JPS6354384A - 混合酸型重合性リン脂質誘導体及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、混合酸型重合性リン脂質誘導体、さらに詳し
くは光重合可能なジエン基を官能基として有するグリセ
ロホスホリルエタノールアミン型すン脂１ｊ、誘導体に
関する。

（従来技術） リン脂質は、生体膜脂質の主体であり、このうちグリセ
ロールに２分子の脂肪酸と１分子のリン酸がエステル結
合したものをホスホグリセリドといい、両親媒性物質の
１種である。

このリン脂質を水中に懸濁後、超音波処理等を用いて分
子組織化を行うことにより、内殻水相を有する脂質２分
子膜からなる閉鎖小胞であるリポソームを形成する。し
かし、このように調製されたリポソームはその構造を疎
水的な凝集力のみで維持しているため、構造が不安定で
あるという問題を有している。

この問題の解決手段として、リボ〈−ム調製原料である
リン脂質に光重合性官能基を導入し、分子組織化した後
、光照射により重合高分子化してその構造を安定化させ
る技術が注目されている。そこで本発明者らは、通常利
用されるジアシル−Ｌ−３−グリ・七ロホスホリルコリ
ン（以下レシチンと称す）型リン脂質の一方のアルキル
鎖のみにジエン基を導入したリン脂質誘導体（以下モノ
ジエンレシチンと称す）を見出し、該誘導体から調製し
たリポソームが安定で、かつ生体適合性にも優れている
ことを報告した。

ところで、このリポソームは生体膜モデルとしてのみな
らず、薬剤・酵素・遺伝子等を封入可能な運搬体（キャ
リアー）としても研究されているが、近年、リポソーム
表面に認識分子を結合して標的化（ターゲツティング）
する試みがなされている。特に癌細胞特有のモノクロナ
ール抗体を認識分子として結合した標的化では、標的部
位に適格に封入薬剤を送りこむいわゆる「ミサイル療法
」が可能となる。この際、モノクロナール抗体とリポソ
ームとの結合には、ジパルミトイルホスファチジルエタ
ノールアミン等のホスファチジルエタノールアミンのア
ミノ基が利用される。さらに、このアミノ基を利用して
極微二の生体物質用センサー等への応用も期待される。

しかしながら、光重合性リン脂質より得られる重合性リ
ポソームに対し、前述の如く表面修飾を施して高機能す
るために必要不可欠なエタノールアミン型の光重合性リ
ン脂質誘導体及びこの化合物を収率よく製造する方法は
知られていない。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は以上の観点からなされたもので、その目的は天
然リン脂質類似の構造及び組成を有し、さらにモノジエ
ンレシチン等と組合せることにより、重合性リポソーム
の高機能化が可能なエタノールアミン型の混合型重合性
リン脂質誘導体及びこの化合物を収率よく製造する方法
を提供するものである。

（問題点を解決するための手段） かかる目的の実現のために鋭意研究を行った結果、エタ
ノールアミン型リン脂質の一方のアルキル鎖に光重合性
官能基としてジエン基を導入したリン脂質誘導体が前述
の要望を満足する化合物であり、しかも、合成レシチン
や天然レシチンから容易に得ることができるモノアシル
−し−３−グリセロホスホリルコリンより完全り体とし
て製造できることを見出し、本発明を完成するに至った
。

以下、本発明の詳細な説明する。

即ち、本発明は下記一般式（Ｉ） Ｒ，ロ　ＣＨ２ １（Ｉ） Ｒ２０（：ＨＯ ＩＩ　　　　　　　　　　の Ｃ）１２０　　　Ｐ　　　ＯＣ１１２Ｇ）１２　　ＮＨ
３１゜ で表される混合酸型重合性リン脂質誘導体及びその製造
方法に関する。

一般式（Ｉ）で表わされる化合物の製造方法は ａ）　レシチンをホスホリパーゼＡ、又はＡ２を用いて
加水分解することにより得られるモノアシル−Ｌ−３−
グリセロホスホリルコリンに、ｂ）　　ＲＯ（：ＩＩ−
ＣＩＩＣＩＩ−ＣＩＣＯＯＨ（但し、ｎｏはｃ、ｃ、、
のアルキル基）で表される長鎖ジエンカルボン酸とＮ、
Ｎ’−カルボニルジイミダゾールとから得られる１−ア
シルイミダゾールを、Ｃ）イミダゾールナトリウム存在
下で反応させ、ｄ）次いで加水分解し、ｅ）さらに触媒
存在下、Ｎ−トリチルエタノールアミンを反応させる工
程からなる。

出発物質であるモノアシル−Ｌ−３−グリセロホスホリ
ルコリンには１−モノアシル体と２−モノアシル体があ
り、いずれも本発明に適用可能である。

このモノアシル−Ｌ−３−グリセロホスホリルコリンは
、通常、レシチンを適当な溶媒、例えばクロロホルムや
エチルエーテルなど、中でｐＨ約７の適当な緩衝液、例
えば０．２１１リス塩酸級街液（ｐ）Ｉ　７．４）など
、および賦活剤、例えば塩化カルシウム溶液、の存在下
、蛇毒、例えばナジャ・ナジャ　（Ｎａｊａ　Ｎａｊａ
）などの毒、から得られるホスホリパーゼＡ２またはそ
の類縁酵素を戸いて、常温にて、アシル転穆を起こさぬ
よう注意深く加水分解を行うことにより得られる。

また、２−モノアシル−Ｌ−３−グリセロホスホリルコ
リンは、各種バクテリア、例えば工・シェリチア・コリ
（Ｅ、Ｃｏ１１）　、　ミコバクテリウム・フレイ（Ｍ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｈｅｒｉ）　、バチルス
・スブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）、から得られる
ホスホリパーゼＡ、または類縁酵素を用いて、同様に、
レシチンを加水分解することにより得られる。

さらに、得られたモノアシル−Ｌ−３−グリセロホスホ
リルコリンに水素添加処理を行い、アルキル鎖中の不飽
和結合をなくした飽和型の完全水添モノアシル−Ｌ−３
−グリセロホスホリルコリンの形にしても本発明に供す
ることができる。

一般式（Ｉ）におけるＲ、又はＲ２の脂肪酸残基は、炭
素数が１０〜２２個で飽和又は不飽和であれば特に制限
はないが、より生体適合性を高めるためには、飽和の脂
肪酸残基が好ましい。木すン脂質誘導体の脂肪酸残基は
、レシチンの２本のアシル鎮のうち、ホスホリパーゼＡ
１又はＡ２によって加水分解を受けなかったアシル基に
相当する。

レシチンには天然レシチンと合成があるが、天然レシチ
ンとしては、例えば卵黄由来レシチン、大豆由来レシチ
ン等、合成レシチンとしては、例えばシミリストイルグ
リセロホスホリルコリン、ジパルミトイルグリセロホス
ホリルコリン、ジステアロイルグリセロホスホリルコリ
ン等をあげることができる。

本発明に用いる長鎖ジエンカルボン酸はＲｏ　ＣＩＩ　
＝　ＣＩｌ　ＣＨ−ＣＨＣ００Ｈ（ｎｏはＣ５〜Ｃ１７
のアルキル基） で表わされるα、β、γ、δ−不飽和カルボン酸である
。このようなジエンカルボン酸の例として、２，４−デ
カジエン酸、２．４−ウンデカジエン酸、２，４−ドデ
カジエン酸、２．４−トリデカジエン酸、２．４−テト
ラデカジエン酸、２．４−ペンタデカジエン酸、２，４
−へキサデカジエン酸、２．４−へブタデカジエン酸、
２．４−オクタデカジエン酸、２．４−ノナデカジエン
酸、２．４−エイコザジェン（２，２，４−ヘンエイコ
サジエン酸および２．４−４コサジエン酸等の全ての光
重合性を有する幾何異性体を挙げることができる。この
ような長鎖ジエンカルボン酸は、例えは特開昭６０−１
３７３７号公報等の方法によってマ）Ｉることができる
。

又、−数域（Ｉ）のＲ３又はＲ２のジエン基を有するア
シル基；　ｆｌｏｃｌＩ・ｃＨｃＨ−ＣＩＩＣＯ（Ｒｏ
は前記に同じ）は、長鎖ジエンカルボン酸のアシル基に
相当する。

１−アシルイミダゾールは、Ｎ、Ｎ’　−カルボニルジ
イミダゾールを無水クロロホルム中に懸回させ、これに
長鎖ジエンカルボン酸を加え、窒素気流中、遮光下で室
温にて約１時間反応させることによって得られる。この
化合物は単口した後、又は単艮１１することなく反応液
のまま、次の工程に供することができる。

以上のように得られた１−アシルイミダゾール反応液に
、触媒であるイミダゾールナトリウム−ジメチルスルホ
キシド溶液及び無水ピリジンと共に先に調製した千ノア
シルーＬ−１１’リセ口ホスホリルコリンを加える。反
応は０℃ないし３０℃の温度で、通導は室温で数時間攪
拌することにより終了する。アシル化剤は、干ノアシル
ーＬ−３−グリセロポスホリルコリンに対し、過剰ユ用
いることが好ましく、さらに好ましくは、１．２当二〜
１．５当量である。

この反応液を塩酸−メタノ−・ルで中和し、減圧濃縮す
る。ついでこの濃縮液をクロロポルム−メタノールに溶
解し、さらに水を入れた後、分液し、その下層をさらに
減圧濃縮する。得られた；員縮液にクロロホルム−メタ
ノール−水、続いてエタノールを加えて「アンバーライ
トＭＢ−３型」樹脂カラムに通し、同溶媒で洗い、その
通導液および洗液を合せて減圧濃縮する。この濃縮物を
常法に従って例えばシリカゲルカラムクロマトグラフ法
にて！Ａ埋精製する。続いて加水分解を行うが、加水分
解はホスホリパーゼＤを用いることが好ましい。即ち、
処理精製後の物質を再びクロロホルムに溶解後、ホスホ
リパーゼＤを含むｐｌ＋約７の緩衝液及び塩化カルシウ
ム水溶液を加える。この７８液を温室にて十数時間攪拌
後、塩酸を加えて反応を停止する。反応混合物より生成
物を！＃雛するには、まず反応溶液を遠心分間して上層
を除去し、残った下層に無水硫酸ナトリウムを加えて乾
燥し、減圧濃縮し、この濃縮液を五酸化リンを用いて温
室でφ２燥すればよい。

このようにして得られた反応物に、触媒存在下、Ｎ−１
リチルエタノールアミンを反応させることにより、目的
とするエタノールアミン型すン脂質銹専体を得ることが
できる。このＮ−トリチルエタノールアミンは、例えば
クロロホルム溶媒中、ハロゲン化トリチルエタノールア
ミン及びトリエチルアミンを反応させることによって調
製することができる。又、触媒としてン は、２，４．６−）−リイ！プロピルベンゼンスルボニ
ルクロリドが好ましい、Ｎ−トリチルエタノールアミン
は、加水分解後の生成物に対し、２〜４当量用いること
が好ましく、触媒は４〜６当量使用することが好ましい
。この時の溶媒としては、無水ピリジンが好ましく、そ
の使用量は、加水分解生成物、Ｎ−１−リチルエタノー
ルアミン及び触媒の合計重量に対し、約３倍以上用いれ
ばよい。反応は、攪拌しながら温室付近で行えばよく、
３０分〜３時間で終了する。

この反応混合物に水を加えた後、常法に従って沈殿物を
除去し、得られた０液を濃縮・絹製する。この生成物に
酢酸等の酸を６〜２０倍重量好ましくはｌＯ〜１５倍量
加え、６０〜１３０℃で１分〜１時間加熱後、常法に従
って精製すれば、本発明のリン脂質誘導体を得ることが
できる。

（実施例） 本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明
はこれらに限定されるものでない。

実施例１ １−バルミトイル−２−（２Ｅ、４Ｅ−オクタデカジェ
ノイル）−Ｌ−３−グリセロホスボリルエタノールアミ
ンの合成 （ａ）１−バルミトイル−Ｌ−３−グリセロホスホリル
コリンの調製 １．２−ジパルミトイル−Ｌ−３−グリセロホスホリル
コリン３ｇをクロロホルム８０ｍＭに溶解し、これに、
ナジャ・ナジャの毒から得られたホスホリパーゼＡ２３
０ｍｇを０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐｌ（７，４）　
６　ｒａｃｌに溶解した液および１Ｍ塩化カルシウム溶
液０．１ｍｌを加えて室温にて約２０時間攪拌した。

この反応液にエタノールを加えて減圧濃縮乾固し、乾固
物を少量のクロロホルムに溶かし、同溶媒で活性化した
シリカゲル（４０ｇ）カラムにかけ、クロロホルム６０
０　ｍｌ、クロロホルム−メタノール−水　（６５：２
５：４）　ｔ、ｓ又で順次溶出させた。得られた溶出分
画を薄層クロマトグラフィー（以下ＴＬＣと略す）を用
いて目的画分を集め、減圧濃縮後、五酸化リンで、約２
０時間減圧乾燥し、１−バルミトイル−Ｌ−３−グリセ
ロホスホリルコリン１．８ｇ（収率：　８７．Ｉｌｎ　
）を得た。

（ｂ）１−バルミトイル−２−（２Ｅ、４Ｅ−オフタデ
カシェノイル）−Ｌ−３−グリセロホスホリンコリンの
調製 ２Ｅ、４Ｅ−オクタデカジエン酸３，５ｇ（１２，５ミ
リモル）とＮ、Ｎ’−カルボニルジイミダゾール２．４
ｇ　（１５ミリモル）に乾燥クロロホルム５０ｍＭを入
れて窒素気流中、遮光下、室温にて約１時間反応させた
。ついで、この反応液に（ａ）の方法で得た１−バルミ
トイル−Ｌ−３−グリセロホスホリルコリン５．１ｇ（
１０ミリモル）を入れ、さらに水冷下で触媒として、水
素化ナトリウム５００　ｍｇ　（５０％）とイミダゾー
ル（以下ＩｍＨと略す）　Ｉｇとを乾燥ジメチルスルホ
キシド（以下ＤＭＳＯと略す）　２０ｍ９゜中、約１時
間反応させて調製したイミダゾールナトリウム（以下ｌ
ｍＮａと略す）−ＤＭＳＯ溶液２０ｍＭおよび無水ピリ
ジン１　ｍｌを加えた後、温室にて２時間攪拌した。

反応終了後、反応液をＩＮ塩酸−メタノールで中和し、
減圧？！Ａ縮する。得られた濃縮物をクロロホルム−メ
タノール（２：１）６００ｍｌに溶解し、ついで水１２
０　ｒｎｌを入れて分液ロートにて分液し、下層を分取
して減圧濃縮する。

得られた残渣にクロロホルム−メタノール−水（６５：
２５：４）　２００　ｍｌ、エタノールｔｏｏ　ｍｌを
加えて溶解し、次いで「アンバーライトＭＢ−３型」８
０Ｉ１１９．を加えて約２時間攪拌した後、樹脂をｒ別
し、前記溶媒系で洗浄し、得られたｒ液と洗液を合せて
減圧濃縮した。

この濃縮液を適量の９５％エタノールに溶解し、あらか
じめ９５％エタノールで活性化したアルミナ（４０ｇ）
カラムにかけ、同溶媒２４０　ｍｌで溶出し、この溶出
液を減圧濃縮した。

この濃縮物をり愈のクロロホルムに溶解し、あらかじめ
同溶媒で活性化したシリカゲル（ｔｓｏｇ）カラムにか
け、クロロホルム１１、クロロホルム−メタノール−水
（６５：２５：２）４．０℃で順次溶出させた。得られ
た溶出画分からＴＬＣによって目的画分を集め、減圧濃
縮乾燥して、１−バルミトイル−２−（２Ｅ。

４Ｅ−オフタデカシェノイル）−Ｌ−３−グリセロホス
ホリルコリン　４．７ｇ　　（収率：　６０．６％）を
得た。

本物質はＴＬＣ分析（シリカゲルプレート。

展開溶媒：クロロホルム−メタノール−水（６５：２５
：４）　）を行ったところ、紫外線およびリンモリブデ
ン酸による検出で、単一のスポットを与え、そのＲｆ値
はジパルミトイル−し−α−グリセロホスホリルコリン
（シグマ）とほぼ一致した。なお、旋光度は次のようで
あった。

〔α）２ｏ　−＋　６．４９　　　　　（ＣＨＣｕ３．
　　（：ｉ）又、本物質の元素分析値、核磁気共０．％
（ＮＭＲ）スペクトル、赤外線（ＩＲ）吸収スペクトル
及び紫外線（ＵＶ）吸収スペクトルの測定結果を示した
。元素分析値（Ｃ４２Ｈ６００８ＮＰ・）１２０分子量
７７８．１として） 計算値（％Ｆ）：ｃ　；　６５．００．Ｈ；　１０．８
５．Ｎ　；　１．８０５実測値（１）：Ｃ；　６４．８
　、Ｈ：　１０．７　、Ｎ　；　２．２”　Ｃ−ｙＭｌ
ｌ　スヘクトルδイ偵（ＣＤＣＵ：＋、　ｐｐｍ）ＣＩ
３ＣＩＩｚＣｔ１２　（Ｃ１１２）　Ｉ　ｏｃｌｌｚｃ
Ｈ２ｃＯ２ｃＨｚＣ１１３Ｃ１１２Ｃ１１ｘ（Ｃｌ１２
）ａｃＩ１２ＣＨ２ＣＨ−ＣＨＣＨ−［：１（ＣＯ２Ｃ
ｌ　　　０１°　２゛３°　４°　　５’　　６’　７
’　　８’　９’　　１０°　１１°１　　　ｌ　　　
　　■ＣＨ２ＯＰ　０Ｃｉ（ｚｃ１１２Ｎ　（ＣＨ３）
　３゜。

’ｌｌ−ＮＭｎスペクトルδ値（ＣＤＣＮ３．　６（ｐ
ｐｍ）　、ＴＩＩ＋ｓ）ＣＩ＋３　（Ｃ１１２）　１２
Ｃ１１２Ｃ１１２に０２Ｃ１＋。

ＣＩ＋３　（ＣＩ＋２）　ｌ。ＣｔｂＣＨ２Ｃ１１＝　
ＣＩＣＩ（−（ＪＩＣ０２ＣＨ０１°　２′　　３′４
°５゛６°７°　８°　１　　ｌ　　　　■ＣＩ（２０
Ｐ　０Ｃ１ｂＧＨｚ　Ｎ　（Ｃ）＋３）３゜。

ＦＴ−１ｆｌスペクトル（ｅｌＴ＋−’）（ＫＢｒディ
スク） １７１６　（νＣヨ。） １６４５．１６２４　（ν（ｇｃ） １２４６（シＰヨ０） １１４４（シｐ−ｏ−ｃ） １０９０（υ、。　） １０５７　（δｐ−ｏ−ｃ） ９９７（δｃ−１１） ＵＶスペクトル（エタノール中）： λｆｆ１ａＸ　−２６２，５（ｎｍ） ｅ　＝２４７００　（ｆｆｉ・ｍｏｌ−’　・ｃｍ−’
）（Ｃ）１−バルミトイル−２−（２Ｅ、４Ｅ−オクタ
デカジェノイル）−Ｌ−３−グリセロホスファチジン酸
の調製 （ｂ）で得た１−バルミトイル−２−（２Ｅ。

４Ｅ−オクタデカジェノイル）−Ｌ−３−グリセロホス
ホリルコリン０．５ｇをクロロホルム５０Ｊに溶解し、
ストレブトマイセスクロモフセイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ　ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｕｉｓ）から得られたホ
スホリパーゼＤ　（５４，Ｏｔｌｎｉｔｓ／Ｌｎｇ）１
．５ｍｇを０．２Ｍトリス塩酸Ｍ街液（ｐ＋＋　７．４
）１．５ｒｎｌに溶解した液及び１Ｍ塩化カルシウム水
溶液０．１　ｒｎｌを加えて室温にて約１６時間攪拌し
た。

この反応液にＩＮ塩酸（約０．５　ｎｕりを加えて反応
を停止し、遠心分離（２５０Ｏｒｐｍ、　１０分間）に
かけ、上層を除去した。得られた下層に少量の無水硫酸
ナトリウムを加えて乾燥し、減圧濃縮後、五酸化リンを
用いて室温で約２０時間減圧乾燥し、１−バルミトイル
−２−（２Ｅ、４Ｅ−オクタデカジェノイル）−Ｌ−３
−グリセロホスファチジン酸０．４２ｇ（収率９５％）
を得た。

本物質はＴＬＣ分析（シリカゲルプレート。

展開溶媒：クロロホルム−メタノール−水（６５：２５
：４）を行ったところ、紫外線、ヨウ素及びリンモリブ
デン酸による検出で単一のスポットを与え、そのＲｆ値
はジパルミトイル−し−α−ホスファチジン酸（シグマ
）とばぼ一致した。

なお、施光度は、次のようであった。

〔α）ｏ＝＋７．６１ （１−１，０，ｏｃｍ、Ｃ−１，０２４ｇ／ｄ又ｉｎ　
ＣＨＣ９，ｓ）又、本物質の元素分析値、核磁気共鳴 （ＮＭＲ）スペクトル、赤外線（ＩＲ）吸収スペクトル
及び紫外線（ＵＶ）吸収スペクトルを測定した結果を示
した。

元素分析値 （Ｃ３Ｊａ＊０ａＰ−Ｈ２Ｏ分子量６９０．９として）
計算値鴎）＋　Ｃ；６４．３２　Ｈ；１０．０６　Ｎ；
　０．００実測値（￥）：　ｃ；　６４．３６１１．１
０．０５　Ｎ、　＜０．３Ｉ３Ｃ−ＮＭＲスペクトルδ
値（ＣＤ１４３．　ｐ９ｎｌ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃｌｈ　（
Ｃ）１２）　ｒ。ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２に）＋２Ｃ１１３
Ｃ１１２Ｃ１＋２　（ＣＨ２）　ａ（：Ｈ２ＣｆｈＣＨ
−ＣＨＣ）ｌ　＝　ＣＨＣ０２ＣＨＯ１’　２’　　３
’　４’　　５’　６°７°　８°９°　　１０°１１
冒　　１Ｃｔｌｚ　　ＯＰｏ１ｌ ＋ｎ　　　　　Ｉ ’ＩＩ−Ｎスペクトル　δ値（ＣＤＣ又、、δ（ｐｐｍ
）　、ＴＭＳ）ＣＨ３（Ｃｔｈ）ｒ□ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ
２ＣＨ２ＣＩ＋３（ＣＨ２）ＩＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ−Ｃ
）Ｉ　　ＣＨ−ＣＨＣＯ２Ｃ）Ｉ　　　Ｏ１’２’３°
　４°　５°　　６°　７°　　８゛　　　１　１ＣＩ
（２０ＰＯＩ（ ＦＴ−Ｉｌｌスペクトル（ｃｍ−’） （Ｎａ０文ディスク） ２Ｂ５２，２９２０．２９５４　（υＣ−□）１７２０
．１７３８　（νｃｏｏ） １６４３　（シＣヨＣ） １４５６．１４６６　（δＣ−Ｈ） １２６８　（νｐ＝ｏ） １０６４　（シＰ−０　　） ｕｖスペクトル（クロロホルム中）： え、、Ｘ−２６２，５（ｎｍ） ε＝２４８００　（Ｌｍｏｌ−’　−ｃｍ−’）（ｄ）
１−バルミトイル−２−（２Ｅ、４Ｅ−オフタデカシェ
ノイル）−Ｌ−３−グリセロホスホリルエタノールアミ
ンの合成 （ｄ）−仁Ｎ−）−リチルエタノールアミンの合成エタ
ノールアミン１．２２ｇ（２ミリモル）とトリエチルア
ミン４．４ｇ　（４ミリモル）をクロロホルム３．０　
ｍｌに溶解し、冷却しながら、このｍ　？＆へトリチル
クロリド５．５６ｇ（２ミリモル）をクロロホルム３０
ｍＮに溶かした液を徐々に滴下する。滴下終了後、室温
で１時間攪拌し、生じた沈殿物をｒ別し、得られたｒ液
を水で数回、洗浄後、クロロホルム層を減圧濃縮した。

この濃縮物を少量のクロロホルムに溶解し、塩基性のア
ルミナ（１５０ｇ）カラムにかけ、クロロホルムで溶出
し、薄層クロマトグラフィー（以下ＴＬＣと略す）検出
後、目的分画を集め、減圧（、グ１縮し、濃縮物をヘン
ゼ’ニー）−ｒｉ−ヘキサンにて再結晶し、五酸化リン
上、室温で、−夜減圧乾燥し、Ｎ−トリチルエタノール
アミン３．３６ｇ（収率５５．４％）を得た。

（ｄ）−０，１−バルミトイル−２−（２Ｅ、４Ｅ−オ
タデジニノイル”）−Ｌ−３−グリセロホスホルエタノ
ールアミンの合成 （ｄ）−仁で得たＮ−１−リチルエタノールアミン１．
７１ｇ（５，５６ミリモル）と２．４．６−ドリイソブ
ロビルベンゼンスルホニルクロリド２．５６ｇ（８，３
４ミリモル）に無水ピリジン２５１Ｔ１９．を人わて溶
解し、室温で約３０分間攪拌した。

次に（Ｃ）で調製した１−バルミトイル−２−（２Ｅ、
４Ｅ−オクタデカジェノイル）−Ｌ−３−グリセロホス
ファチジン酸１．９３ｇ（２，７８ミリモル）を加えて
約２時間反応後、水１５ｎ＋、Ｑを入れて、さらに１時
間攪拌し、適二のエタノールを入れて、減圧濃縮する。

この（ζＮ宿物にエチルエーテ１１３００ｍ９゜を加え
て、冷蔵保存後、生じる沈殿物をｒ別し、得られたシ原
液を減圧７く４縮した。

濃縮物を少量のクロロポルムに溶解し、同溶媒で活性化
したシリカゲル（１００ｇ）カラムにかけ、クロロホル
ム７００　ｒＩ１２．クロロポルム−メタノール（９５
：５）　１０００＋ｎ交で順次溶出し、ＴＬＣで検索後
、目的画分を集め、減圧ン４！宿し、Ｎ−１−リチル−
１−バルミ１−イル−２−（２Ｅ、４Ｅ−オクタデカジ
ェノイル）−Ｌ−３−グリセロホスホリルエタノールア
ミン２．１８３を得た。

次いでこのＮ−１−ジチル−１−バルミトイル−２−（
２Ｅ、４Ｅ−オクタデカジェノイル）−Ｌ−３−グリセ
ロホスボリルエタノールアミンに９０％酢酸溶液２０ｍ
Ｎを入わて、１３０℃の油浴中で約４分間攪拌し、直ち
に冷却後、クロロホルム−メタノール（２：　１　）　
８０ｍ１及びエタノール６０ｍ＋４を加えて、酢酸が消
えるまで減圧濃縮乾固ｌノだ。

この乾固物を少量のクロロホルムに溶解し、同溶媒で活
性化したシリカゲル（７５ｇ）カラムにかけ、クロロホ
ルム５００　ｒｎＬクロロポルム−メタノール−水（７
５：２５：２）　６００ｍ、２で順次溶出し、Ｔ１、Ｃ
で検索後、目的画分を集め、減圧）農縮後、濃縮物をク
ロロホルム−アセトンにて再結晶し、五酸化リン上、室
温約３時間減圧乾固し、１−パルミントイル−２−（２
Ｅ、４Ｅ−オクタデカジェノイル）−Ｌ−３−グリセロ
ホスホリルエタノールアミ：／　１．０７ｇ（５２，２
％）を得た。

本物質は、ＴＬＣ分析（シリカケルプレート、展開溶媒
・クロロホルム−メタノール−水（６５：２５＋４）及
びクロロホルム−メタノール−４アンモニア水（６０：
２０：４）　）を行ったところ、紫外線、ニンヒドリン
試蘂、及びＤｉｔｔｍｅｎ試薬による検出て、単一スポ
ットを与え、そのＲｆ値はジパルミトイル−し−α−グ
リセロホスホリルエタンールアミン（シグマ）とほぼ一
致した。なお、施光度は次のようであった。

〔α〕２シ＝　＋　２．３３ （Ｑ−１０，０ｃｍ、Ｃ−１，０３０ｇ／ｄｕ　ｉｎ　
（：ＨＣｕｚ）又、本物質の元素分析値、核磁気共鳴 （Ｎ！、ｔＲ）スペクトル、赤外線（ＩＲ）吸収スペク
トル及び紫外線（ＵＶ）吸収スペクトルの測定結果を示
した。

元素分析値 （Ｃ３９■７４０ａＮｌ”Ｈ２０分子ｆｚ７３４．０と
して）計算値（ｔ）：　ｃ：　６３．８２　Ｎ：　１０
．１６　Ｎ、　１．９１実測値（’Ｊ）：　ｃ；　６４
．０４　ＩＩ：　１０．１９　Ｎ：　１．９４１３Ｃ−
ＮＭＩ（スペクトル　δ値（ＣＤＩ４ｉ　、　Ｉ’ｌ”
’）ＣＩｌ３（：１（２（：Ｈ２（（：ｌ＋２）　ｌ。

Ｃｌｌ２ＣＨｘＣＯ２ＣＨ２Ｃ１１ｚＣ１１２ＣＩＩ２
（（：Ｈｚ）ａｃＨｚｃ）Ｉ２ＣＩｌ　−ＣＨＣ）ｌ　
−ＣＩ　ＣＨ２ＣＨ０１°２’３’　　４’　　　Ｓ°
６″７°　８°９′１０°ｌｌ’ｌ　　　　Ｉ　　　　
　　ｅＣＨ２０ＰＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ　　ｔｌ＋１０　　
　ｌ　　１１１２ ゜。

’　ｌｌ−ＮＭｎスペクトル　　δ値（ＣＤＣ父３．δ
（ｐｐｍ）　、ＴＭＳ）ＣＨ３（ＣＩｌ２）　１２ｃ１
１２ｃ１１２ＧＯ□Ｃ１（２（：ｌｌ、　（Ｃ１１□）
１゜ＣＩｌ□Ｃｌｌ２Ｃ１ｌ　−ＣＩｌ　Ｃ１１−ＣＩ
ｌ　（：０２　Ｃ）Ｉ　　　Ｏｌｏ　２″３°４°５°
　６°７°　８°　　ＩＩ　　　　　　ｅ０１＋２０　
　ＰＯＣＨ２Ｃｌ１２Ｎ　　ｔｈＦＴ−ＩＲスペクトル
（ｃｍ−１） （ＮａＣ又ディスク） 約３０００　（νＮＨ３） ２８５０．２９２０．２９５６　（シＣ−Ｈ）１７２０
　、１７３７　（ｖｃ−ｏ） １８４３　（ν。−ｃ） １５４７　（δＮＨ３） １４６７　（δ、−Ｈ） １２３６　（νＰ、。） １０８０　（シル−ｏ　　　） Ｕｖスペクトル（クロロホルム中）： λ□、　＝　２６２．５　（ｎｍ） ｅ：　＝　２４８００　（’ｉ−ｍｏｌ−’−ｃｍ−’
）実施例２ 卵黄由来の１−アシル−２−（２Ｅ、４Ｅ−オクタデカ
ジェノイル）−Ｌ−３−グリセロホスホリルエタノール
アミンの合成 実施例１−（ｄ）−４と同様な方法で得た、Ｎ−トリチ
ルエタノールアミン１．７０ｇ（５，５２ミリモル）と
、２，４．６−ドリイソブロビルベンゼンスルホニルク
ロリド　２．５４ｇ（８，２７ミリモル）と、卵黄由来
のリン脂質から実施例１−（ａ）〜（ｃ）　と同様な方
法にて調製した卵黄由来の１−アシル−２−（２Ｅ、４
Ｅ−オクタデカジェノイル）−Ｌ−３−グリセロホスフ
ァチジン酸１．９２ｇ　（２，フロミリモル）とを加え
、実施例１−（ｄ）−０と同様の方法にて、反応および
精製を行い、目的とする卵黄由来の１−、アシル−２−
（２Ｅ、４Ｅ−オクタデカジェノイル）−Ｌ−３−グリ
セロホスホリルエタノールアミン１．０８ｇ　　（収率
５２．０％）を得た。

本物質のＴＬＣ分析を実施例１と同様にして行ったとこ
ろ、単一スポットを示し、その１１ｆは卵黄由来グリセ
ロホスホリルエタノールアミンのそれと一致した。又、
施光度は、次のようであった。

〔α）２：　　＝　＋　３．４４ （？１０．Ｏｃ＋＋＋、Ｃ−０．９８８ｇ／ｄＵ　ｉｎ
　ＣＨＣｕ＊）さらに、実施例１と同様の次のような分
析方法の結果から純物質であることを確認した。

”Ｃ−ＮＭＲスペクトル　δ値（（：Ｄｌ、ｂ　、　Ｉ
’ｍ）１４．２，２２．８，２５．０，２９．５．３２
．０，３３．２．３４．２６２．３．６４．２．７０．
６．　１１８．５　、１２８．３　、１４５．７゜１４
６．４　、１６６．６　、１７３．５Ｊ−ＮＭＩＩスペ
クトル　δ値（ＣＤＣｆｌａ、ｌ）１１ｍ、ＴＭＳ）０
．８Ｂ、　１．２６．１．４１．１．５６．２．１４．
２．２７．４．Ｑ（１４，１０，４，２３，４゜３５．
　５．２８．　５．７Ｂ、　　６．１４．　７．２２８
．５０゜ ＦＴ−ＩＲスペクトル（ｃｍ−’） （ＮａＣｌディスク） Φ 約３０００（ｖ　Ｎ８３） ２８５０．２９２０．２９５５　（シＣ−Ｈ）１７１８
．１７３９　（νｃ＝ｏ） １６４３　（ｖｃ−ｃ） １５４０．１５５８　（δ８゜） １４６７（δＣ−Ｈ） １２３６　（ν、。） １０８０（ｖｐ−ｏ　　） Ｕｖスペクトル（クロロホルム中）： λｍａｔ　”　２６２．３　（ｎｍ） ε＝　２４０００　（１・ｍｏｌ−’・ｃｍ−’）実施
例３ 大豆由来（水添）の１−アシル−２−（２Ｅ、４Ｅ−オ
クタデカジェノイル−し−３−グリセロホスボリルエタ
ノールアミンの合成実施例１−（ｃｌ）−仁と同様な方
法で得たＮ−トリチルエタノールアミン１．８５ｇ（６
，Ｑｌミリモル）と２．４．６−１−リイソプロピルベ
ンゼンスルホニルクロリド２．７８ｇ（９，０８ミリモ
ル）と、実施例１−（ａ）〜（Ｃ）　と同様な方法にて
調製した水素添加した大豆由来の１−アシル−２−（２
Ｅ、４Ｅ−オクタデカジェノイル）−Ｌ−３−グリセロ
ホスファチジン酸２．１７ｇ（３，０２ミリモル）とを
加え、実施例１−（ｄ）−口、と同様の方法にて、反応
および精製を行い、目的とする大豆由来の１−アシル−
２−（２Ｅ、４Ｅ−オクタデカジェノイル）−Ｌ−３−
グリセロホスホリルエタノールアミン１．０７ｇ（収率
４６．５％）を得た。

本物質のＴＬＣ分析を実施例１および２と同様にして行
ったところ、単一スポットを示し、そのＲｆ値は水添大
豆グリセロホスホリルエタノールアミンのそれと一致し
た。又、施光度は次のよってあった。

（α）２二＝　＋　４．７７ （？ｌＯ，Ｏｃｍ、Ｃ−１．００６ｇ／ｄ、Ｑ　ｉｎ　
ＣｌＩＣ１３）さらに、次に示すような、実施例１．２
と同様の分析結果から、本物質が純物質であることを確
認した。

１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル　δ値（ＣＤＣＲ３、ＰＩＩ
ＩＩＩ）１４．２．２２．８．２５．０．２９．５．３
２．０．３３．２．３４．２６２．３．６４．１．７０
．４．１１８．４　、１２８．３　、１４５．８゜１４
６．４　、１８８．５　、１７３．６’ＩＩ−ＮＭＲス
ペクトル　δ値（ＣＤＣＮｓ、ｌ１１１ｍ、ＴＭＳ）０
．８８．１．２６．１．４１．１．５７．２．１５．２
．２８．３．９９４、Ｑ８．４．２３．４．３５．５．
２７．５．７８．６．１５．７．２２８．５０ ＦＴ−Ｉｔ（スペクトル（ｃｍ−’） （Ｎａ唾ディスク） ■ 約３０００（ｖ　Ｎ　Ｒ３） ２８５０．２９１８．２９５６　（シ、−Ｈ）１７３７
．１７１２　（１）　ｃ−ｏ）ｔｓ４ｓ　（ν。、） ■ １５７９　（δ　Ｎ＋１３） １４６６　（δｃ−１１） １２１６（ｕｐ−ｏ　　） １０９０　（１）　ｐ−ｏ　ｅ） Ｕｖスペクトル（クロロホルム中）： λ□、　＝　２６２．２　（ｎｍ） ｅ　＝　２２０００（Ｌｌ−ｍｏｌ−”ａｍ−’）実施
例４ 実施例１．２及び３で得られたリン脂質銹導体のそれぞ
れについて、モル比で１０％となるように、合成レシチ
ン又は天然レシチンから合成した、１−アシル−２−（
２Ｅ、４Ｅ−オクタデカジェノイル）−Ｌ−３−グリセ
ロホスホリルコリン（以下本化合物をモノジエンレシチ
ンと称す）を混合し、全脂質濃度が、ＩＱｍＭとなるよ
うに、常法に従って、多重層リボ９−ム水溶液を調製し
た。さらに、この溶液から超音波法により、小さな１枚
膜リポソームを調製した。以下、これを正荷電のモノメ
リックリポソームと呼ぶ。

又、このリポソーム溶液に高圧水銀ランプ（理工科学産
業■製）を用いて窒素：囲気下、紫外線照射を行い、紫
外部の特性吸収スペクトルの経時変化を測定したところ
、λＬａ、Ｘが２８２　（ｎｍ）付近の吸収ピークが減
少してい鮒、約１時間後には完全に消失し、逆に１９３
ｎｍ付近の吸収が増加した。このことから、重合が完了
したことを確認した（以下、これを正荷電のポリメリッ
クリポソームと呼ぶ）。

酢酸ウラニルを用いたネガティブ染色法による透過型電
顕観察では、モノメリックボソームとポリメリックリポ
ソームにおける形態的変化は、はとんどないこ・とが認
められた。この事はゲルｒ過パターンの比較によっても
確認された。

さらに、室温状態における濁度変化も、モノメリックに
比べ、ポリメリックリポソームの方がはるかに小さく保
存安定性が優れていることがわかった。

実施例５ 実施例２で得た卵黄由来のモノジエンホスホリルエタノ
ールアミンとモノジエンレシチンとの混合物（モル比１
：５）から成るモノメリックリポソームおよびポリメリ
ックリポソームと、該モノジエンホスホリルエタノール
アミンと１．２−　（２Ｅ、４Ｅ−オクタデカジェノイ
ル）−Ｌ−３−グリロホスホリルコリン（以下、ジジエ
ンレシチンと称す）との混合物（モル比に５）から成る
同様のリポソームに関して、示差走差熱量計（理研科学
■製）による測定を行った。その結果、ジジエンレシチ
ンとの組み合せより成るリポソームにおいては、モノメ
リックリポソームいおいて観察された熱量吸収ピーク（
２２℃付近）が、ポリメリックリポソームになるとほぼ
完全に消失した。これに対し、モノジエンレシチンとの
組み合せより成るリポソームにす おいては、ポリメリックリポソームにおいても、モノメ
リックリポソームに存在した熱量吸収ピーク（２９℃付
近）が完全に消失せず、残存することが確認された。

実施例６ 実施例１．２及び３から得られたリン脂質誘導体より調
製したリポソームに関して、グルコースと５（６）−カ
ルボキシフルオレッセインな封入マーカーとして用い、
マーカー保持能力、放出挙動等を検討した。その結果、
それぞれの脂質について、モノメリックリポソームに比
べ、ポリメリックリポソームの方が放出速度が小さく、
保持能力が向上した。

又、熱、有機溶媒（例えばエタノール）および、界面活
性剤（例えば和光純薬工業■社製、商品名’Ｔｒｉｔｏ
ｎ　Ｘ−１００Ｊ、ドデシル硫酸ナトリウム）に対する
安定性が向上した。

さらに、ジジエンレシチンとの組み合せより成るリポソ
ームにおいて、はとんど観察されなかった室温における
そツメリックリポソームのマーカー保持能力がモノジエ
ンレシチンとの組合せより成るモノメリックリポソーム
において認められた。

実施例７ 実施例１．２及び３で得られたリン脂質既導体のそれぞ
れをモル比が５〜２０％となるように、モノジエンレシ
チンと混合し、全脂質濃度が１０ｍＭで常法に従って、
多重層リポソーム水溶液を調製した。さらに、この溶液
から超音波照射法により、小さな一枚膜リポソームを調
製した。このリポソームの表面荷電を電導度滴定で測定
したところ、上記エタノールアミン型リン脂質誘導体の
モノジエンレシチンに対するモル比が増加する程、リポ
ソームの表面筒ＴＬｆｆｉが直線的に増加することがわ
かった。

（発明の効果） 本発明によれは、天然レシチン又は合成レシチンから調
製容易なりゾレシヂンと長鎖ジエンカルボン酸からモノ
ジエンレシチンを合成１ノ、ついで加水分解後、触媒存
在下でＮ−トリチルエタノールアミンを反応させること
により、目的どする混合酸型重合性リン脂質誘導体を高
純度、高収率で完全り体として製造することができる。

本発明の方法によフて製造されるリン脂質誘導体には、
一方のアルキル鎖のみにＲ０ＣＨ−ＣＩＩ　ＣＩＩ−Ｃ
ＩＩＣＯ（Ｒｏは前記と同じ）で示されるアシル基が導
入されているため、従来の合成リン脂質誘導体と比べて
リポソーム化した際に種々の特長をイ丁１”る。即ち、 ｌ）モノメリックリポソーム調製後、紫外線照射により
温和な条件で速やかに重合し、重合前後において形態的
変化は殆んどない。

２）干ツメリックリポソームにおいても、室温で封入物
質の保持能力を有する。

３）重合により、封入物質の保持能力や熱・有機溶媒・
界面活性剤−・ヤに対する安定性が向上し、又潤度変化
も小さくなる。

４）ポリメリックリポソームとノ♂っでも熱全吸収ピー
クは完全に消失しないため、柔軟な膜の形成が可能とな
る。

５）壬ノジエンｌノシヂンとの組み合せより成るモノメ
リックリポソームにおいて、本発明のリン脂質誘導体の
含有率の増加に伴ってモノメリックリポソーム表面の電
荷が増加する。

従って生体適合性や、生体膜との種々の親和性を配慮し
なければならない医用リポソーム等の応用分野には適し
た光重合性リン脂質誘導体であり、その他、バイオセン
ザー、マイクロカプセル、さらには生医学用材料、化粧
品への応用等、二分子１摸ヘシクルの形態に限らず、単
分子層膜、積層（累積）膜の形態での利用を含めた生化
学、医学、薬学、工学など幅広い分野において利用が予
想さね、その工業的価値は大きい。

手続補正書 昭和Δ／年１０月ノケ日 特許庁長官　黒用１：Ｊ」ノＵＫ　　殿１、事件の表示
　　　　　　　　　　　　　　　式塁：昭和Ａ／年特訂
願第１背〃７２号 ３、補正をする者 ・Ｉトイ１１：の関係　　出　願　人 −セーーー汁ゼ卜← 氏　　名（名称）　　Σｆ汀曹達］二業１１コゴ（会７
上住　所　　東Ｉλ都丁−代ｆｉ１区丸の内２丁目６番
２号丸の内へ重洲ビル３３０５、補正命令のＦ１付　　
色各ト。

８、補正の内容　　　別紙のとおり 補　　　　正　　　　書 本願明細書、中下記事項を補正いたします。

記 １、第５頁６行目に 「ナール抗体」とあるな 「ナール抗体」と訂正づろ・ ２、第５頁９行目に 「七ツクＤナール坑体」とあるを 「′ｆニックＤナール抗体」と訂正する。

３、第１０頁１０行目Ｋ 「長鎖じエンカルボン酸」とあるを ［長鎖ジエンカルポジ酸」と訂正する。

４、第１１頁７行目に 「−数域」とあるを 「一般式」と訂正する。

５、第１３頁７行目に 「温室」とあるを 「室温」と訂正する。

６、第１４戸５〜６行目に 「温室」とあるを 「室温」と訂正する。

７、第１６頁３行目に 「スホリシコリン」とあるな 「スホリルコリン」と訂正する。

８、第２３頁２行目に 「旋光度」とあるを 「旋光度」と訂正する。

９、第２７頁６〜７行目に ｒ（２Ｌ４Ｅ−オタデジエノイル）−Ｌ−３−クリ七Ｏ
ホス」とあるな ｒ（２に、４Ｅ−オフタデカシェノイル）−Ｌ−３−Ｊ
ｊリセ０ホスホ」と訂正する。

１０、第２９頁下から３行目に ｒ　Ｄｉｔｔｍｅｎ　Ｊ　ト；ｈ　ル４’［Ｄｉｔｔｒ
ｎｅｒ　Ｊ　、！：　訂正する。

１１、第３０頁２行目、第３４頁下から５行目、第３７
頁５〜６行目に 「旋光度」とあるをそれぞれ 「旋光度」と訂正する。

１２、第３９頁下から４行目に 「ｔノメリックポ」とあるを 「七ツメリックリポ」と訂正する。

１３、第４０頁下から５行目に 「示差走査熱量計」とあるを 「示差走査熱量計」と訂正する。

手続補正書 昭和乙／午／／　月φ　日 昭和ｂ）年特許順第ｔ’／’３４１７２号事件との関係
　　出　願　人 住　所　　東京都千代［１］区丸の内２丁目６番２号丸
の内へ重洲ビル３３０氏名　（３６６７）谷山暉雄１”
　−’　−’　１１２−ユ」 ８、補正の内容　　別紙のとおり 補　　　　正　　　　書

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１とＲ＿２とは互いに異なり、その一方は
   飽和又は不飽和のＣ＿１＿０〜Ｃ＿２＿２の脂肪酸残基
   を示し、他方はＲ＿０ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＯ（但し
   、Ｒ＿０はＣ＿５〜Ｃ＿１＿７のアルキル基）のアシル
   基を示す。） で表される混合酸型重合性リン脂質誘導体。
2. （２）該脂肪酸残基が卵黄リン脂質又は大豆リン脂質由
   来のアルシ基である特許請求の範囲第（１）項記載の混
   合酸型重合性リン脂質誘導体。
3. （３）ａ）レシチンをホスホリパーゼＡ＿１又はＡ＿２
   を用いて加水分解することにより得られるモノ アシル−Ｌ−３−グリセロホスホリルコリ ンに、 ｂ）Ｒ＿０ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨ（但し、Ｒ＿
   ０はＣ＿５〜Ｃ＿１＿７のアルキル基）で表される長鎖
   ジエンカル ボン酸とＮ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾールとから得
   られる１−アシルイミダゾール を、ｃ）イミダゾールナトリウム存在下で反応させ、ｄ
   ）次いで加水分解し、ｅ）さらに触媒存在下、Ｎ−トリ
   チルエタノールアミン を反応させる工程 からなることを特徴とする一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中Ｒ＿１とＲ＿２とは互いに異なり、その一方は飽和
   又は不飽和のＣ＿１＿０〜Ｃ＿２＿２の脂肪酸残基を示
   し、他方はＲ＿０ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＯ（Ｒ＿０は
   前記に同じ）のアシル基を示す。）で表される混合酸型
   重合性リン脂質誘導体の製造方法。
4. （４）該脂肪酸残基が、卵黄リン脂質又は大豆リン脂質
   由来のアシル基である特許請求の範囲第（３）項記載の
   製造方法。