CN1708584A - 具表面活性剂耐性的新型纤维素酶 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了新型纤维素酶，该新型纤维素酶具有以下序列：纤维素酶NCE5的第162位和/或第166位的氨基酸残基被与上述纤维素酶的氨基酸不同的氨基酸置换。还公开了编码上述新型纤维素酶的多聚核苷酸、含有该多聚核苷酸的表达载体、用上述表达载体转化的宿主细胞、以及含有上述纤维素酶的纤维素酶制备物和洗涤剂组合物。本发明的纤维素酶具有表面活性剂耐性，且在碱性条件下保持高活性。

Description

具表面活性剂耐性的新型纤维素酶
技术领域
本发明涉及新型的纤维素酶，该纤维素酶具有亲本纤维素酶的一部分氨基酸序列被置换了的氨基酸序列，其中所述亲本纤维素酶含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
背景技术
纤维素酶可以利用其特性，应用在各种工业领域里。具体的应用领域之一是纤维加工领域，特别是为使含纤维素的纤维具有所需特性而进行的处理。也就是说，为了改善含纤维素的纤维的手感和/或外观，以及为进行“生物洗”而使用纤维素酶，其中所述“生物洗”可对着色的含纤维素的纤维提供色彩局部变化的“石洗”样外观。另外，近年来，将来自木材浆的纤维素溶解于有机溶剂进行纺丝而得到再生纤维素系纤维纤维素短纤维(Lyocell)，因其强度、吸水性等性质以及不会引起环境污染的制造方法而受到人们的关注，在除去其制造工序中产生的织物表面的毛羽的加工中需要采用纤维素酶。
一直以来，人们认识到纤维素酶具有通过多种酶的共同作用来分解纤维素的作用。近年来，由于蛋白质分离技术、基因技术的进步，人们尝试从作为复合酶的纤维素酶中分离并制备适合上述纤维加工的酶成分。尤其是对来自丝状菌的木霉菌属(Trichoderma)或腐殖霉属(Humicola)纤维素酶的研究得到进展，在腐殖霉属中分离出CBH I、EG V、NCE4和NCE2等，在木霉菌属中分离出CBH I、CBH II、EG II和EG III等成分，通过基因操作制备出过量表达的酶、单成分酶等，由此制备出大量含有适合各用途的特定纤维素酶成分的纤维素酶制备物。
在使粗斜棉布对含纤维素的纤维染色成具有石洗外观、或改善手感方面，已知内切葡聚糖酶NCE5在该处理工序中作为部分靛蓝染料再附着或逆染色程度低、即白底染色程度低的纤维素酶有用(参照专利文献1)。
另一方面，在纤维素酶应用于衣物洗涤剂用途时，人们希望不仅对所需纤维素酶成分进行量的改善，还要进行质的改善。也就是说，衣物洗涤剂中混合有各种表面活性剂，将它们溶解于水时显示碱性(pH10-11)，因此作为混合在衣物洗涤剂中的纤维素酶的性质，人们需求对各种表面活性剂具有耐性，以及在碱性条件下显示更强的活性。
(专利文献1)国际公开第WO 01/90375号(第2-3页以及序列表的SEQ ID NO.1所示序列)
发明内容
本发明的课题在于提供对表面活性剂具有耐性和/或在碱性条件下具有高活性的新型纤维素酶。
本发明人为解决上述课题进行了深入的研究，结果在含有SEQ IDNO.1所示氨基酸序列的纤维素酶(NCE5)中，通过将该氨基酸序列中第162位和/或第166位的氨基酸残基置换为其它的氨基酸残基，成功地获得了对表面活性剂具有耐性和/或在碱性条件下具有高活性的新型纤维素酶。即本发明如下。
[1]纤维素酶，该纤维素酶具有(1)含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的纤维素酶的第162位和/或第166位的氨基酸残基被与上述纤维素酶的氨基酸不同的氨基酸置换的氨基酸序列，或者(2)在上述氨基酸序列(1)的N末端附加或缺失1个或多个氨基酸的氨基酸序列。
[2]上述[1]的纤维素酶，该纤维素酶具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
[3]上述[1]的纤维素酶，其中第166位氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸置换。
[4]上述[3]的纤维素酶，该纤维素酶具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
[5]纤维素酶，该纤维素酶具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
[6]多聚核苷酸，该多聚核苷酸编码上述[1]-[5]的纤维素酶。
[7]表达载体，该表达载体含有上述[6]的多聚核苷酸。
[8]宿主细胞，该宿主细胞由上述[7]的表达载体转化。
[9]上述[1]-[5]的纤维素酶的制备方法，该制备方法包括培养上述[8]的宿主细胞，由该宿主和/或培养物收集纤维素酶的步骤。
[10]纤维素酶制备物，该纤维素酶制备物含有上述[1]-[5]的纤维素酶。
[11]洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物含有上述[1]-[5]的纤维素酶或上述[10]的纤维素制备物。
[12]含纤维素的纤维的处理方法，该方法包括使含纤维素的纤维与上述[1]-[5]的纤维素酶、上述[10]的纤维素酶制备物或上述[11]的洗涤剂组合物接触的步骤。
[13]降低含纤维素的纤维开始起毛的速度或降低含纤维素的纤维的起毛程度的方法，该方法包括使含纤维素的纤维与上述[1]-[5]的纤维素酶、上述[10]的纤维素酶制备物或上述[11]的洗涤剂组合物接触的步骤。
[14]以改善含纤维素的纤维的手感和外观为目的的减量加工方法，该方法包括使含纤维素的纤维与上述[1]-[5]的纤维素酶、上述[10]的纤维素酶制备物或上述[11]的洗涤剂组合物接触的步骤。
[15]使着色的含纤维素的纤维的色彩澄清的方法，该方法包括使着色的含纤维素的纤维与上述[1]-[5]的纤维素酶、上述[10]的纤维素酶制备物或上述[11]的洗涤剂组合物接触的步骤。
[16]对着色的含纤维素的纤维提供色彩局部变化的方法，该方法包括使着色的含纤维素的纤维与上述[1]-[5]的纤维素酶、上述[10]的纤维素酶制备物或上述[11]的洗涤剂组合物接触的步骤。
[17]降低含纤维素的纤维开始僵硬的速度或降低含纤维素的纤维僵硬程度的方法，该方法包括使含纤维素的纤维与上述[1]-[5]的纤维素酶、上述[10]的纤维素酶制备物或上述[11]的洗涤剂组合物接触的步骤。
[18]上述[12]-[17]的方法，其中纤维的处理通过对该纤维进行浸渍、洗涤或漂洗进行。
[19]废旧纸脱墨的方法，其特征在于：在将废旧纸用脱墨化学试剂处理，进行脱墨的步骤中，使用上述[1]-[5]的纤维素酶、上述[10]的纤维素酶制备物。
[20]纸浆打浆度的改善方法，该方法包括将纸浆用上述[1]-[5]的纤维素酶、上述[10]的纤维素酶制备物进行处理的步骤。
[21]改善动物饲料消化率的方法，该方法包括将含纤维素的纤维用上述[1]-[5]的纤维素酶、上述[10]的纤维素酶制备物进行处理的步骤。
本说明书中的术语“多聚核苷酸”包括DNA和RNA。
实施发明的最佳方案
以下详细说明本发明。
亲本纤维素酶
本发明中，亲本纤维素酶是含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的纤维素酶。根据生产该亲本纤维素酶的宿主的种类不同，分泌信号序列的加工也不同，结果，像N末端附加或缺失1-多个氨基酸这样的同源物也包括在亲本纤维素酶中。
本发明的新型纤维素酶
当亲本纤维素酶含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列时，本发明的新型纤维素酶的具体例子有：选自该氨基酸序列中第162和166位氨基酸的1个或2个氨基酸残基被其它氨基酸残基置换的纤维素酶。分离自天然菌株等得到的纤维素酶如果也是SEQ ID NO.1所示氨基酸中的第162和166位氨基酸、或与其相当的氨基酸被置换的纤维素酶，则也包含在本发明的纤维素酶中。
根据本发明的优选实施方案，优选的有：SEQ ID NO.1记载的氨基酸序列第162位氨基酸被脯氨酸、第166位氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸置换的纤维素酶。根据本发明更优选的实施方案，更优选的有：具有SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的纤维素酶。这些纤维素酶具有对表面活性剂具有耐性和/或在碱性条件下保持高活性的优良性质。
当亲本纤维素酶为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的同源物时，本发明的新型纤维素酶的具体的例子有：选自相当于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第162和166位氨基酸的位置的氨基酸的1个或2个氨基酸残基被其它氨基酸残基置换的纤维素酶。这里，通过公知的算法进行氨基酸序列比对，可以容易地选择含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的亲本纤维素酶的同源物中要置换的氨基酸残基的位置。
本发明的新型纤维素酶的制备
本发明的新型纤维素酶可以通过重组DNA技术、多肽合成技术等制备，除此之外，也可以由从天然物中分离的菌株获得。
采用重组DNA技术时，可如下制备：获得编码亲本纤维素酶的DNA，在该DNA内使专一性位点发生突变，置换所编码的氨基酸，然后用含有实施了诱变处理的DNA的表达载体转化宿主细胞，通过培养转化细胞，可制备新型的纤维素酶。编码亲本纤维素酶的DNA的获得，可以考察所用宿主细胞，由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列进行适当的总合成，优选含有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的DNA，这可以通过基因工程领域常用的方法，由孤独腐殖霉(Humicola insolens)的cDNA文库获得。
本领域技术人员所公知的向基因的特定位点引入突变的几种方法有：缺口双链法[Methods in Enzymology，154，350(1987)]、定位诱变(Kunkel)法[Methods in Enzymology，154，367(1987)]等。这些方法可用于在编码亲本纤维素酶的DNA内、在专一性位点产生突变。诱变处理后的DNA核苷酸序列可以通过Maxam-Gilbert的化学修饰法[Methods in Enzymology，65，499(1980)]或双脱氧核苷酸链终止法[Gene，19，269(1982)]等确认，本发明的纤维素酶的氨基酸序列可由被确认的核苷酸序列解读。
本发明的新型纤维素酶的生产
本发明的纤维素酶可如下生产：以在可在宿主细胞内复制且该基因可表达的状态下含有编码所述本发明纤维素酶的DNA片段的DNA分子、特别是表达载体的形式转化宿主细胞，在该宿主细胞中产生。
因此，本发明提供表达载体，该表达载体在可在宿主微生物内复制且编码上述本发明的纤维素酶的DNA片段所编码的蛋白质可以表达的状态下含有上述DNA片段。该表达载体是自主复制载体，即作为染色体外的独立体存在，其复制不依赖于染色体的复制，例如可以以质粒为基础构建。该表达载体导入宿主微生物时，也可以整合到该宿主微生物的基因组中，与被整合的染色体一起复制。本发明的载体的构建顺序和方法可以采用基因工程领域中常用的方法。
为了使本发明的表达载体实际导入宿主微生物，并使具有所需活性的蛋白质表达，除上述本发明的DNA片段之外，本发明的表达载体最好还包含用于控制其表达的DNA序列或选择转化体的基因标志等。控制表达的DNA序列包括启动子、终止子和编码信号肽的DNA序列等。启动子只要在宿主微生物中显示转录活性即可，没有特别限定，可以是控制编码与宿主微生物同种或不同种的任意蛋白质的基因的表达的DNA序列。信号肽只要在宿主微生物中作用于蛋白质的分泌即可，并没有特别限定，可以由从编码与宿主微生物同种或不同种的任意蛋白质的基因衍生的DNA序列中获得。本发明的基因标志可以根据转化体的选择方法适当选择，例如可以利用编码化学试剂耐性的基因、与营养缺陷性型互补的基因。
本发明进一步提供由该表达载体转化的微生物。该宿主-载体系并没有特别限定，例如可以采用使用大肠杆菌、放线菌、酵母或丝状菌等的系统、以及除此以外的蛋白质融合的蛋白质表达系等。另外，由该表达载体进行的微生物的转化也可以按照本领域常用的方法实施。
还可以用适当的培养基培养该转化体，由其培养物中分离并获得上述本发明的蛋白质。因此，根据本发明的另一实施方案，还提供上述本发明的新型蛋白质的制备方法。转化体的培养及其条件可以与所用微生物的培养及条件实质上相同。培养转化体后回收目标蛋白质的方法可以采用本领域常用的方法。
本发明的新型纤维素酶的用途/纤维素酶制备物
本发明涉及含有本发明的纤维素酶的纤维素酶制备物。
通常，纤维素酶制备物是指除纤维素酶之外，例如可以含有赋型剂(例如乳糖、氯化钠或山梨糖醇等)、防腐剂、和/或非离子系表面活性剂等。纤维素酶制备物的形态可以是固态也可以是液态。具体来说，有粉剂、粒剂、颗粒剂、无粉尘颗粒或液体制剂。本发明的纤维素酶制备物中除本发明的纤维素酶之外，还可以含有其它纤维素酶，例如纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶以及本发明之外的内切葡聚糖酶。
纤维素酶制备物之一的无粉尘颗粒(优选没有飞散性的颗粒状)，可以采用通常的干式制粒法制备。即，将粉末状态的本发明纤维素酶与选自中性且不影响内切葡聚糖酶活性的无机盐(例如硫酸钠或氯化钠)、不影响内切葡聚糖酶活性的矿物质(例如皂土或蒙脱石)、以及中性有机物(例如淀粉或颗粒状纤维素等)等的一种或多种混合，然后加入1种或多种非离子表面活性剂的粉末或细微悬浮的悬浮液，充分混合或混炼。根据情况，适当添加使固态物质粘结的合成高分子(例如聚乙二醇等)或天然高分子(例如淀粉等)，进一步混炼后，进行圆盘制丸等的挤压成型制粒，将成型物通过滚圆机成型为球状，通过干燥，制成无粉尘颗粒。对1种或多种非离子表面活性剂的添加量没有特别限定，相对于本发明的纤维素酶制备物总量，优选0.1-50％重量，更优选0.1-30％重量，进一步优选1-10％重量。将颗粒表面用聚合物等包衣，则可以控制透氧或透水。
另一方面，纤维素酶制备物之一的液体制剂(优选稳定的液体状)的制备可以是：向含有本发明的纤维素酶的溶液中混合内切葡聚糖酶的稳定剂(例如合成高分子或天然高分子等)，根据需要添加无机盐类和/或合成防腐剂。此时，也可以混合1种或多种非离子表面活性剂。对1种或多种非离子表面活性剂的添加量没有特别限定，相对于本发明的纤维素酶制备物总量，优选0.1-50％重量，更优选0.1-30％重量，进一步优选1-10％重量。
本发明还提供含有本发明的纤维素酶或本发明的纤维素酶制备物的洗涤剂组合物。上述洗涤剂组合物也可以含有表面活性剂(可以是阴离子性、非离子性、阳离子性、两性或偶极离子或者它们的混合物)。上述洗涤剂组合物也可以含有本领域已知的其它洗涤剂成分，例如助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、抗腐蚀剂、金属离子封闭剂、污物分解聚合物、香料、其它酶(蛋白酶、脂酶、淀粉酶等)、酶稳定剂、制剂辅助剂、荧光增白剂和/或发泡促进剂等。代表性的阴离子型表面活性剂有直链烷基苯磺酸盐(LAS)、烷基硫酸盐(AS)、α-烯烃磺酸盐(AOS)、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐(AES)、α-硫代脂肪酸酯盐(α-SFMe)以及天然脂肪酸的碱金属盐等。非离子型表面活性剂的例子有聚氧乙烯烷基醚(AE)、烷基聚乙二醇醚、壬基苯酚聚乙二醇醚、脂肪酸甲酯乙醇盐、蔗糖和葡萄糖的脂肪酸酯、以及烷基葡糖苷、聚乙氧基化烷基葡糖苷的酯等。
本发明的含纤维素的纤维的处理方法是通过将本发明的纤维素酶、本发明的纤维素酶制备物、或本发明洗涤剂组合物与含纤维素的纤维接触而进行。
可通过本发明的纤维处理方法改善的含纤维素的纤维的性质包括以下。
(1)除去毛羽(降低开始起毛的速度或降低起毛程度)
(2)通过减量改善纤维的手感和外观
(3)使着色的含纤维素的纤维的色彩澄清
(4)使着色的含纤维素的纤维的色彩发生局部变化，即，使着色的含纤维素的纤维、典型的是使牛仔布具有石洗外观和风格
(5)柔软化(降低开始僵硬的速度或降低僵硬程度)
本发明的纤维处理方法具体来说，是向浸渍或可浸渍纤维的水中添加本发明的纤维素酶、本发明的纤维素酶制备物、或本发明洗涤剂组合物来进行，例如可以通过纤维的浸渍步骤、洗涤步骤、或漂洗步骤进行。
接触温度，或者上述纤维素酶、上述纤维素酶制备物、或上述洗涤剂组合物的添加量等条件可以考虑其它各种条件适当确定，例如用于降低含纤维素的纤维开始起毛的速度或降低含纤维素的纤维起毛程度时，优选在10-60℃左右的温度下使用0.01-20mg/L蛋白质浓度的上述纤维素酶、上述纤维素酶制备物、或上述洗涤剂组合物。
进行以改善含纤维素的纤维的手感和外观为目的的减量加工时，优选在10-60℃左右的温度下使用0.1-50mg/L蛋白质浓度的上述纤维素酶、上述纤维素酶制备物、或上述洗涤剂组合物。
目的在于使着色的含纤维素的纤维的色彩澄清时，优选在10-60℃左右的温度下使用0.01-20mg/L蛋白质浓度的上述纤维素酶、上述纤维素酶制备物、或上述洗涤剂组合物。
为了对着色的含纤维素的纤维的色彩提供局部变化而使用时，优选在20-60℃左右的温度下使用0.1-100mg/L蛋白质浓度的上述纤维素酶、上述纤维素酶制备物、或上述洗涤剂组合物。
上述方法用于降低含纤维素的纤维开始僵硬的速度或降低含纤维素的纤维僵硬程度时，优选在10-60℃左右的温度下使用0.01-20mg/L蛋白质浓度的上述纤维素酶、上述纤维素酶制备物、或上述洗涤剂组合物。
本发明还涉及废旧纸的脱墨方法，其特征在于：在将废旧纸用脱墨化学试剂处理，进行脱墨的步骤中，使用本发明的纤维素酶或本发明的纤维素酶制备物。
本发明的纤维素酶或纤维素酶制备物作用于废旧纸，可以使脱墨的效率提高，因此在由废旧纸制造再生纸的过程中有用。根据上述脱墨的方法，残留有墨的纤维大幅减少，因此可以提高废旧纸的白度。
上述脱墨化学试剂只要是通常废旧纸脱墨所使用的化学试剂即可，并没有特别限定，例如有碱(例如氢氧化钠、碳酸钠等)、硅酸钠、过氧化氢、磷酸盐、阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、或吸收材料(例如油酸等)等，助剂有pH稳定剂、螯合剂或分散剂等。
可适用于上述脱墨方法的废旧纸只要是通常被称为废旧纸的物品即可，并没有特别限定，例如机械浆和化学浆混合的废旧报纸、废旧杂志、低级-中级废旧印刷纸、含有化学浆的高级废旧纸、或它们的覆膜纸等印刷废旧纸。除被称为废旧纸的物品以外，只要是附着有墨的纸，都可适用上述脱墨的方法。
本发明还涉及纸浆打浆度的改善方法，该方法包括将纸浆用本发明的纤维素酶或本发明的纤维素酶制备物进行处理的步骤。
根据上述方法，纸浆的强度不会显著降低，同时可以显著改善纸浆的打浆度。可适用上述方法的浆并没有特别限定，例如有废旧纸浆、可回收箱纸浆、牛皮纸浆、亚硫酸纸浆或加工热处理等的高收率纸浆等。
本发明还涉及改善动物饲料消化率的方法，该方法包括将动物饲料用本发明的纤维素酶或本发明的纤维素酶制备物进行处理的步骤。
根据上述方法，动物饲料中的葡聚糖被适度降解为低分子量，因而可以改善动物饲料的消化率。
通过将本发明的纤维素酶在动物饲料中使用，可以改善饲料中的葡聚糖的消化率。因此，本发明还提供改善动物饲料的消化率的方法，该方法包括用本发明的纤维素酶或纤维素酶制备物处理动物饲料的步骤。
以上，对本发明的纤维素酶和洗涤剂组合物以及本发明中使用它们的方法进行了说明。其实，本发明纤维素酶的亲本纤维素酶——纤维素酶NCE5可以作为纤维素制备物或洗涤剂组合物的有效成分使用，通过使用这些纤维素酶NCE5或者含有纤维素酶NCE5的纤维素酶制备物或洗涤剂组合物，例如可以改善含纤维素的纤维的各种性质[例如除去毛羽(降低开始起毛的速度或降低起毛程度)、通过减量改善纤维手感和外观、使着色的含纤维素的纤维的色彩澄清、使着色的含纤维素的纤维的色彩发生局部变化、柔软化(降低开始僵硬的速度或降低僵硬程度)等]、可以进行废旧纸的脱墨、可以改善纸浆的打浆度、或者可以改善动物饲料的症可率，这些都在国际公开第WO 01/90375号中有公开。本发明的纤维素酶与亲本纤维素酶NCE5比较，显示优异的表面活性剂耐性和耐碱性，因此作为纤维素酶制备物或洗涤剂组合物的有效成分，或者在使用纤维素酶NCE5实施的上述各种方法中，通过使用本发明的纤维素酶取代纤维素酶NCE5，有望获得更优异的效果。
微生物保藏
用含有编码本发明的亲本纤维素酶的DNA的质粒pNCE5Bam转化的大肠杆菌JM109菌株于2000年4月18日，以FERM BP-7138的保藏号保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心[(原)工业技术院生命工业技术研究所(地址：305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)]。
实施例2(2)中使用的孤独腐殖霉FERM BP-5977菌株于1996年7月15日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心，为国内保藏(FERM P-15736)，于1997年6月13日转为国际保藏。
实施例
以下给出本发明的实施例，这只是举例，并不限定本发明，这里未例举的很多变化的方法或修饰方法全部包括在本发明中。
实施例1：编码纤维素酶的基因的制备
含有SEQ ID NO.1记载的氨基酸序列的亲本纤维素酶中第162位氨基酸被脯氨酸置换得到的纤维素酶(以下称为A162P。SEQ IDNO.3)、第166位氨基酸被谷氨酸置换得到的纤维素酶(以下称为K166E。SEQ ID NO.4)、第162位和第166位氨基酸分别被脯氨酸和谷氨酸置换得到的纤维素酶(以下称为APKE。SEQ ID NO.5)，编码上述纤维素酶的DNA如下制备。
以国际公开第WO 01/90375号中记载的质粒pNCE5Bam为模板DNA，使用LA PCR体外诱变处理试剂盒(LA PCR in vitro Mutagenesiskit)(宝酒造株式会社)，向编码亲本纤维素酶的DNA引入位点专一性突变。方法按照试剂盒所附说明书。引入突变的引物使用以下所示三种引物。
NCE5-A162P：5’-GGGGAAGGGGTCGCACTCGTGGCGTTG-3’(SEQ IDNO.6)
NCE5-K166E：5’-CTTGAGCTCCTCGGGGAAGGCGTCGCA-3’(SEQ IDNO.7)
NCE5-APKE：5’-GAGCTCCTCGGGGAAGGGGTCGCACTCGTG-3’(SEQ IDNO.8)
引物NCE5-A162P是用于制备编码纤维素酶A162P的DNA的引物，引物NCE5-K166E是用于制备编码纤维素酶K166E的DNA的引物，引物NCE5-APKE是用于制备编码纤维素酶APKE的DNA的引物。
将使用上述三种引物得到的引入了突变的PCR产物用限制酶 EcoRI和 Pst I消化，然后用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取，进行乙醇沉淀。将它们与预先用限制酶 EcoR I和 Pst I消化的质粒pUC118连接，得到质粒pNCE5AP-118(A162P)、pNCE5KE-118(K166E)和pNCE5APKE-118(APKE)。用荧光DNA测序仪ABI PRISM 310 GeneticAnalyzer(パ-キン·エルマ-公司制)确定这3种质粒的插入片段的全核苷酸序列，结果表明：各DNA片段只引入了目标突变。
实施例2：各纤维素酶基因在孤独腐殖霉中的表达
(1)纤维素酶基因表达质粒的构建
将实施例1中得到的含有各纤维素酶基因的质粒pNCE5AP-118、pNCE5KE-118和pNCE5APKE-118用限制酶 BamH I消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳，回收约0.7kbp的DNA片段。将它们预先用限制酶 BamHI消化，与用来自大肠杆菌的碱性磷酸酶(宝酒造)进行DNA末端去磷酸的孤独腐殖霉FERM BP-5977表达载体pJD-c5(记载于国际公开第WO01/90375号中)连接，得到用于表达各纤维素酶基因的质粒pNCE5AP(A162P)、pNCE5KE(K166E)和pNCE5APKE(APKE)。
(2)孤独腐殖霉FERM BP-5977的转化
将孤独腐殖霉FERM BP-5977在(S)培养基中、在37℃培养，24小时后，以3000rpm离心10分钟，收集细胞。(S)培养基的组成为：在(N)培养基(5.0％微晶纤维素、2.0％酵母提取物、0.1％蛋白胨、0.03％氯化钙、0.03％氯化镁、pH 6.8)中加入葡萄糖(3.0％)，然后除去微晶纤维素。所得细胞用0.5mol/L蔗糖洗涤，悬浮于用0.45μm滤器过滤的10mL原生质体化酶溶液(3mg/mL-葡糖醛酸糖苷酶、1mg/mL壳多糖酶、1mg/mL消解酶、0.5mol/L蔗糖)中。在30℃振荡60-90分钟，使菌丝原生质体化。过滤该悬浮液，然后以2500rpm离心10分钟，回收原生质体，用SUTC缓冲液[0.5mol/L蔗糖、10mmol/L氯化钙、10mmol/L Tris盐酸(pH 7.5)]洗涤。
将以上制备的原生质体悬浮于1mL SUTC缓冲液中，每100μL中加入10μg的DNA(TE)溶液(10μL)，在冰中静置5分钟。接着，加入400μL PEG溶液[60％PEG4000、10mmol/L氯化钙、10mmol/LTris盐酸(pH 7.5)]，在冰中静置20分钟，然后加入10mL SUTC缓冲液，以2500rpm离心10分钟。将收集的原生质体悬浮于1mL SUTC缓冲液中，然后以4000rpm离心5分钟，最终悬浮于100μL SUTC缓冲液中。
在添加了潮霉素(200μg/mL)的YMG培养基(1％葡萄糖、0.4％酵母提取物、0.2％麦芽提取物、1％琼脂(pH 6.8))上，将进行了以上处理的原生质体与YMG软琼脂一起铺板，在37℃培养5天，将形成的集落作为转化体。
(3)通过SDS-PAGE评价转化体
如上所述，将使用质粒pNCE5AP、pNCE5KE和pNCE5APKE得到的孤独腐殖霉转化体在(N)培养基(5.0％微晶纤维素、2.0％酵母提取物、0.1％蛋白胨、0.03％氯化钙、0.03％氯化镁、pH 6.8)中、在37℃培养5小时，通过SDS-PAGE对所得培养上清进行分析。
SDS-PAGE采用テフコ公司的系统进行。即，使用电泳槽(No.03-101)、电源(型号：3540)、凝胶12％(01-005)以及SDS-PAGE缓冲液试剂盒(06-0301)。电泳条件为18mA/90分钟。电泳后的凝胶染色使用考马斯亮蓝-R250染色液(0.1％考马斯亮蓝-R250、40％甲醇、10％乙酸)进行，之后用脱色液(10％甲醇、7.5％乙酸)脱色，检测蛋白质。分子量标志采用アマシヤムバイオサイエンス公司的LMW标志试剂盒(LMW Marker Kit)(17-0446-01)。
SDS-PAGE分析的结果，发现了25Kda蛋白质得到增强的转化体，并确认这些转化体生产目标纤维素酶。从这些转化体中分别选择了K215-40菌株、K215-42菌株和K229-72菌株作为生产纤维素酶A162P、K166E和APKE的转化体，并用于以后的分析。另外以国际公开第WO 01/90375号中记载的NCE5(亲本纤维素酶)作为分析对照使用。
实施例3：对由各转化体得到的纤维素酶的评价
将孤独腐殖霉转化体K215-40菌株、K215-42菌株和K229-72菌株在(N)培养基、37℃培养5天，使用所得培养上清在(1)pH 6.0、(2)pH 6.0且添加200ppm直链烷基苯磺酸钠(LAS)、(3)pH 10.0三个试验区进行EGU活性测定。
EGU活性如下测定。将羧甲基纤维素(Hercules)溶解于适当的缓冲液中，使终浓度为3.5％，以此作为底物溶液。即，在pH 6.0下测定时，溶解于0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)；在pH 10.0下测定时，溶解于0.1mol/L Tris盐酸缓冲液(pH 10.0)。取5mL底物溶液装入试管，放进40℃的恒温槽预热10分钟。向其中加入0.15mL样品溶液，充分搅拌，40℃下开始酶促反应。反应30分钟后，用设定为40℃的R型粘度仪(东机产业RE100)测定粘度。在各酶促反应条件下，以使初始粘度降低为1/2的酶量为1单位。以试验区(1)中的酶活性为100％，试验区(2)和(3)的酶活性以相对值表示，见下表。
表1
样品   试验区
  (1)   (2)   (3)
  K215-30(A162P)   100   26.6   29.6
  K215-30(K166E)   100   26.7   29.5
  K229-72(APKE)   100   21.1   36.6
  NCE(亲本纤维素酶)   100   7.6   21.5
由以上结果可知：各纤维素酶(A162P、K166E和APKE)与亲本纤维素酶相比，具有LAS耐性，且在碱性条件下保持高活性。
产业实用性
本发明的新型纤维素酶与亲本纤维素酶比较，具有表面活性剂耐性，以及在碱性条件下显示更高的活性，因此与衣物洗涤剂混合使用时有用。
序列表独立文本
SEQ ID NO.3-5所表示的各氨基酸序列是表面活性剂耐性纤维素酶。SEQ ID NO.3-5所表示的各核苷酸序列是用于引入位点专一性突变的引物。
以上按照特定的方案对本发明进行了说明，对本领域人员来讲不言而喻的变形或改良均包含在本发明的范围内。
                          序列表
<110>Mei ji Seika Kaisha，Ltd.
<120>新型表面活性剂耐受性纤维素酶
<130>MEJ-696
<150>JP 2002-318303
<151>2002-10-31
<160>8
<170>Patentln version 3.1
<210>1
<211>205
<212>PRT
<213>孤独腐殖霉
<220>
<221>mat_peptide
<222>(1)..(205)
<223>
<400>1
Gln Ser Gly Ser Gly Arg Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro
1               5                   10                  15
Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Gly Pro Ala Pro Val Arg Thr Cys Asp
            20                  25                  30
Arg Trp Asp Asn Pro Leu Phe Asp Gly Gly Asn Thr Arg Ser Gly Cys
        35                  40                  45
Asp Ala Gly Gly Gly Ala Tyr Met Cys Ser Asp Gln Ser Pro Trp Ala
    50                  55                  60
Val Ser Asp Asp Leu Ala Tyr Gly Trp Ala Ala Val Asn Ile Ala Gly
65                  70                  75                  80
Ser Asn Glu Arg Gln Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr
   85                               90                  95
Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Arg Met Ile Val Gln Ala Ser Asn Thr
            100                 105                 110
Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Ile Ala Met Pro Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Val Gly Ile Phe Asn Ala Cys Thr Asp Gln Tyr Gly Ala Pro Pro
    130                 135                 140
Asn Gly Trp Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Gln Arg His Glu Cys
145                 150                 155                 160
Asp Ala Phe Pro Glu Lys Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp
                165                 170                 175
Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Ser Val Asn Trp Arg Gln Val Ser
            180                 185                 190
Cys Pro Ala Glu Ile Val Ala Lys Ser Gly Cys Ser Arg
        195                 200                 205
<210>2
<211>615
<212>DNA
<213>孤独腐殖霉
<400>2
cagtccggca gcggccgcac cacgcgctac tgggactgct gcaagccgtc gtgcgcgtgg  60
cccggcaagg gcccggcgcc cgtgcggacg tgcgaccggt gggacaaccc gctgttcgac  120
ggcggcaaca cgcgcagcgg gtgcgacgcg ggcggcggcg cctacatgtg ctcggaccag 180
agcccgtggg cggtcagcga cgacctggcg tacggctggg cggccgtcaa cattgccggc 240
tccaacgaga ggcagtggtg ctgcgcctgc tacgagctga ccttcaccag cgggccggtg 300
gcgggcaaga ggatgattgt gcaggcgagc aacacgggag gcgatttggg gaacaaccac 360
tttgatattg ctatgcccgg cggtggcgtc ggtatcttca acgcctgcac cgaccagtac 420
ggcgcgcccc ccaacggctg gggccagcgc tacggcggca tcagccaacg ccacgagtgc 480
gacgccttcc ccgagaagct caagcccggc tgctactggc gctttgactg gttcctcaac 540
gccgacaacc cgagcgtcaa ctggcggcag gtcagctgcc cggccgagat tgtggccaag 600
agcggctgct cgcgt                                                  615
<210>3
<211>205
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：一种表面活性剂耐受性纤维素酶
<400>3
Gln Ser Gly Ser Gly Arg Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro
1               5                   10                  15
Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Gly Pro Ala Pro Val Arg Thr Cys Asp
            20                  25                  30
Arg Trp Asp Asn Pro Leu Phe Asp Gly Gly Asn Thr Arg Ser Gly Cys
        35                  40                  45
Asp Ala Gly Gly Gly Ala Tyr Met Cys Ser Asp Gln Ser Pro Trp Ala
    50                  55                  60
Val Ser Asp Asp Leu Ala Tyr Gly Trp Ala Ala Val Asn Ile Ala Gly
65                  70                  75                  80
Ser Asn Glu Arg Gln Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr
                85                  90                  95
Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Arg Met Ile Val Gln Ala Ser Asn Thr
            100                 105                 110
Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Ile Ala Met Pro Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Val Gly Ile Phe Asn Ala Cys Thr Asp Gln Tyr Gly Ala Pro Pro
    130                 135                 140
Asn Gly Trp Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Gln Arg His Glu Cys
145                 150                 155                 160
Asp Pro Phe Pro Glu Lys Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp
                165                 170                 175
Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Ser Val Asn Trp Arg Gln Val Ser
            180                 185                 190
Cys Pro Ala Glu Ile Val Ala Lys Ser Gly Cys Ser Arg
        195                 200                 205
<210>4
<211>205
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：一种表面活性剂耐受性纤维素酶
<400>4
Gln Ser Gly Ser Gly Arg Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro
1               5                   10                  15
Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Gly Pro Ala Pro Val Arg Thr Cys Asp
            20                  25                  30
Arg Trp Asp Asn Pro Leu Phe Asp Gly Gly Asn Thr Arg Ser Gly Cys
        35                  40                  45
Asp Ala Gly Gly Gly Ala Tyr Met Cys Ser Asp Gln Ser Pro Trp Ala
    50                  55                  60
Val Ser Asp Asp Leu Ala Tyr Gly Trp Ala Ala Val Asn Ile Ala Gly
65                  70                  75                  80
Ser Asn Glu Arg Gln Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr
                85                  90                  95
Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Arg Met Ile Val Gln Ala Ser Asn Thr
            100                 105                 110
Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Ile Ala Met Pro Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Val Gly Ile Phe Asn Ala Cys Thr Asp Gln Tyr Gly Ala Pro Pro
    130                 135                 140
Asn Gly Trp Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Gln Arg His Glu Cys
145                 150                 155                 160
Asp Ala Phe Pro Glu Glu Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp
                165                 170                 175
Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Ser Val Asn Trp Arg Gln Val Ser
            180                 185                 190
Cys Pro Ala Glu Ile Val Ala Lys Ser Gly Cys Ser Arg
        195                 200                 205
<210>5
<211>205
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：一种表面活性剂耐受性纤维素酶
<400>5
Gln Ser Gly Ser Gly Arg Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro
1               5                   10                  15
Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Gly Pro Ala Pro Val Arg Thr Cys Asp
            20                  25                  30
Arg Trp Asp Asn Pro Leu Phe Asp Gly Gly Asn Thr Arg Ser Gly Cys
        35                  40                  45
Asp Ala Gly Gly Gly Ala Tyr Met Cys Ser Asp Gln Ser Pro Trp Ala
    50                  55                  60
Val Ser Asp Asp Leu Ala Tyr Gly Trp Ala Ala Val Asn Ile Ala Gly
65                  70                  75                  80
Ser Asn Glu Arg Gln Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr
                85                  90                  95
Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Arg Met Ile Val Gln Ala Ser Asn Thr
            100                 105                 110
Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Ile Ala Met Pro Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Val Gly Ile Phe Asn Ala Cys Thr Asp Gln Tyr Gly Ala Pro Pro
    130                 135                 140
Asn Gly Trp Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Gln Arg His Glu Cys
145                 150                 155                 160
Asp Pro Phe Pro Glu Glu Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp
                165                 170                 175
Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Ser Val Asn Trp Arg Gln Val Ser
            180                 185                 190
Cys Pro Ala Glu Ile Val Ala Lys Ser Gly Cys Ser Arg
        195                 200                 205
<210>6
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：一种位点专一性诱变引物
<400>6
ggggaagggg tcgcactcgt ggcgttg                                         27
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：一种位点专一性诱变引物
<400>7
cttgagctcc tcggggaagg cgtcgca                                    27
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：一种位点专一性诱变引物
<400>8
gagctcctcg gggaaggggt cgcactcgtg                                 30

Claims (21)

1.纤维素酶，该纤维素酶具有(1)含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的纤维素酶中第162位和/或第166位氨基酸残基被与上述纤维素酶的氨基酸不同的氨基酸置换的氨基酸序列，或者(2)在上述氨基酸序列(1)的N末端附加或缺失1个或多个氨基酸的氨基酸序列。
2.权利要求1的纤维素酶，该纤维素酶具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
3.权利要求1的纤维素酶，其中第166位氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸置换。
4.权利要求3的纤维素酶，该纤维素酶具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
5.纤维素酶，该纤维素酶具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
6.多聚核苷酸，该多聚核苷酸编码权利要求1-5中任一项的纤维素酶。
7.表达载体，该表达载体含有权利要求6的多聚核苷酸。
8.宿主细胞，该宿主细胞由权利要求7的表达载体转化。
9.权利要求1-5中任一项的纤维素酶的制备方法，该制备方法包括培养权利要求8的宿主细胞，由该宿主和/或培养物收集纤维素酶的步骤。
10.纤维素酶制备物，该纤维素酶制备物含有权利要求1-5中任一项的纤维素酶。
11.洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物含有权利要求1-5中任一项的纤维素酶或权利要求10的纤维素制备物。
12.含纤维素的纤维的处理方法，该方法包括使含纤维素的纤维与权利要求1-5中任一项的纤维素酶、权利要求10的纤维素酶制备物或权利要求11的洗涤剂组合物接触的步骤。
13.降低含纤维素的纤维开始起毛的速度或降低含纤维素的纤维的起毛程度的方法，该方法包括使含纤维素的纤维与权利要求1-5中任一项的纤维素酶、权利要求10的纤维素酶制备物或权利要求11的洗涤剂组合物接触的步骤。
14.以改善含纤维素的纤维的手感和外观为目的的减量加工方法，该方法包括使含纤维素的纤维与权利要求1-5中任一项的纤维素酶、权利要求10的纤维素酶制备物或权利要求11的洗涤剂组合物接触的步骤。
15.使着色的含纤维素的纤维的色彩澄清的方法，该方法包括使着色的含纤维素的纤维与权利要求1-5中任一项的纤维素酶、权利要求10的纤维素酶制备物或权利要求11的洗涤剂组合物接触的步骤。
16.对着色的含纤维素的纤维提供色彩局部变化的方法，该方法包括使着色的含纤维素的纤维与权利要求1-5中任一项的纤维素酶、权利要求10的纤维素酶制备物或权利要求11的洗涤剂组合物接触的步骤。
17.降低含纤维素的纤维开始僵硬的速度或降低含纤维素的纤维的僵硬程度的方法，该方法包括使含纤维素的纤维与权利要求1-5中任一项的纤维素酶、权利要求10的纤维素酶制备物或权利要求11的洗涤剂组合物接触的步骤。
18.权利要求12-17中任一项的方法，其中纤维的处理通过对该纤维进行浸渍、洗涤或漂洗进行。
19.废旧纸脱墨的方法，其特征在于：在将废旧纸用脱墨化学试剂处理，进行脱墨的步骤中，使用权利要求1-5中任一项的纤维素酶、权利要求10的纤维素酶制备物。
20.纸浆打浆度的改善方法，该方法包括将纸浆用权利要求1-5中任一项的纤维素酶、权利要求10的纤维素酶制备物进行处理的步骤。
21.改善动物饲料的消化率的方法，该方法包括将含纤维素的纤维用权利要求1-5中任一项的纤维素酶、权利要求10的纤维素酶制备物进行处理的步骤。
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