PL184284B1

PL184284B1 - Kompozycja paszy dla zwierząt i sposób wytwarzania kompozycji paszy

Info

Publication number: PL184284B1
Application number: PL96318138A
Authority: PL
Inventors: Robert F. Beudeker; Arie K. Kies
Original assignee: Gist Brocades Bv
Priority date: 1995-05-15
Filing date: 1996-05-15
Publication date: 2002-09-30
Also published as: NL1003096A1; AU5225596A; AR001939A1; NZ286574A; BR9606365A; DE69633480T2; SI9620013B; JPH0998726A; PL318138A1; CN1099841C; CN1156955A; DE69633480D1; RO117142B1; TW480175B; ATE277524T1; IL118245A; CZ296039B6; WO1996036244A1; CZ11197A3; IL118245A0

Abstract

1 . Kompozycja paszy dla zwierzat polepszajaca wydajnosc wykorzystania paszy i pobudzajacej wzrost zwierzat, znamienna tym, ze zawiera fosfolipidowa substancje pokarmowa, korzystnie lecy- tyne i dodatek fosfolipazowy w postaci enzymu fosfolipazy A1 i/lub A2 w ilosci od 1000 do 5000000 jednostek miedzynarodowych fosfolipazy na kg fosfolipidu, przy czym fosfolipaza wystepuje w steze- niu okolo 100-1000 jednostek miedzynarodowych na kg paszy. 4. Sposób wytwarzania kompozycji paszy, dla zwierzat polepszajacej wydajnosc wykorzysta- nia paszy i pobudzajacej wzrost zwierzat, znamienny tym, ze do paszy zawierajacej fosfolipidowa substancje pokarmowa, korzystnie lecytyne dostarcza sie fosfolipaze A1 i/lub A2 w ilosci od 1000 do 5000000jednostek miedzynarodowych fosfolipazy na kg fosfolipidu, przy czym fosfolipaze dostar- cza sie w stezeniu okolo 100-1000 jednostek miedzynarodowych na kg paszy, a nastepnie miesza sie do jednorodnego wymieszania sie skladników. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania kompozycji paszy dla zwierząt polepszającej wydajność wykorzystania paszy i pobudzającej wzrost zwierząt, polegający na tym, że do paszy zawierającej fosfolipidowąsubstancję pokarmową korzystnie lecytynę dostarcza się fosfolipazę Al i/lub A2 w ilości od 1000 do 5000000jednostek międzynarodowych fosfolipazy na kg fosfolipidu, przy czym fosfolipazę dostarcza się w stężeniu około 100-1000jednostek

184 284 międzynarodowych na kg paszy, a następnie miesza się do jednorodnego wymieszania się składników.

Jako fosfolipazę korzystnie stosuje się fosfolipazę pochodzącą od ssaka, rośliny lub drobnoustroju.

Bardziej korzystnie, jako fosfolipazę stosuje się fosfolipazę A2 ssaka wybraną z grupy, obejmującej fosfolipazę A2 bydlęcą, świńską, mysią, szczurzą i ludzką.

Sposób według wynalazku pozwalana dostarczenie kompozycji poprawiającej wydajność i pobudzenie wzrostu zwierząt przez to, że zwierzę karmi się dietą, obejmującąkompozycję, zawierającą substancję pokarmową i gotowy do użytku dodatek fosfolipazowy.

Niniejszy wynalazek opiera się na użyciu dodanych zewnątrz i gotowych do użytku fosfolipaz, w paszach dla zwierząt, poprawiających właściwości emulgujące fosfolipidów w przewodzie żołądkowe-jelitowym i przez to polepszających wydajność wykorzystania paszy i/lub pobudzających wzrost zwierząt. Pobudzenie wzrostu zwierząt określa się tu jako pobudzenie wzrostu w kategoriach przyrostu ciężaru w czasie (prędkość wzrostu) i/lub pobudzenie wzrostu w kategoriach wykorzystania paszy (współczynnik przetworzenia paszy).

Fosfolipazy, które można stosować w wynalazku obejmują:

fosfolipazę Al (EC 3.1.1.32), fosfolipazę A2, fosfolipazę B (lizofosfolipazę), fosfolipazę C i fosfolipazę D.

W szczególności niniejszy wynalazek opisuje zastosowanie paszy, do której dodaje się fosfolipazę Al i/lub A2 (EC 3.1.1.4). Fosfolipazę A2 można wytworzyć przez wyodrębnienie np. z trzustki świńskiej jako półprodukt np. przy produkcji insuliny. Ewentualnie, fosfolipazę A2 można wytworzyć przy użyciu rekombinantów, przez ekspresję genu heterologicznego w drobnoustroju, takim jak np. Kluyveromyces lactis. Enzym uzyskuje się z takich drobnoustrojów drogą fermentacji i dalszego działania prowadzącego do odzyskania enzymu.

Innąmożliwościąpozaustrojowego dodawania fosfolipaz do paszy, zawierającej lecytynę, jest dodanie materiałów z roślin transgenicznych, zawierających fosfolipazę, korzystnie transgenicznych nasion, w których fosfolipazę zsyntetyzowano przez ekspresję genu heterologicznego. Aby to uzyskać, gen kodujący fosfolipazę klonuje się w wektorze ekspresji rośliny, pod kontrolą sygnałów ekspresji odpowiedniej rośliny, np. specyficznego promotora tkankowego, takiego jak specyficznego promotora nasienia. Wektor ekspresji, zawierający gen fosfolipazy transformuje się następnie do komórek roślinnych i transformowane komórki roślinne selekcjonuje w celu odtworzenia całej rośliny. Tak otrzymane rośliny transgeniczne można uprawiać i zbierać, a te części roślin, które zawierająheterologicznąfosfolipazę, można włączyć do paszy dla zwierząt, albo jako takie, albo po dalszym przetworzeniu. Heterologiczną fosfolipazę mogą zawierać nasiona roślin transgenicznych lub inne surowce roślinne, takie jak korzenie, łodygi, liście, drewno, kwiaty, kora i/lub owoce.

Tak więc dodatek fosfolipazowy rozumie się jako fosfolipazę, która nie jest naturalnym składnikiem głównej substancji pokarmowej lub nie jest w niej obecna w swym naturalnym stężeniu, np. fosfolipaza dodana jest do paszy oddzielnie od substancji pokarmowej, sama lub w połączeniu z innymi dodatkami paszowymi, albo fosfolipaza jest integralną częścią jednego ze składników pokarmowych, lecz wytworzoną przy użyciu technologii rekombinantów DNA.

Gotowy do użytku dodatek fosfolipazowy określa się tujako dodatek, który nie wytwarza się in situ w paszy zwierzęcej. Gotowy do użytku dodatek fosfolipazowy można podawać zwierzętom bezpośrednio, lub korzystnie, bezpośrednio po zmieszaniu z innymi składnikami paszy. Gotowe do użytku dodatki fosfolipazowe obejmują fosfolipazy w nieaktywnej postaci wstępnej, ale które można aktywować w przewodzie żołądkowo-jelitowym np. przez działanie proteolityczne.

Zalecana pasza zawiera fosfolipid, korzystnie lecytynę, albo obecną w surowcach, jak np. zarówno w pełnotłustym ziarnie soi, pełnotłustym ziarnie rzepakowym, oleju sojowym, oleju rzepakowym jak każdych innych nasionach oleistych albo w oleju bogatym w lecytynę, jako dodatek do zewnętrznie dodanej fosfolipazy, którąjest korzystnie świńska fosfolipaza A2 (wytworzona

184 284 przez drobnoustroje). Jednakże pasza nie musi zawierać fosfolipidu, ponieważ trzustka już wydziela fosfolipid.

Innym aspektem tego wynalazkujest to, że fosfolipazę, korzystnie świńską fosfolipazę A2 (wytworzonąprzez drobnoustroje) włącza się do preparatów mlekozastępczych, zawierających lecytynę dla młodych zwierząt. Poprawia to zdolność trawienia tłuszczu przez młode zwierzęta.

Jeszcze innym aspektem tego wynalazku jest to, że fosfolipazę włącza się do diet dla ryb i skorupiaków w celu poprawienia wzrostu i współczynnika przetwarzania paszy.

Po potraktowaniu np. fosfolipaząA2 (PLA2) wartość HLB lecytyny wzrasta od 7 do około 8 lub 9, co może przyczynić się do korzystnego wpływu traktowania fosfolipazą A2 na właściwości emulgujące lecytyny.

Świńska fosfolipaza A2 nie wykazuje aktywności in vitro poniżej pH 6,0. W przewodzie żołądkowo-jelitowym zwierząt monogastrycznych pH wynosi przeważnie poniżej 6,0 w wolu i żołądku.

Nie powinno się oczekiwać żadnych korzystnych skutków dodania fosfolipazy A2 ponieważ:

a) nie oczekuje się aktywności dodanej fosfolipazy w wolu i żołądku, z powodu niezgodności między pH przeważającym, a pH odpowiadającemu enzymowi;

b) oraz same zwierzęta wydzielają wielkie ilości tego enzymu w górnej części jelita cienkiego, gdzie przeważające pH jest na tym samym poziomie, co pH odpowiadające enzymowi.

Nieoczekiwanie okazało się że, na skutek zewnętrznego dodania świńskiej fosfolipazy A2 obserwuje się znaczny wzrost współczynnika przetworzenia paszy u brojlerów (przykład 1).

Oprócz zwierząt monogastrycznych, fosfolipazę A2 można także z korzyścią stosować u zwierząt wielożołądkowych. Np. w czasie wczesnej laktacji u wysoko produkcyjnych krów mlecznych, korzystnejest włączenie do ich diet dużych ilości tłuszczu, aby wyrównać częściowo wielki niedobór energii. Znane jest z literatury, że strawność kwasów tłuszczowych w przewodzie żołądkowo-jelitowym krów mlecznych zmienia się w zależności od inter alia składu dawki i źródła tłuszczu. Stwierdzono, że strawność kwasu tłuszczowego zmienia się od 87% dla diety, zawierającej 500 g nasyconego tłuszczu bogatego w kwas palmitynowy (Cl 6:0) do 64% dla diety, zawierającej 1000 g nasyconego tłuszczu bogatego w kwas stearynowy (Cl 8:0) (Weisbjerg i in., Acta Agric. Scand, Section A, Animal Sciences 42 str. 115-120,1992).

Dużą część zmienności w strawności kwasów tłuszczowych u krów mlecznych tłumaczy się zmiennością w strawności w jelicie cienkim (jak wyżej, str. 114-120). Działanie fosfolipazy A2 w jelicie cienkim prawdopodobnie podnosi strawność kwasów tłuszczowych.

Białka, takie jak enzym fosfolipaza A2 zwykle szybko ulegają rozkładowi w żwaczu. W związku z tym, białka te powinno się dostarczać dojelita cienkiego drogą, która zabezpieczyje przed rozkładem w żwaczu. Dla fachowców dostępnych jest wiele metod sporządzenia preparatów, zabezpieczających enzym przed inaktywacją w żwaczu.

Stwierdzono istotne polepszenie zdolności trawienia tłuszczu przez nie przeżuwające cielęta, dzięki dodaniu fosfolipazy, w szczególności świńskiej fosfolipazy A2 (przykład 2).

Diety dla ryb i skorupiaków często także uzupełnia się odpowiednio wysokim stężeniem fosfolipidów w celu osiągnięcia oczekiwanego wzrostu, zdrowia i przetworzenia paszy. Według wynalazku fosfolipazy można także dodawać do tych diet dla dalszego poprawienia wzrostu i współczynnika przetworzenia paszy.

Jeszcze dalszym aspektem wynalazku jest to, że dodanie fosfolipazy i ewentualnie fosfolipidu do paszy zwierzęcej pozwoli na obniżenie ilości drogich składników paszy, takich jak witaminy i/lub barwniki, włączanych do niej.

Fosfolipazę można dodawać do paszy w stężeniu, które zmienia się w zależności od typu i stężenia fosfolipidu i karmionego zwierzęcia, generalnie od około 1000-5000000 jednostek międzynarodowych IU (jednąjednostkę IU określa się jako ilość enzymu produkującego 1 mikromol wolnego kwasu tłuszczowego na minutę w standardowych warunkach: substrat żółtka jaja (0,4% fosfolipidów), pH 8, 40°C, 6 mM Ca²⁺) na kg fosfolipidu.

184 284

Dodaje się korzystnie około 10000-500000 IU na kg fosfolipidu. Zazwyczaj, pasze zwierzęce zawierają około 1-2 kg fosfolipidu na kg. W rezultacie, odpowiednia będzie wielkość 1-10000 IU/kg lub korzystnie 10-1000 IU/kg paszy, jednakże najbardziej zalecanajest wielkość około 100-1000 IU/kg paszy. Co za tym idzie, dozowanie fosfolipazy dodawanej do paszy można dostosować w przypadku niespotykanej zawartości fosfolipidu w paszy.

Fosfolipazę można otrzymać przy użyciu technologii rekombinantów DNA, na przykład stosując heterologiczną ekspresję genu fosfolipazy lub cDNA w odpowiednim organizmie gospodarza lub, alternatywnie, przez homologicznąnadekspresję odpowiedniego genu wewnątrzustrojowego.

Jak wykazano można też stosować świńską fosfolipazę A2, którą wytworzono dzięki ekspresji genu heterologicznego w drożdżach Kluyveromyces lactis lub otrzymaną z innych źródeł. Fosfolipazy takie mogą pochodzić od innych ssaków, takich jak np. szczurów, myszy lub ludzi, dla których geny fosfolipazy A2 są osiągalne w istniejącym stanie techniki. Alternatywnie, fosfolipazy mogąpochodzić od organizmów innych niż ssaki, takjak np. fosfolipazy drobnoustrojowe lub nawet roślinne.

Po przeprowadzeniu ekspresji genu fosfolipazy A2 w drożdżach można metodami biochemicznymi wytworzyć stabilny preparat enzymatyczny (przykład 3).

Podobnie, drobnoustroje użyte do produkcji fosfolipazy stosowanej w wynalazku niekoniecznie ograniczają się tylko do drożdży Kluyveromyces lactis. Oprócz K. lactis, doniesiono o udanej ekspresji heterologicznej genu świńskiej fosfolipazy A2 u Escherichia coli., Saccharomyces cerevisiae i Aspergillus niger (badane przez Swinkelsa i in. 1993, Antonie van Leeuwenhoek 64, 187-201).

Fosfolipazę można uzyskać na drodze ekspresji heterologicznej w drobnoustrojach takich jak bakterie z rodzaju Bacillus i Escherichia, drożdże z rodzaju Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, Candida lub grzyby nitkowate z rodzaju Aspergillus, Fusarium i Trichoderma.

Dla fachowca oczywistym będzie, że dodanie fosfolipazy w postaci transgenicznego materiału roślinnego np. transgenicznych nasion, zawierających fosfolipazę, może wymagać obróbki materiału roślinnego tak, by udostępnić enzym lub co najmniej poprawić jego dostępność. Takie techniki obróbki mogą obejmować różne techniki mielenia i rozdrabniania albo traktowanie termomechaniczne, tak jak wytłaczanie lub pęcznienie.

Użycie szczepu Streptomyces zdolnego do produkcji fosfolipazy A2 podczas fermentacji kiszonki, jak stwierdzono, przynosi następujące korzyści:

- można brać pod uwagę każdą fosfolipazę. Pozwala to na użycie fosfolipaz endogenicznych dla zwierząt, u których enzym ma być zastosowany, co ułatwi otrzymanie produktu aprobowanego przez organy nadzorcze (regulatory authorities),

- pozwala to dodatkowo na wybranie najodpowiedniejszej fosfolipazy do zastosowania jako dodatku do paszy,

- unika się konieczności fermentowania paszy w celu wytworzenia enzymu in situ.. Pozwala to precyzyjnie kontrolować ilość dodatku fosfolipazowego w paszy, co jest istotne, biorąc pod uwagę optymalne stężenia fosfolipazy w pewnych zastosowaniach (patrz przykład 1),

- pozwala to także na wielką elastyczność w sporządzaniu preperatów zarówno dodatku enzymatycznego jak i paszy zawierającej dodatek enzymatyczny.

Dodatek fosfolipazy A2 ssaka powoduje nieoczekiwanie wysokie efekty pobudzenia wzrostu.

Wynalazek został zilustrowany następującymi przykładami.

Przykład 1. Zastosowanie fosfolipazy A2 w paszy dla zwierząt

Przeprowadza się próby z broilerami, testujące skuteczność fosfolipazy A2. Samce broilerów (Ross) utrzymuje się na standardowej diecie od dnia 1 do dnia 5. W dniu 5 zwierzęta selekcjonuje się z tej grupy i dzieli na klatki. Pod uwagę bierze się ciężar i jego zmienność. Średni ciężar i jego odchylenia są takie same w każdej klatce. W jednej klatce utrzymuje się piętnaście zwierząt. Klatki umieszcza się w sztucznie ogrzewanym, wentylowanym i oświetlonym kurniku.

184 284

Każda klatka ma 0,98 m² powierzchni, z podłogą z drutu. Kurnik jest oświetlony 24 godziny na dobę. W czasie doświadczenia intensywność światła stopniowo się redukuje. Temperaturę stopniowo obniża się od 28°C w czasie pierwszego tygodnia do 23°C w czasie ostatniego tygodnia doświadczenia. Wilgotność w pomieszczeniu dla broilerów wynosi w czasie doświadczenia około 60%. Zwierzęta zostały zaszczepione przeciw chorobie New Castle metodą sprayu w wieku odpowiednio jednego i czternastu dni. Doświadczenie trwało 33 dni, obejmując okres 5 dni przed testem i okres 28 dni testu. Diety doświadczalne oferowane są zwierzętom adlib. Wodajest dowolnie dostępna.

Paszajest granulowana na zimno (temperatury utrzymuje się poniżej 65°C) do średnicy 3 mm.

Doświadczenie obejmuje następujące sposoby traktowania:

a) dieta kukurydziano/pszenno/sojowa (kontrola ujemna)

b) dieta kukurydziano/pszenno/sojowa +100 IU/kg

c) dieta kukurydziano/pszenno/soj owa +500 IU/kg

Każdy sposób traktowania powtarza się sześć razy (każde traktowanie obejmuje w sumie 90 ptaków). Mierzy się przyrost i przetworzenie paszy. Skład użytej paszy ukazano w tableli 1.

Tabela 1

Skład diety kukurydziano/pszenno/sojowej w doświadczeniach z broilerami

Składniki	Zawartość (%)
Kukurydza	25,0
Pszenica	15,0
Olej sojowy	3,5
Tłuszcz zwierzęcy	2,0
Maniok	11,68
Mączka sojowa (50% surowego białka)	19,45
Pełnotłuste prażone ziarno soi	10,0
Mączka rybna	1,0
Mączka mięsna poubojowa, z wysoką zawartością oleju	4,0
Grochy	5,0
Premix mineralno-witam inowy	1,0
Kamień wapienny	0,82
Fosforan monowapniowy	1,00
Sól (NaCl)	0,30
DL-metionina	0,25
100,00 EM dla broilerów (MJ/kg)	12.55 100,00
Białko surowe (%)	22,1
Tłuszcz surowy (%)	9,6
Lizyna (dostępną) (%)	1,23 (1,04)
Metionina + Cysteina (dostępne) (%) Enzym dodaje się do tej diety mieszając go najpierw z nośnikiem	0,91 (0,79)

Wyniki ukazano w tabeli 2.

184 284

Tabela 2

Wpływ fosfolipazy A2 w diecie kukurydziano/pszenno/sojowej na wzrost i współczynnik przetworzenia paszy u broilerów między 5 a 33 dniem życia

	Zużycie paszy g	Wzrost g	Współczynnik przetworzenia paszy
Dieta podstawowa	2613	1445	1,81
Dieta + 100 IU/kg paszy	2569	1458	1,76
Dieta + 500 IU/kg paszy	2526	1472	1,72

Przeprowadza się drugie doświadczenie, zasadniczo identyczne do opisanego powyżej, w którym dietę pszenno/ryżowo/sojową, jaką wyszczególniono w tabeli 3 stosuje się jako dietę podstawową.

Doświadczenie obejmuje następujące sposoby traktowania:

a) dieta pszenno/ryżowo/sojowa (kontrola ujemna)

b) dieta pszenno/ryżowo/soj owa + 100 IU/kg

c) dieta pszenno/ryżowo/soj owa + 500 IU/kg

d) dieta pszenno/ryżowo/soj owa + 1000 IU/kg

Wszystkie inne parametry sątakie, jak opisano powyżej dla doświadczenia z dietąkukurydziano/pszenno/soj ową.

Tabela 3

Skład diety pszenno/ryżowo/sojowej w doświadczeniu z broilerami

Składniki	Zawartość (%)
Pszenica	40,0
Ryż	10,0
Olej sojowy	1,0
Tłuszcz zwierzęcy	6,0
Maniok	4,28
Mączka sojowa (45,4% surowego białka)	22,0
Pełnotłuste prażone ziarno soi	10,0
Mączka mięsna poubojowa (58 surowego białka)	3,0
Premix mineralno-witaminowy	1,0
Kamień wapienny	0,94
Fosforan monowapniowy	1,20
Sól (NaCl)	0,26
L-lizyna HCl	0,11
DL-metionina	0,21 100,00
EM dla broilerów (MJ/kg)	11,9
Białko surowe (%)	21,4
Tłuszcz surowy (%)	10,5
Lizyna (dostępna) (%)	1,23 (1,05)
Metionina + Cysteina (dostępne) (%) Enzym dodaje się do tej diety mieszając go najpierw z nośnikiem	0,90 (0,77)

Wyniki ukazano w tabeli 4.

184 284

Tabela 4

Wpływ fosfolipazy A2 w diecie pszenno/ryżowo/sojowej na wzrost i współczynnik przetworzenia paszy u broilerów między 5 a 33 dniem życia

	Zużycie paszy g	Wzrost g	Współczynnik przetworzenia paszy
Dieta podstawowa	2752	1556	1,77
Dieta + 100 IU/kg paszy	2747	1568	1,75
Dieta + 500 IU/kg paszy	2733	1586	1,72
Dieta + 1000 IU/kg paszy	2724	1572	1.73

Jak ukazano w tabeli 4, istnieje wielkość optymalna stężenia fosfolipazy użytej w tych poszczególnych dietach broilerów, to jest więcej niż około 100 IU/kg paszy i mniej niż około 1000 IU/kg paszy. Dla innych układów mogą istnieć inne optima, które można oznaczyć drogą rutynowych doświadczeń.

Przykład 2. Zastosowanie fosfolipazy A2 w preparatach mlekozastępczych

Przeprowadza się doświadczenie przy użyciu 3 grup po 5 samców cieląt fryzyjskich duńskich holsztyno-fryzyjskich (Friesian Dutch Holstein-Friesian).

Podczas okresu wstępnego przed doświadczeniem skarmia się handlowe preparaty mlekozastępcze. Po 14 dniach dzieli się zwierzęta, biorąc pod uwagę ciężar i jego zmienność, dla przeprowadzenia trzech sposobów traktowania. Zwierzęta utrzymuj e się w indywidualnych boksach. Obora oświetlonajest naturalnie; jest ona wentylowana i panuje w niej temperatura około 18°C.

Zwierzęta przyzwyczaja się do ich diety przez 14 dni. Następnie, w ciągu kolejnych 5 dni, przez 24 godziny na dobę, kolekcjonuje się ilościowo kał. Przed okresem doświadczalnym cielętom zakłada się uprząż. Kał zbiera się do plastykowych torebek przywiązanych do uprzęży. Raz dziennie kał waży się, sumuje i przechowuje w temperaturze -20°C. Przed analizami, kał dokładnie się miesza i dzieli na próbki.

Zwierzęta karmi się indywidualnie zależnie od ich ciężaru zgodnie ze schematem żywienia. Użyty preparat mlekozastępczy ma następujący skład:

%

Tłuszcz 19,8

Laktoza 1 7 , 6

Skrobia, witaminy, składniki mineralne -4,1

EM44 50 kcal/kg

Białko surowe (N*6,25) 21,5%

Tłuszcz surowy 19,5%

Przed karmieniem sproszkowany preparat mlekozastępczy miesza się z wodą i skarmia się w temperaturze około 40°C.

Zależnie od sposobu traktowania tłuszcz zawiera 18%o łoju wołowego, tłuszcz kokosowy lub smalec. Lecytynę dodaje się w stężeniu 10% zawartości tłuszczu.

Świńską fosfolipazę A2 dodaje się do tych diet w stężeniu końcowym 500 IU/kg preparatu mlekozastępczego. Mierzy się strawność tłuszczu.

Wyniki ukazano w tabeli 5.

184 284

Tabela 5

Wpływ traktowania fosfolipazą A2 na strawność różnych tłuszczów u nieprzeżuwających cieląt, otrzymujących w swoich dietach 18% tłuszczu i 1,8% lecytyny (na 10% zawartości tłuszczu). Fosfolipazę A2 sporządza się jak ukazano w przykładzie 2 i dodaje do diety w końcowym stężeniu 500 IU/kg preparatu mlekozastępczego

	Bez fosfolipazy A2	Z fosfolipazą A2
Łój wołowy	70,0%	73,1%
Tłuszcz kokosowy	95,6%	96,2%
Smalec	79,4%	84,3%

Przykład 3. Wytwarzanie stabilnych preparatów enzymu

Bulion z Kluyveromyces lactis poddaje się filtracji przez płytkę, po której następuje ultrafiltracja. Ultrafiltrat traktuje się 0,3% trypsynąprzy pH 8,0 w obecności 10 mM CaCf przez 2,5 godziny, powodujące usunięcie heptapeptydu proenzymu, co uczynnia enzym.

Dodaje się kwas benzoesowy i kwas sorbinowy jako konserwanty przy pH 4,0 i pozostałą aktywną trypsynę inaktywowano przez 30 min. w temperaturze 70°C. Ostateczny produkt jest brązowawy i ma aktywność 10 000 IU/ml. Stabilność tego preparatu można polepszyć przez dodatkowe oczyszczenie i przechowywanie w niskich temperaturach. Po jednym miesiącu przechowywania w temperaturze 4°C nie zauważa się strat aktywności enzymu.

184 284

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja paszy dla zwierząt polepszająca wydajność wykorzystania paszy i pobudzającej wzrost zwierząt, znamienna tym, że zawiera fosfolipidową substancję pokarmową, korzystnie lecytynę i dodatek fosfolipazowy w postaci enzymu fosfolipazy Al i/lub A2 w ilości od 1000 do 5000000jednostek międzynarodowych fosfolipazy na kg fosfolipidu, przy czym fosfolipaza występuje w stężeniu około 100-1000 jednostek międzynarodowych na kg paszy.
2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera fosfolipazę pochodzącą od ssaka, rośliny lub drobnoustroju.
3. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że jako fosfolipazę zawiera fosfolipazę A2 ssaka wybraną z grupy, obejmującej fosfolipazę A2 bydlęcą świńską mysią szczurzą i ludzką
4. Sposób wytwarzania kompozycji paszy, dla zwierząt polepszającej wydajność wykorzystania paszy i pobudzającej wzrost zwierząt, znamienny tym, że do paszy zawierającej fosfolipidową substancję pokarmową, korzystnie lecytynę dostarcza się fosfolipazę Al i/lub A2 w ilości od 1000 do 5000000 jednostek międzynarodowych fosfolipazy na kg fosfolipidu, przy czym fosfolipazę dostarcza się w stężeniu około 100-1000 jednostek międzynarodowych na kg paszy, a następnie miesza się do jednorodnego wymieszania się składników.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się fosfolipazę pochodzącą od ssaka, rośliny lub drobnoustroju.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako fosfolipazę stosuje się fosfolipazę A2 ssaka wybranąz grupy, obejmującej fosfolipazę A2 bydlęcą świńską, mysią szczurząi ludzką.

Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji paszy dla zwierząt i sposobu wytwarzania kompozycji paszy. Kompozycja według wynalazku nadaje się do stosowania w paszach dla zwierząt gospodarskich w celu polepszenia wykorzystania paszy i pobudzenia wzrostu zwierząt.

W przewodzie żołądkowo-j elitowym zwierząt wydziela się wiele enzymów, trawiących pożywienie. Każdy z tych enzymów oddziaływuj e na specyficzne składniki i w specyficznym środowisku części przewodu żołądkowo-jelitowego. Np. pepsyny sąaktywne w kwaśnym środowisku żołądka, podczas gdy inne proteazy, takie jak chymotrypsyna i karboksypeptydazy, wykazują aktywność w górnej części jelita cienkiego przy pH 6-7. Wiele z tych enzymów wymaga prekursora do uaktywnienia. Np. pepsyna powstaje z pepsynogenu tylko w środowisku kwaśnym. Chymotrypsyna i karboksypeptydazy są wydzielane w postaci nieaktywnej i aktywowane przez proteazę trypsynę.

Trawienie tłuszczu jest procesem złożonym. Większość tłuszczów w dietach dla zwierząt jest dostępna w postaci triglicerydów. Triglicerydy te są trudno, lub wcale nie wchłaniane przez j elito i musząbyć rozłożone do mono- i diglicerydów, glicerolu i wolnych kwasów tłuszczowych. Przemianę tę katalizuje enzym lipaza, który wydziela trzustka. Enzym ten jest aktywny na międzyfazowej powierzchni wody i oleju. Do dobrego trawienia niezbędne jest istnienie w emulsji olej-w-wodzie bardzo drobnych kropelek tłuszczu. Emulgatorami są powierzchniowo czynne substancje, które pozwalająna zdyspergowanie tłuszczu w fazie wodnej. Najważniejszym emulgatorem w przewodzie żołądkowo-j elitowym jest żółć. Żółć wydzielana jest przez wątrobę i może być przechowywana w woreczku żółciowym. Żółć zawiera, w porządku alfabetycznym, cholesterol, fosfolipidy oraz kwasy i sole żółciowe. Mieszanina składników żółci z produktami triglicerydowymi (pozostałymi), tworzy małe cząsteczki, micele.

184 284

Micele te dyfimdujądo komórek nabłonka jelita czczego, gdzie ich składniki sąuwalniane i absorbowane. W tych nabłonkowych komórkach triglicerydy sąodtwarzane. Razem z cholesterolem, estrami cholesterolu, fosfolipidami i białkami tworzą nowe, rozpuszczalne w wodzie cząsteczki, zwane chilomikronami.

Fosfolipidy, takie jak lecytyna, są rozkładane enzymatycznie pod działaniem fosfolipaz A i B, które także wydziela trzustka.

Lecytyna jest mieszaniną polarnych i neutralnych lipidów, w których zawartość lipidów polarnych wynosi co najmniej 60%. Ze względu na ich charakter hydrofobowy/hydrofilowy, lipidy polarne (w tym lecytyny) stosuje się jako emulgatory. Lipidy polarne obejmują (glicero)fosfolipidy i glikolipidy.

Podstawowa struktura fosfolipidu jest następująca:

H O

I II

H-C₁-O-C-R₁

R₉- C - O - Cn- H

II I o I o

I II h-c₃-o-p-o-x

I I

H O

X = Cholina

Etanolamina

Inozytol

Seryna

Wodór fosfatydyloetanolamina

- fosfatydylocholina

- fosfatydyloseryna

- fosfatydyloinozytol

- kwas fosfatydylowy

Glicerofosfolipidy zasadniczo składają się z cząsteczki glicerolu podstawionej kwasami tłuszczowymi w pozycjach Cl i C2. Pozycja C3 jest zestryfikowana kwasem fosforowym. Ten kwas fosforowy często jest związany z grupą alkoholową, tworząc w ten sposób następujące związki:

(PE; X = eti^ncoc^L^r^ii^ci) (PC; Xp ehol ina) (PS; X = ssryna) (PI; X = inooy)ol) (PA; X ) wodór)

Glicerofosfolipidy wiążące tylko jedną resztę kwasu tłuszczowego (zamiast zwykle dwóch) nazywa się lizofosfolipidami.

Lecytyny używa się jako emulgatora w licznych zastosowaniach obejmujących żywność i pasze. Emulgatorami są substancje powierzchniowo czynne, które pozwalają na rozproszenie ciekłej fazy olejowej w fazie wodnej. Emulgatory posiadająobie grupy hydrofilowąi lipofilową w tej samej cząsteczce. Stosunek grup hydrofilowych do lipofilowych, znany jako wartość HLB, jest charakterystycznym wskaźnikiem dla emulgatorów.

184 284

Emulgatory hydrofobowe, rozpuszczalne w tłuszczach posiadają wartości HLB, wynoszące od 0 do mniej niż 10, podczas gdy związki rozpuszczalne w wodzie wykazują wartości HLB od powyżej 10 do 20.

Emulgatory, takie jak lecytyna, dodaje się do paszy dla zwierząt, aby osiągnąć wyższą wartość odżywczą paszy lub by uzyskać lepszą dyspersję w przypadku paszy ciekłej. Znane jest także dodawanie lizolecytyny do paszy dla zwierząt (pod nazwą handlową Lysoforte® sprzedawanej przez towarzystwo Kemin), polepszające właściwości emulgujące, co prowadzi do wyższej wartości odżywczej (Pluimveehouderij 24: 20-21 (18 marzec, 1994).

Emulgujące własności lecytyny wykorzystuje się w produkcji zwierzęcej nie tylko przez włączenie lecytyny do suchych dawek lecz także tam, gdzie zwierzętom podaje się pokarm ciekły o dużej zawartości tłuszczu. Są to przede wszystkim preparaty mlekozastępcze dla cieląt i odpowiedniki mleka maciory dla prosiąt. Zadaniem lecytyny jest wytworzenie możliwie najdrobniejszej dyspersji tłuszczu w gotowym ciekłym pokarmie. Wynikiem drobnej dyspersji jest poprawienie zdolności trawienia tłuszczu przez zwierzęta. Dodatkowo, lecytyna wykazuje korzystny wpływ na osiadanie ciał nierozpuszczalnych w ciekłym pokarmie.

W poprzednich latach, przemysł paszowy rozpoczął wykorzystywanie produkowanych przemysłowo enzymów do uzupełnienia enzymów wytwarzanych w przewodzie żołądkowo-jelitowym zwierząt. Przykładowo są to fitazy, a-amylazy, proteazy i różne enzymy rozkładające ścianę komórkową komórek roślinnnych. Jednakże nigdzie, w obecnym stanie techniki, nie opisano bezpośredniego dodawania fosfolipaz do paszy dla zwierząt, jako że same zwierzętajuż wydzielają wielkie ilości tych enzymów w górnej części jelita cienkiego.

EP-A-0 619 079 opisuje użycie inter alia fosfolipidów jako powłoczki granulatów, zawierających biologicznie czynne substancje, włączane do paszy dla przeżuwaczy. Powłoczka służy ochronie substancji biologicznie czynnych w żwaczu, w celu umożliwienia dalszego ich trawienia i absorpcji w organach trawiennych poza-trawieńcowych. EP-A-0 619 079 podaje dalej, że fosfolipazy można ewentualnie wbudować w powłoczki ochronne, w celu ułatwienia ich hydrolizy, jednakże EP-A-0 619 079 nie opisuje ani nie sugeruje możliwości dodawania fosfolipaz do paszy w celu pobudzenia wzrostu lub podwyższenia wydajności wykorzystania paszy.

GB-A-2 267 033 odnosi się do pobudzania wzrostu, jednakże GB-A-2 267 033 zaleca dodawanie do kiszonki zestawu, zawierającego fosfolipid lecytynę razem ze szczepem Streptomyces. Sugerowano, że szczep Streptomyces jest zdolny do wytwarzania fosfolipazy A2 podczas fermentacji kiszonki. Co za tym idzie, użycie wspomnianego zestawu ogranicza się do paszy dla zwierząt, dla której proces produkcyjny obejmuje etap fermentacji, kompatybilny z produkcją fosfolipazy przez wspomniany szczep Streptomyces. Stąd wciąż istnieje zapotrzebowanie na możliwy do szerokiego stosowania, uniwersalny, gotowy do użytku fosfolipazowy dodatek paszowy, poprawiający wydajność wykorzystania paszy i/lub pobudzający wzrost zwierząt.

Streszczenie wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji paszy dla zwierząt polepszającej wydajność wykorzystania paszy i pobudzającej wzrost zwierząt, charakteryzującej się tym, że zawiera fosfolipidową substancję pokarmową, korzystnie lecytynę i dodatek fosfolipazowy w postaci enzymu fosfolipazy Al i/lub A2 w ilości od 1000 do 5000000 jednostek międzynarodowych fosfolipazy na kg fosfolipidu, przy czym fosfolipaza występuje w stężeniu około 100 -1000 jednostek międzynarodowych na kg paszy.

Korzystnie kompozycja zawiera fosfolipazę pochodzącąod ssaka, rośliny lub drobnoustroju.

Bardziej korzystnie kompozycja może zawierać fosfolipazę A2 ssaka wybraną z grupy, obejmującej fosfolipazę A2 bydlęcą, świńską, mysią, szczurzą i ludzką.