CN111372464B - 用于产生瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂的程序 - Google Patents

Abstract

本发明公开了由外源性多酶化合物产生的瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂，整合了用于培养和收获选定真菌物种的生物质、装配真菌来源的活性组分，以及通过根据说明书混合供给物、由此在反刍动物饲料工业中形成适于其应用(作为食物的一部分或通过分配装置作为营养补充物)的瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂的方法和装置。

Description

用于产生瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂的程序

技术领域

本发明涉及反刍动物饲养的领域，更具体地涉及由外源性多酶化合物产生的瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂，整合了用于培养选定真菌物种和收获选定真菌物种的生物质、装配真菌来源的活性组分的方法和装置，并通过根据说明书混合供给物，由此在反刍动物饲料工业中形成适于其应用(作为食物的一部分或通过分配装置作为营养补充物)的瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂。

背景技术

反刍动物，更通常被称为多胃动物(polygastric)(牛、山羊、绵羊、骆驼科(camelid)、鹿科(cervid)等)，其能够消化纤维素和半纤维素，以及陆生植物生物质、牧草、天然牧草、植入物(implanted)、叶、一般植物残留物、木质纤维素的废弃物及其衍生品等的某些木质化组分，单胃的物种(狗、猪、鸟、兔等)不能够做到这样。因此，反刍动物从存在于上述生物质中的这些化合物中产生高质量的蛋白质(例如乳和肉类)。

待解决的问题是，全球肉类和乳产量显著和可持续的增长，当用于喂养动物的饲料添加有高成本的原材料时，其成本随之提高，这在大多数情况下导致反经济的生产方程。因此，研究显示，在动物的不同饲养体系中，使用具有高纤维含量和木质纤维素残留物的饲草与应用本发明的倍增剂添加剂组合允许实现近40％的食物成本节约，将在其他情况下不可行的肉类和乳的生产性活动转变成高利润的对环境友好得多的并且对环境的影响低得多的高产方案。

大量的进化细节解释了互相适应的宿主动物(反刍动物)与微生物物种近2000万年的累积差异，该微生物物种是包含在滋养其的瘤胃中的微生物菌群(microbial flora)或微生物组(microbiome)的一部分，其中这些物种通过许多种“偏利共生(commensalism)”中的一种而产生联系，这构成了存在于自然界中的庞大的微生物多样性。本发明集中于这样的方法，其用于持续地产生营养添加剂，所述添加剂能够在这些物种之间的联系中发展“功能捷径(functional shortcut)”；提高微生物组降解向动物供应的饲料的纤维部分和调节包含在这些食物中具有益生元和益生菌效应的组分之间的平衡的有效性。

关于添加剂在反刍动物的营养中的应用有充足的信息，其试图改进不同类型营养素的转化和使用，以及减少与使用低营养价值的生物质相关的问题，例如以下出版物中表明的问题：

Aasha ReKha，Rama Prasad and Ramana：Evaluations of Groundnut Haulmssupplemented whit yeast culture(INDIAN JOURNAL OF ANIMAL NUTRITION 22-3).

Balci F.，Dikmen，Orman，Turkmen 2007：The Effect of fibrolytic exogenousenzyme on fattening performance of steers(BULGARIAN JOURNAL VETERINARYMEDICINE).

Colombato D.Mould FL，Bhat，Morgavi and Owen 2003-Influence offibrolytic enzymes on the hydrolysis and farmentations of pure cellilose andxylan by mixed ruminal microorganisms in vitro.JOURNAL OF ANIMAL SCIENCE 81：1040-1050

来自本发明的外源性多酶化合物的瘤胃微生物区系倍增剂和凋节剂能够提高动物饮食中的纤维素、半纤维素和某些木质化组分的降解，通过直接提高纤维素、半纤维素和木质素的代谢效率来实现多胃反刍动物物种的乳和肉类的生产力的增强。这种技术不适用于其他物种，例如单胃动物。

所进行的生物统计分析产生了积极的结果，其证实了在不同生产条件下反刍动物体重和产乳量的显著提高。所有生产性图表中也有显著的升高，例如畜群和繁殖畜群的身体状态、断奶时的体重、怀孕率和在不同应用中，既在繁殖畜群中又在多物种密集饲养中，其他可测量的生产性模式的改善。

来自本发明的外源性多酶化合物的瘤胃微生物区系倍增剂和调节剂添加剂允许更多量的纤维用于补充或不补充平衡谷物或常规谷物的密闭(confinement)或旷场生产体系中。多年来，已经观察到动物粪便中存在丰富的可发酵有机物质，这表明在半集约化或集约化体系存在的情况下，利用高含量的浓缩物在反刍过程中存在效率低下。

通过本发明的添加剂提供了这样解决方案，其提高纤维饲草或纤维素残留物的利用效率，这在没有添加与人消耗直接竞争的谷物和高成本的蔬菜来源的蛋白质情况下提高肉类和乳的生产力，使得食物成本降低。此外，对用于人消耗的食物的日益增长的需求大幅增长(对于肉类，猪、家禽的产量提高；对于蛋，家禽的产量提高)，制造用于直接人消耗的添加剂的玉米淀粉和糖衍生品的产量也在不断提高，我们还必须从人消耗玉米中提高生物乙醇的制造。

来自本发明的外源性多酶化合物的瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂，代表了一种可持续的技术，其允许多胃反刍动物不与人竞争谷物和大豆衍生品的使用，这有助于较低的环境污染，估计会显著降低肠道甲烷排放到大气中(-28％)。

本文所述添加剂的使用应用于工业饲料份额中，将玉米(或通常淀粉)和蔬菜来源的蛋白质的使用降低至小于一半，提高了纤维水平，实现了相同的结果，并且对环境产生的影响降低70％，所述添加剂提高了纤维素化合物(饲草、纤维素废弃物等)的利用效率，提高了瘤胃的微生物的产率。在首先的测试和比较测试中，在实验室(体外测量)中以及应用的现场研究(field research)(体内测量)中已经观察到具有瘘管的动物的消化速率的提高和生产力的提高。

微生物的产率与对照相比提高了5.33倍，这是因为在基于纤维素基质进行的测量中，在向相同的对照饮食添加本发明的添加剂的情况下，发现在相同降解时间中，葡萄糖和蔗糖的流量是对照的5.33倍。这是通过比在对照饮食的情况下更高的微生物性能实现的。

表1示出了考虑到在不向饮食添加淀粉或蛋白质的情况下其不同的消化速率，正常微生物性能(Normal Microbial Performance)(NMY)与添加到本发明添加剂对象效果的NMY之间的差异。

表1

与正常微生物产率(Normal Microbial Yield，NMY)相关的瘤胃微生物区系中的95％由攻击、降解和水解纤维素、半纤维素和一部分木质化化合物的细菌构成。在自然状态下，该细菌群体具有不超过平均利用率的40％的向动物供应的饲料的降解效率，最大性能接近45％。

结果，使用本发明的添加剂，可以从前述的45％效率的性能提高到接近88％的值。瘤胃领域中剩余的5％由4％的真菌群体和1％的原生动物构成。

本发明的方法包括产生真菌来源的多酶活性组分(以下称为活性组分1：A.C.1)作为瘤胃微生物区系添加剂的倍增剂和调节剂的配制方法的一部分。对具有高纤维含量的纤维素残留物或饲草的消化过程的调节是所述添加剂操作的基本步骤之一，因为在未并入具有调节作用的供给物的确定混合物(以下称为活性组分2：A.C.2)的情况下，未能在网胃-瘤胃消化复合物中的纤维素体活动(cellulosomatic activity)的加工中寻求到平衡点。

因此，有必要在添加剂的配制中并入A.C.1中包含的调节供给物，以特殊方式滋养瘤胃微生物组并赋予更快的增殖速率，这使得瘤胃效率值的范围提高，直到实现比在无添加剂的情况下通过消耗饲草或日粮(ration)而获得的值高560％的消化速率。

以A.C.1中限定的比例混合的供给物(例如酵母、维生素、矿物质、氨基酸、单-寡糖)的调节活性增强了与A.C.1相关的催化作用(A.C.1通过本专利的方法对象的工业应用获得)，实现了本发明的添加剂提高用于动物饲料的低质量生物质的消化率。

发明内容

通过实施本专利的程序对象(从外源多酶化合物产生瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂)，对选定的真菌物种(与在不同物候学生长阶段中的木材、废弃物和纤维素残留物或仅饲草中的纤维素的降解相关)进行倍增，设法以持续的形式产生含有外源酶的真菌来源的生物质，以用化合物来补充瘤胃，所述化合物在其形成多酶复合物的能力方面增强瘤胃微生物区系，所述的多酶复合物与食物中称为多纤维素酶体(cellulosome)或内聚结构域(cohesion domain)的纤维部分相关，所述纤维部分在瘤胃中存在的微生物群体与本发明的添加剂对象所含活性组分之间。

图1描绘了多纤维素酶体的结构。图1的来源是Montoya et al，Actabiol.Colomb.，Vol.12S，2007，55-74。结构性和催化组分，同时与产生其的微生物细胞以及纤维素基质连接；功能结构域：SLH，与S层同源；CH I和CH II，黏连蛋白I和黏连蛋白II；DKI和DK II，Dockerin I和Dockerin II；CBM，纤维素结合模块；GH，糖基水解酶。

将通过添加剂的产生方法以不同比例重组的所选真菌物种在生长室中分别培养，并且其是来自于在纤维素基质上诱导的结实(fructification)的产物(按照当前说明书中确定的条件)，获得了该添加剂的活性组分1，然后以确定的比例添加酵母培养物、维生素、矿物质、必需氨基酸和其他辅料(活性组分2)以获得最终产物(瘤胃微生物调节剂添加剂)，实现瘤胃的天然微生物营养的平衡。

为了确定瘤胃细菌菌群与本发明的倍增剂和调节剂添加剂的组成之间的最佳总体比例，使用体外和现场研究二者进行了许多测定。考虑到平均细菌尺寸为2至5μm，相对应的真菌的孢子或分生孢子残留物为10至15μm，我们依靠这一前提在催化结构域的规模、内聚位点和群体分配方面保持一定比例。基于此前提，通过实验方法验证了经指定比例的有效性。

经过几次测试，我们已经确定瘤胃内聚结构域中相关组分的推荐比例为1份倍增剂和调节剂添加剂对10份瘤胃内存在的细菌微生物区系。在这些条件下，用粪便的分析作为指标，证实了残留的可发酵有机物质的含量降低(最多至有机物质的-30％)，这指示消化速率更高，纤维素的使用更多，并且因此产率更高。

总之，根据本发明的方法对象产生的添加剂的优点是：

a)由于添加本发明的倍增剂和调节剂添加剂而获得反刍动物的营养成本下降，其具有与来自以下前提的成本下降有关的多种益处：

-使用其他物种无法用于产生肉和乳的经济价值低的纤维素生物质。

-将这些纤维素生物质用于倍增剂和调节剂添加剂，以促进具有糖化纤维素、半纤维素和木质化化合物的能力的瘤胃微生物区系的平衡。

-产生的能量高度地可用于瘤胃细菌产生微生物蛋白。

前述要点反映出为了避免使用例如玉米和大豆的浓缩物，该添加剂允许提高较便宜的原材料(富含纤维的生物质部分)的比例，进一步降低了制造成本。

图2(饮食中纤维/浓缩物比率(可行的范围)和成本)示出了随着浓缩物水平的降低和纤维水平的提高，生产成本降低。以这种方式，可降低用一定量食物生产的每千克乳或肉类的成本。

b)绿色环保技术：

通过本发明的倍增剂和调节剂添加剂与瘤胃微生物区系的相互作用形成的内聚结构域(或复合物)使得在木质纤维素化合物降解之后瘤胃中的最终产物是葡萄糖和蔗糖，而不是纤维二糖，因此在自然条件下产生不易消化化合物的糖化，并实现肠内甲烷向大气中的更低排放(相对于在没有并入添加剂的情况下纤维食物的消耗，以甲烷测得的能量损失的值降低接近-28％)，从而有利于减轻空气污染。

表2示出了甲烷(CH4)的估计产量的微分运算(differential calculation)，这是通过在高浓缩物与高纤维与高纤维+本发明的添加剂(通过以如瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂的产生方法的步骤6中所述的配制方案中指示的比例混合活性组分1和2产生的)的饮食消耗量之间的对比进行的。遵循二次回归模型，以下组分通过表达式相关：Y＝1，62×1-0，38×2+3，78×3+1，49×4+1142

表2

如表2所示，当纤维食物的消耗代替部分浓缩食物的消耗时，以甲烷形式的能量损失(以Y估算)显著降低，但在这种类型的饮食中与添加剂的使用相关的所述降低甚至更高，相对于具有不使用该添加剂的高比例的浓缩食物饮食的估计值达到-49％，这说明该添加剂在高和低比例的浓缩食物二者中的工业有用性。

除了促进使用主要由纤维素和半纤维素构成的生物质的纤维部分外，已经发现并入本发明的倍增剂和调节剂添加剂允许使用更高比例的具有高木质纤维素含量的副产物(例如花生壳和木片)，具有激励的生产效果，使得有可能将家畜的边界扩展到反刍动物的边缘地区。因此，世界范围内至今非生产性地区或区域可提高其接受能力(receptivity)和生产力，并入本发明的添加剂的使用作为反刍动物纤维食物的不同制备和分配体系的一部分。

附图说明

图1描绘了多纤维素酶体的结构，其中参考是：

纤维素-(1)；细胞壁-(2)；纤维素分解微生物-(3)

图2是饮食中纤维/浓缩物比率(可行的范围)和成本的图表，其中参考是：

每kg成本(可行的F/C范围)-(Cv)；比率：纤维(％)/浓缩物(％)-(R％)

图3描绘了培养室中托盘的分布，其中参考是：

模块-(4)；单排列进入-(5)；操作通道(开放)-(6)；操作通道(隧道)-(7)；双排列进入-(8)；入口/出口区域-(9)

表的简要说明

表1：协作联合对细菌物种的影响

表2：与添加剂的消耗量相关的甲烷(CH4)的降低

表3：瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂的产生过程方案

具体实施方式

为了更好地说明用于从外源性多酶化合物产生瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂的程序，证明其独特和新颖的特征，展示了以下与获得本发明的产物相关的流程图及其相应的构造性布局和工作方案。

表3是用于产生瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂的过程方案。

表3

步骤1：对所选的真菌库进行倍增用于产生活性组分1(A.C.1)

这是获得真菌物种和种间杂交物(称为F1)的倍增的技术的第一步，其将负责后续的酶产生。选择用于验证本专利中描述的程序的实施，优选地，有纤维分解性质，具有降解纤维素、半纤维素和木质素的不同能力的真菌物种可按照本专利描述的说明书从种质库中获得。

实验室：

将待单独培养的物种库置于培养皿(Petri dish)培养中的琼脂-琼脂基质上培养，并置于28℃的烘箱中，直到菌丝体扩增的比例达到超过培养皿覆盖范围的90％。

取出培养皿的胶束结构，将其转移至培养室中的倍增托盘。

培养室：

需要的培养室与用于产生本发明的倍增剂和调节剂添加剂对象的真菌物种的数量一样多。

为了举例说明可使用的物种的组合，流程图示出了用作本说明书中所述程序实施的参考的真菌物种(参见步骤4中的真菌物种列表)。

培养室被设计成宽4m×长4m的尺寸，最大高度3m，带有防滑瓷砖地板和涂覆有Durlock塑料的墙，具有可控制的打开和关闭的通风系统。

这些室配有由计算机控制的打开和关闭装置，该计算机根据由不同环境传感器获取的读数水平调节通风，所述环境传感器将测量以下参数：

1-相对湿度

2-温度

3-氧气水平

4-大气中的氨水平

5-每个室的特定波长

6-pH(酸度或碱度水平)

7-基质类型

用于验证本发明所述的瘤胃微生物区系倍增剂和调节剂添加剂的制备方法的真菌物种包括23种纤维分解物种，其对不同类型和形式的植物壁结构具有不同的降解能力，其中一些与纤维素的降解更相关，另一些与半纤维素更相关，并且对于与木质素相关的化合物也是如此。

在这个阶段中，在所述物种中诱导有性阶段。实现其所需的环境条件是：

-相对湿度：必须在86％至95％的相对湿度(RH)的范围内。通过自动洒水可达到此条件。洒水器与超细水滴的圆锥形喷嘴一起工作，压力为4.5kg。

-温度：介于23至28℃之间的值。

-氧气水平：浓度必须在10％O₂至15％O₂之间，由氨态氮代替，这是该阶段引起的低通风饱和氛围所典型的。

-光照(波长)：波长为400至410nm的紫外线电磁辐射。其功能是诱导在每个室内繁殖的所有真菌物种的有性阶段的生长。

-pH：其生长和发育的最适水平是pH为4.5至5.3的酸性介质。

-基质：在尺寸为30cm×40cm，高度为8cm的无菌塑料托盘上制备基质。

所述基质的组成是以下物质的混合物：

-10％泥炭

-10％依次由30％有机物质构成的有机堆肥

-15％具有至少90％活菌群的酵母

-15％普通白糖

-30％木质纤维素生物质。例如，棉花壳与花生壳的混合物

-5％与每个倍增室相对应的真菌物种(根据流程图的指示)

-5％尿素

-10％白云石碳酸钙

如图3所描绘的，将这些成分混合在一起，为了之后用混合物填充托盘，这些托盘从室的地板到天花板放置在架子上，并用水浸没以开始所选真菌物种的生长。

该程序在相应室关门之后进行10天，观察物种的生长和发育。在此阶段结束时，将在培养托盘中获得对应真菌的生长(“帽”型)，并且对在真菌结构底部的胶束残留物根据步骤1中所述的规范要求(specification)进行收获，总结为：

·收集和收获菌丝体和酶基底/收集和收获将进行组合以产生活性组分1(A.C.1)的真菌物种和种间杂种。

在每个室中收获该物种的孢子和子实体之前，用外科手术钢梳将位于真菌繁殖结构底部的菌丝体收获；所述菌丝体将随后保存在培养皿中，如在真菌倍增开始的方案中所述(步骤1，实验室)。

所述菌丝体结构产生与所选择的真菌物种集合相关的酶含量(被认为是“基底”)，并且其作为活性组分1(A.C.1)的一部分并入本发明瘤胃微生物区系对象的倍增剂和调节剂添加剂的配制方法中。

步骤2：真菌培养物的收获-休眠-储存

实施收获操作和保存真菌繁殖结构将用作用于下一步开发的供给物，使用确保与被选择整合到A.C.1中不同真菌物种相关的酶特性的组合的方法和装置。

储存和接种剂库

这组操作确保了在与瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂的产生程序的下一步骤兼容的条件下产生的真菌接种剂库的储存。

在经处理用于菌丝体和酶基底收获的同一托盘上，进行真菌孢子和分生孢子残留物的收获，并尽可能多的将其与每个托盘的基质底(substrate floor)或基底分离。

为此，将薄的丝毯置于基质的表面上，并以此方式收集在培养皿中分离的真菌孢子，用于“储存和接种剂库”阶段。这些培养皿还将作为供应物用于下一个步骤2(对应于在步骤1中倍增的物种和种间杂种的无性培养和增殖)，并将活性组分1(A.C.1)的基础原料整合到本发明的倍增剂和调节剂添加剂的产生过程中。

这些培养皿根据其来自对应于物种或种间杂种或组合的每个室的起源进行完全鉴定，其包含旱生型(xerophytic type)的制剂，其具有白云石石灰基底和硅铝酸锌，以诱导真菌生长的中断。

该阶段的生长中断需要以下条件：

相对湿度：9％至11％的RH，其由白云石石灰的吸附基底保持。

pH：介于6.5至7.5之间的值是指示控制真菌的生长和发育的值。

温度：介于10至15℃之间的值。

光照：常规白光，永久。

氧气：通过强制通风获得的过饱和氧气气氛。

步骤3：培养先前选择的和经倍增的真菌(步骤1)的物种和种间杂交物(F1)，以收获丰富的外源性多酶化合物生物质

执行旨在实现所选的物种的生物质的组合用于从外源性酶化合物产生瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂，使用确保与被选择整合到A.C.1中不同真菌物种相关的酶特性的组合的方法和装置。

为了实现这一目标，在一连串精密设计为步骤1中使用的那些的五个室中，5种物种的组被分离，并在与所涉及的物种数量的组合相对应的月生产批次中培养(例如，月生产4批，组合20种)。

已观察到由于使用种间种群，在木质纤维素化合物的糖化提高中有改善，为提高方法的改善，作为用于获得活性组分1所选的真菌库管理程序的一部分，为真菌培养物设立两个单独的培养室是必要的，所述真菌培养物源自步骤1的包含的种间杂交物(特别是长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)×里氏木霉(T.reesei)、长梗木霉×绿色木霉(T.viridae)和里氏木霉(Trichoderma reseei)×绿色木霉(Trichoderma viridae))。

在该程序的此步骤中，必须根据确定的要求控制环境条件以诱导真菌培养物的无性阶段，从上一步中达到的状态开始，以刺激酶活性在真菌物种的相应的形式(变形变体)中的表达，所述真菌物种的相应的形式(变形变体)被选择以整合用于作为本发明对象的瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂的制剂的A.C.1。

实行该步骤所需的环境条件如下：

相对湿度：通过以雾的形式喷洒水滴来实现高湿度饱和，使该场所和理想介质的RH为89％至98％。

pH：酸性。指示了3.5-4.8的pH水平。

温度：28至31℃。

光照：589nm钠黄光。

氧气：正常大气。

用于制造步骤3中使用的托盘的基质

在尺寸为30cm×40cm，高度为8cm的无菌塑料托盘上制备基质。在上述托盘中，基于以下混合物制备基质：

-30％泥炭

-15％含有30％的有机物质的有机堆肥

-5％多于90％活群体的活酵母

-5％普通白糖

-10％木质纤维素生物质。例如，棉花壳与花生壳的混合物

-5％对应于每个倍增室的真菌物种

-15％磷酸氢二铵

-5％白云石碳酸钙

-10％整合精细研磨稻

在15天之后检查这些托盘，并在所述环境条件下，收获将成为活性组分1(A.C.1)的一部分的胶束结构和分生孢子残留物。通过用外科手术钢梳扫过而实施收获，并随后进行真空包装。

来自外源性多酶化合物的瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂中存在的最明显的酶是：

内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶(纯培养物或杂交品)、木聚糖酶、Lacasa、CeloBio-水解酶(CBHI、CBHII)、β-葡糖苷酶、半纤维素酶、果胶酶。

储存收获的胶束结构和分生孢子残留物，然后作为A.C.1的一部分进行混合。

一旦产生A.C.1，为了实现本发明的增倍剂和调节剂添加剂的独特特征并因此实现更大的木质纤维素化合物降解效率，需要在以下之间取得平衡：

-纤维素酶(与使用的所选真菌物种相关)

-使用的真菌物种和种间杂种的分生孢子残留物

-调节有助于瘤胃的微生物营养并通过更高的降解高纤维含量的食物的能力达到化学计量平衡的成分，使其作为另外的供给物并入瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂的制剂中。

步骤4：装配活性组分1(A.C.1)

A.C.1对瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂的功能性贡献是通过其作为催化复合物、多纤维素酶体的引发剂的活性而实现，包括纤维食物和瘤胃纤维素分解细菌。在此步骤中，所述组分的装配通过将在外源性多酶化合物中富集的真菌生物质(来自步骤3)与源自步骤2所示条件下保存的菌丝体和酶基底作物(来自步骤1)的材料混合完成。

为了获得所述的混合物，将其置于在封闭和清洁的环境中运行的不锈钢微型混合器中：

-25％至35％的酶复合物(来自步骤1)

-60％至65％的分生孢子残留物(来自步骤3)

-5％至10％的微晶纤维素(辅料基底)

将这些活性成分混合300秒，然后将混合物真空包装，并将容器热封用于随后的储存。

在外源性多酶化合物中富集的真菌生物质(菌丝体和酶收获物+分生孢子残留物)来自以下物种及其可能的种间杂种组合(由相应物种的科学名称之间的×指示)，通过使用本说明书中描述的方法、装置和产生条件产生：

长梗木霉

里氏木霉(Trichoderma reesei)(＝红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))

绿色木霉(Trichoderma viride)(＝哈茨木霉(T.harzianum)和深绿肉座菌(Hypocrea atroviridis))

长梗木霉×里氏木霉

长梗木霉×绿色木霉

里氏木霉×绿色木霉

Trichoderma hirsuta

黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)

Chrysosporium lucknowense

双孢蘑菇(Agaricus bisporus)

土曲霉(Aspergillus terreus)

米曲霉(Aspergillus oryzae)

黑曲霉(Aspergillus niger)

黄曲霉(Aspergillusflavus)

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)

稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)

朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)

糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)

刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)

水稻纹枯病菌(Thanatephorus cucumeris)

脉射菌(Phlebia radiata)

血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)

冠状球盖菇(Stropharia coronilla)

步骤5：装配活性组分2(A.C.2)

出于此步骤的目的，这样的物质被视为调节剂(或“瘤胃微生物区系的立体调节剂(stequio-regulators)”)：一定量的天然的、有机的和无机的产物，其旨在实现与本发明所述的倍增剂和调节剂添加剂的制剂中所包含的外源性多酶化合物的进入相关瘤胃微生物群体的功能平衡。

瘤胃微生物区系调节剂的装配(通过以确定比例混合其供给物)促进了其随后与活性组分1的组合，是旨在使所选的真菌物种生长并从所选的真菌物种中收获生物质的装置和方法整合过程中的基本步骤，根据说明书用于产生在反刍动物的饲养体系中具有工业应用的瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂。

这种程序被认为是特别动态的，因为其可用于实现与所选的真菌物种相关的酶特性的不同组合，并且因为通过现有装置传递的或为所述目开发的直接作为食物或作为补充营养并入到反刍动物的多种饲料体系中是可行的，并对家畜生产体系具有积极的经济和环境影响。

将确定为瘤胃微生物区系调节剂的组分混合(在封闭和清洁的环境下操作的不锈钢微型混合器中)以形成A.C.2，比例如下：

活性组分2(A.C.2)的成分

这种成分的混合物(A.C.2)应以确定的比例与A.C.1组合，如步骤6中所述。

步骤6：瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂的配制方案

该步骤对应于多酶组分(A.C.1)与调节组分(A.C.2)的混合物(为期300秒)，以根据作为饲养反刍动物的补充物的产物的分配的特殊条件来获得不同比例的倍增剂和调节剂添加剂，其中所述混合A.C.1+A.C.2在50kg容量的混合器中实行。

旨在在家畜生产体系的食物制备中直接使用的瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂的推荐混合比为：15％至20％的A.C.1，和75％至80％的A.C.2。在与这些比例相对应的间隔内，确定了消耗的纤维食物的消化率的改善，并报告了饲养成本的降低(通过对消耗的纤维食物的更多利用)，也与和瘤胃甲烷释放相关的能量损失的显著降低相关。

在相应部分(步骤4：A.C.1和步骤5：A.C.2)详细介绍了组分A.C.1和A.C.2的装配，并且以在本步骤6中确定的比例用于配制倍增剂和调节剂添加剂的其混合物，被认为是本专利的程序对象的主要部分。

进行的功能评估包含使用用于分配和使用所述制剂的不同途径，其适合反刍动物的每种饲养体系，包括以下：

a)矿物质维生素预混合物(二者均以粉末状的盐和固体块的形式)和旨在用于反刍动物饲养的最终饲料(TMR)，当所述添加剂的比例为预混合物总量的10％至20％时。

b)用于在受限、半受限条件或广阔的农田系统下饲养的反刍动物营养补充物分配的装置，例如由纤维性木质纤维素基质形成的片剂(通过制粒机获得，直径为8至18mm)，其含有1％的添加剂，并且能够通过允许本发明的添加剂对象的制剂中包含的组分缓慢释放的瘤胃内施用器施用，对于应用需要超过90天的有效期。

一个实施方案是制备瘤胃微生物区系的添加剂中的第一活性组分的方法，该方法包括以下步骤：

(a)使真菌物种库倍增以产生酶复合物，所述酶复合物包含(i)菌丝体结构和(ii)孢子和子实体；其中所述真菌物种库是以下中的两种或更多种：长梗木霉；里氏木霉(＝红褐肉座菌)；绿色木霉(＝哈茨木霉和深绿肉座菌)；Trichoderma hirsuta；黄孢原毛平革菌；Chrysosporium lucknowense；双孢蘑菇；土曲霉；米曲霉；黑曲霉；黄曲霉；粟酒裂殖酵母；稻瘟病菌；朱红密孔菌；糙皮侧耳；刺芹侧耳；水稻纹枯病菌；脉射菌；血红密孔菌；冠状球盖菇；

(b)培养(a)中的特定种的种间杂交物(F1)，以产生分生孢子残留物，其中所述种间杂交物(F1)是以下中的一种或更多种：长梗木霉×里氏木霉；长梗木霉×绿色木霉；或里氏木霉×绿色木霉；以及

(c)将(a)和(b)的产物与辅料基底混合以产生活性组分。

公开了用于瘤胃微生物区系的添加剂，所述添加剂包含：

(a)含有以下的第一活性组分：

(i)来自真菌物种库的菌丝体结构、孢子和子实体，其中所述真菌物种库包含以下中的两种或更多种：长梗木霉、里氏木霉(＝红褐肉座菌)、绿色木霉(＝哈茨木霉和深绿肉座菌)、Trichoderma hirsuta、黄孢原毛平革菌、Chrysosporium lucknowense、双孢蘑菇、土曲霉、米曲霉、黑曲霉、黄曲霉、粟酒裂殖酵母、稻瘟病菌、朱红密孔菌、糙皮侧耳、刺芹侧耳、水稻纹枯病菌、脉射菌、血红密孔菌、冠状球盖菇；以及

(ii)一种或更多种以下种间杂交物(F1)的分生孢子残留物：长梗木霉×里氏木霉、长梗木霉×绿色木霉和里氏木霉×绿色木霉；以及

(b)含有以下中的两种或更多种的所述第二活性组分：玉米淀粉、糖、小麦、稻、纤维素、白云石、蛭石、酵母、葡聚糖甘露聚糖寡聚果糖(M.O.S.)、植酸酶、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸、氯化胆碱、硒、维生素E或碳酸钙。

其中与未摄入所述添加剂的反刍动物产生的甲烷相比，反刍动物在摄入所述添加剂后产生的甲烷降低至少28％。

以上是本发明特定实施方案的详细描述。应当认识到，在本发明的范围内可以做出与所公开的实施方案的偏离，以及本领域技术人员将想到的明显的修改。本领域技术人员应当理解，鉴于本公开内容，可以在本文公开的特定实施方案中进行许多改变，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下仍可获得类似或相似的结果。鉴于本公开内容，在不进行过度实验的情况下可以制造和执行本文公开和要求保护的所有实施方案。

Claims (12)

1.瘤胃微生物区系的倍增剂和调节剂添加剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使真菌物种库倍增以产生酶复合物，所述酶复合物包含(i)菌丝体结构和(ii)孢子和子实体；其中所述真菌物种库是以下中的两种或更多种：

长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)

里氏木霉(Trichoderma reesei)

红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)

绿色木霉(Trichoderma viride)

哈茨木霉(T.harzianum)

深绿肉座菌(Hypocrea atroviridis)

Trichoderma hirsuta

黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)

Chrysosporium lucknowense

双孢蘑菇(Agaricus bisporus)

土曲霉(Aspergillus terreus)

米曲霉(Aspergillus oryzae)

黑曲霉(Aspergillus niger)

黄曲霉(Aspergillus flavus)

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)

稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)

朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)

糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)

刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)

水稻纹枯病菌(Thanatephorus cucumeris)

脉射菌(Phlebia radiata)

血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)

冠状球盖菇(Stropharia coronilla)；

(b)培养(a)中的特定种的种间杂交物，以产生分生孢子残留物，其中所述种间杂交物是以下中的一种或更多种：

长梗木霉×里氏木霉(T.reesei)；

长梗木霉×绿色木霉(T.viridae)；或

里氏木霉×绿色木霉；以及

(c)将(a)和(b)的产物与辅料基底混合以产生第一活性组分。

2.权利要求1所述的方法，其中步骤(c)的所得混合物包含：25至35％的所述酶复合物；60至65％的所述分生孢子残留物，以及5至10％的所述辅料基底。

3.权利要求1所述的方法，其还包括将所述第一活性组分与第二活性组分组合，所述第二活性组分包含具有调节效应的供给物的限定混合物，以使得当所得的添加剂添加到瘤胃微生物区系时，所述瘤胃微生物区系中的消化速率提高至少5倍。

4.权利要求3所述的方法，其中所述第二活性组分包含以下中的两种或更多种：玉米淀粉、糖、小麦、稻、纤维素、白云石、蛭石、酵母、葡聚糖、甘露聚糖、寡聚果糖、植酸酶、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸、氯化胆碱、硒、维生素E或碳酸钙。

5.权利要求3所述的方法，其中将15至20％的所述第一活性组分与75至80％的所述第二活性组分组合以产生所述添加剂。

6.用于瘤胃微生物区系的添加剂，所述添加剂包含：

(a)第一活性组分，其包含：

(i)来自真菌物种库的菌丝体结构、孢子和子实体，其中所述真菌物种库包含以下中的两种或更多种：长梗木霉、里氏木霉、红褐肉座菌、绿色木霉、哈茨木霉、深绿肉座菌、Trichoderma hirsuta、黄孢原毛平革菌、Chrysosporium lucknowense、双孢蘑菇、土曲霉、米曲霉、黑曲霉、黄曲霉、粟酒裂殖酵母、稻瘟病菌、朱红密孔菌、糙皮侧耳、刺芹侧耳、水稻纹枯病菌、脉射菌、血红密孔菌、冠状球盖菇；以及

(ii)以下种间杂交物中一种或更多种的分生孢子残留物：长梗木霉×里氏木霉、长梗木霉×绿色木霉和里氏木霉×绿色木霉；以及

(b)第二活性组分，其包含以下中的两种或更多种：玉米淀粉、糖、小麦、稻、纤维素、白云石、蛭石、酵母、葡聚糖、甘露聚糖、寡聚果糖、植酸酶、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸、氯化胆碱、硒、维生素E或碳酸钙，

其中与未摄入所述添加剂的反刍动物产生的甲烷相比，反刍动物在摄入所述添加剂的情况下产生的甲烷降低至少28％。

7.权利要求6所述的添加剂，其中甲烷降低至少49％。

8.反刍动物饲料制剂，其包含权利要求6所述的添加剂。

9.权利要求8所述的反刍动物饲料制剂，其还包含盐。

10.权利要求8所述的反刍动物饲料制剂，其中所述添加剂占所述制剂的10％至20％。

11.权利要求8所述的反刍动物饲料制剂，其中所述添加剂被并入到包含木质纤维素基质的片剂中。

12.权利要求8所述的反刍动物饲料制剂，其为延长释放制剂的形式，所述形式能够经至少90天的时间段释放所述添加剂。