BR112020007813B1

BR112020007813B1 - Procedimento para a produção de um aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal

Info

Publication number: BR112020007813B1
Application number: BR112020007813-1A
Authority: BR
Inventors: Marcelo Alejandro Paternó
Original assignee: Biopremix Technologies Llc
Priority date: 2017-11-23
Filing date: 2018-09-17
Publication date: 2024-03-26

Abstract

A presente invenção descreve um aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal criado a partir de compostos multienzimáticos exógenos, o qual integra processos e dispositivos para o cultivo e colheita da biomassa de espécies de fungos selecionadas, montagem de componentes ativos de origem fúngica e pela mistura de materiais de acordo com as especificações, formando, assim, um aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal adequado para a sua aplicação (como parte de rações ou por meio de dispositivos de distribuição como um suplemento nutricional) na indústria de alimentos para animais ruminantes.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção se refere ao campo da alimentação de animais ruminantes, mais especificamente se refere a um aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal criada a partir de compostos multienzimáticos exógenos, o qual integra processos e dispositivos para o cultivo e a colheita de biomassa de espécies de fungo selecionadas, a montagem de componentes ativos de origem fúngica e a mistura de materiais de acordo com as especificações, assim, formando um aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal adequado para a sua aplicação (como parte da ração ou por meio de dispositivos de distribuição como um suplemento nutricional) na indústria de alimentos para animais ruminantes.

Antecedentes da invenção

[002] Animais ruminantes, mais comumente denominados poligástricos (bovinos, caprinos, ovinos, camelídeos, cervídeos, etc.) têm a capacidade de digerir celulose e hemicelulose e determinados componentes lignificados da biomassa vegetal terrestre, pastagens, pastos naturais, implantados, folhas, resíduos vegetais em geral, resíduos lignocelulósicos e seus derivados, etc., os quais espécies monogástricas (caninos, suínos, aves, coelhos, etc.) não são capazes de fazer. Portanto, os ruminantes produzem proteínas de alta qualidade, como leite e carne, a partir destes compostos presentes na biomassa acima mencionada.

[003] O problema para resolver é o aumento significativo e sustentável da produção mundial de carne e leite, e seu consequente aumento em custos quando os alimentos destinados à alimentação dos animais são aditivados com matérias-primas de alto custo, o que leva, na maioria dos casos, a equações produtivas antieconômicas. Consequentemente, estudos têm demonstrado que o uso em diferentes sistemas de alimentação para animais de forragens com alto teor de fibras e resíduos lignocelulósicos combinados com a aplicação do aditivo multiplicador da presente invenção, permite alcançar uma economia de quase 40 % dos custos dos alimentos, transformando atividades produtivas de carne e leite que, de outra forma, seriam inviáveis, em esquemas produtivos altamente rentáveis e muito mais ecológicos e de muito menor impacto ambiental.

[004] Uma grande quantidade de detalhes evolutivos explica as diferenças acumuladas em quase 20 milhões de anos de coadaptação do animal hospedeiro (o ruminante) com espécies de microrganismos que fazem parte da flora microbiana ou do microbioma contido no rúmen que o alimenta, no qual estas espécies se ligam através de um dos muitos “comensalismos” que compõem a vasta diversidade microbiológica existente na natureza. A presente invenção foca em um método para produzir consistentemente um aditivo nutricional com a capacidade de desenvolver um “atalho funcional” na ligação entre estas espécies, multiplicando a eficácia do microbioma para degradar a fração fibrosa da ração fornecida ao animal, e modular o equilíbrio entre os componentes com efeito prebiótico e probiótico que estão incluídos nestes alimentos.

[005] Existe ampla informação sobre a aplicação de aditivos na nutrição de ruminantes, procurando melhorar a conversão e o uso de diferentes tipos de nutrientes e reduzir problemas associados ao uso de biomassa de baixo valor nutricional, tal como aquela indicada nas seguintes publicações: Aasha ReKha, Rama Prasad e Ramana: Avaliações de folhagens de amendoim suplementadas com cultura de levedura (REVISTA INDIANA DE NUTRIÇÃO ANIMAL 22 - 3); Balci F., Dikmen, Orman, Turkmen 2007: O efeito da enzima fibrolítica exógena no desempenho de engorda de bois (REVISTA BÚLGARA DE MEDICINA VETERINÁRIA); Colombato D. Mould FL, Bhat, Morgavi e Owen 2003 - Influência das enzimas fibrolíticas na hidrólise e nas fermentações de celulose e xilana puras por microrganismos ruminais mistos in vitro. REVISTA DE CIÊNCIA ANIMAL 81: 1040 - 1050.

[006] O aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal dos compostos multienzimáticos exógenos da presente invenção apresentam a capacidade de aumentar a degradação da celulose, hemicelulose e determinados componentes lignificados da dieta animal, alcançando um aumento na produtividade do leite e da carne de espécies ruminantes poligástricas, por um incremento direto na eficiência de metabolização de celuloses, hemiceluloses e ligninas. Não é uma tecnologia aplicável a outras espécies, tais como as monogástricas.

[007] A análise biométrica realizada tem gerado resultados positivos que confirmam o significativo aumento de peso e produção de leite em animais ruminantes, sob diferentes condições de produção. Há também um aumento significativo em todos os números produtivos, como a melhora dos estados corporais em rebanhos e rebanhos reprodutores, peso no desmame, taxas de gestação e outros padrões produtivos mensuráveis em diferentes aplicações, tanto em rebanhos reprodutores quanto em rações intensivas de múltiplas espécies.

[008] O aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal a partir de compostos multienzimáticos exógenos da presente invenção permite que maiores quantidades de fibra sejam utilizadas em sistemas de produção em confinamento ou em campo aberto com e sem suplementação de grãos balanceados ou convencionais. Por anos, foi observado que existem abundantes matérias orgânicas fermentáveis no adubo animal, as quais mostram que a ineficiência nos processos ruminais na presença de sistemas semi-intensivos ou intensivos existem usando altos teores de concentrados.

[009] Por meio do aditivo da presente invenção, é fornecida uma solução que aumenta a eficiência do uso de forragens fibrosas, ou de resíduos celulósicos, os quais aumentam a produtividade da carne ou do leite sem a adição de cereais e de proteínas de origem vegetal de alto custo que competem diretamente com o consumo humano, permitindo uma redução dos custos dos alimentos.

[010] Em adição, o aumento da demanda de alimentos para o consumo humano está crescendo acentuadamente (aumento da produção de suínos, de aves para carne, de aves para ovos), a produção de amido de milho e derivados de açúcar para fabricação de aditivos para consumo humano direto também está aumentando, ao que temos que acrescentar a fabricação de bioetanol a partir do milho para consumo humano.

[011] O aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal dos compostos multienzimáticos exógenos da presente invenção representa uma tecnologia sustentável, que permite que animais ruminantes poligástricos não compitam com os seres humanos para o uso de cereais e derivados da soja, os quais contribuem para uma menor contaminação do meio ambiente, estimando uma significativa redução na emissão do metano entérico para a atmosfera (-28 %).

[012] O uso do aditivo aqui descrito, aplicado aos lotes de ração industrial, reduzem o uso do milho (ou amidos em geral) e proteínas de origem vegetal para menos da metade, aumentando os níveis de fibra, alcançando os mesmos resultados, e produzindo um impacto 70 % menor no meio ambiente, o referido aditivo aumenta a eficiência do uso de compostos de celulose (forragens, descartes de celulose, etc.) aumentando a taxa de rendimento microbiano do rúmen. Já nos primeiros testes e testes comparativos, foi observado no laboratório (medidas in vitro), bem como em pesquisa de campo aplicada (medidas in vivo), com animais fistulados, uma melhora na taxa de digestão e aumento na produtividade.

[013] A taxa de rendimento microbiano aumentou em 5,33 vezes quando comparada ao controle, isto porque em medidas feitas em substrato celulósico, com a adição do aditivo da presente invenção à mesma dieta de controle, verificou-se que a taxa de fluxo de glicose e sacarose foi 5,33 vezes maior do que o controle no mesmo tempo de degradação. Isto foi alcançado com maior desempenho microbiano do que com a dieta de controle.

[014] A Tabela 1 mostra a diferença entre o Desempenho Microbiano Normal (sigla em inglês, NMY) vs. NMY adicionado ao efeito do aditivo objeto da presente invenção, considerando sua taxa de digestão diferencial sem a adição de amidos ou proteínas à dieta. Tabela 1

[015] 95 % do microbioma ruminal associado com o Rendimento Microbiano Normal (NMY) é composto de bactérias que atacam, degradem e hidrolisam celulose, hemicelulose e uma fração de compostos lignificados. Em um estado natural, esta população bacteriana apresenta uma eficiência de degradação da ração suplementada ao animal que não excede 40 % da utilização média, com um desempenho máximo próximo a 45 %.

[016] Como uma consequência, o uso do aditivo da presente invenção, é possível ir de um desempenho da eficiência de 45 % acima mencionada para valores próximos a 88 %. Os 5 % restantes deste universo ruminal é constituído por uma população de fungos de 4 % e 1 % de protozoários.

[017] O processo da presente invenção inclui a produção de um componente multienzimático ativo de origem fúngica (daqui em diante referido como componente ativo 1: CA 1) como parte do processo da formulação do aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal. A modulação do processo de digestão dos resíduos de celulose ou forragens com alto teor fibroso é uma etapa fundamental para a operação do referido aditivo, uma vez que, sem a incorporação de uma mistura definida de materiais com efeito modulador (daqui em diante referido como componente ativo 2: CA 2), o ponto de equilíbrio buscado no processamento das atividades celulossomáticas dentro do complexo digestivo retículo - ruminal não é alcançado.

[018] Sendo assim, é necessário incorporar na formulação do aditivo os materiais moduladores contidos no CA 1, para nutrir de maneira especial o microbioma ruminal e conferir uma taxa de reprodução mais rápida, a qual permite aumentar a taxa de valores de eficiência ruminal até alcançar uma taxa de digestão 560 % maior do que o valor obtido ao longo do consumo das forragens ou proporções sem aditivação.

[019] A atividade moduladora de materiais a serem misturados (tais como levedura, vitaminas, minerais, aminoácidos, mono-oligosacarídeos) nas proporções definidas dentro do CA 1 potencializa os efeitos catalíticos associados ao CA 1 (os quais são obtidos pela aplicação industrial do processo objeto desta patente), fazendo com que o presente aditivo aumente a digestibilidade da biomassa de baixa qualidade para a ração animal.

Breve descrição da invenção

[020] Através da implementação do procedimento objeto desta patente (produção de um aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal a partir de compostos multienzimáticos exógenos), espécies selecionadas de fungos (associadas à degradação da celulose em madeira, descartes e resíduos de celulose ou simplesmente forragens em diferentes estágios fenológicos de crescimento) são multiplicadas, conseguindo produzir de forma sustentada biomassa de origem fúngica contendo exo-enzimas para suplementar o rúmen com compostos que melhoram a microbiota do rúmen em termos de sua capacidade em formar complexos multienzimáticos associados com a fração fibrosa dos alimentos denominada celulossomas ou domínios de coesão entre as populações microbiana presente no rúmen e os componentes ativos contidos no aditivo objeto da presente invenção.

[021] A Figura 1 mostra a Estrutura do celulossoma. A fonte para a Figura 1 é Montoya et al, Acta biol. Colomb., Volume 12S, 2007, 55 - 74. Componentes estruturais e catalíticos, simultaneamente ligados a uma célula do microrganismo que o produz e ao substrato celulósico; domínios funcionais: SLH, homologia com a camada S; CH I e CH II, coesina I e II; DK I e DK II, dockerina I e II; CBM, módulo de ligação à celulose; GH, glicosil hidrolase.

[022] As espécies selecionadas de fungos, as quais são recombinadas em uma diferente proporção por meio do processo de produção do aditivo, são cultivadas separadamente em salas de crescimento e é a partir do produto da frutificação induzida em substratos de celulose - pelas condições definidas no presente Relatório Descritivo - que o componente ativo 1 deste aditivo é obtido, o qual é posteriormente adicionado à cultura de levedura, vitaminas, minerais, aminoácidos essenciais e outros excipientes em proporções definidas (Componente ativo 2) para obter o produto final (aditivo modulador da microbiota ruminal), alcançando um equilíbrio na nutrição microbiana natural do rúmen.

[023] Para determinar a proporção da população ótima entre a flora bacteriana ruminal e a composição do aditivo multiplicador e modulador da presente invenção, inúmeros ensaios foram realizados usando ambos os estudos in vitro e de campo. Considerando um tamanho médio bacteriano de 2 - 5 μm versus 10 - 15 μm de um esporo ou resíduo de conídio de um fungo, nós confiamos na premissa de manter uma proporção em termos de escala dos domínios catalíticos, sítios de coesão e distribuição da população. Com base nesta premissa, por métodos experimentais, a eficácia da proporção indicada foi verificada.

[024] Após diversos testes, determinamos que a proporção recomendada de componentes associados nos domínios de coesão ruminal é 1 parte do aditivo multiplicador e modulador com 10 partes da microbiota bacteriana existente no rúmen. Sob estas condições, usando como indicador uma análise de adubo, uma redução na quantidade de matéria orgânica fermentável residual foi verificada (até -30 % da matéria orgânica), a qual indica uma maior digestão, maior uso de celulose e, assim, maior produção.

[025] Em resumo, as vantagens do aditivo produzido de acordo com o processo objeto da presente invenção são: a) Redução dos custos na nutrição de ruminantes obtidos como um resultado da adição do aditivo multiplicador e modulador da presente invenção, com diversos benefícios relacionados com a redução de custos a partir das seguintes premissas: - O uso de biomassa celulósica de baixo valor econômico, não utilizável por outras espécies para a produção de carne e leite; - O uso destas biomassas celulósicas para o aditivo multiplicador e modulador para promover o equilíbrio da microbiota ruminal com capacidade para a sacarificação da celulose, hemicelulose e compostos lignificados; - Geração de energia altamente disponível para que as bactérias do rúmen produzam proteína microbiana.

[026] Os pontos acima mencionados refletem que o aditivo permite o aumento da proporção de materiais brutos menos custosos (frações de biomassa rica em fibras), a fim de evitar o uso dos concentrados, tais como milho e soja, diminuindo, ainda, os custos de produção.

[027] A Figura 2 (proporção fibra / concentrado (faixa viável) na dieta e no custo) mostra que, como os níveis de concentrados diminui e os níveis de fibra aumentam, os custos de produção diminuem. Neste sentido, é possível reduzir os custos por quilograma de leite ou de carne produzido com uma determinada quantidade de alimento. b) Tecnologia verde e ecologicamente correta:

[028] Os domínios de coesão (ou complexos) que são formados através da interação do aditivo multiplicador e modulador da presente invenção e a microbiota ruminal fazem com que os produtos finais no rúmen, após a degradação dos compostos lignocelulósicos, sendo glicose e sacarose, em vez de celobiose, produzem, então, a sacarificação de compostos indigeríveis sob condições naturais e alcançam uma menor liberação de metano entérico na atmosfera (os valores de redução na perda de energia medida como metano é próxima a -28 %, em relação ao consumo de alimentos fibrosos sem incorporação do aditivo), com a consequente mitigação favorável da poluição do ar.

[029] A Tabela 2 mostra o cálculo diferencial da produção estimada de metano (CH4) pelo contraste entre o consumo de dietas com alto concentrado vs. alta fibra vs. alta fibra + aditivo da presente invenção (produzido pela mistura dos Componentes ativos 1 e 2, nas proporções indicadas no protocolo de formulação descrito na etapa 6 do processo de produção do aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal). Após um modelo de regressão quadrática, os seguintes componentes foram relacionados através da expressão: Y = 1,62 x 1 – 0,38 x2 + 3,78 x 3 + 1,49 x 4 + 1142 Tabela 2

[030] Tal como mostrado na Tabela 2, há uma redução significativa na perda de energia como metano (estimada como Y) quando o consumo de alimentos fibrosos substitui uma parte do consumo de alimentos concentrados, porém a redução associada ao uso do aditivo neste tipo de dietas é ainda maior, atingindo -49 % em relação aos valores estimados para dietas com alta proporção de alimentos concentrados que não utilizam o aditivo: isto demonstra a utilidade industrial do aditivo para ambas a alta e a baixa proporção de alimentos concentrados.

[031] Além de facilitar o uso da fração fibrosa da biomassa composta principalmente de celulose e hemicelulose, verificou-se que a incorporação do aditivo multiplicador e modulador da presente invenção permite o uso de uma maior proporção de subprodutos com alto teor lignocelulósico (tais como casca de amendoim e cavaco de madeira) com resultados produtivos encorajadores, possibilitando a extensão das fronteiras do gado para áreas marginais para ruminantes. Portanto, zonas ou regiões ao redor do mundo que até hoje eram improdutivas, poderiam aumentar sua receptividade e produtividade, incorporando o uso do aditivo da presente invenção como parte de diferentes sistemas de preparo e distribuição de alimentos fibrosos para animais ruminantes.

Breve descrição das figuras

[032] A Figura 1 mostra a estrutura do celulossoma, em que as referências são: Celulose (1); parede celular (2); microrganismo celulolítico (3).

[033] A Figura 2 é um gráfico da proporção fibra / concentrado (faixa viável) na dieta e custo, em que as referências são: Custos por kg (faixa de F / C viável) - (Cv); Proporção: % de fibra / % de concentrado - (R %).

[034] A Figura 3 mostra uma distribuição de bandejas na sala de cultura, em que as referências são: Módulo (4); Entrada de alinhamento simples - (5); Corredor de manobra (livre) (6); Corredor de manobra (túnel) (7); Entrada de alinhamento duplo (8); Área de entrada / saída (9).

Breve descrição das tabelas

[035] Tabela 1: Efeito do associativismo cooperativo na população bacteriana.

[036] Tabela 2: Redução do metano (CH4) associado ao consumo do aditivo.

[037] Tabela 3: Esquema do procedimento para a produção de um aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal.

Descrição detalhada da invenção

[038] Para melhor explicar o procedimento para a produção de um aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal a partir de compostos multienzimáticos exógenos, demonstrando suas características únicas e novas, o diagrama de fluxo a seguir e sua configuração construtiva correspondente e os protocolos de trabalho associados para a obtenção do produto da presente invenção são apresentados.

[039] A Tabela 3 é um esquema do procedimento para a produção de um aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal. Tabela 3

ETAPA 1: Multiplicação do banco de fungos selecionado para a produção do componente ativo 1 (CA 1)

[040] Esta é a primeira etapa da técnica para a obtenção da multiplicação de espécies de fungo e cruzamentos interespécies (denominado como F1) que será responsável pela produção enzimática subsequente. As espécies de fungo selecionadas para validar a implementação do procedimento descrito nesta patente, preferencialmente de natureza fibrolítica, com diferentes capacidades de degradar celulose, hemicelulose e lignina, podem ser obtidas a partir de um banco de germoplasma, de acordo com as especificações descritas nesta patente.

Laboratório:

[041] O banco de espécies a serem separadamente cultivadas é posicionado em culturas em placas de Petri em substrato agar-agar, e posicionadas em um forno a 28 °C até que a expansão micelar tenha sido alcançada em uma porcentagem maior do que 90 % de cobertura das placas de Petri.

[042] A estrutura micelar das placas de Petri é removida para transferir a mesma para bandejas de multiplicação nas salas de cultura.

Salas de cultivo:

[043] Muitas salas de cultura são requeridas conforme a quantidade de espécies de fungo que são usadas para a produção do aditivo multiplicador e modulador objeto da presente invenção.

[044] A fim de ilustrar as combinações de espécies que podem ser usadas, o diagrama de fluxo mostra as espécies de fungo (vide lista de espécies de fungo na etapa 4) usadas como referência para a implementação do procedimento descrito no presente Relatório Descritivo.

[045] As salas de cultivo são projetadas em uma dimensão de 4 m de largura por 4 m de comprimento e uma altura máxima de 3 m, com um piso de porcelana antiderrapante e paredes revestidas com plástico Durlock com sistemas de abertura e fechamento da ventilação controlados.

[046] Estas salas são equipadas com dispositivos de abertura e fechamento controlados por um computador que regula a ventilação de acordo com os níveis de leitura que são tomados por diferentes sensores ambientais que irão medir os parâmetros de: 1 - Umidade relativa 2 - Temperatura 3 - Nível de oxigênio 4 - Níveis de amônia na atmosfera 5 - Comprimento de onda específico para cada sala 6 - pH (níveis de acidez ou alcalinidade) 7 - Tipo de substrato

[047] As espécies de fungo usadas para validar o método para o preparo do aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal descrito na presente invenção inclui 23 espécies fibrolíticas com diferentes capacidades para degradar os diferentes tipos e formas de estrutura de parede vegetal, em que alguns são mais relacionados à degradação da celulose, outros da hemicelulose e os mesmos aos compostos relacionados à lignina.

[048] Nesta etapa, a fase sexuada é induzida nas referidas espécies. As condições ambientais necessárias para alcançar a mesma são: - Umidade relativa: deve estar na faixa de 86 % a 95 % de UR. Esta condição é alcançada com aspersão automática. Os aspersores atuam com bicos cônicos de gotas ultrafinas de água com uma pressão de 4,5 kg. - Temperatura: valores entre 23 a 28 °C. - Nível de oxigênio: a concentração deve estar entre 10 a 15 % de O2, deslocados pelo nitrogênio amoniacal típico das atmosferas saturadas de baixa ventilação induzidas para esta etapa. - Luz (comprimento de onda): radiação eletromagnética ultravioleta em um comprimento de onda de 400 - 410 nm. Sua função é induzir o crescimento das fases sexuadas de todas as espécies de fungo que são reproduzidas em cada uma das salas. - pH: o nível ótimo para este crescimento e desenvolvimento é um meio ácido com um pH de 4,5 a 5,3. - Substrato: o substrato é preparado em bandejas plásticas estéreis de um tamanho de 30 cm por 40 cm com uma altura de 8 cm.

[049] A composição do referido substrato é uma mistura de: - 10 % de turfa - 10 % de composto orgânico composto com cerca de 30 % de matéria orgânica - 15 % de leveduras com um mínimo de 90 % de população viva - 15 % de açúcar branco comum - 30 % de biomassa lignocelulósica, por exemplo, uma mistura de casca de algodão e casca de amendoim - 5 % de espécies de fungo que correspondem a cada sala de multiplicação (de acordo com o diagrama de fluxo indicado) - 5 % de ureia - 10 % de carbonato de cálcio dolomítico.

[050] Tal como mostrado na Figura 3, estes ingredientes são misturados a fim de, então, preencher as bandejas com a mistura, as quais são posicionadas em prateleiras a partir do chão até o teto da sala, e são inundadas com água para começar o crescimento das espécies de fungo selecionadas.

[051] Este procedimento é realizado a portas fechadas das salas correspondentes por 10 dias, observando o crescimento e o desenvolvimento de espécies. Ao final deste período, o crescimento do fungo correspondente (tipo “chapéu”) será obtido nas bandejas de cultura e restos micelares aos pés das estruturas fúngicas, os quais serão colhidos de acordo com as especificações descritas na etapa 1, a qual é resumida como: • Coleta e colheita do micélio e base enzimática / coleta e colheita das espécies de fungo e híbridos de interespécies que serão combinados para produzir o componente ativo 1 (CA 1).

[052] Antes da colheita dos esporos e corpos de frutificação das espécies em cada sala, os micélios localizados aos pés das estruturas reprodutivas fúngicas são colhidos com pente de aço cirúrgico. Os referidos micélios serão, subsequentemente, preservados em placas de Petri, tal como descrito no protocolo para o início da multiplicação fúngica (Etapa 1, Laboratório).

[053] A referida estrutura micelar produz um teor enzimático (considerado como “Base”) associado ao conjunto de espécies de fungo selecionadas, e o qual é incorporado como parte do componente ativo 1 (CA 1) dentro do processo de formulação do aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal objeto da presente invenção.

ETAPA 2: Colheita - dormência - armazenamento de culturas fúngicas

[054] É a implementação das operações de colheita e conservação das estruturas reprodutivas dos fungos que serão usadas como materiais para desenvolver a próxima etapa, usando processos e dispositivos que garantem a combinação de propriedades enzimáticas associadas às diferentes espécies de fungos selecionadas para a sua integração no CA 1.

Armazenamento e Banco de Inoculante

[055] Este conjunto de operações garante o armazenamento do banco de inoculante fúngico que foi produzido sob condições compatíveis com a próxima etapa do procedimento de produção do aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal.

[056] Nas mesmas bandejas tratadas para a colheita da base micelial e enzimática, a colheita de esporos fúngicos e restos de conídios é realizada, com o máximo cuidado para isolar as mesmas o tanto quanto possível a partir do fundo ou da base do substrato de cada bandeja.

[057] Para esta finalidade, mantas de seda finas são posicionadas na superfície do substrato e, neste sentido, os esporos fúngicos isolados nas placas de Petri são coletados para a etapa de “Armazenamento e Banco de Inoculante”. Estas placas de Petri também servirão como suprimento para a próxima Etapa 2 (que corresponde ao cultivo e propagação assexuada de espécies e híbridos interespécies que foram multiplicados na Etapa 1), e irá integrar o material bruto base do componente ativo 1 (CA 1) dentro do processo para a produção do aditivo multiplicador e modulador objeto da presente invenção.

[058] Estas placas de Petri, perfeitamente identificadas de acordo com a sua origem a partir de cada sala correspondente a uma espécie ou um híbrido ou combinação interespécies, contêm uma preparação do tipo xerofítica com uma base de calcário dolomítico e um alumino silicato de zinco, a fim de induzir a interrupção do crescimento dos fungos.

[059] As condições requeridas para este estágio de interrupção de crescimento são: Umidade relativa: varia de 9 % a 11 % de UR, a qual é mantida com a base adsorvente de calcário dolomítico. pH: valores entre 6,5 a 7,5 são aqueles indicados para o controle do crescimento e desenvolvimento de fungos. Temperatura: entre valores de 10 - 15 °C. Luz: branca comum, permanente. Oxigênio: atmosfera de oxigênio supersaturada, obtida por ventilação forçada.

ETAPA 3: Cultivo de espécies e cruzamentos interespécies (F1) de fungos previamente selecionados e multiplicados (etapa 1) para a colheita de biomassa enriquecida de compostos multienzimáticos exógenos

[060] É a implementação de operações projetadas para alcançar a combinação da biomassa das espécies selecionadas para a produção do aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal a partir de compostos enzimáticos exógenos, utilizando processos e dispositivos que garantem uma combinação das propriedades enzimáticas associadas com as diferentes espécies de fungos que são integrados no CA 1.

[061] Para alcançar isso, em uma bateria de cinco salas exatamente projetadas como aquelas utilizadas na Etapa 1, os grupos de 5 espécies são isolados e cultivados, em bateladas de produção mensal que correspondem à combinação do número de espécies envolvidas (por exemplo, 4 bateladas de produção mensal para combinar 20 espécies).

[062] Tendo observado uma melhora no aumento da sacarificação de compostos lignocelulósicos como um resultado do uso de populações interespecíficas, para alcançar uma melhora do processo é necessário ter duas salas isoladas para a cultura de fungos derivada dos cruzamentos interespécies incluídos na etapa 1 (em particular, Trichoderma longibrachiatum x T. reesei, Trichoderma longibrachiatum x T. viridae e Trichoderma reseei x Trichoderma viridae), como parte do procedimento de gestão do banco de fungos selecionado para a obtenção do componente ativo 1.

[063] Nesta etapa do procedimento, as condições ambientais devem ser controladas de acordo com os requisitos definidos para induzir a fase assexuada das culturas de fungos, começando pelo estado alcançado na etapa anterior, a fim de estimular a expressão da atividade enzimática nas formas correspondentes (variedades anamórficas) das espécies de fungo selecionadas para integrar o CA 1 usado para a formulação do aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal que é o objeto da presente invenção.

[064] As condições ambientais requeridas para realizar esta etapa são as seguintes: Umidade relativa: alta saturação da umidade pelo gotejamento de água de aspersão na forma de névoa que fornece ao lugar e ao meio ideal para estar em uma faixa de 89 - 98 % de UR. pH: ácido. Os níveis do pH na faixa de 3,5 - 4,8 são indicados. Temperatura: entre 28 - 31 °C. Luz: 589 nm de emissão amarela do sódio. Oxigênio: atmosfera normal.

Substrato para produzir as bandejas usadas na ETAPA 3:

[065] O substrato é preparado em bandejas plásticas estéreis de um tamanho de 30 cm x 40 cm com uma altura de 8 cm. Nas referidas bandejas, o substrato é preparado com base em uma mistura de: - 30 % de turfa - 15 % de composto orgânico contendo 30 % de matéria orgânica - 5 % de leveduras vivas de mais de 90 % de população viva - 5 % de açúcar branco comum - 10 % de biomassa lignocelulósica, por exemplo, mistura de casca de algodão e casca de amendoim - 5 % de espécies de fungo que correspondem a cada sala de multiplicação - 15 % de fosfato de diamônio - 5 % de carbonato de cálcio dolomítico - 10 % de arroz integral moído fino

[066] Estas bandejas são verificadas após 15 dias, e sob as condições ambientais descritas, as estruturas micelares e restos de conídios que serão parte do componente ativo 1 (CA 1) são colhidas. A colheita é realizada através de varredura com pente de aço cirúrgico, e posterior embalagem a vácuo.

[067] As enzimas mais notáveis que estão presentes no aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal a partir dos compostos multienzimáticos exógenos são: Endoglucanases, Exo-glucanases (cultura pura ou cruzamentos), Xilanases, Lacasa, CeloBio-Hidrolases (CBHI, CBHII), Beta-Glucosidases, Hemicelulases, Pectinase.

[068] As estruturas micelares e restos de conídios colhidos são armazenados e subsequentemente misturados como parte do CA 1.

[069] Uma vez que o CA 1 é produzido, para alcançar as características distintivas do aditivo multiplicador e modulador da presente invenção e, então, alcançar uma maior eficiência de degradação dos compostos lignocelulósicos, é necessário alcançar um equilíbrio entre: - Enzimas fibrolíticas (associadas com as espécies de fungo selecionadas usadas) - Restos de conídios das espécies de fungo e interespécies híbridas usadas - Ingredientes moduladores que contribuem para a nutrição microbiana do rúmen e que alcançam um equilíbrio estequiométrico com maior capacidade de degradar alimentos com alto teor de fibras, para serem incorporados como materiais adicionais na formulação do aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal.

ETAPA 4: Montagem do componente ativo 1 (CA 1)

[070] A contribuição funcional do CA 1 para o aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal é alcançado através da sua atividade como iniciador dos complexos catalíticos, celulossomas, envolvendo alimentos fibrosos e bactérias celulolíticas do rúmen. Nesta etapa, a montagem do referido componente é realizada pela mistura da biomassa fúngica enriquecida em compostos multienzimáticos exógenos (da etapa 3) com o material derivado da cultura de base micelial e enzimática (da etapa 1) conservada sob as condições indicadas na etapa 2.

[071] A fim de alcançar a mistura descrita, é posicionado em um micro misturador de aço inoxidável operado em ambiente fechado e limpo: - 25 a 35 % de complexo enzimático (da etapa 1) - 60 a 65 % de restos de conídios (da etapa 3) - 5 a 10 % de celulose microcristalina (base de excipiente).

[072] Estes ingredientes ativos são misturados por 300 segundos, então, a mistura é embalada a vácuo e os recipientes são selados à quente para armazenamento posterior.

[073] A biomassa fúngica (colheita micelial e enzimática + resíduos de conídios) enriquecida em compostos multienzimáticos exógenos é proveniente das seguintes espécies e suas possíveis combinações híbridas interespécies (indicadas por um X entre os nomes científicos das espécies correspondentes), produzida usando os processos, dispositivos e condições de produção descritos neste Relatório Descritivo: Trichoderma longibrachiatum Trichoderma reesei (= Hypocrea jecorina) Trichoderma viride (= T. harzianum ó Hypocrea atroviridis) Trichoderma longibrachiatum x T. reesei Trichoderma longibrachiatum x T. viridae Trichoderma reseei x Trichoderma viridae Trichoderma hirsuta Phanerochaete chrysosporium Chrysosporium lucknowense Agaricus bisporus Aspergillus terreus Aspergillus oryzae Aspergillus niger Aspergillus flavus Schizosaccharomyces pombe Pyricularia oryzae Pycnoporus cinnabarinus Pleurotus ostreatus Pleurotus eryngii Thanatephorus cucumeris Phlebia radiata Pycnoporus sanguineus Stropharia coronilla

ETAPA 5: Montagem do componente ativo 2 (CA 2)

[074] Para os fins desta etapa, é considerada como moduladora (ou “reguladores estequiométricos da microbiota ruminal”) uma determinada quantidade de produtos orgânicos e inorgânicos naturais que objetivam alcançar um equilíbrio funcional da população microbiana do rúmen associada com a entrada dos compostos multienzimáticos exógenos incluídos na formulação do aditivo multiplicador e modulador descrito na presente invenção.

[075] A montagem dos moduladores da microbiota do rúmen (pela mistura dos seus materiais nas proporções definidas) facilita sua subsequente combinação com o componente ativo 1, sendo uma etapa fundamental no processo de integração dos processos e dispositivos projetados para produzir e coletar biomassa a partir de espécies de fungo selecionadas, de acordo com as especificações para produzir um aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal com aplicação industrial em sistemas de alimentação para animais ruminantes.

[076] Este procedimento é considerado particularmente dinâmico, uma vez que ele pode ser usado para alcançar diferentes combinações das propriedades enzimáticas associadas às espécies de fungo selecionadas, e porque é viável para ser incorporado em múltiplos sistemas de alimentação de animais ruminantes, tanto diretamente como ração ou como um suplemento nutricional para ser distribuído ao longo dos dispositivos existentes ou para ser desenvolvido com a referida finalidade, e com impacto econômico e ambiental positivo nos sistemas de produção animal.

[077] Os componentes identificados como moduladores da microbiota ruminal são misturados (em um micro misturador de aço inoxidável operado em ambiente fechado e limpo) para formar o CA 2, nas seguintes proporções: Ingredientes do componente ativo 2 (CA 2)

[078] Esta mistura de ingredientes (CA 2) deve ser combinada com CA 1, em proporções definidas, tal como descrito na etapa 6.

ETAPA 6: Protocolo para a formulação do aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal

[079] Esta etapa corresponde à mistura (com períodos de 300 segundos) do componente multienzimático (CA 1) e do componente modulador (CA 2), a fim de alcançar as diferentes proporções do aditivo multiplicador e modulador de acordo com as condições particulares de distribuição do produto como um suplemento para a alimentação de animais ruminantes, em que a referida mistura CA 1 + CA 2 é realizada em um misturador com capacidade de 50 kg.

[080] A proporção da mistura recomendada para a formulação do aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal pretendida para o uso direto no preparo de rações para sistemas de produção animal é: 15 % a 20 % de CA 1 e 75 % a 80 % de CA 2. No intervalo correspondente a estas proporções, as melhoras na digestibilidade do alimento fibroso consumido foram determinadas e as reduções dos custos de alimentação foram reportadas (para um maior aproveitamento dos alimentos fibrosos consumidos), também associadas a uma redução significativa na perda de energia associada com a liberação do metano ruminal.

[081] A montagem dos componentes CA 1 e CA 2 foi detalhada nas seções correspondentes (etapa 4: CA 1 e etapa 5: CA 2), e sua mistura, nas proporções definidas nesta etapa 6 para a formulação do aditivo multiplicador e modulador, é considerada como uma parte integral do procedimento objeto desta patente.

[082] As avaliações funcionais realizadas incluíram o uso de diferentes vias para a distribuição e uso da referida formulação, adequadas para cada sistema de alimentação para animais ruminantes, incluindo as seguintes: a) Pré mistura de vitaminas e minerais (ambos na forma de sais em pó e blocos sólidos) e rações finalizadas (TMR) pretendidas para a alimentação de ruminantes, quando a proporção do referido aditivo está entre 10 % e 20 % do total da pré mistura. b) Dispositivos usados para a distribuição de suplementos para a nutrição de ruminantes alimentados sob condições de confinamento, semi confinamento ou sistemas extensivos de terras agrícolas, tais como comprimidos (obtidos por meio de um granulador, com uma faixa entre 8 - 18 mm em diâmetro) formados por uma matriz lignocelulósica fibrosa, contendo 1 % do aditivo e capazes de serem administrados através de um aplicador intrarruminal que permite a lenta liberação dos componentes incluídos na formulação do aditivo objeto da presente invenção, para aplicações que requerem um período de eficácia maior do que 90 dias.

[083] Uma modalidade é um método para o preparo de um primeiro componente ativo em um aditivo para a microbiota ruminal, o método compreendendo as etapas de: (a) multiplicar um banco de espécies de fungo para produzir um complexo enzimático compreendendo (i) estruturas de micélio e (ii) esporos e corpos de frutificação; em que o banco de espécies de fungo é duas ou mais do seguinte: Trichoderma longibrachiatum; Trichoderma reesei (= Hypocrea jecorina); Trichoderma viride (= T. harzianum ó Hypocrea atroviridis); Trichoderma hirsuta; Phanerochaete chrysosporium; Chrysosporium lucknowense; Agaricus bisporus; Aspergillus terreus; Aspergillus oryzae; Aspergillus niger; Aspergillus flavus; Schizosaccharomyces pombe; Pyricularia oryzae; Pycnoporus cinnabarinus; Pleurotus ostreatus; Pleurotus eryngii; Thanatephorus cucumeris; Phlebia radiata; Pycnoporus sanguineus; Stropharia coronilla; (b) cultivar cruzamentos interespécies (F1) de determinadas espécies de (a), para produzir restos de conídios, em que os cruzamentos interespécies (F1) são um ou mais dos seguintes: Trichoderma longibrachiatum x T. reesei; Trichoderma longibrachiatum x T. viridae; ou Trichoderma reseei x Trichoderma viridae; e (c) misturar os produtos de (a) e (b) com uma base de excipiente para produzir o componente ativo.

[084] É descrito um aditivo para a microbiota ruminal, o aditivo compreendendo: (a) um primeiro componente ativo compreendendo: (i) estruturas de micélio, esporos e corpos de frutificação a partir de um banco de espécies de fungo, em que o banco de espécies de fungo inclui duas ou mais das seguintes: Trichoderma longibrachiatum; Trichoderma reesei (= Hypocrea jecorina); Trichoderma viride (= T. harzianum ó Hypocrea atroviridis); Trichoderma hirsuta; Phanerochaete chrysosporium; Chrysosporium lucknowense; Agaricus bisporus; Aspergillus terreus; Aspergillus oryzae; Aspergillus niger; Aspergillus flavus; Schizosaccharomyces pombe; Pyricularia oryzae; Pycnoporus cinnabarinus; Pleurotus ostreatus; Pleurotus eryngii; Thanatephorus cucumeris; Phlebia radiata; Pycnoporus sanguineus; Stropharia coronilla e (ii) restos de conídios de um ou mais dos seguintes cruzamentos interespécies (F1): Trichoderma longibrachiatum x T. reesei, Trichoderma longibrachiatum x T. viridae e Trichoderma reseei x Trichoderma viridae; e (b) um segundo componente ativo compreendendo dois ou mais dos seguintes: amido de milho, açúcar, trigo, arroz, celulose, dolomita, vermiculita, levedura, glucanos mananos oligofrutanos (M.O.S.), fitase, isoleucina, lisina, leucina, metionina, treonina, triptofano, cloreto de colina, selênio, vitamina E ou carbonato de cálcio; em que a redução no metano produzido por um ruminante quando ingere o aditivo é de pelo menos 28 % quando comparado com o metano produzido por um ruminante que não ingeriu o aditivo.

[085] O acima exposto é uma descrição detalhada de modalidades particulares da invenção. É reconhecido que os desvios das modalidades divulgadas podem ser realizados dentro do escopo da invenção e que modificações óbvias ocorrerão para um técnico no assunto. Aqueles com habilidade na técnica devem, à luz da presente divulgação, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são aqui divulgadas e ainda obter um resultado semelhante ou similar sem se afastar do âmbito e do escopo da invenção. Todas as modalidades aqui divulgadas e reivindicadas podem ser realizadas e executadas sem experimentação indevida à luz da presente revelação.

Claims

1. Procedimento para a produção de um aditivo multiplicador e modulador da microbiota ruminal, o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender as etapas de: (a) multiplicar um banco de espécies de fungo para produzir um complexo enzimático compreendendo (i) estruturas de micélio e (ii) esporos e corpos de frutificação; em que o banco de espécies de fungo é duas ou mais das seguintes: Trichoderma longibrachiatum Trichoderma reesei (= Hypocrea jecorina) Trichoderma viride (= T. harzianum ó Hypocrea atroviridis) Trichoderma hirsuta Phanerochaete chrysosporium Chrysosporium lucknowense Agaricus bisporus Aspergillus terreus Aspergillus oryzae Aspergillus niger Aspergillus flavus Schizosaccharomyces pombe Pyricularia oryzae Pycnoporus cinnabarinus Pleurotus ostreatus Pleurotus eryngii Thanatephorus cucumeris Phlebia radiata Pycnoporus sanguineus Stropharia coronilla; (b) cultivar cruzamentos interespécies (F1) de determinadas espécies de (a) para produzir restos de conídios, em que os cruzamentos interespécies (F1) são um ou mais dos seguintes: Trichoderma longibrachiatum x T. reesei; Trichoderma longibrachiatum x T. viridae; ou Trichoderma reseei x Trichoderma viridae; e (c) misturar os produtos de (a) e (b) com uma base de excipiente para produzir o componente ativo.

2. Procedimento, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de a mistura resultante da etapa (c) compreender: 25 a 35 % de complexo enzimático; 60 a 65 % de restos de conídios e 5 a 10 % de base de excipiente.

3. Procedimento, de acordo com a reivindicação 1, CARAC TERI ZADO pelo fato de compreender ainda combinar o primeiro componente ativo com um segundo componente ativo, o segundo componente ativo compreendendo uma mistura definida de materiais com efeito modulador, de modo que o aditivo resultante, quando adicionado à microbiota ruminal, aumenta a taxa de digestão na microbiota ruminal em pelo menos 5 vezes.

4. Procedimento, de acordo com a reivindicação 3, CARAC TERI ZADO pelo fato de o segundo componente ativo compreender dois ou mais dos seguintes: amido de milho, açúcar, trigo, arroz, celulose, dolomita, vermiculita, levedura, glucanos mananos oligofrutanos (M.O.S.), fitase, isoleucina, lisina, leucina, metionina, treonina, triptofano, cloreto de colina, selênio, vitamina E ou carbonato de cálcio.

5. Procedimento, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de 15 a 20 % do primeiro componente ativo ser combinado com 75 a 80 % do segundo componente ativo para produzir o aditivo.

6. Aditivo para a microbiota ruminal, o aditivo CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (a) um primeiro componente ativo compreendendo: (i) estruturas de micélio, esporos e corpos de frutificação a partir de um banco de espécies de fungo, em que o banco de espécies de fungo inclui duas ou mais das seguintes: Trichoderma longibrachiatum; Trichoderma reesei (= Hypocrea jecorina); Trichoderma viride (= T. harzianum ó Hypocrea atroviridis); Trichoderma hirsuta; Phanerochaete chrysosporium; Chrysosporium lucknowense; Agaricus bisporus; Aspergillus terreus; Aspergillus oryzae; Aspergillus niger; Aspergillus flavus; Schizosaccharomyces pombe; Pyricularia oryzae; Pycnoporus cinnabarinus; Pleurotus ostreatus; Pleurotus eryngii; Thanatephorus cucumeris; Phlebia radiata; Pycnoporus sanguineus; Stropharia coronilla; e (ii) restos de conídios de um ou mais dos seguintes cruzamentos interespécies (F1): Trichoderma longibrachiatum x T. reesei, Trichoderma longibrachiatum x T. viridae e Trichoderma reseei x Trichoderma viridae; e (b) um segundo componente ativo compreendendo dois ou mais dos seguintes: amido de milho, açúcar, trigo, arroz, celulose, dolomita, vermiculita, levedura, glucanos mananos oligofrutanos (M.O.S.), fitase, isoleucina, lisina, leucina, metionina, treonina, triptofano, cloreto de colina, selênio, vitamina E ou carbonato de cálcio; em que a redução no metano produzido por um ruminante quando ingere o aditivo é de pelo menos 28 % quando comparado com o metano produzido por um ruminante que não ingeriu o aditivo.

7. Aditivo, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de a redução no metano ser de pelo menos 49 %.

8. Formulação de ração para ruminantes CARACTERIZADA pelo fato de compreender o aditivo conforme definido na reivindicação 6.

9. Formulação de ração para ruminantes, de acordo com a reivindicação 8, CARAC TERI ZADA pelo fato de compreender ainda sal.

10. Formulação de ração para ruminantes, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de o aditivo compreender 10 a 20 % da formulação.

11. Formulação de ração para ruminantes, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de o aditivo ser incorporado em um comprimido compreendendo uma matriz lignocelulósica fibrosa.

12. Formulação de ração para ruminantes, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de estar na forma de uma formulação de liberação prolongada que é capaz de liberar o aditivo por um período de pelo menos 90 dias.