JPS5940839B2 - 混合酸型１，２−ジアシル−３−グリセリルホスホリルコリン類の製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、混合酸型１・２−ジアシルー ３−グリセリ
ルホスホリルコリン類の製法、さらに詳しくは、モノア
シルー３−グリセリルホスホリルコリンまたはその塩を
特定の条件下にアシル化して、有用な生物学的活性を有
する、一般式ＣＨ２−Ｏ−ＣＯＲ ＣＨ−Ｏ−ＣＯＲ’ ＩＷｆ／ＣＨ゛（Ｉ） ＣＨ２−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−ＣＨ３１＼
〔式中、ＲおよびＲ５は、たがいに異なつて、飽和また
は不飽和の脂肪酸残基を意味す伐ただし、ＲおよびＲ５
のいずれか一方がアイソトープ体の脂肪酸残基であると
きは、他方も同種の脂肪酸残基であつてもよい〕で不さ
れる混合酸型１・２−ジアシル−３−グリセリルホスホ
リルコリン類の改良製法に関し、本発明の方法は前記式
（１）中のＲまたはＲ２のいずれかが高度の不飽和脂肪
酸のアシル残基である場合にとくに有利に用いられる。

前記一般式（１）で示される化合物は、一般にレシチン
と称せられ、ことにそのアシル基が主としてリノール酸
、リノレン酸などの必須脂肪酸に属する高度不飽和脂肪
酸からなるレシチンは、生物学的活性が高く薬物として
重要であることが知られており、その同種の脂肪酸残基
を有するレシチンの改良製法については、本発明者らに
よりすでに特許出願されている（特願昭５０−０１５１
４３号）。

ところで、このレシチンの生体、ことに生体膜における
存在意義を明確にするためには、その１位と２位に異種
の脂肪酸残基を有する混合酸型レシチン、とくにそのラ
ベル体（１位と２位の脂肪酸残基が同種脂肪酸であつて
も一方のみがラベルされたものも本発明の混合酸型に含
まれる）が必要であるが、従米そのような混合酸型レシ
チンを純粋な形で与える方法が知られておらず、そのた
めに、レシチンの生化学的意義が今ひとつ明確にされて
いない。

すなわち、この混合酸型レシチンは、非常に複雑な工程
を経て合成された混合酸型ジグリセラードを、さらに数
工程を経てレシチンに導く方法でえているが経済的でな
く、ことに高度不飽和脂肪酸系の混合酸型レシチンの合
成はほとんど不可能と考えられていた。ごく最近になつ
て、リゾレシチンをアシルイミダゾール中間体と直接反
応させてラベルしたレシチンをうる方法が報告されてい
る〔Ｗ．Ｆ．ＢＯｓｓ等；ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉＯ
ｃｌｌｅｍｉｓｔｒｙｌ６４巻、２８９〜２９２頁（１
９７５年）〕ｏしかしながら、この方法によつても、な
お充分な高収率で目的とするレシチンをうることは困難
であり、とくに高度不飽和脂肪酸残基の導入は不可能で
ある。

このような事情のもとに、本発明者らは、混合酸型レシ
チンを高純度、高収率にてうる方法を見出すべく種々研
究を重ねた結果、アシル転位を注意深く防いで製造した
モノアシル−３−グリセリルホスホリルコリンまたはそ
の塩に、イミダゾールナトリウムおよび酸化ナトリウム
から選ばれる触媒の存在下に、特定のアシル化剤を反応
させることにより、その目的を達成しうることを知り、
本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、脂肪酸
を１−アシルイミダゾールの形にかえ、これをアシル化
剤として用い、イミダゾールナトリウムおよび酸化ナト
リウムから選ばれる触媒の存在下に、モノアシル−３−
グリセリルホスホリルコリンの遊離型またはその塩、た
とえば塩化カドミウム塩、塩化バリウム塩など（通常複
合体とみられている）に作用させることにより容易に目
的とする混合酸型１・２−ジアシル−３−グリセリルホ
スホリルコリン類がえられる。

本発明における出発物質のモノアシル−３−グリセリル
ホスホリルコリメ類には、１−モノアシル体と２−モノ
アシル体とがあり、いずれも本発明の方法に用いられる
。

この１−モノアシル−３一グリセリルホスホリルコリン
類は、通常、合成純レシチンを適当な溶媒（たとえばエ
チルエーテル）中で、緩衝液（ＰＨ約７）〔たとえば、
０．２Ｍホウ酸一炭酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）
、０．２Ｍトリス緩衝液（ＰＨ７．２）〕および賦活剤
（たとえば塩化カルシウム液）の存在下、蛇毒〔たとえ
ば、クロタラス・アドマンテウス（ＣｒＯｔａｌｕｓａ
ｄｍａｎｔｅｕｓ）、ナジヤ・ナジヤ（Ｎａｊａｎａｊ
ａ）、トリメレスラス・フラボビリデイス（Ｔｒｉｍｅ
ｒｅＳＵｒｌ］ＳｆｌａｖＯｖｉｒｉｄｉｓ）などの毒
〕、ハチ毒〔たとえば、ミツバチ（Ａｐｉｓｍｅｌｌｌ
ｆｅｒａ）などの毒〕、トカゲ毒〔たとえば、ヘロデル
マ・ホリダム（ＨｅｌＯｄｅｒｍａｈＯｒｉｄｕｍ）な
どの毒〕、サソリ毒〔たとえば、ロイラス・クインケス
．・トリアタス（ＬｅＵｒｌｌＳｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒ
ｉａｔｕｓ）などの毒〕、または動物の各種臓器（たと
えば、ブタの膵臓、ラツトの肝臓など）などからえられ
るホスホリパーゼＡ２またはその類縁酵素を用いて、常
温にて、アシル転位を起さぬように注意深く加水分解を
行なうことによりえられる。

また２−モノアシル−３−グリセ１ノルホスホリルコリ
ン類は、各種バクテリア〔たとえば、エシエリチア・コ
リ（Ｅ．ｃＯｌｉ）、ミコバクテリウム・プレイ（Ｍｙ
ｃＯｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｈｒｅｉ）、７ゞチルス・メ
ガセリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・
ズブチリス（Ｂ．ｓｌｌｂｔｉｌｉｓ）〕、または動物
の各種臓器（たとえば、ウシの膵臓、ラツトの胸腺、腎
臓、牌臓、肺など）からえられるホスホリパーゼＡ１ま
たはその類縁酵素を用いて、同様に、合成純レシチンを
加水分解することによりえられる。なお、このモノアシ
ル体は、それをホスホリパーゼＣを用いて酵素分解して
、そのホスホリルコリン部分を除いて、モノグリセリド
に導き、このモノグリセリドを分析することにより、そ
の１−モノアシル型または２−モノアシル型としての純
度を測定することができる。また、本発明における化合
物は、その分子中に不斉炭素原子を含み、光学異性体が
存在するが、本発明はこれら各光学異性体（Ｄ型、Ｌ型
）およびそのラセミ体もすべて包含する。

本発明において用いられる触媒としては、イミダゾール
ナトリウムならびに酸化ナトリウムが挙げられ、この反
応は室温で充分進行する。

本発明の方法を、そのアシル化剤の製造工程ならびに１
−アシル−３−グリセリルホスホリルコリンの製造工程
を含めて式示すればつぎのとおりである。

（式中、ＲおよびＲ゛は前記と同じ） 本発明の方法を、さらに詳細に説明すると、まずＮ−Ｎ
５−カルボニルジイミダゾール（）を無水テトラヒドロ
フラン（以下、ＴＨＦと略す）に懸濁し、これに飽和ま
たは不飽和高級脂肪酸（）を加え、この混合物を窒素気
流中で室温にて十数〜数十時間攪拌して１−アシルイミ
ダゾールをえる。

この化合物は単離したのち、または単離することなく反
応液のままつぎの反応に供することができる。なお、こ
の１−アシルイミダソＬルは、スターブの方法により、
イミダゾールに脂肪酸クロライドを反応させてもえられ
る〔Ｈ．Ａ．Ｓｔａａｂ；Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．、第８９
巻、１９４０頁（１９５６年）〕。別に、合成純レシチ
ン（Ｖ）をエチルエーテル溶液中で、緩衝液（ＰＨ約７
）および賦活剤の存在下、ホスホリパーゼＡ２を用いて
、常温にて、アシル転位を起さぬように注意深く加水分
解を行なつて１−アシル−３−グリセリルホスホリルコ
リン（）をえる。

かくしてえられた１−アシル−３−グリセリルホスホリ
ルコリン（）をそのまま、もしくはその塩化カドミウム
塩にかえたのち、無水ＴＨＦ中に懸濁し、これに前記の
１−アシルイミダゾールおよび触媒としてたとえばイミ
ダゾールナトリウムを加え、室温にて十数〜数十時間攪
拌すれば反応は完了する。

なお、目的物としてアイソトープ（たとえば、１４Ｃま
たは３Ｈ）でラベルした脂肪酸残基を有する１・２−ジ
アシル−３−グリセリルホスホリルコリン類は、該アシ
ル基が、そのようなアイソトープでラベルされた脂肪酸
残基であるアシル化剤を用いまつたく同様にしてえられ
る。

また、出発物質のモノアシル−３−グリセリルホスホリ
ルコリンがラベルされていてもよい。前記の方法でえら
れた反応混合物から目的物を単離するには、反応混合液
にクロロホルムを加え、１ＮＨＣ１−メタノールで中和
し、これに希メタノールの適当量を加え、分液ロードに
て２層に分離し、その下層を分別して減圧濃縮する。

ついでこの濃縮液をエタノール・クロロホルム・水（７
ニ１ ：３）にとかし、アンバーライトＭＢ−３型樹脂
のカラムに通し、同溶媒で洗い、その通導液および洗液
を合せて濃縮する。この濃縮物を常法にしたがい、たと
えば、シリカゲルカラムクロマトグラフイで処理して精
製すれば目的物が８０％以上の高収率でえられる。本発
明の方法では、脂肪酸として、カプロン酸、ラウリン酸
、ミリスチン酸、パルミチ４、ステアリン酸、アラキン
酸、ベヘン酸などの飽和脂肪酸、およびミリストレン酸
、パルミトレン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン
酸、アラキドン酸などの不飽和脂肪酸のいずれも用いる
ことができ、従来公知の方法では製造の困難な高度不飽
和脂肪酸、たとえばリノール酸、リノレン酸、アラキド
ン酸などの導入にきわめて有利であり、さらに高価なア
イソトープ体の製造にもきわめて価値ある方法である。

しかして、本発明の方法によれば、アシル化剤として高
度不飽和脂肪酸残基を有するもの、あるいはアイソトー
プでラベルしたものを用い、また出発物質のモノアシル
−３−グリセリルホスホリルコリンを適宜選択すること
により、１位または２位のいずれかに高度不飽和脂肪酸
残基またはアイソトーブでラベルした脂肪酸残基を有す
る１・２−ジアシル−３−グリセリルホスホリルコリン
類が容易にえられる。

このように本発明の方法は、特定の触媒の存在下に反応
が行なわれ、反応条件がきわめて緩和であり、単純な工
程と操作で高収率にて目的物がえられるという利点があ
り、ことに、不安定な高度不飽和脂肪酸誘導体の製法に
適し、さらに高価な原料である脂肪酸のアイソトープ体
を利用する特定の燐脂質ラベル体の合成にもきわめて有
利に用いられる。

とりわけ、不飽和脂肪酸を１位および２位のいずれかに
結合する混合酸型レシチンの製造には本発明の方法はき
わめて大きな価値を有し、そのような有利な方法はこれ
までまつたく知られていない。また前述したように、一
方の脂肪酸をアイソトープでラベルした不飽和脂肪酸で
おきかえたレシチンも製造することができる。本発明方
法でえられる、これら一連の混合酸型純レシチン類は、
医薬として有用であるばかりでなく、レシチンの生化学
的研究、とくにそれらの代謝研究にもきわめて大きな価
値を有し、医薬としてのレシチンの意義を確立するため
にも有用である。

つぎに実施例を挙げて本発明の方法をさらに具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例 １ 合成純１・２−ジステアロイル一Ｌ−３−グリセリルホ
スホリルコリン５０ηをエチルエーテル１ｍ１にとかし
、これにクロタラス・アドマンテウスの毒からのホスホ
リパーゼＡ２Ｏ．５ηを０．２Ｍホウ酸一炭酸ナトリウ
ム緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）０．５ｍ１にとかした溶液を加
え、さらに賦活剤として２．５ｍＭの塩化カルシウム液
数滴を加えて約１時間室温で攪拌する。

この反応液を減圧濃縮し、ついで少量のベンゼンを加え
てさらに濃縮して水分を完全に除去する。えられた無色
の固形物を無水エタノールにとかし、濾過して不溶物を
除き、濾液にエチルエーテルを加えて−２０℃で２回再
結晶させて結晶性物質の１−ステアロイル一Ｌ−３−グ
リセリルホスホリルコリン２５〜（７７％）をえる。本
品は薄層クロマトグラフイ〔ＣＨＣｌ３−ＣＨ３ＯＨ−
Ｈ２Ｏ（６５：２５：４）〕にて単一のスポットを与え
標品のそれと一致した。またボスホスホリパーゼＣにて
酵素分解してえたモノグリセリドの分析結果から１−ア
シル型としての糸曲斐は９５．５％であつ≠二。かくし
てえられた１−ステアロイル一Ｌ−３−グリセリルホス
ホリルコリン５００ｍ９を、ハナハンらの方法〔Ｄ．Ｊ
．Ｈａｎａｈａｎｅｔａｌ；Ｊ．ＢｉＯｌ．Ｃｈｅｍ．
２３５巻、１９１８頁（１９６０）〕にしたがつて、エ
タノール１０ｍ１にとかし、この溶液に、あらかじめ塩
化カドミウム（２．５分子結晶水）７００ηを水０．５
ｍ１にとかし、エタノール８ｍ１を加えてえた溶液を加
え、この混合液を２時間放置し、析出した結晶を濾取し
、残渣をエタノール、エチルエーテルでよく洗浄して１
−ステアロイル一Ｌ−３−グリセリルホスホリルコリン
の塩化カドミウム塩６５０ｍ９（６４％）をえる。

かくしてえられた塩化カドミウム塩３００ワ（３．６Ｘ
１０−４Ｍ）を無水ＴＨＦｌＯｍｌに懸濁し、これに１
−パルミトイルイミダゾール６６０〜およびイミダゾー
ルナトリウム１０ワを加え、この混合物を室温で１６時
間攪拌する。えられた反応液にクロロホルム５０ｍ１を
加え、これを１ＮＨＣ１−メタノール３ｍ１にて中和し
、さらに水１５Ｗ１１およびメタノール２５ｍ１を加え
、分液ロードにて分液し、その下層を分取して濃縮する
。えられた残渣をエタノール・クロロホルム●水（７：
１：３）１０ｍ１に溶解させ、同溶媒で活性化したアン
バーライトＭＢ−３型樹脂１０ｍ１を充填したカラムに
通導し、同溶媒でカラムを洗う。通導液と洗液を合せ、
減圧濃縮する。この濃縮物をクロロホルム・メタノール
（９８：２）混液にとかし、同溶媒で処理したシリカゲ
ル３０ｆを充填したカラムに通し、これをクロロホルム
・メタノール（９８：２）２５０ｍ１（画分１）、クロ
ロホルム・メタノール（６：４）３００ｍ１（画分２）
およびクロロホルム・メタノール（２：８）２５０ｍ１
（画分３）にて溶出する。えられた画分２を減圧濃縮し
て目的とする無色結晶の１−ステアロイルー２−パルミ
トイル一Ｌ−３−グリセリルホスホリルコリン２６０η
（８０％）をえる。融点２３３〜２３５℃、（９）青＝
＋６．０融±０．５（ＣＨＣ）３、Ｃ−１０．０）元素
分析値：Ｃ４２Ｈ８６Ｏ９ＮＰ（分子量７８０．１）と
して計算値（％）：Ｃｌ６４．６６；Ｈｌｌｌ．ｌｌ；
Ｎｌ．８Ｏ実測値（％）：Ｃｌ６４．３Ｏ；Ｈｌｌｌ．
２３；Ｎｌｌ．９３上記の方法で用いる１−パルミトイ
ルイミダゾールはつぎのようにして製造される。

１００ｍ１の三ロフラスコにＮ−Ｎ５−カルボニルジイ
ミダゾール８１０ワ（５×１０−３モル）を無水ＴＨＦ
ｌＯｍｌに懸濁させ、これにパルミチン酸１．０７（３
．８×１０−３モル）をＴＨＦ２Ｏｍｌにとかした溶液
を加え、湿気をできるだけさけて窒素気流中、室温にて
３時間攪拌し、不溶物を濾別し、濾液を減圧濃縮したの
ち、えられた残渣を酢酸エチルより再結晶すると目的物
１．０ｔをえる。

融点８１〜８３℃実施例 ２ 合成純１・２−ジパルミトイル一Ｌ−３−グリセリルホ
スホリルコリン１２３４ワをエチルエーテル７０ｍ１に
とかし、これにナジヤ・ナジヤの毒からのホスホリパー
ゼＡ２４ηを水４ｍ１にとかした溶液、０．２Ｍトリス
緩衝液（ＰＨ７．２）２ｍ１および０．１ＭＣａＣ１２
溶液０．５ｍ１を加え、この混合物を室温で４時間反応
させる。

えられた反応液を減圧濃縮し、これを実施例１と同様に
処理し、エチルエーテルから−２０℃で再沈澱させて１
−パルミトイル一Ｌ−３−グリセリルホスホリルコリン
６７４ＴＩ１？（８０％）をえる。このものは、ホスホ
リパーゼＣにて酵素分解してえたモノグリセリドの分析
結果から１−アシル型としての純度は９７．９％であつ
た。かくしてえられた１−パルミトイル一Ｌ−３−グリ
セリルホスホリルコリン２６６η（５．１７×１０−４
Ｍ）を無水ＴＨＦｌＯｍｌに懸濁し、これに１−リノレ
オイルィミダゾール５１０η（１．５５×１０−３Ｍ）
とイミダゾールナトリウム１０ηを加え、この混合物を
室温にて７０時間攪拌する。

えられた反応液を実施例１と同様に処理し、最後にシリ
カゲルカラムクロマトグラフイで処理して目的とする１
−パノレミトイノレ一２−リノレオイノレ一Ｌ−３−グ
リセリルホスホリルコリン３４２．３Ｔｆ１ｙ（８４％
）を無色粘稠状物質としてえる。０一＋６．５８±０．
５無（ＣＨＣｌ３：ＣＨ３ＯＨ＝１：１、Ｃ＝５．０）
元素分析値：Ｃ４２Ｈ８２Ｏ９ＮＰ（分子量７７６．１
）として計算値（％）：Ｎｌｌ．８Ｏ；Ｐｌ３．９９実
測値（％）：Ｎｌ２．ｌｌ；Ｐｌ３．６Ｏ本品は薄層ク
ロマトグラフイで単一のスポツトを示し、標品のそれと
一致する。

また赤外吸収スペクトルも標品のそれと一致する。なお
、上記の方法で用いられる１−リノレオイルイミダゾー
ルは、Ｎ−ＮＩ−カルボニルジイミダゾール１６２０Ｔ
ｆ９とリノール酸２１００ηとから実施例１における場
合と同様にして製造される。

実施例 ３純１・２−ジリノレオイル一Ｌ−３−グリセ
リルホスホリルコリンから、前記実施例１または２と同
様にして、クロタルス・アドマンテウスまたはナジヤ・
ナジャの毒からのホスホリパーゼＡ２を用いて、１−リ
ノレオイル一Ｌ−３−グリセリルホスホリルコリンを製
造する。

この１−リノレオイル一Ｌ−３−グリセリルホスホリル
コリン３５２．２η（６．５４×１０−４Ｍ）１−パル
ミトイルイミダゾール５９４．８η（１．９６Ｘ１０−
３Ｍ）およびイミダゾールナトリウム１０ワを無水ＴＨ
Ｆに加え、室温で７０時間反応させる。

この反応液を実施例１と同様に処理し、最後にシリカゲ
ルカラムクロマトグラフイで精製して目的とする１−リ
ノレオイノレ一２−パノレミトＩＺイル一Ｌ−３−グリ
セリルホスホリルコリン３０２．６η（５８．９％）を
無色粘稠物質としてえる。

（ロ）駕一＋６．５％土０．５粘（ＣＨＣｌ３：ＣＨ３
−０Ｈ＝１：１、Ｃ−５．０）元素分析値：Ｃ４２Ｈ８
２Ｏ，ＮＰ（分子量７７６．１）として計算値（％）：
Ｎｌｌ．８Ｏ；Ｐｌ３．９９実測値（％）：Ｎ、１．７
８；Ｐ、３．８０本品の薄層クロマトグラフイは単一の
スポツトを示し、標品のそれと一致し、また赤外吸収ス
ベクトルも標品のそれと一致した。

実施例 ４ 前記実施例２で得られた１−パルミトイル一Ｌ−３−グ
リセリルホスホリルコリン３００ηと塩化カドミウム（
２．５分子結晶水）４５０ηから実施例１と同様に処理
して得られる１−パルミトイル一Ｌ−３−グリセリルホ
スホリルコリンの塩化カドミウム塩５８η（６．４Ｘ１
０−５Ｍ）を、無水ＴＨＦ２ｍｌに懸濁し、これに、Ｎ
−マーカルボニルジイミダゾール１６２０〜とステアリ
ン酸２１２０Ｔｆ９から実施例１と同様に処理して得ら
れる１−ステアロイルイミダゾール１２５〜（３．７５
Ｘ１０−４Ｍ）および酸化ナトリウム４．７〜を加え、
この混合物を室温にて２時間攪拌する。

得られた反応液を実施例１と同様に処理し、最後にシリ
カゲルクロマトグラフイで処理して目的とする１−パル
ミトイル一２−ステアロイル一Ｌ−３−グリセリルホス
ホリルコリン３９．８η（６８％）を無色結晶としてえ
る。融点２３０〜２３「ＣＯ２ｌ）＝＋８．０る±０．
５３（ＣＨＣｌ３：ＣＨ３ＯＨ一１：１、Ｃ−１０．０
）元素分析値：Ｃ４２Ｈ８６Ｏ，ＮＰ（分子量７８０．
１）として計算値（％）：Ｐ、３．９７ 実測値（％）：Ｐ、３．９１ 本品の薄層クロマトグラフイは単一のスポツトを示し、
標品のそれと一致し、また赤外吸収スペクトルも標品の
それと一致した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ モノアシル−３−グリセリルホスホリルコリンまた
   はその塩に１−アシルイミダゾールから選ばれるアシル
   化剤をイミダゾールナトリウムおよび酸化ナトリウムか
   ら選ばれる触媒の存在下に反応させることを特徴とする
   、一般式▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＲおよびＲ′は、たがいに異なつて、飽和また
   は不飽和の脂肪酸残基を意味する。 ただし、ＲおよびＲ′のいずれか一方がアイソトープ体
   の脂肪酸残基であるときは、他方も同種の脂肪酸残基で
   あつてもよい〕で示される混合酸型１・２−ジアシル−
   ３−グリセリルホスホリルコリン類の製法。 ２ 該モノアシル−３−グリセリルホスホリルコリンが
   １−モノアシル−３−グリセリルホスホリルコリンであ
   る特許請求の範囲第１項記載の製法。 ３ 該１−モノアシル基がアイソトープ体の脂肪酸残基
   である特許請求の範囲第２項記載の製法。 ４ 該モノアシル−３−グリセリルホスホリルコリンが
   ２−モノアシル−３−グリセリルホスホリルコリンであ
   る特許請求の範囲第１項記載の製法。 ５ 該アシル化剤のアシル基が高度不飽和脂肪酸の残基
   である特許請求の範囲第１項または第４項いずれかに記
   載の製法。 ６ 該高度不飽和脂肪酸がリノール酸、リノレン酸また
   はアラキドン酸である特許請求の範囲第５項記載の製法
   。 ７ 該アシル化剤のアシル基がアイソトープ体の脂肪酸
   残基である特許請求の範囲第１、５または６項いずれか
   に記載の製法。