CN1566338A

CN1566338A - 脱毛蛋白酶和编码这种脱毛蛋白酶的多核苷酸

Info

Publication number: CN1566338A
Application number: CNA031352790A
Authority: CN
Inventors: 张义正; 黄庆; 李珉; 潘皎; 王海燕
Original assignee: Mianyang Huawei Gene Engineering Co Ltd; Sichuan University
Current assignee: Mianyang Huawei Gene Engineering Co Ltd; Sichuan University
Priority date: 2003-06-24
Filing date: 2003-06-24
Publication date: 2005-01-19
Anticipated expiration: 2023-06-24
Also published as: CN100374558C

Abstract

本发明涉及一种芽孢杆菌属的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株(保藏号：CGMCCNO.0518)，通过培养所说的菌株或其突变体所获得的脱毛蛋白酶、编码这种脱毛蛋白酶的多核苷酸和经DNA重组技术产生这种脱毛蛋白酶的方法。本发明还公开了此酶的用途，以及编码这种酶的多核苷酸的用途。

Description

脱毛蛋白酶和编码这种脱毛蛋白酶的多核苷酸

技术领域本发明属于生物技术领域。具体地说，本发明描述了一种脱毛蛋白酶以及编码此酶的多核苷酸序列。

背景技术蛋白酶是一种具有十分重要作用的工业用酶，已被广泛地应用于食品、轻工、化工、纺织、洗涤剂等行业。尤其在制革工业中，蛋白酶的研究具有特别重要的意义。21世纪将是一个绿色的世纪，如何消除环境污染和污染源，建立一个更适宜于人类生存的，可持续发展的自然界是人类面临的重要挑战。传统碱性脱毛法中的石灰-硫化物会对环境造成十分严重的污染。实践证明，用酶法脱毛替代石灰—硫化钠脱毛是消除硫化物污染的有效方法，即将污染源消灭在生产工艺过程中。自上世纪初Rohm成功地获取第一个脱毛蛋白酶以来，人们在酶品种的开发和推广方面开展了大量工作，特别是微生物蛋白酶的出现，使皮革生产的面貌发生了根本的变化。蛋白酶用于皮革脱毛及软化工序，代替了传统的石灰—硫化钠脱毛法，消除了制革工业的头号污染物—脱毛废液中的硫化物对环境的污染，是皮革生产史上的重大变革，在很大程度上缩短了古老的皮革工业与现代化文明生产之间的距离。

我国是皮革生产大国，目前大小制革企业148万家，年产优质皮革4.2亿张，年产值658亿元，利税66亿元，是我国的第二大出口创汇产业。但由于采用传统的碱法脱毛工艺，其生产过程中所使用的石灰-硫化物对环境造成严重污染，制革业中70-80％的污染物来源于此过程，也成为了我国仅次于造纸业的第二大有机物污染源，而且还造成了大量毛发不能利用，使资源严重浪费。因此，如何利用酶法脱毛技术来消除环境污染和充分利用资源，是我国皮革工业面临的严重挑战。

采用酶法脱毛，不仅带来脱毛工艺的零污染，从源头上制止了污染物产生；而且还可使脱下的毛发得以综合利用，这是发展的大势所趋。用于毛皮脱毛的酶类，主要是一些蛋白酶类，尤其是碱性蛋白酶。对于其脱毛机理，已经有一些研究，但并不深入。由于有的蛋白酶对真皮层(胶原结构)的损害，酶法脱毛也会因酶制剂不纯而有很大的局限性。此外，蛋白酶制剂的价格较高，也影响了酶法脱毛的广泛应用。寻找一种无胶原水解活性或其活性很低，同时具有良好脱毛效果的蛋白酶，同时可用基因工程的方法进行基因的克隆和高效表达，能很好地解决这些问题。

发明人发现由芽孢杆菌属的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株(保藏号：CGMCCNO.0518)产生的脱毛蛋白酶(命名为DHAP)是一种碱性蛋白酶。仅使用此酶进行的酶法脱毛表明，该酶具有非常好的脱毛效果，并且不损伤皮胶原，比常规用酶AS1398蛋白酶的脱毛时间短而且脱毛效果优于AS1398。同时，该酶对皮具有良好的软化效果，优于目前软化工艺用的胰酶。该酶还可用于脱毛前的浸水工艺。

发明内容

鉴于以上所述，本发明的一个目的是提供这种脱毛蛋白酶以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一个目的是提供编码这种脱毛蛋白酶的多核苷酸。

本发明的另一个目的是提供含有编码这种脱毛蛋白酶的多核苷酸的重组质粒。

本发明的另一个目的是提供含有编码这种脱毛蛋白酶的多核苷酸的基因工程化的宿主细胞。

本发明所说的产生本发明酶的微生物、本发明酶的制造方法和本发明酶的理化特性在我们的一个相关专利申请(专利申请号：0012641.9，公开号：CN 1361278A)中有详细描述。本专利公开编码这种脱毛蛋白酶的多核苷酸和经DNA重组技术产生这种多肽的方法。

本发明涉及这样一种分离的多核苷酸，它包含选自下组的一种核苷酸序列或其变体：

编码具有SEQ ID No：2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

与SEQ ID No：1中162-1310的序列互补的多核苷酸；

与SEQ ID No：1中162-1310的多核苷酸序列至少有90％相同性的多核苷酸。

更佳地，该多核苷酸的序列选自SEQ ID No：1中162-1310的序列。

本发明另外涉及一种含有本发明多核苷酸的载体，特别是表达载体；一种用该载体进行基因工程化的宿主细胞，包括转化、转导或转染的宿主细胞；一种包括培养所述宿主细胞和回收表达产物的制备本发明酶的方法；本发明酶的用途。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。本说明书和权利要求书中使用的下列术语除非特别说明具有如下的含义：

“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因组或合成的DNA或RNA，它们可以是单链或双链的，代表有义链或反义链。类似地，术语“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列及其片段或部分。当本发明中的“氨基酸序列”涉及一种天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，这种“多肽”或“蛋白质”不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸。

蛋白质或多核苷酸“变体”是指一种具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的多核苷酸序列。所述改变可以包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替换。变体可具有“保守性”改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一个或多个氨基酸或核苷酸的缺失。

“插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导致与天然存在的分子相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的增加。“替换”是指由不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸。

“生物活性”是指具有天然分子结构、调控或生物化学功能的蛋白质。“调节”是指脱毛蛋白酶的功能发生改变，包括蛋白质活性的升高或降低，结合特性的改变及脱毛蛋白酶的任何其他生物学性质、功能或免疫性质的改变。

“基本上纯”是指基本上不含天然与其相关的其他蛋白、脂类、糖类等物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化脱毛蛋白酶，基本上纯的脱毛蛋白酶的纯度可用氨基酸序列分析。

“互补的”或“互补”是指在允许的盐浓度和温度条件下通过碱基配对的多核苷酸天然结合。例如，序列“C-T-G-A”可与互补的序列“G-A-C-T”结合。两个单链分子之间的互补可以是部分的或全部的。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间杂交的效率及强度有明显影响。

“同源性”是指互补的程度，可以是部分同源或完全同源。“部分同源”是指一种部分互补的序列，其至少可部分抑制完全互补的序列与靶核酸的杂交。这种杂交的抑制可通过在严格性程度降低的条件下进行杂交(Southern印迹或Northern印迹等)来检测。基本上同源的序列或杂交探针可竞争和抑制完全同源的序列与靶序列在的严格性程度降低的条件下的结合。这并不意味严格性程度降低的条件允许非特异性结合，因为严格性程度降低的条件要求两条序列相互的结合为特异性或选择性相互结合。

“相同性百分率”是指在两种或多种氨基酸或核苷酸序列比较中序列相同或相似的百分率。可用电子方法测定相同性百分率，如通过MEGALIGN程序(Lasergene software package，DNASTAR，Inc.，Madison Wis.)，MEGALIGN程序可根据不同的方法如Cluster法比较两种或多种序列(Higgins D.G.，Sharp，P.M.，Gene，1988，73：237-244)。Cluster法通过检查所有配对之间的距离将各组序列排列成簇，然后将各簇以成对或成组分配。两个氨基酸序列的匹配的残基个数可通过Cluster法或用本领域众所周知的方法如Jotun Hein测定核酸序列之间的相同性百分率(Hein J.，Methods in enzymology，1990，183：625-645)。

“相似性”是指氨基酸序列之间排列对比相应位置氨基酸残基的相同或保守性取代的程度。用于保守性取代的氨基酸例如，带负电荷的氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸可包括赖氨酸和精氨酸；具有不带电荷的头部基团有相似亲水性的氨基酸可包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸。

“衍生物”是指本发明酶或编码酶的核酸的化学修饰物。这种化学修饰物可以是用烷基、酰基或氨基替换氢原子，核酸衍生物可编码天然分子的主要生物学特性的多肽。

“反义”是指与特定的DNA或RNA序列互补的核苷酸序列。“反义链”是指与“有义链”互补的核酸链。

“分离的”一词指将物质从它原来的环境(例如，若是自然产生的就指其天然环境)之中移出。比如说，一个自然产生的多核苷酸或多肽存在于活动物中就是没有被分离出来，但同样的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系统中与之共存的物质分开就是分离的。这样的多核苷酸可能是某一载体的一部分，也可能这样的多核苷酸是某一组合物的一部分。既然载体或组合物不是它天然环境的成分，它们仍然是分离的。

如本发明所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中间存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的脱毛蛋白酶”是指脱毛蛋白酶基本上不含天然与其相关的其他蛋白、脂类、糖类等物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化脱毛蛋白酶，基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。本发明的脱毛蛋白酶的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明提供了一种脱毛蛋白酶，是由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成。

本发明的脱毛蛋白酶可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的脱毛蛋白酶可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生，根据重组生产方案所用的宿主，本发明的脱毛蛋白酶可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。本发明的脱毛蛋白酶还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括脱毛蛋白酶的片段，衍生物和类似物。如本发明所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的脱毛蛋白酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的脱毛蛋白酶的片段、衍生物或类似物可以是：(I)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；或者(II)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其他基团取代包含取代基；或者(III)这样一种，其中成熟多肽与另一种化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(IV)这样一种，其中附加的氨基酸序列融合进成熟多肽而形成的多肽序列(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白序列)。通过本文的阐述，这样的片段，衍生物和类似物被认为在本领域技术人员的知识范围内。

本发明提供了分离的核酸(多核苷酸)，基本由编码具SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的多核苷酸组成。本发明的多核苷酸是从短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株(保藏号：CGMCCNO.05 18)中得到的包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列，全长为1578个碱基，开放读码框编码了383个氨基酸残基。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或是简并的突变体，如本发明所用，“简并的突变体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质或多肽，但与SEQ ID NO：1所示的编码区有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸包括：只有成熟多肽的编码序列，成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列，成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”是指包括编码此多肽的多核苷酸和包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸(两个序列之间具有90％的同源性)。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可以杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％ SDS，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的核酸片段。如本发明所用，“核酸片段”的长度至少含有10个核苷酸，较好是至少20-30个核苷酸，更好是至少50-60个核苷酸，最好是100个核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码脱毛蛋白酶的多核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的编码脱毛蛋白酶的特异的多核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括但不局限于：1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源的多核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的多核苷酸片段。

本发明的DNA片段序列也能用以下方法得到：1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所述多肽的双链DNA。

上述提到的方法中，分离基因组DNA最不常用。DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法，更经常选用的是cDNA序列的分离。分离感兴趣的是cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可以从商业途径获得(Qiagene公司)，而构建cDNA文库也是最通用的方法(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。还可以得到商业提供的cDNA文库。当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。

可用常规方法从这些基因组文库或cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于)：(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因功能的出现或缺失；(3)测定脱毛蛋白酶的转录本的水平；(4)通过免疫学技术或是测定生物学活性来检测基因表达的蛋白产物。上、述方法可单用，也可多种方法联合应用。

在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少10个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸，此外，探针的长度通常在2000个核苷酸以内，较佳的为1000个核苷酸之内，此处所用的探针通常是在本发明的基因序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用做探针。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。

在第(4)种方法中，检测脱毛蛋白酶基因表达的蛋白产物可用检测脱毛活性的方法，免疫学技术如Western印迹法，放射性免疫沉淀法，酶联免疫吸附法(ELISA)等。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.，Science，1985，230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的基因或cDNA时，可优选使用RACE(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的多核苷酸序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

如上述所述得到的本发明的基因或各种DNA片段等的多核苷酸序列可用常规方法如双脱氧核苷酸链终止法(Sanger，et al.PNAS，1977，74：5463-5467)测定。这类多核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的基因或cDNA序列，测序需要反复进行。有时需要测定多个克隆的基因或cDNA序列，才能拼接成全长的基因或cDNA序列。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或直接用脱毛蛋白酶编码序列经过基因工程方法产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述脱毛蛋白酶的方法。

本发明中，编码脱毛蛋白酶的多核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在大肠杆菌中复制的基于T7启动子的表达载体(Rosenberg，et al.，Gene，1987，56：125)；在大肠杆菌-枯草杆菌穿梭表达载体pSUGV4(刘成君，et al.，四川大学学报(自然科学版)，2001，38：243)。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译调控元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建包含编码脱毛蛋白酶的DNA序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，a Labororatory Nanual，Cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA的合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；枯草杆菌常用启动子；毕赤酵母菌的AOX基因启动子；λ噬菌体的P₁启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可调控基因在原核细胞或真核细胞中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶，新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体/转录调控元件(如启动子、增强子等)和选择性标记基因。

本发明中，编码脱毛蛋白酶的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌；链霉菌；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真核细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。

用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后获得，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用原生质体转化法，基因枪转化法、DNA转染法，磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984，224：1431)，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的脱毛蛋白酶。一般说来有以下步骤：

(1)得到编码该脱毛蛋白酶的基因。

(2)用编码本发明的脱毛蛋白酶的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(3)在合适的培养基中培养宿主细胞；

(4)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

在步骤(1)中编码本发明的基因可从短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株(保藏号：CGMCC NO.0518)中克隆。克隆可通过熟知的方法进行。这些方法的实施例为：合成合适的引物，通过PCR克隆靶基因的方法。

在步骤(2)中，为了制备包括上述编码脱毛蛋白酶基因的重组载体，所述的基因可结合到适于在目的宿主中进行基因表达的任意载体中。这些载体的实施例包括但不局限于大肠杆菌作宿主时使用的pET-15b(Novagen公司)。使用由此获得的重组质粒，通过诸如原生质体法或感受态细胞法等常规方法转化宿主。虽然对宿主没有具体的限制，但微生物是优选的。

在步骤(3)中，任何能够使产生本发明脱毛蛋白酶的微生物生长并产生所说的脱毛蛋白酶的培养基都可以用于生产本发明的脱毛蛋白酶。

例如，可以使用葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、糊精作为碳源，使用无机氮化合物(如草酸铵、氯化铵、硝酸钾、磷酸氢二铵等)或有机氮化合物(如酪素、大豆饼、玉米浸液、黄豆粉等)作为氮源，此外还要加入矿物质，如磷酸盐、钾盐、镁盐和钙盐。培养基的初始pH值为7.5-10。在本发明中，将培养物在需氧的条件下培养，培养温度为37℃，培养时间为36小时到48小时，即可得到最大产量的酶。

在步骤(4)中，可以按照常规的分离和纯化方法，对通过以上过程获得的培养物进行纯化。通过盐析沉淀蛋白质、喷雾干燥方法、冻干法等，将可溶性盐加入到所得的上清液或滤液(所说的上清液和滤液是通过离心或者过滤菌体细胞和培养基的固体剩余物而得到的)中，即可获得了本发明的蛋白酶。也可以结合使用其它的纯化方法(如离子交换层析和凝胶过滤层析)来进一步纯化所说的酶。发明人把通过上述方式所获得的本发明的蛋白酶命名为DHAP。通过下述方法测定蛋白酶的活性并测试它的脱毛活性。

1、蛋白酶活力的测定

1ml酶液在50℃，pH9.6条件下测定，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位(U)。

2、脱毛活性的测试

用硼砂一氢氧化钠缓冲液(pH9.6)将酶液调至400U/ml，于250mL三角瓶内装酶液50mL，放入清洗后的猪臀部盐腌皮(10×15cm)3块，37℃恒温摇床(转速160r/min)上脱毛，定时观察脱毛情况。

可以将本发明的酶、多核苷酸及其模拟物、激动剂、拮抗剂和抑制剂与合适的添加剂组合后使用。这些添加剂可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合或其他一些用于制作蛋白酶酶制剂的添加剂。

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

附图说明图1：纯化蛋白酶的SDS-PAGE(A)和等电聚焦(B)分析

1，纯化蛋白酶 2，蛋白质标准物

图2：纯化蛋白酶的最适反应pH(A)和温度(B)测定

图3：纯化蛋白酶的热稳定性测定

图4：脱毛蛋白酶基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析

1，PCR产物 2，DL2000 marker

图5：脱毛蛋白酶基因重组质粒的限制酶切分析

1，重组质粒Pst I和Bam HI双酶切

2，重组质粒的PCR产物

3，Bacillus pumilus UN-31-C-42脱毛蛋白酶基因的PCR产物

4，DL2000 marker

图6：脱毛蛋白酶基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列

图7：脱毛蛋白酶非融含表达质粒pET-DHAp的鉴定

1，用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)基因组为模板扩增的蛋白酶基因

2，pET-DHAp质粒中蛋白酶基因的PCR产物

3，λ/Hind III+EcoRI分子量标准物

4，pET-DHAp/NcoI+BamH I

5，pET-DHAp/NcoI

6，pET15b/NcoI

图8：脱毛蛋白酶非融合表达产物的SDS-PAGE分析

1，蛋白质分子量标准物

2，IPTG诱导前

3，IPTG诱导后2小时

4，IPTG诱导后3小时

5，IPTG诱导后4小时

*表达产物用箭头标出

图9： Bp片段的核苷酸序列

The TATA盒和GACA盒用下划线表示，ATG用加粗的黑体表示。

图10 Bp片段与脱毛蛋白酶基因编码区PCR扩增产物

1：脱毛蛋白酶基因信号肽+前肽+成熟肽 2：Bp片段PCR扩增产物

3：λ/H marker

图11重组子pMD-BpAp的酶切分析

1：质粒pUC18 2：质粒pMD-BpAp

3：pMDM-BpAp经EcoRI限制酶酶切 4：pMD-BpAp经BamHI和SalI限制酶酶切

5：pUC18经BamHI和SalI限制酶酶切 6：pMD-BpAp经HindIII限制酶酶切

7：λ/H marker

图12重组子pMD-BpAp的PCR验证

1：λ/H marker 2：引物P5，引物P8在重组子pMD-BpAp中的扩增

3：引物P7，引物P8在重组子pMD-BpAp中的扩增

4：引物P，引物P8在质粒pUC18中的扩增

5：引物P7，引物P8在质粒pUC18中的扩增

6：λ/EH marker

图13 Bp片段与脱毛蛋白酶基因编码区连接处的核苷酸序列

TCTAGA盒用下划线表示，ATG用加黑的粗体表示

图14 pSU-BpAp的构建图

图15重组子pSU-BpAp的酶切分析

1：λ/H marker 2：质粒pSUGV4 3：质粒pSU-BpAp

4：pSUGV4经XbaI限制酶酶切 5：pSU-BpAp经XbaI限制酶酶切

6：pSUGV4经BamHI和SalI限制酶酶切 7：pSU-BpAp经BamHI和SalI限制酶酶切

8：λ/EH marker

图16重组子pSU-BpAp的PCR验证

1：Bp片段在pSU-BpAp中的扩增 2：Bp片段在短小芽孢杆菌总DNA中的扩增

3：Bp片段在pSUGV4中的扩增 4：脱毛蛋白酶基因编码区在pSU-BpAp中的扩增

5：脱毛蛋白酶基因编码区在短小芽孢杆菌总DNA中的扩增

6：脱毛蛋白酶基因编码区在pSUGV4中的扩增7：λ/EH marker

图17枯草杆菌WB600转化子在牛奶平板上的生长

A：含有pSUGV4的WB600转化子

B：含有pSU-BpAp的WB600转化子

图18转化子pSU-BpAp/WB600的发酵上清液的SDS-PAGE分析

M：Marker

1：负对照：转化子pSUGV4/WB600的发酵上清液

2：转化子pSU-BpAp/WB600的发酵上清液

3：短小芽孢杆菌(B.pumilis UN31-C-42)的发酵上清液

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人所著的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

具体实施方式

实施例1、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株(保藏号：CGMCC NO.0518)的放大培养

将短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株(保藏号：CGMCC NO.0518)在含有麸皮2.5％，黄豆粉(或水解液)2％，酵母膏0.3％，K₂HPO₄ 0.4％，NaH₂PO₄ 0.04％，CaCO₃ 0.3％的培养基中，于35℃下进行500L培养36小时，每隔4小时取培养液10000rpm离心10分钟后取上清液测定蛋白酶活性。该菌株在16小时开始产生蛋白酶，到28小时时达到最大酶活性5400U/ml(表1)。

表1短小芽孢杆菌脱毛蛋白酶活性的变化

发酵时间(hrs) 4 8 12 16 20 24 28 32 36

蛋白酶活性(U/mL) 0 0 0 20 1700 5000 5400 3900 2250

实施例2、脱毛蛋白酶的纯化和电泳分析

将在实施例1中获得的培养物10000rpm离心10分钟后，取上清液用0.8μm过滤器(Millipore，Bedford)过滤，滤液用10mM Tris-HCl缓冲液(pH6.8)透析。透析液上CM-sepharose Fast Flow柱(8×40cm，Pharmacia公司)，用含0.1M NaCl的10mMTris-HCl缓冲液(pH6.8)洗脱，将酶活峰进行冷冻干燥，得到的干粉重新溶解在10mMTris-HCl缓冲液(pH9.0)中，然后对相同缓冲液透析。将此溶液加入到DEAE-sepharose FastFlow柱(1 by 10cm)(Pharmacia公司)中，使用含0.01M NaCl的10mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)洗脱，收集酶活峰进行冷冻干燥，得到的干粉重新溶解在含0.5 M NaCl的10mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)中。酶液上串联的Sephacryl S-100(2.5×100cm)/Sephacryl S-200(1.5×100cm)凝胶过滤柱，用含0.5 M NaCl的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)洗脱。收集的酶活液用硫酸铵沉淀，终浓度为1M，将此液上疏水层析柱(HIC，1.5×10cm)，最后用含不同浓度硫酸铵(1M至0.1M)的20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)洗脱。每步纯化的效率和回收率总结于表2。

表2短小芽孢杆菌脱毛蛋白酶的纯化效率和收率

总酶活比活性纯化倍收率

纯化步骤总蛋白(mg)

(units) (U/mg) 数 (％)

粗酶液 40000 18140000 453.5 1 100

CM-sepharose 2770 1739100 628 1.39 9.59

DEAE-sepharose 370 689400 1854 4.09 3.8

凝胶过滤 18 249840 13800 30.43 1.38

疏水层析 9.1 159630 17530 38.65 0.88

将活性峰收集、透析、冷冻干燥，重新溶解后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，表明此酶为一条单一的带，其分子量为32000(见附图1A)。

对此蛋白酶进行等电聚焦分析，其等电点为9(见附图1B)。

实施例3、纯脱毛蛋白酶的最适反应pH和温度及热稳定性

取同样量的蛋白酶液在pH6.8，7.5，8.0，8.42，9.0，9.53，10.0，10.5，10.92条件下测定酶活性，结果发现最适反应pH约为9.6(见附图2A)。

取同样量的蛋白酶液在31℃，37℃，45℃，50℃，58℃和66℃测定酶活，发现最适反应温度为55℃(见附图2B)。

测定纯化的蛋白酶的热稳定性发现，在50℃下保温30分钟后的酶活仅剩47％，在60℃下保温30分钟后的酶活仅剩15％，而在70℃下保温10分钟后的酶活则全部丧失(见附图3)。

实施例4、抑制剂和金属离子对纯脱毛蛋白酶活性的影响

利用不同浓度的蛋白酶抑制剂和金属离子测定它们对纯脱毛蛋白酶活性的影响，结果列于表3。

表3抑制剂和金属离子对纯脱毛蛋白酶活性的影响

抑制剂和金属离子浓度剩余活性(％)

PMSF 1mM 0

DFP 1mM 0

1mM 84

EDTA

10mM 59

1mM 81

EGTA

10mM 53

pepstatin A 0.55mg/ml 77

leupeptin 0.5mg/ml 94

benznmidine 10mM 90

hydrochloride

Aprotin 0.5mg/ml 98

Na⁺ 0.1M 113

Ca²⁺ 10mM 119

Mg²⁺ 10mM 115

Cu²⁺ 1mM 76

Zn²⁺ 1mM 80

实施例5、纯蛋白酶的脱毛效果

取一小块猪皮，用约10ml含有300U的蛋白酶液浸泡，在37℃下浸泡约4小时后，猪毛可以全部脱去，说明纯化的蛋白酶也可以脱毛。

实施例6、脱毛蛋白酶基因的PCR扩增

设计了如下一对引物以期扩增出全长脱毛蛋白酶基因：

P1：5’-TTTCCAAGCGACTTAATTCC-3’(见SEQ ID NO：3)

P2：5’-GGCATCAAGAACCGTGCAGC-3’(见SEQ ID NO：4)

以短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株(保藏号：CGMCC NO.0518)的总DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃变性5min；94℃变性1min，52℃复性1min，72℃延伸2min，共32个循环，最后一轮72℃延伸10min。PCR扩增得到一条约1.6kb的特异性片段(见附图4)。

实施例7、脱毛蛋白酶基因的克隆及其鉴定

将实施例6得到的扩增产物从低熔点琼脂糖凝胶中回收和纯化后，与pGEM-T载体(Promega公司)连接，然后转化大肠杆菌JM109。从转化子中提取质粒，电泳检测得到重组质粒，从而获得阳性克隆。将阳性克隆用PCR检测，能够扩增出大小相同的特异DNA带；用PstI与BamHI双酶切，也产生约1.6kb的片段，均与预期结果一致(见附图5)。

实施例8、脱毛蛋白酶基因的鉴定

已从短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株(保藏号：CGMCC NO.0518)发酵液中纯化了能够完成脱毛过程的脱毛蛋白酶，并测定了其N-末端氨基酸残基序列。其末端序列为：AQTVPYGIPQIKAPAVHAQG。

将克隆到的DNA片段进行全序列测定，结果发现克隆片段全长1578bp，含有完整的编码序列及转录起始位点。片段中含有一个1149bp的ORF，编码全长为383个氨基酸残基的蛋白质。根据软件分析与同源性比较推测，该蛋白质包括由29个氨基酸残基组成的信号肽，以及79个氨基酸残基组成的前肽。成熟蛋白酶全长共275个氨基酸残基，其中，D32，H64，和S221三个氨基酸残基为催化活性中心(见附图6)。

将克隆到的全长脱毛蛋白酶基因(命名为AP)编码的成熟蛋白N-端序列与纯化的脱毛蛋白酶N-端序列进行比较，二者完全相同，均为：AQTVPYGIPQIKAPAVHAQG，这充分证明，克隆到的AP基因就是该菌株的脱毛蛋白酶基因。

实施例9、脱毛蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达

根据已经测定的脱毛蛋白酶基因序列，设计了P3和P4一对引物。P3引物从成熟肽的第一个编码核苷酸开始，P4端引物采用成熟蛋白酶基因编码区的3’-端序列：

P3：5’- CATATGGCCCAAACCGTCCCTTAT-3’(见SEQ ID NO：5)

NdeI

P4：5’-TTAGTTAGAAGCTGCTTGAA-3’(见SEQ ID NO：6)

使用这对引物直接从短小芽孢杆菌UN-31-C-42菌株总DNA中扩增，得到一个800bp左右的编码成熟肽序列的片段，该片段命名为DHAp。将此片段与pGEM-T载体(Promega公司)连接，转化大肠杆菌JM109，从转化子中提取质粒，电泳检测得到重组质粒，从而获得阳性克隆。再将筛选到的重组子使用Ndel与BamHI进行双酶切，回收得到的800bp片段。纯化后进行Ndel和BamHI双酶切，再与相应酶切的pET-15b载体相连，得到重组质粒，命名为pET-DHAp。对该质粒的PCR验证和限制酶酶切结果(见附图7)，均与预期完全一致。

将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后，将转化子于37℃培养，4小时后加入IPTG进行诱导(终浓度1mM)，即表达出相应的蛋白质。表达的蛋白质形成包涵体，含量约为总蛋白的30％(见附图8)。

实施例10、脱毛蛋白酶基因在枯草杆菌中的表达

为了使脱毛蛋白酶基因在枯草杆菌中得到表达，先从短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株(保藏号： CGMCC NO.0518)中克隆到一个启动子片段(命名为Bp片段，其序列见附图9)，然后将此启动子片段与脱毛蛋白酶基因的编码区片段(命名为Ap片段)相连，再把相连而成的融合基因(命名为BpAp)插入到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体pSUGV4(刘成君，et al.，四川大学学报(自然科学版)，2001，38：243，其物理图谱见附图14)中，构建了表达载体pSU-BpAp(其构建过程见附图14)。将pSU-BpAp用感受态转化法转入到枯草杆菌WB600中，所得转化子命名为pSU-BpAp/WB600。该转化子能够在牛奶平板上产生透明的水解圈。在该转化子的发酵上清液中检测到了脱毛蛋白酶的活性，而空载体pSUGV4转入到枯草杆菌WB600后则检测不到水解圈和蛋白酶的活性。这些结果都表明了脱毛蛋白酶在枯草杆菌中得到表达，表达的蛋白酶具有脱毛活性。

具体步骤如下：

1、PCR扩增短小芽孢杆菌基因启动子Bp片段

由于Bp启动子片段的序列已测，因此分别设计了一对引物，直接从这一片段的供体菌株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)(保藏号：CGMCC NO.0518)基因组中扩增。

P5(上游引物)：5’-CCG GGATCCTCATTTAGTCAGCTTTAACAT-3’(见SEQ ID NO：7)

BamHI

P6(下游引物)：5’-CCG TCTAGACATCTCATCACTTAAGAT-3’(见SEQ ID NO：8)

XbaI

以短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)(保藏号：CGMCC NO.0518)的总DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增条件：94℃ 3min，30×(94℃ 30sec，59℃ 30 sec，72℃30sec)72℃ 5min，扩增出大小为184bp的一条特异性的带(见附图10)。PCR产物经试剂盒纯化，然后用Xbal进行酶切，酶切后电泳回收。

2、PCR扩增脱毛蛋白酶基因编码区序列

设计了一对PCR引物：

P7(上游引物)：5’-CCG TTCTAGAATGTGCGTGAAAAAGAAAAAT-3’(见SEQ IDNO：9)

XbaI

P8(下游引物)：5’-CGC GTCGACGGCATCAAGAACCGTGCAGC-3’(见SEQ IDNO：10)

SalI

以短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)(保藏号：CGMCC NO.0518)的总DNA为模板，将脱毛蛋白酶基因的信号肽+前肽+成熟肽编码区序列(即Ap片段)用PCR方法扩增出，PCR扩增条件：

94℃5min，30×(94℃30sec，58℃ 30 sec，72℃ 60sec)72℃10min，大小为1365bp(见附图10)。其上游引物含有XbaI位点，下游引物含有SalI位点.。PCR产物经试剂盒纯化后，用XbaI进行酶切，酶切后电泳回收。

3、Bp片段与脱毛蛋白酶基因编码区相连

将上述两个回收产物相连后再电泳，然后回收预期大小的DNA片段，再将其插入TaKaRa公司(大连宝生物工程公司)的pMD18T中，构建了重组子pMD-BpAp。通过蓝白菌落选择，挑选阳性克降。重组子pMD-BpAp的酶切分析见附图11，重组子pMD-BpAp的PCR验证见附图12。

为了确保两个DNA片段融合处核苷酸序列正确，对重组子pMD-BpAp进行测序。测得的连接处序列如图13所示。

如图13所示，序列中的第一个ATG为Bp片段上的起始密码子，第二个ATG为AP基因信号肽的第一个氨基酸，并且保证了Bp片段上的起始密码子与AP基因信号肽的第一个氨基酸密码子的相位一致。TCTAGA为XbaI的识别序列。测出的序列表明：融合正确。

4、表达载体pSU-BpAp的构建

将上述重组子pMD-BpAp用BamHI和SalI双酶切，分离纯化1.5Kb的BpAp DNA带。大肠杆菌-枯草杆菌的穿梭质粒pSUGV4用BamHI和SalI双酶切，并脱磷酸化处理，再与BpAp基因片段以适当比例连接，转化大肠杆菌(E.coli)DH5α，获得了重组子(命名为pSU-BpAp)。pSU-BpAp的构建见附图14，重组子pSU-BpAp的酶切分析见附图15，PCR验证见附图16。

5、脱毛蛋自酶基因在枯草杆菌WB600中的表达

将重组子pSU-BpAp用感受态转化法转入到了枯草杆菌WB600中，获得转化子(命名为pSU-BpAp/WB600)。该转化子不仅能够在牛奶平板上产生透明的水解圈(图17)，而且在转化子的发酵上清液中检测到了脱毛蛋白酶的酶活。原载体pSUGV4转入到枯草杆菌WB600后则检测不到水解圈和蛋白酶的活性。

6、pSU-BpAP/WB600的发酵上清液的SDS-PAGE分析

如图18所示：转化子pSU-BpAp/WB600的发酵上清液和原出发菌短小芽孢杆菌(B.pumilis UN-31-C-42)的发酵上清液在SDS-PAGE中都显示出一条大约为31KD的蛋白带。根据本实验室已有的结果，纯化的蛋白酶分子量大约为31KD。由此证明：脱毛蛋白酶基因在枯草杆菌WB600中得到了表达。转化子pSUGV4/WB600的发酵上清液则没有显示出31KD的蛋白质带。

7、转化子pSU-BpAp/WB600发酵液的制备及酶活测定

脱毛蛋白酶活力测定按照轻工部部颁标准进行(酶活(U/ml)＝O.D.500mm×稀释倍数×斜率)。发酵过程参考短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)(保藏号：CGMCC NO.0518)最佳产酶条件：种龄24h，接种量1％，培养条件100ml LB置于250ml三角瓶中，卡那霉素含量20μg/ml，37℃摇床培养，转速200rpm。从接种4h后开始，每4h取样一次，共9次。酶活测定表明，该菌株在发酵20h后开始产酶，在48h达到高峰，其酶活测定结果如表4所示：转化子pSU-BpAp/WB600表达出了有活性的脱毛蛋白酶。

表4发酵不同时间酶活测定

样品编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

发酵时间(h) 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52

酶活(U/mL) 0 0 0 5.4 8.3 11. 12.6 15. 18.1 20.4 21.2 19.7

8 5

转化子pSUGV4/WB600的发酵上清液中检测不到脱毛蛋白酶的酶活。

8、转化子pSU-BpAp/WB600发酵液的脱毛实验

取一小块生羊皮，浸泡于转化子pSU-BpAp/WB600的48h发酵液中，用pH9.6的硼砂缓冲液调发酵液的pH值为9.6，37℃摇床震荡，每隔一定时间检测一次，根据手感判断脱毛效果。结果表明，转化子pSU-BpAp/WB600发酵液可以脱毛，且对皮革胶原没有损伤。脱毛效果如表5所示：

表5不同处理时间的脱毛实验

标号 1 2 3 4 5 6 7 8 9

处理时间(h) 8 12 16 20 24 28 32 36 48

脱毛效果 - - - - + + + ++ ++

注：“-”表示不能脱毛：“+”表示能够脱毛，但效果一般：

“++”表示能够脱毛，且效果很好。

用相同pH值的缓冲液为对照转化子pSUGV4/WB600的发酵上清液进行脱毛，未检测到脱毛效果。

由实验结果表明：转化子pSU-BpAp/WB600中Ap片段所产生的碱性蛋白酶能够独立完成生皮的脱毛，且对皮革胶原没有损伤。进一步证明了脱毛蛋白酶的独特功能。

序列表

(1)一般信息：

(i)发明名称：脱毛蛋白酶和编码这种脱毛蛋白酶的多核苷酸

(ii)序列数目：10

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1578bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓补类型：线性

(E)(162)...(248)sig_peptide信号肽

(F)(249)...(488)sig_peptide前导肽

(G)(489)...(1310)mat_peptide成熟肽

(H)(162)...(1310)CDS编码序列

(l)(1326)...(1357)teminator终止子

(ii)分子类型：DNA

(iii)序列描述：SEQ ID NO：1：

1 TTTCCAAGCG ACTTAATTCC CTATTTTTCG CTAGGACTTC CCAAAAATTC AGGTCTACTC

61 TTATTTGCCT ATCTCTATTA AACTGAAAAT ACAGAATAAT CAAACGGATC ATTCTAATAG

121 ACTACGGATG ATTATTCTGA AATAAGAAAA AGGGATGTGG AATGTGCGTG AAAAAGAAAA

181 ATGTGATGAC AAGTGTTTTA TTGGCTGTCC CTCTTCTGTT TTCAGCAGGG TTTGGAGGCT

241 CGATAGCAAA TGCCGAGACT GCCTCAAAGT CAGAAAGCGA AAAAAGCTAT ATCGTTGGCT

301 TTAAAGCTTC TGCCACCACA AACAGCTCTA AGAAACAAGC AGTGACACAA AATGGTGGGA

361 AATTAGAAAA ACAATACCGC CTCATTAATG CTGCACAAGT GAAGATGTAT GAACAAGCCG

421 CAAAAAAACT TGAACACGAC CCTAGCATTG CTTATGTAGA AGAAGACCAC AAAGCAGAAG

481 CATATGCCCA AACCGTCCCT TATGGTATCC CTCAAATCAA AGCTCCAGCC GTACACGCTC

541 AAGGTTATAA AGGTGCTAAC GTCAAAGTAG CTGTCCTTGA TACTGGAATC CACGCCGCAC

601 ACCCTGACTT AAATGTTGCA GGCGGTGCTA GCTTCGTCCC TTCAGAGCCA AATGCCACAC

661 AAGACTTTCA ATCACACGGA ACTCACGTAG CCGGAACCAT TGCTGCCCTT GATAACACGA

721 TTGGTGTTCT TGGGGTTGCG CCAAGCGCCT CCTTGTATGC CGTTAAAGTG TTAGATCGTT

781 ACGGCGATGG ACAATACAGC TGGATTATCA GTGGTATTGA ATGGGCTGTT GCCAATAACA

841 TGGATGTCAT CAATATGAGC TTAGGCGGAC CAAACGGCTC CACAGCGCTT AAAAATGCTG

901 TAGACACAGC GAATAATCGC GGAGTAGTTG TCGTTGCCGC AGCAGGGAAT TCAGGTTCCA

961 CTGGCTCTAC CAGCACCGTA GGCTATCCTG CAAAATACGA CTCTACGATT GCTGTTGCCA

1021 ACGTGAACAG CAACAATGTC AGAAACTCAT CTTCTAGCGC AGGTCCTGAA TTAGATGTTT

1081 CTGCACCTGG TACATCGATT TTAAGTACAG TACCAAGCAG TGGATATACA TCTTATACGG

1141 GAACATCGAT GGCATCTCCT CATGTAGCAG GAGCAGCAGC GCTTATCCTT TCTAAGTATC

1201 CGAATCTATC GACTTCTCAG GTTCGTCAGC GCTTAGAAAA TACGGCAACA CCGCTTGGTA

1261 ATTCGTTCTA TTATGGAAAA GGATTAATTA ACGTTCAAGC AGCTTCTAAC TAAAATAAGT

1321 GTGACAAAAA ATCCGGCTAA CTGAGCCGGA TTTTTTTATT TATTGCTTTT TCGATGTTTC

1381 CTCTTTTTTC GCTGCCTTTT CCATATCGAT GATTCTCTCC ATCATCGTCG GGTGCCCATA

1441 GCGGAATATT TTCACTAAAA GTGGCGGATT GACTTGGGAA AGCCCTGATT TTGCAAGCTT

1501 TTGAAATGAC GTCACCCCCG CCTCTCCATC TTTCGTCAAG TTCACGGCGT ATTCATCAGC

1561 TGCACGGTTC TTGATGCC

(3)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：383个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓补结构：线性

(D)(1)...(29)SIGNAL

(E)(30)...(108)PROPEP

(F)(109)...(383)CHAIN

(ii)分子类型：多肽

(iii)序列描述：SEQ ID NO：2：

Met Cys Val Lys Lys Lys Asn Val Met Thr Ser Val Leu Leu Ala

1 5 10 15

Val Pro Leu Leu Phe Ser Ala Gly Phe Gly Gly Ser Ile Ala Asn

20 25 30

Ala Glu Thr Ala Ser Lys Ser Glu Ser Glu Lys Ser Tyr Ile Val

35 40 45

Gly Phe Lys Ala Ser Ala Thr Thr Asn Ser Ser Lys Lys Gln Ala

50 55 60

Val Thr Gln Asn Gly Gly Lys Leu Glu Lys Gln Tyr Arg Leu Ile

65 70 75

Asn Ala Ala Gln Val Lys Met Tyr Glu Gln Ala Ala Lys Lys Leu

80 85 90

Glu His Asp Pro Ser Ile Ala Tyr Val Glu Glu Asp His Lys Ala

95 100 105

Glu Ala Tyr Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Gln Ile Lys

110 115 120

Ala Pro Ala Val His Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys

120 125 135

Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile His Ala Ala His Pro Asp Leu

135 140 150

Asn Val Ala Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro Ser Glu Pro Asn Ala

150 155 165

Thr Gln Asp Phe Gln Ser His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile

165 170 180

Ala Ala Leu Asp Asn Thr Ile Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser

180 185 195

Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asp Arg Tyr Gly Asp Gly

195 200 210

Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Ser Gly Ile Glu Trp Ala Val Ala Asn

210 215 225

Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Asn Gly Ser

225 230 240

Thr Ala Leu Lys Asn Ala Val Asp Thr Ala Asn Asn Arg Gly Val

240 245 255

Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Thr Gly Ser Thr

255 260 270

Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Thr Ile Ala Val

270 275 285

Ala Asn Val Asn Ser Asn Asn Val Arg Asn Ser Ser Ser Ser Ala

285 290 300

Gly Pro Glu Leu Asp Val Ser Ala Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser

300 305 315

Thr Val Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Thr Gly Thr Ser Met

315 320 330

Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys

330 335 345

Tyr Pro Asn Leu Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Arg Leu Glu Asn

345 350 360

Thr Ala Thr Pro Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu

360 365 375

Ile Asn Val Gln Ala Ala Ser Asn

380

(4)SEQ ID NO：3的信息

(i)序列特征：

(A)长度： 20碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓补结构：线性

(E)PCR引物

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述： SEQ ID NO：3

TTTCCAAGCGACTTAATTCC

(5)SEQ ID NO：4的信息

(i)序列特征：

(A)长度： 20碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓补结构：线性

(E)PCR引物

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述： SEQ ID NO：4

GGCATCAAGAACCGTGCAGC

(6)SEQ ID NO：5的信息

(i)序列特征：

(A)长度：24碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓补结构：线性

(E)PCR引物

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO：5

CATATGGCCCAAACCGTCCCTTAT

(7)SEQ ID NO：6的信息

(i)序列特征：

(A)长度：20碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓补结构：线性

(E)PCR引物

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述： SEQ ID NO：6

TTAGTTAGAAGCTGCTTGAA

(8)SEQ ID NO：7的信息

(i)序列特征：

(A)长度：30碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓补结构：线性

(E)PCR引物

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO：7

CCGGGATCCTCATTTAGTCAGCTTTAACAT

(9)SEQ ID NO：8的信息

(i)序列特征：

(A)长度：27碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓补结构：线性

(E)PCR引物

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO：8

CCGTCTAGACATCTCATCACTTAAGAT

(10)SEQ ID NO：9的信息

(i)序列特征：

(A)长度：30碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓补结构：线性

(E)PCR引物

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述： SEQ ID NO：9

CCGTCTAGAATGTGCGTGAAAAAGAAAAAT

(ii)SEQ ID NO：10的信息

(i)序列特征：

(A)长度：29碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓补结构：线性

(E)PCR引物

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO：10

CGCGTCGACGGCATCAAGAACCGTGCAGC

Claims

1.一种蛋白酶，其特征在于它包含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、类似物或衍生物。

2.如权利要求1所述的蛋白酶，其特征在于所述蛋白酶、类似物或衍生物的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列至少95％的相同性。

3.如权利要求2所述的蛋白酶，其特征在于它包含具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

4.一种分离的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含选自下组中的一种：

(a)编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的酶或其片段、类似物、衍生物的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；或

(c)与(a)或(b)至少有90％相同性的多核苷酸。

5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多核苷酸。

6.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含有SEQ ID NO：1中162-1310位的序列。

7.一种含有外源多核苷酸的重组载体，其特征在于它是由权利要求4-6中的任一权利要求所述多核苷酸与质粒或其他表达载体构建而成的重组载体。

8.一种含有外源多核苷酸的遗传工程化宿主细胞，其特征在于它是选自于下列一种宿主细胞：

(a)用权利要求7所述的重组载体转化或转导的宿主细胞；或

(b)用权利要求4-6中的任一权利要求所述多核苷酸转化或转导的宿主细胞。

9.一种具有蛋白酶活性的多肽的制备方法，其特征在于所述方法包括：

(a)在表达蛋白酶基因的条件下，培养权利要求8所述的遗传工程化宿主细胞；

(b)从培养物中分离出具有蛋白酶活性的多肽。

10.一类模拟或调节多肽活性或表达的化合物，其特征在于它们是模拟、促进、拮抗或抑制蛋白酶的活性的化合物。

11一种权利要求10所述化合物的应用，其特征在于所述化合物用于调节蛋白酶活性的方法。

12.如权利要求1-3中的任一权利要求所述多肽的应用，其特征在于它应用于筛选蛋白酶的模拟物、激动剂、拮抗剂或抑制剂。

13.如权利要求4-6中的任一权利要求所述的核酸分子的应用，其特征在于它作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应。

14.如权利要求1-6及10中的任一权利要求所述的多肽、多核苷酸或化合物的应用，其特征在于用所述多肽、多核苷酸或其模拟物、激动剂、拮抗剂或抑制剂以有效剂量与用于制备该蛋白酶制剂的添加剂组成作为制革用浸水、脱毛、软化用酶制剂。

15.权利要求1-6及10中的任一权利要求所述的多肽、多核苷酸或化合物的应用，其特征在于用所述多肽、多核苷酸或化合物制备用于制革用浸水、脱毛、软化用酶制剂。