JPH11103859A - 組み換え型ヒト肝癌細胞由来増殖因子、およびヒト肝癌細胞由来増殖因子を認識する抗体 - Google Patents
組み換え型ヒト肝癌細胞由来増殖因子、およびヒト肝癌細胞由来増殖因子を認識する抗体Info
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- JPH11103859A JPH11103859A JP9274608A JP27460897A JPH11103859A JP H11103859 A JPH11103859 A JP H11103859A JP 9274608 A JP9274608 A JP 9274608A JP 27460897 A JP27460897 A JP 27460897A JP H11103859 A JPH11103859 A JP H11103859A
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】ヒトＨＤＧＦをコードする遺伝子を含む原核発
現ベクター、該ベクターにより形質転換された原核細
胞、および該形質転換された原核細胞より調製された増
殖活性を持った組み換え型のヒトＨＤＧＦを提供する。
ヒトＨＤＧＦを認識する抗体を提供する。 【解決手段】 増殖活性を有する、原核発現された組み
換え型のヒト肝癌細胞由来増殖因子タンパクである。上
記増殖因子タンパクをコードするＤＮＡ配列を含有する
発現ベクターを含んでなる原核宿主細胞により発現され
たタンパクである。原核性プロモーター配列に作用可能
に連結されたヒト肝癌細胞由来増殖因子タンパクをエン
コードするＤＮＡ配列を含んでなる原核発現ベクターで
ある。ヒト肝癌由来増殖因子を認識する抗体であって、
ヒト肝癌由来培養細胞ＨｕＨ−７の培養上清を精製して
得られたヒト肝癌由来増殖因子に反応する抗体である。
現ベクター、該ベクターにより形質転換された原核細
胞、および該形質転換された原核細胞より調製された増
殖活性を持った組み換え型のヒトＨＤＧＦを提供する。
ヒトＨＤＧＦを認識する抗体を提供する。 【解決手段】 増殖活性を有する、原核発現された組み
換え型のヒト肝癌細胞由来増殖因子タンパクである。上
記増殖因子タンパクをコードするＤＮＡ配列を含有する
発現ベクターを含んでなる原核宿主細胞により発現され
たタンパクである。原核性プロモーター配列に作用可能
に連結されたヒト肝癌細胞由来増殖因子タンパクをエン
コードするＤＮＡ配列を含んでなる原核発現ベクターで
ある。ヒト肝癌由来増殖因子を認識する抗体であって、
ヒト肝癌由来培養細胞ＨｕＨ−７の培養上清を精製して
得られたヒト肝癌由来増殖因子に反応する抗体である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト肝癌由来増殖
因子（ヒトHepatoma-Derived Growth factor、ヒトＨＤ
ＧＦと略記する）の遺伝子を用い原核細胞の発現系を利
用して作成した組み換え型ヒトＨＤＧＦに関する。
因子（ヒトHepatoma-Derived Growth factor、ヒトＨＤ
ＧＦと略記する）の遺伝子を用い原核細胞の発現系を利
用して作成した組み換え型ヒトＨＤＧＦに関する。
【０００２】発明は、また、ヒトＨＤＧＦを認識する抗
体に関する。
体に関する。
【０００３】
【従来の技術】ヒトＨＤＧＦはヒト肝癌由来培養細胞Ｈ
ｕＨ−７の培養上清よりＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞に対する
増殖活性を持つ分子量約２５キロダルトン（以下ｋＤａ
と略記する）のタンパク質として抽出された（Nakamur
a,H.ら, Clinica Chimica Acta183, 273-284 (198
9)）。その遺伝子はすでにクローニングされ、ヒトＨＤ
ＧＦが癌細胞のみならず肝臓をはじめとする多くのヒト
臓器で発現していることが判明している（Nakamura,H.
ら, J. Biol. Chem. 269, 25143-25149 (1994)）。
ｕＨ−７の培養上清よりＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞に対する
増殖活性を持つ分子量約２５キロダルトン（以下ｋＤａ
と略記する）のタンパク質として抽出された（Nakamur
a,H.ら, Clinica Chimica Acta183, 273-284 (198
9)）。その遺伝子はすでにクローニングされ、ヒトＨＤ
ＧＦが癌細胞のみならず肝臓をはじめとする多くのヒト
臓器で発現していることが判明している（Nakamura,H.
ら, J. Biol. Chem. 269, 25143-25149 (1994)）。
【０００４】また、特開平６−２２００９４号公報に
は、ヒトＨＤＧＦは、分子量が２万〜３万５千の範囲に
あり、Ｎ末端から２０残基が下記(1)(2)(3) のいずれか
のアミノ酸配列で構成されたポリペプチドであることが
記載されている。
は、ヒトＨＤＧＦは、分子量が２万〜３万５千の範囲に
あり、Ｎ末端から２０残基が下記(1)(2)(3) のいずれか
のアミノ酸配列で構成されたポリペプチドであることが
記載されている。
【０００５】配列(1) ：Ser Asn Asn Gln Lys Glu Tyr
Lys Cys Gly Asp Leu Val Phe Ala Lys Met Lys Gly Ty
r 配列(2) ：Ser Asn Asn Gln Lys Glu Tyr Lys Ser Gly
Asp Leu Val Phe Ala Lys Met Lys Gly Tyr 配列(3) ：Ser Asn Asn Gln Lys Glu Tyr Lys Thr Gly
Asp Leu Val Phe Ala Lys Met Lys Gly Tyr
Lys Cys Gly Asp Leu Val Phe Ala Lys Met Lys Gly Ty
r 配列(2) ：Ser Asn Asn Gln Lys Glu Tyr Lys Ser Gly
Asp Leu Val Phe Ala Lys Met Lys Gly Tyr 配列(3) ：Ser Asn Asn Gln Lys Glu Tyr Lys Thr Gly
Asp Leu Val Phe Ala Lys Met Lys Gly Tyr
【０００６】さらにマウス睾丸組織より抽出したメッセ
ンジャーＲＮＡより作製したｃＤＮＡライブラリーを、
ヒトＨＤＧＦのＤＮＡをプローブとしてスクリーニング
することにより、ヒトＨＤＧＦのマウスホモログ（即ち
マウスＨＤＧＦ）がクローニングされた（特願平８−０
６４００１）だけでなく、マウスＨＤＧＦのＮ末端約１
００アミノ酸において高いホモロジーを持つ類縁のタン
パク質（ＨＥＴ−ＡおよびＨＥＴ−Ｂ）をエンコードし
ている遺伝子が見い出された（特願平８−１３１７８
８）。これらから明らかなように、ＨＤＧＦは遺伝子フ
ァミリーを形成している。
ンジャーＲＮＡより作製したｃＤＮＡライブラリーを、
ヒトＨＤＧＦのＤＮＡをプローブとしてスクリーニング
することにより、ヒトＨＤＧＦのマウスホモログ（即ち
マウスＨＤＧＦ）がクローニングされた（特願平８−０
６４００１）だけでなく、マウスＨＤＧＦのＮ末端約１
００アミノ酸において高いホモロジーを持つ類縁のタン
パク質（ＨＥＴ−ＡおよびＨＥＴ−Ｂ）をエンコードし
ている遺伝子が見い出された（特願平８−１３１７８
８）。これらから明らかなように、ＨＤＧＦは遺伝子フ
ァミリーを形成している。
【０００７】ところで、あるタンパクの機能や病気など
との関係を研究するに際し、しばしば免疫学的な解析が
行われる。またそのタンパクと病気との関係が明らかと
なり臨床検査等に応用される場合にはそのタンパクの測
定を簡便に行うため、あるいはそのタンパクを高い感度
で特異的に測定するために、しばしば免疫学的な測定法
が利用される。抗原性の物質の免疫学的な解析・測定を
行うには、抗原と特異的に反応する抗体が必要である。
との関係を研究するに際し、しばしば免疫学的な解析が
行われる。またそのタンパクと病気との関係が明らかと
なり臨床検査等に応用される場合にはそのタンパクの測
定を簡便に行うため、あるいはそのタンパクを高い感度
で特異的に測定するために、しばしば免疫学的な測定法
が利用される。抗原性の物質の免疫学的な解析・測定を
行うには、抗原と特異的に反応する抗体が必要である。
【０００８】ヒトＨＤＧＦは肝癌由来の増殖活性をもつ
因子であるが故に、これを肝臓疾患その他に対する医薬
品またはその臨床検査試薬などの分野へ応用することが
期待される。そのためにはヒトＨＤＧＦを大量に生産
し、その機能を詳細に解明することが必要である。ま
た、抗原性物質であるヒトＨＤＧＦの免疫学的な解析・
測定を行うには、ヒトＨＤＧＦを認識する抗体を作成す
ることが要望される。
因子であるが故に、これを肝臓疾患その他に対する医薬
品またはその臨床検査試薬などの分野へ応用することが
期待される。そのためにはヒトＨＤＧＦを大量に生産
し、その機能を詳細に解明することが必要である。ま
た、抗原性物質であるヒトＨＤＧＦの免疫学的な解析・
測定を行うには、ヒトＨＤＧＦを認識する抗体を作成す
ることが要望される。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】一般的にタンパクを取
得するには、(1) 生体または培養細胞から精製単離する
方法、(2) ペプチド合成による方法、そして(3) 遺伝子
組み換え技術を用いる方法などが挙げられるが、工業的
には(3) の方法が望ましい。遺伝子組み換え技術を用い
てタンパクを生産するための発現系（宿主−ベクター
系）としては、たとえば、細菌などの原核細胞、酵母、
昆虫細胞、および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。
とくに哺乳動物細胞を用いた組み換えタンパクの発現系
は、天然に近い翻訳後修飾(posttranslational modific
ation)が付加されるなど他の系では得られない特徴を備
えているために、天然型と同じ活性を持つタンパクの生
産によく用いられている。実際ヒトＨＤＧＦの場合にも
ＣＯＳ−７細胞を用いて組み換え型のタンパクが作られ
ている（Nakamura,H.ら, J. Biol. Chem. 269, 25143-2
5149 (1994)）。
得するには、(1) 生体または培養細胞から精製単離する
方法、(2) ペプチド合成による方法、そして(3) 遺伝子
組み換え技術を用いる方法などが挙げられるが、工業的
には(3) の方法が望ましい。遺伝子組み換え技術を用い
てタンパクを生産するための発現系（宿主−ベクター
系）としては、たとえば、細菌などの原核細胞、酵母、
昆虫細胞、および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。
とくに哺乳動物細胞を用いた組み換えタンパクの発現系
は、天然に近い翻訳後修飾(posttranslational modific
ation)が付加されるなど他の系では得られない特徴を備
えているために、天然型と同じ活性を持つタンパクの生
産によく用いられている。実際ヒトＨＤＧＦの場合にも
ＣＯＳ−７細胞を用いて組み換え型のタンパクが作られ
ている（Nakamura,H.ら, J. Biol. Chem. 269, 25143-2
5149 (1994)）。
【００１０】しかしながら、哺乳動物細胞の系では一般
的にタンパクの発現量が少なく、また培地等の試薬が高
価であるために工業的には必ずしも最良の方法ではな
い。安価にタンパクを生産するためには大腸菌(E.coli)
をはじめとする原核細胞を用いた方法が望ましいが、糖
鎖の付加などの翻訳後修飾が原核細胞では起らない等の
理由により、必ずしも活性を持つタンパクを得られると
は限らない。
的にタンパクの発現量が少なく、また培地等の試薬が高
価であるために工業的には必ずしも最良の方法ではな
い。安価にタンパクを生産するためには大腸菌(E.coli)
をはじめとする原核細胞を用いた方法が望ましいが、糖
鎖の付加などの翻訳後修飾が原核細胞では起らない等の
理由により、必ずしも活性を持つタンパクを得られると
は限らない。
【００１１】本発明の目的は、上記の点に鑑み、ヒトＨ
ＤＧＦをコードする遺伝子を含む原核発現ベクター、該
ベクターにより形質転換された原核細胞、および該形質
転換された原核細胞より調製された増殖活性を持った組
み換え型のヒトＨＤＧＦを提供することである。
ＤＧＦをコードする遺伝子を含む原核発現ベクター、該
ベクターにより形質転換された原核細胞、および該形質
転換された原核細胞より調製された増殖活性を持った組
み換え型のヒトＨＤＧＦを提供することである。
【００１２】本発明のもう１つの目的は、ヒトＨＤＧＦ
を認識する抗体を提供することである。
を認識する抗体を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明により、増殖活性
を有する、原核発現された組み換え型のヒトＨＤＧＦタ
ンパクが提供させる。
を有する、原核発現された組み換え型のヒトＨＤＧＦタ
ンパクが提供させる。
【００１４】これは、上記ヒトＨＤＧＦタンパクをコー
ドするＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを含んでなる
原核宿主細胞により発現されたものである。
ドするＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを含んでなる
原核宿主細胞により発現されたものである。
【００１５】本発明により、また、原核性プロモーター
配列に作用可能に連結されたＨＤＧＦタンパクをエンコ
ードするＤＮＡ配列を含んでなる原核発現ベクター、お
よび該ベクターを含んでなる原核細胞が提供される。
配列に作用可能に連結されたＨＤＧＦタンパクをエンコ
ードするＤＮＡ配列を含んでなる原核発現ベクター、お
よび該ベクターを含んでなる原核細胞が提供される。
【００１６】このベクターは、例えば、図１に示す開裂
地図で表されるものである。
地図で表されるものである。
【００１７】原核細胞としては大腸菌が好ましく用いら
れる。
れる。
【００１８】上記タンパクは研究試薬および医薬物等へ
の応用が期待される。
の応用が期待される。
【００１９】Nakamura,H.らの論文, J. Biol. Chem. 26
9, 25143-25149 (1994)、および特開平６−２２００９
４では、ヒトＨＤＧＦ遺伝子が大腸菌のベクター（例え
ばpBluescriptなど）に組み込まれているが、これはＤ
ＮＡの調製や塩基配列の決定など目的としたものであ
り、タンパク生産を目的としたものではない。一般に原
核細胞の発現系でヒトＨＤＧＦを生産するには(1) ヒト
ＨＤＧＦの翻訳領域のＤＮＡを適当なプロモーターの下
流に直接接続する方法、または(2) ヒトＨＤＧＦを他の
ポリペプチドとの融合タンパク(fusion protein)として
産生する方法が考えられる。(1) の場合、例えば大腸菌
で発現を行うには、ヒトＨＤＧＦ遺伝子を適当なプロモ
ーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモー
ター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下
流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐ
ＢＲ３２２，ｐＵＣ１８，ｐＵｃ１９等）に挿入して発
現ベクターを作成する。次にこの発現ベクターで形質転
換した大腸菌（例えば、E.coli DHl, E.coli JM109等）
を適当な培地で培養して、その菌体より目的とするヒト
ＨＤＧＦを得る方法である。しかしながら、本発明者が
この方法を実施してみたところ、十分な発現量を得るこ
とができず、この方法は実用的でないことがわかった。
9, 25143-25149 (1994)、および特開平６−２２００９
４では、ヒトＨＤＧＦ遺伝子が大腸菌のベクター（例え
ばpBluescriptなど）に組み込まれているが、これはＤ
ＮＡの調製や塩基配列の決定など目的としたものであ
り、タンパク生産を目的としたものではない。一般に原
核細胞の発現系でヒトＨＤＧＦを生産するには(1) ヒト
ＨＤＧＦの翻訳領域のＤＮＡを適当なプロモーターの下
流に直接接続する方法、または(2) ヒトＨＤＧＦを他の
ポリペプチドとの融合タンパク(fusion protein)として
産生する方法が考えられる。(1) の場合、例えば大腸菌
で発現を行うには、ヒトＨＤＧＦ遺伝子を適当なプロモ
ーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモー
ター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下
流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐ
ＢＲ３２２，ｐＵＣ１８，ｐＵｃ１９等）に挿入して発
現ベクターを作成する。次にこの発現ベクターで形質転
換した大腸菌（例えば、E.coli DHl, E.coli JM109等）
を適当な培地で培養して、その菌体より目的とするヒト
ＨＤＧＦを得る方法である。しかしながら、本発明者が
この方法を実施してみたところ、十分な発現量を得るこ
とができず、この方法は実用的でないことがわかった。
【００２０】そこで、本発明者は、鋭意検討の結果、
(2) の方法において十分なヒトＨＤＧＦを得ることがで
きることを見い出し発明を完成した。
(2) の方法において十分なヒトＨＤＧＦを得ることがで
きることを見い出し発明を完成した。
【００２１】即ち、ヒトＨＤＧＦが融合する相手として
適当なペプチドは、例えば、グルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼ等である。この適当なペプチドとヒトＨＤ
ＧＦが融合するようにそれぞれの遺伝子を結合し、適当
なプロモーター（例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプ
ロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター
等）の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例
えば、ｐＧＥＸ−３Ｘ，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１８，ｐ
Ｕｃ１９等）に挿入して発現ベクターを作成する。次に
この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、E.co
li DHl, E.coli JM109等）を適当な培地で培養すること
によって、その菌体より目的とするヒトＨＤＧＦ−グル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパクが得ら
れる。この際にヒトＨＤＧＦを切断分離できるように適
当なプロテアーゼの切断部位を予め適当なポリペプチド
とヒトＨＤＧＦの間に介在させておくことが望ましい。
適当なプロテアーゼとしてはFactor Xaやトロンビン(Th
rombin)等が挙げられる。切断された融合タンパクから
のヒトＨＤＧＦの分離は適当な分離手段（アフィニティ
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
疎水性クロマトグラフィー等）で分離精製することがで
きる。例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの
場合にはグルタチオンを固定化した担体を用いたアフィ
ニティクロマトグラフィーによりヒトＨＤＧＦが分離さ
れる。
適当なペプチドは、例えば、グルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼ等である。この適当なペプチドとヒトＨＤ
ＧＦが融合するようにそれぞれの遺伝子を結合し、適当
なプロモーター（例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプ
ロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター
等）の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例
えば、ｐＧＥＸ−３Ｘ，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１８，ｐ
Ｕｃ１９等）に挿入して発現ベクターを作成する。次に
この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、E.co
li DHl, E.coli JM109等）を適当な培地で培養すること
によって、その菌体より目的とするヒトＨＤＧＦ−グル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパクが得ら
れる。この際にヒトＨＤＧＦを切断分離できるように適
当なプロテアーゼの切断部位を予め適当なポリペプチド
とヒトＨＤＧＦの間に介在させておくことが望ましい。
適当なプロテアーゼとしてはFactor Xaやトロンビン(Th
rombin)等が挙げられる。切断された融合タンパクから
のヒトＨＤＧＦの分離は適当な分離手段（アフィニティ
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
疎水性クロマトグラフィー等）で分離精製することがで
きる。例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの
場合にはグルタチオンを固定化した担体を用いたアフィ
ニティクロマトグラフィーによりヒトＨＤＧＦが分離さ
れる。
【００２２】このようにして得た組み換えヒトＨＤＧＦ
は予想に反して異常に大きな分子量を示す。遺伝子配列
から予想されるヒトＨＤＧＦの分子量は約２５ｋＤａで
あり、実際に肝癌培養細胞ＨｕＨ−７の培養上清から抽
出した天然型のヒトＨＤＧＦは分子量約２５ｋＤａを示
す（Nakamura,H.ら, J. Biol. Chem. 269, 25143-25149
(1994)、および特開平６−２２００９４）。従って組
み換え型のヒトＨＤＧＦも約２５ｋＤａを示すと予想さ
れるが、実際には約４０ｋＤａを示す。この分子量が正
しいかどうかを確めるには、無細胞タンパク合成系（た
とえば血球の抽出物など）を用いた既知の方法が適用さ
れる。この無細胞タンパク合成系にヒトＨＤＧＦの遺伝
子を添加し、同時に放射能ラベルしたメチオニンを添加
すると、放射能ラベルされたヒトＨＤＧＦが得られる。
このサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析するとやはりＨ
ＤＧＦは約４０ｋＤａの分子量を示すことが確認でき
る。
は予想に反して異常に大きな分子量を示す。遺伝子配列
から予想されるヒトＨＤＧＦの分子量は約２５ｋＤａで
あり、実際に肝癌培養細胞ＨｕＨ−７の培養上清から抽
出した天然型のヒトＨＤＧＦは分子量約２５ｋＤａを示
す（Nakamura,H.ら, J. Biol. Chem. 269, 25143-25149
(1994)、および特開平６−２２００９４）。従って組
み換え型のヒトＨＤＧＦも約２５ｋＤａを示すと予想さ
れるが、実際には約４０ｋＤａを示す。この分子量が正
しいかどうかを確めるには、無細胞タンパク合成系（た
とえば血球の抽出物など）を用いた既知の方法が適用さ
れる。この無細胞タンパク合成系にヒトＨＤＧＦの遺伝
子を添加し、同時に放射能ラベルしたメチオニンを添加
すると、放射能ラベルされたヒトＨＤＧＦが得られる。
このサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析するとやはりＨ
ＤＧＦは約４０ｋＤａの分子量を示すことが確認でき
る。
【００２３】上記組み換えヒトＨＤＧＦが異常な分子量
を示す原因として組み換えヒトＨＤＧＦが二量体等にな
っていることも考えられる。しかし予想分子量約２５ｋ
Ｄａの二倍は約５０ｋＤａであり、実際の組み換えヒト
ＨＤＧＦの示す分子量約４０ｋＤａと一致しない。また
融合タンパクを作成した場合、その分子量は融合する相
手のペプチドの分子量と組み換えヒトＨＤＧＦの分子量
（約４０ｋＤａ）を併せたものになる。たとえば融合相
手としてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを使用
した場合には、融合タンパクの分子量はグルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼ（約２７ｋＤａ）とヒトＨＤＧ
Ｆの分子量（約４０ｋＤａ）を併せた分子量約６７ｋＤ
ａになる。従って組み換えヒトＨＤＧＦの単量体が異常
な分子量（約４０ｋＤａ）を示していると考えられる。
を示す原因として組み換えヒトＨＤＧＦが二量体等にな
っていることも考えられる。しかし予想分子量約２５ｋ
Ｄａの二倍は約５０ｋＤａであり、実際の組み換えヒト
ＨＤＧＦの示す分子量約４０ｋＤａと一致しない。また
融合タンパクを作成した場合、その分子量は融合する相
手のペプチドの分子量と組み換えヒトＨＤＧＦの分子量
（約４０ｋＤａ）を併せたものになる。たとえば融合相
手としてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを使用
した場合には、融合タンパクの分子量はグルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼ（約２７ｋＤａ）とヒトＨＤＧ
Ｆの分子量（約４０ｋＤａ）を併せた分子量約６７ｋＤ
ａになる。従って組み換えヒトＨＤＧＦの単量体が異常
な分子量（約４０ｋＤａ）を示していると考えられる。
【００２４】この組み換え型ヒトＨＤＧＦは天然型のヒ
トＨＤＧＦと同様の増殖活性を示す。例えば、組み換え
型ヒトＨＤＧＦをＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞に作用させＤＮ
Ａ合成の際の３Ｈトリチウムの取り込みを指標として増
殖活性を測定すると、ヒトＨＤＧＦが増殖活性を持つこ
とが確認される。よってこの組み換え型ヒトＨＤＧＦは
異常な分子量を示すものの増殖因子であることは間違い
ない。
トＨＤＧＦと同様の増殖活性を示す。例えば、組み換え
型ヒトＨＤＧＦをＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞に作用させＤＮ
Ａ合成の際の３Ｈトリチウムの取り込みを指標として増
殖活性を測定すると、ヒトＨＤＧＦが増殖活性を持つこ
とが確認される。よってこの組み換え型ヒトＨＤＧＦは
異常な分子量を示すものの増殖因子であることは間違い
ない。
【００２５】遺伝子の配列より推定される分子量と実際
に作成した組み換えタンパクの分子量とが異なるという
現象はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて散見される。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥでは、負電荷を持つＳＤＳがタンパクの疎水性
部位を中心に付着することによりタンパクの３次構造が
解消され、全体が一様に負電荷を帯るので、電気泳動に
より分子量にのみ依存してタンパクを分離することがで
きる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて異常な分子量がみられ
る原因はかならずしも明らかではないが、何らかの理由
でタンパクに付着するＳＤＳの量が異常になるためと考
えられている。たとえば組み換え型ヒトＨＤＧＦの場合
には、グルタミンなどの負電荷を持つアミノ酸が多いた
め（全体の約２５％）、ＳＤＳが付着する量が少なく、
したがって電気泳動度が少なくなり、見かけ上の分子量
が大きいように見えると考えられる。天然型ヒトＨＤＧ
Ｆがなぜ２５ｋＤａを示すかは不明であるが、例えばプ
ロテアーゼで切断され偶然に２５ｋＤａを示すと考えら
れる。この場合、天然型ヒトＨＤＧＦのＮ未満のアミノ
酸配列は決定されており、ｃＤＮＡより推定される配列
と一致していることを考えると、おそらくＣ末端側が切
断されていると考えられる。
に作成した組み換えタンパクの分子量とが異なるという
現象はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて散見される。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥでは、負電荷を持つＳＤＳがタンパクの疎水性
部位を中心に付着することによりタンパクの３次構造が
解消され、全体が一様に負電荷を帯るので、電気泳動に
より分子量にのみ依存してタンパクを分離することがで
きる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて異常な分子量がみられ
る原因はかならずしも明らかではないが、何らかの理由
でタンパクに付着するＳＤＳの量が異常になるためと考
えられている。たとえば組み換え型ヒトＨＤＧＦの場合
には、グルタミンなどの負電荷を持つアミノ酸が多いた
め（全体の約２５％）、ＳＤＳが付着する量が少なく、
したがって電気泳動度が少なくなり、見かけ上の分子量
が大きいように見えると考えられる。天然型ヒトＨＤＧ
Ｆがなぜ２５ｋＤａを示すかは不明であるが、例えばプ
ロテアーゼで切断され偶然に２５ｋＤａを示すと考えら
れる。この場合、天然型ヒトＨＤＧＦのＮ未満のアミノ
酸配列は決定されており、ｃＤＮＡより推定される配列
と一致していることを考えると、おそらくＣ末端側が切
断されていると考えられる。
【００２６】発明は、また、ヒトＨＤＧＦを認識する抗
体に関する。
体に関する。
【００２７】本発明により、ヒトＨＤＧＦを認識する抗
体であって、ヒト肝癌由来培養細胞ＨｕＨ−７の培養上
清を精製して得られたヒトＨＤＧＦに反応する抗体(a)
が提供される。
体であって、ヒト肝癌由来培養細胞ＨｕＨ−７の培養上
清を精製して得られたヒトＨＤＧＦに反応する抗体(a)
が提供される。
【００２８】本発明により、ヒトＨＤＧＦを認識する抗
体であって、すでに取得されているヒトＨＤＧＦをコー
ドする遺伝子を微生物細胞を宿主として発現させて得ら
れる組み換えヒトＨＤＧＦに反応する抗体(b)が提供さ
れる。
体であって、すでに取得されているヒトＨＤＧＦをコー
ドする遺伝子を微生物細胞を宿主として発現させて得ら
れる組み換えヒトＨＤＧＦに反応する抗体(b)が提供さ
れる。
【００２９】本発明により、また、ヒトＨＤＧＦを抗体
と結合させ共存成分と分離した後に、抗体と結合したヒ
トＨＤＧＦを回収するヒトＨＤＧＦの精製方法であっ
て、抗体として上記抗体(a)(b)を用いる方法が提供され
る。
と結合させ共存成分と分離した後に、抗体と結合したヒ
トＨＤＧＦを回収するヒトＨＤＧＦの精製方法であっ
て、抗体として上記抗体(a)(b)を用いる方法が提供され
る。
【００３０】一般に、抗体は抗原を兎等の実験動物に接
種することにより得ることができる。そのためには抗原
としてヒトＨＤＧＦが数ミリグラムは必要である。しか
しながらヒトＨＤＧＦはヒト肝癌由来培養細胞ＨｕＨ−
７の上清中にわずかしか存在しないので、多量の上清を
用意しないと十分量を抽出することはできない。たとえ
ばヒト肝癌由来培養細胞ＨｕＨ−７の培養上清２０リッ
ターを出発原料としたとき約０．１ｍｇ程度のヒトＨＤ
ＧＦを回収できるにすぎない。そこで本発明者は、大量
のヒトＨＤＧＦを得るためにヒトＨＤＧＦのアミノ酸を
コードする遺伝子を適当なホストーベクター系に組み込
んで発現させる方法を採用し、上記特許出願を行った。
当然のことながら組み換え型のヒトＨＤＧＦは培養上清
から抽出したヒトＨＤＧＦと同じアミノ酸配列を持つの
で同じ抗原性を持つと考えられる。発現させた組み換え
型のヒトＨＤＧＦを抗原として家兎に接種することによ
り本発明の抗体を得ることができる。またヒトＨＤＧＦ
を抗原とするときに、その抗原性を高めるために色々な
技術を応用することができる。フロイント・アジュバン
トは免疫原性を高めるために必要な成分の一つである。
種することにより得ることができる。そのためには抗原
としてヒトＨＤＧＦが数ミリグラムは必要である。しか
しながらヒトＨＤＧＦはヒト肝癌由来培養細胞ＨｕＨ−
７の上清中にわずかしか存在しないので、多量の上清を
用意しないと十分量を抽出することはできない。たとえ
ばヒト肝癌由来培養細胞ＨｕＨ−７の培養上清２０リッ
ターを出発原料としたとき約０．１ｍｇ程度のヒトＨＤ
ＧＦを回収できるにすぎない。そこで本発明者は、大量
のヒトＨＤＧＦを得るためにヒトＨＤＧＦのアミノ酸を
コードする遺伝子を適当なホストーベクター系に組み込
んで発現させる方法を採用し、上記特許出願を行った。
当然のことながら組み換え型のヒトＨＤＧＦは培養上清
から抽出したヒトＨＤＧＦと同じアミノ酸配列を持つの
で同じ抗原性を持つと考えられる。発現させた組み換え
型のヒトＨＤＧＦを抗原として家兎に接種することによ
り本発明の抗体を得ることができる。またヒトＨＤＧＦ
を抗原とするときに、その抗原性を高めるために色々な
技術を応用することができる。フロイント・アジュバン
トは免疫原性を高めるために必要な成分の一つである。
【００３１】こうして得られた抗体のヒトＨＤＧＦとの
反応性を確認するには、ウエスタンブロッティング法が
有効である。すなわち、ヒトＨＤＧＦを分子量マーカー
とともに変性条件下で電気泳動法により分離した後、こ
れをニトロセルロース膜にブロッティングする。こうし
てヒトＨＤＧＦを固定したセルロース膜に反応性をチェ
ックすべき抗体を接触させ、必要に応じて洗浄した後、
さらに抗体に対する標識抗体を反応させる。標識抗体の
結合を肉眼的に判定して反応性の比較を行う。あるいは
発色強度（酵素標識）やオートラジオグラフィー（ＲＩ
標識）の信号強度をデンシトメーターで測定することに
より、反応性の比較を定量的に行うことができる。な
お、後述する実施例で示すように、本発明の抗体は組み
換え型のヒトＨＤＧＦとの反応性を備えるとともに培養
上清より抽出した天然型のヒトＨＤＧＦとの反応性を有
する。
反応性を確認するには、ウエスタンブロッティング法が
有効である。すなわち、ヒトＨＤＧＦを分子量マーカー
とともに変性条件下で電気泳動法により分離した後、こ
れをニトロセルロース膜にブロッティングする。こうし
てヒトＨＤＧＦを固定したセルロース膜に反応性をチェ
ックすべき抗体を接触させ、必要に応じて洗浄した後、
さらに抗体に対する標識抗体を反応させる。標識抗体の
結合を肉眼的に判定して反応性の比較を行う。あるいは
発色強度（酵素標識）やオートラジオグラフィー（ＲＩ
標識）の信号強度をデンシトメーターで測定することに
より、反応性の比較を定量的に行うことができる。な
お、後述する実施例で示すように、本発明の抗体は組み
換え型のヒトＨＤＧＦとの反応性を備えるとともに培養
上清より抽出した天然型のヒトＨＤＧＦとの反応性を有
する。
【００３２】本発明は、また、抗体を利用したヒトＨＤ
ＧＦの精製方法を提供する。本発明の抗体をアフィニテ
ィークロマトグラフ法に応用してヒトＨＤＧＦを回収す
ることができる。すなわち培養上清などのヒトＨＤＧＦ
を含む材料をそのまま、あるいはイオン交換クロマトグ
ラフィー等で前処理した後に、本発明の抗体を固定した
カラムにアプライし、免疫反応によってヒトＨＤＧＦを
補足する。ヒトＨＤＧＦを補足したカラムを免疫学的な
結合に影響しない適当な緩衝液で洗浄した後、免疫学的
な結合を開烈する溶出剤でヒトＨＤＧＦを抗体からはず
して回収することにより、ヒトＨＤＧＦを高い効率で得
ることができる。溶出剤には１Ｍ以上の高濃度の尿素や
グアニジン等のカオトロピック剤が利用される。抗体ア
フィニティグラフ法は適当な界面活性剤の存在下で行っ
てもよい。また先に述べた組み換え型のヒトＨＤＧＦの
回収にも本発明の抗体を利用することができる。
ＧＦの精製方法を提供する。本発明の抗体をアフィニテ
ィークロマトグラフ法に応用してヒトＨＤＧＦを回収す
ることができる。すなわち培養上清などのヒトＨＤＧＦ
を含む材料をそのまま、あるいはイオン交換クロマトグ
ラフィー等で前処理した後に、本発明の抗体を固定した
カラムにアプライし、免疫反応によってヒトＨＤＧＦを
補足する。ヒトＨＤＧＦを補足したカラムを免疫学的な
結合に影響しない適当な緩衝液で洗浄した後、免疫学的
な結合を開烈する溶出剤でヒトＨＤＧＦを抗体からはず
して回収することにより、ヒトＨＤＧＦを高い効率で得
ることができる。溶出剤には１Ｍ以上の高濃度の尿素や
グアニジン等のカオトロピック剤が利用される。抗体ア
フィニティグラフ法は適当な界面活性剤の存在下で行っ
てもよい。また先に述べた組み換え型のヒトＨＤＧＦの
回収にも本発明の抗体を利用することができる。
【００３３】
【発明の実施の形態】以下に実施例を挙げ、本発明を更
に詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限す
るものではない。
に詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限す
るものではない。
【００３４】なお、下記実施例において、各操作は特に
明示がない限り、サムブルックらのマニュアル(Sambroo
k,J.ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2n
d. Ed., Vol.1-3, Cold Spring Harbour Laboratory, C
old Spring Harbour, New York (1989)に記載されてい
る方法に従って行った。また制限酵素等は市販のものを
用い、その具体的使用方法は市販品の指示に従って行っ
た。
明示がない限り、サムブルックらのマニュアル(Sambroo
k,J.ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2n
d. Ed., Vol.1-3, Cold Spring Harbour Laboratory, C
old Spring Harbour, New York (1989)に記載されてい
る方法に従って行った。また制限酵素等は市販のものを
用い、その具体的使用方法は市販品の指示に従って行っ
た。
【００３５】（実施例１） ａ） グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合
法による組み換え型のヒトＨＤＧＦの作成 １） ヒトＨＤＧＦ遺伝子の発現用ベクター（ＧＳＴと
の融合用ベクター）への組み込み。
法による組み換え型のヒトＨＤＧＦの作成 １） ヒトＨＤＧＦ遺伝子の発現用ベクター（ＧＳＴと
の融合用ベクター）への組み込み。
【００３６】ヒトＨＤＧＦ遺伝子を含むプラスミドｐＹ
ＫＴ２（特開平６−２２００９４号公報参照）を制限酵
素ＮｒｕＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、ヒトＨＤＧＦ遺
伝子を含む約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。次に
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパ
クを発現するために構築されたベクターｐＧＥＸ−３Ｘ
(Pharmacia社製またはSmith,D.B.ら Gene 67 (1988))を
制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
で切断末端を修復した後に、ＥｃｏＲＩで切断した。こ
のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで切断したｐＧＥＸ−３Ｘ
と、ＮｒｕＩおよびＥｃｏＲＩで切断したヒトＨＤＧＦ
遺伝子を含む約２．１ｋｂのＤＮＡ断片とを結合した。
構築されたベクターの塩基配列をダイデオキシ法により
確認、決定した。これをｐＧＥＸ２７と命名した。ｐＧ
ＥＸ２７上ではグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
遺伝子の下流にヒトＨＤＧＦ遺伝子が結合しており、か
つFactorXaプロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡ配列がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼ遺伝子とヒトＨＤＧＦ遺伝子の間に挿入されている
（図１参照）。従ってこれをFactorXaで切断した場合、
ヒトＨＤＧＦのＮ末端はＧｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｓｅ
ｒ−となり、最初のＧｌｙ−Ｉｌｅ−は人工的に付加し
たもので、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−以降は天然のヒトＨＤＧＦ
そのものである。
ＫＴ２（特開平６−２２００９４号公報参照）を制限酵
素ＮｒｕＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、ヒトＨＤＧＦ遺
伝子を含む約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。次に
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパ
クを発現するために構築されたベクターｐＧＥＸ−３Ｘ
(Pharmacia社製またはSmith,D.B.ら Gene 67 (1988))を
制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
で切断末端を修復した後に、ＥｃｏＲＩで切断した。こ
のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで切断したｐＧＥＸ−３Ｘ
と、ＮｒｕＩおよびＥｃｏＲＩで切断したヒトＨＤＧＦ
遺伝子を含む約２．１ｋｂのＤＮＡ断片とを結合した。
構築されたベクターの塩基配列をダイデオキシ法により
確認、決定した。これをｐＧＥＸ２７と命名した。ｐＧ
ＥＸ２７上ではグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
遺伝子の下流にヒトＨＤＧＦ遺伝子が結合しており、か
つFactorXaプロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡ配列がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼ遺伝子とヒトＨＤＧＦ遺伝子の間に挿入されている
（図１参照）。従ってこれをFactorXaで切断した場合、
ヒトＨＤＧＦのＮ末端はＧｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｓｅ
ｒ−となり、最初のＧｌｙ−Ｉｌｅ−は人工的に付加し
たもので、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−以降は天然のヒトＨＤＧＦ
そのものである。
【００３７】２）大腸菌内での発現と精製 構築されたｐＧＥＸ２７のＤＮＡを常法により調製し、
新たに大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。得られた形質転
換体を用いて融合タンパク（ＧＳＴ＋ＨＤＧＦ）の発
現、抽出、融合タンパクの切断、および組み換え型ＨＤ
ＧＦの精製を行った。その操作はスミスらの方法（Smit
hら、Gene 6731-40 (1988)または特公平６−８１５９
６）に従って行った。すなわち、ｐＧＥＸ２７を保持す
る大腸菌のコロニーを２５０ｍｌのＬＢ培地で３７℃で
一晩前培養した。１リッターの培地にこの前培養液１０
ｍｌを加えて３７℃で２時間培養した後に、融合タンパ
クの合成開始剤であるＩＰＴＧを１ｍＭになるように添
加した。この培養液をさらに約５時間３７℃で培養した
後に遠心して菌体を回収した。
新たに大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。得られた形質転
換体を用いて融合タンパク（ＧＳＴ＋ＨＤＧＦ）の発
現、抽出、融合タンパクの切断、および組み換え型ＨＤ
ＧＦの精製を行った。その操作はスミスらの方法（Smit
hら、Gene 6731-40 (1988)または特公平６−８１５９
６）に従って行った。すなわち、ｐＧＥＸ２７を保持す
る大腸菌のコロニーを２５０ｍｌのＬＢ培地で３７℃で
一晩前培養した。１リッターの培地にこの前培養液１０
ｍｌを加えて３７℃で２時間培養した後に、融合タンパ
クの合成開始剤であるＩＰＴＧを１ｍＭになるように添
加した。この培養液をさらに約５時間３７℃で培養した
後に遠心して菌体を回収した。
【００３８】この菌体をＳＴＥ緩衝液(10mM TrisHCl、 p
H8.0、 150mM NaCl、 1mM EDTA)で懸濁し、超音波破砕機
（Branson社製）でmicrotio tipを用いて２分間破砕し
た後に、遠心により融合タンパクを含むライセートを得
た。このライセートにグルタチオンセファロースビーズ
（Pharmacia社製）をリッターあたり８ｍｌ添加して４
℃で一晩反応を行った。グルタチオンセファロースビー
ズを遠心により回収してＰＢＳ緩衝液で十分に洗浄した
後に、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分析した
ところ約６７ｋＤａを示した（図２参照）。次に融合タ
ンパクの約１ｍｇに対してFactorXaを１unit加えて２２
℃、１６時間反応を行い融合タンパクを切断した。その
結果、大腸菌培養液１リッターあたり約５ｍｇの組み換
え型ヒトＨＤＧＦが得られた。その一部をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより分析したところ、組み換え型ヒトＨＤＧＦは
約４０ｋＤａの分子量を示した。また組み換え型ヒトＨ
ＤＧＦの分解産物と考えられる４０ｋＤａよりも小さい
分子量のバンドが多数見られた（図２参照）。
H8.0、 150mM NaCl、 1mM EDTA)で懸濁し、超音波破砕機
（Branson社製）でmicrotio tipを用いて２分間破砕し
た後に、遠心により融合タンパクを含むライセートを得
た。このライセートにグルタチオンセファロースビーズ
（Pharmacia社製）をリッターあたり８ｍｌ添加して４
℃で一晩反応を行った。グルタチオンセファロースビー
ズを遠心により回収してＰＢＳ緩衝液で十分に洗浄した
後に、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分析した
ところ約６７ｋＤａを示した（図２参照）。次に融合タ
ンパクの約１ｍｇに対してFactorXaを１unit加えて２２
℃、１６時間反応を行い融合タンパクを切断した。その
結果、大腸菌培養液１リッターあたり約５ｍｇの組み換
え型ヒトＨＤＧＦが得られた。その一部をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより分析したところ、組み換え型ヒトＨＤＧＦは
約４０ｋＤａの分子量を示した。また組み換え型ヒトＨ
ＤＧＦの分解産物と考えられる４０ｋＤａよりも小さい
分子量のバンドが多数見られた（図２参照）。
【００３９】組み換え型ヒトＨＤＧＦが異常な分子量を
示す原因として、組み換え型ヒトＨＤＧＦが二量体とな
っている可能性が考えられる。通常はたとえ組み換え型
ヒトＨＤＧＦがＳ−Ｓ結合により二量体化していてもＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ分析においては反応液中に含まれる２−
メルカプトエタノールによってＳ−Ｓ結合が分離される
ので、正しい分子量のバンドが示されるはずである。そ
こでＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の際に添加する２−メルカプ
トエタノールの量を増やしてみたが、組み換え型ヒトＨ
ＤＧＦの分子量に変化は認められなかった（データ省
略）。また組み換え型ヒトＨＤＧＦが二量体化した場合
の分子量は約５０ｋＤａでありＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果
とも合わない。これらの結果を解釈するには次の二とお
りの可能性が考えられる。
示す原因として、組み換え型ヒトＨＤＧＦが二量体とな
っている可能性が考えられる。通常はたとえ組み換え型
ヒトＨＤＧＦがＳ−Ｓ結合により二量体化していてもＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ分析においては反応液中に含まれる２−
メルカプトエタノールによってＳ−Ｓ結合が分離される
ので、正しい分子量のバンドが示されるはずである。そ
こでＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の際に添加する２−メルカプ
トエタノールの量を増やしてみたが、組み換え型ヒトＨ
ＤＧＦの分子量に変化は認められなかった（データ省
略）。また組み換え型ヒトＨＤＧＦが二量体化した場合
の分子量は約５０ｋＤａでありＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果
とも合わない。これらの結果を解釈するには次の二とお
りの可能性が考えられる。
【００４０】(1) 組み換え型ヒトＨＤＧＦは本来約４０
ｋＤａの分子量を示す。
ｋＤａの分子量を示す。
【００４１】(2) 組み換え型ヒトＨＤＧＦは産生されて
いないか、または非常に量が少なく、代わりに大腸菌由
来のタンパクが取得されている。
いないか、または非常に量が少なく、代わりに大腸菌由
来のタンパクが取得されている。
【００４２】これら二とおりの可能性の是非を検討する
ために、以下のような無細胞系を用いた組み換え型ヒト
ＨＤＧＦの産生を試みた。
ために、以下のような無細胞系を用いた組み換え型ヒト
ＨＤＧＦの産生を試みた。
【００４３】３）無細胞系を用いた放射能ラベルされた
組み換えヒトＨＤＧＦ遺伝子の作成大腸菌から抽出する
際の影響を除いた状態での組み換え型ヒトＨＤＧＦの分
子量を測定するために、無細胞タンパク合成系を用いて
組み換え型ヒトＨＤＧＦを作成した。無細胞系での組み
換え型ヒトＨＤＧＦの合成はPelhamrらの方法(Pelman,
H.R.B Eur. J. Biochem. (1976) 67 247)を基にしたウ
サギ赤血球ライセートシステム(TNT Coupled Reticuloc
yto Lysate System,Promega社製）を用いて行った。ヒ
トＨＤＧＦ遺伝子をこの無細胞系での発現のためのプラ
スミドｐＳＰ６４ｐｏｌｙＡ（Promega社製）に以下の
ように導入した。導入するｈＨＤＧＦのアミノ酸配列の
３番目のアルギニンから２４０番目のロイシンに対応す
る７１４塩基対のＤＮＡ配列の５' 末端側に制限酵素Ｈ
ｉｎｄIIIの配列(AAGCTT)を、３'末端側にＸｂａＩの配
列（ＴＣＴＡＧＡ）をそれぞれ結合した。そのためにこ
の領域をＰＣＲ(Polymerase chain reaction)で増幅す
るためのセンスプライマー(5' GCAAGCTTCGATCCAACCGGCA
GAAGGA-3' )とアンチセンスプラスマー(5' -GCTCTAGACA
GGCTCTCATGATCTCTGA-3' )をデザインした。これら両プ
ライマーをＤＮＡ自動合成機（モデル３９４、Applied
Biosystems社製）により合成し、ｈＨＤＧＦ ｃＤＮＡ
（特開平６−３４３４７０号公報参照）を鋳型としてＰ
ＣＲ反応を行った。１ｍｇのｈＨＤＧＦ ｃＤＮＡを含
むプラスミドをＴＥ緩衝液５０ｍｌに溶解させた。この
ｃＤＨＡ溶液５ｍｌに、合成したセンスプライマーおよ
びアンチセンスプライマーを各々１００ｐｍｏｌｅ添加
し、さらに１０ｍｌの１０倍濃度のアンプリフィケーシ
ョン溶液(500mM KCl,100mM Tris HCl pH8.3,15mM MgCl
2 ,0.1%(W/V)ゼラチン)および１６ｍｌのｄＮＴＰｓ
ｍｉｘ(1.25mM dATP, 1.25mM dGTP, 1.25mM dCTP, 1.25
mM dTTP)を添加し、水を加え、さらに０．５ｍｌのＴａ
ｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５units/ml，パーキンエルマ
ーシータス社製）を加え、反応液の容量を１００ｍｌと
した。この反応液を９４℃に３分間置いてｃＤＮＡを変
性させた。これをさらに９４℃で１分間放置して変性を
行い、５０℃で１分間放置してアニーリングを行い、つ
いで７２℃で２分間放置して伸張反応を行うという反応
を１５回行った。その後に７２℃で２分間放置して伸張
反応を完成させた。このようなＰＣＲ反応を計１０回行
い、その反応液すなわち１ｍｌ分の反応生成物を、微量
脱塩チューブ"Suprec-02"（宝酒造社製）によって脱
塩、濃縮した。チューブのメンブレン上に残った反応産
物を２０μｌのＴＥ緩衝液で回収した。回収したＰＣＲ
産物をＳｐｅＩ−ＸｂａＩで切断し、目的とする約７１
４ｂｐのバンドを得た。このｈＨＤＧＦの全長ｃＤＮＡ
断片をＳｐｅＩ−ＸｂａＩで切断したベクターｐＳＰ６
４ｐｏｌｙＡに導入し、組み換えプラスミドを得た。こ
れをｐＳＧ０４と命名した。
組み換えヒトＨＤＧＦ遺伝子の作成大腸菌から抽出する
際の影響を除いた状態での組み換え型ヒトＨＤＧＦの分
子量を測定するために、無細胞タンパク合成系を用いて
組み換え型ヒトＨＤＧＦを作成した。無細胞系での組み
換え型ヒトＨＤＧＦの合成はPelhamrらの方法(Pelman,
H.R.B Eur. J. Biochem. (1976) 67 247)を基にしたウ
サギ赤血球ライセートシステム(TNT Coupled Reticuloc
yto Lysate System,Promega社製）を用いて行った。ヒ
トＨＤＧＦ遺伝子をこの無細胞系での発現のためのプラ
スミドｐＳＰ６４ｐｏｌｙＡ（Promega社製）に以下の
ように導入した。導入するｈＨＤＧＦのアミノ酸配列の
３番目のアルギニンから２４０番目のロイシンに対応す
る７１４塩基対のＤＮＡ配列の５' 末端側に制限酵素Ｈ
ｉｎｄIIIの配列(AAGCTT)を、３'末端側にＸｂａＩの配
列（ＴＣＴＡＧＡ）をそれぞれ結合した。そのためにこ
の領域をＰＣＲ(Polymerase chain reaction)で増幅す
るためのセンスプライマー(5' GCAAGCTTCGATCCAACCGGCA
GAAGGA-3' )とアンチセンスプラスマー(5' -GCTCTAGACA
GGCTCTCATGATCTCTGA-3' )をデザインした。これら両プ
ライマーをＤＮＡ自動合成機（モデル３９４、Applied
Biosystems社製）により合成し、ｈＨＤＧＦ ｃＤＮＡ
（特開平６−３４３４７０号公報参照）を鋳型としてＰ
ＣＲ反応を行った。１ｍｇのｈＨＤＧＦ ｃＤＮＡを含
むプラスミドをＴＥ緩衝液５０ｍｌに溶解させた。この
ｃＤＨＡ溶液５ｍｌに、合成したセンスプライマーおよ
びアンチセンスプライマーを各々１００ｐｍｏｌｅ添加
し、さらに１０ｍｌの１０倍濃度のアンプリフィケーシ
ョン溶液(500mM KCl,100mM Tris HCl pH8.3,15mM MgCl
2 ,0.1%(W/V)ゼラチン)および１６ｍｌのｄＮＴＰｓ
ｍｉｘ(1.25mM dATP, 1.25mM dGTP, 1.25mM dCTP, 1.25
mM dTTP)を添加し、水を加え、さらに０．５ｍｌのＴａ
ｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５units/ml，パーキンエルマ
ーシータス社製）を加え、反応液の容量を１００ｍｌと
した。この反応液を９４℃に３分間置いてｃＤＮＡを変
性させた。これをさらに９４℃で１分間放置して変性を
行い、５０℃で１分間放置してアニーリングを行い、つ
いで７２℃で２分間放置して伸張反応を行うという反応
を１５回行った。その後に７２℃で２分間放置して伸張
反応を完成させた。このようなＰＣＲ反応を計１０回行
い、その反応液すなわち１ｍｌ分の反応生成物を、微量
脱塩チューブ"Suprec-02"（宝酒造社製）によって脱
塩、濃縮した。チューブのメンブレン上に残った反応産
物を２０μｌのＴＥ緩衝液で回収した。回収したＰＣＲ
産物をＳｐｅＩ−ＸｂａＩで切断し、目的とする約７１
４ｂｐのバンドを得た。このｈＨＤＧＦの全長ｃＤＮＡ
断片をＳｐｅＩ−ＸｂａＩで切断したベクターｐＳＰ６
４ｐｏｌｙＡに導入し、組み換えプラスミドを得た。こ
れをｐＳＧ０４と命名した。
【００４４】１μｇのｐＳＧ０４を、４μｌの35Ｓ−メ
チオニン（Amersham社製）とともに、５０μｌのウサギ
赤血球ライセートシステムに添加したところ、ヒトＨＤ
ＧＦ遺伝子が転写され翻訳されて組み換え型のヒトＨＤ
ＧＦが作成された。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離
し、Ｘ線フィルムに感光させて分析したところ、やはり
組み換え型ヒトＨＤＧＦは約４０ｋＤａの分子量を示し
た（図３参照）。
チオニン（Amersham社製）とともに、５０μｌのウサギ
赤血球ライセートシステムに添加したところ、ヒトＨＤ
ＧＦ遺伝子が転写され翻訳されて組み換え型のヒトＨＤ
ＧＦが作成された。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離
し、Ｘ線フィルムに感光させて分析したところ、やはり
組み換え型ヒトＨＤＧＦは約４０ｋＤａの分子量を示し
た（図３参照）。
【００４５】以上より組み換え型ヒトＨＤＧＦは約４０
ｋＤａの分子量を示すものであると考えられる。
ｋＤａの分子量を示すものであると考えられる。
【００４６】４）組み換え型ヒトＨＤＧＦの動物細胞に
対する増殖活性の測定 得られた組み換え型ヒトＨＤＧＦは天然型のヒトＨＤＧ
Ｆと同じく増殖活性をもつか否かを検証するために、こ
れを天然型ヒトＨＤＧＦの場合と同じくＳｗｉｓｓ３Ｔ
３細胞に作用させて 3Ｈトリチウムの取り込みを指標と
して増殖活性を測定した。Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞に対す
るＤＮＡ合成刺激はガンバリニらの方法(Gambarini,A.,
G.ら (1982) J. Bio. Chem. 257, 9692-9697.)に従っ
て、放射性物質である 3Ｈ−チミジン(thymidine)の細
胞への取り込みを以下のように測定した。Ｓｗｉｓｓ３
Ｔ３細胞を２５ｃｍ2 のフラスコで、１０％子牛血清、
６０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＤＭＥ培地で、３
７℃、５％炭酸ガスで維持した。常法によりトリプシン
処理し、９６ウエルのマルチウエルプレートに１ウエル
当たり３×１０3 個の細胞を分注し、２００μｌの１０
％子牛血清、６０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＤＭ
Ｅ培地で、３７℃、５％炭酸ガスで４８時間培養した。
その後に各ウエルの培地を１５０μｌの０．２％子牛血
清、６０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＤＭＥ培地で
置換して、３７℃、５％炭酸ガスで３６時間培養した。
この操作により細胞を血清飢餓の状態(serum-stavatio
n)にすることができた。各ウエルに２０μｌの組み換え
型ヒトＨＤＧＦサンプル（２ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７
℃、５％炭酸ガスで２０時間培養することによってＳｗ
ｉｓｓ３Ｔ３細胞の増殖を刺激した。その後に０．５μ
Ｃｉの 3Ｈ−チミジンを加え、３７℃、５％炭酸ガスで
４時間培養することによって、 3Ｈ−チミジンを細胞に
取り込ませた。陰性コントロールとしてリン酸緩衝液Ｐ
ＢＳを、陽性コントロールとして１０％牛胎児血清を使
用した。細胞内のＤＮＡの取り込まれた 3Ｈ−チミジン
の放射活性は、セルハーベスターによってグラスフィル
ター上に細胞を集めた後、液体シンチレーションカウン
ターにて測定した。その結果を表１に示す。対照のリン
酸緩衝液ＰＢＳに比べて本発明の組み換え型ヒトＨＤＧ
Ｆでは明らかに 3Ｈ−チミジンの取り込みが増えてお
り、増殖活性を確認することができた。よって組み換え
型ヒトＨＤＧＦは天然型ＨＤＧＦと同じ増殖活性を示す
ことが認められた。
対する増殖活性の測定 得られた組み換え型ヒトＨＤＧＦは天然型のヒトＨＤＧ
Ｆと同じく増殖活性をもつか否かを検証するために、こ
れを天然型ヒトＨＤＧＦの場合と同じくＳｗｉｓｓ３Ｔ
３細胞に作用させて 3Ｈトリチウムの取り込みを指標と
して増殖活性を測定した。Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞に対す
るＤＮＡ合成刺激はガンバリニらの方法(Gambarini,A.,
G.ら (1982) J. Bio. Chem. 257, 9692-9697.)に従っ
て、放射性物質である 3Ｈ−チミジン(thymidine)の細
胞への取り込みを以下のように測定した。Ｓｗｉｓｓ３
Ｔ３細胞を２５ｃｍ2 のフラスコで、１０％子牛血清、
６０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＤＭＥ培地で、３
７℃、５％炭酸ガスで維持した。常法によりトリプシン
処理し、９６ウエルのマルチウエルプレートに１ウエル
当たり３×１０3 個の細胞を分注し、２００μｌの１０
％子牛血清、６０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＤＭ
Ｅ培地で、３７℃、５％炭酸ガスで４８時間培養した。
その後に各ウエルの培地を１５０μｌの０．２％子牛血
清、６０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＤＭＥ培地で
置換して、３７℃、５％炭酸ガスで３６時間培養した。
この操作により細胞を血清飢餓の状態(serum-stavatio
n)にすることができた。各ウエルに２０μｌの組み換え
型ヒトＨＤＧＦサンプル（２ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７
℃、５％炭酸ガスで２０時間培養することによってＳｗ
ｉｓｓ３Ｔ３細胞の増殖を刺激した。その後に０．５μ
Ｃｉの 3Ｈ−チミジンを加え、３７℃、５％炭酸ガスで
４時間培養することによって、 3Ｈ−チミジンを細胞に
取り込ませた。陰性コントロールとしてリン酸緩衝液Ｐ
ＢＳを、陽性コントロールとして１０％牛胎児血清を使
用した。細胞内のＤＮＡの取り込まれた 3Ｈ−チミジン
の放射活性は、セルハーベスターによってグラスフィル
ター上に細胞を集めた後、液体シンチレーションカウン
ターにて測定した。その結果を表１に示す。対照のリン
酸緩衝液ＰＢＳに比べて本発明の組み換え型ヒトＨＤＧ
Ｆでは明らかに 3Ｈ−チミジンの取り込みが増えてお
り、増殖活性を確認することができた。よって組み換え
型ヒトＨＤＧＦは天然型ＨＤＧＦと同じ増殖活性を示す
ことが認められた。
【００４７】
【表１】 ｂ）抗体の作成 組み換え型のヒトＨＤＧＦを０．０５％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗ
ｅｅｎ２０を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
６）で１ｍｇ／ｍｌに調整した後、フロイント・アジュ
バント（シグマ社製）と等量混合し、十分に乳化させ
た。この乳化液１ｍｌを家兎の四肢に免疫した。免疫は
二週間ごとに行った。４カ月後に得られた抗血清を４０
％硫安分画してＩｇＧを回収し、ＰＢＳに対して透析
し、本発明による抗ヒトＨＤＧＦ抗体（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を得た。
ｅｅｎ２０を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
６）で１ｍｇ／ｍｌに調整した後、フロイント・アジュ
バント（シグマ社製）と等量混合し、十分に乳化させ
た。この乳化液１ｍｌを家兎の四肢に免疫した。免疫は
二週間ごとに行った。４カ月後に得られた抗血清を４０
％硫安分画してＩｇＧを回収し、ＰＢＳに対して透析
し、本発明による抗ヒトＨＤＧＦ抗体（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を得た。
【００４８】ｃ）抗体の反応性 得られた抗体の反応性をウエスタンブロッティング法に
よって検討した。ブロッティングするサンプルは培養細
胞ＨｕＨ−７の培養上清中の天然型のヒトＨＤＧＦと大
腸菌より抽出した組み換え型のヒトＨＤＧＦである。
よって検討した。ブロッティングするサンプルは培養細
胞ＨｕＨ−７の培養上清中の天然型のヒトＨＤＧＦと大
腸菌より抽出した組み換え型のヒトＨＤＧＦである。
【００４９】培養上清は限外濾過法により約１００倍程
度に濃縮して使用した。組み換え型のヒトＨＤＧＦは１
ｍｇ／ｍｌ濃度で使用した。ウエスタンブロッティング
の具体的操作はＳａｍｂｒｏｏｋらの文献“Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”に記載されている方法に從
った。すなわち、ブロッティングするサンプルの各１０
μｌを４−２０％のアクリルアミドゲルで分離した後に
ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ社製）に転写（ブロ
ッティング）した。このブロッティングしたニトロセル
ロース膜を０．０５％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含む
ＰＢＳで洗浄した後、５％牛血清アルブミンを含むＰＢ
Ｓを加えて一晩放置してブロッキングを行った。牛血清
アルブミンを含むＰＢＳを除いた後、０．０５％（Ｗ／
Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで膜を２回洗浄した
後、１００倍希釈した本発明の抗体を含むＰＢＳを加え
て室温で２時間放置し反応させた。０．０５％（Ｗ／
Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで膜を３回洗浄した
後、２５ｎｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗兎
ＩｇＧ抗体（ベクタステイン社製）を５０μｌ加え、室
温で２時間放置し、抗原抗体反応をさせた。０．０５
（Ｗ／Ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで膜を３回洗浄し
た後、発色溶液（20mg diaminobenzidine, 20mg imidaz
ole, 10μl H2O2を含むＰＢＳ）を加えて室温で約１５
分放置して発色反応させた。この結果、図４で示すよう
に、本発明の抗体は組み換え型のヒトＨＤＧＦとの反応
性を備えるとともに培養上清より抽出した天然型のヒト
ＨＤＧＦとの反応性も有することが判明した。「ａ）組
み換え型のヒトＨＤＧＦの作成」の項で述べたように、
組み換え型のヒトＨＤＧＦはアクリルアミドゲルで分離
した場合分子量約４０ｋＤａを示した。図４の組み換え
型のヒトＨＤＧＦ（レーン１）の場合にはこの分子量約
４０ｋＤａのバンドが発色した。一方、培養細胞ＨｕＨ
−７の培養上清中の天然型のヒトＨＤＧＦは約２５ｋＤ
ａを示すタンパクとして抽出されてきた。図４の天然型
のヒトＨＤＧＦ（レーン２）の場合にはこの分子量約２
５ｋＤａのバンドが発色したのみならず、分子量約４０
ｋＤａ付近のバンドも薄く発色した。このことは、天然
型のヒトＨＤＧＦも本来は分子量約４０ｋＤａを示す
が、何らかの修飾（例えばプロテアーゼによる切断等）
を受けて偶然に分子量約２５ｋＤａを示すのではないか
という考えを支持する。
度に濃縮して使用した。組み換え型のヒトＨＤＧＦは１
ｍｇ／ｍｌ濃度で使用した。ウエスタンブロッティング
の具体的操作はＳａｍｂｒｏｏｋらの文献“Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”に記載されている方法に從
った。すなわち、ブロッティングするサンプルの各１０
μｌを４−２０％のアクリルアミドゲルで分離した後に
ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ社製）に転写（ブロ
ッティング）した。このブロッティングしたニトロセル
ロース膜を０．０５％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含む
ＰＢＳで洗浄した後、５％牛血清アルブミンを含むＰＢ
Ｓを加えて一晩放置してブロッキングを行った。牛血清
アルブミンを含むＰＢＳを除いた後、０．０５％（Ｗ／
Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで膜を２回洗浄した
後、１００倍希釈した本発明の抗体を含むＰＢＳを加え
て室温で２時間放置し反応させた。０．０５％（Ｗ／
Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで膜を３回洗浄した
後、２５ｎｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗兎
ＩｇＧ抗体（ベクタステイン社製）を５０μｌ加え、室
温で２時間放置し、抗原抗体反応をさせた。０．０５
（Ｗ／Ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで膜を３回洗浄し
た後、発色溶液（20mg diaminobenzidine, 20mg imidaz
ole, 10μl H2O2を含むＰＢＳ）を加えて室温で約１５
分放置して発色反応させた。この結果、図４で示すよう
に、本発明の抗体は組み換え型のヒトＨＤＧＦとの反応
性を備えるとともに培養上清より抽出した天然型のヒト
ＨＤＧＦとの反応性も有することが判明した。「ａ）組
み換え型のヒトＨＤＧＦの作成」の項で述べたように、
組み換え型のヒトＨＤＧＦはアクリルアミドゲルで分離
した場合分子量約４０ｋＤａを示した。図４の組み換え
型のヒトＨＤＧＦ（レーン１）の場合にはこの分子量約
４０ｋＤａのバンドが発色した。一方、培養細胞ＨｕＨ
−７の培養上清中の天然型のヒトＨＤＧＦは約２５ｋＤ
ａを示すタンパクとして抽出されてきた。図４の天然型
のヒトＨＤＧＦ（レーン２）の場合にはこの分子量約２
５ｋＤａのバンドが発色したのみならず、分子量約４０
ｋＤａ付近のバンドも薄く発色した。このことは、天然
型のヒトＨＤＧＦも本来は分子量約４０ｋＤａを示す
が、何らかの修飾（例えばプロテアーゼによる切断等）
を受けて偶然に分子量約２５ｋＤａを示すのではないか
という考えを支持する。
【００５０】
【発明の効果】本発明により、工業的に取扱いの容易な
大腸菌等の原核細胞の発現系を用いて、増殖活性を有す
る組み換え型ヒトＨＤＧＦを得ることができる。該組み
換え型ヒトＨＤＧＦは研究試薬としてまた医薬品等に利
用されうる。
大腸菌等の原核細胞の発現系を用いて、増殖活性を有す
る組み換え型ヒトＨＤＧＦを得ることができる。該組み
換え型ヒトＨＤＧＦは研究試薬としてまた医薬品等に利
用されうる。
【００５１】本発明により、抗原性物質であるヒトＨＤ
ＧＦの免疫学的な解析・測定に有用な抗体を提供するこ
とができる。さらに本発明はヒトＨＤＧＦの精製に有用
である。
ＧＦの免疫学的な解析・測定に有用な抗体を提供するこ
とができる。さらに本発明はヒトＨＤＧＦの精製に有用
である。
【図１】 ヒトＨＤＧＦ遺伝子を原核発現用ベクターｐ
ＧＥＸ−３Ｘ（ＧＳＴとの発現用ベクター）へ組み込ん
で作成したＰＧＥＸ２７の構造を示す開裂地図である。
ＧＥＸ−３Ｘ（ＧＳＴとの発現用ベクター）へ組み込ん
で作成したＰＧＥＸ２７の構造を示す開裂地図である。
【図２】 大腸菌内で発現させ精製した融合タンパク
（レーン１）および切り離して精製した組み換え型ヒト
ＨＤＧＦ（レーン２）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によ
り分析した結果を示すものである。
（レーン１）および切り離して精製した組み換え型ヒト
ＨＤＧＦ（レーン２）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によ
り分析した結果を示すものである。
【図３】ウサギ赤血球ライセートシステムを用いて放射
能ラベルされた組み換え型ヒトＨＤＧＦタンパクをＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ電気泳動により分析した結果を示すもので
ある。
能ラベルされた組み換え型ヒトＨＤＧＦタンパクをＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ電気泳動により分析した結果を示すもので
ある。
【図４】 本発明の抗体の反応性を天然型のヒトＨＤＧ
Ｆ（レーン１）および組み換え型のヒトＨＤＧＦ（レー
ン２）に対してウエスタンブロットにより調べた結果を
示すものである。
Ｆ（レーン１）および組み換え型のヒトＨＤＧＦ（レー
ン２）に対してウエスタンブロットにより調べた結果を
示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/28 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＳ Ｃ１２Ｎ 1/21 ＡＤＳ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＥＥ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (11)
- 【請求項１】 増殖活性を有する、原核発現された組み
換え型のヒト肝癌細胞由来増殖因子タンパク。 - 【請求項２】 上記増殖因子タンパクをコードするＤＮ
Ａ配列を含有する発現ベクターを含んでなる原核宿主細
胞により発現されたものである、請求項１記載のタンパ
ク。 - 【請求項３】 上記原核細胞が大腸菌である、請求項１
または２に記載のタンパク。 - 【請求項４】 原核性プロモーター配列に作用可能に連
結されたヒト肝癌細胞由来増殖因子タンパクをエンコー
ドするＤＮＡ配列を含んでなる原核発現ベクター。 - 【請求項５】 図１に示す開裂地図で表される、請求項
４記載のベクター。 - 【請求項６】 請求項４または５記載のベクターを含ん
でなる原核細胞。 - 【請求項７】 上記原核細胞が大腸菌である、請求項６
記載の細胞。 - 【請求項８】 請求項１〜３のいずれかに記載のタンパ
クを含む研究試薬および医薬物。 - 【請求項９】 ヒト肝癌由来増殖因子を認識する抗体で
あって、ヒト肝癌由来培養細胞ＨｕＨ−７の培養上清を
精製して得られたヒト肝癌由来増殖因子に反応する抗
体。 - 【請求項１０】 ヒト肝癌由来増殖因子を認識する抗体
であって、すでに取得されているヒト肝癌由来増殖因子
をコードする遺伝子を微生物細胞を宿主として発現させ
て得られる組み換えヒト肝癌由来増殖因子に反応する抗
体。 - 【請求項１１】 ヒト肝癌由来増殖因子を抗体と結合さ
せ共存成分と分離した後に、抗体と結合したヒト肝癌由
来増殖因子を回収するヒト肝癌由来増殖因子の精製方法
であって、抗体として請求項９または１０記載のものを
用いる方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9274608A JPH11103859A (ja) | 1997-10-07 | 1997-10-07 | 組み換え型ヒト肝癌細胞由来増殖因子、およびヒト肝癌細胞由来増殖因子を認識する抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9274608A JPH11103859A (ja) | 1997-10-07 | 1997-10-07 | 組み換え型ヒト肝癌細胞由来増殖因子、およびヒト肝癌細胞由来増殖因子を認識する抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11103859A true JPH11103859A (ja) | 1999-04-20 |
Family
ID=17544110
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9274608A Withdrawn JPH11103859A (ja) | 1997-10-07 | 1997-10-07 | 組み換え型ヒト肝癌細胞由来増殖因子、およびヒト肝癌細胞由来増殖因子を認識する抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11103859A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008054431A3 (en) * | 2005-12-23 | 2009-07-09 | Univ Texas | Anti-hyperproliferative therapies targeting hdgf |
-
1997
- 1997-10-07 JP JP9274608A patent/JPH11103859A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008054431A3 (en) * | 2005-12-23 | 2009-07-09 | Univ Texas | Anti-hyperproliferative therapies targeting hdgf |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040217 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070314 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20070515 |