypeptid med en terminal glycinrest hvor glycinet fungerer som aminogruppedonor. Substratpeptidet eller poly-peptidet kan renses ud fra naturlige kilder, syntetiseres ud fra de indgående aminosyrer eller fremstilles ved rekombinant DNA-teknikker. Det glycinterminerende poly-20 peptid kombineres med oxygen i nærværelse af en effektiv mængde af enzymet. Den mængde af enzymet som behøves afhænger af flere variabler som er velkendte for de sagkyndige, især men ikke begrænset til følgende: den specifikke aktivitet af et givet enzympræparat, mængden og 25 den kemiske karakter af det til omdannelse værende substrat, det tidsrum i løbet af hvilket omdannelsen skal finde sted og reaktionsblandingens temperatur og pH-vær-di. De sagkyndige på området vil være klar over andre variabler som kan påvirke den præcise mængde udkrævet 30 enzym i en given situation. Oxygenet er sædvanligvis til stede under reaktionen i molært overskud i forhold til substratkoncentrationen. En ønsket koncentration af kobberioner kan tilvejebringes ved hjælp af et hvilket som helst kobbersalt hvis anion ikke påvirker reaktionen 35 i ugunstig retning. Med et enzym med en specifik enzymatisk aktivitet på kun ca. 1 mU/mg protein indtræder maksimal α-amidering med en forholdsvis høj koncentration

I DK 175538 B1 I

I 20 I

I på ca. 4 ym kupri ioner. Efterhånden som enzymets renhed I I forøges går koncentrationsbehovet for exogene kupriioner I I ned. Den enzymatiske aktivitet kan også forøges ved til- I

stedeværelse af askorbationer som kan tilvejebringes ved I I 5 hjælp af et hvilket som helst askorbinsyresalt blot sal- I I tets kation ikke påvirker reaktionen i ugunstig retning. I

For et renset enzym med en specifik enzymatisk aktivi- I I tet på omkring 50 mU/mg protein, indtræder maksimal ak- I I tivitet af α-amideringen ved ca. 5 mM askorbat. Den α- I I 10 amiderende aktivitet kan forøges ved tilsætning af kata- I I lase. Den optimale pH-værdi til omdannelse af et biolo- I I gisk relevant substrat til amiderede produkter ligger I I mellem 6,5 og 7,5. I I Der er vundet monoklonale og polyklonale anti- I I 15 stoffer rettet mod enzymet under anvendelse af homogent I I enzym,som antigen til fremkaldelse af immunreaktion hos I I henholdsvis mus og høns. På basis af den forelig- I I gende opfindelse er der blevet fremstillet og renset I

både monoklonale og polyklonale antistoffer som nærmere I I 20 forklaret i eksempel 8. Et lager af antistoffer der er I I specifikke for α-amiderende enzym opbevares i nærværende I

patenthavers laboratorier. I I Antistofferne kan immobiliseres på en fast ma- I I trix som ikke er opløselig i de medier hvori den skal I

25 bruges. Fortrinsvis er matrixen en sådan som er resi- I I stent mod nedbrydning. Matrixen leveres med en funktio- I I nel gruppe med evne til at binde proteiner, og derefter I I bindes de funktionelle grupper co-valent til antistof- I I ferne. En sådan immobilisering af antistoffer vil lette I I 30 isolering af det α-amiderende enzym fra naturlige og/ I

eller rekombinant-kilder. Dette opnås ved at man blander I I de immobiliserede antistoffer med rå præparater af enzy- I I met. Antistofferne vil binde de α-amiderende enzymmole- I I kyler specifikt. Forurenende proteiner vil ikke binde I I 35 sig til antistofferne og kan let fjernes ved eluering I I eller forsigtig centrifugering. Efter fjernelse af for- I I ureninger kan det α-amiderende enzym fjernes fra de immo- I

21.

DK 175538 B1 biliserede antistoffer ved ændringer i ionstyrke eller pH, eller ved tilsætning af chaotrope-ioner ("Affinity Chromatography: Principles and Methods, Manual, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) og udvindes i høj-5 renset form.

Enzymet er også blevet tilstrækkelig renset til at muliggøre at dets aminosyresekvens kan bestemmes. Denne bestemmelse blev udnyttet til at isolere nukleinsyre som koder for enzymet.

10 Efterfølgende inkorporering i en passende encel let organisme eller en værtscelle isoleret fra en fler-cellet organisme udføres ved standard rekombinant DNA-processer som fx oplyst hos Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982; 15 eller R. Wu, red., Methods in Enzymology, bind 68, Academic Press, 1979, hvilke skrifter hermed indgår i nærværende beskrivelse pr. reference. De resulterende celler indeholdende det heterologe DNA som koder for det a-amiderende enzym tillader produktion af tilstrækkelige 20 mængder af enzymet til at gennemføre post-translaterings-α-amidering in vitro og tillader teoretisk disse celler at gennemføre denne modificering af et peptid eller poly-peptid in vivo:-

Omend den foreliggende opfindelse her beskrives i 25 forbindelse med foretrukne udførelsesformer derfor, vil mange modifikationer være åbenbare for de sagkyndige. Foretrukne udførelsesformer for opfindelsen belyses endvidere ved de følgende eksempler.

30 Eksempel 1

Fremstilling af et α-amiderende enzympræparat ud fra MTC-tumorer_

Frosne MTC-svulster fra rotter blev pulveriseret 25 til ganske små fragmenter og homogeniseret i 150 mM Tris pH 7,5 indeholdende 250 mM sakkarose, 0,25% N-acetylglu-kopyranosid, 0,1 mM PMSF, 20 pg/ml pepstatin og 100 pg/ I DK 175538 B1 22. ' H ml sojabønne trypsin-inhibitor. Typisk blev 25 g svulst- væv homogeniseret i 200 ml af ovennævnte puffer på is.

Homogeniseringen gennemførtes ad 4 gange på hver 20 se- kunder ved hjælp af en "Polytron" homogenisator (Brink- 5 man) ved en indstilling på 7. Homogenisatet centrifuge- redes i 15 minutter i 9000 x g i en ”JA-20" rotor (Beck- man) og den ovenstående væske (Sup.1) dekanteredes. Den tilbageværende klump genhomogeniserede i 60 ml af homoge- niseringspufferen i 3 omgange på hver 20 sekunder og ved 10 en indstilling på 7. Dette andet homogenisat blev centri- fugeret på tilsvarende måde i 15 minutter ved 9000 x g.

Den ovenstående væske fra denne centrifugering (Sup.2) blev forenet med Sup.1. Blandingen af Sub.1 og Sub.2 blev derefter centrifugeret i 30 minutter ved 100.000 x I 15 g i en "SW28" rotor (Beckman) ved 4°C. Til det klarede homogen i sat·: (Sup.3) sattes der en tilstrækkelig mængde ammoniumsulfatkrystaller til at give opløsningen et ind- hold på 25% ammoniumsulfat. Tilsætningen af krystallerne skete gradvist i løbet af en periode på 15 minutter med 20 konstant omrøring af homogenisatet ved 4°C. Efter yder- I ligere 30 minutters omrøring ved 4°C blev blandingen cen- I trifugeret i 15 minutter ved 27.000 x g i en "JA-20” ro- I tor (Beckman) ved 4°C. Den ovenstående væske dekantere- I des og der sattes yderligere ammoniumsulfat til den I 25 ovenstående væske for at gøre opløsningen 40% med hen- I syn til ammoniumsulfat. Efter yderligere 30 minutters I omrøring blev blandingen på ny centrifugeret i 15 minut- I ter ved 27.000 x g som beskrevet ovenfor. Den ovenståen- de væske fra denne centrifugering kasseredes og klumpen, 30 der indeholdt mindst 50% af homogenisatets samlede en- zymaktivitet, gensuspenderedes i 50 mM Tris-HCl pH 7,0 I til tilvejebringelse af en prøve. Aktiviteten var 8,2 mU/mg protein.

I 35 Størrelsesudelukkelses-kromatografering ved gelfiltre- I ring på "Sephacryl"® S-300_ I "Sephacryl"® S-300 (Pharmacia) blev ækvilibreret 23 ..

DK 175538 B1 i 50 mM Tris-HCl pH 7,0 og udhældtes i en K 50/100 kolonne (Pharmacia) i overenesstemmelse med fabrikantens instruktioner. Kolonnens lejerumfang var ca. 1,3 1. Prøven overførtes på kolonnen i et rumfang svarende til ca.

5 3% af kolonnens lejerumfang. Proteiner elueredes fra ko lonnen i 50 mM Tris-HCl pH 7,0 med en strømningshastighed på ca. 2 ml pr. minut. Der opsamledes fraktioner på 10 ml og de blev afprøvet med hensyn til a-amiderende enzymaktivitet under anvendelse af et substrat af Dan-10 syl-D-Tyr-Val-Gly. Enzymet elueredes fra kolonnen som en enkelt aktivitets-top der er vist i fig. I med en mole-kylmasse på 60.000-65.000 dalton. Aktiviteten var mindst 50 mU/mg protein.

15 "Mono'® Q kromatografering ved pH 6,0 - stærk anion- bytterkromatografering_

Fraktioner fra "Sephacryl"® S-300 kolonnen som indeholdt den maksimale enzymaktivitet forenedes og dialyseredes mod 4 1 20 mM bis-Tris pH 6,0 puffer. Det hele 20 overførtes derefter til en "Mono"® Q HR 5/5 kolonne (Pharmacia) der var blevet forbehandlet i overensstemmelse med fabrikantens instruktioner og ækvilibre-ret i 20 mM bis-Tris pH 6,0. Derefter opsamledes de proteiner som ikke bandt sig til kolonnen i effluenten fra 25 kolonnen (gennemløbet) og de bundne proteiner blev elue-ret med en lineær saltgradient på 0 til 300 mM NaCl i 20 ml bis-Tris pH 6,0. Kolonnen blev drevet med en strømningshastighed på 0,5 ml pr. minut og der opsamledes fraktioner på hver 2 ml. Den opløsning af proteiner som 30 elueredes fra "Mono"® Q kolonnen ved pH 6,0 blev øjeblikkeligt neutraliseret ved opsamling i rørglas hver indeholdende 200 pi 1,0M Tris pH 7,0. Fraktionerne blev bestemt for α-amiderende enzymaktivitet som foran, og der konstateredes en aktivitetstop som elueredes fra 35 kolonnen ved ca. 160 mM NaCl (fig. II). Aktiviteten var 161 mU/mg protein.

I DK 175538 B1 I

I 24 I

"Mono1® Q kromatografering ved pH 8,0 I

I Fraktioner som indeholdt toppen af den ct-amide- I

I rende enzymaktivitet fra "Mono"® Q ved pH 6,0 blev dia- I

I lyseret mod 2 portioner på hver 4 1 50 mM Tris-HCl pH I

I 5 8,0. Derefter overførtes enzymet til en "Mono"® Q HR 5/5 I

I kolonne (Pharmacia) ækvilibreret med 50 mM Tris-HCl pH I

I 8,0. Proteiner elueredes med en saltgradient på 0-300 mM I

I NaCl i 50 mM Tris-HCl pH 8,0. Der anvendtes en strøm- I

I ningshastighed på 0,5 ml pr. minut og der opsamledes I

10 fraktioner på hver 2 ml. Hver fraktion blev neutralise- I

I ret ved tilsætning af 200 μΐ 1,0M Tris pH 7,0 i hvert af I

I opsamlingsrørene. Der konstateredes to distinkte toppe I

I for enzymaktivitet, der elueredes ved henholdsvis 190 mM I

NaCl og 220 mM NaCl (fig. III). Aktiviteterne var mindst I

I 15 henholdsvis 80 mU/mg protein og 400 mU/mg protein. I

I Gelelektroforese af enzymtopfraktionen fra "Mono"® Q I

I kromatografering ved pH 8,0_ I

I En prøve af den enzymtopfraktion der elueredes I

I 20 ved 220 mM NaCl og med en aktivitet på 408 mU/mg protein I

I overførtes til en 10%s SDS-polyakrylamid-gel efter var- I

I medenaturering i en puffer indeholdende SDS og B-merkap- I

I toætanol (fig. IV). Der konstateredes et enkelt bånd I

I fra fraktioneringen under eluering ved 220 mM NaCl. Den I

25 tilsyneladende molekylmasse af dette bånd er omkring I

I 73.000-75.000 dalton. I

Verificering af identiteten af båndet på 73.000-75.000 I

I dalton som det α-amiderende enzym_ I

I 30 Fra yderligere prøver på enzympræparater af det I

I α-amiderende enzym, renset på kriterier som er identiske I

I med de foran beskrevne, blev der brugt prøver til elek- I

I troforese på en ikke-denaturerende 10%s akrylamidgel. Der I

I blev overført prøver på 50 μΐ på hver af to baner. Efter I

I 35 elektroforese blev proteinet i én af banerne synliggjort I

I ved hjælp af sølvfarvningsteknikken. Fra den anden bane I

I blev der udskåret strimler på hver 3 mm, og hver strim- I

25 DK 175538 B1 mel inkuberedes i ét rum (well) i en mikrotiterbakke.

Til hvert rum blev der sat 100 μΐ af en blanding indeholdende Dansyl-substratetf katalase, askorbinsyre og 150 mM Tris pH 7,0. Inkubering gennemførtes i 16 timer 5 ved 37°C under konstant rystning. Prøver fra hvert rum blev derefter analyseret for omdannelse af substratet til det amiderede produkt. Der fandtes enzymatisk aktivitet i to gelstykker. Aktiviteten vandrede sammen med et intenst farvende proteinbånd i den tilsvarende farvede 10 gelbane (fig. V).

Eksempel 2

Fremgangsmåder til fremstilling af humant rekombinant- - j 5 calcitonin__

Humant calcitonin er et peptidhormon med 32-amino-syrer og som besidder en amideret prolylrest i karboxyl-enden. En mikroorganisme blev gensplejset til frembringelse af et rekombinant-funktionsprotein som indeholdt 2Q den aminosyresekvens som svarede til det humane calcitonin. Fusions-proteingenet udformedes på en sådan måde at den humane calcitonin-sekvens var indrammet af en argi-nylrest på dens aminoende og en glycylrest på dens kar-boxylende, hvilken glycylrest også afsluttede rekombi-25 nant-fusionsproteinet (se fig. VII). Efter ligatering af det humane calcitonin-gen ind i et plasmid til dannelse af det relevante fusionsplasmid blev en mikroorganisme transformeret med dette plasmid og der opnåedes ekspression af fusionen (se fig. VI). Dette proteinindeholdende 2q humane calcitonin blev isoleret fra lysater af rekombi-nant-mikroorganismerne ved udfældning. Cysteinylresterne blev derefter omdannet til S-sulfonater og lysylresterne reversibelt blokerede ved omsætning med citrakonsyrean-hydrid. Eftersom humant calcitonin ikke indeholder argi-25 nin dannedes der ved tryptisk digerering eller fordøjelse af rekombinant-fusionsproteinét-etpeptid som indeholdt den humane calcitonin-sekvens med en karboxylter-

I DK 175538 B1 I

I 26 I

minal glycin-udvidelse. Dette peptid blev isoleret en- I

I ten ved reversfase-HPLC (se fig. VIII) eller ved ionbyt- I

I terkromatografering, og dets struktur fastslået ved ami- I

I nosyreanalyse og mikrosekvensanalyse. I

I 5 Peptidets glycylrest fjernedes og den næstsidste I

I prolylrest omdannedes til prolinamid ved indvirkning I

I af det α-amiderende enzympræparat ifølge opfindelsen. I

I Et eksempel på de betingelser der blev anvendt til α-ami- I

I dering i halv-præparativ målestok af dette peptid er som I

I 10 følger: det frysetørrede peptid (200-300 nanomol; sub- I

I strat) blev opløst i 200 pi 150 mM Tris-HCl puffer pH I

I 7, indholdende ca. 750 pU af det α-amiderende enzympræpa- I

I rat. Enzymet stammede fra enten rotte-MTC-væv eller I

I brugt vævkultursmedium fra rotte-MTC CA-77 cellelinien. I

I 15 Enzymet rensedes i en sådan grad at al proteolytisk ak- I

I tivitet fjernedes. Dette opnåedes ved en kombination af I

I ionbyttekromatografering og størrelsesudelukkelses- I

I kromatografering (se den foran beskrevne fremgangsmåde). I

Rent, homogent enzym er ikke nødvendigt. Derefter sattes I

20 der askorbinsyre og kobbersulfat til blandingen i til- I

I strækkelige mængder til at give slutkoncentrationer på I

I henholdsvis 3 mM og 2 pM. Den resulterende opløsning I

gennemblandedes og inkuberedes·ved 37°C i 5-6 timer. Ty- I

I piske omdannelsesprocenter af substratet til produkt er I

I 25 70-90%. Efter fjernelse af S-sulfonatgrupperne blev det I

I humane rekombinant-calcitonin (rhCT) renset ved re- I

I versfase HPLC (se fig. IX). Slutproduktet blev karakte- I

riseret ved retentionen deraf ved reversfase HPLC (se I

I fig. X), ved kvantitativ tryptisk kortlægning (se fig. I

I 30 XI), aminosyreanalyse, og ved den biologiske aktivitet I

(se fig. XII). I alle tilfaldene var det humane rekom- I

binant calcitonin udskelneligt fra syntetisk humant cal- I

citonin. I

I Det foregående viser at præparaterne ifølge op- I

I 35 findelsen har evne til at amidere et fysiologisk rele- I

I vant substrat, fx humant calcitonin, frembragt ved rekom- I

I binant DNA-teknikker, dvs. kun L-aminosyrer. I

27 - DK 175538 B1

Sammenligningseksempler

Sammenligning af aktiviteten af præparatet ifølge opfindelsen med aktivitet af tilsvarende produkter høren- 2 de til kendt teknik____________

Sammenligning af prøvesystemer til bestemmelse af den speeifikke_aktivitet_af_præparaterne_ifølge_opfindelsen

Der er i den kendte teknik anvendt flere forskellige prøvesystemer for aktiviteten. Det meste af det 10 som kendt teknik anførte arbejde har udnyttet en prøvemetode baseret på omdannelse af D-Try-Val-Gly til D-Tyr-

Val-amid. Denne prøve kvantificeres ved anvendelse af et 125 strålingsmærket sporstof ( I-D-Tyr-Val-Gly) der er blandet med overskud af ikke-mærket materiale (D-Tyr-15 Val-Gly). Måling af omdannelse af det mærkede sporstof muliggør ekstrapolering til det umærkede materiale, og det muliggør for sit vedkommende en beregning af aktiviteten.

Mens denne prøvemetode har været anvendt af nær-20 værende patenthavere, er aktivitetsbestemmelserne af præparaterne ifølge opfindelsen baseret på direkte måling af omdannelsen af Dansyl-Tyr-Val-Gly til Dansyl-Tyr-Val- . amid.

For at muliggøre en meningsfyldt sammenligning af 25 den specifikke aktivitet af præparater ifølge den kendte teknik med præparater ifølge den foreliggende opfindelse blev der gennemført forsøg for at sammenligne prøvesystemerne.

Protokollerne kan resumeres som følger: 30 I. Moncdansyl-L-Tyr-Val^Gly

Som enzymkilde i disse forsøg brugtes der a-ami-derende enzympræparat isoleret fra karcinomsvulster fra rotteskjoldbruskkirtelmarv, og fra vævskulturmedier op-35 samlet fra CA-77-celler. Den koncentration der brugtes i alle forsøgene holdtes konstant undtagen hvor andet er angivet.

I DK 175538 B1 I

I 26 I

I Reaktionsblandingen til omdannelse af monodansyl- I

I substituttet indeholdt: I

I 5 μΐ enzym I

I 5 μΐ 30 mM askorbat I

I 5 5 μΐ 20 pm CuSO^ I

I 5 μΐ 100 pg/ml oksebugspytkirtelkatalase I

5 μΐ indeholdende 2 nmol substrat I

I 25 μΐ 150 mM TES pH 7,0 I

10 Prøverne blev fremstillet i duplikat og inkubere- I

I des ved 37°C i perioder på 10, 20 og 30 minutter. Den I

I enzymatiske reaktion standsedes ved tilsætning af 10 μΐ I

I 500 mM EDTA. Substrat og produkt adskiltes ved revers- I

I fase-HPLC under anvendelse af et Hewlett Packard-1090 I

I 15 væskekromatograferingssystem og kvantificering udførtes I

I ved hjælp af en HP-3392 integrator. Det påvistes at om- I

I dannelse af monodansyl-L-Tyr-Val-Gly til det α-amiderede I

I produkt var lineær med hensyn til tiden. I

I 20 II. ^^-I-D^Tyr-Val-Gly I

I D-Tyr-Val-Gly og D-Tyr-Val-NH2 blev joderet ved I

I hjælp af jodholdige perler fra Pierce Chemical Compa- I

I ny. Det radioaktivt mærkede substrat og produkt brugtes I

I til kalibrering af et sulfylpropyl-kationbytterkolonne. I

I 25 Der sattes 125I-D-Tyr-Val-Gly til 650 μΜ D-Tyr-Val-Gly I

I og det brugtes som substrat. Reaktionsblandingen til om- I

I dannelse af monodansyl-substratet indeholdt: I

I 5 μΐ enzym I

I 5 μΐ askorbat (30 mM) I

30 5 pi 100 yg/ml katalase I

5 μΐ 20 μΜ CuSC>4 I

5 μΐ substrat, 650 μΜ slutkoncentration I

25 μΐ 150 mM TES pH 7,0 I 1

Prøverne blev inkuberet i 10, 20 og 30 minutter I

ved 37°C. Reaktionen standsedes ved tilsætning af 500 mM I

EDTA. Hele prøven fortyndedes med 10 mM natriumfosfat- I

DK 175538 B1 29.

puffer pH 5,2 og overførtes et sulfylpropyl-kationbytter-kolonne. Substratet .binder sig ikke til kolonnen; det amiderede produkt elueredes med 500 mM NaCl. Omdannelse af det radioaktivt mærkede substrat til produktet var 5 lineær med hensyn til tiden.

III. D-Tyr=Val=Gly

De reaktionsbetingelser der brugtes til amidering af D-Tyr-Val-Gly er identisk med dem der er beskrevet 10 for dansylsubstratet og de joderede substrater. Substratkoncentrationen i reaktionsblandingen var 650 μΜ. Adskillelse af substratet og produktet opnås ved gradientelue-ring på reversfase-HPLC under anvendelse af et HP-1090 væskekromatograferingssystem. Effluenterne fra kolonnen 15 overvågedes ved 280 nm. Følsomhedsgraden ved denne prøve er langt lavere end for både dansylsubstrat og joderede substrater. For at tilpasse dette lavere følsomhedsniveau blev der udført α-amideringsreaktioner gennem længere tidsperioder, og/eller med forøgede mængder a-amiderende 20 enzym.

Analyse af de opnåede data for fraktioneret omdannelse af 125I-D-Tyr-Val-Gly til 125I-D-Tyr-Val-amid og dansyl-Tyr-Val-Gly til dansyl-Tyr-Val-amid viser at der på ethvert tidsrum var omdannet ca. 1;55 gange så meget 25 joderet substrat som dansylsubstrat. Når man således sammenligner prøvesystemet fra den kendte teknik med det prøvesystem der er anvendt i forbindelse med den foreliggende opfindelse, må der anvendes en omdannelsesfaktor på ca. 1,5 gange den aktivitet der bestemmes ved 30 dansyl-substratmetoden (den af patenthaverne anvendte).

Desuden er der anvendt en noget strengere kinetisk analyse for at sammenligne dansyl-Tyr-Val-Gly-bestemmelsen (patenthavernes) med D-Tyr-Val-Gly-bestem-melsen (den i kendt teknik anvendte). Denne analyse vi-35 ser

I DK 175538 B1 I

I 30 I

Substrat Km Vmax I

I D-Tyr-Val-Gly 37 31 I

I (kendt teknik) I

I Dansyl-Tyr-Val-Gly 1,7 21 I

^ (i forbindelse med I

opfindelsen) I

I Ved sammenligning af den maksimale hastighed I

(Vmax = pmol produkt/minut/μΐ) for de to substrater kan I

det ses at D-Tyr-Val-Gly (kendt teknik) giver ca. 1,48 I

I 10 gange så megen aktivitet som dansyl-Tyr-Val-Gly (op- I

findelsen). Dette stemmer med og beskræfter de ovenfor I

givne oplysninger. I

I Sammenligning af aktivitet I

I 15 Eipper et al. viser (PNAS) på side 5147, fig. 4 I

I et Vmax på 39 picomol pr. pg pr. time. Dette er ækviva- I

lent med en specifik aktivitet på 0,65 mU/mg protein pr. I

I minut. Dette er den højeste aktivitet der er rapporteret I

i noget af den anførte kendte teknik. Hvis man deler I

I 20 denne værdi med den foran beskrevne omdannelsesfaktor på I

1,5, finder man frem til en specifik aktivitet på 0,4 mU/ I

mg protein pr. minut. Denne værdi kan nu sammenlignes I

direkte med de foran beskrevne specifikke aktiviter som I

I er opnået ved den foreliggende opfindelse. Nærværende op- I

I 25 findere har som tidligere angivet opnået aktiveter på I

mindst 25 mU/mg protein og over 1500 mU/mg protein. Der I

I er således ved opfindelsen opnået aktiviteter der er fra I

I 60 gange til 3750 gange større end den af Eipper et al. I

(PNAS) rapporterede aktivitet. I

30 I

Eksempel 3 I

Rensning og karakterisering af α-amiderende enzymer fra I

rotte MTC-tumor_ I

25 Frosset rotte MTC-væv blev pulveriseret til gan- I

ske små fragmenter og homogeniseret i en vandig puffer I

rth I

under anvendelse af en " Poly tr onhomogen i sator. Efter I

33.

DK 175538 B1 centrifugering ved lav hastighed blev den ovenstående væske bevaret og den dannede klump blev genekstraheret med frisk puffer. Det andet homogenisat blev på ny underkastet centrifugering ved lav hastighed og denne oven-5 stående væske blev forenet med den første. De to forenede ovenstående væsker blev derefter klaret ved centrifugering ved høj hastighed og den ovenstående væske fra højhastighedsbehandlingen blev brugt som udgangsmateriale for rensning af enzymet.

10 Der gennemførtes fraktionering med ammoniumsulfat af den ovenstående væske fra højhastigheds-centrifugeringen. Hovedparten af enzymaktivitetén viste sig at blive udfældet i fraktionen med 26-40% ammoniumsulfat, og klumpen fra denne fraktion rensedes videre som beskrevet 15 nedenfor.

Der gennemførtes størrelsesudelukkelses-kromato-grafering på en "Sephacryl1^ S-300 kolonne. I eksempel 1 foran blev hele enzymet elueret fra denne kolonne i en enkelt aktivitetstop. I nærværende eksempel var kolon-20 nens længde forøget og strømningshastigheden gennem ko lonnen nedsat. Under disse nye elueringsbetingelser konstateredes der en hoved-aktivitetstop {som i eksempel 3) efterfulgt af en mindre efterfølgende top som muligvis svarer til en form for enzymet med lavere molekylvægt.

25 Det er for tiden uklart om denne lavmolekylære form for enzymet eksisterer in vivo eller er frembragt ved partiel proteolytisk fordøjelse under ekstraktions- og rensningsbehandlinger.

Hoved-aktivitetstoppen fra S-300 kolonnen blev 30 forenet og kromatograferet på en “Mono"® Q kolonne ved pH 6,0. I dette eksempel blev der anvendt en større ko-lonne af præparativ størrelse end i eksempel 1 ("Mono1^ Q HR 10/10), der blev elueret under anvendelse af en mindre stejl lineær saltgradient. Som resultat af disse 35 ændringer detekteredes der på dette trin fire toppe for α-amiderende enzymaktivitet, der elueredes ved 160 mM, 200 mM, 220 mM og 240 mM NaCl (henholdsvis toppene I,

I DK 175538 B1 I

I 32 I

I II, III og IV i figur XIII). Dette viser at der eksi- I

sterer multiple former for enzymet og at disse former I

I har en ladnings-heterogenitet. Desuden viser polyakryl- I

I amidgel-analyse af proteinerne i toppene med enzymakti- - I

I 5 vitet at toppene II, III og IV indeholder α-amiderende I

I enzym med tilnærmelsesvis samme molekylvægt (dvs. 73.000- I

I 75.000 dalton), mens top I havde et enzym med en anden, I

I sandsynligvis mindre molekylvægt. Aktiviteten i top III I

I blev renset til homogenitet på følgende måde: I

I 10 Enzymet fra toppen III blev forenet og kromato- I

I graferet på en "Mono'® Q HR 10/10 kolonne ved pH 8,0 ' I

I (fig. XIV). Det enzym som elueredes fra denne kolonne I

I som en enkelt top ved 250 NaCl, og gelanalyse viste at enzy- I

I met var renset til homogenitet (fig. XVa, bane 6). Der I

I 15 gennemførtes følgende karakteriseringsforsøg med det ren- I

I sede enzym fra top III. I

I 1. Molekylvægten af enzymet fra top III bestem- I

I tes ved analyse på 7%s polyakrylamidgel til at være ca. I

I 75.000 dalton (fig. XVb). I

20 2. Den optimale pH-værdi for enzymets aktivitet I

I bestemtes til at være pH 5,0-5,5 ved anvendelse af N I

I dansyl-Tyr-Val-Gly som substrat (fig. XVI). På grund af I

I enzymets forøget stabilitet ved neutral pH-værdi kan det I

I imidlertid .være fordelagtigt at udføre amideringsreak- I

I 25 tionen ved en sådan pH-værdi. I

I 3. Det blev konstateret at den mængde kobber der I

I behøves som co-faktor for enzymaktiviteten var omvendt I

I proportional med enzymets renhed. Enzymet renset til ho- I

I mogenitet behøvede 0,1 μΜ eller mindre Cu+ for at opnå I

I 30 maksimal aktivitet, mens rå præparater af enzymet behø- I

I vede 2 μΜ Cu++. I

I 4. Erizymets isoelektriske punkt (pi) var 4,8. I

I 5. Den specifikke aktivitet af det homogene en- I

I zym fra top III var 2100 mU/mg protein. I

I 35 Enzymet fra top II blev også renset til homoge- I

I nitet. Med dette enzym viste det sig imidlertid at "Mo- I

I no"®Q kromatografering ved pH 8,0 var utilstrækkelig I

33 DK 175538 B1 til at opnå et homogent præparat. Derfor blev de forenede mængder top II enzym fra "Mono"® Q kolonnen pH 6,0 (fig. XIII) dialyseret mod 1M Tris pH 7,0 og overført til en fenylsepharosekolonne ækvilibreret med samme puf-5 fer. Hovedparten af de forurenende proteinarter blev udvundet i strømmen gennem og ud af kolonnen,og det amiderende enzym som elueredes på et senere trin blev renset væsentligt. Yderligere rensning af det forenede enzym var fenylsepharosekolonnen på en "Mono,,,£y Q HR 10/10 10 pH 8,0 kolonne resulterede i et homogent præparat af top Il-enzymet som elueredes fra kolonnen ved eller over 220 mM NaCl.

Karakterisering af enzymet fra top II viste at: 1. Molekylvægten af top Il-enzymet, bestemt ved 15 elektroforese på 7%s polyakrylamidgel, var omkring 73.000-75.000 dalton. Således var enzymerne fra top II og top III uskelnelige ved sammenligning af deres mole-kylmasse.

2. Den optimale pH for aktiviteten af top II-20 enzymet var pH 5,0-5,5. Også denne egenskab af top Ilenzymet er det samme som for top III-enzymet.

3. Det isoelektriske punkt (pi) for enzymet fra top II var ca. 5.8.

25 Eksempel 4

Rensning og karakterisering af det α-amiderende enzym stammende fra CA-77-celle-vævskulturmedium_

En medulær skjoldbruskkirtel-karcinom-cellelinie, ~ CA-77, stammende fra rotter dyrkedes som monolagkultur i jU ^ 150 cnr T-kolber (Corning) ved 8% CO2. Kulturen holdtes i et defineret medium bestående af Dulbeccos modificerede Eagle Medium/F-10 1:1, 3,7 g/liter NaHCO^, 5 pg/ml transferrin, 10 yg/ml insulin, 30 nM selen og 4 yg/ml gen-22 tamycinsulfat. Kulturer dyrket på denne måde kunne opretholdes ubegrænset såfremt mediet ændredes hver 48. time. For at forøge stambeholdningen af celler blev der . dannet subkulturer og de dyrkedes i et medium in- 1 I DK 175538 B1

I 34 I

deholdende serum (5% hesteserum og 2,5% kalvefosterse- I

I rum) i 3 dage. Derefter vaskedes cellerne to gange med I

fosfatpufret saltvand og opfyldtes med ovennævnte bestem- I

I te, definerede medium. I

I 5 Vævskulturmedier opsamledes aseptisk over en 48 I

timers tidsplan og opbevarede ved -20°C indtil rensnin- I

I gen fandt sted. Vævskulturmedierne (rutinemæssigt 6 li- I

I ter) blev fortyndet med 2 liter deioniseret vand (3:1) I

I og tilførtes med en strømningshastighed på 50 ml/minut I

I /5) I

10 til en svag DEAE anionbytterpatron ("Cuno,My 250) som i

forvejen var ækvilibreret med 1,0 liter 20 mM bis Tris- I

I HC1 pH 6,0 ved 4°C. Det α-amiderende enzym ("α-AE") blev

I elueret fra patronen på trinvis måde med 50 mM Tris HC1 I

I pH 7,0 indeholdende 500 mM NaCl med en strømningshastig- I

I 15 hed på ca. 50 ml/minut. De fraktioner som indeholdt α-ΑΕ I

I aktivitet (specifik aktivitet 10-15 mU/mg) fra to anion- I

bytterpræparater blev slået sammen og koncentreret til 4- til 5-dobbelt koncentration under nedsat tryk un- I der anvendelse af en "Savant" RH-100 prep-rotor.

I 20 Dette materiale overførtes direkte til en 5 x 50 ih cm kolonne indeholdende "Sephacryl,,,4y 300-SF (Pharmacia).

I Den mobile fase var 100 mM Tris HC1 pH 7,0 med en strøm- ningshastigbed på 1,0 ml/minut. Al gelfiltreringskroma- tografering blev også udført ved 4°C (fig. XVII).

25 Det amiderende enzympræparat er på dette rens- I ningstrin frit for uspecifik proteolytisk aktivitet og I har en aktivitet på mindst 50 mU/mg protein. Det amide- I rende enzympræparat fra dette trin har været brugt med I held til amidering af rekombinant Gly-udvidet humant cal- 30 citonin og væksthormon-frigivende faktor. Med udgangs- f.

punkt i en celletæthed på 1-1,5 x 10 celler/ml (fra T-kolber) er der rutinemæssigt blevet opnået et udbytte på 200-350 mU amiderende enzymaktivitet/liter brugt medium efter disse to rensningstrin. Enzymet er stabilt og eg-35 net til anvendelse i opløsning eller efter immobilisering på en fast bærer.

Kolonnefraktionen indeholdende α-AE aktivitet 35 ' DK 175538 B1 blev forenet og dialyseret mod 6 liter 20 mM bis TrissHCl pH 6,0. Enzymet blev overført til en "Mono"® Q HR 10/10 stærk ionbytterkolonne {Pharmacia) i forvejen aekvilibreret med 20 mM bis Tris:Hd pH 6,0. Enzymet blev elueret fra kolonnen under anvendelse af 5 en lineær gradient af 0-300 mM NaCl over en periode på 3 timer med en strømningshastighed på 2,5 ml/minut. Der blev resolveret fire kromatografisk distinkte former for α-amiderende enzymaktivitet under dette rensningstrin.

Toppene blev nummereret i den rækkefølge i hvilken de 10 elueredes fra kolonnen (fig. XVIII). Toppene III og IV

repræsenterer højeremolekylære former for enzymet og svarer til toppen II og III stammende fra MTC-svulster. Toppene I og II repræsenterer lavere-molekylære former for enzymet som muligvis repræsenterer proteolytiske frag-15 menter af toppene III og IV.

De fire former for det α-amiderende enzym som er identificeret i laboratoriet afviger fra hinanden med hensyn til netto-overfladeladning, hvilket fremgår af deres indbyrdes afvigende retentionstider under stærk 20 anionbytterkromatografering (fig. XVIII). pH-optimum for disse fire kromatografisk distinkte former for enzymet er også forskellig. Resultaterne i fig. XIX viser at toppene III og IV har identisk pH-optimum mellem pH 5,0 og 5,5. Disse resultater er i overensstemmelse med det 25 pH-optimum som er bestemt for toppene II og III renset fra MTC-svulster. Toppene I og II har langt bredere pH-område f or aktiviteten med optimum mellem pH 5 og 8,5 (fig. XIX). Disse resultater er i nøje overensstemmelse med de pH-optima der er rapporteret af Eipper et al., 30 Peptides, bind 4, side 921-928 (1983) og Murthy et al., J. Biol Chem, bind 261, side 1815-1822 (1986).

Radiomærkning af enzym fra toppene II og IV med Na^^I efterfulgt af SDS-PAGE bekræftede at top IV-en-zymaktiviteten havde en tilnærmet molekylmasse på 73-35 75 kD, mens enzymaktiviteten af top II var under 55 kD.

Den præcise molekylvægt er ukendt for top Il-enzymets vedkommende fordi det ikke blev renset til homogenitet

I DK 175538 B1 I

I 36- I

I (der er tydeligvis flere proteinbånd til stede i området I

I 45-55 kD). I

I Enzymet fra top III og IV kan renses til homoge- I

I nitet ved hjælp af en kombination af hydrofob interaktiv I

I 5 kromatografering og stærk anion-bytterkromatografering I

I ved pH 8,0. Top IV-enzymaktivitet (fig. XVIII) blev for- I

I enet, koncentreret til ca. 2 ml i vakuum og overført di- I

I rekte til en 1,3 x 8 cm stor kolonne af fenylsepharose I

I (Pharmacia) ækvilibreret med 500 mM TrisrHCl pH 7,0. I

I 10 Fraktioner indeholdende a-AE aktivitet blev elueret med I

I en ækvilibreringspuffer med en strømningshastighed på I

I 0,5 ml/minut (fig. XX). De topfraktioner som indeholdt I

I σ-amiderende aktivitet blev forenet, dialyseret mod 50 I

I mM Tris:HCl pH 8,0 og derefter overført til en "Mono"® I

I 15 Q HR 10/10 kolonne ækvilibreret med 50 mM Tris-HCl pH 8,0. I

I Enzymet blev elueret fra kolonnen under anvendelse af I

I en lineær gradient på 0-300 mM NaCl i løbet af en perio- I

I de på tre timer med en strømningshastighed på 2,0 ml/ I

I minut (fig. XXI). Fraktioner som indeholdt a-AE aktivi- I

I 20 tet der elueredes ved eller over ca. 240 mM blev forenet, I

I reduceret til 0,001% i "Triton"®X-100 og opbevaret ved I

I 4°C. Det rensede enzyms specifikke aktivitet viste sig I

I at være ca. 1500 mU/mg protein ved pH 7,0. a-AE aktivi- I

I teten fra top III rensedes til homogenitet ved ganske I

I 25 samme fremgangsmåde som den der er beskrevet for top IV. I

I De fysisk-kemiske egenskaber for svulsttoppen (fra I

I eksempel 3) og vævkulturtop IV (fra eksempel 4), her- I

I under molekylmasse (73.000-75.000 dalton) pH-optimum oH I

I 5,0-5,5, aminoterminal sekvens og elueringsposition I

I 30 (over ca. 240 mM natriumklorid fra stærk ionbytterkroma- I

I tografering udført ved pH 8,0), viser at disse to toppe I

I kan repræsenterer samme enzym. I

I 35 I

37 - DK 175538 B1

Eksempel 5 α-Amidering af biologisk relevante peptidhormoner ved hjælp af det a-amiderende enzym_

Der er fremstillet flere forskellige rekombinant-5 peptidhormonsubstrater, herunder for lakse- og menneske-calcitonin, frigivende faktor for menneskets væksthormon og peptid genrelateret til menneske-calcitonin er blevet fremstillet og med held α-amideret ved hjælp af det α-amiderende enzympræparat ifølge den foreliggende 10 opfindelse. Til nærmere belysning beskrives i det følgende kort de fremgangsmåder der er anvendt til fremstilling af rekombinant lakse-calcitonin, menneske-calcito-nin-gelrelateret peptid og frigivende faktor for menneskets væksthormon. Lignende typer fremgangsmåder kan 15 bruges til andre rekombinant-peptider.

Lakse-calcitonin er et 32-leddet peptidhormon som har en α-amideret propylrest i sin karboxyl-ende. En mikroorganisme blev genmanipuleret til frembringelse af et rekombinant-fusionsprotein som indeholdt den amino-20 syresekvens som svarer til lakse-calcitonin. Fusionsprotein-genet var udformet på en sådan måde at lakse-calci-toninsekvensen var omsluttet af en metionylrest i sin aminoende og i sin karboxylende af en glycylrest, der også afsluttede rekombinant-fusionsproteinet. Efter li-25 gatering af lakse-calcitoningenet i et plasmid blev en mikroorganisme transformeret med dette plasmid og der opnåedes ekspression af fusionsproteinet. Dette calcito-nin-indeholdende protein blev isoleret fra lysater af rekombinant-mikroorganismen ved udfældning og dets cy-30 steinylrester omdannet til S-sulfonater. Eftersom lakse-calcitonin ikke indeholder metionin udvikledes spaltning ved hjælp af cyanogenbromid af rekombination-fusionsproteinet et peptid indeholdende lakse-calcitoriinsekvensen med en karboxylterminal glycinudvidelse. Dette peptid 35 isoleredes enten ved reversfase HPLC eller ionbytterkro-matografering og dets struktur blev fastslået ved analy-

I DK 175538 B1 I

I 38 . I

I se a£ aminosyresammensætningen og mikrosekvensen. I

I Den næstsidste prolylrest omdannedes til prolin- I

I amid ved indvirkning af det α-amiderende enzym. Et ek- I

I sempel på de betingelser der anvendtes til α-amiderin- I

I 5 gen af dette peptid er som følger: det frysetørrede pep- I

I tidsubstrat (glycin-udvidet lakse-calcitonin-prækursor, I

I 200-300 nanomol) blev opløst i 200 μΐ 150 mM Tris-HCl pH I

I 7, indeholdende ca. 750 μϋ α-amiderende enzym. Enzymet I

I kan stamme enten fra en MTC-svulst eller fra brugt vævs- I

I 10 kulturmedium fra rotte MTC CA-77 cellelinien. Enzymet I

I må renses i en sådan grad at al fremmed proteolytisk en- I

I zymaktivitet er blevet fjernet. Dette opnås som regel I

I ved en kombination af ionbytterkromatografering og stør- I

I relsesudelukkelseskromatografering {se eksempel 4). Det I

I 15 er ikke nødvendigt at enzymet er rent og homogent. Der- I

I efter sattes der askorbinsyre og kobbersulfat til bian- I

I dingen i tilstrækkelige mængde til at give slutkoncen- I

I trationer på henholdsvis ca. 3 mM og ca. 2 μΜ. Der kan I

I også inkorporeres katalase {7,5 pg/ml), ætanol (1 rum- I

I 20 fangs%) og kaliumjodid (50 mM) i reaktionsblandingen for I

I at forbedre udbyttet af α-amideret lakse-calcitonin. Den I

I resulterende opløsning gennemblandedes og inkuberedes I

I ved 37°C i 5-6 timer. I

I Efter fjernelse af S-sulfonatgrupperne ved be- I

I 25 handling med ø-merkaptoætanol blev rekombinant-lakse- I

I calcitoninet renset ved reversfase HPLC. Slutproduktet I

I blev karakteriseret ved dets retention på reversfase HPLC, I

I kvantitativ tryptisk kortlægning og aminosyreanalyse. I I

I alle tilfælde var rekorobinant-lakse-calcitoninet udskel- I

I 30 neligt fra syntetisk lakse-calcitonin. I

I Humant calcitonin-genrelateret peptid er et pep- I

I tidhormon med 37 led og indeholdende en α-amideret fe- I

I nylalanylrest ved karboxylenden. Fusionsprotein-genet I

I var udformet på lignende måde som lakse-calcitoninet I

I 35 (se ovenfor) for så vidt som den humane calcitonin-gen- I

I relaterede peptidsekvens var indrammet af en metionyl- I

I rest i aminoenden og i karboxylenden af en glycylrest I

39 · DK 175538 B1 som også afsluttede rekombinant-fusionsproteinet. Frigørelse, rensning, α-amidering og karakterisering af præ-kursoren for det rekombinante humant-calcitonin-genrela-terede peptid blev også udført på en måde som er analog 5 med den der anvendtes til det rekombinante lakse-calci-tonin.

Den humane væksthormon-friqivende faktor (hGHRF) er et peptidhormon med 44 led og indeholdende en a-ami-derende leucylrest ved sin karboxylende. Fusionsprotein-10 genet for hGHRF var udformet på en sådan måde at amino-syresekvensen for peptidhormonet var indrammet af en tryptofanylrest på sin aminoende og på sin karboxylende af en glycylrest som også afsluttede rekombinant-fusionsproteinet. Det hGHRF-indeholdende fusionsprotein 15 blev isoleret fra lysater af rekombinant-mikroorganismen ved udfældning. Ikke-hGHRF-delen af fusionsproteinet blev denatureret ved omdannelse af cysteinylresterne til S-sulfonatderivater. Eftersom hGHRF indeholder tryptofan førte kemisk fordøjelse af rekombinant-fusionsproteinet 20 med reagenset BNPS-skatol til oxidativ spaltning af fusionsproteinet, hvorved der udvikledes ikke-amideret hGHRF med en karboxylterminal glycinforlængelse.Samtidig blev metionylresten i stilling 27 i hGHRF-molekylet oxideret til metioninsulfoxid. Dette glycin-udvidede peptid 25 blev isoleret ved gelfiltrering og reversfase HPLC. Dets struktur blev fastslået ved aminosyreanalyse af de fragmentpeptider der dannedes ved fordøjelse med trypsin.

Den næstsidste leucylrest blev omdannet til leu-cinamid ved indvirkning af det α-amiderende enzym ifølge 30 den foreliggende opfindelse. Et eksempel på de betingelser der brugtes til fremstilling af α-amideret hGHRF er som følger: det frysetørrede peptidsubstrat (20-40 nanomol) opløstes i 150 pi deioniseret vand og blandedes med 90 μΐ (500 pU; pH 7,0) α-amiderende enzympræparat 35 stammende enten fra rotte-MTC-svulst eller brugt vævskulturmedium fra rotte-cellelinien CA-77. Enzymet var blevet renset for at fjerne al fremmed proteolytisk en-

I DK 175538 B1 I

I 40 . I

I zymaktivitet ved en kombination af størrelsesudelukkel- I

ses-kromatografering og ionbytterkromatografering. Der I

I sattes derefter askorbinsyre og kobbersulfat til bian- I

I dingen af enzymet og substratet i tilstrækkelige mængder I

5 til at give koncentrationer på henholdsvis 3 mM og 2 μΜ. I

I Den resulterende opløsning gennemblandedes og inkubere- I

I des ved 37°C i 4-6 timer. En typisk omdannelsesprocent I

fra substrat til produkt er 95%, baseret på aminosyre- I

I analyse af de fragmenter der frigøres ved fordøjelse med I

I 10 trypsin. Til slut blev metioninsulfoxidresten reduceret I

I til metionin ved indvirkning af 4M β-merkaptoætanol puf- I

I ret til pH 4 med 10 mM natriumacetat ved 80°C i 1 time. I

I Slutproduktet rensedes ved reversfase HPLC og karakterise- I

redes ved retentionstiden, analyse ved tryptisk fordø- I

I 15 jelse og aminosyreanalyse. Det rekombinante σ-amiderede I

I produkt blev også afprøvet for biologisk aktivitet. I I

samtlige tilfælde var rekombinant-hGHRF uskelneligt fra I

I syntetisk hGHRF. I

I Foruden de ovennævnte undersøgelser blev to kom- I

20 mercielt tilgængelige glycinudvidede peptidhormoner eva- I

I lueret for deres evne til at virke som substrater for I

I det α-amiderende enzym. Det drejer sig om prækursorer I

I til det a-melanocytstimulerende hormon og substans P. I

I begge tilfælde viser resultaterne at begge peptider I

I 25 er egnede som substrater for det α-amiderende enzym. I

I Eksempel 6 I

I Sekvensanalyse af renset α-amiderende enzym fra rotter I

I 20 Fraktioner indeholdende renset α-amiderende enzym I

I blev slået sammen fra enten MTC-svulstvæv fra rotter el- I

I ler ovenstående væsker fra en CA-77 cellekultur, og en- I

I zymets sulphydrylgruppe blev underkastet reduktion efter- I

I fulgt af karboxymetylering. De resulterende reaktions- I

I 25 blandinger blev derefter overført til en "Vydac" C4 re- I

I versfase HPLC-kolonne (partikelstørrelse 5 μΜ, porestør- I

I relse 33 nm) som var blevet ækvilibreret med 0,1%s van- I

41- DK 175538 B1 dig triiluoreddikesyre. Kolonnen blev vasket med denne opløsning for at fjerne overskud af puffersalte. Det af-saltede enzym fjernedes fra HPLC-kolonnen ved eluering med 80%s acetonitril indeholdende 0,08% trifluoreddikesyre.

5 Effluenten fra kolonnen blev overvåget ved UV-detektering ved 220 rnn. De resulterende proteinfraktioner opsamledes, forenedes og frysetørredes. Derefter genopløstes dette materiale i 100 μΐ 0,01% SDS og overførtes derefter til et protein-sekvensbestemmelsesapparat, Applied Bio-10 systems model 470A. Procedure der bruges til mikrose- kvensanalysen var den der er specificeret af Applied Biosystems. De resulterende fenyltiohydantoin-aminosy-rer blev analyseret ved HPLC på en "Hypersil" Cl8 kolonne (partikelstørrelse 5 pm, porestørrelse 10 nm) med ab-15 sorption overvåget ved 269 og 313 nm på et Hewlett-Packard 1090 væskekromatograferingssystem. Den aminotermi-nale sekvens for komponentenzymets hovedtop (top III) fra svulstvævet var som følger: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 2q NI^-Ser-Phe-Ser-Asn-Glu-Cys-Leu-Gly-Thr-Ile-Gly-Pro-Val- 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Thr-Pro-Leu-Asp-Ala-Ser-Asp-Phe-Ala-Leu-Asp-Ile-Arg-Met- 28

Pro

Aminoterminale sekvensdata for hoved-komponent-25 formen for enzymet (top IV) for ovenstående væsker fra CA-77 cellevævskultur viser at det er identisk med det fra svulstvævenzymet (top III). Der opdagedes imidlertid også en mindre komponent under mikrosekvensanalysen af dette enzym, og den synes at indeholde en aminoterminal-30 udvidelse i sammenligning med hovedformen af det a-ami-derende enzym. Tilstedeværelsen af denne komponent skyldes sandsynligvis differentiel post-translationel behandling af enzymet. Den aminoterminale aminosyrese-kvens for denne komponent var som følger: 35 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 11 IM^-Phe-Lys-Glu-Thr-Thr-Arg-Ser-Phe-Ser-Asn-Glu-Cys- 1 14

Leu-Gly -

42- I

DK 175538 B1 I

Yderligere data for aminosyresekvensen opnåedes

for det α-amiderende enzym fra rotters MTC-svulstvæv på I

følgende måde: ca. 400 yg renset enzym underkastedes reduktion I

og karboxymetylering. Efter denne behandling blev enzym- I

5 opløsningen overført til dialyserøret og dialyseret i I

18 timer mod 25 mM Tris-HCl pH 8,0/0,5M urinstof. Reten- I

tatet overførtes derefter til et 1,5 ml stort centrifu- I

gerør og koncentreredes til et rumfang på 600 μΐ under I

nedsat tryk. Til enzymopløsningen sattes der 2 μΐ (2 pg) I

10 trypsin og blandingen inkuberedes i 1 time ved 37°C. På I

dette tidspunkt tilsattes der en anden portion trypsin

(2 yg) og inkuberingen fortsattes i 2 timer ved 37°C. I

Fordøjelsen afsluttedes ved tilsætning af 200 yl 4M I

urinstof/10%s eddikesyre. Fordøjelsesproduktet blev der- I

15 efter overført til en "Vydac" Cl 8 reversfase HPLC-ko- I

lonne (partikelstørrelse 5 yin, porestørrelse 33 nm) som I

var blevet ækvilibreret med 0,1%s vandig trifluoreddi- I

kesyre. Kolonnen blev derefter elueret med en lineær gra- I

dient af acetonitril til en koncentration på 50% i løbet I

20 af en periode på 4 timer og der opsamledes fraktioner I

med to minutters mellemrum. De resulterende karakteri- I

stiske reversfase HPLC-elueringstoppe for det tryptiske I

fordøjelsesprodukt af enzymet er vist grafisk i fig. I

XXIII. Tre af de resulterende tryptiske peptider blev I

25 underkastet automatiseret sekvensanalyse som beskrevet I

ovenfor og resultaterne er anført nedenfor. Peptider er I

betegnet med deres fraktionsnummer. I

Tryptisk peptid nr. 65 I

30 -Ser-Met-Gln-Pro-Gly-Ser-Asp-Gln-Asn-His-Phe-Ser-Gln- I

Pro-Thr- I

Tryptisk peptid nr. 58 I

-Asn-Gly-Gln-Trp-Thr-Leu-Ile-Gly-Arg- I

35 I

Tryptisk peptid nr. 86 I

-Phe-Val-Thr-Gln-Trp-Gly-Glu- I

43 DK 175538 B1

Eksempel 7

Molekylær kloning af det gen eller de DNA-sekvenser som koder for det α-amiderende enzym fra rotte-MTC- eller CA-77-celler_ 5 Evnen til at klone det gen eller den DNA-sekvens som koder for det α-amiderende enzym stammer fra flere kritiske informationskilder og reagenser. Man må opdage en pålidelig kilde til enzymproteinet, der så vil fungere som kilde til enzymets budbringer-RNA (mRNA) og 10 til syvende og sidst dets komplementære DNA (cDNA). Isolering af enzymets gen eller cDNA fordrer også en molekylær probe saner specifik for det pågældende enzym. Generelt har denne molekylære probe den ene af to former, det er enten et oligoniikleotid hvis sekvens er komple-15 mentær til en del af enzymgenet, eller det er et antistofmolekyle (eller en samling af antistofmolekyler) som genkender enzymproteinet specifikt. Udvikling af disse molekylære prober fordrer opdagelse af en sådan fremgangsmåde til rensning af enzymet, at enten enzymets 20 specifikke antistoffer kan fremstilles eller at enzymets aminosyresekvenser kan bestemmes så man kan udforme oli-gonukleotid-prober. Disse opdagelsesbetingelser er tilfredsstillet for så vidt angår det α-amiderende enzym ifølge den foreliggende opfindelse.

25 Det α-amiderende enzym blev renset fra konditio nerede medier på basis af rotte-MTC-væv og rotte-CA-77-celler. Det blev derved fastslået at disse cellekilder ville indeholde det mRNA som koder for enzymproteinet.

De fremgangsmåder som er blevet anvendt til fremstilling 30 af cDNA for det α-amiderende enzym er velkendte på molekylærbiologiens område.

Specifikke protokoller for disse forskellige metoder kan findes i laboratoriehåndbøger såsom Molecular Cloning (1982), DNA Cloning (bind 1), a Practical Ap-35 proach (1985) eller primære litteraturreference såsom V. Gubier & B.J. Hoffman, Gene, bind 25, s. 262-269 (1983); eller

I DK 175538 B1 I

I 44 I

I R.A. Young og R.W. Davis, PNAS, bind 80, side 1194-1198 I

I (1983). Disse fremgangsmåder er generelt anvendelige når. I

I den kritiske variable er kilden det udnyttede mRNA. For I

I at fremstille cDNA som er specifikt for amideringsenzy- I

I 5 met har nærværende opfindere anvendt både mRNA fra rot- I

I te-MTC-væv og mRNA fra CA-77-celler. De dobbeltstrengede · I

I cDNA-prøver som blev syntetiseret blev derefter anvendt I

I til at fremstille særskilte genbibliotekér ved velkend- I

I te fremgangsmåder. I

I 10 Som diskuteret foran fordrer identificering af de I

I særlige cDNA’er for det α-amiderende enzym-mRNA moleky- I

I lære prober som kan skelne disse rekombinanter fra andre I

I rekombinanter i et givet bibliotek. Eksemplerne 3 og 4 I

I angiver detaljer om de rensninsmetoder der brudes til at I

I 15 fremstille det enzym som er nødvendigt for at frembrin- I

I ge molekylære prober. Eksempel 6 beskriver anvendelse af I

I dette protein til at bestemme aminosyresekvenser mens I

I eksempel 8 beskriver anvendelse af det rensede protein I

I til at fremstille enzymets specifikke antistoffer. I

I 20 Aminosyresekvenserne ifølge eksempel 6 er tilstræk- I

I kelig til at udvikle specifikke selektive oligonukleo- I

I tidprober. Ved fremstilling af oligonukleotid-prober er I

I flere faktorer betydningsfulde for at gøre proben selek- I

I tiv. En fuld diskusion af disse overvejelser kan findes I

I 25 hos R.J. Lathe, J. Mol. Biol., bind 183, side 1-12 (1985). I

I Eftersom i almindelighed mere end én nukleotidsekvens I

I kan indkode en og samme aminosyresekvens (et princip der I

I kendes under betegnelsen degeneration af den genetiske I

I kode) vil en hvilken som helst nukleotidsekvens kun re- I

I 30 præsentere én af et antal potentielle gensekvenser. For I

I at garantere at en oligonukleotid-probe vil identifi- I

I cere genet af interesse, kan man fremstille en ækvimolær I

I blanding af alle de mulige oligonukleotidsekvenser som I

I kunne kode for aminosyresekvenser som er specifikke for I

I 35 amideringsenzymet. Kompleksiteten af sådanne blandinger I

I gør dem ofte mindre end absolut selektive, og der må så- I

I ledes i almindelighed bruges oligonukleotidblandinger I

45 DK 175538 B1 som svarer til mere end én regionaminosyresekvens fra et protein for at opnå absolut specifik selektivitet for et givet gen.

Alternativt kan man også fremstille et oligonu-5 kleotid som er selektivt for genet af interesse ved at fremstille en eneste nukleotidsekvens med tilstrækkelig længde til at selv svagt ufuldkommen komplementaritet til det ønskede gen vil frembringe en stabil hybrid. Denne enestående sekvens vil have en meget ringe (længdeaf-10 hængig) sandsynlighed for at danne en stabil hybrid med andre gensekvenser. Den enestående sekvens indeholder det mest hyppigt anvendte kodon for hver aminosyre i proteinsekvensen. Frekvensen af kodonudnyttelse for en given art kan bestemmes ved kompilering af kendte gense-15 kvenser for proteiner hørende til den givne art. Disse metoder er velkendte for de sagkyndige inden for molekylærbiologiens område.

Endnu en anden fremgangsmåde som kan anvendes til at fremstille specifikke oligonukleotid-prober indebærer 20 inkorporering af deoxyinosinrester i oligonukleotidet ved positioner med maksimal degeneration. Denne nukleotid-udskiftning tjener til at nedsætte degenerationen af pro-beprøven og kan følgelig have gunstige virkninger på selektionsprocessen (med hensyn til diskusion af anvendel-25 se af desoxyinosin i en oligonukleotid-probe, se Ohtasu-ka et al., J. Biol. Chem., bind 260, side 2605-2608 (1985).

Nærværende opfindere har anvendt de a-amiderende enzymproteinsekvenser til at planlægge en række forskel-30 lige oligonukleotid-prober som er nyttige til at isolere amideringsenzymets cDNA. De anvendte sekvenser og de fremstillede prober er vist i tabel II. Det vil forstås at når en sagkyndig molekylærbiolog er blevet forsynet med aminosyresekvenserne, så kan han udvikle alternative 35 strategier til isolering af genet ved probe-hybridise-ring.

De således udviklede oligonukleotid-prober er

DK 175538 B1 I

46 I

blevet anvendt ved vel fastslåede metoder (se Molecular

Cloning 1982) til at gennemgå både plasmid- og bakterie- I

fag-cDNA biblioteker og til at isolere α-amiderende en- I

zym-cDNA'er. I

47 DK 175538 B1 Ό O ΌΟ tQTJ tn >

Kl— Kl- (D K (D 3 Mi (D i-h OH. OH· DO ** H·

£ΓΛ CTiQ 01 1_I. < D O ** (D

(DO (DO (DH· (DO O O ft D D ** o D in Z 3

> C > C <(D to ►< > Ό Q

M ** M>sr (DK ·· κ ·Η·ια

ι_η m D(D (D (D tu (D

(D (D ID α 3 3 3

O O (D (D D (DH-D

ft rt- K K D Oi (D

Η· H· · · rt (D

Qj α ft K rt il K (D D> (D D O*

Qi (D O (D I- H* U) OJ LH H- (D O'

- - iQ 3 (D

►3 i3 > > O N m

►3 i3 >10-. 3 ►< KJ

O > Cl > O *3 3 C 3 tn

** i (D

O O Cl Cl t- »O K

O O O I- to h3 (D K

> Cl i-3 O i-3 Cl > O >< K O O D)

·< rt rt H

Cl Cl O Cl Ό H- (D h1 »3 t3 > i— w ft DjH-(Di3 •3 0 *3 0 > Cl 3 H· ID D) in Ό · O. cr

> > ·3·-3 ** K (D (D

o o ci k ί. όσιό O CIO ft CTD3

O (D Di C M

•3 *3 >*3 Ό K (D I— H

Cl Cl O 3“ m K H-

ui t n Cl > i-3 O K D tn iQ

- K O Dj (D

►3 0 t-1 · 3 (D

►3 (D O t ua

Clt30Cl C tn (D Ό (D

CD K K D

> H O tn

►3 H 3 <—l. (D

> O i3 (D *<·--* rt o <

Cl Cl rt (D (D

Cl H oo H· K D

•3 Cl > O *< iQIDtn

(D D< (D

> O > »K

Cl K to rt •3 O > Cl iQ π- men

ui I— (D O

3 H· <

Di (D tn (D D <

3 III H

rt (D K

Η· K (D

fti K

H· (D O K rt (D H-

K Di M H· (D

3 K C vD D· < <

O H· {U

vQ tn i— ft Ifl η· rt

tn 3 (D O O

I— iQ K

(D I— tD K (D iQ H· H-

3 Di O »O ι-h 3 <D K

I DK 175538 B1 I

I 48 I

I Ό O Ό O ΌΟΌΟ SS?I? s?> I

HV-* η H4 If (—1 H H4 fD fD M 0 3

I Oh· Oh· O η· O h· ·"< 3 O £· I

I OT<a CTiQ tT*Q CJ“vQ Ul lj. < 3

I too oo oo oo 2LtT 2 £ I

a333 X O 3 .01

I pG>C & G > G I

I C3X WX MX WX - O* "m I

I —* φ O (D (DO < Oj

1 0 00003 I

I r+ er r+ rt ? U

I H. H· H· H-

Cl· Cl· Cl· £l· U1

ill'- I

I > -3 M

. . O > -3 O *1

I -3 ^ > 2 I

- > > *i ro ίο O O Ω rr

I o o π o I

*3 *-3 > h* ω *3 O *-3 O > O 3

I Ω Ω n *d I

ω ω n *i o*

hi *h Ω O > *-3 O

I η η ω o I

O η Ω h· tn I H* Hl *9Ω>Π η

I >-3 > > *a m s I

I [j »j O O O O (D oi pk.

I . η > η. ω > o *3 *n £

I n oon ώ > ϊ. I

I *-i *-3 »-3 ^ I >Ω >Ω >Ci >Ω *-3 Ci Ό ^

I Ω Ω Ω Ω O Ω ,2 I

H *-3 »-3 *3 > h4 oo ” I *3 n *-30 *-3 Ω >Ω 3 3

I »3 ►a *a >->?’ I

I *"3 *3 >-3 fn >-3 .„ is» tfl vo

I >ω >ω “ °l 3 g, I

I Ω Ω OS 1 I

l~3 H Js* »*· I—· > Ω > Ω >-3 O M o

I > > H T3 I

I .. -3 3* M

I __ βΟΟΗ*

I > *a w I

Ω O (DM

Ω > H3 O 3 N3 I nol

> Μ M

I > Ω 3 ω

I n v I

I O 3 M

I Ω »· *3 O O ·«“

> -3 I

I n stm I Qn>3u Ί oi 49 DK 175538 B1 Ό O W Ω W > M t-· CD CD ·* <D 3 O- H· H 3 O * £·.

U) LJ- < D

(D O CD »— CD O

a ?cn 3 te > C < cd U) ><

M *· CD >1 "S

vr> t—1 3 CD CD

cd i α o CD 3

rt H

H- * O.

l*> CJ1

S i Ό H

Z> *-3 3* H “ Ω > . OHI ® £

*O

Π Ω < rt > H DJ to £' -*n > *3 n o ►- « *4 > ►s Ω Ω a* oj t"* *-· n α > *3 n ·-» o Ό ω n o *4 >* M rfk 3 ►3-n >Q 3 * • δ ** *3 m Q o *n t n ® · n o tj ® n g o Q _ Cl j-· σ\ ηπ n ft *3 > a. w:

Π Ω O

•3 > M -J

tn > Cl C

- U)

I DK 175538 B1 I

I 50 I

I m o *T3 tn > > O >0 rn m w mg I

I -sis II i se Ξ£ sss s·* i

I ^ ^ ^ j -λ iq ·· (Λ i—i· ^ 3 I

I -“ϊ <3 O o n> (KO I

I ® f;· 5 o i 2 2 n 3 w I

I <8 2«j § I ss :¾ I

I S 3 “ S £ £ = s. I

I i o, n> n> I

I »d o o * S I

I r £ £ «- · I

I & & I > -3 w _ ^ > -3 cn on»*-* V *2 on (1)1-- O n -3 -i u> 2 * o > -3 n -t I o o I o > σ' σ -a *tj > in to ! ft σ H sr to

-a η *σ o | -a n ro I

I ho! > -3 w I

-3 3*n> .. era o ro u>

I n-a o> m } ~ a>-a n -i I

I ω > ! 3 > > I

I η η- n> 5 > tn ip*

Ci > -3 n CB to | ** 0-3 3

I -ant·'! Q ω α I* I

I _ -3 re to 2 > . t- ui p.

I n > -a o c ω { n > ci c g

I Λ > ! £ -3 0 ° I

I >ww Q οκσ»Α I

I -an ό *- } ωη »an« £ I

I 5 ~ ί >"> t- fL I

I > -3 n ro tn | n n n > -a o c 5, I

I > η > { no ο η M I

I -an>o ua m j ΜΛ λ -an> η *< S I

I >2: I n n > -a < I

I -3 (DM y S O 2r*VO m

I a rr->i I “ o>-3 n -t S I

I o * i $3 s > ~ κ I

I __n no ,_ ζ C -a ·— w I o 0 > -3 ο ο 1 ^ ^ > 0 -a mo

I inn η η I

I 01-1--

I I Ω ° . -a ο > o *< *-* I

I ΐ η * η η ό I

I wSoS ni»- I } **** on> -a 0 ro

I I G G ci < I

I I w Λ Λ ,Λ H ØJ Μ I

I j >-ao o »-ω

I I ^ *“3 kJ I

I { acnn OSTM I

I ! S η ό I

I o n -» h> I , n o > -a o o en

I I 2 -a o r* I

I r> -3 λ m I { n o > -3 o e o%

I G Cl > I

I j > n -a ό ό I

I ! Ω Cl > I

I n n i- m I 1 ^ n > -3 n tu m 51 DK 175538 B1

Eksempel 8 A. Udvikling i mus af monoklonale antistoffer som er specifikke for ot-amideringsenzym_

Elleve mus af stammen Balb/cJ blev immuniseret og virk-5 ningen forstærket med rensede præparater af amiderings-enzymet. Disse mus blev åreladt og serummet behandledes og titreredes mod det rensede enzym ved en ELISA-prøve. Prøven (de anvendte teknikker er velkendte) udførtes ved at det rensede enzym absorberes på en polystyrénplade 10 som derefter vaskedes og blokeredes (for at forhindre u-vedkommende binding af antistofferne til pladen) med ok-seserumalbumin (BSA). De fortyndede musesera (som indeholdt de formodede antistoffer mod det amiderende enzym) blev derefter inkuberet på den amiderings-enzym-coatede 15 plade og vasket. Et andet antistof (mærket med en markør, alkalisk fosfatase, som netop beskræftelse af bindingen af det første antistof til det pladebundne enzym) blev derefter inkuberet i rummene (wells). Efter vask og tilsætning af en substratopløsning blev signalet over-20 våget kolorimetrisk ved hjælp af et spektrofotometrisk registreringsapparat. "Positive" sera udviste et forhold signal/"støj" på mindst 2:1.

Mus nr. 7, der udviste en høj titer ved ELISA-prøven, blev dræbt 4 dage efter den sluttelige forstærk-25 ning. Milten fjernedes aseptisk og blev mekanisk nedbrudt til frembringelse af i alt 132,6 x 10® splenocyt-ter der blev fusioneret til 122,8 x 10® NS-1 myelomcel-ler med 1,28 ml polyætylenglykol 4000. Cellerne blev fordelt i fem plader med hver 24 rum (wells) som i forvejen 30 var blevet coatet med Balb/cJ thymocytter og splenocyt-ter,der fungerede som foderceller. Cellerne opretholdtes i selektive HAT-roedier, der kun tillader overlevelse af hybridcellerne.

De ovenstående væsker fra 116 rum, der udviste 35 klonal vækst, blev screenet ved radioimmunbestemmelse og ELISA-metoder for antistofproduktion. Radioimmunprøve-metoden lignede den foran beskrevne ELISA-prøve, men med

DK 175538 B1 I

52 I

125' I

den forskel at det andet antistof var mærket med I

og de radioaktive tællinger blev målt ved hjælp af en I

gammatæller. I

56 af de 116 rum var positive med hensyn til an- I

5 tistofproduktion og blev derefter screenet for radioak- I

tivitet til α-amiderende enzymer. 25 kloner som viste sig I

at være positive for de α-amiderende enzymer blev klonet I

ud ved en seriefortyndingsproces. De primære kloner I

blev screenet både mod α-amiderende enzymer og BSA {ef- I

10 tersom polystyrenpladerne var blokeret med BSA, kan an- I

tistoffer som var bundet til pladen muligvis blot være bundet I

til eller absorberet af okseserumalbuminet på uspecifik I

måde) for at bestemme om de faktisk var specifikke for I

det amiderende enzym. Kloner som viste et signal for det I

15 α-amiderende enzym, som var mindst det dobbelte af det I

der var påvist for BSA blev klonet ud i et fordelings- I

forhold 1 celle/2 rum. I

21 positive hybridomer (se tabel III) overførtes I

til det tertiære kloningstrin og 20 af dem karakterise- I

.20 redes med hensyn til antistofklasse ved både Ouchterlony- I

og ELISA-teknik. 17 af klonerne har IgG2a tunge kæder og I

3 har IgG1 tunge kæder. Alle de 20 typer henførte kloner I

udskiller antistoffer med kappa-lette kæder. I

Hver af linierne blev dyrket individuelt i mas- I

25 sekultur og celleprøver blev frosset i flydende nitro- I

gen. Pristan-præparerede mus af stammen Balb/cJ fik in- I

traperitoneale indsprøjtninger med 5 x 10^ hybridomcel- I

ler. Senere fik mus som ikke udviste angreb af ascitiske I

svulster en forstærkningsinjektion af celler. Ascites- I

30 væske og blod blev fjernet 1-2 uger senere. Efter behand- I

ling blev ascites og sera screenet og titreret mod det I

ct-amiderende enzym såvel som mod negative antigener (fx

okseserumalbumin, ægalbumin, karbonsyreanhydrase og I

væksthormon-frigivende faktor) for at sikre antistof- I

35 specificitet.

53 DK 175538 B1

Tabel III

Monoklonale Balb/c a-amideringsenzym-cellelinier

Cellelinie Tung kæde Titer1 5 4-1-4-20-3 IgG2a -1:5.000 4-1-4-18-1 IgG2a 4-5-7-3 IgG2a -1:5.000 4-2-3-17-7 IgG2a 3- 7-1-20-24 IgG2a -1:10.000 10 4-8-15-2-6 IgG2a 4- 7-21-14-9 IgG2a 4-10-45-1-16 IgG2a 54-2-1-39-2 IgG2a -1:10.000 4-6-12-3-17 IgG2a 15 52-1-31-24-2 IgG2a 4-3-11-46-1 IgG2a 3- 7-9-9-3 IgG2a 86-1-38-15 IgG1 1:1.000 4- 5-6-1 IgG1 1:1.000 20 4-4-24-3-5 IgG2a -1:5.000 4-11-3-1-8 IgG1 8-9-94-4-2 IgG2a 4-10-30-3-1 IgG2a 75-10-17-14-4 IgG2a 25 92-10-26-32-39 Ej klassificeret 1 Ascitesvæsker blev titreret med 100 ng rent enzym ved en fastfase ELISA. 1 2 3 4 5 6 B. Rensningsproces for monoklonale antistoffer frem- 2 bragt i mus__ 3

Monoklonale antistoffer som var specifikke for 4 det a-amiderende enzym fremstillet ved de foran beskrev 5 ne fremgangsmåder blev renset på følgende måde. Ascites- 6 væske opsamlet fra flere mus som var podet med samme klon blev brugt som kilde til antistof. Ascitesvæsken fortyndedes (5 gange) med 10 mM MES pH 5,6. Den fortyn-

I DK 175538 B1 I

I 54 I

I dede ascitesvæske overførtes til en 1,5 x 20 cm stor ko- I

I lonne indeholdende 40 pm ABX blandet-måde silicaharpiks I

I (J.T. Baker) i forvejen ækvilibreret med 10 mM MES pH I

I 5,6 puffer. Monoklonale antistoffer blev elueret fra ko- I

I 5 lonnen under anvendelse af en 0-500 mM natriumacetat pH I

I 7,0 gradient. De fraktioner som indeholdt de rensede an- I

I tistoffer blev forenet, afprøvet for specifik aktivitet I

I og opbevaret ved 4°C indtil de skulle anvendes. I

I 10c. Udvikling i høns af polyklonale antistoffer som er I

I specifikke for o-amiderende enzym_ I

I Der blev givet intravenøse, intramuskulære og I

I subkutane injektioner til to læggehøner med i alt ca. I

50 pg af det rensede α-amideringsenzym i Ribi adjuvans I

I 15 for hver høne. Ribi adjuvans er et fuldstændigt metabo- I

liserbart lipid-emulsionssystem som består af et mito- I

I gen for hønse-lymfocytter og et adjuvans for at forøge I

I antistofreaktionen på antigener i fjerkræ (Ribi Immuno- I

I chem Research, Montana). Efter den indledende immunise- I

I 20 ring blev der givet to forstærker-injektioner med mel- I

I lem på to uger og i en mængde på ca. 30 pg af enzymet I

I pr. høne. Dyrene blev åreladt på dag på nr. 21 og dag I

I nr. 35 og de udtagne sera blev behandlet og screenet for I

I tilstedeværelse af specifikke antistoffer ved følgende I

I 25 fremgangsmåde: sera fra begge høns, dag 0 (før immuni- I

seringen), dag 21 og dag 35 blev screenet ved en fast- I

I fase ELISA-prøve mod 100 ng renset α-amideringsenzym. I

I Der brugtes okseserumalbumin som negativ kontrol for u- I

I specifik antistofbinding. De enzymspecifikke antistof- I

I 30 fer blev detekteret med kanin anti-hønse IgG sera mær- I

I ket med alkalisk fosfatase. I

I Resultaterne af de ovenfor beskrevne procedurer I

I beviste at der kunne detekteres specifikke antistoffer i I

I serummet fra høne nr. 257 på dag 35. Serum fortyndet 1: I

35 10.000 gav et forhold mellem signal og "støj” på ca. I

I 4:1. Høne 258 viste enzymspecifikke antistoffer på dag I

I 21 og dag 35. Fra begge åreladninger gav sera fortyndet I

55 DK 175538 B1 1:10.000 et forhold signal/"støj" på ca. 4:1. Indsamling af æg fra begge høner begyndte på dag 56. IgY'er isoleret ved fældning med polyætylenglykol af førimmuni-serings-æg og efter-immuniserings-æg blev analyseret ved 5 Ouchterlony-teknikker og enzymspecifikke antistoffer blev screenet ved ELISA.

D. Rensning af IgY-antistoffer fra høns

Der blev dannet polyklonale fugleantistoffer som 10 er specifikke for det ct-amiderende enzym i høns på den ovenfor beskrevne måde. Æg fra immuniserede høner indsamledes og blev enten indlejret i paraffin eller fros-set indtil anvendelse med henblik på rensning af IgY. Æggehviderne blev adskilt fra blommerne, der indeholder 15 de a-amideringsenzym-specifikke antistoffer. Æggeblom

merne blev fortyndet 3 gange med 10 mM natriumfosfat pH

7,5 indeholdende 0,1M NaCl og 0,01% natriumazid. Der gennemførtes et indledende fældningstrin med polyætylenglykol (PEG) idet der brugtes en slutkoncentration på 20 3,5% PEG 8000. Man lod bundfaldet danne sig i 30 minut ter ved stuetemperatur hvorefter der centrifugeredes og den ovenstående væske (indeholdende IgY) blev opsamlet.

Der sattes yderligere PEG til den ovenstående væske for at bringe slutkoncentrationen til 12,5% PEG. De IgY-an-25 tistoffer som udfældedes ved denne koncentration af PEG blev pelleteret ved centrifugering. IgY-antistofferne på dette rensningstrin blev renset yderligere ved to metoder : 1) De udfældede IgY-antistoffer blev suspenderet 30 på ny i 10 mM MES pH 5,6 og derefter dialyseret natten over ved 4°C mod denne samme puffer. Derefter blev prøven overført til en 1,5 x 20 cm stor kolonne indeholdende 40 pg, blandet-måde ABX silicaharpiks (J.T. Baker).

Den efterfølgende rensningsforskrift var identisk med 35 den som er beskrevet for ascitesvæske.

2) Ved den anden metode blev klumpen indeholdende IgY suspenderet på ny i startpufferen og derefter udfæl-

I DK 175538 B1 I

I 56 I

I det på ny ved hjælp af mættet ammoniumsulfat (3:1, rum- I

I fang). Klumpen indeholdene IgY blev suspenderet på ny i I

I et lille rumfang destilleret H20 og opbevaret ved 4°C I

I indtil, videre anvendelse. Immobiliseringsprocessen for I

I 5 hønse-IgY er beskrevet i eksempel 12. I

Eksempel 9 I

I Kinetiske undersøgelser af ct-amiderende enzymaktkivitet I

I 1q Det ot-amideringsenzym som er blevet renset til I

I homogenitet (både fra medullære skjoldbruskkirtelkarci- I

I nom CA-77-celler i kultur, og fra et tilsvarende svulst- I

I væv fjernet fra laboratorierotter) fungerer ved omdan- I

I nelse af inaktive glycin-udvidede peptid-prohormoner til I

I 15 de bioaktive C-terminale amider. På grundlag af disse I

I undersøgelser må den C-terminale aminosyre i prohormonet I

I være en glycinrest for at enzymet skal kunne genkende I

I det og amidere det på følgende måde: I

I Amiderings- I

I 20 enzym I

R-X-Gly-COOH + 02 --> R-X-CONH2 + HCO-COOH + HjO I

I reduktions- oxideret I

I middel reduktionsmiddel I

I Rekonstitution in vitro af denne aktivitet for- I

25 drer ubetinget, foruden peptidsubstratet molekylært oxy- I

I gen og et reduktionsmiddel (L-askorbinsyre). Det har imid- I

I lertid vist sig at den enzymatiske aktivitet kan forøges I

I +2 I

væsentligt ved tilsætning af Cu ioner (kobbersulfat) I

I og katalase. Dette exogene kobber bindes af enzymet og I

30 bruges som sted for binding af molekylært oxygen og ak- I

I tivering. På den anden side er katalase et enzym som tjener I

I til at bortskylle det hydrogenperoxid som ellers ville I

I akkumulere sig i kraft af bireaktioner som indvolverer oxygen, askorbat og kobber og som ødelægger amiderings- I 35 enzymet.

I Det er lykkedes os at udvikle følsomme ikke-radio- I metriske prøvemetoder til detektering af ct-amiderende en- 57 DK 175538 B1 zymaktivitet. Disse prøver udnytter anvendelse af syntetiske tripeptid-substrater. Amidering af disse substrater overvåges hensigtsmæssigt ved fraskillelse og kvantificering af produktet {amideret dipeptid og substrat-5 tripeptid) under udnyttelse af HPLC. Den mest følsomme af de udviklede prøvemetoder udnytter monodansyl-L-Tyr-Val-Gly som substrat. Denne forbindelse kan detekteres ved yderst lave koncentrationer fordi dansylgruppen er fluorescerende. Følsomheden af denne prøvemetode er derfor 10 sammenlignelig med følsomheden af tilsvarende radiometriske prøvemetoder som er udviklet i andre laboratorier.

Nærværende opfindere har anvendt denne prøvemetode til at undersøge det α-aroiderende enzyms kinetiske egenskaber. Specielt er de kinetiske parametere Km og 15 Vmax bestemt ved undersøgelse af virkningen af variationer i substratkoncentrationen på den enzymatiske aktivitet. Km er et mål på den affinitet som enzymet har til et givet substrat. Desto mindre værdien af Km er desto større er affiniteten. Vmax er den maksimale hastig-20 hed med hvilken enzymet omdanner substratet til produkt og iagttages ved mættende koncentrationer af substratet (dvs. at substratet er til stede i stort overskud i forhold til enzymet).

Ved en typisk amideringsenzym-prøve indholder re-25 aktionssystemet (50 μΐ) enzym (ca. 7 pg), dansyl-L-Tyr-Val-Gly (indtil 40 pM), L-askorbinsyre (3 mM) katalase (0 til 100 pg. ml og kobbersulfat (0 til 2 pM) i 60 mM TES-puffer ved pH 7,0. Reaktionen sættes i gang ved 37°C ved tilsætning af enzymet og afsluttes efter en 30 forudbestemt periode ved tilsætning af 0,1M EDTA (slut-koncentration), der binder kobber og gør det utilgængeligt for enzymet.

Det α-amiderende enzym udviser høj affinitet for enzymatisk amidering af dansyl-L-Tyr-Val-Gly idet Km 35 ligger i området mellem 1 og 2 pM. Denne værdi synes at være konstant uanset den grad i hvilken enzymet er ren set. Den enzympulje der opnås ved kromatografering med

I DK 175538 B1 I

I 58 I

I /G) I

"Sephacryl"^ S-300 udviser således samme Km-værdi som de I

I elektroforetisk rene præparater af enzymet stammende fra I

I "Mono1^ Q kromatografering ved pH 8,0, eller de lavere- I

I molekylære former som er resolveret på "Mono"® Q kroma- I

I 5 tografering ved pH 6,0. På den anden side varierer som I

I ventet værdierne for Vmax (udtrykt pr. mg protein) vs- I

sentligt med rensningstilstanden. Mens således Vmax fra I

I den pulje der er opnået ved behandling på "Sephacryl"® I

I S-300 omkring 50-100 nmol produkt dannet pr. minut pr. mg I

I 10 protein, så er Vmax for det rene svulst-enzym ca. 5000 I

I nmol produkt dannet pr. mg protein. I

Det har vist sig at askorbatet og subtratet I

I kan konkurrere med hinanden om enzymet under visse be- I

I tingelser. Hvis fx koncentrationen af substratet øges I

I 15 væsentligt ud over mætningsniveauet, svækkes enzymakti- I

viteten på grund af forringet vekselvirkning mellem en- I

I zymet og askorbinsyren. For hvert specielt substrat synes I

I det således at være en fin balance mellem optimale kon- I

I centrationer af substrat og askorbat, i afhængighed af I

20 enzymets affinitet til det specielle substrat. I

Det amiderende enzyms affinitet til glycin-forlængede I

I peptider_ I

I Prøven med amidering af monodansyl-L-Tyr-Val-Gly I

I 25 er blevet anvendt som følsom undersøgelsesmetode for re- I

I aktionen mellem amideringsenzymet og flere forskellige I

I Gly-forlængede- peptidprohomorner. Formålet med denne un- I

I dersøgelse var at undersøge enzymets relative affinitet I

I med hensyn til binde visse forskellige typer peptidsub- I

I 30 strater. Omend det tidligere er påvist at enzymet succes- I

I sivt amiderer de glycin-udvidede prækursor-substrater for I

I humant calcitonin og den frigivende faktor for det hu- I

I mane væksthormon, siger dette intet om enzymets evne til I

I fortrinsvis at binde disse eller andre peptider i for- I

I 35 hold til hinanden. I

I Det er påvist at glycin-udvidet a-melanocyt-sti- I

I mulerende hormon, substans P, vasopressin-analoger og I

59 DK 175538 B1 den væksthormon-frigivende faktor vil vekselvirke med høj affinitet med det amiderende enzym og dermed forhindre det i at metabolisere dansyl-L-Tyr-Val-Gly. Desuden konkurrerer pentapeptid-modeller svarende til de fem C-5 terminale aminosyrerester i glycin-udvidet humant calcitonin, neuropeptid Y, cholecystokinin, corticotropin-frigivende faktor og calcitonin-genrelateret peptid ved denne prøve. Enzymet har med andre ord evne til at binde og antagelig til at amidere alle disse glycin-forlæn-10 gede peptid-substrater, I modsætning hertil viste det sig at når de ami-derede peptider svarende til disse substrater blev undersøgt, havde de langt mindre evne til at vekselvirke med enzymet. Evnen hos dette enzym-katalytiske 15 sted til at genkende mange forskellige glycin-udvidede substrater gør det til et yderst nyttigt alment reagens til kommerciel amidering af peptid-prohormoner udviklet ved rekombinant-DNA-teknologi.

20 Eksempel 10

Isolering af en DNA-sekvens som indkoder det a-amide- rende enzym top III_ B^A-fremstilling 25 Totalt RNA blev fremstillet ud fra MTC-væv fra rotter under anvendelse af guanidintiocyanat-proceduren.

Poly A RNA blev selekteret med oligo-dT-cellulose.

Syntese_af_cDNA

30 Dobbeltstrenget cDNA blev fremstillet ved vel kendte metoder. Under anvendelse af poly A RNA fra rot-te-MTC-væv som model (template) og oligo-dT^.-jø som primer blev syntese af første streng gennemført ved en enzymatisk reaktion med revers-transskriptase. cDNA'et 35 og RNA*et blev adskilt og RNA nedbrudt med alkali. Syntese af den anden streng af cDNA'et blev selv-frembragt under anvendelse af DNA-polymerase I fra Escherichia co- ________ - — -j

I DK 175538 B1 I

I 60 I

I li. Der anvendtes S1-nukleasedigerering for at fjerne I

I hårnåleløkker i cDNA'et og for at nedbryde eventuelle til- I

I stedeværende enkeltstrengede regioner af cDNA'et. Efter I

I omsætning med DNA-polymerase I for at danne flugtende (flush) I

I 5 ender på cDNA'et blev det dobbeltstrengede cDNA behand- I

I let med EcoRl-metylase og s-adenosylmetionin for at me- I

I tylere EcoRl-stederne og beskytte dem mod efterfølgende I

I enzymatisk spaltning. EcoRl-koblere blev ligateret til I

I cDNA. Efter EcoRl-digerering blev overskydende koblere I

I 10 skilt fra cDNA'et og dette blev størrelsesfraktioneret I

I (Sn I

I på en kolonne af "Sepharose"^' 4B. Por én sådan syntese I

I blev der opsamlet molekyler som var større end 500 base- I

I par, mens i en anden blev molekyler som var større end I

I 1000 basepar slået sammen til kloning. I

I 15 I

I £225££HiS£i2G_2£-£_gt2i_cDNA;bibliotek m

I Efter syntese af kobler-adapteret dobbeltstrenge- I

I de cDNA blev molekylerne brugt til at udvikle cDNA-bib- I

I lioteker i vektoren Xgt 11. Dette blev gennemført ved I

I 20 ligatering af cDNA’et til kgt 11 DNA som var blevet I

I spaltet med EcoRl og behandlet med fosfatase for at for- I

I hindre selv-ligatering af vektor-DNA. Efter ligateringen I

I af DNA'erne blev rekombinant-DNA'erne pakket in vitro I

I til dannelse af infektiøse bakteriofag-partikler (ekstrak- I

I 25 ter til pakning er tilgængelige i handelen fra "Promega"® I

I Biotech eller "Clontech Laboratories" eller kan frem- I

I stilles ved standardmetoder). I

I Efter at DNA'et var pakket blev prøver af pak- I

I ningsblandingen testet for at bestemme antallet af re- I

I 30 kombinanter i bibliotekerne. Et af bibliotekerne viste I

I sig at indeholde ca. 2,57 x 10® infektiøse partikler af I

I hvilke ca. 78% åbenbart var rekombinanter (idet de gav I

I klare plakker på X-Gal plader ved dyrkning i nærværel- I

I se af IPTG). Det andet bibliotek viste sig at indeholde I

I 35 i alt ca. 2,75 x 10® plakdannende enheder og ca. 81% til- I

I syneladende rekombinanter. I

61 DK 175538 B1

Biblioteks-screening

For at identificere hvilken rekombinant-bakterio-fag som indeholdt cDNA for det α-amiderende enzyms protein blev fagen screenet med radiomærkede oligonukleo-5 tidprober udformet ud fra de specifikke aminosyresekven-ser i det α-amiderende enzym (se eksempel 7, tabel II). Screeningen gennemførtes ved at udstryge prøver af bak-teriofagen og løfte fagen op på nitrocellulose-filterskiver. Procedurerne til fag-immobilisering på nitrocel- 10 lulosefiltre er kendt vidt og bredt. Duplikatfiltre fra 32 hver plade blev hybridiseret med P-mærket oligonukleo-tid AE 9. Hybridiseringen udførtes ved 37°C i 20-24 timer i 6xNET, 0,5% NP40, 5xDenhardts opløsning, 100 pg/ml laksesperma-DNA, med oligonukleotidproben i en mængde på 15 0,3-0,4 pmol/ml. Efter hybridiseringen blev filtrene va sket i 6xSCC ved 44-45°C i flere timer og eksponeret til røntgenfilm. Positivt hybridiserende fager blev identificeret som sammenfaldende pletter på duplikat-filtre.

De rensedes ved seriemæssig berigelse gennem flere om-20 gange udstrygning og hybridisering. Blandt omkring 4-5 x 4 10 fag-screenede blev 18 identificeret af AE 9.

For at meddele selekteringen specificitet blev der gennemført hybridisering med et andet a-amiderings-enzym-oligonukleotid, AE 8. Denne afprøvning viste at 25 mindst 4 af de 18 fager indeholdt cDNA til de a-amide-rende enzym-proteinsekvenser. Dette resultat blev bekræftet ved en yderligere specifik oligonukleotid-hybri-disering (med AE 4 og AE 5) såvel som ved DNA-sekvensana-lyse.

30

Ekspression_af_a-amiderende_enzym

Top III-αΑΕ, for hvis vedkommende proteinsekvenser er blevet bestemt, har en molekylvægt på ca. 75.000 dalton. Hvis den gennemsnitlige molekylvægt af en amino-35 syre ansættes til 120 dalton så indeholder det amiderende enzym i det højeste 625 aminosyrer. Genet for 625 aminosyre må indeholde mindst 1875 basepar. Alle de 4 I DK 175538 B1 I 62 cDNA’er som nærværende opfindere har isoleret som ami- deringsenzym-specifikke er tilstrækkelig store til fuld- stændigt at kode for α-amiderings-enzynproteinet. En af cDNA- klonerne^ XAE1, har en længde på ca. 2200 nukleotider.

5 Inden for de første 50 nukleotider fra den ene ende be- gynder det at kode for de aminosyrekvenser som er blevet identificeret som amino-enden af top Ill-enzymet. Det H kan derfor antages at dette cDNA indeholder hele den kodningskapacitet som er nødvendig for top III-enzymet.

’10 På basis af denne oplysning og nukleotidsekvenserne i enderne af det 2200 bp store cDNA, er det en forholds- vis simpel procedure at tilpasse cDNA'et til ekspres- H sionskloning i en prokaryotisk vært såsom Escherichia coli.

15 En mulig fremgangsmåde som kan anvendes på XAE1- cDNA er skitseret i fig. XXII. Fx isoleres det 2200 base- par store indstats cDNA af XAE1 efter EcoR1-digerering af rekombinant bakteriofag-DNA'et og elektroforese på agarosegel. Det klones ind i EcorRI-stedet på pBR322 for 20 at udvikle plasmidet pAE8-1. pAE8-1 indeholder et ene- ste KpnI-spaltningssted inden for cDNA-sekvenserne og et eneste Hindlll-sted inden for pBR322-sekvenserne. Dige- rering af pAE8-1 med Kpnl og Hindlll giver et fragment

på ca. 2,15 kb, som har mistet ca. 62 basepar af cDNA

I 25 (ved den aminoterminalt kodende ende af cDNA’et). For at I bygge de aminosyrer tilbage, som findes i aminoenden af det amiderende enzym fra top III og for at tilpasse I cDNA’et til kloning ind i et ekspressionsplasmid liga- I teres det KpnI-Hindlll afsluttede fragment til oligonu- 30 kleotid-kobleradaptere. I det viste eksempel er der brugt ekspressionsplasmid pKK233-2 fra Escherichia coli og købt hos Pharmacia. Det 2,15kb cDNA-fragroent ligate- res til den dobbeltstrengede kobler-adapter bestående af I 35 AE17(+)305CATGTCATTTTCCAATGAATGCCTTGGTAC3' I og I AE18(-)2 2 5CAAGGCATTCATTGGAAAATGA3 63 DK 175538 B1

Det adapterede fragment ligateres derefter til plas-· mid pKK233-2 DNA som i forvejen er blevet spaltet med Ncol og Hindlll til dannelse af en 4,6 kb stor lineær vektor. Det ligaterede produkt, pAE12, indeholder cDNA’et 5 for det α-amiderende enzym og foran det er der et ATG-startkodon og et ribosombindingssted og under kontrol af hybriden, IPTG inducerbar promotor, tre. Genet efterfølges af 5S RNA-genet og et transskriptions-afslutningssted. IPTG inducerbar ekspression af pAE12 opnås efter 10 transformering af plasmid-DNA i en stamme af Escherichia coli med en laci^ genotype.

Partiel DNA-sekvens af den 2,2 kb store cDNA-indsats af_\AE1______________________________________________ 15 Den 2,2 kb store indsats blev udskåret ved EcoR1- 32 digerering af λΑΕΙ og indsatsen blev mærket med P. Efter en sekundær digerering med Hine II blev de resulterende 1,6 kb og 0,6 kb store fragmenter sekvensbestemt ved Maxams og Gilberts kemiske nedbrydnignsmetode.

20 DNA-sekvens fundet ved Maxam-Gilberts sekvensbestemmelse af _et_6 00 _bp_s tort _f ragmen t_af_7yAE-2_fra_EcoR2i§nden£__ v v v v 50v

AATTCCGGTCTTTAAGAGGTTTAAAGAAACTACCAGATCATTTTCCAATG

25 v v v v lOOv

AATGCCTTGGTACCATTGGACCAGTCACCCCTCTTGATGCATCAGATTTT

v v v v 150v

GCGCTGGATATTCGCATGCCTGGGGTTACACCTAAAGAGTCTGACACATA

v v v v 200v

30 CTTTCTGCACGTCCATGCGTCTACCT

DNA-sekvens fundet ved Maxam-Gilberts sekvensbestemmelse 1

I DK 175538 B1 I

I 64 I

I v v v v 50v I

AATTCCGTCTCAGTTTCTGTTTCTCTTGCATCTTCTGCAATTCTGAGGAG I

I v v v v lOOv I

I GTGGGTTTGTTCTCCACTTTGGGTTCGACAACTGCCTCGGCTTCTTTGAT I

I c v v v v 150v I

3 TTCGTGGACTTCGATGCCAGCCTTTTTAACTGACGCATGCTCCATTTTTT I

I v v v v 200v I

I CGGTCAGGGTGAACTTCCACACGGTGTTGTGTGTGCGCTCGAAGACCG I

I Undersøgelse for sekvenshomologi til oligonukleotid” I

I 10 proben AE8(-)22_ I

I Der blev udført en computersøgning for I

I at finde frem til homologi mellem de aminosyrer der bru- I

I ges til at udvikle proben AE8 (Leu-Gly-Thr-Ile-Gly-Pro- I

I Val-Thr) og translateringen af den partielle DNA-sekvens I

I 15 i det 600 bp store fragment af λΑΕΙ. I

I Der blev opnået en region med perfekt homologi I

og denne region er blevet fremhævet ved hjælp af aste- I

I risker på DNA-sekvensen og store bogstaver for aminosy- I

I rernes vedkommende. De aminosyrer som er blevet identi- I

I 20 ficeret ved Nl^-terminal sekvensbestemmelse af det ren- I

I sede amiderende enzym er sat i parentes. Aminosyretil- I

I skrivninger som har vist sig at afvige fra dem som blev I

I forud sagt på basis af DNA-sekvensen er mærket med et +. I

I -- AATTCCGGTCTTTAAGAGGTTTAAAGAAACTACCAGATCATTTTCCAATG I

“ ----·----+----·----+——·----+----·----+----·---+ 50 I

I ipvfkrfkettr(sfs ne I

I I

I ********************** I

I AATGCCTTGGTACCATTGGACCAGTCACCCCTCTTGATGCATCAGATTTT I

I ----·----+----*----+----·----+----*----+---·----+ loo I

I ,0 cLGTIGPVTpldasdf I

I GCGCTGGATATTCGCATGCCTGGGGTTACACCTAAAGAGTCTGACACATA I

----·----+----·----+----·----+----·----+----·----+ 150 I

I aldirmp)gvt pkesdty I

I I

I CTTTCTGCACGTCCATGCGTCTACCT I

35 ----*----+----·----+----·- 176 I

I flhvhast. I

65 DK 175538 B1

Eksempel 11

Enzymimmobilisering Rensning_af_α-ΔΕ

Forud for immobiliseringen blev det a-amiderende 5 enzym renset ved svag anionbytterkromatografering og gelfiltreringskromatografering (eksempel 4). I nogle tilfælde kan enzympraparatet renses yderligere enten ved hjælp af immunoaffinitetskromatografering eller ved kro-matografering på fenylsepharose. Den påfølgende immobi-10 liseringsproces er uafhængig af rensningsproceduren; rutinemæssig bør den specifikke aktivitet imidlertid være mindst 25 mU og fortrinsvis 50 mU eller derover.

Immobilisering_af_g-AE

15 Immobiliseringsteknologien for det a-amiderende enzym kan være baseret på samtidig reaktion af tre komponenter, nemlig enzymet, en vandopløselig copolymer af akrylamid (PAN) og et lavmolekylært tværbindingsmiddel (TET). Den i forvejen dannede polymer (PAN) består af 20 akrylamid og N-akryloxysuccinimid som er polymeriseret i THF-opløsning under termisk igangsættelse med azo-bis-(isobutyronitril). Tværbindingsmidlet kan være α,ω-di-amin, triætylentetramin (TET), cystamin. Omsætningen af diaminen med de aktive estergrupper i PAN bevirker tvær-25 binding af polymerkæderne via en amidbinding, og der dannes en uopløselig gel. Aminofunktionerne i enzymet (fortrinsvis ε-aminogruppen i lysin) reagerer samtidig med tilbageværende aktive estere på gelen og danner stabile covalente amidbindinger. Immobiliseringsprocessen udfø-30 res i nærværelse af substrat og cofaktorer. Tilstedeværelse af et højaffinitets-substrat og cofaktorer i højere koncentrationer end K inhiberer reaktionen mellem PAN-aktive estere og nukleofile grupper på eller nær det katalytiske sted i enzymet og beskytter således en-35 zymet mod kemisk inaktivering.

I DK 175538 B1 I

I 66 I

I Inmobiliseringsbetingelser I

I Partielt renset a-AE opløseliggøres i 30 mM HE- I

I PES puffer pH 7,0. Mængdeforholdet mellem PAN og TET I

I etableres på en sådan måde at 15% af de aktive estere I

I 5 forbliver uomsat, hvorved de fungerer som bindingssteder I

I for det α-amiderende enzym. Standardopløsningen af PAN I

I er 20 vægt% . Den α-amiderende enzymreaktionsblanding I

I består af 0,2 μΜ CuS04, 40 μΜ dansyl-His-Phe-Gly og 10 I

I mM askorbat samt 0,5-2,0 mg α-AE/gram PAN. TET-koncen- I

I 10 trationen beregnes til at være lig med 0,85 ækvivalent I

I primær amin pr. ækvivalent aktiv ester. Det er rutine- I

I mæssigt at bestemme de optimale betingelser, en reak- I

I tion uden enzym gennemføres til at fastslå geltid, dvs. I

I varigheden af den tid der følger efter tilsætning af det I

I 15 TET som behøves til opnå geldannelse. De optimale udbyt- I

I ter for immobilisering af det α-amiderende enzym opnås I

I når tilsætning af enzymet flyttes nærmere til gelpunk- I

I tet. Den almene regel er at desto kortere tid enzymet er I

I eksponeret til PAN før geldannelse, desto højere er ud- I

I 20 byttet af aktivt immobiliseret enzym. For de fleste re- I

I aktioner tilsættes a-AE 2,0 mg/gram PAN) 45-60 sekun- I

I der efter TET. Den enzymholdige gel henstår ved stue- I

I temperatur i ca. 1 time for at tillade koblingsreaktio- I

I nen at gå til fuldførelse. Efter 60 minutter males ge- I

I 25 len med en morter og støder og giver fragmenter med en I

I gennemsnitlig størrelse på 100 pm. Disse partikler va- I

I skes med ammoniumsulfat for at fjerne ubundne reaktan- I

I ter og for at omdanne tilbageværende aktive estergrup- I

I per til amider og derved dække de reaktive grupper. Ud- I

I 30 byttet af aktivt α-amiderende enzym efter immobilise- I

I ringen forventes at være 60%. De vaskevæsker der frem- I

I kommer efter immobiliseringen kan indeholde 30-40% af I

I udgangsaktiviteten. Det α-amiderende enzym kan udvindes I

I fra vaskevæskerne ved at forøge koncentrationen af am- I

I 35 moniniumsulfat til 45%, hvilket fører til fældning af I

I aktivt α-amiderende enzym. I

67 DK 175538 B1

De immobiliserede gelpartikler egner sig til por-ticsnsvise ot-amider i ngsreakt ioner hvor partiklerne holdes i suspension med en mekanisk omrører. Efter at den enzymatiske reaktion er fuldført får partikler lov til at 5 sætte sig og den ovenstående væske indeholdende det ami-derede peptidprodukt dekanteres. Denne procedure er ikke optimal for omsætninger i større målestok. De enzym-holdige gelpartikler er ikke stive nok til at blive pakket i en kolonne og tillade rimelige strømningshastig-10 heder. For at kanme uden an dette problem foreligger der to alternative muligheder.

1. Man lader gelen polymerisere i nærværelse af glasperler; typisk sættes der ét minut før gelpunktet glasperler til reaktionsblandingen og der omrøres med 15 en mekanisk omrører indtil perlerne er dækket med et lag af PAN-opløsning. Strømningshastighederne for dette sammensatte materiale er langt bedre end strømningshastighederne end gelpartiklerne alene.

2. Man kan også blande PAN-partiklerne med fil- 20 terhjælpemateriale "Celite"® 545. Typisk tilberedes der en blanding af PAN og "Celite"® hvor PAN udgør mindre end 8 vægt% (tørvægt) af blandingen. For at udvikle denne type kolonne suspenderes gelpartiklerne i 50 mM Tris: HC1 pH 7f0 og under konstant omrøring tilsættes "Celi-25 te"® 545 hvorefter der gennemblandes i to timer. En kolonne pakket med denne opslæmning (3 x 40 cm) og kolonnens temperatur holdes på 37°C for at lette amiderings-reaktionen. Ved at gå frem på denne måde kan der opretholdes en strømningshastighed på 8-10 liter/dag.

30 Et tilstrækkende alternativ til søjlekromatogra- fering er anvendelse af et tangentielt strømningssystem. PAN-polyraeren før gelpunktet udhældes over et ark poly-sulfonbærer med 0,45 pm store porer. Efter geldannelse kan arkene udskæres til at passe til "Millipore" eller 35 "New Brunswick" ultrafiltreringsenheder til tangentiel strømning. I denne variant stables de sammensatte lag af polysulfon-PAN-immobiliseret enzymlag i lag son giver en I DK 175538 B1 I 68 enorm forøgelse af overfladearealet. Denne fremgangsmåde kan forstørres direkte op til strømningshastigheder der

I nærmer sig liter pr. minut. Denne type system giver og- I

H så en hensigtsmæssig fremgangsmåde til recirkulation af I

I 5 reaktionsblandingen for at maksimere amideringen af pep- I

H tidsubstratet. I

De fordele der opnås ved at immobilisere det α- I

H amiderende enzym omfatter også genvinding og genanven- I

I delse af enzymet. Desuden forøger den immobiliserede ma- I

H 10 trix enzymets stabilitet og tilvejebringer en arbejds- I

form med enzymet som kan give amideringsreaktioner i I

stor målestok (af størrelsesordenerne gram til kilogram I

mængder substrat) over lange tidsrum. I

I 15 Eksempel 12 I

I Fremstilling af en immunoaffinitetskolonne til rens- I

I ning af urene ct-amiderende enzympræparater_ I

A. Immobiliseringsbehandling I

I 20 Den avenc^te immobiliseringsmatrix var cyano- I

I genbromid-aktiveret "Sepharose1® 4B (Pharmacia). Den tør- I

I rede gel blev først vasket med 1M HC1 (200 ml/gram har- I

piks) for at kvælde og vaske den faste bærer. Ca. 40 mg I

I renset polykional antistof renset fra hønseæggeblomme blev I

I 25 dialyseret mod 100 mM NaHCO^ pH 8,3 indeholdende 0,5M I

I NaCl. Koblingen udførtes ved hjælp af 8 ml af den i for- I

I vejen kvældede og vaskede faste bærer. Reaktionen gennem- I

førtes i 3 timer ved stuetemperatur i 100 mM natriumbi- I

I karbonatpuffer pH 8,3 indeholdende 500 mM NaCl som ind- I

I 20 9ik for at reducere uspecifik binding af proteinet til I

I den faste bærer. De tilbageværende aktive grupper i ge- I

I len blev blokeret ved hjælp af 0,2M glycin. Efter bio- I

keringstrinnet blev gelen vasket fire-fem gange, under I anvendelse af et kredsløb af puffere med høj og lav pH-

I 35 værdi (høj-pH puffer: 100 mM NaHCO^ pH 8,3 + 500 mM NaCl, I

I lav-pH puffer: 100 mM acetat pH 4,0 + 500 mM NaCl). Dis- I

I se vasketrin medførte at alt ubundet protein og bloke- 69 DK 175538 B1 ringsreagens (glycin) blev fjernet fra harpiksen. Immu-noaffinitetsharpiksen blev opbevaret ved 4°C i en puffer med basisk pH-vaerdi indeholdende mertiolat som bak-teriostatisk middel. Al efterfølgende immunoaffini-5 tets kromatografering udføres ved 4°C. En lignende metode kan bruges til at immobilisere rensede monoklonale antistoffer.

B. Immunoaffinitetskromatografering 10 Immunoaffinitetskolonnen bruges som alternativt trin med høj effektivitet ved rensning af α-AE. Vævskkul-turmedier fra CA-77 celler (se eksempel 4) fortyndes med destilleret vand og pumpes gennem en DEAE-anionbytter-patron som i forvejen er ækvilibreret med 20 mM Bis-15 Tris-HCl pH 6,0. Det α-amiderende enzym elueres fra patronen med 50 mM TrisrHCl pH 7,0 indeholdende 500 mM NaC-1. De fraktioner som indeholder α-AE-aktiviteten dialyseres enten mod Tris-HCl pH 7,0 puffer eller renses yderligere ved gelfiltreringskromatografering (eksempel 20 4) forud for immunoaffinitetskromatografering. Prøver som indeholder α-AE føres over i immunoadsorptionskolonnen ved neutral pH-værdi. Antistofferne binder specifikt det α-amiderende enzym mens forurenende proteiner ikke blive bundet og fjernes i elueringsmidlet. a-AE-25 aktiviteten kan elueres fra kolonnen ved hjælp af 100 mM glycin:HC1 puffer pH 3,0 (der kan bruges andre desorp-tionsmidler som fx urinstof, dioxan, ætylenglykol og Nal). Fraktionerne opsamles i 1,0M Tris-HCl pH 7,0 for at neutralisere puffersystemet og derved bevare a-AE-30 aktivitet.

35

Claims (19)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et a-amide- I I rende enzym med trin omfattende at tilvejebringe en DNA- I I sekvens der kan kode for et or-amiderende enzym, ligere I I 5 denne DNA-sekvens i en ekspressionsvektor, inducere I I transformation af en værtscelle der kan eksprimere DNA- I I sekvensen med ekspressionsvektoren, især ved valg af I I værtsceller med og eksprimerende DNA-sekvensen, og eks- I I primere enzymet, kendetegnet ved at DNA- I I 10 sekvensen hybridiserer med mindst en sekvens fra mindst I I to af følgende probér: I I AE1: 3'-TTACTCACGG ACCCGTGGTA ACCGGGA/TCAC/G TGGGGGGAC 1 I I TACG-5' I I AE8: 3'-AC/ICCG/lTGG/ITA A/lCCG/lGGA/lCAC/l TG-5' I I 15 AE4: 3"-TTAGCCG/TGTC/TA CCTG-5' I I AE5: 3'-TTA/GCCG/AGTC/TA CCTG-5' I I AE6: 3'-TACGTC/TGGIC CIAGICTG/AGT C/TTT-5' I I AE7: 3'-TACGTC/TGGIC CITCA/GCTG/AGT C/TTT-5' I I AE10: 3'-CTG/AGTCTTG/AG TG/AAA-5' I I 20 AE11: 3'-CTG/AGTTTTG/AG TG/AAa-5' I I AE9: 3'-AAA/GCAC/ITGC/IG TC/TACCCCC/ICT-5' I I der kan benyttes til at identificere denne sekvens hvor I I hver probe omfatter en blanding af sekvenser. I

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg- I I 25 n e t ved at proberne er valgt fra AE8, AE9, AE4 og AE5. I

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, k e η - I I detegnet ved at den transformerede værtscelle er I I en E. coli celle, en gærcelle eller en eukaryotisk celle. I I

-4. Genmanipuleret mikroorganisme, kende- I I 30tegnet ved at omfatte mindst en især udvalgt værts- I I celle fremstillet ved fremgangsmåden ifølge et vilkårligt I I af kravene 1 til 3. I V. 71 DK 175538 B1

5. Værtscelle, kendetegnet ved at den er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 3.

6. Værtscelle ifølge krav 5, kendeteg- 5. e t ved at DNA-sekvensen i det væsentlige er identisk med en fra et rottegen kodende for pept idyl-glycin a-amiderende monooxygenase.

7. Værtscelle ifølge krav 5, kendeteg net ved at DNA-sekvensen koder for α-amiderende enzym 10 med apparent molekylvægt på 60.000-65.000 dalton målt ved gelfiltreringskromatografi og 73.000-75.000 dalton ved elektroforese på natriumdodecylsulfat/polyakrylamid-gel.

8. Værtscelle ifølge krav 5, kendeteg net ved at DNA-sekvensen i det væsentlige er identisk 15 med en fra et pattedyrsgen kodende for peptidyl-glycin or-amiderende monooxygenase.

9. Værtscelle ifølge krav 5, kendeteg net ved at DNA-sekvensen i det væsentlige er identisk med en fra et carcinomgen fra rotteskjoldbruskkirtelmarv 20 kodende for peptidyl-glycin α-amiderende monooxygenase.

10. Værtscelle ifølge et vilkårligt af kravene 5 til 9, k e n d e t egne t ved, at DNA-sekvensen koder for et Qf-amiderende enzym med et surt pH-optimum.

11. Værtscelle ifølge et vilkårligt af kravene 5 25 til 9, kendetegnet ved at DNA-sekvensen koder for en aminosyresekvens med mindst et fragment af: (a) -Ser-Phe-Ser-Asn-Glu-Cys-Leu-Gly-Thr-Ile-Gly-Pro-Val-Thr-Pro-Leu-Asp-Ala-Ser-Asp-Phe-Ala-Leu-Asp-Ile-Arg-Met-Pro-; 30 (b) -Ser-Met-Gln-Pro-Gly-Ser-Asp-Gln-Asn-His-Phe-Ser- Gln-Pro-Thr-; (c) -Asn-Gly-Gln-Trp-Thr-Leu-Ile-Gly-Arg; og (d) -Phe-Val-Thr-Gln-Trp-Gly-Glu-. I DK 175538 B1 I I 72 I I

12. Værtscelle ifølge et vilkårligt af kravene 5 I I til 11, kendetegnet ved at DNA-sekvensen in- I I kluderer mindst et fragment valgt fra gruppen udgjort af: I I 5 (a) I I v v v v 50v I I AATTCCGGTCTTTAAGAGGTTTAAAGAAACTACCAGATCATTTTCCAATG I I V v V v lOOv I I AArGCCTTGGTACCATTGGACCAGTCACCCCTCTTGATGCATCAGATTTT I I v v v v 150v I I GCGCTGGATATTCGCATGCCTGGGGTTACACCTAAAGAGTCTGACACATA I I v v V V 200v I I 15 CTTTCTGCACGTCCATGCGTCTACCT . I I og I I (b) I I 20 i I v v v v 50v I AATTCCGTCTCAGTTTCZTGTTTCTCTTGCATCTTCTGCAATTCTGAGGAG I I V v v v lOOv I I GTGGGTTTGTTCTCCACTTTGGGTTCGACAACTGCCTCGGCTTCTTTGAT I I 25 I I v v v v 150v I I ttcgtggacttcgatgccagcctttttaactgaccgatgctccatttttt I I v v v v 200v I I CGGTCAGGGTGAACTTCCACACGGTGTTGTGTGTGCGCTCGAAGACCG I I 30 I 73 DK 175538 B1

13. Værtscelle ifølge krav 5, kendetegnet ved at DNA-sekvensen er identisk med en sådan fra et carcinomgen fra rotteskjoldbruskkirtelmarv kodende for en peptidyl-glycin a-amiderende monooxygenase der har et 5 surt pH-optimum og en molekylvægt mellem 60.000 og 65.000 dalton målt ved gelfiltreringskromatografi.

14. Mikroorganisme ifølge krav 4, kendetegnet ved at DNA-sekvensen er som defineret i et vilkårligt af kravene 6 til 13.

15. Rekombinant DNA-molekyle, kendeteg net ved at det omfatter en nucleot idsekvens med evne til at kode for et a-amiderende enzym hvor sekvensen er defineret som i et vilkårligt af kravene 1 til 3 eller 5 til 12. 15 20 1 30 I DK 175538 B1 I I 74 I

16. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 15, I I kendetegnet ved at det omfatter en del af el- I I ler en hel nucleotidsekvens valgt fra: I s (a) I I v v v v 50v I AATTCCGGTCTTTAAGAGGTITAAAGAAACTACCAGATCATTTTCCAATG I I v v v v lOOv I I AATGCCTTGGTACCATTGGACCAGTCACCCCTCTTGATGCATCAGArTTT I I 10 I I V v v v 150v I GCGCTGGATATTCGCATGCCTGGGGTTACACCTAAAGAGTCTGACACATA I I v v v v 200v I I CTTTCTGCACGTCCATGCGTCTACCT i I I 15 I I 09 I I (b) I I 20 v v v v 5Qv I I AATTCCGTCTCAGTTTCTGTTTCTCTTGCATCTTCTGCAA.TTCTGAGGAG I I v v v v lOOv I I GTGGGTTTGTTCTCCACTTTGGGTTCGACAACTGCCTCGGCTTCTTTGAT I I 25 I I TTCGTGGACTTCGA.TGCCAGCCTTT1TAACTGACCGATGCTCCATTTTTT I I v v v v 200v I I CGGTCAGGGTGAACTTCCACACGGTGTTGTGTGTGCGCTCGAAGACCG I I 30 I I eller en homolog sekvens omfattende substitutioner, addi- I I tioner eller sletninger der ikke materielt påvirker funk- I I tionen af det deraf kodede enzym. I 75 DK 175538 B1

17. Fremgangsmåde til fremstilling af a-amiderede produkter, kendetegnet ved at omfatte at bringe et substrat med en C-terminal glycinrest i kontakt med et α-amiderende enzym fremstillet ved fremgangsmåden 5 ifølge krav 1 til 3 eller ud fra værtsceller ifølge et hvilket som helst af kravene 4 til 14 og derefter udvinde det amiderede produkt.

18. Fremgangsmåde ifølge krav l til 3 eller 17, kendetegnet ved at det a-amiderende enzym har 10 en specifik aktivitet på mindst 1500 mU/mg protein.

19. Rekombinant α-amiderende enzym, kende -tegnet ved at det er fremstillet ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 3, hvor DNA-sekvensen er som defineret i et vilkårligt af kravene 1 til 3 eller 6 til 12.