CN1255533C - 角质酶变体 - Google Patents

Abstract

真菌角质酶的变体，其具有更好的热稳定性。所述变体在角质酶的氨基酸序列N末端邻近区或三维结构中包含一或多个氨基酸参加的取代。

Description

角质酶变体

发明领域

本发明涉及一种角质酶变体，更明确的说，本发明涉及一种提高了热稳定性的角质酶变体。本发明也涉及编码此变体的DNA序列，含有此DNA序列的载体，转化后的含有此DNA序列或载体的宿主细胞，以及生产这种变体的方法，和这种变体的用途。

发明背景

角质酶是一种分解脂肪的酶，它可以水解角质。已知多种真菌中均含有角质酶(参见P.E.Kolattukudy的“脂肪酶”一文，Ed.B.Borgstrm和H.L.Brockman，Elsevier，1984年，第471-504页)。有文献描述豌豆茄病镰孢中角质酶的氨基酸序列和晶体结构(S.Longhi等，分子生物学杂志，268(4)，779-799(1997))。Humicola insolens中角质酶的氨基酸序列也已被公开(美国专利5,827,719)。

豌豆茄病镰孢中角质酶的一些变体也已被公开：WO 94/14963；WO94/14964；《应用环境微生物学》64，2794-2799，1998；蛋白质：结构，功能和遗传学26，442-458，1996；计算机化学杂志17，1783-1803，1996；蛋白质工程6，157-165，1993；蛋白质：结构，功能和遗传学33，253-264，1998；生物技术杂志66，11-26，1998；生物化学35，398-410，1996。

真菌角质酶可以用来酶性水解聚(对苯二甲酸亚乙酯)的环状低聚物，例如用在以聚(对苯二甲酸亚乙酯)纤维涂饰纱线或织物的方法中(WO97/27237)。然而，亟需增进已知真菌角质酶的热稳定性而获得更高的操作温度。

发明概述

本发明的发明者已发现真菌角质酶的某些变体具有更好的热稳定性。

即，本发明提供了一种亲代真菌角质酶的变体，其是亲代真菌角质酶在以下位置的一个或多个氨基酸残基被取代后的产物。

a)从N末端氨基酸起17以内(按晶体结构中的氨基酸残基计算)，和/或

b)从N末端氨基酸起20个残基以内。

本发明还提供了编码此变体的DNA序列，含有此DNA序列的表达载体，转化后的含有此DNA序列或表达载体的宿主细胞，以及生产这种变体的方法，使用此变体的方法，和一种含有此变体的去污剂组合物。

附图简述

图1给出了H.insolens角质酶三维结构的坐标。

图2显示了豌豆茄病镰孢(左)和H.insolens(右)的角质酶三维结构的计算机模型。图中使用了不同的颜色以区分N末端氨基酸和围绕其的直径为12和17的区域。

图3-6显示了c3ET的水解过程。细节参见实施例。

发明详述

真菌角质酶

亲代角质酶是一种真菌角质酶，例如一种丝状真菌角质酶，其为腐质霉或镰孢霉菌株所固有，尤其H.insolens或豌豆茄病镰孢，更尤其H.insolensDSM 1800株。

H.insolens DSM 1800的角质酶的氨基酸序列和编码其的DNA序列由美国专利5,827,719中SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：1表示。这里使用于H.insolens角质酶的编号系统是基于其成熟肽，如SEQ ID NO：2所示。

豌豆茄病镰孢角质酶的氨基酸序列由WO 94/14964中图1D的成熟肽表示。文中使用于豌豆茄病镰孢角质酶的编号系统与使用在WO 94/14964中所用编号系统相同；它含有如图1D所示的蛋白质序列；因此成熟的角质酶是在16-214位点之间。

母体角质酶的氨基酸序列可至少50％(尤其至少70％或至少80％)同源于H.insolens DSM 1800的角质酶。母体角质酶可具体为与H.insolens DSM1800的角质酶相匹配的酶。

氨基酸及其改变的命名法

说明书和权利要求书均以单一字母代码表示氨基酸。在某一序列中的特定氨基酸由其单一字母代码和其位置表示，举例来说，Q1代表Gln(在位置1的谷氨酰胺，即位于N末端)。

文中用于定义取代的命名法基本与WO 92/05249中的描述一致。因此，R51P代表在位置51由P(脯氨酸，Pro)取代R(精氨酸，Arg)。

同源性和比对

为了本发明的目的，宜参照Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物学杂志，48，433-45所述方法确定同源程度，并以下列设置用于多肽序列比对：GAP生成罚分3.0，GAP延伸罚分0.1。同源性的确定可使用已知的计算机程序完成，例如GCG软件包中提供的GAP程序(Wisconsin软件包程序手册，第8版，1994年8月，遗传学计算机组，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)。

可按Needleman(出处同上)所述方法使用同样的参数对两个给定的序列进行比对。这种比对可以使用GAP程序(出处同上)完成。

角质酶的三维结构

H.insolens角质酶的结构依照所选X射线晶体衍射方法的原理得出，例如在X射线结构测定，Stout，G.K.和Jensen，L.H.，John Wiley & Sons，Inc.NY，1989中所示的原理。使用同晶置换的方法得出的分辨率为2.2的晶体结构坐标由图1以标准PDB(蛋白数据库，Brookhaven国家实验室，Brookhaven，CT)格式给出。

豌豆茄病镰孢角质酶的结构在Martinez等(1992)自然356，615-618有描述。豌豆茄病镰孢和H.insolens角质酶的三维结构用图2中的计算机模型进行比较。

应该注意到真菌角质酶的总体三维结构非常相似，并且X射线衍射显示具有高度同源性。在图2所示的计算机模型中可以清楚的看出豌豆茄病镰孢和H.insolens角质酶的相似性。因此，对一种真菌角质酶的修饰对其他真菌角质酶将同样有效。

近N末端取代

本发明的变体在N末端附近有一个或多个氨基酸取代。取代发生在距离N末端的17内(例如在12以内)和/或在20个位置以内(例如在15个位置以内)。与N末端的距离由晶体结构(即X射线结构中可见的结构)中氨基酸的α碳原子之间的距离计算得到。

在H.insolens DSM 1800的角质酶中，N末端的两个氨基酸(Q1和L2即分别在位置1和位置2的谷氨酰胺和亮氨酸)在X射线结构中不可见，因此所述距离从氨基酸G3开始计算。在17距离内的氨基酸包括以下位置，3-12，18，20-60，62-64，82，85-86，100-108，110-111，130-132，174，176-182，184-185，188，和192。在12距离内的氨基酸包括以下位置，3-8，22-27，30-47，53-59，102，177，和180-181。

在豌豆茄病镰孢角质酶中，N末端氨基酸G17在X射线结构中可见。在17距离内的氨基酸包括以下位置，17-26，34-75，77-79，101，115，117-119，147，191-197，199-200，和203。在12距离内的氨基酸包括以下位置，17-22，38，40，45-58，60，65，和70-72。

与亲代酶相比较，本发明中的变体增进了热稳定性。热稳定性可以通过DSC(差式扫描热量法)对变性温度的测量来确定，如在某实施例中在pH值8.5以扫描率90k/hr进行测量。所述变体的变性温度至少可比亲代酶的变性温度高出5℃。

在以上区域中的取代总数一般为1-10个，例如在以上区域中有1-5个取代。而且，本发明中的角质酶变体可以选择性含有对所述亲代酶的其它修饰，一般小于或等于10个，例如在以上区域外有5个或更少的改变(取代，缺失或插入)。因此与亲代酶相比较，所述变体的完整氨基酸序列一般有1-20，例如1-10个改变。

溶剂可接近性表面

在一个外露的氨基酸残基，即溶剂可接近性表面的氨基酸残基中可发生一个或多个取代。这时可通过W.Kabsch和C.Sandar，生物多聚体，22(1983)2577-2637页中所述的方法使用“dssp”程序(1988年10月版)计算得到。

在H.insolens DSM 1800的角质酶中，以下位置的氨基酸残基位于N末端17距离内并且有大于0的溶剂可接近性表面：3-12，18，26-33，36-38，40-45，47-56，59-60，62-64，82，85-86，104-105，174，176-179，181-182，192。

特定的取代

接近N末端的取代可具体为增加电荷的取代，即以中性或带正电的氨基酸取代带负电的氨基酸，或者以带正电的氨基酸取代中性氮基酸。因此可以由中性或带正电的氨基酸，例如R，K，Y，H，Q或N取代H.insolens DSM1800的角质酶中E6，E10，E30，E47，D63，E82和/或E179位置的带负电的氨基酸残基。一些特定的取代为E6Q/N，E10Q/N，E47K/R或E179Q/N。同样，可以由带正电的氨基酸，例如R，K或H取代H.insolens角质酶中N7，S11，N44或N52位置的中性氨基酸。

另一个接近N末端取代的例子是以脯氨基酸残基取代，例如对应于H.insolens DSM 1800的角质酶中A14P或R51P的取代。

特定的变体

下列是一些H.insolens角质酶的变体的实例。相应的变体可以在其他亲代角质酶的基础上经改造而成。

R51P

E6N/Q+L138I

A14P+E47K

E47K

E179N/Q

E6N/Q+E47K+R51P

A14P+E47K+E179N/Q

E47K+E179N/Q

E47K+D63N

E6N/Q+E10N/Q+A14P+E47K+R51P+E179N/Q

E6N/Q+A14P+E47K+R51P+E179N/Q

Q1P+L2V+S11C+N15T+F24Y+L46I+E47K

角质酶变体的用途

本发明涉及的角质酶变体可以用来酶性水解聚(对苯二甲酸亚乙酯)的环状低聚物，例如环状三(对苯二甲酸亚乙酯)，缩写为c3ET。

特别地，使用本发明的角质酶处理含聚酯的纱线或织物可以去除纱线或织物中的此类环状低聚物，在此处理步骤后可选择以pH约7-11的水溶液漂洗所述纱线或织物。对聚酯的处理可以方便地在高于c3ET的玻璃态转变温度(约55℃)和低于聚酯的玻璃态转变温度(约70℃)下进行。因此，此处理方法适于在50-80℃下进行，例如在60-75℃。处理方法可与WO 97/27237相似。

所述角质酶变体可以用来处理含聚酯的纺织品，例如PET(1，2-亚乙基乙二醇和对苯二酸的聚合物)，P3GT(1，3丙二醇和对苯二酸的聚合物)或者聚酯/棉花的混合物。此处理可使聚酯纺织物具有以下优点，例如增加穿着舒适度，增加水的穿透性，减小抗静电行为，改善手感和柔软度，改变再沉淀特性和/或颜色净化。

所述角质酶变体可以用来改进对含PET的纱线或织物的功能性涂饰，方法是在经所述角质酶变体处理后以加工剂，例如软化剂，抗皱树脂，抗静电剂，抗污剂或一些用来减弱无皱，持续压力，或防火效果的试剂进行处理。使用本角质酶变体进行处理可以增加织物等表面的功能性基团的数目，从而用来吸附功能性涂饰剂。在由Nihon Seni Sentaa KK发表于1998年10月15日的“SENSHOKU SIAGEKAKO BENRAN”一文中有关于涂饰剂实例的描述。

本发明的角质酶变体也可用于去污剂中，加入了这种角质酶变体可以增进去除脂类污渍的效果，如WO 94/03578和WO 94/14964所述。在衣用洗涤剂中加入这种角质酶变体可以减少多次清洗/穿着后积存于衣物上的恶臭。

本角质酶变体也可用来降解和回收利用聚酯，例如聚己内酯(PCL)，聚1，2-亚乙基乙二醇对苯二酸酯(PET)，聚乳酸，聚亚丁基琥珀酸酯和聚(羟基丁酸)联(羟基戊酸)，如胶片和瓶子，见日本平成5年专利申请344897。

本角质酶变体也可用于脂肪酶和角质酶的其他已知用途，如面包制造业(见WO 94/04035和EP 585988)，造纸业(如用于去除松脂，见EP 374700)和皮革、羊毛及相关产业(如用于对动物生皮、羊皮或羊毛的脱脂)，以及用于其他有关脱脂/去脂的用途。可在脂类和油类制造业中用固定化的所述变体作为有机合成的催化剂(如用于酯化作用，转酯化作用或脂类水解反应)。

染色聚酯

本发明提供了一种用于染色聚酯纱线或织物的方法。在该方法中，纱线或织物首先由角质酶处理，如在50-70℃或65-70℃，pH7-10处理12-48小时，然后用染料染色，如反应性染料，分散染料或阳离子染料。反应性染料可以是与OH或COOH基团发生反应的那种，例如可拥有生色团-NHPh-SO₂CH₂CH₂OSO₃Na结构。染色可在40-80℃进行，时间可为20-60分钟。

本角质酶变体可以是一种热稳定性角质酶，其在pH8.5的热变性温度T_d至少比亲代酶高5℃，例如高出7-10℃，例如为65℃或更高。对热变性温度的测量可按本说明书中实施例所述的DSC方法进行。

表面活性剂

在对纱线或织物的处理方法中，可以使用传统的润湿剂和/或分散剂促进纱线或织物与酶之间的接触。润湿剂可以是非离子型表面活性剂，例如脂肪醇乙氧酸酯。一种非常有效的润湿剂是乙氧酸化和丙氧酸化的脂肪酸酯如Berol 087(瑞士Akzo Nobel产品)。

分散染料宜选自非离子型、阴离子型、阳离子型、两性电解质型或两性离子型表面活性剂。更具体地，分散染料可选自羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、烷基芳基磺酸酯，长链醇硫酸酯(初级和二级烷基硫酸酯)，磺化烯烃、甘油单硫酸酯、硫酸化醚、磺基琥珀酸酯、磺化甲醚、烷基磺酸酯、磷酸酯、烷基异硫氰酸酯、酰基肌氨酸、烷基氨基磺酸酯、含氟表面活性剂、脂肪醇和烷基酚缩合物、脂肪酸缩合物、环氧乙烷与胺的缩合物、蔗糖酯、山梨醇酐酯、烷基醇酰胺、脂肪族胺氧化物、乙氧基化-元胺、乙氧基化二胺、脂肪醇乙氧基化物和它们的混合物。非常有效的分散剂之一是一种脂肪醇乙氧基化物如Berol 08(瑞士Akzo Nobel产品)。

制备角质酶变体的方法

本发明的角质酶变体可通过业内已知的方法制备，如WO 94/14963或WO 94/14964(Unilever)所述。下文描述克隆编码角质酶的DNA序列的方法，然后描述在角质酶编码序列的特定位点产生突变的方法。

克隆编码角质酶的DNA序列

编码亲代角质酶的DNA序列可从任何产生这种角质酶的细胞或微生物中，通过业内已熟知的方法分离得到。首先，使用可产生目的角质酶的生物的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。然后，如果这种角质酶的氨基酸序列已知，则合成标记的寡核苷酸探针用以从目的生物所制备的基因组文库中识别出角质酶编码克隆。或者，也可用含有与另一已知角质酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针经过低严谨度杂交和洗涤，而鉴定出角质酶编码克隆。

另一种鉴别角质酶编码克隆的方法涉及将基因组DNA片段插入到表达载体，例如质粒中，用所得基因组DNA文库转化角质酶阴性细菌，然后将转化后的细菌铺到含有角质酶底物(即麦芽糖)的琼脂板上，从而鉴定出表达角质酶的克隆。

或者，编码角质酶的DNA序列可以使用已经确立的标准方法人工合成，如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，四面晶体通信1981年第22期1859-1869页中所述的亚磷酰胺方法，或Matthes等，欧洲分子生物学组织杂志1984年第3期801-805页中所述的方法。在亚磷酰胺方法中，寡核苷酸在例如自动DNA合成仪中合成，然后经纯化、退火、连接并克隆到适宜的载体中。

最终，通过用标准技术连接合成产生的、基因组来源的或cDNA来源的片段(优选这些片段对应于完整DNA序列的各个部分)，可获得基因组来源与合成来源相混合的DNA序列、合成来源与cDNA来源相混合的DNA序列、或cDNA来源与基因组来源相混合的DNA序列。DNA序列也可以使用特异引物通过聚合酶链反应(PCR)制备，如在US 4,683,202或R.K.Saiki等在《科学》1988年第239期487-491页所述。

定点诱变

一旦分离了编码角质酶的DNA序列，并鉴别出目的突变位点，可用合成性寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有侧翼于目的突变位点的核苷酸序列。在一种特定的方法中，在含有角质酶基因的载体中产生编码角质酶的DNA序列的单链缺口。然后使带有目的突变的合成产生的核苷酸与所述单链DNA的同源部分退火。剩余的缺口由DNA多聚酶I(Klenow片段)填补，该构建体由T4连接酶连接。这种方法的具体实例见Morinaga等，生物技术，1984年第2期646-639页。美国专利4,760,025公开了通过使基因盒产生微小改变而引入编码多个突变的寡核苷酸。但由于可引入不同长度的多种寡核苷酸，所以可通过Morinaga方法一次引入更多的突变。

另一种在编码角质酶的DNA序列中引入突变的方法由Nelson和Long在《分析生物化学》1989年第180期147-151页中有述。它涉及经3步产生含目的突变的PCR片段，其通过用化学合成的DNA链作为引物之一进行PCR反应而得。可用限制性内切核酸酶切割这种PCR产生的片段，从而分离含有目的突变的DNA片段，并将其重新插入到一种表达质粒中。

角质酶变体的表达

依照本发明，由以上所述方法或任何业内已知的其它方法制备的编码角质酶变体的DNA序列可以通过表达载体以酶的形式表达，所述表达载体一般含有控制序列，其编码启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号的调控序列和任选抑制基因或各种激活因子的基因。

表达载体

含有编码本发明角质酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是任何可方便进行重组DNA操作的载体，并且对载体的选择一般依赖于将要引入该载体的宿主细胞类型。当被引入宿主细胞中时，这种载体可以整合至宿主细胞基因组，并与这些染色体一同复制。合适的表达载体有pMT838。

启动子

在载体中，DNA序列应被有目的的与合适的启动子序列连接。这种启动子可以是在选定的宿主细胞中表现转录活性的任何DNA序列，其可以源于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。

介导编码本发明角质酶变体的DNA序列的转录，尤其在细菌宿主中转录的适当启动子有：大肠杆菌lac操纵子的启动子，天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因的dagA启动子，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子，嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖的淀粉酶基因(amyM)的启动子，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子，枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。用于在真菌宿主中有效转录的启动子有：米曲霉TAKA淀粉酶基因的启动子，酿酒酵母TPI(丙糖磷酸异构酶)启动子(Alber等，(1982)，J.Mol.Appl.Genet 1，p.419-434)，以及米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，米赫根毛霉脂肪酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶的启动子。

表达载体

本发明的表达载体还含有适当的转录终止子，在真核生物中，所述载体还含有聚腺苷酸化序列，该序列与编码本发明α-淀粉酶变体的DNA序列可操作相连。终止序列和聚腺苷酸化序列优选与启动子有相同的来源。

载体也可进一步含有能使该载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。这类序列有质粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的复制起点。

载体也可以含有选择标记，例如产生可补偿宿主细胞缺陷的产物的基因，如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者能赋予抗生素抗性，如氨苄青霉素，卡那霉素，氯霉素或四环素抗性的基因。另外，所述载体可含有曲霉属的选择标记，如amdS，argB，niaD和sC，产生潮霉素抗性的一种标记，或可通过WO 91/17243所述的共转化完成选择。

用于分别连接编码角质酶变体的本发明DNA构建体，启动子，终止子和其它元件的方法，以及用于将它们插入含有复制所需信息的适当载体的方法是本领域技术人员众所周知的(例见Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港，1989)。

宿主细胞

含有如上所述的本发明DNA构建体或表达载体的本发明细胞可以有利地用作重组生产本发明角质酶变体的宿主细胞。通过将编码所述变体的本发明DNA构建体(一个或多个拷贝)整合至宿主染色体，可以方便地转化细胞。一般认为这种整合是有利的，因为DNA序列更可能在细胞中稳定维持。可根据常规方法，例如通过同源或异源重组将DNA构建体整合至宿主染色体。或者，可以用上述相关于其它宿主细胞类型的表达载体转化细胞。

本发明的细胞可以是高等生物如哺乳动物或昆虫的细胞，但也优选微生物细胞，如细菌或真菌(包括酵母)细胞。

适当的细菌有革兰氏阳性细菌，例如枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌或淡紫青链霉菌或鼠灰链霉菌，或者革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌。可通过原生质体转化，或通过使用感受态细胞以其固有方式转化细菌。

酵母优选糖酵母属或裂殖糖酵母属的种，例如酿酒酵母。

宿主细胞也可以是丝状真菌，例如曲霉属的菌株，最优选米曲霉或黑曲霉；或镰孢属的菌株，如尖孢镰孢，禾谷镰孢(最佳状态称为玉米赤霉，以前被称为Sphaeria zeae，与Gibberella roseum和Gibberella roseum f.sp.cerealis是同义词)，或硫色镰孢(最佳状态称为虱状赤霉，与Fusarium trichothecioides，杆孢状镰孢，接骨木镰孢，玫瑰色镰孢和玫瑰色镰孢禾谷变种是同义词)，Fusarium cerealis(与 Fusarium crokkwellnse是同义词)，或Fusariumvenenatum。

本发明的优选实施方案中，宿主细胞是蛋白酶缺陷株或蛋白酶阴性株。

例如，宿主细胞可以是蛋白酶缺陷的米曲霉菌株JaL 125，其碱性蛋白酶基因(被称为“alp”)缺失。该菌株描述于WO 97/35956(Novo Nordisk)。

可通过形成原生质体，转化原生质体，接着以其原有方式再生细胞壁，而转化丝状真菌细胞。曲霉属作为宿主微生物的用途描述于EP 238023(Novo Nordisk A/S)，其内容列入本文作为参考。

通过培养转化体产生角质酶变体

本发明特别涉及一种产生本发明角质酶变体的方法，此方法包括在适于所述变体产生的条件下培养宿主细胞，并且从所述细胞和/或培养基中回收变体。

用以培养宿主细胞的培养基可以是任何一种传统培养基，只需其适于所使用的宿主细胞的生长并可获得本发明中角质酶变体的表达。合适的培养基可以商购，或根据公开的配方(例如描述于美国典型培养物保藏中心目录中的配方)制备。

宿主细胞分泌的角质酶变体可方便的通过众所周知的操作从培养基中回收，此方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，使用盐例如硫酸铵沉淀培养基中的蛋白质成分，然后用例如离子交换层析、亲和层析或类似的层析方法。

变体在植物中的表达

本发明还涉及转基因植物，植物部分或植物细胞，它们已被编码本发明变体的DNA序列转化，从而能够以可回收的量表达和产生此酶。可从植物或植物部分中回收所述酶。或直接使用含有重组酶的植物或植物部分。

转基因植物可以是双子叶或单子叶植物。单子叶植物的例子是禾本科植物，如草甸草(早熟禾属(Poa))，饲料草，如羊茅属(festuca)，黑麦草属(lolium)，温带草如剪股颍属(Agrostis)，和谷类植物，如小麦，燕麦，黑麦，大麦，水稻，高粱和玉米。

双子叶植物的例子是烟草，豆科植物，如羽扇豆属植物，马铃薯，甜豆，豌豆，蚕豆和大豆，和十字花科植物(芸苔科)，如花椰菜，油菜子和密切相关的模型生物拟南芥。

植物部分的例子是茎，愈伤组织，叶，根，果实，种子和块茎。在本发明的上下文中，特定的植物组织也被认为是植物部分，如叶绿体，质外体，线粒体，液泡，过氧化物酶体和胞质。另外，任何植物细胞(无论其来源于何种组织)都被认为是植物部分。

本发明范围内还包括所述植物，植物部分和植物细胞的后代。

可根据本领域已知的方法构建表达本发明变体的转基因植物或植物细胞。简单地说，可通过下列方法构建植物或植物细胞，即将编码本发明的酶的一种或多种表达构建体掺入植物宿主基因组，并将所得的已修饰的植物或植物细胞繁殖成转基因植物或植物细胞。

合适的表达构建体可以是DNA构建体，其含有编码本发明所述酶的基因，该基因与适当的调节序列可操作相连，所述调节序列是在选定植物或植物部分中表达该基因所必需的。另外，所述表达构建体可含有选择标记和将该构建体导入所述植物所需的DNA序列(后者取决于所用的DNA导入法)，所述选择标记可用于鉴定整合了表达构建体的宿主细胞。

可根据例如需要在何时，何地和以何种方式表达酶来选择调节序列，例如启动子和终止序列并任选包括信号序列或转运序列。例如，编码本发明所述酶的基因的表达可以是组成型或诱导型表达，或者可以是发育，阶段或组织特异性表达，基因产物可以靶向特定的组织或植物部分，如种子或叶。调节序列描述于例如Tague等，植物生理学，86，506，1988。

为了进行组成型表达，可使用35S-CaMV启动子(Franck等，1980.细胞21：285-294)。器官特异性启动子可以是例如贮藏库组织(如种子，马铃薯块茎和果实)的启动子(Edwards & Coruzzi，1990.遗传学年鉴24：275-303)，或代谢库组织(如分生组织)的启动子(Ito等，1994.植物分子生物学.24：863-878)，种子特异性启动子，如水稻谷蛋白，谷醇溶蛋白，球蛋白或白蛋白的启动子(Wu等，植物和细胞生理学Vol.39，No.8 pp.885-889(1998))，蚕豆豆球蛋白B4和蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子(Conrad U等，植物生理学杂志Vol.152，No.6pp.708-711(1998))，种子油体蛋白的启动子(Chen等，植物和细胞生理学vol.39，No.9pp.935-941(1998))；Brassica napus贮藏蛋白napA的启动子，或本领域已知的任何其它种子特异性启动子(例见WO91/14772)。另外，启动子可以是叶特异性启动子，例如水稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，植物生理学Vol.102，No.3 pp.991-1000(1993))，小球藻属病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra，A和Higgins，OW，植物分子生物学Vol.26，No.1 pp.85-93(1994))，或水稻的aldP基因启动子(Kagaya等，分子和普通遗传学，Vol.248，No.6 pp.668-674(1995))，或创伤诱导型启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等，植物分子生物学Vol.22，No.4 pp.573-588(1993))。

可使用启动子增强子元件在植物中获得较高的酶表达。例如，启动子增强子元件可以是位于启动子和编码所述酶的核苷酸序列之间的内含子。例如，Xu等，文献同上公开了使用水稻肌动蛋白1基因的第一个内含子来增强表达。

选择标记基因和表达构建体的任何其它部分可选自本领域已知的那些。

可根据本领域已知的常规技术将DNA构建体掺入植物基因组，所述技术包括农杆菌-介导的转化，病毒-介导的转化，显微注射，微粒轰击，biolistic转化和电穿孔(Gasser等，科学，244，1293；Potrykus，Bio/Techn.8，535，1990；Shimamoto等，自然，338，274，1989)。

目前，根瘤农杆菌介导的基因转移是产生转基因双子叶植物的候选方法(有关综述见Hooykas & Schilperoort，1992.植物分子生物学.19：15-38)，然而，该方法也可用于转化单子叶植物，但单子叶植物一般使用其它的转化方法。目前，产生转基因单子叶植物的候选方法是胚愈伤组织或发育中的胚的微粒(被转化DNA包被的显微金或钨颗粒)轰击(Christou，1992.植物杂志.2275-281；Shimamoto，1994.最新生物技术观点.5：158-162；Vasil等，1992.Bio/Technology 10：667-674)。转化单子叶植物的另一种方法基于原生质体转化(Omirulleh S等，植物分子生物学Vol.21，No.3 pp.415-428(1993))。

转化之后，根据本领域众所周知的方法选择掺入了所述表达构建体的转化子并将其再生成完整植物。

材料和方法

质粒

pJSO026

这是一种酿酒酵母表达质粒，见WO 97/07205和J.S.Okkels，(1996)“pYES载体的URA3启动子缺失可提高酿酒酵母中真菌脂肪酶的表达水平”，重组DNA技术III：生物科学和工程科学的结合，纽约科学院年鉴，第782卷。

pFuku83

这是一种酵母和大肠杆菌中的穿梭载体，可用来在TPI启动子控制下表达H.insolens角质酶，其由pJSO026改建而成。

底物

BETER

此处的对苯二酸双(2-羟乙基)酯二苯甲酸盐缩写为BETEB(苯甲酰基-亚乙基-对苯二酸基-亚乙基-苯甲酸盐)。它由对苯二酸双(2-羟乙基)酯和苯甲酸制备而成。

脂肪酶活性(LU)

使用阿拉伯胶作为乳化剂乳化三丁酸甘油酯(甘油三丁酸酯)来制备脂肪酶底物。在恒pH的滴定实验中，于30℃，pH7的条件下水解三丁酸甘油酯。一个单位的脂肪酶活性(1LU)等于能在标准条件下每分钟释放1μmol丁酸的酶量。

差式扫描热量法(DSC)

将样品和参比溶液仔细脱气并立即将样品装入热量计中(参比溶液：即不含酶的缓冲液)。样品和参比溶液(约0.5ml)在5℃预先热平衡20分钟。以约90k/hr的扫描率从5℃到95℃进行扫描。由此测出变性温度，其准确度在1℃上下。MicroCal Inc.的VP-DSC适用于这些实验。

方法

PCR条件

步骤1：94℃，120秒

步骤2：94℃，60秒

步骤3：50℃，60秒

步骤4：72℃，150秒

返回步骤2，35个循环

步骤5：72℃，480秒

步骤6：4℃，永久

实施例

实施例1：角质酶变体的制备

如美国专利5,827,719(Novo Nordisk)所述获得编码H.insolens角质酶的DNA序列，发现其具有本文SEQ ID NO：1所示DNA序列。

经定域随机诱导变异，并于BETEB培养基上60℃保温1天后筛选阳性克隆，可获得变体。这种BETEB培养基含有200ml/l的浓度为500mM的甘油缓冲液(pH8.5)，1.25g/l的BETEB(溶于热乙醇中)和20g/l的琼脂。

分离出三个阳性变体，并测定了它们的氨基酸序列。与其母体H.insolens角质酶相比，它们具有如下改变：

A14P+E47K

E47K

E179Q

实施例2：定点诱变

H.insolens角质酶的一种包含E6Q+E47K+R57P取代的变体如下所述方法制备：

利用邻近区已有的限制性内切酶位点，设计一对PCR引物以引入氨基酸取代，如下(星号表示引入的突变)

上游引物：E6QF

cgg  cag ctg gga acc atc c*ag aac

       Pvu II

下游引物：E47K，R51P

cgc cct  gga tcc aga tgt tcg* gga tgt ggg act t*aa ggc

        BamH I

PCR在上述的条件下使用这些引物并且以pFukuNL83为模板进行。

获得的PCR片段由Clontech离心柱纯化，并用Pvu II和BamH I消化。

所得片段经凝胶纯化，与在相同限制酶切位点被消化的pFukuNL83连接。

实施例3：角质酶变体的热稳定性

变体

如下述检测H.insolens角质酶及其以下变体的热稳定性：

A14P+E47K

E47K

E179Q

E6Q+E47K+R51P

A14P+E47K+E179Q

E6Q+A14P+E47K+R51P+E179Q

E6Q+E10Q+A14P+E47K+R51P+E179Q

差式扫描热量法(DSC)

角质酶变体的热稳定性使用DSC方法在pH4.5(50mM乙酸盐缓冲液)和pH8.5(50mM甘氨酰-甘氨酸缓冲液)的环境下研究。热变性温度T_d是指温度记录图(Cp对T)上变性峰(主要吸热峰)的最高温度。此温度记录图是已设好程序的恒定加热速率下加热酶溶液后得到的。

经测定发现母体角质酶在pH8.5时其T_d是63℃，而6种上述变体的T_d是70-73℃，即提高了7-10℃。

经测定发现母体角质酶在pH4.5时其T_d是61℃，而5种上述变体的T_d是64-66℃，即提高了3-5℃。

BETEB的水解

H.insolens角质酶和上述变体中的2种的热稳定性在升温的条件下通过BETEB的水解来测定。在针对每种角质酶的实验中，将以下混合物于55-70℃范围内的不同温度保温17小时。

0.1ml  0.5M甘氨酰-甘氨酸缓冲液(pH8.5)

0.1ml  0.5％BETEB的乙醇溶液

0.1ml  酶溶液(约25LU/ml)

0.7ml  Milli Q水

水解程度在保温后测定，结果由下表所示。

	变体	变体	母体
					27LU/ml	25LU/ml	24LU/ml
55℃	98％	99％	72％
				60℃	91％	83％	33％
65℃	66％	13％	7％

这些结果清楚的显示了与母体相比，变体的热稳定性提高了

BETEB的水解

H.insolens角质酶和上述变体中的3种的热稳定性是在60℃通过BETEB水解2小时来测定的。除了温度固定在60℃和角质酶剂量有所变化，水解的条件与上述相同。结果由下表所示。

LU/ml	变体	变体	变体	母体
					0	0％	0％	0％	0％
10	97％	99％	9％	6％
					20	98％	99％	74％
50	98％	94％	93％	15％
					100	88％	69％	92％	34％
300				41％
					600				63％
1200				82％

这些结果显示，这些变体在60℃水解的速度明显比亲代角质酶更快。

实施例4：c3ET的水解

通过在不断升温的条件下c3ET的水解来测定H.insolens角质酶和上述变体中的5种。在针对每种角质酶的实验中，将以下混合物于不同温度保温2小时。

0.115mg c3ET(在反应容器中加入0.1ml溶于HFIP的2mM c3ET，真空除去溶剂，然后于70℃烘干过夜)

0.1ml  0.5M甘氨酰-甘氨酸缓冲液(pH8.5)

0.1ml  酶溶液(约600LU/ml)

0.8ml  Milli Q水

保温后，在每种反应混合物中加入2ml 1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)，然后用HPLC测定水解速率。图3所示结果清楚表明这些变体的热稳定性比亲代角质酶提高了。

实施例5：纱线上c3ET的水解

H.insolens角质酶和上述变体中的5种的热稳定性通过含有副产物c3ET的聚酯纱线来测定。将以下底物混合物于60或65℃预保温。

0.1g    聚酯纱线

0.2ml   0.5M甘氨酰-甘氨酸缓冲液(pH8.5)

1.7ml   Milli Q水

预保温后，每个反应容器中加入0.1ml酶溶液(约1000LU/ml)并保温17小时。然后加入2ml HFIP，作用30分钟以抽提并水解所述聚酯纱线表面的c3ET，再测定水解率，结果如图4所示。

显而易见，在水解聚酯纱线上的c3ET方面，变体比母体更加有效。其中一种变体在65℃时的水解率高于在60℃时的水解率。

实施例6：用角质酶变体处理纱线

本实施例考察了不同温度、不同c3ET剂量对聚酯型纱线的c3ET水解进程。图5显示了不同温度下的时间进程。从此图可见最适温度为65℃。70℃时仍保留约一半的活性。图6显示了以逐渐增加的酶量进行的水解进程。剂量为275和550LU/ml的两条曲线相同，这表明在100到275LU/ml之间水解率到达了一个平台期。因此可以假定200LU/ml已足够。

实施例7：以反应性染料对聚酯染色

本实施例中对以下的聚酯型织物进行了处理：

机织织物；大约2×2cm，34mg

编织织物；大约1.5×1.5cm，50mg

每种织物均在0.9ml、50mM GlyGly(甘氨酰甘氨酸)缓冲液(pH8.5)和0.1ml H.insolens角质酶变体溶液(1100LU/ml)中浸泡，并在65℃或70℃下保温。一天后加入另一份0.1ml酶溶液并继续保温，两天后取出织物并以清水漂洗。使用亲代角质酶进行对照实验，空白对照组织物以相同方式不加酶来处理。

在60℃下，将织物在120g Na₂SO₄和60g Na₂CO₃的9g混合物在3升去离子水中搅拌30分钟，并在流动温水中漂洗。反应性染料为考马斯亮蓝B(日本Mitsui Chemical Co.生产)，其结构为生色团-NHPh-SO₂CH₂CH₂OSO₃Na。

在所有四项实验中，(机织织物和编织织物，65℃和70℃)，织物均被均匀的染色。

实施例8：编织织物中聚酯碎片的增溶作用

将1×1cm的聚酯型编织纺织物(PET，亚乙基乙二醇和对苯二酸的聚合物)与0.01mg H.insolens角质酶变体于60℃在1ml缓冲液pH10中保温1小时。分离反应混合物，通过在250nm下测量溶液的OD值可以发现对苯二酸的释放(以OD₂₅₀/mgPET表示)。对照实验在不含此酶或含有亲代角质酶的条件下进行。结果为：

	酶	OD250
			本发明	角质酶变体	4.5
对照	亲代角质酶	0.3
			无	0.1

此结果表明该角质酶变体可有效促进聚酯型织物的溶解。

另一个实验中，于65℃使用从0.5到200LU/ml的不同酶量，对加入或不加入非离子型表面活性剂(脂肪醇乙氧基化物，产品名Softanol 50)的角质酶变体测试2小时。结果显示在非离子型表面活性剂存在时角质酶变体的增溶作用更强。

实施例9：聚己内酯胶片和聚酯胶片的水解

在试管中放入约0.1克的聚己内酯或聚酯胶片。将其浸泡在5ml 50mM的GlyGly缓冲液中(pH8.5)，缓冲液中含或不含H.insolens角质酶变体(450LU)。70℃保温5小时。反应后的聚己内酯胶片和聚酯胶片在含酶的试管壁上均观察到薄层的水解产物。而在不含酶的对照管中却无变化。聚己酯胶片有10％的重量损失。聚酯胶片未见任何重量变化。

实施例10：cPET的水解

本实验中对角质酶变体与亲代酶的效用进行了比较。试验如下进行：

在微型涤垢仪中相对轻微的搅拌下用所述酶处理一块有寡聚体污渍的(黑色)PET织物样品(约4cm×13cm)。PET织物放置在一个有孔圆柱形固定器上(半径约2cm，高约6cm)，该固定器围绕其轴线旋转，使该PET织物被寡聚体浸渍过的一面朝向圆柱体的外表面。

在指定温度下(这里是65℃)，将织物浸泡于盛有100ml处理液的150ml玻璃烧杯中。处理一定时间后(这里是90分钟)，将PET样品从处理液中取出，用去离子水漂洗并风干。

在调整处理后，对样品浸渍过寡聚体的一面目测评级(依照寡聚体污渍斑块被去除的效果)。评级标准如下：

-2：样品明显劣于空白对照(不加酶)

-1：样品略差于空白对照(不加酶)

0：样品无法与空白对照分优劣

1：样品略优于白对照

2：样品明显优于白对照

同时，使用分光光度计(仪器：Hunterlab Reflectometer)读取样品以量化颜色强度(600nm处的K/S-值)。

下表总结了在相似条件下比较所述酶之性能的试验中所使用的测试条件：

温度：                  65℃

缓冲液/pH：             50mM甘氨酸缓冲液，pH10.3

处理时间(分钟)：        90

酶的剂量(LU/g)：        30000

该试验结果总结在下表中

酶	目测评分(平均)	600nm处的K/S差异
			无	0(指定的)	2.33
亲代角质酶	0	2.38

角质酶变体

1.5-2.0

2.89

从本组实验可以看出，亲代角质酶在给定的测试条件下无效果或仅有非常有限的效果(可能因为实验温度太高以致酶很难保留其活性)，然而角质酶变体可以明显的去除PET织物上的寡聚体污渍。

实施例11：cPET的水解

在模式化分散染色实验中测试H.insolens角质酶变体的pH和温度特性。试验如下述进行：

使用Werner Mathis Labomat的典型的分散染色系列程序，处理一块有寡聚体污渍的(黑色)PET织物样品。此过程可概述为，将所述样品加入到缓冲溶液中，加热到130℃，再冷却到处理温度。加入酶或缓冲液并维持所需温度30分钟。将溶液冷却至室温并测量洗液的混浊度。混浊度的下降是对角质酶活性的直接测定，其对应于已水解的cPET寡聚物。

本实验的详细描述

将一块黑色PET样品(约4cm×13cm)加入到含有0.2g/l LutensolAT11(BASF)的140ml 100mM的Britton-Robinson缓冲液中，并置于Labomat中(32转每分钟)。

以9℃/分钟的速率将Labomat加热到130℃，并维持10分钟。

以9℃/分钟的速率将烧杯降温到运行温度(参照下表)，并维持1分钟。

在烧杯中注入合适pH值的10mL酶溶液(100LU/ml所述变体)或缓冲溶液(0LU/ml)。

以2℃/分钟的速率重新加热Labomat，并维持30分钟。

取出样品，将洗液冷却至室温。

测量洗液的混浊度。

评价：以1.8、18和180NTU标准混浊度为标准，使用Hach 18900比率混浊度仪测量混浊度。计算相对于空白对照的酶效应，其为对照空白液(无酶)和酶处理液的混浊度之间的差异。

计算出了所述角质酶变体的相对性能(混浊度的降低)，结果如下表所示。当计算得到负数值时，结果表示为“负”。由于设置的变化，可以假定负数结果是人为因素的结果。

温度	pH7	pH8	pH9	pH10
					60℃	39	57	37	14
65℃	39	16	60	30
					70℃	25	12	54	33
75℃	22	50	114	58
					85℃	负	负	15	负

结果显示该角质酶变体在较宽pH和温度范围内均有活性，在pH9和75℃的设置下有最佳寡聚物去除效果。似乎在85℃或更高温度下此酶会失活。

实施例12：cPET的水解

在模式化分散染色实验中研究H.insolens角质酶变体的处理时间的影响。试验如下进行：

使用Werner Mathis Labomat的典型的分散染色系列程序，处理一块有寡聚体污渍的(黑色)PET织物样品。此过程可概述为，将样品加入到缓冲溶液中，加热到130℃，再冷却到处理温度。加入酶或缓冲液(100mM Britton-Robinson pH9)并于75℃维持0-40分钟。将溶液冷却至室温并测量洗液的混浊度。混浊度的下降是对角质酶活性的直接测定，其对应于已水解的cPET寡聚物。

本实验的详细描述

将一块黑色PET样品(约4cm×13cm)加入到含有0.2g/l LutensolAT11(BASF)的140ml 100mM的Britton-Robinson缓冲液中，并置于Labomat中(32转每分钟)。

以9℃/分钟的速率将Labomat加热到130℃，并维持10分钟。

以9℃/分钟的速率将烧杯降温到75℃，并维持1分钟。

在烧杯中注入10mL酶溶液(100LU/ml的变体)或100mM Britton-Robinson pH9的缓冲溶液(0LU/ml)。

以2℃/分钟的速率重新加热Labomat到75℃，并维持合适的时间(0-40分钟，参见下表)。

取出样品，将洗液冷却至室温。

测量洗液的混浊度。

评价：(以1.8、18和180NTU标准混浊度为标准，)使用Hach 18900比率混浊度仪测量混浊度。以0时的空白对照为参照，计算酶的相对效应：0时空白对照液(无酶)的混浊度减去酶处理液的混浊度(指定时间)。

计算出了该角质酶变体的相对性能(混浊度的降低)，结果如下表所示。

时间(分钟)	相对性能(混浊度的降低)
		0	0
5	42
		10	48
15	62
		20	69
25	85
		30	72
40	78

结果表明酶的效果随时间而增加。在本实验所用的酶剂量和寡聚体浓度下，在约20分钟后酶的效果趋于稳定。

实施例13：纤维的改性

通过在染色前用一种H.insolens角质酶变体处理分散染色后的聚酯纤维，研究了此酶对这类纤维的润湿性能的影响。因此本实验包括两个阶段，纤维改性和分散染色。

阶段1-纤维改性

设备：          Atlas Launder-O-meter LP2

纤维：          Testfabrics提供的100％聚酯编织物

pH值：          50mM磷酸钾缓冲液，pH7

研磨剂：        5个大钢球

烧杯容量：      120mL

处理：          65℃2小时后突升至90℃并维持1小时

样品制备：      切下3*1.5g的织物样品，每烧杯3块＝4.5g

漂洗：

在去离子水中漂洗。

阶段2-染色-分散染料

染料溶液：

加入去离子水配成1∶20的0.4％Dianix Red(DyStar)SE-CB(owf)溶液

pH4.5-5

染色方法

1.每次使用一块经纤维改性后的样品进行染色(使用1.5g/样品进行溶液比率的计算)。

2.依照上述配方配制染色液。在Labomat烧杯中加入冷染色溶液并以3.5℃/分钟的速率加热到55℃。到达预定温度后继续运行5分钟。

3.将织物加入到烧杯中。

4.以1.5℃/分钟的速率加热到130℃。染色30分钟。

5.以5℃/分钟的速率冷却到70℃。倒掉染色液，但收集并热(60℃)漂洗织物10分钟。热漂洗后，室温下充溢漂洗直到不再有颜色被洗下。

6.放置风干过夜。

测试/分析

AATCC测试方法61-洗涤不褪色性

染色液耗损百分比-分光光度计

K/S和L^*-反射计

AATCC TM-79微量测试

结果：

纤维改性的结果如下表所示。

剂量变化	染色度(AATCC TM-61)	色泽变化(TM-61之前和之后的K/S@530)	微量测试(AATCC TM-79)
				空白对照	4.5	5	53秒
50LU/ml	4.5	5	18秒
				100LU/ml	4.5	5	15秒

结果表明使用该角质酶变体处理聚酯可以显著增加其润湿性。在以上设置下未发现其对分散染料染色性的副作用。

实施例14：洗衣业中使用角质酶变体以减少源于人类汗液/皮脂污渍的纺织品上的恶臭

使用振荡式涤垢仪(Terg-O-tometer)进行单轮洗涤试验以测试角质酶去除恶臭的性能。

实验条件

洗涤液：每烧杯1000ml

样品：100％聚酯(连锁编织，使用前经Soxhlet提取液清洗)。每烧杯24块样品(3.3×3.5cm)。

污渍：人类男性腋窝汗液和取自运动后腋窝的皮脂。

洗涤剂：5g/L标准脱色剂。未调整pH值。

水的硬度：3.2mM Ca²⁺/Mg²⁺(比值为5∶1)

洗涤温度：30℃

洗涤时间：30分钟

漂洗：流动自来水中15分钟

评价

清洗后的潮湿样品放置于密封的200ml有色玻璃杯中。一组经过训练的感觉人员(9-11个评委组成)嗅闻潮湿样品的顶部空间从而对其气味和总气味强度做出评价。气味强度通过在15cm长的非格度坐标上放置标记的方法纪录，在非格度坐标两端分别标有文字(坐标开始处为“无”，结尾处为“非常强烈”)。所有的评价均进行两次。样品在清洗后的第1、2和3天进行评价(样品始终放置于玻璃杯中)。

Claims (29)

1.一种来自Humicola insolens菌株DSM1800的亲代真菌角质酶的变体，其

a)在以下位点含有一个或多个氨基酸残基的取代，E6，E10，E30，E47，D63，E82和/或E179位点，和

b)比亲代角质酶具有更好的热稳定性。

2.权利要求1中的变体，其中所述一个或多个取代为荷负电荷的氨基酸被中性或荷正电荷的氨基酸取代，或中性氨基酸被荷正电荷的氨基酸取代。

3.权利要求1或2中的变体，其中所述取代为用R/K/Y/H/Q/N取代。

4.权利要求1或2中的变体，其中所述取代为对应于E6N/Q，E10N/Q，E47K/R和/或E179N/Q的取代(H.insolens角质酶编号)。

5.权利要求1或2中的变体，其中所述一个或多个取代是用脯氨酸残基取代。

6.权利要求5的变体，其中所述取代在相应于位点A14和/或R51的位点进行。

7.权利要求1或2中的变体，其含有1、2、3、4、5或6个上述取代。

8.权利要求1或2中的变体，其在对应于Humicola insolens DSM 1800的角质酶中以下位置具有取代：

a)R51P

b)E6N/Q+L138I

c)A14P+E47K

d)E47K

e)E179N/Q

f)E6N/Q+E47K+R51P

g)A14P+E47K+E179N/Q

h)E47K+E179N/Q

i)E47K+D63N

j)E6N/Q+A14P+E47K+R51P+E179N/Q

k)E6N/Q+E10N/Q+A14P+E47K+R51P+E179N/Q，或

l)Q1P+L2V+S11C+N15T+F24Y+L46I+E47K

9.权利要求1或2中的变体，其对对苯二酸酯有水解活性。

10.权利要求1或2中的变体，其对环三(对苯二甲酸亚乙酯)和/或对苯二酸双(2-羟乙基)酯二苯甲酸盐(BETEB)有水解活性。

11.权利要求1或2中的变体，其变性温度至少比亲代角质酶高出5℃，

12.权利要求1或2的变体，其中所述变性温度是在pH8.5所测。

13.一种DNA序列，其编码权利要求1-12中任一项的变体。

14.一种载体，其含有权利要求13中的DNA序列。

15.一种转化的宿主细胞，其携有权利要求13的DNA序列或权利要求14的载体。

16.一种生产权利要求1-12中任一项的变体的方法，其包括：

a)培养权利要求15的细胞，从而表达所述变体，和

b)回收变体。

17.权利要求16的方法，其中a)中培养权利要求15的细胞，从而表达并分泌所述变体。

18.一种构建来自Humicola insolens菌株DSM1800的角质酶变体的方法，其包括：

a)选择亲代真菌角质酶，

b)鉴定所述亲代角质酶中以下位点的一个或多个氨基酸残基：

E6，E10，E30，E47，D63，E82和/或E179的位点，和

c)实施改变，每个改变分别为氨基酸残基的插入、缺失或取代，

d)任选在除b)以外的一个或多个位置上进行改变，所述改变各为插入，缺失或取代一个氨基酸残基，

e)制备步骤b-d获得的变体，

f)测量所述变体的热稳定性，

g)任选重复步骤b-f，和

h)选出热稳定性高于亲代角质酶的变体。

19.一种产生来自Humicola insolens菌株DSM1800的角质酶变体的方法，包括：

a)选择亲代真菌角质酶，

b)鉴定所述亲代角质酶中以下位点的一个或多个氨基酸残基：

E6，E10，E30，E47，D63，E82和/或E179的位点，和

c)实施改变，每个改变分别为氨基酸残基的插入、缺失或取代，

d)任选在除b)以外的一个或多个位置上进行改变，所述改变各为插入，缺失或取代一个氨基酸残基，

e)制备步骤b-d获得的变体，

f)测量所述变体的热稳定性，

g)可选择地重复步骤b-f，和

h)选出热稳定性高于亲代角质酶的变体，

i)生产该变体以获得角质酶变体。

20.一种酶性水解聚(对苯二甲酸亚乙酯)的环状低聚物的方法，其包括用权利要求1-12中任一项的真菌角质酶变体处理该环状低聚物。

21.权利要求20的方法，其中环状低聚物是环状三(对苯二甲酸亚乙酯)。

22.权利要求20或21的方法，其中所述处理在60-80℃进行，

23.权利要求22的方法，其中所述处理在65-75℃进行。

24.权利要求20或21的方法，其中环状低聚物存在于含聚酯的织物或纱线的纤维中或其上。

25.权利要求20或21的方法，其进一步包括随后对所述织物或纱线进行漂洗，

26.权利要求25的方法，其中所述漂洗用pH约7-11的水溶液漂洗。

27.对聚酯型织物或纱线进行染色的方法，其包括：

a)用权利要求1-12中任一项的角质酶变体处理所述织物或纱线；

b)使用反应性染料或分散染料对处理过的织物染色。

28.一种去污组合物，其含有一种表面活性剂以及权利要求1-12中任一项的变体。

29.一种改进含PET的纱线或织物的功能性涂饰的方法，包括

a)用权利要求1-12中任一项的变体处理所述织物或纱线，

b)然后用选自软化剂，抗皱树脂，抗静电剂，抗污剂的涂饰剂处理所述织物或纱线。

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