PL199746B1 - Wariant kutynazy macierzystej, sekwencja DNA kodująca wariant kutynazy macierzystej, wektor zawierający sekwencję DNA, transformowana komórka gospodarza, sposób wytwarzania wariantu kutynazy macierzystej, sposób hydrolizy enzymatycznej cyklicznego oligomeru poli(tereftalanu etylenu), sposób barwienia poliestrowej tkaniny lub przędzy, kompozycja detergentowa i sposób polepszania wykończenia specjalnego przędzy lub tkaniny zawierającej PET - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku s a warianty kutynazy grzybowej o polepszonej stabilno sci termicznej oraz m.in. sposób ich wytwarzania. Warianty zawieraj a podstawienie jednego lub wi ekszej liczby reszt aminokwasów blisko N-ko nca w sekwencji aminokwasów lub w trójwymiarowej strukturze kutynazy. PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są wariant kutynazy macierzystej, a bardziej konkretnie wariant kutynazy wykazującej polepszoną stabilność termiczną, sekwencja DNA kodująca wariant kutynazy macierzystej, wektor zawierający sekwencję DNA, transformowana komórka gospodarza, sposób wytwarzania wariantu kutynazy macierzystej, sposób hydrolizy enzymatycznej cyklicznego oligomeru poli(tereftalanu etylenu), sposób barwienia poliestrowej tkaniny lub przędzy, kompozycja detergentowa zawierająca wariant kutynazy i sposób polepszania wykończenia specjalnego przędzy lub tkaniny zawierającej PET.

Kutynazy są enzymami lipolitycznymi, zdolnymi do hydrolizowania substratu kutyny. Znane są kutynazy z różnych grzybów (P.E. Kolattukudy, w: „Lipases, red. B. Borgstrom i H.L.Brockman, Elsevier 1984, 471-504). Opisano sekwencję aminokwasów i strukturę krystaliczną kutynazy Fusarium solani pisi (S. Longhi i inni, Journal of Molecular Biology, 268 (4), 779-799 (1997)). Opublikowano również sekwencję aminokwasów kutynazy z Humicola insolens (US 5827719).

Opublikowano liczne warianty kutynazy Fusarium solani pisi: WO 94/14963, WO 94/14964, Appl. Environm. Microbiol. 64, 2794-2799, 1998; Proteins: Structure, Function and Genetics 26, 442458, 1996; J. of Computational Chemistry 17, 1783-1803, 1996; Protein Engineering 6, 157-165, 1993; Proteins: Struture, Function, and Genetics 33, 253-264, 1988; J. of Biotechnology 66, 11-26, 1998; Biochemistry 35, 398-410, 1996.

Kutynazy grzybowe można stosować w enzymatycznej hydrolizie cyklicznych oligomerów poli(tereftalanu etylenu), np. w wykończaniu przędzy lub tkaniny z włókien z poli(tereftalanu etylenu) (WO 97/27237). Jednakże pożądane jest polepszenie stabilności termicznej znanych kutynaz grzybowych dla umożliwienia stosowania wyższej temperatury procesu.

Twórcy wynalazku znaleźli pewne warianty kutynaz grzybowych, wykazujących polepszoną stabilność termiczną.

Tak więc wynalazek dotyczy wariantu macierzystej kutynazy, przy czym

a) kutynazę macierzystą stanowi kutynaza szczepu DSM 1800 H. insolens,

b) wariant ten ma sekwencję aminokwasów z 1-20 zmianami w porównaniu z kutynazą macierzystą,

c) wariant ten obejmuje podstawienie reszty aminokwasu o ładunku ujemnym w pozycji odpowiadającej pozycji E6, E10, E30, E47, D63, E82 i/lub E179 aminokwasem obojętnym lub aminokwasem o ładunku dodatnim, bądź podstawienie resztą Pro w pozycji odpowiadającej A14 lub R51 w kutynazie macierzystej,

d) wariant ten wykazuje aktywność hydrolityczną wobec cyklicznego tri(tereftalanu etylenu) i tereftalanu bis(2-benzoiloksyetylu), oraz

e) wariant ten jest bardziej stabilny termicznie niż kutynaza macierzysta.

Korzystny jest wariant kutynazy według wynalazku, który obejmuje podstawienie odpowiadające E6N/Q, E10N/Q, E47K/R i/lub E179N/Q (numeracja kutynazy H. insolens).

Korzystny jest również wariant kutynazy według wynalazku, który obejmuje podstawienie odpowiadające A14P lub R51P w kutynazie szczepu DSM 1800 Humicola insolens.

Ponadto korzystny jest wariant kutynazy według wynalazku, który ma jedno, dwa, trzy, cztery, pięć lub sześć tych podstawień.

Ponadto korzystny jest także wariant kutynazy według wynalazku, który ma podstawienia odpowiadające jednemu z następujących podstawień w kutynazie szczepu DSM 1800 Humicola insolens:

a) R51P

b) E6N/Q + L138I

c) A14P + E47K

d) E47K

e) E179N/Q

f) E6N/Q + E47K + R51P

g) A14P + E47K + E179N/Q

h) E47K + E179N/Q

i) E47K + D63N

j) E6N/Q + A14P + E47K + R51P + E179N/Q

k) E6N/Q + E10N/Q + A14P + E47K + R51P + E179N/Q lub

l) Q1P + L2V + S11C + N15T + F24Y + L46I + E47K.

PL 199 746 B1

Ponadto korzystny jest również wariant kutynazy według wynalazku, który ma temperaturę denaturacji o co najmniej 5° wyższą niż dla kutynazy macierzystej, mierzoną przy pH 8,5.

Ponadto wynalazek dotyczy sekwencji DNA kodującej zdefiniowany powyżej wariant kutynazy.

Ponadto wynalazek dotyczy wektora zawierającego zdefiniowaną powyżej sekwencję DNA.

Ponadto wynalazek dotyczy transformowanej komórki gospodarza zawierającej zdefiniowaną powyżej sekwencję DNA.

Ponadto wynalazek dotyczy transformowanej komórki gospodarza zawierającej zdefiniowany powyżej wektor.

Ponadto wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania zdefiniowanego powyżej wariantu kutynazy, który charakteryzuje się tym, że

a) hoduje się zdefiniowaną powyżej komórkę tak aby osiągnąć ekspresję i korzystnie sekrecję tego wariantu i

b) odzyskuje się ten wariant.

Ponadto wynalazek dotyczy sposobu hydrolizy enzymatycznej cyklicznego oligomeru poli(tereftalanu etylenu), który charakteryzuje się tym, że prowadzi się obróbkę cyklicznego oligomeru zdefiniowanym powyżej wariantem kutynazy.

Korzystny jest sposób według wynalazku, w którym prowadzi się obróbkę cyklicznego oligomeru, który stanowi cykliczny tri(tereftalan etylenu).

Korzystny jest również sposób według wynalazku, w którym K prowadzi się obróbkę w temperaturze 60-80°C, korzystnie w temperaturze 65-75°C.

Ponadto korzystny jest sposób według wynalazku, w którym prowadzi się obróbkę cyklicznego oligomeru, który znajduje się we włóknach i na włóknach tkaniny lub przędzy zawierającej poliester.

Korzystny jest także sposób według wynalazku, w którym prowadzi się dalsze płukanie tkaniny lub przędzy, korzystnie płukanie roztworem wodnym o pH w zakresie od około pH 7 do około pH 11.

Ponadto wynalazek dotyczy sposobu barwienia poliestrowej tkaniny lub przędzy, który charakteryzuje się tym, że

a) prowadzi się obróbkę tkaniny lub przędzy zdefiniowanym powyżej wariantem kutynazy i b) barwi się poddaną obróbce tkaninę barwnikiem reaktywnym lub barwnikiem zawiesinowym. Ponadto wynalazek dotyczy kompozycji detergentowej, której cechą jest to, że zawiera środek powierzchniowo czynny i zdefiniowany powyżej wariant kutynazy.

Ponadto wynalazek dotyczy sposobu polepszania wykończenia specjalnego przędzy lub tkaniny zawierającej PET, który charakteryzuje się tym, że

a) prowadzi się obróbkę przędzy lub tkaniny zdefiniowanym powyżej wariantem kutynazy i b) następnie prowadzi się obróbkę przędzy lub tkaniny środkiem wykończalniczym wybranym z grupy obejmującej środki zmiękczające, żywice przeciwmnące, środki antyelektrostatyczne, środki zapobiegające osadzaniu się brudu.

Kutynaza grzybowa

Macierzystą kutynazą jest kutynaza grzybowa ze szczepu DSM 1800 H. insolens, należąca do kutynaz grzybów strzępkowych, np. natywnych dla szczepu Humicola lub Fusarium, szczególnie H. insolens lub F. solani pisi.

Sekwencję aminokwasów kutynazy szczepu DSM 1800 H. insolens oraz kodującą ją sekwencję DNA przedstawiono jako SEQ ID NO: 2 oraz SEQ ID NO: 1 w US 5827719. Układ numeracji stosowany w niniejszym opisie dla kutynazy H. insolens jest oparty na dojrzałym peptydzie, jak przedstawiono w SEQ ID NO: 2.

Sekwencję aminokwasów kutynazy F. solani pisi przedstawiono jako sekwencję dojrzałego peptydu na fig. 1D w WO 94/14964. Układem numeracji stosowanym w niniejszym opisie dla kutynazy F. solani pisi jest ten stosowany w WO 94/14964; obejmuje on prosekwencję przedstawioną na tej fig. 1D; a zatem dojrzałą kutynazą są pozycje 16 - 214.

Macierzysta kutynaza może posiadać sekwencję aminokwasów, która jest w co najmniej 50% (szczególnie w co najmniej 70% lub co najmniej 80%) homologiczna do kutynazy szczepu DSM 1800 H. insolens. Macierzystą kutynazą może być szczególnie taka, dla której można wykonać dopasowanie sekwencji do sekwencji kutynazy szczepu DSM 1800 H. insolens.

Nomenklatura aminokwasów i zmian

W opisie i zastrzeżeniach aminokwasy określa się ich kodem jednoliterowym. Określony aminokwas w sekwencji identyfikuje się przez jego kod jednoliterowy i pozycję, np. Q1 wskazuje Gln (glutaminę) w pozycji 1, to jest na N-końcu.

PL 199 746 B1

Nomenklatura stosowana w tym opisie do definiowania podstawień jest zasadniczo taka jak opisana w WO 92/05249. Zatem R51P wskazuje podstawienie R (Arg) w pozycji 51 przez P (Pro).

Homologia i dopasowywanie

Dla celów niniejszego wynalazku, stopień homologii można odpowiednio określać zgodnie z metodą opisaną w Needleman, S.B. i Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 43345, z następującymi ustawieniami porównywania sekwencji polipeptydów: punkty ujemne za utworzenie przerwy: 3,0 i punkty ujemne za wydłużenie przerwy: 0,1. Określenia można dokonać stosując program komputerowy, taki jak GAP dostarczony w pakiecie oprogramowania GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, wersja 8, sierpień 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711).

Dwie dane sekwencje można dopasować zgodnie z metodą opisaną w Needleman (powyżej) stosując te same parametry. Można tego dokonać stosując program GAP (powyżej).

Trójprzestrzenna struktura kutynazy

Strukturę kutynazy H. insolens określono zgodnie z zasadami metod krystalografii rentgenowskiej, podanymi np. w X-Ray Structure Determination, Stout, G.K. i Jensen, L.H., John Wiley & Sons, Inc. NY, 1989. Współrzędne strukturalne dla określonej struktury krystalicznej o rozdzielczości 2,2 x 10^-10 m z zastosowaniem metody zastąpień izomorficznych podano na fig. 1 w standardowym formacie PDB (Protein Data Bank, Brookhaven National Laboratory, Brookhaven, CT).

Strukturę kutynazy F. solani pisi opisano w Martinez i inni (1992) Nature 356, 615-618. Struktury przestrzenne kutynaz F. solani pisi i H. insolens porównano w postaci modeli komputerowych przedstawionych na fig. 2.

Należy zauważyć, że ogólne struktury przestrzenne kutynaz grzybowych są bardzo podobne i metodą krystalografii rentgenowskiej wykazano, że są wysoce homologiczne. Z modelu komputerowego przedstawionego na fig. 2 wynika, że podobieństwa pomiędzy kutynazami z F. solani pisi i H. insolens są wyraź ne. Zatem modyfikacje typu wskazanego dla jednej kutynazy grzybowej będ ą również funkcjonowały w przypadku innych kutynaz grzybowych.

Podstawienia w pobliżu N-końca

Wariant według wynalazku posiada jedno lub większą liczbę podstawień aminokwasów w pobliżu N-końca. Podstawienie znajduje się w obrębie 17 x 10^-10 m (np. w obrębie 12 x 10^-10 m) i/lub w obrę bie 20 pozycji (np. w obrę bie 15 pozycji) od N-koń ca. Odległ o ść od N-koń ca należ y obliczać pomiędzy atomami Ca aminokwasów i oblicza się ją od aminokwasu w strukturze krystalicznej (to jest widocznego w strukturze rentgenograficznej).

W kutynazie szczepu DSM 1800 H. insolens, dwa aminokwasy N-końcowe (Q1 i L2, to jest Gln i Leu w pozycjach 1 i 2) nie są widoczne w strukturze rentgenograficznej, tak że odległość należy obliczać od aminokwasu G3. Aminokwasy w obrębie 17 x 10^-10 m obejmują pozycje 3-12, 18, 20-60, 62-64, 82, 85-86, 100-108, 110-111, 130-132, 174, 176-182, 184-185, 188 i 192. Te w obrębie 12 x 10^-10 m obejmują pozycje 3-8, 22-27, 30-47, 53-59, 102, 177 i 180-181.

W kutynazie F. solani pisi, N-końcowy aminokwas G17 jest widoczny w strukturze rentgenograficznej. Aminokwasy w obrębie 17 x 10^-10 m obejmują pozycje 17-26, 34-75, 77-79, 101, 115, 117-119, 147, 191-197, 199-200 i 203. Te w obrębie 12 x 10^-10 m obejmują pozycje 17-22, 38, 40, 45-58, 60, 65 i 70-72.

Warianty według wynalazku wykazują polepszoną stabilność termiczną w porównaniu z enzymem macierzystym. Stabilność termiczną można określić na podstawie temperatury denaturacji metodą DSC (różnicowej kalorymetrii skaningowej), np. jak opisano w przykładzie, np. przy pH 8,5 przy szybkości skanowania 90 K/godzinę. Warianty mogą mieć temperaturę denaturacji o co najmniej 5°C wyższą niż enzymu macierzystego.

Całkowita liczba podstawień w powyższych regionach zazwyczaj wynosi 1-10, np. 1-5 podstawień. Ponadto wariant kutynazy według wynalazku może ewentualnie obejmować inne modyfikacje enzymu macierzystego, zazwyczaj 10 lub mniej, np. 5 lub mniej zmian (podstawień, delecji lub insercji), poza powyższymi regionami. Zatem całkowita sekwencja aminokwasów wariantu zazwyczaj posiada 1-20, np. 1-10, zmian w porównaniu z sekwencją kutynazy macierzystej.

Powierzchnia dostępna dla rozpuszczalnika

Można dokonać jednego lub większej liczby podstawień eksponowanych reszt aminokwasów, to jest reszt mających powierzchnie dostępną dla rozpuszczalnika. Obliczeń można dokonać stosując program „dssp (wersja z października 1988 r.), opisany w W. Kabsch i C. Sander, Biopolymers, 22 (1983), str. 2577-2637.

PL 199 746 B1

W kutynazie szczepu DSM 1800 H. insolens nastę pują ce aminokwasy są poło ż one w obrę bie 17 x 10^-10 m od G3 na N-końcu i posiadają wyższą od 0 dostępność dla rozpuszczalnika: 3-12, 18, 26-33, 36-38, 40-45, 47-56, 59-60, 62-64, 82, 85-86, 104-105, 174, 176-179, 181-182, 192.

Specyficzne podstawienia

Podstawieniem w pobliżu N-końca może być w szczególności podstawienie, które zwiększa ładunek elektrostatyczny, to jest podstawienie aminokwasu o ładunku ujemnym aminokwasem obojętnym lub posiadającym ładunek dodatni, bądź podstawienie aminokwasu obojętnego aminokwasem o ł adunku dodatnim. Tak wię c resztę aminokwasu o ł adunku ujemnym w pozycji odpowiadają cej pozycji E6, E10, E30, E47, D63, E82 i/lub E179 w kutynazie szczepu DSM 1800 Humicola insolens można podstawiać aminokwasem obojętnym lub dodatnim, np. R, K, Y, H, Q lub N. Pewnymi specyficznymi podstawieniami są te odpowiadające E6Q/N, E10Q/N, E47K/R, lub E179Q/N. Także resztę aminokwasu obojętnego w pozycji odpowiadającej N7, S11, N44 lub N52 kutynazy H. insolens można podstawiać aminokwasem obdarzonym ładunkiem dodatnim (R, K lub H).

Innym przykładem podstawienia w pobliżu N-końca jest podstawienie resztą Pro, np. podstawienie odpowiadające A14P lub R51P w kutynazie szczepu DSM 1800 Humicola insolens.

Specyficzne warianty

Poniżej podano niektóre przykłady wariantów kutynazy H. insolens. Odpowiednie warianty można wytwarzać na podstawie innych macierzystych kutynaz.

R51P

E6N/Q + L138I

A14P + E47K

E47K

E179N/Q

E6N/Q + E47K + R51P

A14P + E47K + E179N/Q

E47K + E179N/Q

E47K + D63N

E6N/Q + E10N/Q + A14P + E47K + R51P + E179N/Q

E6N/Q + A14P + E47K + R51P + E179N/Q

Q1P + L2V + S11C + N15T + F24Y + L46I + E47K

Zastosowanie wariantu kutynazy

Wariant kutynazy według wynalazku można stosować np. w procesie enzymatycznej hydrolizy cyklicznych oligomerów poli(tereftalanu etylenu), takich jak cykliczny tri(tereftalan etylenu), o skróconej nazwie c3ET.

W szczególności można go stosować do usuwania takich cyklicznych oligomerów z zawierającej poliester tkaniny lub przędzy poprzez obróbkę tkaniny lub przędzy wariantem kutynazy, a następnie płukanie tkaniny lub przędzy wodnym roztworem o pH w zakresie od około 7 do około 11. Obróbkę poliestru dogodnie prowadzi się w temperaturze wyższej od temperatury zeszklenia c3ET (około 55°C), a niższej od temperatury zeszklenia poliestru (około 70°C). Zatem obróbkę można odpowiednio prowadzić w temperaturze 50 - 80°C, np. w temperaturze 60 -75°C. Proces można prowadzić analogicznie do WO 97/27237.

Wariant kutynazy można stosować do obróbki materiału włókienniczego zawierającego poliester, np. PET (polimer glikolu etylenowego i kwasu tereftalowego), P3GT (polimer 1,3-propanodiolu i kwasu tereftalowego) lub mieszaninę poliester/bawełna. Obróbka może nadać poliestrowemu materiałowi włókienniczemu takie zalety, jak lepsza odporność na zużycie i wygoda, zwiększona przepuszczalność wody, obniżone właściwości antyelektrostatyczne, polepszony chwyt i miękkość, zmienione właściwości wtórnego osadzania się i/lub wyraźniejsze barwy.

Wariant kutynazy można stosować do polepszania specjalnego wykończenia przędzy lub tkaniny zawierającej PET poprzez obróbkę wariantem kutynazy, a następnie obróbkę środkiem wykończalniczym, takim jak środek zmiękczający, żywica przeciwmnąca, środek antyelektrostatyczny, środek przeciwplamowy lub środki osłabiające bezzmarszczkowe trwałe zagniecenia lub odporności na ogień. Obróbka wariantem kutynazy może zwiększać liczbę grup funkcyjnych na powierzchni, co można wykorzystać do zastosowania dodatkowego specjalnego wykończenia. Przykłady środków wykończalniczych opisano w „SENSHOKU SIAGEKAKO BENRAN, opublikowanym 15 października 1998 r. przez Nihon Seni Sentaa KK.

PL 199 746 B1

Wariant kutynazy według wynalazku jest również użyteczny w detergentach, do których można go wprowadzać dla ułatwienia usuwania tłustych plam, jak opisano w WO 94/03578 i WO 94/14964. Dodawanie wariantu kutynazy do detergentów do prania może zmniejszać przykry zapach odzieży, nasilający się podczas kilku cykli prania/noszenia.

Wariant kutynazy można również stosować do degradacji i ponownego wprowadzania do obiegu poliestru, takiego jak polikaprolakton (PCL), politereftalan etylenu (PET), polikwas mlekowy, polibursztynian butylenu i kopolimer poli(kwasu hydroksymasłowego) i poli(kwasu hydroksywalerianowego), np. błon lub butelek, np. jak opisano w JP-A 5-344897.

Wariant kutynazy można również stosować w innych znanych zastosowaniach lipaz i kutynaz, np. w przemyśle piekarskim (np. jak opisano w WO 94/04035 i EP 585988), w przemyśle papierniczym (np. do usuwania smoły, patrz EP 374700) oraz w przemysłach skórzanym, przerobu wełny i pokrewnych (np. do odtłuszczania skór zwierzęcych, skór baranich lub wełny) oraz w innych zastosowaniach obejmujących usuwanie tłuszczów/odtłuszczanie. W postaci immobilizowanej można go stosować w przemyśle tłuszczowym i olejowym, jako katalizator w syntezie organicznej (np. w reakcjach estryfikacji, transestryfikacji lub hydrolizy estrów).

Barwienie poliestru

Jak podano powyżej wynalazek dotyczy sposobu barwienia tkaniny lub przędzy poliestrowej. Zgodnie z tym sposobem tkaninę lub przędzę najpierw poddaje się obróbce kutynazą, np. w ciągu 12-48 godzin w temperaturze 50-70°C lub 65-70°C, pH 7-10, a następnie barwi barwnikiem, np. barwnikiem reaktywnym, barwnikiem zawiesinowym lub barwnikiem kationowym. Barwnikiem reaktywnym może być barwnik, który reaguje z grupami OH lub COOH, np. o strukturze chromofor-NHPhSO2CH2CH2OSO3Na. Barwienie można prowadzić w temperaturze 40-80°C, np. w ciągu 20-60 minut.

Kutynazą może być kutynaza stabilna termicznie, mająca temperaturę denaturacji termicznej, Td, przy pH 8,5, która jest o co najmniej 5°C wyższa niż kutynazy macierzystej, np. o 7-10°C wyższa, np. wynoszącą 65°C lub wyższą. Pomiaru można dokonać metodą DSC, jak opisano w przykładzie podanym w tym opisie.

Środek powierzchniowo czynny

W obróbce tkaniny lub przę dzy, do poprawy kontaktu z enzymem moż na stosować zwykł y ś rodek zwilżający i/lub środek dyspergujący. Środkiem zwilżającym może być niejonowy środek powierzchniowo czynny, np. etoksylowany alkohol tłuszczowy. Bardzo użytecznym środkiem zwilżającym jest ester etoksylowanego i propoksylowanego kwasu tłuszczowego, taki jak Berol 087 (produkt Akzo Nobel, Szwecja).

Środek dyspergujący można odpowiednio wybrać spośród niejonowych, anionowych, kationowych, amfolitycznych lub amfeterycznych środków powierzchniowo czynnych. Bardziej szczegółowo, środek dyspergujący można wybrać spośród karboksymetylocelulozy, hydroksypropylocelulozy, alkiloarylosulfonianów, siarczanów alkoholi długołańcuchowych (pierwsze- i drugorzędowych siarczanów alkilowych), sulfonowanych olefin, sulfonowanych monoglicerydów, sulfonowanych eterów, sulfobursztynianów, sulfonowanych eterów metylowych, alkanosulfonianów, estrów fosforanowych, izotionianów alkilowych, acylosarkozynianów, taurynianów alkilowych, fluorowych związków powierzchniowo czynnych, kondensatów alkoholi tłuszczowych i alkilofenoli, kondensatów kwasów tłuszczowych, kondensatów tlenku etylenu z aminą, kondensatów tlenku etylenu z amidem, estrów sacharozy, estrów sorbitanu, alkiloamidów, tlenków amin tłuszczowych, etoksylowanych monoamin, etoksylowanych diamin, etoksylatów alkoholi oraz ich mieszanin. Bardzo użytecznym środkiem dyspergującym jest etoksylat alkoholu, taki jak Berol 08 (produkt Akzo Nobel, Szwecja).

Sposoby wytwarzania wariantów kutynazy

Wariant kutynazy według wynalazku można wytwarzać znanymi sposobami, np. jak opisano w WO 94/14963 lub WO 94/14964 (Unilever). Poniż ej opisano sposoby klonowania kodują cych kutynazę sekwencji DNA, a następnie sposoby tworzenia mutacji w określonych miejscach sekwencji kodującej kutynazę.

Klonowanie sekwencji DNA kodującej kutynazę

Sekwencję DNA kodującą kutynazę można wyizolować z dowolnej komórki lub mikroorganizmu wytwarzających daną kutynazę, stosując różne sposoby dobrze znane w tej dziedzinie. Najpierw należy skonstruować bibliotekę genomowego DNA i/lub cDNA, wykorzystując chromosomalny DNA lub matrycowy RNA z organizmu, który wytwarza kutynazę przeznaczoną do badania. Następnie, jeśli sekwencja aminokwasów kutynazy jest znana, można zsyntetyzować wyznakowaną sondę oligonukleotydową i zastosować ją do identyfikacji kodujących kutynazę klonów z genomowej biblioteki przyPL 199 746 B1 gotowanej z odpowiedniego organizmu. Alternatywnie wyznakowaną sondę oligonukleotydową, zawierającą sekwencje homologiczne do innego znanego genu kutynazy, można zastosować jako sondę do identyfikacji klonów kodujących kutynazę, stosując warunki hybrydyzacji i odmywania o niższej ostrości.

Jeszcze inny sposób identyfikowania klonów kodujących kutynazę może obejmować wstawianie fragmentów genomowego DNA do wektora ekspresyjnego, takiego jak plazmid, transformowanie kutynazo-ujemnych bakterii uzyskaną biblioteką genomowego DNA, a następnie wysiewanie transformowanych bakterii na agar zawierający substrat dla kutynazy (to jest maltozę), w ten sposób umożliwiając identyfikację klonów, w których zachodzi ekspresja kutynazy.

Alternatywnie sekwencję DNA kodującą enzym można wytworzyć syntetycznie ustalonymi standardowymi sposobami, np. metodą amidofosforynową, opisaną w S. L. Beaucage i M. H. Caruthers, (1981), Tetrahedron Letters 22, str. 1859-1869, lub sposobem opisanym przez Matthesa i innych (1984), EMBO J. 3, str. 801-805. W metodzie amidofosforynowej syntetyzuje się oligonukleotydy, np. w automatycznym syntezatorze DNA, oczyszcza je, hybrydyzuje, liguje i klonuje w odpowiednich wektorach.

Wreszcie sekwencja DNA może mieć mieszane pochodzenie genomowe i syntetyczne, mieszane pochodzenie syntetyczne i cDNA lub mieszane pochodzenie genomowe i cDNA, po wytworzeniu przez ligację fragmentów pochodzenia syntetycznego, genomowego lub cDNA (jak jest to właściwe fragmentów odpowiadających różnym częściom całej sekwencji DNA) zgodnie ze standardowymi sposobami. Sekwencję DNA można również wytworzyć drogą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), stosując specyficzne startery, np. jak opisano w US 4683202 lub R. K. Saiki i inni, (1988), Science 239, 1988, str. 487-491.

Ukierunkowana mutageneza

Po wyizolowaniu sekwencji DNA kodującej kutynazę oraz zidentyfikowaniu pożądanych miejsc mutacji, można wprowadzać mutacje stosując syntetyczne oligonukleotydy. Oligonukleotydy te zawierają sekwencje nukleotydów flankujące miejsca pożądanych mutacji. W szczególnym sposobie, w wektorze obejmują cym gen kutynazy tworzy się jednoniciową przerwę w DNA sekwencji kodują cej kutynazę. Następnie hybrydyzuje się syntetyczny nukleotyd, niosący pożądaną mutację, z homologiczną częścią jednoniciowego DNA. Pozostającą przerwę następnie wypełnia się stosując polimerazę DNA I (fragment Klenowa) i konstrukt liguje się stosując ligazę T4. Konkretny przykład tego sposobu opisano w Morinaga i inni, (1984), Biotechnology 2, str. 646-639. W US 4760025 ujawniono wprowadzanie oligonukleotydów kodujących kilka mutacji poprzez dokonanie nieznacznych zmian kasety ekspresyjnej. Jednakże metodą Morinaga'ego można wprowadzać nawet jeszcze większą różnorodność mutacji jednocześnie, ponieważ można wprowadzać liczne oligonukleotydy o różnej długości.

Inny sposób wprowadzania mutacji do kodujących kutynazę sekwencji DNA opisano w Nelson i Long, (1989), Analytical Biochemistry 180, str. 147-151. Obejmuje on trójetapowe tworzenie fragmentu otrzymywanego drogą PCR, zawierającego pożądaną mutację wprowadzoną z zastosowaniem chemicznie zsyntetyzowanej nici DNA jako jednego ze starterów w reakcjach PCR. Z powstałego w reakcji PCR fragmentu moż na wyizolować zawierający mutację fragment DNA przez strawienie endonukleazami restrykcyjnymi i ponownie wstawić go do plazmidu ekspresyjnego.

Ekspresja wariantów kutynazy

Zgodnie z wynalazkiem można przeprowadzić ekspresję w postaci enzymu sekwencji DNA kodującej wariant wytworzony opisanymi powyżej sposobami, względnie dowolnymi alternatywnymi znanymi sposobami, stosując wektor ekspresyjny, który zazwyczaj obejmuje sekwencje kontrolujące, obejmujące promotor, operator, miejsce wiązania rybosomów, sygnał inicjacji translacji i ewentualnie gen represora lub geny różnych aktywatorów.

Wektor ekspresyjny

Zrekombinowanym wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję DNA kodującą wariant kutynazy według wynalazku może być dowolny wektor, który można dogodnie poddawać procedurom rekombinacji DNA, a wybór wektora często będzie zależeć od komórki gospodarza, do której ma on zostać wprowadzony. Wektorem może być wektor, który po wprowadzeniu do komórki gospodarza zostaje włączony do genomu komórki gospodarza i ulega replikacji razem z chromosomem(ami), do którego(ych) został włączony. Przykłady odpowiednich wektorów ekspresyjnych obejmują pMT838.

Promotor

Sekwencja DNA w wektorze powinna być funkcyjnie połączona z sekwencją odpowiedniego promotora. Promotorem może być dowolna sekwencja DNA, która wykazuje aktywność transkrypcyjną w wybranej komórce gospodarza, przy czym może ona pochodzić z genów kodujących białka albo homologiczne, albo heterologiczne wobec komórki gospodarza.

PL 199 746 B1

Przykładami promotorów odpowiednich do kierowania transkrypcją sekwencji DNA kodującej wariant kutynazy według wynalazku, zwłaszcza w gospodarzu bakteryjnym, są promotor operonu lac

E. coli, promotory genu agarazy dagA Streptomyces coelicolor, promotory genu α-amylazy (amyL) Bacillus licheniformis, promotory genu maltogennej amylazy (amyM) Bacillus stearothermophilus, promotory α-amylazy (amyQ) Bacillus amyloliquefaciens, promotory genów xy1A i xy1B Bacillus subtilis itp. Przykładami promotorów przydatnych do transkrypcji w gospodarzach grzybowych są te pochodzące z genu kodującego amylazę TAKA A. oryzae, promotor TPI (izomerazy triozofosforanowej) z S. cerevisiae (Alber i inni (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1, str. 419-434), proteinazy aspartylowej Rhizomucor miehei, obojętnej α-amylazy A niger, stabilnej w kwasach α-amylazy A niger, glukoamylazy A. niger, lipazy Rhizomucor miehei, alkalicznej proteazy A. oryzae, izomerazy triozofosforanowej A. oryzae lub acetamidazy A. nidulans.

Wektor ekspresyjny

Wektor ekspresyjny według wynalazku może również obejmować odpowiedni terminator transkrypcji i, w przypadku organizmów eukariotycznych, sekwencje poliadenylacji funkcyjnie połączone z sekwencją DNA kodującą wariant kutynazy według wynalazku. Sekwencje terminacji i poliadenylacji mogą odpowiednio pochodzić z tego samego źródła co promotor.

Wektor może ponadto obejmować sekwencję DNA umożliwiającą replikację wektora w danej komórce gospodarza. Przykładami takich sekwencji są miejsca początku replikacji plazmidów pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 i pIJ702.

Wektor może również obejmować marker selekcyjny, np. gen, którego produkt komplementuje defekty komórki gospodarza, taki jak geny dal z B. subtilis lub B. licheniformis, bądź gen, który nadaje oporność na antybiotyk, taką jak oporność na ampicylinę, kanamycynę, chloramfenikol lub tetracyklinę. Ponadto wektor może obejmować markery selekcyjne Aspergillus, takie jak amdS, argB, niaD i sC, marker powodujący wzrost oporności na higromycynę, względnie selekcję można przeprowadzić przez kotransformację, np. jak opisano w WO 91/17243.

Procedury stosowane do ligacji odpowiednio konstruktu DNA według wynalazku kodującego wariant kutynazy, promotora, terminatora i innych elementów, oraz do wstawiania ich do odpowiednich wektorów zawierających informację konieczną do replikacji, są dobrze znane fachowcom (patrz np. Sambrook i inni, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor, 1989).

Komórki gospodarza

Komórkę według wynalazku, albo zawierającą konstrukt DNA, albo wektor ekspresyjny według wynalazku, jak zdefiniowano powyżej, korzystnie stosuje się jako komórkę gospodarza w rekombinacyjnym wytwarzaniu wariantu kutynazy według wynalazku. Komórka może być transformowana kodującym wariant konstruktem DNA według wynalazku, dogodnie przez włączenie konstruktu DNA (w jednej lub większej liczbie kopii) do chromosomu gospodarza. To włączenie ogólnie uważa się za korzystne, ponieważ bardziej prawdopodobne jest stabilne utrzymywanie konstruktu w komórce. Konstrukty DNA można włączać do chromosomu gospodarza zgodnie ze znanymi sposobami, np. przez rekombinację homologiczną lub heterologiczną. Alternatywnie komórkę można transformować wektorem ekspresyjnym, jak opisano powyżej w odniesieniu do różnych rodzajów komórek gospodarza.

Komórką według wynalazku może być komórka organizmu wyższego, takiego jak ssak lub owad, ale korzystnie jest ona komórką mikroorganizmu, np. komórką bakteryjną lub grzybową (w tym drożdżową).

Przykładami odpowiednich bakterii są bakterie Gram-dodatnie, takie jak Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thurinqiensis lub Streptomyces lividans bądź Streptomyces murinus, albo bakterie Gram-ujemne, takie jak E. coli. Transformację bakterii można osiągnąć np. przez transformację protoplastów lub zastosowanie kompetentnych komórek, w sposób znany per se.

Organizm drożdży można korzystnie wybrać spośród gatunków Saccharomyces lub Schizosaccharomyces, np. Saccharomyces cerevisiae.

Komórką gospodarza może być także grzyb strzępkowy, np. szczep należący do gatunków Aspergillus, najkorzystniej Aspergillus oryzae lub Aspergillus niger, albo szczep Fusarium, taki jak szczep Fusarium oxysporium, Fusarium graminearum (w stadium doskonałym nazywany Gribberella zeae, uprzednio Sphaeria zeae, synonim dla Gibberella roseum i Gibberella roseum f. sp. cerealis) lub Fusarium sulphureum (w stadium doskonałym nazywany Gibberella puricaris, synonim dla Fusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucium, Fusarium roseum i Fusarium roseum var. graminearum), Fusarium cerealis (synonim dla Fusarium crokkwellnse) lub Fusarium venenatum.

PL 199 746 B1

W korzystnej postaci wynalazku, komórką gospodarza jest szczep z niedoborem proteaz lub pozbawiony proteaz.

Może to być np. wykazujący niedobór proteaz szczep Aspergillus oryzae JaL 125 z usuniętym genem alkalicznej proteazy o nazwie „alp. Szczep ten opisano w WO 97/35956 (Novo Nordisk).

Komórki grzybów strzępkowych można transformować sposobem obejmującym tworzenie protoplastów i ich transformację, a następnie regenerację ścian komórkowych w sposób znany per se. Zastosowanie Aspergillus jako mikroorganizmu gospodarza opisano w EP 238023 (Novo Nordisk A/S), którego treść włączono do niniejszego opisu jako źródło literaturowe.

Wytwarzanie wariantu kutynazy drogą hodowli transformanta

Jak podano powyżej, wynalazek dotyczy, między innymi, sposobu wytwarzania wariantu kutynazy według wynalazku, który to sposób obejmuje hodowlę komórki gospodarza w warunkach sprzyjających wytwarzaniu wariantu oraz odzyskiwanie wariantu z komórek i/lub pożywki hodowlanej.

Pożywką stosowaną do hodowli komórek może być dowolna znana pożywka odpowiednia dla hodowania danej komórki gospodarza oraz uzyskiwania ekspresji wariantu kutynazy według wynalazku. Odpowiednie pożywki są dostępne w handlu od dostawców, względnie można je przygotowywać zgodnie z opublikowanymi przepisami (np. w sposób opisany w katalogach American Type Culture Collection).

Wariant kutynazy wydzielany z komórek gospodarza można bez trudu odzyskiwać z pożywki hodowlanej zgodnie z dobrze znanymi procedurami, obejmującymi oddzielanie komórek od pożywki przez wirowanie lub sączenie oraz wytrącanie białkowych składników pożywki z użyciem soli, takiej jak siarczan amonu, a następnie stosowanie procedur chromatograficznych, takich jak chromatografia jonowymienna, chromatografia powinowactwa itp.

Ekspresja wariantu w roślinach

Transgeniczne rośliny, ich części oraz komórki roślinne można wytwarzać poprzez transformowanie sekwencją DNA kodującą wariant według wynalazku, tak aby zachodziła ekspresja i wytwarzanie tego enzymu w ilościach umożliwiających jego odzyskiwanie. Enzym można odzyskiwać z rośliny lub części rośliny. Alternatywnie roślinę lub część rośliny zawierającą zrekombinowany enzym można stosować jako takie.

Roślina transgeniczna może być dwuliścienna lub jednoliścienna. Przykładami roślin jednoliściennych są trawy, takie jak wiechliny łąkowej (wiklina, Poa), trawy pastewne, takie jak kostrzewa, życica, trawy stepowe, takie jak Agrostis (mietlica), oraz zboża, np. pszenica, owies, żyto, jęczmień, ryż, sorgo i kukurydza.

Przykładami roślin dwuliściennych są tytoń, strączkowe rośliny paszowe, takie jak łubin, ziemniak, burak cukrowy, groch, fasola i soja, oraz rośliny krzyżowe (rodzina Brassicaceae), takie jak kalafior, rzepak i blisko spokrewniony organizm modelowy Arabidopsis thaliana.

Przykładami części roślin są łodyga, kalus, liście, korzenie, owoce, nasiona i bulwy. W tym kontekście, za część rośliny uważa się także określone tkanki roślinne, takie jak chloroplast, apoplast, mitochondria, wakuole, peroksysomy i cytoplazma. Ponadto za część rośliny uważa się każdą komórkę, pochodzącą z dowolnej tkanki.

Zakres wynalazku obejmuje także potomstwo takich roślin, części roślin i komórek roślinnych.

Transgeniczną roślinę lub komórkę roślinną, w której zachodzi ekspresja wariantu według wynalazku, można skonstruować zgodnie ze znanymi sposobami. W skrócie, roślinę lub komórkę roślinną tworzy się przez wprowadzenie jednego lub większej liczby konstruktów ekspresyjnych kodujących enzym według wynalazku do genomu rośliny gospodarza oraz rozmnażanie otrzymanej zmodyfikowanej rośliny lub komórki roślinnej dla otrzymania transgenicznej rośliny lub komórki roślinnej.

Dogodnie konstruktem ekspresyjnym jest konstrukt DNA, który obejmuje gen kodujący enzym według wynalazku w funcjonalnym połączeniu z odpowiednimi sekwencjami regulującymi, wymaganymi do ekspresji genu w wybranej roślinie lub części rośliny. Ponadto konstrukt ekspresyjny może obejmować marker selekcyjny użyteczny do identyfikowania komórek gospodarza, do których został włączony konstrukt ekspresyjny, oraz sekwencje DNA konieczne do wprowadzania konstruktu do danej rośliny (te ostatnie zależą od zamierzonego sposobu wprowadzania DNA).

Wyboru sekwencji regulujących, takich jak sekwencje promotora i terminatora, oraz ewentualnie sekwencje sygnałowe lub kierujące, dokonuje się np. na podstawie tego kiedy, gdzie i jaka ekspresja enzymu jest pożądana. Przykładowo ekspresja genu kodującego enzym według wynalazku może być konstytutywna lub indukowalna, bądź może być specyficzna rozwojowo, w zależności od stadium, lub tkankowo, a produkt genu może być ukierunkowany wobec specyficznej tkanki lub części rośliny, takiej jak nasiona lub liście. Sekwencje regulujące opisano np. w Tague i inni, Plant Phys., 86, 506, 1988.

PL 199 746 B1

Do konstytutywnej ekspresji można stosować promotor 35S-CaMV (Franck i inni, 1980, Cell 21: 285-294). Promotorami specyficznymi wobec narządu mogą być np. promotory z tkanek spichrzowych, takich jak nasiona, bulwy ziemniaczane i owoce (Edwards i Coruzzi, 1990. Annu. Rev. Genet. 24: 275-303) lub z tkanek aktywnych metabolicznie, takich jak tkanki merystematyczne (Ito i inni, 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), promotor specyficzny dla nasion, taki jak promotor gluteliny, prolaminy, globuliny lub albuminy z ryżu (Wu i inni, Plant and Cell Physiology, tom 39, nr 8, str. 885-889 (1998)), promotor leguminy B4 Vicia faba oraz genu nieznanego białka nasion Vicia faba, opisany w Conrad, U. i inni, Journal of Plant Physiology, tom 152, nr 6, str. 708-711 (1998)), promotor biał ka ciał oleistych nasion (Chen i inni, Plant and cell physiology, tom 39, nr 9, str. 935-941 (1998)), promotor białka zapasowego napA z Brassica napus, lub dowolny znany promotor specyficzny dla nasion, np. jak opisano w WO 91/14772. Ponadto promotorem może być promotor specyficzny dla liści, taki jak promotor rbcs z ryżu lub pomidora (Kyozuka i inni, Plant Physiology, tom 102, nr 3, str. 9911000 (1993), promotor genu metylotransferazy adeninowej wirusa chlorelli (Mitra, A. i Higgins, D.W., Plant Molecular Biology, tom 26, nr 1, str. 85-93 (1994) lub promotor genu aldP z ryżu (Kagaya i inni, Molecular and General Genetics, tom 248, nr 6, str. 668-674 (1995), bądź promotor indukowany ranami, taki jak promotor pin2 ziemniaka (Xu i inni, Plant Molecular Biology, tom. 22, nr 4, str. 573-588 (1993).

Dla osiągnięcia wyższej ekspresji enzymu w roślinie można stosować element wzmacniający promotor. Przykładowo elementem wzmacniającym promotor może być intron, który jest umieszczony pomiędzy promotorem a sekwencją nukleotydową kodującą enzym. Przykładowo Xu i inni (literatura cytowana), ujawnili stosowanie do wzmacniania ekspresji pierwszego intronu genu aktyny 1 ryżu.

Gen markera selekcyjnego i dowolną inną część konstruktu ekspresyjnego można wybrać spośród tych dostępnych w tej dziedzinie.

Konstrukt DNA wprowadza się do genomu rośliny zgodnie ze zwykłymi znanymi sposobami, włącznie z transformacją za pośrednictwem Agrobacterium, transformacją za pośrednictwem wirusów, mikroiniekcją, bombardowaniem cząstkami, transformacją biolistyczną oraz elektroporacją (Gasser i inni, Science, 244, 1293; Potrykus, Bio/Techn. 8, 535, 1990; Shimamoto i inni, Nature, 338, 274, 1898).

Obecnie sposobem z wyboru tworzenia transgenicznych roślin dwuliściennych jest przenoszenie genów za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (dla zapoznania się z przeglądem patrz Hooykas i Schilperoort, 1992. Plant Mol. Biol. 19: 15-38), jednak można również stosować je do transformowania roślin jednoliściennych, chociaż dla tych roślin ogólnie korzystne są inne sposoby transformacji. Obecnie sposobem z wyboru tworzenia transgenicznych roślin jednoliściennych jest bombardowanie cząstkami (mikroskopijnymi cząstkami złota lub wolframu powleczonymi transformującym DNA) zarodkowego kalusa lub rozwijających się zarodków (Christou, 1992. Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994. Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil i inni, 1992. Bio/Technology 10: 667-674). Alternatywny sposób transformowania roślin jednoliściennych jest oparty na transformacji protoplastów, jak opisano w Omirulleh S. i inni, Plant Molecular Biology, tom 21, nr 3, str. 415-428 (1993).

Po transformacji selekcjonuje się transformanty mające włączony konstrukt ekspresyjny i regeneruje się całe rośliny zgodnie z dobrze znanymi sposobami.

Materiały i metody

Plazmidy pJSO026

Jest to wektor ekspresyjny S. cerevisiae, opisany w WO 97/07205 oraz w J.S. Okkels, (1996) „A URA3-promotor deletion in a pYES vector increases the expression level of fungal lipase in Saccharomyces cerevisiae. Recombinant DNA Biotechnology III: The Integration of Biological and Engineering Sciences, tom 782, Annals of the New York Academy of Sciences).

pFuku83

Jest to wektor wahadłowy drożdży i E. coli do ekspresji kutynazy H. insolens pod kontrolą promotora TPI, skonstruowany z pJSO026.

Substrat

BETEB

W niniejszym opisie stosuje się skróconą nazwę BETEB (benzoiloksy-etyleno-tereftaloiloksyetyleno-benzoiloksyl) dla tereftalanu bis(2-benzoiloksyetylu). Wytworzono go z estru bis(2-hydroksyetylowego) kwasu tereftalowego i kwasu benzoesowego.

PL 199 746 B1

Aktywność lipazy (LU)

Substrat dla lipazy przygotowuje się przez emulgowanie tributyryny (trimaślanu glicerylu) z użyciem gumy arabskiej jako emulgator. Po hydrolizie tributyryny w temperaturze 30°C przy pH 7 prowadzi się doświadczenie miareczkowania pH-statycznego. Jedna jednostka aktywności lipazy (1 LU) jest równa ilości enzymu zdolnej do uwalniania w standardowych warunkach 1 pmola kwasu masłowego/minutę.

Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC)

Roztwory próbki i wzorcowe ostrożnie odgazowuje się bezpośrednio przed wprowadzaniem próbek do kalorymetru (wzorzec: bufor bez enzymu). Roztwory próbki i wzorcowe (około 0,5 ml) wstępnie równoważy się termicznie w ciągu 20 minut w temperaturze 5°C. Skanowanie DSC prowadzi się od temperatury 5°C do 95°C przy szybkości skanowania około 90 K/godzinę. Temperaturę denaturacji określa się z dokładnością około ±1°C. Do doświadczeń odpowiedni jest aparat VP-DSC z MicroCal Inc.

Metody

Warunki PCR etap 1: 94°C, 120 sekund etap 2: 94°C, 60 sekund etap 3: 50°C, 60 sekund etap 4: 72°C, 150 sekund powrót do etapu 2, 35 cykli etap 5: 72°C, 480 sekund etap 6: 4°C, na stałe Krótki opis figur

Fig. 1 podaje współrzędne przestrzennej struktury kutynazy H. insolens.

Fig. 2 to komputerowy model przedstawiający przestrzenne struktury kutynaz z F. solani pisi (po lewej stronie) i H. insolens (po prawej stronie). Dla identyfikacji N-końcowego aminokwasu i stref wokół niego o średnicach 12 x 10^-10 m i 17 x 10^-10 m zastosowano różne kolory.

Fig. 3-6 ilustrują hydrolizę c3ET. Szczegóły podano w przykładach.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1. Wytwarzanie wariantów kutynazy

Sekwencję DNA kodującą kutynazę H. insolens otrzymano w sposób opisany w US 5827719 (Novo Nordisk) i stwierdzono, że ma sekwencję DNA przedstawioną tam SEQ ID NO: 1.

Warianty wytworzono przez umiejscowioną losową mutagenezę i selekcję dodatnich klonów przez inkubację w temperaturze 60°C w ciągu 1 dnia na płytkach z BETEB. Płytki z BETEB zawierały 200 ml/litr 500 mM buforu glicynowego (pH 8,5), 1,25 g/litr BETEB (rozpuszczonego w gorącym etanolu) i 20 g/litr agaru.

Wyizolowano trzy dodatnie warianty i określono ich sekwencje aminokwasów. Stwierdzono, że posiadają one następujące modyfikacje w porównaniu z macierzystą kutynazą H. insolens:

A14P + E47K

E47K

E179Q

P r z y k ł a d 2. Ukierunkowana mutacja

Wariant kutynazy H. insolens, posiadający podstawienia E6Q + E47K + R51P, wytworzono w następujący sposób.

Zaprojektowano parę starterów PCR, tak aby wprowadzić podstawienia aminokwasów, wykorzystując istniejące pobliskie miejsca restrykcyjne, jak przedstawiono poniżej (gwiazdka wskazuje wprowadzoną mutację):

Starter górny: E6Q F cgg cag ctg gga gcc atc c*ag aac

Pvu II

Starter dolny: E47K, R51P cgc cct gga tcc aga tgt tcg* gga tgt ggg act t*aa ggc BamH I

PCR prowadzono w opisanych powyżej warunkach z użyciem tych starterów i pFukuNL83 jako matrycy.

Fragment otrzymany w PCR oczyszczono z użyciem Spincolumn Clontech i strawiono Pvu II i BamH I.

PL 199 746 B1

Otrzymany fragment oczyszczono na żelu i zligowano z pFukuNL83, który został strawiony w tych samych miejscach enzymów restrykcyjnych.

P r z y k ł a d 3. Stabilność termiczna wariantów kutynazy

Warianty

W sposób opisany poniżej testowano stabilność termiczną kutynazy H. insolens i jej następują cych wariantów:

A14P + E47K

E47K

E179Q

E6Q + E47K + R51P

A14P + E47K + E179Q

E6Q + A14P + E47K + R51P + E179Q

E6Q + E10Q +A14P + E47K +R51P + E179Q

Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC)

Stabilność termiczną wariantów kutynazy badano metodą DSC przy pH 4,5 (50 mM bufor octanowy) i pH 8,5 (50 mM bufor glicyloglicynowy). Za temperaturę denaturacji termicznej, Td, przyjmowano wierzchołek piku denaturacji (głównego piku endotermicznego) na termogramach (zależność Cp i T) otrzymanych po ogrzewaniu roztworów enzymów przy stałej zaprogramowanej szybkości ogrzewania.

Stwierdzono, że macierzysta kutynaza ma Td 63°C przy pH 8,5. Stwierdzono, że sześć z powyższych wariantów ma Td 70-73°C, to jest poprawioną o 7-10°.

Stwierdzono, że macierzysta kutynaza ma Td 61°C przy pH 4,5. Stwierdzono, że pięć z powyższych wariantów ma Td 64-66°C, to jest poprawioną o 3-5°.

Hydroliza BETEB

Stabilność termiczną kutynazy H. insolens i dwóch z powyższych wariantów mierzono przez hydrolizę BETEB w podwyższonej temperaturze. W przypadku każdej kutynazy poniższą mieszaninę inkubowano w ciągu 17 godzin w różnych temperaturach w zakresie 55-70°C:

0,1 ml 0,5 M buforu glicyloglicynowego (pH 8,5)

0,1 ml 0,5% BETEB rozpuszczonego w etanolu

0,1 ml roztworu enzymu (około 25 LU/ml)

0,7 ml wody oczyszczonej w Milli Q

Po inkubacji mierzono stopień hydrolizy. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli.

	Wariant	Wariant	Enzym macierzysty
	27 LU/ml	25 LU/ml	24 LU/ml
55°C	98%	99%	72%
60°C	91%	83%	33%
65°C	66%	13%	7%

Wyniki te wyraźnie wykazują, że warianty wykazują polepszoną stabilność termiczną w porównaniu z kutynazą macierzystą.

Hydroliza BETEB

Stabilność termiczną kutynazy H. insolens i trzech z powyższych wariantów mierzono przez hydrolizę BETEB w temperaturze 60°C w ciągu 2 godzin. Hydrolizę prowadzono w powyższych warunkach, z tym wyjątkiem, że temperaturę ustalono na 60°C, a dawki kutynazy były różne. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli.

LU/ml	Wariant	Wariant	Wariant	Enzym macierzysty
0	0%	0%	0%	0%
10	97%	99%	9%	6%
20	98%	99%	74%
50	98%	94%	93%	15%
100	88%	69%	92%	34%
300				41%
600				63%
1200				82%

PL 199 746 B1

Wyniki wykazują znacznie wyższą hydrolizę w temperaturze 60°C w przypadku wariantów niż w przypadku kutynazy macierzystej.

P r z y k ł a d 4. Hydroliza c3ET

Kutynazę H. insolens i pięć z powyższych wariantów testowano prowadząc hydrolizę c3ET w podwyż szonej temperaturze. W przypadku każdej kutynazy, poniż szą mieszaninę inkubowano w ciągu 2 godzin w róż nych temperaturach.

W naczyniu reakcyjnym umieszczono 0,115 mg c3ET (0,1 ml 2 mM c3ET rozpuszczonego w HFIP. Rozpuszczalnik usunięto pod próżnią, a następnie wysuszono przez noc w temperaturze 70°C).

0,1 ml 0,5 M buforu glicyloglicynowego (pH 8,5)

0,1 ml roztworu enzymu (około 600 LU/ml)

0,8 ml wody oczyszczonej Milli Q

Po inkubacji do każdej mieszaniny reakcyjnej dodano 2 ml 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolu (HFIP), a następnie mierzono stopień hydrolizy metodą HPLC. Wyniki przedstawione na fig. 3 wyraźnie wykazują, że warianty wykazują polepszoną stabilność termiczną w porównaniu z kutynazą macierzystą.

P r z y k ł a d 5. Hydroliza c3ET na przędzy

Stabilność termiczną kutynazy H. insolens i pięciu z powyższych wariantów testowano z użyciem przędzy poliestrowej zawierającej c3ET jako produkt uboczny. Poniższą mieszaninę substratów preinkubowano w temperaturze 60 lub 65°C:

0,1 g przędzy poliestrowej

0,2 ml 0,5 M buforu glicyloglicynowego (pH 8,5)

1,7 ml wody oczyszczonej w Milli Q

Po preinkubacji do każdego naczynia reakcyjnego dodawano 0,1 ml roztworu enzymu (około 1000 LU/ml) i inkubowano w ciągu 17 godzin. Następnie dodawano 2 ml HFIP i pozostawiano na 30 minut dla ekstrakcji i hydrolizy c3ET znajdującego się na powierzchni przędzy poliestrowej; następnie mierzono stopień hydrolizy. Wyniki przedstawiono na fig. 4.

Widać, że warianty są bardziej skuteczne niż kutynaza macierzysta pod względem hydrolizowania c3ET na przędzy poliestrowej. Jeden wariant wykazuje wyższy stopień hydrolizy w temperaturze 65°C niż w 60°C.

P r z y k ł a d 6. Obróbka przędzy wariantem kutynazy

Badano przebiegi czasowe hydrolizy c3ET na przędzy poliestrowej w różnych temperaturach lub dawkach. Przebieg czasowy w różnych temperaturach przedstawiono na fig. 5. Widać, że optymalna temperatura wynosi 65°C. W temperaturze 70°C pozostaje nadal około połowy aktywności. Przebieg czasowy przy podwyższonych dawkach enzymu przedstawiono na fig. 6. Krzywe dla dawek 275 i 550 LU/ml wyglądają tak samo, co wskazuje, że stopień hydrolizy osiągnął plateau pomiędzy dawką 100 a 275 LU/ml. Przypuszczalnie wystarczająca jest ilość 200 LU/ml.

P r z y k ł a d 7. Barwienie poliestru barwnikiem reaktywnym

Obróbce poddano następujące tkaniny poliestrowe: tkaninę; około 2x2 cm, 34 mg dzianinę; około 1,5 x 1,5 cm, 50 mg.

Każdą tkaninę moczono w 0,9 ml 50 mM buforu GlyGly (glicyloglicynowego) (pH 8,5) i 0,1 ml roztworu wariantu kutynazy H. insolens (1100 LU/ml) i inkubowano w temperaturze 65 lub 70°C. Po jednym dniu dodawano kolejne 0,1 ml roztworu enzymu, inkubację kontynuowano w ciągu następnych dwóch dni, tkaniny wyjmowano i płukano wodą. Doświadczenie porównawcze wykonano z użyciem kutynazy macierzystej i w taki sam sposób poddano obróbce próbkę kontrolną bez enzymu.

Tkaniny mieszano w mieszaninie 9 g 120 g Na2SO4 i 60 g Na2CO3 w 3 litrach wody dejonizowanej w temperaturze 60°C przez 30 minut, a następnie płukano bieżącą ciepłą wodą. Barwnikiem reaktywnym był Celmazol Brilliant Blue B (produkt Mitsui Chemical Co., Japonia) o strukturze chromofor-NHPh-SO2CH2CH2OSO3Na.

We wszystkich czterech doświadczeniach (tkanina i dzianina, 65°C i 70°C) tkaniny były jednolicie wybarwione.

P r z y k ł a d 8. Solubilizacja fragmentów poliestrowych z dzianiny

Próbkę 1 x 1 cm dzianiny poliestrowej (PET, polimer glikolu etylenowego i kwasu tereftalowego) inkubowano w ciągu 1 godziny w 1 ml buforu o pH 10, w temperaturze 60°C, z 0,01 mg wariantu kutynazy H. insolens. Oddzielono mieszaninę reakcyjną i określano uwalnianie kwasu tereftalowego przez pomiar OD przy długości fali 250 nm (wyniki wyrażano jako OD250/mg PET). Doświadczenia porównawcze wykonano bez enzymu lub z użyciem kutynazy macierzystej. Wyniki:

PL 199 746 B1

	Enzym	OD250
Wynalazek	wariant kutynazy	4,5
Próba porównawcza	kutynaza macierzysta	0,3
brak	0,1

Wyniki wykazują, że wariant jest skuteczny pod względem solubilizacji poliestru.

W innym doś wiadczeniu wariant kutynazy testowano w cią gu 2 godzin w temperaturze 65°C z i bez dodawania niejonowego środka powierzchniowo czynnego (etoksylatu alkoholu, nazwa produktu Softanol 50), z użyciem różnych ilości wariantu, od 0,5 do 200 LU/ml. Wyniki wykazały większą solubilizację w obecności niejonowego środka powierzchniowo czynnego.

P r z y k ł a d 9. Hydroliza błony polikaprolaktonowej i poliestrowej

W probówkach umieszczono okoł o 0,1 g bł ony polikaprolaktonowej i poliestrowej. Moczono je w 5 ml 50 mM buforu GlyGly (pH 8,5) z wariantem kutynazy H. insolens (450 LU) lub bez niego. Inkubowano je w temperaturze 70°C w ciągu 5 godzin. Po reakcji stwierdzono cienką warstwę hydrolizatu na powierzchni probówek z enzymem, zarówno w przypadku błony polikaprolaktonowej, jak i poliestrowej. Z drugiej strony, nie stwierdzono żadnej zmiany w próbkach kontrolnych bez enzymu. W przypadku polikaprolaktonu wystąpił 10% ubytek wagi. Nie stwierdzono żadnej zmiany wagi poliestru.

P r z y k ł a d 10. Hydroliza cPET

Skuteczość wariantu kutynazy porównano z enzymem macierzystym (kutynazą H. insolens). Próby wykonano w następujący sposób.

Próbkę zaplamionej oligomerem tkaniny PET (czarnej) (około 4 cm x 13 cm) poddano obróbce enzymatycznej w trakcie stosunkowo słabego mieszania w tak zwanym minitergitometrze. Tkaninę PET umieszczono na cylindrycznym, perforowanym uchwycie (promień około 2 cm, wysokość około 6 cm), który obracał się wokół swojej osi, przy czym zaplamiona oligomerem strona tkaniny PET stykała się z zewnętrzną stroną cylindra.

Tkaninę zanurzono w szklanej zlewce o pojemności 150 ml, zawierającej 100 ml roztworu do obróbki o danej temperaturze (w tym przypadku 65°C). Po danym czasie obróbki (w tym przypadku 90 minut), próbki tkaniny PET usunięto z kąpieli, przemyto wodą dejonizowaną i wysuszono na powietrzu.

Po kondycjonowaniu próbki oceniano wzrokowo (pod względem usunięcia zaplamienia oligomerem) po stronie zaplamionej oligomerem. Oceny były następujące:

-2: próbka znacząco gorsza od próbki kontrolnej (bez enzymu)

-1: próbka nieznacznie gorsza od próbki kontrolnej (bez enzymu)

0: próbki nie można odróżnić od próbki kontrolnej

1: nieznaczna poprawa próbki w stosunku do próbki kontrolnej

2: znacząca poprawa próbki w stosunku do próbki kontrolnej

Próbki tkanin poddano również pomiarom spektrofotometrycznym (aparat: Hunterlab Reflectometer) dla ilościowej oceny intensywności barwy (wartość K/S przy długości fali 600 nm).

W poniż szej tabeli zestawiono warunki testu dla próby porównania skutecznoś ci enzymów w podobnych warunkach:

temperatura: 65°C bufor/pH: 50 mM bufor glicynowy, pH 10,3 czas obróbki (minuty): 90 dawka enzymu (LU/g): 30000

Wyniki próby podano poniżej.

Enzym	Ocena wzrokowa (średnia)	Różnica K/S przy 600 nm
brak	0 (zdefiniowana)	2,33
kutynaza macierzysta	0	2,38
wariant kutynazy	1,5-2,0	2,89

Na podstawie tego szeregu doświadczeń okazało się więc, że enzym macierzysty nie zapewnia lub zapewnia bardzo ograniczony wpływ w danych warunkach testu (prawdopodobnie dlatego, że temperatura jest zbyt wysoka dla zachowania aktywności przez enzym), podczas gdy wariant kutynazy zapewnia znaczące usuwanie zaplamienia oligomerem z tkaniny PET.

PL 199 746 B1

P r z y k ł a d 11. Hydroliza cPET

Profil zależności aktywności wariantu kutynazy H. insolens od pH i temperatury testowano w modelu doświadczenia barwienia zawiesinowego. Próby prowadzono w następujący sposób.

Próbkę zaplamionej oligomerem tkaniny PET (czarnej) poddano warunkom typowej sekwencji barwienia zawiesinowego w Werner Mathis Labomat. Opisując skrótowo ten proces, próbkę tkaniny wprowadzono do roztworu buforu, ogrzewano do temperatury 130°C i ochłodzono do temperatury obróbki. Dodano enzymu lub buforu, a następnie roztwór utrzymywano w żądanej temperaturze w ciągu 30 minut. Roztwór ochłodzono do temperatury pokojowej i zmierzono zmętnienie kąpieli piorącej. Zmniejszenie zmętnienia jest bezpośrednią miarą aktywności kutynazy, co odpowiada hydrolizie oligomerów cPET.

Szczegółowy opis doświadczenia

Próbkę czarnej tkaniny PET (około 4 cm x 13 cm) dodano do 140 ml 100 mM buforu Brittona-Robinsona zawierającego 0,2 g/litr Lutensol AT11 (BASF) i wprowadzono do aparatu Labomat (32 obroty na minutę).

Labomat ogrzewano do temperatury 130°C z szybkością 9°C/minutę i tę temperaturę utrzymywano w ciągu 10 minut.

Zlewki ochłodzono do temperatury procesu (zgodnie z poniższą tabelą) z szybkością 9°C/minutę i tę temperaturę utrzymywano w ciągu 1 minuty.

Do zlewek wstrzyknięto 10 ml roztworu enzymu (100 LU/ml wariantu) lub roztworu buforu (0 LU/ml) o odpowiednim pH.

Labomat ponownie ogrzewano do temperatury z szybkością 2°C/minutę i temperaturę utrzymywano w ciągu 30 minut.

Usunięto próbki tkaniny i kąpiel piorącą ochłodzono do temperatury pokojowej.

Zmierzono zmętnienie kąpieli piorących.

Ocena: zmętnienie mierzono z użyciem aparatu Hach 18900 Ratio Turbidimeter (wykalibrowany za pomocą standardów zmętnienia 1,8, 18 i 180 NTU). Skuteczność enzymu obliczano w stosunku do próbki kontrolnej jako różnicę pomiędzy zmętnieniem kąpieli kontrolnej (bez enzymu) a zmętnieniem kąpieli po obróbce enzymem.

Obliczono względną skuteczność (zmniejszenie zmętnienia) wariantu kutynazy, a wyniki przedstawiono w poniższej tabeli. Gdy uzyskiwano wartość ujemną, wynik podano jako „ujemna. Przyjmuje się, że wartość ujemna jest artefaktem powodowanym przez wahania w układzie.

Temperatura	pH7	pH8	pH9	pH10
60°C	39	57	37	14
65°C	39	16	60	30
70°C	25	12	54	33
75°C	22	50	114	58
85°C	ujemna	ujemna	15	ujemna

Wyniki wykazują, że wariant kutynazy jest aktywny w szerokich zakresach pH i temperatury, z optimum usuwania oligomeru w tym układzie około pH 9 i temperatury 75°C. Inaktywacja wydaje się następować w temperaturze 85°C lub wyższej.

P r z y k ł a d 12. Hydroliza cPET

Badano wpływ czasu obróbki z użyciem wariantu kutynazy H. insolens w modelu doświadczenia barwienia zawiesinowego. Próby przeprowadzono w następujący sposób.

Próbkę zaplamionej oligomerem tkaniny PET (czarnej) poddano warunkom typowej sekwencji barwienia zawiesinowego w Werner Mathis Labomat. Opisując skrótowo ten proces, próbkę tkaniny wprowadzono do roztworu buforu, ogrzewano do temperatury 130°C i ochłodzono do temperatury obróbki. Dodano enzymu lub buforu (100 mM bufor Brittona-Robinsona, pH 9), a następnie roztwór utrzymywano w temperaturze 75°C w ciągu 0-40 minut. Roztwór ochłodzono do temperatury pokojowej i zmierzono zmętnienie kąpieli piorącej. Zmniejszenie zmętnienia jest bezpośrednią miarą aktywności kutynazy, co odpowiada hydrolizie oligomerów cPET.

PL 199 746 B1

Szczegółowy opis doświadczenia

Próbkę czarnej tkaniny PET (około 4 cm x 13 cm) dodano do 140 ml 100 mM buforu Brittona-Robinsona zawierającego 0,2 g/litr Lutensol AT11 (BASF) i wprowadzono do aparatu Labomat (32 obroty na minutę).

Labomat ogrzewano do temperatury 130°C z szybkością 9°C/minutę i tę temperaturę utrzymywano w ciągu 10 minut.

Zlewki ochłodzono do temperatury 75°C z szybkością 9°C/minutę i tę temperaturę utrzymywano w cią gu 1 minuty.

Do zlewek wstrzyknięto 10 ml roztworu enzymu (100 LU/ml wariantu) lub 100 mM buforu Brittona-Robinsona o pH 9,0 (0 LU/ml).

Labomat ponownie ogrzewano do temperatury 75°C z szybkością 2°C/minutę i tę temperaturę utrzymywano w ciągu odpowiedniej liczby minut (0-40 minut, patrz tabela poniżej).

Usunięto próbki tkaniny i kąpiel piorącą ochłodzono do temperatury pokojowej.

Zmierzono zmętnienie kąpieli piorących.

Ocena: zmętnienie mierzono stosując Hach 18900 Ratio Turbidimeter (wykalibrowany za pomocą standardów zmętnienia 1,8, 18 i 180 NTU). Skuteczność enzymu obliczano w stosunku do próbki kontrolnej w czasie równym zero: różnica pomiędzy zmętnieniem kąpieli kontrolnej w czasie zero (bez enzymu) a zmętnieniem kąpieli po obróbce enzymem (w danym czasie).

Obliczono względną skuteczność (zmniejszenie zmętnienia) wariantu kutynazy i wyniki przedstawiono w poniższej tabeli.

Czas (minuty)	Względna skuteczność (zmniejszenie zmętnienia)
0	0
5	42
10	48
15	62
20	69
25	85
30	72
40	78

Wyniki wykazują, że wpływ enzymu zwiększa się w czasie. Przy tej dawce enzymu i stężeniu oligomeru, wydaje się on osiągać maksymalny poziom po około 20 minutach.

P r z y k ł a d 13. Modyfikacja włókien

Badano wpływ na zwilżalność wybarwionej zawiesinowo tkaniny poliestrowej poprzez jej obróbkę wariantem kutynazy H. insolens przed barwieniem. Zatem doświadczenie składało się z dwóch faz, rzeczywistej modyfikacji włókien oraz procedury barwienia zawiesinowego.

Faza 1 - Modyfikacja włókien

Wyposażenie: Atlas Launder-O-meter LP2

Tkanina: dziany 100% odtłuszczony poliester z Test fabrics pH: 50 mM bufor fosforanów potasowych, pH 7,0

Materiał ścierny: 5 dużych kul stalowych

Objętość zlewki: 120 ml

Obróbka: 2 godziny w temperaturze 65°C, następnie stopniowe podwyższanie do temperatury 90°C i utrzymywanie jej w ciągu 1 godziny

Przygotowywanie próbki: odciąć 3 x próbkę tkaniny o masie 1,5 g, 3 na zlewkę = 4,5 g

Płukanie

Płukać w wodzie dejonizowanej.

Faza 2 - Barwienie - barwnik zawiesinowy

Roztwór barwnika

Dodawać razem z wodą dejonizowaną dla osiągnięcia krotności kąpieli 1:20

0,4% Dianyx Red (DyStar) SE-CB (owf) pH do 4,5 - 5

PL 199 746 B1

Procedura barwienia

1. Do barwienia stosuje się jedną próbkę tkaniny po modyfikacji włókien na obróbkę (do obliczania krotności kąpieli przyjmuje się masę 1,5 g/próbkę).

2. Przygotować kąpiel barwiącą zgodnie z powyższym przepisem. Dodać zimnego roztworu barwnika do zlewek Labomat i ogrzewać do temperatury 55°C z szybkością 3,5°C/minutę. Po osiągnięciu tej temperatury proces prowadzono przez 5 minut.

3. Dodać tkaninę do zlewki.

4. Podwyższyć temperaturę do 130°C z szybkością 1,5°C/minutę. Barwić w ciągu 30 minut.

5. Ochłodzić do temperatury 70°C z szybkością 5°C/minutę. Usunąć kąpiel zbierając ją i płukać tkaninę na gorąco (60°C) w ciągu 10 minut. Po płukaniu na gorąco prowadzić płukanie przelewowe w temperaturze pokojowej do ustania powstawania zacieków.

6. Umożliwić suszenie na powietrzu przez noc.

Testy/analiza metoda testowa AATCC - odporność barwy na pranie

Procent zużycia kąpieli barwiącej - spektrofotometr

K/S i L* - reflektometr

Test kroplowy TM-79 AATCC

Wyniki

Wyniki dla modyfikacji włókien przedstawiono w poniższej tabeli.

Dawka wariantu	Barwienie (TM-61 AATCC)	Zmiana barwy (K/S przy 530 nm przed i po tM-61)	Test kroplowy (TM-79 AATCC)
próba kontrolna	4,5	5	53 sekundy
50 LU/ml	4,5	5	18 sekund
100 LU/ml	4,5	5	15 sekund

Wyniki wykazują, że obróbka poliestru wariantem zasadniczo zwiększa zwilżalność. W tym układzie nie stwierdzono niekorzystnego wpływu na zdolność barwienia barwnikiem zawiesinowym.

P r z y k ł a d 14. Zmniejszanie nieprzyjemnego zapachu wyrobów włókienniczych zabrudzonych ludzkim potem/łojem dzięki zastosowaniu wariantu kutynazy w praniu

Skuteczność kutynazy pod względem zmniejszania nieprzyjemnego zapachu można testować w próbie jednego cyklu prania przeprowadzonej w Terg-O-tometer.

Warunki doświadczenia

Kąpiel piorąca: 1000 ml na zlewkę

Próbki tkaniny: 100% poliester (dziany splotowo, uprzednio oczyszczony przez ekstrakcję z użyciem aparatu Soxhleta). 24 próbki (3,3 x 3,5 cm) na zlewkę.

Zabrudzenie: pot i łój z pachy mężczyzny uzyskany przez wytarcie dołów pachowych po ćwiczeniach.

Detergent: 5 g/litr standardowego detergentu do tkanin kolorowych. Bez ustalania pH.

Twardość wody: 3,2 mM Ca²⁺/Mg²⁺ (w stosunku 5:1)

Temperatura prania: 30°C

Czas prania: 30 minut

Płukanie: 15 minut w bieżącej wodzie wodociągowej

Ocena

Po praniu mokre próbki tkaniny umieszczono w zamykanych, ciemnych naczyniach szklanych o pojemności 200 ml. Wyszkolony zespół oceniający (9-11 fachowców) oceniało zapach przez wdychanie nosem warstwy powietrza nad mokrymi próbkami i oceniał całkowitą intensywność zapachu. Intensywność zapachu odnotowano przez umieszczenie znaku na elastycznej skali liniowej mierzącej 15 cm, z przymocowanymi oznaczeniami słownymi na każdym końcu („brak na początku skali i „bardzo silny na końcu). Wszystkich ocen dokonano dwukrotnie. Próbki tkaniny oceniano w 1, 2 i 3 dniu po praniu (cały czas próbki tkaniny przechowywano w naczyniach szklanych).

Claims (19)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Wariant kutynazy macierzystej, gdzie:

   a) kutynazę macierzystą stanowi kutynaza szczepu DSM 1800 H. insolens,

   b) wariant ten ma sekwencję aminokwasów z 1-20 zmianami w porównaniu z kutynazą macierzystą,

   c) wariant ten obejmuje podstawienie reszty aminokwasu o ładunku ujemnym w pozycji odpowiadającej pozycji E6, E10, E30, E47, D63, E82 i/lub E179 aminokwasem obojętnym lub aminokwasem o ładunku dodatnim, bądź podstawienie resztą Pro w pozycji odpowiadającej A14 lub R51 w kutynazie macierzystej,

   d) wariant ten wykazuje aktywność hydrolityczną wobec cyklicznego tri(tereftalanu etylenu) i tereftalanu bis(2-benzoiloksyetylu), oraz

   e) wariant ten jest bardziej stabilny termicznie niż kutynaza macierzysta.
2. 2. Wariant według zastrz. 1, który obejmuje podstawienie odpowiadające E6N/Q, E10N/Q, E47K/R i/lub E179N/Q (numeracja kutynazy H. insolens).
3. 3. Wariant według zastrz. 1 albo 2, który obejmuje podstawienie odpowiadające A14P lub R51P w kutynazie szczepu DSM 1800 Humicola insolens.
4. 4. Wariant według zastrz. 1-3, który ma jedno, dwa, trzy, cztery, pięć lub sześć tych podstawień.
5. 5. Wariant według zastrz. 1-4, który ma podstawienia odpowiadające jednemu z następujących podstawień w kutynazie szczepu DSM 1800 Humicola insolens:

   a) R51P

   b) E6N/Q + L138I

   c) A14P + E47K

   d) E47K

   e) E179N/Q

   f) E6N/Q + E47K + R51P

   g) A14P + E47K + E179N/Q

   h) E47K + E179N/Q

   i) E47K + D63N

   j) E6N/Q + A14P + E47K + R51P + E179N/Q

   k) E6N/Q + E10N/Q + A14P + E47K + R51P + E179N/Q lub

   l) Q1P + L2V + S11C + N15T + F24Y + L46I + E47K.
6. 6. Wariant według zastrz. 1-5, który ma temperaturę denaturacji o co najmniej 5° wyższą niż dla kutynazy macierzystej, mierzoną przy pH 8,5.
7. 7. Sekwencja DNA kodująca wariant zdefiniowany w zastrz. 1-6.
8. 8. Wektor zawierający sekwencję DNA zdefiniowaną w zastrz. 7.
9. 9. Transformowana komórka gospodarza zawierająca sekwencję DNA zdefiniowaną w zastrz. 7.
10. 10. Transformowana komórka gospodarza zawierająca wektor zdefiniowany w zastrz. 8.
11. 11. Sposób wytwarzania wariantu zdefiniowanego w zastrz. 1-6, znamienny tym, że

    a) hoduje się komórkę zdefiniowaną w zastrz. 9 tak aby osiągnąć ekspresję i korzystnie sekrecję tego wariantu i

    b) odzyskuje się ten wariant.
12. 12. Sposób hydrolizy enzymatycznej cyklicznego oligomeru poli(tereftalanu etylenu), znamienny tym, że prowadzi się obróbkę cyklicznego oligomeru wariantem kutynazy zdefiniowanym w zastrz. 1-6.
13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że prowadzi się obróbkę cyklicznego oligomeru, który stanowi cykliczny tri(tereftalan etylenu).
14. 14. Sposób według zastrz. 12 albo 13, znamienny tym, że obróbkę prowadzi się w temperaturze 60-80°C, korzystnie w temperaturze 65-75°C.
15. 15. Sposób według zastrz. 12-14, znamienny tym, że prowadzi się obróbkę cyklicznego oligomeru, który znajduje się we włóknach i na włóknach tkaniny lub przędzy zawierającej poliester.
16. 16. Sposób według zastrz. 12-15, znamienny tym, że ponadto prowadzi się dalsze płukanie tkaniny lub przędzy, korzystnie płukanie roztworem wodnym o pH w zakresie od około pH 7 do około pH 11.
17. 17. Sposób barwienia poliestrowej tkaniny lub przędzy, znamienny tym, że

    a) prowadzi się obróbkę tkaniny lub przędzy wariantem kutynazy zdefiniowanym w zastrz. 1-6 i

    b) barwi się poddaną obróbce tkaninę barwnikiem reaktywnym lub barwnikiem zawiesinowym.
18. 18. Kompozycja detergentowa, znamienna tym, że zawiera środek powierzchniowo czynny i wariant zdefiniowany w zastrz. 1-6.

    PL 199 746 B1
19. 19. Sposób polepszania wykończenia specjalnego przędzy lub tkaniny zawierającej PET, znamienny tym, że

    a) prowadzi się obróbkę przędzy lub tkaniny wariantem zdefiniowanym w zastrz. 1-6 i

    b) następnie prowadzi się obróbkę przędzy lub tkaniny środkiem wykończalniczym wybranym z grupy obejmującej środki zmiękczające, żywice przeciwmnące, środki antyelektrostatyczne, środki zapobiegające osadzaniu się brudu.