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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Cutinase-Variante, genauer eine
Cutinase-Variante mit verbesserter Wärmestabilität. Die Erfindung betrifft auch
eine DNA, die die Variante codiert, einen Vektor, der die DNA-Sequenz
umfasst, eine transformierte Wirtszelle, die die DNA-Sequenz oder
den Vektor beherbergt, ein Verfahren zur Herstellung der Variante
und die Verwendung der Variante.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Cutinasen
sind lipolytische Enzyme, die in der Lage sind, das Substrat Cutin
zu hydrolysieren. Cutinasen sind aus verschiedenen Pilzen bekannt
(P.E. Kolattukudy in „Lipases", Hrsg. B. Borgström und H.L.
Brockman, Elsevier 1984, 471–504).
Die Aminosäuresequenz
und die Kristallstruktur einer Cutinase aus Fusarium solani pisi
wurden bereits beschrieben (S. Longhi et al., Journal of Molecular
Biology, 268 (4), 779–799
(1997)). Auch die Aminosäuresequenz
einer Cutinase aus Humicola insolens wurde bereits veröffentlicht
(
US 5,827,719 ).
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Eine
Anzahl von Varianten von Cutinasen aus Fusarium solani pisi ist
bereits veröffentlicht:
WO 94/14963 ;
WO 94/14964 ; Appl. Environm. Microbiol.
64, 2794–2799,
1998; Proteins: Structure, Function and Genetics 26, 442–458, 1996;
J. of Computational Chemistry 17, 1783–1803, 1996; Protein Engineering
6, 157–165,
1993; Proteins; Structure, Function and Genetics 33, 253–264, 1998;
J. of Biotechnology 66, 11–26, 1998;
Biochemistry 35, 398–410,
1996.
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Pilzliche
Cutinasen können
zur enzymatischen Hydrolyse von cyclischen Oligomeren von Poly(ethylenterephthalat)
verwendet werden, z. B. bei der Veredlung von Garn oder Stoff aus
Poly(ethylenterephthalat)-Fasern (
WO
97/27237 ). Es ist jedoch wünschenswert, die Wärmestabilität bekannter
pilzlicher Cutinasen zu verbessern, um eine höhere Prozesstemperatur zu ermöglichen.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfinder haben festgestellt, dass bestimmte Varianten pilzlicher
Cutinasen eine verbesserte Wärmestabilität aufweisen.
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Demnach
stellt die Erfindung eine Variante einer pilzlichen Eltern-Cutinase
bereit, wobei
- a) die Eltern-Cutinase eine Aminosäuresequenz
aufweist, die wenigstens 70% homolog zu der Cutinase von H. insolens
Stamm DSM 1800 ist,
- b) die Variante eine Aminosäuresequenz
aufweist, die 1–20 Änderungen
im Vergleich zur Eltern-Cutinase aufweist,
- c) die Variante den Austausch eines negativen Aminosäurerestes
an einer Stelle, die der Position E6, E10, E30, E47, D63, E82 und/oder
E179 entspricht, durch eine neutrale oder positive Aminosäure oder
eine Substitution mit Pro an einer Stelle, die A14 oder R51 in der
Eltern-Cutinase entspricht, umfasst,
- d) die Variante eine hydrolytische Aktivität für cyclisches Tri(ethylenterephthalat)
oder Terephthalsäure-bis(2-hydroxyethyl)-ester-dibenzoat
aufweist, und
- e) die Variante wärmestabiler
ist als die Eltern-Cutinase.
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Die
Erfindung stellt auch eine DNA Sequenz, die die Variante codiert,
einen Expressionsvektor, der die DNA-Sequenz umfasst, eine transformierte
Wirtszelle, die die DNA-Sequenz oder den Expressionsvektor beherbergt,
ein Verfahren zur Herstellung der Variante, Verfahren unter Verwendung
der Variante und eine Detergenszusammensetzung, die die Variante
umfasst, bereit.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 gibt
die Koordinaten der 3D-Struktur der Cutinase von H. insolens an.
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2 ist
ein Computermodell, das die dreidimensionalen Strukturen der Cutinasen
von F. solani pisi (links) und H. insolens (rechts) zeigt. Es wurden
verschiedene Farben verwendet, um die N-terminale Aminosäure und
Zonen von 12 Å und
17 Å Durchmesser
um diese herum zu bezeichnen.
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3–6 zeigen
die Hydrolyse von c3ET. Einzelheiten sind in den Beispielen angegeben.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Pilz-Cutinase
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Die
Eltern-Cutinase ist eine Pilz-Cutinase, wie eine filamentöse Pilz-Cutinase,
z. B. die einem Stamm von Humicola oder Fusarium, speziell H. insolens
oder F. solani pisi, genauer H. insolens Stamm DSM 1800, arteigen
ist.
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Die
Aminosäuresequenz
der Cutinase des H. insolens Stamm DSM 1800 und die sie codierende DNA-Sequenz
sind als SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 1 der
US 5,827,719 gezeigt. Das hier verwendete
Nummerierungssystem für
die H. insolens Cutinase beruht auf dem reifen Peptid, wie in der
SEQ ID NO: 2 gezeigt.
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Die
Aminosäuresequenz
der Cutinase von F. solani pisi ist als reifes Peptid in
1D von
WO 94/14964 gezeigt. Das
hier verwendete Nummerierungssystem für die F. solani pisi Cutinase
ist das in
WO 94/14964 verwendete;
es schließt
die Pro-Sequenz ein, die in
1D gezeigt
ist; daher befindet sich die reife Cutinase an den Positionen 16–14.
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Die
Eltern-Cutinase kann eine Aminosäuresequenz
aufweisen, die wenigstens 50% (insbesondere wenigstens 70% oder
wenigstens 80%) zu der Cutinase von H. insolens Stamm DSM 1800 homolog
ist. Die Eltern-Cutinase kann insbesondere eine Cutinase sein, die
mit der Cutinase von H. insolens Stamm DSM 1800 abgeglichen werden
kann.
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Nomenklatur für Aminosäuren und die Änderungen
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Die
Beschreibung und Ansprüche
bezeichnen Aminosäuren
mit ihrem Einbuchstabencode. Eine bestimmte Aminosäure in einer
Sequenz wird durch ihren Einbuchstabencode und ihre Position benannt,
z. B. Q1 bezeichnet Gln (Glutamin bei Position 1, d. h. am N-Terminus).
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Die
hierin zur Definition von Substitutionen verwendete Nomenklatur
ist grundsätzlich
wie in
WO 92/05249 beschrieben.
Demnach bezeichnet R51P die Substitution von R (Arg) an Position
51 mit P (Pro).
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Homologie und Abgleich
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Für Zwecke
der vorliegenden Erfindung kann der Homologiegrad zweckmäßigerweise
nach dem Verfahren, das bei Needleman, S.B. und Wunsch, C.D. (1970),
Journal of Molecular Biology, 48, 443–45 beschrieben ist, mit den
folgenden Einstellungen für
den Polypeptid-Sequenzvergleich
bestimmt werden: GAP creation penalty von 3.0 und GAP extension
penalty von 0,1. Die Bestimmung kann durch ein Computerprogramm durchgeführt werden,
das als GAP bekannt ist, das im GCG Programmpaket (Programm-Anleitung
für das Wisconsin
Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science
Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) bereitgestellt ist.
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Zwei
gegebene Sequenzen können
nach dem Verfahren, das bei Needleman (supra) beschrieben ist, unter
Verwendung der gleichen Parameter abgeglichen werden. Dies kann
mit einem GAP-Programm (supra) erfolgen.
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Dreidimensionale Struktur
von Cutinase
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Die
Struktur der Cutinase von H. insolens wurde in Übereinstimmung mit dem Prinzip
für röntgenkristallographische
Verfahren gelöst,
wie z. B. in X-Ray Structure Determination, Stout, G.K. und Jensen,
L.H., John Wiley & Sons,
Inc. NY, 1989 beschrieben. Die Strukturkoordinaten für eine aufgelöste Kristallstruktur
bei 2,2 Å Auflösung unter
Verwendung des Verfahrens des isomorphen Ersatzes sind in 1 im
Standard-PDB-Format
(Protein Data Bank, Brookhaven National Laboratory, Brookhaven,
CT) angegeben.
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Die
Struktur der Cutinase von F. solani pisi ist bei Martinez et al.
(1992) Nature 356, 615–618
beschrieben. Die 3D-Strukturen der Cutinasen von F. solani pisi
und H. insolens werden als Computermodell in 2 verglichen.
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Es
sollte festgehalten werden, dass die dreidimensionalen Gesamt-Strukturen
von Pilz-Cutinasen
sehr ähnlich
sind und durch Röntgenkristallographie
als stark homolog gezeigt wurden. Die Ähnlichkeiten zwischen den Cutinasen
von F. solani pisi und H. insolens gehen eindeutig aus dem Computermodell
in 2 hervor. Daher sind Modifikationen der für eine Pilz-Cutinase
gezeigten Art auch für
andere Pilz-Cutinasen funktionell.
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Substitution nahe dem N-Terminus
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Die
erfindungsgemäße Variante
besitzt eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen
in der Nachbarschaft des N-Terminus. Die Substitution liegt in einer
Entfernung von 17 Å (z.
B. innerhalb von 12 Å)
und/oder innerhalb von 20 Positionen (z. B. innerhalb von 15 Positionen)
des N-Terminus. Der Abstand vom N-Terminus muss zwischen dem Cα-Atom der
Aminosäuren
berechnet werden und wird aus einer Aminosäure in einer Kristallstruktur
(d. h. sichtbar in der Röntgenstruktur)
berechnet.
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In
der Cutinase des H. insolens Stamm DSM 1800 sind die zwei N-terminalen
Aminosäuren
(Q1 und L2, d. h. Gin und Leu an den Positionen 1 und 2) nicht in
der Röntgenstruktur
sichtbar, also muss die Entfernung aus der Aminosäure G3 berechnet
werden. Aminosäuren
innerhalb von 17 A schließen
die Positionen 3–12,
18, 20–60,
62–64,
82, 85–86,
100–108,
110–111,
130–132,
174, 176–182,
184–185,
188 und 192 ein. Diejenigen innerhalb von 12 Å schließen die Positionen 3–8, 22–27, 30–47, 53–59, 102,
177 und 180–181
ein.
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In
der Cutinase von F. solani pisi ist die N-terminale Aminosäure G17
in der Röntgenkristallstruktur sichtbar.
Aminosäuren
innerhalb von 17 Å schließen die
Positionen 17–26,
34–75,
77–79,
101, 115, 117–119, 147,
191–197,
199–200
und 203 ein. Solche innerhalb von 12 Å schließen die Positionen 17–22, 38,
40, 45–58, 60,
65 und 70–72
ein.
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Die
erfindungsgemäßen Varianten
weisen im Vergleich zu dem Eltern-Enzym eine verbesserte Wärmestabilität auf. Die
Wärmestabilität kann aus
der Denaturierungstemperatur durch DSC (Differential Scanning Calorimetrie)
bestimmt werden, z. B. wie in einem Beispiel beschrieben, z. B.
bei pH 8,5 mit einer Scangeschwindigkeit von 90 K/h. Die Varianten
können
eine Denaturierungstemperatur aufweisen, die wenigstens 5°C höher ist
als die des Eltern-Enzyms.
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Die
Gesamtanzahl von Substitutionen in den obigen Regionen beträgt typischerweise
1–10,
z. B. 1–5 Substitutionen
in den obigen Regionen. Zusätzlich
kann die Cutinase-Variante der Erfindung fakultativ andere Modifikationen
des Eltern-Enzyms umfassen, typischerweise 10 oder weniger, z. B.
5 oder weniger Änderungen
(Substitutionen, Deletionen oder Insertionen) außerhalb der obigen Regionen.
Daher enthält
die Aminosäuresequenz
der Variante typischerweise 1–20,
z. B. 1–10 Änderungen
im Vergleich zu der Eltern-Cutinase.
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Lösungsmittel-zugängliche
Oberfläche
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Eine
oder mehr der Substitutionen können
an einem exponierten Aminosäurerest
vorgenommen werden, d. h. einem Aminosäurerest mit einer Lösungsmittel-zugänglichen
Oberfläche.
Dieses kann mit dem „dssp" Programm (Version
Oktober 1988), das bei W. Kabsch und C. Sander, Biopolymers, 22
(1983), S. 2577–2637
beschrieben ist, berechnet werden.
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In
der Cutinase des H. insolens Stamm DSM 1800, liegen die folgenden
Aminosäuren
innerhalb von 17 Å von
G3 am N-Terminus und weisen eine Lösungsmittel-zugängliche
Oberfläche
von größer als
0 auf: 3–12,
18, 26–33,
36–38,
40–45,
47–56,
59–60,
62–64,
82, 85–86,
104–105,
174, 176–179,
181–182,
192.
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Spezifische Substitutionen
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Die
Substitution nahe dem N-Terminus kann spezifisch eine Substitution
sein, die die elektrische Ladung erhöht, d. h. eine Substitution
einer negativ geladenen Aminosäure
mit einer neutralen oder positiv geladenen Aminosäure oder
eine Substitution einer neutralen Aminosäure mit einer positiv geladenen
Aminosäure. Demnach
kann ein negativer Aminosäurerest
an einer Position entsprechend Position E6, E10, E30, E47, D63, E82
und/oder E179 in der Cutinase von Humicola insolens Stamm DSM 1800
durch eine neutrale oder positive Aminosäure substituiert sein, z. B.
R, K, Y, H, Q oder N. Einige spezielle Substitutionen sind diejenigen,
die E6Q/N, E10Q/N, E47K/R oder E179Q/N entsprechen. Auch kann ein
neutraler Aminosäurerest
an einer Position entsprechend N7, S11, N44 oder N52 in der H. insolens
Cutinase durch eine positive Aminosäure (R, K oder H) ersetzt sein.
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Ein
weiteres Beispiel für
eine Substitution nahe dem N-Terminus ist eine Substitution mit
einem Pro-Rest, z. B. eine Substitution, die A14P oder R51P in der
Cutinase des Humicola insolens Stammes DSM 1800 entspricht.
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Spezielle Varianten
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Die
folgenden sind einige Beispiele von Varianten in der H. insolens
Cutinase. Entsprechende Varianten können auf der Grundlage von
anderen Eltern-Cutinasen hergestellt werden.
R51P
E6N/Q
+ L138I
A14P + E47K
E47K
E179N/Q
E6N/Q + E47K
+ R51P
A14P + E47K + E179N/Q
E47K + E179N/Q
E47K
+ D63N
E6N/Q + E10N/Q + A14P + E47K + R51P + E179N/Q
E6N/Q
+ A14P + E47K + R51P + E179N/Q
Q1P + L2V + S11C + N15T + F24Y
+ L46I + E47K
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Verwendung der Cutinase-Variante
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Die
Erfindungsgemäße Cutinase-Variante
kann z. B. für
die enzymatische Hydrolyse von cyclischen Oligomeren von Poly(ethylenterephthalat),
wie cyclisches Tri(ethylenterephthalat), abgekürzt als c3ET, verwendet werden.
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Insbesondere
kann diese verwendet werden, um solche cyclischen Oligomere aus
Polyester-enthaltendem
Textilstoff oder Garn durch Behandlung des Stoffs oder des Garns
mit der Cutinase-Variante und gegebenenfalls anschließendes Spülen des
Stoffs oder Garns mit einer wässrigen
Lösung
mit einem pH im Bereich von etwa pH 7 bis etwa pH 11 zu entfernen.
Die Behandlung von Polyester wird zweckmäßigerweise oberhalb der Glasübergangstemperatur
von c3ET (etwa 55°C)
und unterhalb der Glasübergangstemperatur von
Polyester (etwa 70°C)
durchgeführt.
Demnach kann die Behandlung zweckmäßigerweise bei 50–80°C, z. B.
bei 60–75°C, durchgeführt werden.
Das Verfahren kann in Analogie zu
WO
97/27237 durchgeführt
werden.
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Die
Cutinase-Variante kann verwendet werden, um Polyester-enthaltenden
Textilstoff zu behandeln, z. B. PET (Polymer von Ethylengylcol und
Terephthalsäure),
P3GT (Polymer von 1,3-Propandiol und Terephthalsäure) oder eine Polyester/Baumwolle-Mischung.
Die Behandlung kann für
den Polyester-Textilstoff Vorteile bieten, wie verbesserten Tragekomfort,
erhöhte
Wasser-Durchlässigkeit,
vermindertes antistatisches Verhalten, Handhabung und Weichheit
verbessern, veränderte
Wiederabsetzungseigenschaften und/oder Farbaufhellung.
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Die
Cutinase-Variante kann verwendet werden, um die funktionelle Veredelung
eines PET-enthaltenden
Garns oder Stoffs durch Behandlung mit der Cutinase-Variante zu
verbessern, gefolgt von einer Behandlung mit einem Veredelungsmittel,
wie ein Weichmacher, ein Antiknitterharz, ein antistatisches Mittel,
ein schmutzabweisendes Mittel oder Mittel, um faltenfreie, bügelfreie
oder feuerbeständige
Wirkungen zu verleihen. Die Behandlung mit der Cutinase-Variante
kann die Anzahl von funktionellen Gruppen auf der Oberfläche erhöhen, und
dies kann verwendet werden, um die funktionelle Veredelung anzubringen.
Beispiele für Veredelungsmittel
werden in „SENSHOKU
SIAGEKAKO BENRAN",
veröffentlicht
1998-10–15 von
Nihon Seni Sentaa KK beschrieben.
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Die
erfindungsgemäße Cutinase-Variante
ist auch in Detergentien geeignet, in die sie eingearbeitet werden
kann, um die Entfernung von Fettschmutz zu verbessern, wie in
WO 94/03578 und
WO 94/14964 beschrieben.
Der Zusatz der Cutinase-Variante zu Wäsche-Waschmitteln kann schlechten Geruch
von Kleidung mindern, der sich während
mehrerer Wasch/Trage-Zyklen ansammelt.
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Die
Cutinase-Variante kann auch für
den Abbau und das Recycling von Polyester, wie Polycaprolacton (PCL),
Polyethylenglycolterephthalat (PET), Polymilchsäure, Polybutylensuccinat and
Poly(hydroxybuttersäure)-co-(hydroxyvalerat),
z. B. Film und Flaschen, verwendet werden, z. B. wie in
JP-A 5-344897 beschrieben.
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Die
Cutinase-Variante kann auch für
andere bekannte Anwendungen von Lipasen und Cutinasen verwendet
werden, z. B. in der Backindustrie (z. B. wie beschrieben in
WO 94/04035 und
EP 585988 ), in der Papierherstellungsindustrie
(z. B. für
Pech-Entfernung, siehe
EP 374700 )
und in der Leder-, Wolle- und verwandten Industrien (z. B. zur Entfettung
von Tierhäuten,
Schafhaut oder Wolle) und für
andere Anwendungen unter Verwendung von Entschmierung/Entfettung.
Sie kann in immobilisierter Form in der Fett- und Ölindustrie,
als ein Katalysator in der organischen Synthese (z. B. Veresterung,
Umesterung oder Esterhydrolysereaktionen) verwendet werden.
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Färben von Polyester
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Die
Erfindung stellt ein Verfahren zum Färben von Polyesterstoff oder
-garn bereit. Bei diesem Verfahren wird der Stoff oder das Garn
erst mit einer Cutinase behandelt, z. B. 12–48 Stunden bei 50–70°C oder 65–70°C, pH 7–10, und
anschließend
mit Farbstoff, z. B. einem Reaktivfarbstoff, einem Dispersionsfarbstoff oder
einem kationischen Farbstoff, gefärbt. Der Reaktivfarbstoff kann
ein Farbstoff sein, der mit OH- oder COOH-Gruppen reagiert, z. B.
mit der Struktur Chromophor-NHPh-SO2CH2CH2OSO3Na.
Das Färben
kann bei 40–80°C, z. B.
für 20–60 Minuten
durchgeführt
werden.
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Die
Cutinase kann eine wärmestabile
Cutinase mit einer Wärmedenaturierungstemperatur
Td bei pH 8,5 sein, die wenigstens 5°C höher als
diejenige der Eltern-Cutinase ist, z. B. 7–10°C höher, z. B. ein Wert von 65°C oder höher. Die
Messung kann durch DSC, wie in einem Beispiel dieser Beschreibung
beschrieben, vorgenommen werden.
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Tensid
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Bei
der Behandlung von Stoff oder Garn kann ein herkömmliches Netzmittel und/oder
ein Dispergiermittel verwendet werden, um den Kontakt mit dem Enzym
zu verbessern. Das Netzmittel kann ein nichtionisches Tensid sein,
z. B. ein ethoxylierter Fettalkohol. Ein sehr geeignetes Netzmittel
ist ein ethoxylierter und propoxylierter Fettsäureester, wie Berol 087 (Produkt
von Akzo Nobel, Schweden).
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Das
Dispergiermittel kann zweckmäßigerweise
aus nichtionischen, anionischen, kationischen, ampholytischen oder
zwitterionischen Tensiden ausgewählt
werden. Spezieller kann das Dispergiermittel ausgewählt werden
aus Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Alkylarylsulfonaten,
langkettigen Alkoholsulfaten (primären und sekundären Alkylsulfaten),
sulfonierten Olefinen, sulfatierten Monoglyceriden, sulfatierten
Ethern, Sulfosuccinaten, sulfonierten Methylethern, Alkansulfonaten,
Phosphatestern, Alkylisothionaten, Acylsarcosiden, Alkyltauriden,
Fluortensiden, Fettalkohol und Alkylphenol Kondensaten, Fettsäurekondensaten,
Kondensaten von Ethylenoxid mit einem Amin, Kondensaten von Ethylenoxid
mit einem Amid, Saccharoseestern, Sorbitanestern, Alkylamiden, Fettaminoxiden,
ethoxylierten Monoaminen, ethoxylierten Diaminen, Alkoholethoxylaten
und Mischungen davon. Ein sehr geeignetes Dispergiermittel ist ein
Alkoholethoxylat, wie Berol 08 (Produkt von Akzo Nobel, Schweden).
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Verfahren zur Herstellung
von Cutinase-Varianten
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Die
erfindungsgemäße Cutinase-Variante
kann durch Verfahren hergestellt werden, die auf dem Fachgebiet
bekannt sind, z. B. wie in
WO
94/14963 oder
WO 94/14964 (Unilever)
beschrieben. Das Folgende beschreibt Verfahren zur Klonierung von
Cutinase-codierenden DNA-Sequenzen und anschließend Verfahren zur Erzeugung
von Mutationen an speziellen Stellen innerhalb der Cutinase-codierenden
Sequenz.
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Klonierung einer DNA-Sequenz, die eine
Cutinase codiert
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Die
eine Eltern-Cutinase codierende DNA-Sequenz kann aus einer beliebigen
Zelle oder einem Mikroorganismus, die die fragliche Cutinase produzieren,
unter Verwendung verschiedener auf dem Fachgebiet wohlbekannter
Verfahren isoliert werden. Zuerst sollte eine genomische DNA und/oder
cDNA-Bibliothek unter Verwendung chromosomaler DNA oder Messenger-RNA
aus dem Organismus konstruiert werden, der die zu untersuchende
Cutinase herstellt. Ist dann die Aminosäuresequenz der Cutinase bekannt,
können
markierte Oligonucleotidsonden synthetisiert und verwendet werden,
um Cutinase-codierende Klone aus der genomischen Bibliothek, die
aus dem fraglichen Organismus hergestellt wurde, zu identifizieren.
Alternativ könnte eine
markierte Oligonucleotidsonde, die Sequenzen enthält, die
zu anderen bekannten Cutinase-Genen homolog sind, als Sonde verwendet
werden, um Cutinase-codierende Klone unter Verwendung von Hybridisierungs-
und Waschbedingungen von niedrigerer Stringenz zu identifizieren.
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Noch
ein weiteres Verfahren zur Identifizierung von Cutinase-codierenden
Klonen würde
das Inserieren von Fragmenten genomischer DNA in einen Expressionsvektor,
wie ein Plasmid, das Transformieren Cutinase-negativer Bakterien
mit der resultierenden genomischen DNA-Bibliothek und das anschließende Ausplattieren
der transformierten Bakterien auf Agar, der ein Substrat für Cutinase
(d. h. Maltose) enthält,
umfassen, wodurch es möglich
ist, Klone, die die Cutinase exprimieren, zu identifizieren.
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Alternativ
kann die DNA-Sequenz, die das Enzym codiert, durch bewährte Standard-Verfahren synthetisch
hergestellt werden, z. B. durch das Phosphoramidit-Verfahren, das
bei S.L. Beaucage und M.H. Caruthers, (1981), Tetrahedron Letters
22, S. 1859–1869
beschrieben ist, oder das Verfahren, das bei Matthes et al., (1984),
EMBO J. 3, S. 801–805
beschrieben ist. Bei dem Phosphoramidit-Verfahren werden Oligonucleotide
synthetisiert, z. B. in einem automatischen DNA-Synthesizer, gereinigt,
anneliert, ligiert und in passende Vektoren kloniert.
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Schließlich kann
die DNA-Sequenz gemischt genomischen und synthetischen Ursprungs,
gemischt synthetischen und cDNA-Ursprungs oder gemischt genomischen
und cDNA Ursprungs sein, die durch das Ligieren von Fragmenten synthetischen,
genomischen oder cDNA Ursprungs (wie angemessen, die Fragmente, die
verschiedenen Teilen der Gesamt-DNA-Sequenz
entsprechen) in Übereinstimmung
mit Standardtechniken hergestellt werden. Die DNA-Sequenz kann auch
durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von spezifischen
Primern, zum Beispiel wie in
US
4,683,202 oder R.K. Saiki et al., (1988), Science 239,
1988, S. 487–491
beschrieben, hergestellt werden.
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Ortsgerichtete Mutagenese
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Nachdem
eine Cutinase-codierende DNA-Sequenz isoliert und wünschenswerte
Stellen für
Mutationen identifiziert wurden, können unter Verwendung synthetischer
Oligonucleotide Mutationen eingeführt werden. Diese Oligonucleotide
enthalten Nucleotidsequenzen, die die gewünschten Mutationsstellen flankieren. Bei
einem speziellen Verfahren wird eine einzelsträngige DNA-Lücke, die Cutinase-codierende
Sequenz, in einem Vektor erzeugt, der das Cutinase-Gen trägt. Dann
wird das synthetische Nucleotid, das die gewünschte Mutation trägt, mit
einem homologen Teil der einzelsträngigen DNA anneliert. Die verbleibende
Lücke wird dann
mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aufgefüllt, und das Konstrukt wird
unter Verwendung von T4-Ligase ligiert. Ein spezielles Beispiel
für dieses
Verfahrens wird bei Morinaga et al., (1984), Biotechnology 2, S.
646–639
beschrieben.
US 4,760,025 offenbart
das Einführen
von Oligonucleotiden, die mehrere Mutationen codieren, durch die
Durchführung
kleiner Änderungen
der Kassette. Allerdings kann eine noch größere Auswahl von Mutationen
durch das Morinaga-Verfahren beliebig eingeführt werden, weil eine Vielzahl
von Oligonucleotiden verschiedener Länge eingeführt werden kann.
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Ein
weiteres Verfahren zur Einführung
von Mutationen in Cutinase-codierende DNA-Sequenzen wird bei Nelson und Long,
(1989), Analytical Biochemistry 180, S. 147–151 beschrieben. Es schließt die 3-Schritt-Erzeugung
eines PCR-Fragments ein, das die Mutation enthält, die unter Verwendung eines
chemisch synthetisierten DNA-Strangs als einer der Primer bei den
PCR-Reaktionen eingeführt
wurde. Von dem PCR-erzeugten Fragment kann ein DNA-Fragment, das
die Mutation trägt,
durch Spaltung mit Restriktionsendonukleasen isoliert und in ein
Expressionsplasmid reinseriert werden.
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Expression von Cutinase-Varianten
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Gemäß der Erfindung
kann eine durch die vorstehend beschriebenen Verfahren oder durch
beliebige auf dem Fachgebiet bekannte alternative Verfahren produzierte
DNA-Sequenz, die die Variante in Enzymform codiert, unter Verwendung
eines Expressionsvektors exprimiert werden, der typischerweise Kontrollsequenzen,
die einen Promotor codieren, einen Operator, eine Ribosomen-Bindungsstelle,
ein Translationsinitiationssignal und gegebenenfalls ein Regressorgen
oder verschiedene Aktivatorgene einschließt.
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Expressionsvektor
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Der
rekombinante Expressionsvektor, der die DNA-Sequenz trägt, die
eine erfindungsgemäße codiert, kann
ein Vektor sein, der zweckmäßigerweise
rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen werden kann, und die Wahl
des Vektors hängt
oft von der Wirtszelle ab, in welche er eingeführt werden soll. Der Vektor
kann ein Vektor sein, der bei Einführung in die Wirtszelle in
das Wirtszellgenom integriert und zusammen mit dem/den Chromosom(en),
in welche(s) er integriert wurde, repliziert wird. Beispiele von
passenden Expressionsvektoren schließen pMT838 ein.
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Promotor
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In
dem Vektor sollte die DNA-Sequenz mit einer geeigneten Promotorsequenz
operabel verknüpft sein.
Der Promotor kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, welche in der
Wirtszelle der Wahl Transkriptionsaktivität zeigt, und kann von Genen
abgeleitet sein, die Proteine codieren, die zur Wirtszelle entweder
homolog oder heterolog sind.
-
Beispiele
für geeignete
Promotoren zur Steuerung der Transkription der DNA-Sequenz, die
eine erfindungsgemäße Cutinase-Variante
codiert, insbesondere in einem bakteriellen Wirt, sind die Promotoren
des lac Operons von E. coli, die Streptomyces coelicolor Agarase
Gen dagA Promotoren, die Promotoren des Bacillus licheniformis α-Amylase
Gens (amyL), die Promotoren des Bacillus stearothermophilus maltogenischen
Amylase Gens (amyM), die Promotoren der Bacillus amyloliquefaciens α-Amylase
(amyQ), die Promotoren der Bacillus subtilis xylA and xylB Gene
etc. Zur Transkription in einem Pilzwirt sind Beispiele für geeignete
Promotoren solche Promotoren, die sich von dem Gen ableiten, das
die A. oryzae TAKA Amylase codiert, der TPI (Triosephosphat-Isomerase)
Promotor von S. cerevisiae (Alber et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet
1, S. 419–434),
Rhizomucor miehei Aspartatprotease, A. niger neutrale α-Amylase,
A. niger säurestabile α-Amylase,
A. niger Glucoamylase, Rhizomucor miehei Lipase, A. oryzae alkalische
Protease, A. oryzae Triosephosphat-Isomerase oder A. nidulans Acetamidase.
-
Expressionsvektor
-
Der
erfindungsgemäße Expressionsvektor
kann auch einen passenden Transkriptionsterminator und, in Eukaryoten,
Polyadenylierungssequenzen umfassen, die mit der DNA-Sequenz operabel
verknüpft
sind, die die erfindungsgemäße α-Amylase
Variante codiert. Terminations- und Polyadenylierungssequenzen können zweckmäßigerweise
von den gleichen Quellen wie der Promotor abgeleitet sein.
-
Der
Vektor kann außerdem
eine DNA-Sequenz umfassen, die es dem Vektor ermöglicht, sich in der in Frage
kommenden Wirtszelle zu replizieren. Beispiele solcher Sequenzen
sind die Replikationsstartpunkte der Plasmide pUC19, pACYC177, pUB110,
pE194, pAMB1 und pIJ702.
-
Der
Vektor kann auch einen selektierbaren Marker enthalten, z. B. ein
Genprodukt, welches einen Defekt in der Wirtszelle ausgleicht, wie
die dal Gene aus B. subtilis oder B. licheniformis, oder einen Marker,
der eine Antibiotikum-Resistenz verleiht, wie Ampicillin-, Kanamycin-,
Chloramphenicol- oder Tetracyclinresistenz. Außerdem kann der Vektor Aspergillus-Selektions-Marker,
wie amdS, argB, niaD und sC, einen Marker, der Hygromycinresistenz
verleiht, umfassen, oder die Selektion kann durch Cotransformation
erfolgen, z. B. wie beschrieben in
WO
91/17243 .
-
Die
Verfahren, die verwendet werden, um das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt,
das eine Cutinase-Variante codiert, den Promotor, Terminator bzw.
andere Elemente zu ligieren und sie in die passenden Vektoren zu
inserieren, die die für
die Replikation notwendige Information enthalten, sind dem Fachmann
wohlbekannt (vgl., z. B., Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor, 1989).
-
Wirtszellen
-
Die
erfindungsgemäße Zelle,
die entweder ein DNA-Konstrukt oder einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor,
wie vorstehend definiert, umfasst, wird zweckmäßigerweise als Wirtszelle bei
der rekombinanten Herstellung einer erfindungsgemäßen Cutinase-Variante
verwendet. Die Zelle kann mit dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt, das die
Variante codiert, transformiert werden, zweckmäßigerweise durch Einbau des DNA-Konstrukts
(in einer oder mehreren Kopien) in das Wirtschromosom. Dieser Einbau
wird im Allgemeinen als ein Vorteil betrachtet, da die DNA-Sequenz
wahrscheinlicher in der Zelle stabil aufrechterhalten wird. Der Einbau
des DNA-Konstrukts in das Wirtschromosom kann nach konventionelle
Verfahren, z. B. durch homologe oder heterologe Rekombination, durchgeführt werden.
Alternativ kann die Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, wie
vorstehend in Verbindung mit den verschiedenen Typen von Wirtszellen
beschrieben, transformiert werden.
-
Die
erfindungsgemäße Zelle
kann eine Zelle eines höheren
Organismus, wie eines Säugetiers
oder eines Insekts, sein, ist aber vorzugsweise eine mikrobielle
Zelle, z. B. eine Bakterien- oder
Pilz-(inklusive Hefe-)Zelle.
-
Beispiele
für geeignete
Bakterien sind Gram-positive Bakterien, wie Bacillus subtilis, Bacillus
licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus,
Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans,
Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus
thuringiensis oder Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus,
oder Gram-negative Bakterien wie E. coli. Die Transformation der Bakterien
kann z. B. durch Protoplasten-Transformation oder unter Verwendung
kompetenter Zellen in einer per se bekannten Weise erfolgen.
-
Der
Hefe-Organismus kann bevorzugt aus einer Spezies von Saccharomyces
oder Schizosaccharomyces, z. B. Saccharomyces cerevisiae ausgewählt sein.
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Die
Wirtszelle kann auch ein filamentöser Pilz sein, z. B. ein Stamm,
der einer Spezies von Aspergillus, besonders bevorzugt Aspergillus
oryzae oder Aspergillus niger, angehört, oder ein Fusarium-Stamm,
wie ein Stamm von Fusarium oxysporium, Fusarium graminearum (im
perfekten Stadium benannt als Gribberella zeae, früher Sphaeria
zeae, synonym mit Gibberella roseum und Gibberella roseum f. sp.
cerealis) oder Fusarium sulphureum (im perfekten Status benannt
als Gibberella puricaris, synonym mit Fusarium trichothecioides,
Fusarium bactridioides, Fusarium sambucium, Fusarium roseum, und
Fusarium roseum var. graminearum), Fusarium cerealis (synonym mit
Fusarium crokkwellens), oder Fusarium venenatum.
-
Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist die Wirtszelle ein Proteasedefizienter oder Protease-minus
Stamm.
-
Dies
kann z. B. der Protease-defiziente Stamm Aspergillus oryzae JaL
125 sein, in dem das alkalische Protease-Gen, das „alp" genannt wird, deletiert
ist. Dieser Stamm wird in
WO
97/35956 (Novo Nordisk) beschrieben.
-
Filamentöse Pilzzellen
können
durch ein Verfahren transformiert werden, das Protoplasten-Transformation und
Transformation der Protoplasten und anschließende Regeneration der Zellwand
in einer per se bekannten Weise umfasst. Die Verwendung von Aspergillus
als Wirts-Mikroorganismus ist in
EP
238 023 (Novo Nordisk A/S) beschrieben, deren Inhalt hiermit
durch Bezugnahme mit eingeschlossen ist.
-
Herstellung der Cutinase-Variante
durch Kultivierung des Transformanten
-
Die
Erfindung betrifft, inter alia, ein Verfahren zur Herstellung einer
erfindungsgemäßen Cutinase-Variante,
wobei das Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle unter Bedingungen, die
der Produktion der Variante förderlich
sind, und das Gewinnen der Variante aus den Zellen und/oder Kulturmedium
umfasst.
-
Das
zur Kultivierung der Zellen verwendete Medium kann jedes herkömmliche
Medium sein, das für das
Wachsen der fraglichen Wirtszelle und zum Erhalt der Expression
der erfindungsgemäßen Cutinase-Variante
geeignet ist. Passende Medien sind von kommerziellen Lieferanten
erhältlich
oder können
nach veröffentlichten
Rezepturen hergestellt werden (z. B. wie in Katalogen der American
Type Culture Collection beschrieben).
-
Die
von den Wirtszellen sezernierte Cutinase-Variante kann zweckmäßigerweise
aus dem Kulturmedium durch wohlbekannte Verfahren gewonnen werden,
einschließlich
Abtrennen der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration
und Präzipitation
der Protein-Komponenten des Mediums durch Salz, wie Ammoniumsulfat,
gefolgt von der Verwendung chromatographischer Verfahren, wie Ionenaustauscherchromatographie,
Affinitätschromatographie
oder ähnliche.
-
Expression der Variante in
Pflanzen
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine transgene Pflanze,
Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, welche mit einer DNA-Sequenz, die
die erfindungsgemäße Variante
codiert, transformiert wurde, um dieses Enzym in gewinnbaren Mengen
zu exprimieren und zu produzieren. Alternativ kann die Pflanze oder
der Pflanzenteil, der das rekombinante Enzym enthält, als
solcher verwendet werden.
-
Die
transgene Pflanze kann zweikeimblättrig oder einkeimblättrig, kurz
dikotyl oder monokotyl, sein. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind
Gräser,
wie Wiesengras (Blaues Gras, Poa), Futtergras, wie Festuca, Lolium,
gemäßigtes Gras,
wie Agrostis und Getreide, wie z. B. Weizen, Hafer, Roggen, Gerste,
Reis, Hirse. und Mais (Korn).
-
Beispiele
für dikotyle
Pflanzen sind Tabak, Gemüse,
wie Lupinen, Kartoffeln, Zuckerrübe,
Erbse, Bohne und Sojabohne und Kruziferen (Familie Brassicaceae)
wie Blumenkohl, Raps und der nah verwandte Modellorganismus Arabidopsis
thaliana.
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Beispiele
für Pflanzenteile
sind Stamm, Kallus, Laub, Wurzel, Früchte, Saat und Knollen. Im
vorliegenden Zusammenhang werden auch spezielle Pflanzengewebe,
wie Chloroplasten, Apoplasten, Mitochondrien, Vakuole, Peroxisomen
und Cytoplasma, als Pflanzenteil angesehen. Außerdem wird jede Pflanzenzelle,
gleich welchen Gewebe-Ursprungs, als Pflanzenteil angesehen.
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Ebenfalls
im Schutzumfang der Erfindung liegen die Nachkommen von solchen
Pflanzen, Pflanzenteilen und Pflanzenzellen.
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Die
transgene Pflanze oder Pflanzenzelle, die die erfindungsgemäße Variante
exprimiert, kann in Übereinstimmung
mit auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren konstruiert werden. Kurz
gesagt wird die Pflanze oder Pflanzenzelle durch Einbringen von
einem oder mehreren Expressionskonstrukten, die das erfindungsgemäße Enzym
codieren, in das Wirtspflanzengenom und Vermehren der resultierenden
modifizierten Pflanze oder Pflanzenzelle zu einer transgenen Pflanze
oder Pflanzenzelle konstruiert.
-
Zweckmäßigerweise
ist das Expressionsprodukt ein DNA-Konstrukt, welches ein Gen. das
das erfindungsgemäße Enzym
codiert, in operabler Assoziation mit geeigneten regulatorischen
Sequenzen umfasst, die für
die Expression des Gens in der Pflanze oder dem Pflanzenteil der
Wahl erforderlich sind. Außerdem kann
das Expressionskonstrukt einen selektierbaren Marker, der für die Identifizierung
von Wirtszellen geeignet ist, in die das Expressionskonstrukt eingebaut
wurde, und DNA-Sequenzen, die zur Einführung des Konstrukts in die
fragliche Pflanze (letzteres hängt
von dem einzusetzenden DNA-Einführungsverfahren
ab) notwendig sind, umfassen.
-
Die
Wahl regulatorischer Sequenzen, wie Promotor- und Terminator-Sequenzen,
und fakultativ Signal- und Transitsequenzen wird z. B. auf der Grundlage
davon bestimmt, wann, wo und wie das Enzym exprimiert werden soll.
Die Expression des Gens, das das erfindungsgemäße Enzym codiert, kann z. B.
konstitutiv oder induzierbar sein oder kann Entwicklungs-, Stadien-
oder Stoff-spezifisch sein, und das Genprodukt kann auf ein spezielles
Gewebe oder einen speziellen Pflanzenteil, wie Samen oder Laub,
gerichtet sein. Regulatorische Sequenzen werden z. B. von Tague
et al., Plant, Phys., 86, 506, 1988 beschrieben.
-
Für die konstitutive
Expression kann der 35S-CaMV-Promotor verwendet werden (Franck et
al., 1980. Cell 21: 285–294).
Organ-spezifische Promotoren können
z. B. sein ein Promotor aus Speichergeweben, wie Samen, Kartoffelknollen
und Früchten
(Edwards & Coruzzi,
1990. Annu. Rev. Genet. 24: 275–303)
oder aus metabolischen Speichergeweben, wie Meristeme (Ito et al.,
1994. Plant Mol. Biol. 24: 863–878),
ein Saat-spezifischer Promotor, wie der Glutelin-, Prolamin-, Globulin-
oder Albumin-Promotor aus Reis (Wu et al., Plant and Cell Physiology
Band 39, Nr. 8 S. 885–889
(1998)), ein Vicia faba Promotor aus dem Legumin B4 und dem unbekannten
Saat Proteingen aus Vicia faba, beschrieben von Conrad U. et al.,
Journal of Plant Physiology Band 152, Nr. 6 S. 708–811 (1998),
ein Promotor eines Saatölkörperproteins
(Chen et al., Plant and cell physiology Band 39, Nr. 9 S. 935–941 (1998),
der Lagerprotein napA-Promotor aus Brassica napus oder ein beliebiger
anderer Saat-spezifischer
Promotor, der auf dem Fachgebiet bekannt ist, wie z. B. in
WO 91/14772 beschrieben.
Außerdem
kann der Promotor ein laubspezifischer Promotor sein, wie der rbcs
Promotor aus Reis oder Tomate (Kyozuka et al., Plant Physiology
Band 102, Nr. 3 S. 991–1000
(1993)), der Chlorellavirus Adeninmethyltransferase-Gen-Promotor
(Mitra, A. und Higgins, DW, Plant Molecular Biology Band 26, Nr.
1, S. 85–93
(1994) oder der aldP-Genpromotor
aus Reis (Kagaya et al., Molecular and General Genetics Band 248,
Nr. 6 S. 668–674
(1995) oder ein Wund-induzierbarer Promotor, wie der Kartoffel pin2-Promotor
(Xu et al., Plant Molecular Biololgy Band 22, Nr. 4 S. 573–588 (1993).
-
Ein
Promotor-Enhancer-Element kann verwendet werden, um eine höhere Expression
des Enzyms in der Pflanze zu erreichen. Z. B. kann das Promotor-Enhancer-Element
ein Intron sein, welches zwischen den Promotor und die Nucleotidsequenz,
die das Enzym codiert, angeordnet ist. Z. B. beschreiben Xu et al.
die Verwendung des ersten Introns des Reis-Actin 1 Gens, um Expression
zu verbessern.
-
Das
selektierbare Markergen und jeder andere Teil des Expressions-Konstrukts
kann aus denjenigen gewählt
werden, die auf dem Fachgebiet verfügbar sind.
-
Das
DNA-Konstrukt wird in das Pflanzengenom nach konventionellen auf
dem Fachgebiet bekannten Verfahren eingebaut, einschließlich Agrobacterium-vermittelte
Transformation, Virus-vermittelte Transformation, Mikroinjektion,
Partikelbombardement, biolistische Transformation und Elektroporation
(Gasser et al., Science, 244, 1293; Potrykus, Bio/Techn. 8, 535,
1990; Shimamoto et al., Nature, 338, 274, 1989).
-
Derzeit
ist der Agrobacterium Tumefaciens-vermittelte Gentransfer das Verfahren
der Wahl zur Herstellung transgener Dikotyle (für einen Überblick: Hooykas & Schilperoort,
1992. Plant Mol. Biol. 19: 15–38), allerdings
kann er auch zur Transformation von Monokotylen verwendet werden,
obwohl allgemein andere Transformationsverfahren für diese
Pflanzen bevorzugt sind. Derzeit ist der Teichenbeschuss das Verfahren der
Wahl zur Erzeugung von transgenen Monokotylen (mikroskopische Gold-
oder Wolfram-Partikel beschichtet mit der transformierenden DNA),
von embryonalen Kalli oder sich entwickelnden Embryonen (Christou, 1992.
Plant J. 2: 275–281;
Shimamoto, 1994. Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158–162; Vasil et al., 1992. Bio/Technology
10: 667–674).
Ein alternatives Verfahren zur Transformation von Monokotylen beruht
auf der Protoplasten-Transformation, wie von Omirulleh, S. et al.,
Plant Molecular Biology Band 21, Nr. 3, S. 415–428 (1993) beschrieben.
-
Nach
der Transformation werden die Transformanten, die das Expressionskonstrukt
eingebaut aufweisen, selektiert und nach auf dem Fachgebiet wohlbekannten
Verfahren zu ganzen Pflanzen regeneriert.
-
Material und Verfahren
-
Plasmide
-
pJSO026
-
Dieses
ist ein S. cerevisiae Expressionsplasmid, beschrieben in
WO 97/07205 und bei J.S.
Okkels, (1996) „A
URA3-promoter deletion in a pYES vector increases the expression
level of a fungal lipase in Saccharomyces cerevisiae. Recombinant
DNA Biotechnology III: The Integration of Biological and Engineering Sciences,
Band 782 der Annals of the New York Academy of Sciences).
-
pFuku83
-
Dieses
ist ein Hefe- und E. coli-Shuttlevektor zur Expression der H. insolens
Cutinase unter Kontrolle eines TPI-Promotors, konstruiert aus pJSO026.
-
Substrat
-
BETEB
-
Therephthalsäure-bis(2-hydroxyethyl)ester-dibenzoat
wird hier als BETEB (Benzoyl-ethylen-terephthal-ethylen-benzoat) abgekürzt. Sie
wurde aus Therephthalsäure-bis(2-hydroxyethyl)ester
und Benzoesäure hergestellt.
-
Lipase-Aktivität (LU)
-
Ein
Substrat für
Lipase wird durch Emulgieren von Tributyrin (Glycerintributyrat)
unter Verwendung von Gummi Arabicum als Emulgator hergestellt. Die
Hydrolyse von Tributyrin bei 30°C
bei pH 7 erfolgt in einem pH-stat Titrationsexperiment. Eine Einheit
Lipaseaktivität
(1 LU) ist gleich die Menge Enzym, die 1 μmol Buttersäure/Minute unter Standardbedingungen
freisetzen kann.
-
Differential Scanning Calorimetrie (DSC)
-
Proben-
und Referenzlösung
werden unmittelbar vor Laden der Proben in das Calorimeter (Referenz: Puffer
ohne Enzym) vorsichtig entgast. Proben- und Referenzlösungen (etwa
0,5 ml) werden für
20 Minuten bei 5°C
thermisch voräquilibriert.
Der DSC-Scan wird von 5°C
bis 95°C
bei einer Scanrate von etwa 90 K/h durchgeführt. Denaturierungstemperaturen
werden mit einer Genauigkeit von etwa +/– 1°C bestimmt. Ein VP-DSC von MicroCal
Inc. ist für
die Experimente geeignet.
-
Verfahren
-
PCR-Bedingungen
-
- Schritt 1: 94°C,
120 Sek.
- Schritt 2: 94°C,
60 Sek.
- Schritt 3: 50°C,
60 Sek.
- Schritt 4: 72°C,
150 Sek.
- Zurückgehen
zu Schritt 2, 35 Zyklen
- Schritt 5: 72°C,
480 Sek.
- Schritt 6: 4°C
für immer
-
Beispiele
-
Beispiel 1: Herstellung von Cutinase-Varianten
-
Eine
DNA-Sequenz, die H. insolens Cutinase codiert, wurde wie in
US 5,827,719 (Novo Nordisk)
beschrieben erhalten, und es wurde festgestellt, dass sie eine DNA-Sequenz,
wie hier in SEQ ID NO: 1 gezeigt, aufweist.
-
Varianten
wurden durch lokalisierte Zufalls-Mutagenese und Selektion von positiven
Klonen durch Inkubation bei 60°C
für einen
Tag auf BETER-Platten hergestellt. Die BETER-Platten enthielten
200 ml/l 500 mM Glycin-Puffer (pH 8,5), 1,25 g/l BETER (aufgelöst in heißem Ethanol)
und 20 g/l Agar.
-
Drei
positive Varianten wurden isoliert, und ihre Aminosäuresequenz
wurde bestimmt. Es wurde festgestellt, dass sie, verglichen mit
der Eltern-H. insolens-Cutinase, folgende Modifikationen aufweisen:
A14P
+ E47K
E47K
E179Q
-
Beispiel 2: Ortsgerichtete Mutation
-
Eine
Variante der H. insolens Cutinase mit den Substitutionen E6Q + E47K
+ R51P wurde wie folgt hergestellt:
Ein Paar PCR-Primer wurde
entworfen, so dass unter Verwendung der nahebei existierenden Restriktionsenzym-Schnittstellen
Aminosäuresubstitutionen
wie folgt eingeführt
wurden (ein Stern zeigt eine eingeführte Mutation an):
Oberer
Primer: E6QF
cgg cag ctg gga gcc atc c*ag aac
Pvu II
Unterer
Primer: E47K, R51P
cgc cct gga tcc aga tgt tcg* gga tgt ggg
act t*aa ggc
BamH I
-
Die
PCR wurde unter Verwendung dieser Primer und pFukuNL83 als Templat
unter den vorstehend beschriebenen PCR-Bedingungen durchgeführt.
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Die
erhaltenen PCR-Fragmente wurde mit Clontech Spin-Säulen gereinigt
und mit Pvu II und BamHI verdaut.
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Das
resultierende Fragment wurde Gel-gereinigt und an pFukuNL83 ligiert,
welches mit den gleichen Restriktionsenzymstellen verdaut worden
war.
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Beispiel 3: Wärmestabilität von Cutinase-Varianten
-
Varianten
-
Die
Wärmestabilität wurde
getestet, wie nachstehend für
die H. insolens Cutinase und ihre folgenden Varianten beschrieben:
A14P
+ E47K
E47K
E179Q
E6Q + E47K + R51P
A14P + E47K
+ E179Q
E6Q + A14P + E47K + R51P + E179Q
E6Q + E10Q +
A14P + E47K + R51P + E179Q
-
Differential Scanning Calorimetrie (DSC)
-
Die
Wärmestabilität von Cutinase-Varianten
wurde mittels DSC bei pH 4,5 (50 mM Acetat-Puffer) und pH 8,5 (50 mM Glycyl-Glycin-Puffer)
untersucht. Die thermische Denaturierungstemperatur, Td,
wurde als die Spitze des Denaturierungssignals (größter endothermer
Peak) in den erhaltenen Thermogrammen (Cp vs. T) herangezogen, die
nach Erwärmen
der Enzymlösungen
bei einer konstanten programmierten Aufwärmgeschwindigkeit erhalten
wurden.
-
Es
wurde festgestellt, dass die Eltern-Cutinase eine Td von
63°C bei
pH 8,5 aufweist. Es wurde festgestellt, dass sechs der obigen Varianten
eine Td von 70–73°C aufweisen, d. h. eine Verbesserung
von 7–10°C.
-
Es
wurde festgestellt, dass die Eltern-Cutinase eine Td von
61°C bei
pH 4,5 aufweist. Es wurde festgestellt, dass fünf der obigen Varianten eine
Td von 64–66°C aufweisen, d. h. eine Verbesserung
von 3–5°C.
-
Hydrolyse von BETER
-
Die
Wärmestabilität der H.
insolens Cutinase und zwei der obigen Varianten wurde durch Hydrolyse von
BETER bei erhöhter
Temperatur gemessen. Für
jede der Cutinasen wurde die folgende Mischung 17 h bei verschiedenen
Temperaturen im Bereich 55–70°C inkubiert:
0,1
ml 0,5 M Glycyl-Glycin-Puffer (pH 8,5)
0,1 ml 0,5 % BETEB aufgelöst in Ethanol
0,1
ml Enzymlösung
(etwa 25 LU/ml)
0,7 ml MilliQ-Wasser
-
Der
Hydrolysegrad wurde nach der Inkubation gemessen. Die Ergebnisse
sind in der Tabelle nachstehend gezeigt.
| | Variante | Variante | Eltern |
| | 27
LU/ml | 25
LU/ml | 24
LU/ml |
| 55°C | 98% | 99% | 72% |
| 60°C | 91% | 83% | 33% |
| 65°C | 66% | 13% | 7% |
-
Diese
Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die Varianten eine im Vergleich
zur Eltern-Cutinase verbesserte Wärmestabilität aufweisen.
-
Hydrolyse von BETEB
-
Die
Wärmestabilität der H.
insolens Cutinase und drei der obigen Varianten wurde durch Hydrolyse von
BETEB bei 60°C
für 2 Stunden
gemessen. Die Hydrolyse wurde unter den obigen Bedingungen durchgeführt, außer dass
die Temperatur bei 60°C
festgehalten und die Cutinase-Dosierung variiert wurde. Die Ergebnisse
sind in der Tabelle nachstehend gezeigt.
| LU/ml | Variante | Variante | Variante | Eltern |
| 0 | 0% | 0% | 0% | 0% |
| 10 | 97% | 99% | 9% | 6% |
| 20 | 98% | 99% | 74% | |
| 50 | 98% | 94% | 93% | 15% |
| 100 | 88% | 69% | 92% | 34% |
| 300 | | | | 41% |
| 600 | | | | 63% |
| 1200 | | | | 82% |
-
Die
Ergebnisse zeigen eine viel schnellere Hydrolyse bei 60°C mit den
Varianten als mit der Eltern-Cutinase.
-
Beispiel 4: Hydrolyse von c3ET
-
Die
H. insolens Cutinase und fünf
der obigen Varianten wurden bei der Hydrolyse von c3ET bei erhöhter Temperatur
getestet. Für
jede Cutinase wurde die folgende Mischung 2 Stunden bei verschiedenen
Temperaturen inkubiert.
| 0,115
mg | c3ET
(0,1 ml von 2 mM c3ET, aufgelöst
in HFIP, wurde in einem |
| | Reaktionsgefäß vorgelegt.
Das Lösungsmittel
wurde unter Vakuum entfernt, |
| | dann
bei 70°C über Nacht
getrocknet) |
| 0,1
ml | 0,5
M Glycylglycin-Puffer (pH 8,5) |
| 0,1
ml | Enzymlösung (etwa
600 LU/ml) |
| 0,8
ml | MilliQ-Wasser |
-
Nach
der Inkubation wurden jeder Reaktionsmischung 2 ml 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro2-propanol
(HFIP) zugegeben, dann wurde die Hydrolyserate mit HPLC gemessen.
Die Ergebnisse in 3 zeigen eindeutig, dass die
Varianten eine im Vergleich zur Eltern-Cutinase verbesserte Wärmestabilität aufweisen.
-
Beispiel 5: Hydrolyse von c3ET auf Garn
-
Die
Wärmestabilität der H.
insolens Cutinase 5 der obigen Varianten wurde unter Verwendung
von Polyester-Garn, das c3ET als Nebenprodukt enthält, getestet.
Die folgende Substratmischung wurde bei 60 oder 65°C vorinkubiert:
| 0,1
g | Polyester-Garn |
| 0,2
ml | 0,5
mM Glycylglycin-Puffer (pH 8,5) |
| 1,7
ml | MilliQ-Wasser |
-
Nach
der Vorinkubation wurden jedem Reaktionsgefäß 0,1 ml Enzymlösung (etwa
1000 LU/ml) zugegeben und 17 Stunden inkubiert. Dann wurden 2 ml
HFIP zugegeben und 30 Minuten stehen gelassen, um c3ET, das auf
der Oberfläche
des Polyester-Garns sitzt, zu extrahieren und zu hydrolysieren;
dann wurde der Hydrolysegrad bestimmt. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
-
Man
sieht, dass die Varianten für
die Hydrolyse von c3ET auf Polyester-Garn wirksamer sind als die Eltern-Cutinase.
Eine Variante ergibt bei 65°C
einen höheren
Hydrolysegrad als bei 60°C.
-
Beispiel 6: Behandlung von Garn mit Cutinase-Variante
-
Zeitverläufe der
c3ET-Hydrolyse auf Polyester-Garn bei verschiedener Temperatur oder
Dosierung wurden untersucht. Der Zeitverlauf bei verschiedenen Temperaturen
wird in 5 gezeigt. Man sieht, dass die optimale
Temperatur 65°C
ist. Bei 70°C
ist noch etwa die Hälfte
der Aktivität übrig. Der
Zeitverlauf mit erhöhter Enzym-Dosierung
wird in 6 gezeigt. Man sieht, dass die
Kurven bei der Dosis 275 und 550 LU/ml gleich sind, was zeigt, dass
die Hydrolyserate bei 100 bis 275 LU/ml ein Plateau erreichte. Vermutlich
sind 200 LU/ml genug.
-
Beispiel 7: Färben von Polyester mit Reaktivfarbstoff
-
Die
folgenden Polyester-Stoffe wurden behandelt:
Gewebter Stoff;
ca. 2 × 2
cm, 34 mg
Gestrickter Stoff; ca. 1,5 × 1,5 cm; 50 mg
-
Jeder
Stoff wurde in 0,9 ml, 50 mM GlyGly (Glycyl-Glycin) Puffer (pH 8,5)
und 0,1 ml Lösung
einer Variante der H. insolens-Cutinase (1100 LU/ml) eingeweicht
und bei 65 oder 70°C
inkubiert. Nach einem Tag wurden weitere 0,1 ml Enzymlösung zugegeben,
die Inkubation wurde für
mehr als zwei Tage fortgesetzt, die Stoffe wurden dann herausgenommen
und in Wasser gespült.
Ein Vergleichsexperiment wurde mit der Eltern-Cutinase vorgenommen, und eine Blindprobe
wurde auf die gleiche Weise ohne Enzym behandelt.
-
Die
Stoffe wurden in einer Mischung von 9 g 120 g Na2SO4 und 60 g Na2CO3 in 3 Liter deionisiertem Wasser bei 60°C für 30 Minuten
gerührt
und dann mit laufendem warmem Wasser gespült. Der Reaktivfarbstoff war
Celmazol Brilliant Blau B (Produkt von Mitsui Chemical Co., Japan),
welcher die Struktur Chromophor-NHPh-SO2CH2CH2OSO3Na
aufweist.
-
Bei
allen vier Experimenten (gewebt und gestrickt, 65 und 70°C) wurden
die Stoffe gleichmäßig gefärbt.
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Beispiel 8: Solubilisierung von Polyesterfragmenten
aus Strickstoff
-
Eine
1 × 1
cm Probe von Polyester (PET, Polymer von Ethylengylcol und Terephthalsäure)-Strickstoff wurde
1 Stunde in 1 ml Puffer bei pH 10, 60°C mit 0,01 mg einer Variante
der H. insolens-Cutinase inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde abgetrennt,
und die Freisetzung von Terephthalsäure wurde durch Messungen der
OD bei 250 nm (ausgedrückt
als OD
250/mg PET) bestimmt. Vergleichsexperimente
wurden ohne Enzym oder mit der Eltern-Cutinase vorgenommen. Ergebnisse:
| | Enzym | OD250 |
| Erfindung | Cutinase-Variante | 4,5 |
| Referenz | Eltern-Cutinase | 0,3 |
| ohne | 0,1 |
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass die Variante für die Solubilisierung von Polyester
wirksam ist.
-
Bei
einem anderen Experiment wurde die Cutinase-Variante 2 Stunden bei
65°C mit
und ohne Zugabe von nicht-ionischen Tensiden (Alkoholethoxylat,
Produktname Softanol 50) unter Verwendung verschiedener Mengen der
Variante von 0,5 bis 200 LU/ml getestet. Die Ergebnisse zeigten
in Gegenwart eines nicht-ionischen Tensids eine stärkere Solubilisierung.
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Beispiel 9: Hydrolyse von Polycaprolacton-
und Polyester-Film
-
Etwa
0,1 g Polycaprolacton- oder Polyester-Film wurden in Röhrchen gegeben.
Sie wurden in 5 ml 50 mM GlyGly-Puffer (pH 8,5) mit oder ohne eine
Variante der H. insolens-Cutinase (450 LU) eingeweicht. Sie wurden
5 Stunden bei 70°C
inkubiert. Nach der Reaktion stellten wir auf der Oberfläche der
Röhrchen
mit Enzym sowohl mit Polycaprolacton- als auch mit Polyester-Film
eine dünne
Hydrolysatschicht fest.
-
Andererseits
wurde in Kontrollen ohne Enzym keine Veränderung beobachtet. Im Fall
von Polycaprolacton gab es einen Gewichtsverlust von 10 %, Bei Polyester
sehen wir keine Gewichtsänderung.
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Beispiel 10: cPET-Hydrolyse
-
Die
Leistung einer Cutinase-Variante wurde mit dem Eltern-Enzym (H.
insolens-Cutinase) verglichen. Die Versuche wurden wie folgt vorgenommen:
Eine
Oligomer-gefärbte
Stoffprobe von (schwarzem) PET-Stoff (etwa 4 cm × 13 cm) wird bei relativ langsamem Schütteln in
einem so genannten Mini-Tergitometer der Enzym- Behandlung unterzogen. Der PET-Stoff
wird auf einem zylindrischen perforierten Halter befestigt (Radius
ca. 2 cm, Höhe
ca. 6 cm), der sich um seine Achse dreht, und wobei die Oligomer-gefärbte Seite
des PET-Stoffs zum Zylinder-Äußeren weist.
-
Der
Stoff wird bei einer gegebenen Temperatur (hier 65°C) in ein
150-ml-Becherglas mit 100 ml Behandlungslösung eingetaucht. Nach einer
gegebenen Behandlungszeit (hier 90 Minuten) wird die PET-Stoffprobe
aus dem Bad genommen und in deionisiertem Wasser gespült und an
der Luft getrocknet.
-
Nach
dem Konditionieren werden die Stoffproben auf der Seite mit der
Oligomer-Färbung
visuell bewertet (in Hinblick auf die Oligomer-Flecken-Entfernung).
Die Bewertung ist wie folgt:
–2: Probe signifikant schlechter
als Blindprobe (kein Enzym)
–1: Probe etwas schlechter
als Blindprobe (kein Enzym)
0: Probe kann von der Blindprobe
nicht unterschieden werden
1: Probe gegenüber Blindprobe etwas verbessert
2:
Probe gegenüber
Blindprobe signifikant verbessert
-
Die
Stoffproben werden auch spektralphotometrisch gelesen (Gerät: Hunterlab
Reflectometer), um die Farbstärke
(K/S-Wert bei 600 nm) zu quantifizieren.
-
Die
Tabelle nachstehend fasst die Test-Bedingungen für einen Versuch zusammen, der
die Leistung von Enzymen unter ähnlichen
Bedingungen vergleicht:
| Temperatur: | 65°C |
| Puffer/pH: | 50
mM Glycinpuffer, pH 10,3 |
| Behandlungszeit
(min) | 90 |
| Enzymdosis
(LU/g) | 30000 |
Die Ergebnisse des Versuchs werden nachstehend
zusammengefasst
| Enzym | visuelle
Bewertung (Durchschn.) | K/S
Unterschied |
| | | @
600 nm |
| ohne | 0
(definiert) | 2,33 |
| Eltern-Cutinase | 0 | 2,38 |
| Cutinase-Variante | 1,5–2,0 | 2,89 |
-
Aus
dieser Reihe von Experimenten scheint es somit, dass das Eltern-Enzym
bei den gegebenen Testbedingungen keine oder nur eine sehr begrenzte
Wirkung bereitstellt (wahrscheinlich weil die Temperatur für das Enzym
zu hoch ist, um Aktivität
zu behalten), während
die Cutinase-Variante eine nennenswerte Entfernung von Oligomer-Färbung aus
PET-Stoff bereitstellt.
-
Beispiel 11: cPET-Hydrolyse
-
Das
pH- und Temperatur-Profil einer Variante der H. insolens-Cutinase
wurde in einem Modell-Dispersionsfärbe-Experiment getestet. Die
Versuche wurden wie folgt durchgeführt: Eine Oligomer-gefärbte Stoffprobe
von (schwarzem) PET-Stoff wird in einem Werner-Mathis-Laborrat den Bedingungen einer
typischen Dispersionfärbungsabfolge
unterzogen. Als Überblick über das
Verfahren wird die Stoffprobe einer Pufferlösung zugegeben, auf 130°C erwärmt, auf
Raumtemperatur abgekühlt.
Enzym oder Puffer wird zugegeben und dann 30 Minuten bei der gewünschten
Temperatur gehalten. Die Lösung
wird auf Raumtemperatur abgekühlt,
und die Trübung
in der Waschlauge wird gemessen. Die verminderte Trübung ist
ein direktes Maß der
Cutinase-Aktivität,
das hydrolysierten cPET-Oligomeren entspricht.
-
Ausführliche
Beschreibung des Experiments:
-
Einer
schwarze PET (etwa 4 cm × 13
cm) Stoffprobe wird zu 140 ml 100 mM Britton-Robinson-Puffer zugesetzt, der 0,2 g/l
Lutensol AT11 (BASF) enthält,
und in den Labomat geladen (32 Drehungen pro Minute).
-
Der
Labomat wird mit einem Gradienten von 9°C/Minute auf 130°C erhitzt
und 10 Minuten gehalten.
-
Die
Bechergläser
werden mit einem Gradienten von 9°C/Minute
auf die Arbeitstemperatur (gemäß der Tabelle
nachstehend) abgekühlt
und 1 Minute gehalten.
-
10
ml Enzymlösung
(100 LU/ml der Variante) oder Pufferlösung (0 LU/ml) bei geeignetem
pH werden in die Bechergläser
injiziert.
-
Der
Labomat wird mit einem Gradienten von 2°C/Minute wieder auf Temperatur
gebracht und 30 Minuten gehalten.
-
Die
Stoffproben werden entnommen, und die Waschlauge wird auf Raumtemperatur
abgekühlt.
-
Die
Trübung
der Waschlaugen wird bestimmt.
-
Bewertung:
die Trübung
wird auf einem Hach 18900 Ratio Turbidimeter (standardisiert mit
den Trübungsstandards
1,8, 18 und 180 NTU) gemessen. Die Enzymleistung wird relativ zu
einer Blindprobe als Differenz zwischen Trübung der Blindprobenflüssigkeit
(kein Enzym) und Trübung
der Enzym-behandelten Waschlauge berechnet.
-
Die
relative Leistung (herabgesetzte Trübung) der Cutinase-Variante
wird berechnet, und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle
gezeigt. Wenn eine negative Zahl erhalten wird, wird das Ergebnis
als „negativ" angegeben. Eine
negative Zahl wird als Artefakt betrachtet, der durch die Schwankung
des Aufbaus hervorgerufen wird.
| Temperatur | pH
7 | pH
8 | pH
9 | pH
10 |
| 60°C | 39 | 57 | 37 | 14 |
| 65°C | 39 | 16 | 60 | 30 |
| 70°C | 25 | 12 | 54 | 33 |
| 75°C | 22 | 50 | 114 | 58 |
| 85°C | negativ | negativ | 15 | negativ |
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass die Cutinase-Variante über einen breiten pH- und Temperaturbereich
aktiv ist, mit einer optimalen Oligomer-Entfernung bei dem aktuellen
Aufbau um pH 9 und 75°C.
Inaktivierung scheint bei oder über
85°C aufzutreten.
-
Beispiel 12: cPET-Hydrolyse
-
Der
Einfluss der Behandlungsdauer wurde für eine Variante der H. Insolens
Cutinase in einem Dispersionsfärbe-Modellexperiment
untersucht. Die Versuche wurden wie folgt durchgeführt:
Eine
Oligomer-gefärbte
Stoffprobe von (schwarzem) PET-Stoff wird in einem Werner-Mathis-Labomat den
Bedingungen einer typischen Dispersionfärbungsabfolge unterzogen. Als Überblick über das
Verfahren wird die Stoffprobe einer Pufferlösung zugegeben, auf 130°C erhitzt,
auf Raumtemperatur abgekühlt.
Enzym oder Puffer (100 mM Britton-Robinson-pH 9) wird zugegeben
und dann 0–40
Minuten bei 75°C
gehalten. Die Lösung wird
auf Raumtemperatur abgekühlt,
und die Trübung
in der Waschlauge wird gemessen. Die verminderte Trübung ist
ein direktes Maß der
Cutinase-Aktivität,
entsprechend hydrolysierten cPET Oligomeren.
-
Ausführliche
Beschreibung des Experiments:
-
Eine
schwarze PET (etwa 4 cm × 13
cm) Stoffprobe wird zu 140 ml 100 mM Britton-Robinson-Puffer zugesetzt, der 0,2 g/l
Lutensol AT11 (BASF) enthält,
und in den Labomat geladen (32 Drehungen pro Minute).
-
Der
Labomat wird mit einem Gradienten von 9°C/Minute auf 130°C erwärmt und
10 Minuten gehalten.
-
Die
Bechergläser
werden auf 75°C
mit einem Gradienten von 9°C/Minute
abgekühlt
und 1 Minute gehalten.
-
10
ml Enzymlösung
(100 LU/ml der Variante) oder 100 mM Britton-Robinson-Puffer pH
9,0 (0 LU/ml) werden in die Bechergläser injiziert.
-
Der
Labomat wird mit einem Gradienten von 2°C/Minute wieder auf 75°C erwärmt und
während
der entsprechenden Zahl von Minuten (0–40 Minuten, siehe Tabelle
nachstehend) gehalten.
-
Die
Stoffproben werden entnommen, und die Waschlauge wird auf Raumtemperatur
abgekühlt.
-
Die
Trübung
der Waschlaugen wird bestimmt.
-
Bewertung:
die Trübung
wird auf einem Hach 18900 Ratio Turbidimeter (mit den Trübungsstandards 1,8,
18 und 180 NTU standardisiert) gemessen. Die Enzymleistung wird
relativ zu einer Blindprobe zum Zeitpunkt Null : Trübung der
Blindprobenflüssigkeit
(kein Enzym) zum Zeitpunkt Null abzüglich Trübung der Enzym-behandelten
Waschlauge (zu einer gegebenen Zeit) berechnet.
-
Die
relative Leistung (verminderte Trübung) der Cutinase-Variante
wurde berechnet, und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle
gezeigt.
| Zeit
(Minuten) | relative
Leistung (verminderte Trübung) |
| 0 | 0 |
| 5 | 42 |
| 10 | 48 |
| 15 | 62 |
| 20 | 69 |
| 25 | 85 |
| 30 | 72 |
| 40 | 78 |
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass die Wirkung des Enzyms mit der Zeit zunimmt.
Bei der aktuellen Enzymdosierung und Oligomerkonzentration scheint
sie oberhalb von etwa 20 Minuten ein Plateau zu erreichen.
-
Beispiel 13: Fasermodifizierung
-
Die
Wirkung auf die Benetzungseigenschaften eines dispersionsgefärbten Polyesterstoffes
wurde durch Behandeln des Stoffes mit einer Variante der H. insolens
Cutinase vor dem Färben
untersucht. Das Experiment bestand daher aus zwei Phasen, der tatsächlichen
Fasermodifikation und dem Dispersionsfärbeverfahren. Phase
1 – Fasermodifikation
| Ausstattung: | Atlas
Launder-O-meter LP2 |
| Stoff: | gestrickter
100% gereinigter Polyester von Testfabrics |
| pH: | 50
mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7 |
| Scheuermittel: | 5
große
Stahlkugeln |
| Becherglasvolumen: | 120
ml |
| Behandlung: | 2
Stunden 65°C,
dann Anstieg auf 90°C
und 1 Stund |
| | Halten |
| Stoffproben-Vorbereitung: | 3 × geschnittene
1,5 g Stoffprobe, 3 pro Becherglas = 4,5 g |
-
Spülen:
-
Spülen in deionisiertem Wasser
-
Phase 2 – Färben – Dispersionsfarbstoff:
-
Farbstofflösung:
-
Zugabe
zu deionisiertem Wasser zum Herstellen eines Flottenverhältnisses
von 1:20–0,4%
Dianix Red (DyStar) SE-CB (owf)
pH 4,5–5
-
Färbeverfahren:
-
- 1. Eine Stoffprobe pro Behandlung aus der Fasermodifikation
wird für
das Färben
verwendet (1,5 g/Stoffprobe wird für die Berechnung des Flottenverhältnisses
verwendet).
- 2. Herstellen eines Färbebades
gemäß der Rezeptur,
vorstehend. Hinzufügen
der kalten Farbstofflösung zu
den Labomat-Bechergläsern
und Erwärmen
auf 55°C
mit einem Gradienten von 3,5°C/Minute.
5 min Laufenlassen nach Erreichen der Temperatur.
- 3. Zugeben des Stoffs zu den Bechergläsern.
- 4. Erhöhen
der Temperatur auf 130°C
mit einem Gradienten von 1,5°C/Minute.
30 min Färben.
- 5. Abkühlen
auf 70°C
mit einem Gradienten von 5°C/Minute.
Ausleeren des Bades, jedoch Sammeln und 10 min heißes Spülen des
Stoffes (60°C).
Nachfolgendes Überlauf-Spülen bei
Raumtemperatur nach dem heißen
Spülen,
bis jegliches Ausbluten zu Erliegen kommt.
- 6. Über
Nacht an der Luft Trocknenlassen.
-
Tests/Auswertungen:
-
- AATCC-Testverfahrenmethode 61 – Farbechtheit
beim Waschen
- Prozent Farbstoffbad-Erschöpfung – Spektralphotometer
- K/S und L*-Reflektometer
- AATCC TM-79 Drop Test
-
Ergebnisse:
-
Die
Ergebnisse der Fasermodifikation werden in der folgenden Tabelle
gezeigt.
| Varianten-Dosierung | Anfärbung (AATCC
TM 61) | Farbveränderung
(K/S @ 530 vor und nach TM-61) | Drop
Test (AATCC TM-79) |
| Blindprobe | 4,5 | 5 | 53
Sek. |
| 50
LU/ml | 4,5 | 5 | 18
Sek. |
| 100
LU/ml | 4,5 | 5 | 15
Sek. |
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung des Polyesters mit der Variante
die Benetzung wesentlich verstärkte.
Mit dem Dispersionsfarbstoff im aktuellen Aufbau werden keine nachteiligen
Auswirkungen auf die Färbbarkeit
festgestellt.
-
Beispiel 14: Verminderung von schlechtem
Geruch in mit menschlichem Schweiß/Talg verschmutzten Textilien durch
Verwendung einer Cutinase-Variante in der Wäsche
-
Die
Leistung von Cutinase im Hinblick auf die Verminderung von schlechtem
Geruch kann in einem Ein-Zyklus-Waschversuch, der in einem Terg-O-tometer
durchgeführt
wird, getestet werden. Experimentelle
Bedingungen
| Waschlauge: | 1000
ml pro Becherglas |
| Stoffproben: | 100%
Polyester (interlock gestrickt, vorher durch Soxhlet- |
| | Extraktion
gereinigt). 24 Stoffproben (3,3 × 3,5 cm) pro |
| | Becherglas. |
| Schmutz: | Menschlicher
männlicher
Achselschweiß und
Talg, aufgetragen |
| | durch
Abwischen der Achselhöhlen
nach sportlicher |
| | Anstrengung. |
| Reinigungsmittel: | 5
g/l eines Standard-Farbwaschmittels. Keine pH-Anpassung. |
| Wasserhärte: | 3,2
mM Ca2+/Mg2+ (im
Verhältnis
5:1) |
| Waschtemperatur: | 30°C |
| Waschzeit: | 30
min |
| Spülen: | 15
min unter laufendem Leitungswasser |
-
Bewertung:
-
Nach
dem Waschen werden die nassen Stoffproben in geschlossene, getönte 200
ml Gläser
verbracht. Ein geschultes sensorisches Panel (9–11 Juroren) bewertet den Geruch
durch Beriechen des Gasraums über
den nassen Proben und bewertet die Gesamtgeruchsintensität. Die Geruchsintensität wird durch Anbringen
einer Markierung auf einer ununterteilten Linienskala von 15 cm
mit Wortmarken an jedem Ende („Nichts” am Beginn
der Skala und „Sehr
stark" am Ende)
notiert. Alle Bewertungen werden zweimal durchgeführt. Die
Stoffproben werden an Tag 1, 2 und 3 nach dem Waschen bewertet (die
Stoffproben werden zu allen Zeiten in den Gläsern gehalten).