JP2011505865A - 脂質アシルトランスフェラーゼを用いる食用油精製のためのプロセス - Google Patents
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Abstract
Description
以下の関連する出願を参照する:US2002−0009518、US2004−0091574、国際公開第2004/064537号、国際公開第2004/064987号、国際公開第2005/066347号、国際公開第2005/066351号、2006年2月2日に出願された米国特許出願第60/764,430号、国際公開第2006/008508号、国際特許出願第PCT/IB2007/000558号および米国特許出願第11/671,953号。これらの出願の各々およびこれらの出願の各々において引用された文献の各々(「出願引用文献」)、ならびに該出願引用文献において参照または引用された各文献は、これらの出願の文中または実行の間のいずれかにおける、ならびにそのような実行の間に進んだ特許性のサポートにおける議論は、参考により本明細書中に援用される。種々の文献がまた、本文中で引用される(「明細書引用文献」)。明細書引用文献のそれぞれ、および明細書引用文献中で引用または参照された各文献は、参考により本明細書中に援用される。
本発明の第1の態様によれば、a)約0.1〜5%w/wの水を食用油(好ましくは、粗製食用油)および脂質アシルトランスフェラーゼと混合する段階と、b)約45℃〜約90℃で約10分間〜180分間、前記混合物を撹拌する段階と、c)油相とガム相を分離する段階とを含む、食用油(好ましくは、粗製食用油)を水脱ガムするプロセスが提供される。
トランスフェラーゼ活性の決定「トランスフェラーゼアッセイ(コレステロール:リン脂質)」(TrU)
基質:50mgのコレステロール(Sigma C8503)および450mgの大豆ホスファチジルコリン(PC)、Avanti #441601をクロロホルムに溶解し、クロロホルムを減圧下、40℃で蒸発させる。
酵素法:
250μlの基質を、40℃で、蓋を有するガラス中に加える。
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼが加えられている食用油を、CHCl3:CH3OH2:1との酵素反応後、抽出することができ、脂質材料を含む有機相を単離し、本明細書の下記に詳述された手順に従ってGLCおよびHPLCによって分析する。GLCおよびHPLC分析から、遊離脂肪酸およびステロール/スタノールエステルの1つまたは複数の量を決定する。本発明による酵素が加えられていない対照食用油を同様に分析する。
計算:
GLCおよびHPLC分析の結果から、遊離脂肪酸およびステロール/スタノールエステルの増加を計算することができる:
Δ%脂肪酸=%脂肪酸(酵素)−%脂肪酸(対照)
Mv脂肪酸=脂肪酸の平均分子量
A=Δ%ステロールエステル/Mvステロールエステル(ただし、Δ%ステロールエステル=%ステロール/スタノールエステル(酵素)−%ステロール/スタノールエステル(対照)、およびMvステロールエステル=ステロール/スタノールエステルの平均分子量)
トランスフェラーゼ活性は、全酵素活性のパーセンテージとして計算される。
植物ステロールおよびホスファチジルコリンを、撹拌しながら95℃まで加熱することによって大豆油に溶解した。その後、油を40℃まで冷却し、酵素を加えた。水を、油相の5%の全濃度に加えた。試料を、磁力で撹拌しながら40℃に維持し、4時間後および20時間後、試料を取り出し、TLCによって分析した。
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下を結果として生じるものである:
i)(以下の方法を用いる:植物ステロールおよびホスファチジルコリンを、撹拌しながら95℃まで加熱することによって大豆油に溶解した。その後、油を40℃まで冷却し、酵素を加えた。試料を、磁力で撹拌しながら40℃に維持し、0.5時間後、1時間後、2時間後、4時間後、および20時間後、試料を取り出し、TLCによって分析した)植物ステロール(1%)およびホスファチジルコリン(2%)油を追加した大豆油に存在するリン脂質の除去;
ならびに/または
ii)(上記のi)に教示された方法を用いる)加えられたステロールのステロールエステルへの変換(%変換)。実施例2に教示されているように、ステロールおよびステロールエステルのレベルを決定するためのGLC方法を用いてもよい。
リン含有量についてのアッセイ
水脱ガム後の油に存在するリン脂質のレベルは、AOAC Official Method 999.10(>Lead, Cadmium, Zinc, Copper, and Iron in Foods Atomic Absorption Spectrophotometry after Microwave Digestion, First Action 1999 NMKL−AOAC Method)に教示された試料調製に従って油試料を最初に調製することによって決定される。その後、油中のリン脂質量を、AOAC Official Method Ca 20−99:Analysis of Phosphorus in oil by inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopyに従って脱ガム後の油試料におけるリン含有量を分析することによって測定する。
基質:50mmのHepes、pH7.0に溶解した、1.75%のL−植物ホスファチジルコリン95%(441601、Avanti Polar Lipids)、6.3%のTriton X−100(#T9284、Sigma)、および5mM CaCl2。
アッセイ手順:試料、キャリブレーション、および対照を、10mMのHEPES、pH7.0、0.1%のTriton X−100(#T9284、Sigma)に希釈した。分析をKonelab Autoanalyzer(Thermo、Finland)を用いて行った。アッセイを、30Cで実行した。4μLの試料を加える前に、34μLの基質を180秒間、サーモスタットで調温した。酵素法は600秒間続いた。酵素法中に遊離した遊離脂肪酸の量を、NEFA Cキット(999−75406、WAKO、Germany)を用いて測定した。56μLのNEFA Aを加え、その混合物を300秒間インキュベートした。後で、113μLのNEFA Bを加え、その混合物を300秒間インキュベートした。その後、OD520nmを測定した。酵素活性(μモルFFA/分・mL)を、標準酵素調製に基づいて計算した。
上記で述べたように、リン脂質分解酵素(好ましくは脂質アシルトランスフェラーゼ)は、ホスホリパーゼC(E.C.3.1.4.3)と組み合わせて用いることができる。
本発明の一つの利点は、油収率の増加が水脱ガムプロセスの終わりに得られることである。油収率の増加は、本発明による酵素の添加がないことを除いて比較可能な水脱ガムプロセスと比較される。
宿主生物体は、原核生物または真核生物であり得る。
適用によっては、本発明の方法および/または使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼ配列は、選択された宿主細胞(B.licheniformis細胞など)によるなどのヌクレオチド配列の発現を提供する能力がある制御配列に、それをコードするヌクレオチド配列を作動可能に連結することによって、得ることができる。
本発明に従って用いられるプロモーター配列は、脂質アシルトランスフェラーゼをコードする配列と異種性でも同種性でもよい。
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列の発現による宿主細胞によって産生される脂質アシルトランスフェラーゼは、用いられる配列および/もしくはベクターに依存して、分泌されてもよいし、細胞内に含まれてもよい。
用語「発現ベクター」は、インビボまたはインビトロの発現の能力がある構築物を意味する。
本発明の方法および/または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、天然の脂質アシルトランスフェラーゼをコードしてもよいし、変種脂質アシルトランスフェラーゼをコードしてもよい。
酵素は、脂質アシル供与体の本来のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移されて、新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義され得るアシルトランスフェラーゼ活性を有する;および
酵素は、アミノ酸配列モチーフGDSXを含み、ただし、Xが以下のアミノ酸残基、L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、またはSの1つまたは複数である。
(i)酵素は、脂質アシル供与体の本来のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移されて、新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義され得るアシルトランスフェラーゼ活性を有する;
(ii)酵素は、アミノ酸配列モチーフGDSXを含み、ただし、Xが以下のアミノ酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、またはSの1つまたは複数である;
(iii)酵素は、His−309を含み、または図2および4(配列番号1または配列番号3)に示されたAeromonas hydrophila脂質アシルトランスフェラーゼ酵素におけるHis−309に対応する位置にヒスチジン残基を含む。
酵素は、第1の脂質アシル供与体の本来のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移されて、新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義され得るアシルトランスフェラーゼ活性を有する;および
酵素は、少なくともGly−32、Asp−33、Ser−34、Asp−134、およびHis−309を含み、または配列番号3もしくは配列番号1に示されたAeromonas hydrophila脂質アシルトランスフェラーゼ酵素におけるGly−32、Asp−33、Ser−34、Asp−306、およびHis−309、それぞれに対応する位置にグリシン、アスパラギン酸、セリン、アスパラギン酸、およびヒスチジン残基を含む。
(a)配列番号36として示されたヌクレオチド配列(図29参照);
(b)配列番号38として示されたヌクレオチド配列(図31参照);
(c)配列番号39として示されたヌクレオチド配列(図32参照);
(d)配列番号42として示されたヌクレオチド配列(図35参照);
(e)配列番号44として示されたヌクレオチド配列(図37参照);
(f)配列番号46として示されたヌクレオチド配列(図39参照);
(g)配列番号48として示されたヌクレオチド配列(図41参照);
(h)配列番号49として示されたヌクレオチド配列(図57参照);
(i)配列番号50として示されたヌクレオチド配列(図58参照);
(j)配列番号51として示されたヌクレオチド配列(図59参照);
(k)配列番号52として示されたヌクレオチド配列(図60参照);
(l)配列番号53として示されたヌクレオチド配列(図61参照);
(m)配列番号54として示されたヌクレオチド配列(図62参照);
(n)配列番号55として示されたヌクレオチド配列(図63参照);
(o)配列番号56として示されたヌクレオチド配列(図64参照);
(p)配列番号57として示されたヌクレオチド配列(図65参照);
(q)配列番号58として示されたヌクレオチド配列(図66参照);
(r)配列番号59として示されたヌクレオチド配列(図67参照);
(s)配列番号60として示されたヌクレオチド配列(図68参照);
(t)配列番号61として示されたヌクレオチド配列(図69参照);
(u)配列番号62として示されたヌクレオチド配列(図70参照);
(v)配列番号63として示されたヌクレオチド配列(図71参照);
(w)または
配列番号36、配列番号38、配列番号39、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、もしくは配列番号63として示された配列のいずれか一つと70%以上、好ましくは75%以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
(i)配列番号68として示されたアミノ酸配列
(ii)配列番号3として示されたアミノ酸配列
(iii)配列番号4として示されたアミノ酸配列
(iv)配列番号5として示されたアミノ酸配列
(v)配列番号6として示されたアミノ酸配列
(vi)配列番号7として示されたアミノ酸配列
(vii)配列番号8として示されたアミノ酸配列
(viii)配列番号9として示されたアミノ酸配列
(ix)配列番号10として示されたアミノ酸配列
(x)配列番号11として示されたアミノ酸配列
(xi)配列番号12として示されたアミノ酸配列
(xii)配列番号13として示されたアミノ酸配列
(xiii)配列番号14として示されたアミノ酸配列
(xiv)配列番号1として示されたアミノ酸配列
(xv)配列番号15として示されたアミノ酸配列
(xvi)配列番号16として示されたアミノ酸配列
(xvii)配列番号17として示されたアミノ酸配列
(xviii)配列番号18として示されたアミノ酸配列
(xix)配列番号34として示されたアミノ酸配列
(xx)配列番号35として示されたアミノ酸配列、または
配列番号68、配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号34、もしくは配列番号35として示された配列のいずれか一つと75%、80%、85%、90%、95%、98%もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列。
(a)配列番号3もしくは配列番号1のアミノ酸残基1〜100位として示されたアミノ酸配列;
(b)配列番号3もしくは配列番号1のアミノ酸残基101〜200位として示されたアミノ酸配列;
(c)配列番号3もしくは配列番号1のアミノ酸残基201〜300位として示されたアミノ酸配列;または
(d)上記の(a)〜(c)に定義されたアミノ酸配列のいずれか一つに対して75%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の同一性を有するアミノ酸配列。
(a)配列番号3もしくは配列番号1のアミノ酸残基28〜39位として示されたアミノ酸配列;
(b)配列番号3もしくは配列番号1のアミノ酸残基77〜88位として示されたアミノ酸配列;
(c)配列番号3もしくは配列番号1のアミノ酸残基126〜136位として示されたアミノ酸配列;
(d)配列番号3もしくは配列番号1のアミノ酸残基163〜175位として示されたアミノ酸配列;
(e)配列番号3もしくは配列番号1のアミノ酸残基304〜311位として示されたアミノ酸配列;または
(f)上記の(a)〜(e)に定義されたアミノ酸配列のいずれか一つに対して75%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の同一性を有するアミノ酸配列。
a)脂質アシルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチドをコードし、かつ配列番号16に示されたポリペプチド配列と、または配列番号68に示されたポリペプチドと少なくとも70%同一(好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%同一)である核酸;
b)配列番号16もしくは配列番号68に示されたアミノ酸配列、または配列番号16もしくは配列番号68と少なくとも70%同一(好ましくは少なくとも80%同一、より好ましくは少なくとも90%同一)であるアミノ酸配列を含む(またはアミノ酸配列からなる)(単離された)ポリペプチド;
c)脂質アシルトランスフェラーゼをコードする核酸であって、配列番号49として示されたヌクレオチド配列、または配列番号49として示されたヌクレオチド配列と少なくとも70%同一(好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%同一)であるヌクレオチド配列を含む(またはヌクレオチド配列からなる)核酸;
d)配列番号49として示されたヌクレオチド配列を含む核酸プローブに中程度または高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、かつ脂質アシルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチドをコードする核酸;
e)a)、c)、またはd)に特定された核酸配列の断片である核酸;または
f)b)に特定されたポリペプチドの断片であるポリペプチド。
a)配列番号36に示されたヌクレオチド配列を含む核酸;
b)遺伝暗号の縮重によって配列番号のヌクレオチド配列に関連している核酸;および
c)配列番号36に示されたヌクレオチド配列と少なくとも70%同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸。
a)配列番号36に示されたヌクレオチド配列を含む核酸;
b)遺伝暗号の縮重によって配列番号36のヌクレオチド配列に関連している核酸;および
c)配列番号36に示されたヌクレオチド配列と少なくとも70%同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸。
i)本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、GDSxモチーフ、より好ましくは、GDSLもしくはGDSYモチーフから選択されたGDSxモチーフを有する脂質アシルトランスフェラーゼであり得、
ならびに/または
ii)本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、GANDYブロック、より好ましくは、アミノGGNDx、より好ましくはGGNDAもしくはGGNDLを含むGANDYブロックを有する脂質アシルトランスフェラーゼであり得、
ならびに/または
iii)本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、好ましくはHTPブロックを有する脂質アシルトランスフェラーゼであり得、
ならびに、好ましくは、
iv)本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、GDSxもしくはGDSYモチーフ、およびアミノGGNDx、好ましくはGGNDAもしくはGGNDLを含むGANDYブロック、およびHTPブロック(保存されたヒスチジン)を好ましくは有する脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。
好ましい実施形態において、本発明の方法および/または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、変種脂質アシルトランスフェラーゼである脂質アシルトランスフェラーゼをコードし得る。
アミノ酸セット1:
アミノ酸セット1(これらは1IVN(図53および図54)におけるアミノ酸であることに留意されたい)
Gly8、Asp9、Ser10、Leu11、Ser12、Tyr15、Gly44、Asp45、Thr46、Glu69、Leu70、Gly71、Gly72、Asn73、Asp74、Gly75、Leu76、Gln106、Ile107、Arg108、Leu109、Pro110、Tyr113、Phe121、Phe139、Phe140、Met141、Tyr145、Met151、Asp154、His157、Gly155、Ile156、Pro158
GDSxおよび触媒性残基などの高度に保存されたモチーフをセット1から除外した(下線を引いた残基)。誤解を避けるために言えば、セット1は、1IVNモデルの活性部位におけるグリセロールの中央の炭素原子の10Å以内のアミノ酸残基を定義する。
アミノ酸セット2(アミノ酸の番号付けは、P10480成熟配列におけるアミノ酸を参照していることに留意されたい)
Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、およびVal290。
アミノ酸セット3は、セット2と同一であるが、Aeromonas salmonicida(配列番号4)コード配列を参照する、すなわち、これが、シグナル配列を含むタンパク質(配列番号25)と比較しての成熟タンパク質(配列番号34)におけるアミノ酸番号付けの間での違いを反映しているため、アミノ酸残基番号はセット3において18大きい。
アミノ酸セット4はS3、Q182、E309、S310、および−318である。
F13S、D15N、S18G、S18V、Y30F、D116N、D116E、D157N、Y226F、D228N、Y230F。
アミノ酸セット6は、Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、−318である。
アミノ酸セット7は、Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、−318、Y30X(XはA、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、またはWから選択される)、Y226X(XはA、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、またはWから選択される)、Y230X(XはA、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、またはWから選択される)、S18X(XはA、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W、またはYから選択される)、D157X(XはA、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、W、またはYから選択される)である。
S3E、A、G、K、M、Y、R、P、N、T、またはG
E309Q、R、またはA、好ましくはQまたはR
−318Y、H、S、またはY、好ましくはY。
S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、もしくはY;および/または
L17A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
S18A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W、もしくはY;および/または
K22A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
M23A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
Y30A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、もしくはW;および/または
G40A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
N80A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
P81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
K82A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
W111A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、もしくはY;および/または
A114C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
Y117A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、もしくはW;および/または
L118A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
P156A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
G159A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
Q160A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
N161A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
P162A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
S163A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、もしくはY;および/または
A164C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
R165A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、もしくはY;および/または
S166A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、もしくはY;および/または
Q167A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
K168A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
V169A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、もしくはY;および/または
V170A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、もしくはY;および/または
E171A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
A172C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、もしくはW;および/または
H180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
N181A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
Q182A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、もしくはY、好ましくはK;および/または
M209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
L210A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
R211A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
Y226A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、もしくはW;および/または
Y230A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、もしくはW;および/または
K284A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
M285A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
V290A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、もしくはY;および/または
E309A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY;および/または
S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、もしくはY。
S3、D157、S310、E309、Y179、N215、K22、Q289、M23、H180、M209、L210、R211、P81、V112、N80、L82、N88;N87
リン脂質からのトランスフェラーゼ活性が向上している変種酵素を提供することができる特定の好ましい改変は、以下の1つまたは複数から選択することができる:
S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、またはY;好ましくは、N、E、K、R、A、P、またはM、最も好ましくは、S3A
D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはY;好ましくは、D157S、R、E、N、G、T、V、Q、K、またはC
S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、またはY;好ましくは、S310T
−318E
E309A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、またはY;好ましくは、E309R、E、L、R、またはA
Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、またはW;好ましくは、Y179D、T、E、R、N、V、K、Q、またはS、より好ましくは、E、R、N、V、K、またはQ
N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、またはY;好ましくは、N215S、L、R、またはY
K22A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはY;好ましくは、K22E、R、C、またはA
Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、またはY;好ましくは、Q289R、E、G、P、またはN
M23A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはY;好ましくは、M23K、Q、L、G、T、またはS
H180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、またはY;好ましくは、H180Q、R、またはK
M209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはY;好ましくは、M209Q、S、R、A、N、Y、E、V、またはL
L210A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはY;好ましくは、L210R、A、V、S、T、I、W、またはM
R211A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、またはY;好ましくは、R211T
P81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、またはY;好ましくは、P81G
V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、またはY;好ましくは、V112C
N80A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、またはY;好ましくは、N80R、G、N、D、P、T、E、V、A、またはG
L82A、C、D、E、F、G、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはY;好ましくは、L82N、S、またはE
N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、またはY;好ましくは、N88C
N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、またはY;好ましくは、N87M、またはG
以下の残基の1個または複数の好ましい改変は、リン脂質に対する絶対的トランスフェラーゼ活性が増加している変種酵素を生じる:
S3N、R、A、G
M23K、Q、L、G、T、S
H180R
L82G
Y179E、R、N、V、K、またはQ
E309R、S、L、またはA
一つの好ましい改変はN80Dである。これは、特に、参照配列の配列番号35をバックボーンとして用いる場合である。したがって、参照配列は、配列番号16であってもよい。この改変は、1つまたは複数のさらなる改変と組み合わせてもよい。それゆえに、本発明の好ましい実施形態において、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号35、または配列番号35に対して75%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、さらにより好ましくは98%以上、さらにより好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードし得る。
適切には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、本明細書に教示されたヌクレオチド配列のいずれか一つによってコードされ得る。
一態様において、脂質アシルトランスフェラーゼは、回収された/単離された脂質アシルトランスフェラーゼである。したがって、産生された脂質アシルトランスフェラーゼは単離された形であり得る。
一態様において、脂質アシルトランスフェラーゼは、精製された形であり得る。
本明細書に定義されているような特定の性質を有するポリペプチドかまたは改変に適しているポリペプチドかのいずれかをコードするヌクレオチド配列は、前記ポリペプチドを産生する任意の細胞または生物体から単離することができる。ヌクレオチド配列の単離のための様々な方法が、当技術分野内で周知である。
本発明はまた、本明細書に定義されているような特定の性質を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。本明細書に用いられる場合、用語「ヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列、ならびに(その部分などの)それの変種、相同体、断片、および誘導体を指す。ヌクレオチド配列は、ゲノム起源でも、合成起源でも、組換え起源でもよく、それが、二本鎖でも、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖にかかわらず、一本鎖でもよい。
いったん酵素コード化ヌクレオチド配列が単離されたならば、または推定の酵素コード化ヌクレオチド配列が同定されたならば、選択されたヌクレオチド配列を改変することが望ましい場合があり、例えば、本発明による酵素を調製するためにその配列を突然変異させることが望ましい場合がある。
本発明はまた、本発明の方法および/または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の使用を含む。
精製されたポリペプチドを凍結乾燥し、100μgのその凍結乾燥材料を8Mの尿素および0.4Mの炭酸水素アンモニウムの50μlの混合物、pH8.4の50μlに溶解することができる。溶解したタンパク質を、窒素でのオーバーレイおよび5μlの45mMのジチオスレイトールの添加後、50℃で15分間、変性および還元することができる。室温まで冷却後、5μlの100mMのヨードアセトアミドを加えて、窒素の存在下、暗闇中、室温で15分間、システイン残基を誘導体化することができる。
本明細書では、用語「相同体」は、本アミノ酸配列および本ヌクレオチド配列とある特定の相同性を有する実体を意味する。本明細書では、用語「相同性」は、「同一性」と同等とみなすことができる。
本発明はまた、本発明の配列に相補的である配列、または本発明の配列かもしくはそれらと相補的である配列かのいずれかにハイブリダイズする能力がある配列の使用を含む。
本発明に用いるヌクレオチド配列、または本明細書に定義されているような特定の性質を有するポリペプチドをコードするためのヌクレオチド配列は、組換えの複製可能なベクターへ組み入れることができる。ベクターは、適合性の宿主細胞中に、および/またはその宿主細胞から、ポリペプチドの形で、ヌクレオチド配列を複製および発現させるために用いることができる。発現は、プロモーター/エンハンサーおよび他の発現制御シグナルを含む調節配列を用いて調節することができる。原核生物のプロモーター、および真核細胞において機能し得るプロモーターを用いてもよい。組織特異的または刺激特異的プロモーターを用いてもよい。上記の2つ以上の異なるプロモーター由来の配列エレメントを含むキメラプロモーターもまた、用いてもよい。
用語「構築物」−「コンジュゲート」、「カセット」、および「ハイブリッド」などの用語に関する同義語である−は、プロモーターに直接的または間接的に付着した、本発明に従って用いる、本明細書に定義されているような特定の性質を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。間接的付着の例は、プロモーターと本発明のヌクレオチド配列の間に入る、Sh1イントロンまたはADHイントロンなどのイントロン配列などの適切なスペーサー群の供給である。直接的または間接的付着を含む本発明に関しての用語「融合した」についても同じである。場合によっては、それらの用語は、野生型遺伝子プロモーターと通常付随したタンパク質をコードするヌクレオチド配列で、かつそれらがどちらもそれらの天然環境下にある場合のその天然の組合せを網羅しない。
本発明に関しての用語「生物体」は、本発明によるヌクレオチド配列、もしくは本明細書に定義されているような特定の性質を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および/またはそれらから得られる産物を含み得る任意の生物体を含む。
宿主生物体は、原核生物または真核生物であり得る。
宿主生物体は、糸状菌などの真菌であってもよい。適切なそのような宿主の例として、Thermomyces属、Acremonium属、Aspergillus属、Penicillium属、Mucor属、Neurospora属、Trichoderma属などに属する任意のメンバーが挙げられる。
別の実施形態において、トランスジェニック生物体は酵母であり得る。
本発明に適した宿主生物体は植物であり得る。一般的な技術の概説は、Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991年]42巻:205〜225頁)およびChristou(Agro−Food−Industry Hi−Tech 1994年3月/4月 17〜27頁)による論文、またはWO01/16308に見出すことができる。トランスジェニック植物は、例えば、植物ステロールエステルおよび植物スタノールエステルのレベルの増強を生じることができる。
しばしば、ポリペプチドが発現宿主から培地へ分泌されることが望ましくあり、その酵素はより容易にその培地から回収することができる。本発明によれば、分泌リーダー配列は、所望の発現宿主に基づいて選択することができる。ハイブリッドシグナル配列もまた、本発明のコンテクストに関して、用いてもよい。
アミノ酸配列の発現を検出および測定するための様々なプロトコールは当技術分野において公知である。例として、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、および蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)が挙げられる。
本発明に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、例えば、その抽出および精製を助けるために、融合タンパク質として産生されてもよい。融合タンパク質パートナーの例として、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、6×His、GAL4(DNA結合ドメインおよび/または転写活性化ドメイン)、およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。融合タンパク質配列の除去を可能にするために融合タンパク質パートナーと対象となるタンパク質配列との間にタンパク質分解性切断部位を含むことも便利である場合がある。好ましくは、融合タンパク質は、タンパク質配列の活性を妨げないようにする。
Bacillus licheniformisにおけるKLM3’の発現
脂質アシルトランスフェラーゼ(配列番号16、本明細書以下においてKLM3’とする)をコードするヌクレオチド配列(配列番号49)をBacillus licheniformisにおいて、B.licheniformis [α]−アミラーゼ(LAT)のシグナルペプチドとの融合タンパク質として発現させた(図53および54を参照されたい)。Bacillusにおける最適な発現のために、コドン最適化遺伝子構築物(no.052907)をGeneart(Geneart AG、Regensburg、Germany)に注文した。
Plat5XhoI_FW:
ベクター構築
プラスミド構築物は、AsnからAspへの置換を位置80(KLM3’)に有する天然Aeromonas salmonicidaグリセロリン脂質−コレステロールアシルトランスフェラーゼの成熟形態をp32プロモーターの支配下にCGTaseシグナル配列と共にコードする配列を保持しているpCCmini派生物であるpCS32new N80Dである。
50mg/lカナマイシンを補充したLBブロス5ml(10g/l酵素消化カゼイン、5g/l低ナトリウム酵母エキス、5g/l塩化ナトリウム、2g/l Inert錠剤化補助剤)に単一コロニーを接種し、30℃、6時間、205rpmでインキュベートした。この培養物0.7mlを、50mg/lカナマイシンおよび高マルトースデンプン加水分解物溶液(60g/l)を補充したSAS培地(10g/l K2HPO4 、40g/l MOPS(3−モルホリノプロパンスルホン酸)、5g/l塩化ナトリウム、5滴/l消泡剤(Sin 260)、20g/l脱脂ダイズ粉、20g/lバイオスプリンガー106(100%dw YE))50mlに接種するために使用した。インキュベーションは、19000rpm、30分間の遠心分離によって培養上清を分離する前に40時間、30℃、180rpmで継続した。上清を清浄なチューブに移し、トランスフェラーゼ活性の測定に直接使用した。
PC(Avanti Polar Lipids #441601)およびコレステロール(Sigma C8503)を9:1の比で秤量し、クロロホルムに溶解し、乾燥のために蒸発させた。
基質は、50mM Hepes緩衝液pH7中に、3% PC:コレステロール 9:1を分散させることによって調製した。
基質溶液0.250mlをスクリュー蓋付きの3mlガラス試験管に移した。培養上清0.025mlを加え、混合物を40℃、2時間インキュベートした。酵素の代わりに水を含む参照試料も調製した。反応混合物を沸騰水浴中で10分間加熱し、酵素反応を停止させた。コレステロールアッセイ分析に供する前に、99%エタノール2mlを反応混合物に加えた。
0.1M Tris−HCl pH6.6および0.5%TritonX−100(Sigma X−100)中に1.4U/mlコレステロール酸化酵素(SERVA Electrophoresis GmbH cat.No17109)、0.4mg/ml ABTS(Sigma A−1888)、6U/mlペルオキシダーゼ(Sigma 6782)を含有する基質100μlを、酵素反応試料5μlを加えて混合する前に37℃、5分間インキュベートした。反応混合物をさらに5分間インキュベートし、OD405を測定した。コレステロール含有量を、0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.20mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/mlおよび0mg/mlのコレステロールを99%EtOH中に含有するコレステロールの標準溶液の分析から算出した。
表は別々の8個の発現培養物の平均を示す。
水脱ガムにおける脂質アシルトランスフェラーゼの使用
材料および方法
酵素
KLM3’:配列番号68(本明細書において「K932」とも称する)を有する実施例1で説明した脂質アシルトランスフェラーゼ−1128TIPU/ml。
SBO 1:Solae、Aarhus、DK.27.09.2007 Delite(カナダ産のマメに由来)からの粗製ダイズ油
SBO 2:ブラジル産の粗製ダイズ油
RSO 3:Aarhus Karslhamn産の粗製抽出ナタネ油
RSO 4:Scanola、Aarhus、DK産の粗製圧搾ナタネ油
SPectra Lipid、Germanyからのダイズレシチン混合標準物(ST16)
方法:
HPTLC:
アプリケーター:Automatic TLC Sampler4、CAMAG
HPTLCプレート:20×10cm、Merck no.1.05641 使用前に160℃で10分間活性化。
油相:クロロホルム:メタノール 2:1中の油の8%溶液5μlをAutomatic TLC Samplerを使用してHPTLCプレートに添加した。
ガム相:油10グラムからのガム相をクロロホルム:メタノール 2:1の7.5mlに溶解した。
ランニング緩衝液6:クロロホルム:1−プロパノール:酢酸メチル:メタノール:水中の0.25%KCl 25:25:25:10:9
ランニング緩衝液5:P−エーテル:MTBE 30:70
溶出:プレートをCamagからのAutomatic Developing Chamber ADC2を使用して7cm溶出させた。
プレートをオーブンで160℃、10分間乾燥させ、冷却し、16%H3PO4中の6%酢酸銅(II)に浸した。さらに160℃で10分間乾燥させ、直接評価した。
発色後、プレートをCamag Scanner上で走査し、TLCプレート上の各成分(スポット)の面積を算出した。
油相:
油相中のリン脂質の量を、公知の濃度のリン脂質(PE、PA、PI、PC、PS)を含む標準レシチンを様々な濃度で油試料と同じTLCプレート上で分析することによって算出した。標準混合物に基づいて各リン脂質についての検量線を作成し、油試料中の各リン脂質のリン脂質濃度の算出のために使用した。分子量に基づいてリン脂質の濃度をppm P(リン)に換算した。
ガム相中のトリグリセリドの含有量を、ガム相と同じプレート上で標準精製植物油を分析することに基づいて算出した。植物油の分析に基づいて検量線を作成し、ガム相中のトリグリセリドの算出のために使用した。
ガム相中のリン脂質の分析は、対照(酵素を添加しない)から様々な容量のガム相を他のガム相と同じプレート上に添加することに基づいた。対照ガム相中のリン脂質(PEおよびPA)の分析に基づいて検量線を作成し、100%と定義した対照中のリン脂質の量と比較した酵素処理試料中のリン脂質の量の算出のために使用した。
油脱ガム由来試料のpHを、http://www.3i−usa.com/downloads/hydrop man.pdfに記載の蛍光法によって分析した、すなわちpH測定は、Presens、Josef Engert Str.11、D−93053 Regensburg、GermanyからのHydroPlate(登録商標)HP96Cを使用することによって実行した。
HydroPlate(登録商標)は、96個の統合されたセンサーを備える通常の96ウェル形式の滅菌済み、ポリスチレンマイクロタイタープレートである。センサーは各ウェルの底に固定されている。センサーは、底側から読み取ることができる。これは、ほとんどの市販の蛍光プレートリーダーによって実行できる。アッセイは、2つの異なる蛍光色素:pH感受性指示薬および不活性参照色素による。この組合せは、実験の最も厳密な結果を達成するための正確な内部参照シグナルを保証する。
油中の残存水をAOCS法Ca 2c−25または同等法によって定量する。
WCOT溶融シリカカラム12.5m×0.25mm ID×0.1μフィルム厚 5%フェニル−メチル−シリコン(ChrompackからのCP Sil 8 CB)を備えたPerkin Elmer Autosystem 9000 Capillary Gas Chromatograph。
インジェクター、PSSI cold split injection(初期温度50℃を385℃に加熱)、容量1.0μl
検出器FID:395℃
基質
0.6%L−αホスファチジルコリン 95%Plant(Avanti #441601)、0.4%Triton−X 100(Sigma X−100)および5mM CaCl2を0.05M HEPES緩衝液pH7に溶解した。
基質34μlをKoneLab自動化分析機を使用してキュベットに加えた。T=0分に酵素溶液4μlを加えた。酵素の代わりに水を用いたブランクも分析した。試料を混合し、30℃で10分間インキュベートした。
試料の遊離脂肪酸含有量をWAKO GmbHからのNEFA Cキットを使用して分析した。
酵素活性TIPU pH7をアッセイ条件下で1分間に生成された脂肪酸のマイクロモル数として算出した。
粗製ダイズ油100gを蓋付きの250ml青キャップフラスコに秤量し、50℃または55℃または60℃または65℃または70℃に加熱した。
次いで水を油に加え、続いて酵素を加えた。油をUltra Turraxミキサーで30秒間均質化し、次いで磁気攪拌機で450rpm、30分間撹拌した。
30、120または180分後、油10mlを12ml遠心チューブ(予め秤量した)に移した。油を沸騰水浴中で97℃に10分間加熱し、次いで5000gで5分間直ちに遠心分離した。
油をガム相からデカントし、チューブを30分間ドレインし、両方の相の重量を測定した(図75を参照されたい)。
油相を遊離ステロール、ステロールエステルおよび遊離脂肪酸についてGLCで分析し、油相もTLCによって分析した(図76を参照されたい)。
(実施例2a)
この実験においてKLM3’を粗製SBO1の水脱ガムプロセスにおいて検査した。
この実験において異なる投与量のKLM3’を50℃でのSBO 2の水脱ガムにおいて検査した。異なるレベルの水、すなわち1.5%、2%および2.5%も酵素の添加を行うまたは行わないプロセスで検査した。
異なる温度での油の収率へのKLM3’の効果を調査するために、酵素を55、60、65および70℃でのSBO2の水脱ガムにおいて検査した。
異なる温度、反応時間および酵素投与量でのSBO 2の水脱ガムによる%ガム相
パイロットプラントでの酵素的水脱ガム
処方
試験的水脱ガム試験において適用した成分
バッチ1:対照、70℃
バッチ2:酵素使用(すなわち、配列番号68として本明細書に示すアミノ酸配列を有する脂質アシルトランスフェラーゼK932(本明細書においてKLM3’とも称する))、70℃
バッチ3:対照、55℃、および
バッチ4:酵素使用(すなわち、配列番号68として本明細書に示すアミノ酸配列を有する脂質アシルトランスフェラーゼK932(本明細書においてKLM3’とも称する))、55℃
50リットルタンク中で油を最初にN2カバーおよび撹拌下で加熱した。その後水(および酵素)を油に加えた。最初の実験(バッチ1および2)においては、水および酵素の添加後に油をホモジナイザー(Silverson、Chesham Sweden)を使用して再循環させた。バッチ3および4においては、タンク中の撹拌を低下させるために再循環ポンプだけを使用した。
粗製ダイズ油100gを蓋付きの250ml青キャップフラスコに秤量し、55℃に加熱した。水を油に加え、続いて酵素を加えた。油をUltra Turraxミキサーを使用して30秒間均質化し、次いで磁気攪拌機で450rpm、30分間撹拌した。30分後、油10mlを12ml遠心チューブ(予め秤量した)に移した。油を沸騰水浴中で97℃に10分間加熱し、次いで様々な相対遠心力(500、1000、2500および5000)で様々な時間(3、6および10分間)直ちに遠心分離した。
油の収率
図85は、本発明による粗製ダイズ油の酵素的脱ガムから獲得された油の収率の増加を対照と比較して示す。油を漸増する相対遠心力(rcf)(500、1000、2500および5000)で3分間遠心分離し、酵素的試料中のガム量を減算した対照中のガムの量(%)から油の収率を算出する。
様々な時間(棒の中の分)遠心分離した油試料から獲得されたガム中のトリグリセリドの量およびガムの量をバッチ3および4について図86に示す。
粗製ダイズ油の水脱ガムにおけるNaOHの評価
処方
粗製ダイズ油100gを蓋付きの250ml青キャップフラスコに秤量し、55℃に加熱した。水およびNaOHを油に加え、続いて酵素を加えた。油をUltra Turraxミキサーを使用して30秒間均質化し、磁気攪拌機で450rpm、30分間撹拌した。30分後、油およそ10mlを12ml遠心チューブ(予め秤量した)に移した。油を沸騰水浴中で97℃に10分間加熱した。
油の収率の分析
図88は、KLM3’(すなわち、配列番号68として本明細書に示すアミノ酸配列を有する脂質アシルトランスフェラーゼK932(本明細書においてKLM3’とも称する))(0.1TIPU−k/g)および漸増する量のNaOH(0、0.1、0.2、0.5、1、1.5および1.9ml 4%溶液)での酵素的脱ガムから獲得した油の収率の増加を示す。算出は、酵素的試料中のガム量を減算した対照におけるガム量に基づく。
対照および酵素的脱ガム油中のフィトステロール、フィトステロールエステルおよび脂肪酸の含有量を図90に示す。フィトステロールエステルの含有量は、0.19%(対照)から0.42%(NaOH 0.2ml)に増加し、最大に達する。この時点後、フィトステロールエステルは0.15%に減少する。したがって0.3%から0.12%へのフィトステロールの最初の減少に続いて、0.12%から0.28%への増加が観察される。
表2は、漸増する量のNaOH(0、0.1、0.2、0.5、1および1.9ml)で脱ガムした油中(対照および酵素的試料)のリン脂質(ホスファチジル−エタノールアミンおよびホスファチジン酸)の含有量(ppm)を示す。
図91は、対照と比較して酵素的ガム試料におけるホスファチジン酸(PA)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルイノシトール(PI)の相対的分解を示す。対照でのリン脂質の分解を100%と設定し、酵素的試料中の含有量を対照と比較して算出する。
予測された通り、粗製ダイズ油の水脱ガムにおけるNaOHでのpHの上昇は、KLM3’の活性の増大を生じた。フィトステロールエステルの形成は、NaOHの量の増加とともに増加した。最大フィトステロールエステルレベル(0.42%)はpH6.3(NaOH 0.2ml)で獲得され、その後連続的に減少した。油中のFFAについて同様の傾向が観察され、対照の0.46%からNaOH 0.2mlで脱ガムした油中での0.60%に増加し、その後減少した。
酵素的水脱ガム由来のガム相の分析−顕微鏡およびX線分析
粗製ダイズ油100gを蓋付きの250ml青キャップフラスコに秤量し、55℃に加熱した。水を油に加え、続いて酵素を加えた。油をUltra Turraxミキサーを使用して30秒間均質化し、磁気攪拌機で450rpm、30分間撹拌した。30分後、油を遠心分離(2000rcf、3分間)した。ガム相を顕微鏡およびX線分析のために採取した。
顕微鏡/X線分析
対照および酵素的水脱ガム試験(後者は本発明による)からのガムを顕微鏡およびX線分析のために回収した。ガム相を様々な温度(25、35、45、55および65℃)で顕微鏡(直線偏光)で検査した。図92で対照および酵素的試料(25℃)について見られる通り全ての温度においてガムは、ラメラ相(水層によって分離された脂質二重層)になっていた。
沈降検査
粗製ダイズ油200gを蓋付きの250ml青キャップフラスコに秤量し、55℃に加熱した。水を油に加え、続いて酵素を加えた。油をUltra Turraxミキサーを使用して30秒間均質化し、磁気攪拌機で450rpm、30分間撹拌した。30分後、試料を分液漏斗に入れた。ガム相の写真を1、3および6日後に撮った。6日後ガムを顕微鏡分析のために採取した。
ガム相/顕微鏡の写真
図94において、油相およびガム相が対照および酵素的試料について観察できる。重力による沈降を3日間実施した。油相およびガム相の両方から見られる通り、対照と酵素的試料との間に明らかな差異が存在する。
粗製ダイズ油の酵素的脱ガムにおける水量の変動の評価
粗製ダイズ油100gを蓋付きの250ml青キャップフラスコに秤量し、55℃に加熱した。水を油に加え、続いて酵素を加えた。油をUltra Turraxミキサーで30秒間均質化し、磁気攪拌機で450rpm、30分間撹拌した。30分後、油およそ10mlを12ml遠心チューブ(予め秤量した)に移した。油を沸騰水浴中で97℃に10分間加熱した。チューブを300rcfで3分間遠心分離した。油をガム相からデカントし、チューブを逆さまにして15分間ドレインした。ガム相の重量に基づいて油の収率を算出した。
油の収率
図96は、様々な量の水での粗製ダイズ油の酵素的水脱ガムから獲得された油の収率の増加を示す。油の収率の増加は、酵素的試料でのガムの量を減算した対照でのガムの量から算出する。
対照と比較した酵素的ガム相中のホスファチジン酸(PA)およびホスファチジルエタノールアミン(PE)の相対的分解(%)を図98に示す。
様々な量の水での脱ガム由来の酵素(KLM3’ 0.2TIPU−K/g)的ガム相の粘性を図99に示す。粘性は異なる水含有量によって顕著には影響されない。低いずり速度(およそ10まで)では、粘性は全ての試料についてある程度類似しているが、この時点以降では、水の量が最も少ない(1.25%)試料の粘性は増加し、一方水の量が最も多い(2%)ガム試料は増加する。
粗製トウモロコシ油の水脱ガム
要約
脂質アシルトランスフェラーゼ、KLM3’(K932とも称し、配列番号68として本明細書に示すアミノ酸配列を有するを粗製トウモロコシ油について、この油の水脱ガムにおける油の収率への効果を研究する目的で検査した。
酵素:
KLM3’K932 1128TIPU/g
油:
Cargill 2008年5月産の粗製トウモロコシ油
脱ガム手順:
粗製トウモロコシ油100gを蓋付きの250ml青キャップ付きフラスコに秤量し、55℃に加熱した。
水および酵素を加え、油をUltra Turraxミキサーで30秒間均質化し、次いで磁気攪拌機で450rpm、30分間撹拌した。
油をガム相からデカントし、チューブを逆さまにして15分間ドレインした。ガム相の重量に基づいて油の収率を酵素で処理していない油と比較して算出した。
次いでガム相をHPTLCで分析し、ガム相中のリン脂質の分解を算出した。
油の脱ガムプロセスを様々な濃度のKLM3’で実施した。
粗製ダイズ油の水脱ガム、および受容体の添加
脂質アシルトランスフェラーゼ、KLM3’をSolae産の粗製ダイズ油において、酵素KLM3’に対する受容体基質を添加することの効果を研究する目的で検査した。
この研究において、Henkel、Germanyからのフィトステロール製品Generol 122、および脂肪アルコール、ラウリルアルコールを検査した。
油へのフィトステロールの添加は、遊離脂肪酸形成の低下を伴ってより多いステロールエステルを産生した。より多い受容体基質が利用可能である場合は、より高い程度のリン脂質転換が脂肪酸産生の増大を伴わずに達成できることが結論される。
酵素:
KLM3’K932(配列番号68として示されるアミノ酸配列を有する−1128TIPU/g
ダイズ由来フィトステロール:Generol 122N、Grunau、Illertissen、Germanyから
ラウリルアルコール:Sigma L−5375
油:
Solae、2008年1月産、粗製ダイズ油
Spectra Lipid、Germanyからのダイズレシチン混合標準物(ST16)
脱ガム手順
粗製ダイズ油100g、フィトステロールおよびラウリルアルコールを蓋付きの250ml青キャップフラスコに秤量し、55℃に加熱した。さらなる加工の前にフィトステロールを油に完全に溶解した。
水および酵素を加え、油をUltra Turraxミキサーで30秒間均質化し、次いで磁気攪拌機で450rpm、30分間撹拌した。
油をガム相からデカントし、チューブを逆さまにして15分間ドレインした。ガム相の重量に基づいて油の収率を算出した。
次いで油相およびガム相をHPTLCで分析し、ガム相中のトリグリセリドの量および油相中のリン脂質の分解を算出した。
油の脱ガムプロセスを様々な濃度のKLM3、フィトステロールおよび脂肪アルコールで表1に示す通り実施した。
粗製油への脂質アシルトランスフェラーゼKLM3’の添加は、ステロールエステルの形成の際に脂肪酸成分のリン脂質からステロールへの移動を触媒する。分子レベルでは、ステロールの量は粗製ダイズ油においてリン脂質の量の1/3未満である。アシル受容体ステロールが粗製ダイズ油におけるKLM3’についての制限因子であることから、加水分解反応は酵素投与量および反応時間に依存して生じ得る。
この研究において、油を脂質アシルトランスフェラーゼKLM3’で処理する場合に、粗製油へのより多いステロールの添加がより多いステロールエステルを生じ、形成される脂肪酸の量はステロールを添加しない場合の油と比較して減少することが見出された。
脂質アシルトランスフェラーゼとホスホリパーゼCとの組合せ
材料および方法
酵素:
脂質アシルトランスフェラーゼ KLM3’K932.1128LATU/g(本明細書において配列番号68として示されるアミノ酸配列を有する)
ホスホリパーゼC、Sigma P7633 15単位/mg
油:
Solae、Aarhus、DKからの粗製ダイズ油
脱ガム手順
粗製ダイズ油100gを蓋付きの250ml青キャップフラスコに秤量し、55℃に加熱する。50%クエン酸1水和物0.14mlを加える。油をUltra Turraxミキサーで30秒間均質化し、次いで磁気攪拌機で450rpm、15分間撹拌する。1N NaOH 0.367mlに続いて2.5%水および油1g当たり5単位のホスホリパーゼCを加える。油を再びUltra Turraxミキサーで30秒間均質化し、磁気攪拌機で450rpmで撹拌した。反応時間2時間の後、油1g当たり0.2LATUの酵素脂質アシルトランスフェラーゼKLM3’を加え、撹拌しながらさらに1時間反応を継続する。
脂質アシルトランスフェラーゼとホスホリパーゼCとの組合せでの脱ガムプロセスは、酵素処理しない油と比較して2%を超えて油の収率を増加させると予測される。最初の研究はジグリセリドが酵素処理試料の油相中において産生されていることを示唆している。
ホスホリパーゼCとの組合せでの脂質アシルトランスフェラーゼ
材料および方法
酵素:
脂質アシルトランスフェラーゼKLM3’K932.1128LATU/g
ホスホリパーゼC Sigma P7633 15単位/mg
油:
Solae、Aarhus、DKからの粗製ダイズ油
脱ガム手順
粗製ダイズ油100gを蓋付きの250ml青キャップフラスコに秤量し、55℃に加熱する。
予備調査は、脂質アシルトランスフェラーゼとホスホリパーゼCとの組合せでの水脱ガムプロセスは、酵素処理を行わない油と比較して2%を超える油の収率の顕著な増加を生じることを示唆する。最初の研究は、ジグリセリドが油相中で産生され、油相中のステロールの大部分がエステル化されることを示している。
脂質アシルトランスフェラーゼKLM3およびホスホリパーゼC(PLC)での酵素的脱ガム
材料および方法
酵素:
脂質アシルトランスフェラーゼKLM3’K932.1128LATU/g
ホスホリパーゼC Sigma P7633 15単位/mg
油:
Solae、Aarhus、DKからの粗製ダイズ油
脱ガム手順
粗製ダイズ油100gを蓋付きの250ml青キャップフラスコに秤量し、55℃に加熱する。
最初の調査は、脂質アシルトランスフェラーゼとホスホリパーゼCとの組合せを使用する水脱ガムプロセスは、酵素処理を行わない油と比較して2.5%を超えて油の収率を増加させることを示唆している。予備調査は、ジグリセリドが油相中で15分後に産生されていることを示唆している。
脂質アシルトランスフェラーゼKLM3およびホスホリパーゼC(PLC)での酵素的脱ガム
脂質アシルトランスフェラーゼKLM3’およびSigmaからのホスホリパーゼC(PLC)を粗製ダイズ油の水脱ガムにおいて単独でおよび組合せで検査した。油の脱ガムにおいてホスホリパーゼCは油中のリン脂質からジグリセリドを産生した。KLM3’がトリグリセリドの産生の際にジグリセリドを受容体分子として使用できることが驚くべきことに示された。ジグリセリドおよびホスファチジルコリンを含有する基質でのモデル実験は、脂質アシルトランスフェラーゼ(KLM3’)が、トリグリセリドの産生の際にリン脂質からジグリセリドへの脂肪酸成分の移動反応を触媒することを確認した。
この研究は、KLM3’とホスホリパーゼC(PLC)との組合せが、粗製植物油の脱ガムの際に非常に有利であることを示す目的で始めた。
・KLM3’:グリセロリン脂質コレステロールアシルトランスフェラーゼ(FoodPro LysoMax Oil)(K932)(配列番号68)
Lot no 102629600.活性1128LATU/g
・ホスホリパーゼC P7633 Sigma、Clostridium perfringens由来、135.3mg
固体:固体1mg当たり3.8単位、タンパク質1mg当たり13.2単位
・ホスホリパーゼC P6621 Sigma、Bacillus cereus由来、250単位
ジグリセリド、サンフラワー油由来の蒸留ジグリセリド、Jour2641/064
ホスファチジルコリン、Avanti#441601
モノ−ジ−トリグリセリド:GRINDSTED(登録商標)MONO−DI R50/D
粗製ダイズ油 no 18:アルゼンチン産
HPTLC分析
酵素処理試料からのガム相におけるリン脂質の分解をHPTLCによって分析した。
HPTLCプレート:20×10cm、Merck no.1.05641 使用前に160℃で10分間活性化
添加:
油10グラムからのガム相をヘキサン:イソプロパノール 3:2 7.5mlに溶解した。
試料1μlをHPTLCプレートに添加した。
いくつかの添加についてリン脂質含有量は、酵素処理していない対照ガムと比較して算出した。この対照試料を0.1−0.3−0.5−0.8−1μl添加し、検量線を作成するために使用した。
油相。およそ90mgを秤量し、ヘキサン:イソプロパノール 3:2 1mlに溶解した。
試料5μlをHPTLCプレートに添加した。公知の濃度の5mg/mlモノ−ジグリセリドを0.1−0.3−0.5−0.8−1.5μlで添加し、個々のグリセリド成分の算出のために使用した。
ランニング緩衝液no.1:P−エーテル:メチルターシャリーブチルケトン:酢酸 50:50:1
ランニング緩衝液no.6:クロロホルム:1−プロパノール:酢酸メチル:メタノール:水中0.25%KCl 25:25:25:10:9
溶出:プレートをCamagからのAutomatic Developing Chamber ADC2を使用して7cm溶出させた。
プレートをCamag TLC Plate Heater IIIで6分間、160℃で乾燥させ、冷却し、16%H3PO4中の6%酢酸銅(II)に浸した。さらに160℃で10分間乾燥させ、直接評価した。
TLCプレート上の成分の濃さをCamag TLC Scanner3によって分析した。
ガム相中の遊離脂肪酸をGLCによって分析した。
油相のモノ−ジ−トリグリセリド、ステロールおよびステロールエステルもGLCで分析した。
装置:
・WCOT溶融シリカカラム12.5m×0.25mm ID×0.1μフィルム厚 5%フェニル−メチル−シリコン(ChrompackからのCP Sil 8 CB)を備えたPerkin Elmer Autosystem 9000 Capillary Gas Chromatograph。
・キャリアガス:ヘリウム
・インジェクター:PSSI cold split injection(初期温度50℃を385℃に加熱)、容量1.0μl
検出器FID:395℃
試料を内部標準ヘプタデカン0.5mg/mlを含有するヘプタン:ピリジン 2:1 12mlに溶解した。試料溶液500μlをクリンプバイアルに移し、MSTFA(N−メチル−N−トリメチルシリル−トリフルオラセアミド)100μlを加え、15分間、60℃で反応させた。
ステロール、ステロールエステル、遊離脂肪酸、モノ−、ジ−およびトリグリセリドに対する応答計数を純粋な参照物質に基づいて決定した。
アシルトランスフェラーゼKLM3’およびPLCを粗製ダイズ油を表1に示す処方で使用する水脱ガムプロセスにおいて検査した。
ホスホリパーゼC P6621 Sigma、Bacillus cereus由来 水1mlに溶解した250単位
10 LATU/mlに希釈したアシルトランスフェラーゼKLM3’(K932)
粗製ダイズを20ml Wheaton glass中で45℃に加熱した。水および酵素を加えた。
試料を高せん断混合で30秒間均質化した。
試料を45℃の加熱ブロックに置き、磁気撹拌した。
試料1mlを30および240分後にエッペンドルフチューブに採取し、酵素を97℃、10分間不活性化させた。特に、実験においては酵素の不活性化が実施されるが、これは産業での実施においては一般に実施されない。不活性化は、酵素分解の正確な分析のために本明細書の実験においてだけ実施される。
試料を3000rcfで3分間遠心分離した。油相をガム相から分離し、両方の相をTLCおよびGLCで分析した。
TLC分析
30分後および240分後に採取した試料をTLCで分析し、結果を図103〜106に示す。
表1における実験からの油相、試料番号1〜6をGLCによっても分析した。
理論に縛られなければ、アシルトランスフェラーゼ(KLM3’)とホスホリパーゼC(PLC)とを組合せることによるジグリセリドの減少は、2つの酵素が一緒に使用される場合の基質(リン脂質)競合によって生じる可能性がある。
上の表5に記載の実験を、トリグリセリドの形成の際にリン脂質からジグリセリドへの脂肪酸成分の移動反応についての、より高いレベルの水の効果をさらに詳細に調査するために研究した。実験の設定を下の表7に列挙する。
脂質アシルトランスフェラーゼKLM3’およびホスホリパーゼC(PLC)は、植物油の脱ガムにおける油の収率の増加に寄与することが公知である。
粗製ダイズ油の水脱ガムにおけるKLM3’の使用
ダイズ油を含む植物油は、1〜3%のリン脂質を含有しており、油の脱ガムプロセスによって除去される。油の脱ガムプロセスは、通常、水脱ガムプロセスと中和プロセスとに分けられる。1〜3%のリン脂質を含む粗製ダイズ油は、水脱ガム粗製油についての規格に適合させるためにリンのレベルをリン200ppmリンまたはそれ未満に低下させる目的での水脱ガムを行わずには輸出用に出荷できない。
脂質アシルトランスフェラーゼKLM3’(配列番号68)を図117に概説するプロセスでの粗製ダイズ油の水脱ガムにおいて使用した。
KLM3’を使用する酵素的水脱ガムでの実験において、遠心分離における油とガムとの間の相間を規格に近いレベルのリンを含む(すなわち200ppmに近いがそれ未満の)水脱ガム油を産生するために容易に調整、または管理できることが示された。
植物油の酵素的水脱ガム後の「ガム相」における酵素反応
脂質アシルトランスフェラーゼ、LysoMax Oil(KLM3’)を粗製ダイズ油の水脱ガムにおいて検査した。特に、酵素は酵素的水脱ガムプロセスの最後で不活性化されなかった−産業での実施において慣例である通り。したがって酵素的水脱ガムプロセスは下に示す実験手順書に従って実施した。特に酵素を脱ガム後に不活性化しなかった。
KLM3’でのダイズ油の酵素的な油の脱ガムは、油の収率を0.5%から1.5%に向上できることを示している。このプロセスから単離されたガム相は、典型的にはいくらかの油およびリン脂質をまだ含有している(EP1624047)。ガム相の加水分解によって油相がガムから分離でき、遠心分離または他の分離手段によって単離できることは公知である。高レベルの遊離脂肪酸を含有する油相は、ミールに加えられる通常のガム相よりも高価値で酸性油として販売できる。
本発明者らは、脂質アシルトランスフェラーゼLysoMax Oil(KLM3’)が粗製ダイズ油の酵素的水脱ガムから単離されたガム相中で活性であることを驚くべきことに示している。したがって、遠心分離によってガム相中の残存トリグリセリドと共に酸性油として単離され得る遊離脂肪酸に酵素がリン脂質をさらに分解できるかどうかが推側された。
・KLM3’:グリセロリン脂質コレステロールアシルトランスフェラーゼ(FoodPro LysoMax Oil)(K932)
Lot no 102629600.1 活性 1128LATU/g
粗製ダイズ油 no 18:アルゼンチン産
HPTLC分析
酵素処理試料からのガム相中のリン脂質の分解をHPTLCで分析した。
HPTLCプレート:20×10cm、Merck no.1.05641 使用前に160℃で10分間活性化。
油10グラムからのガム相をヘキサン:イソプロパノール 3:2の7.5mlに溶解した。
試料1μlをHPTLCプレートに添加した。
リン脂質標準物(0.5%リン脂質(Spectra Lipid、Germany)を添加し(0.1、0.3、0.5、0.8および1.5μl)、ガム中の個々のリン脂質の算出に使用した。
試料5μlをHPTLCプレートに添加した。公知の濃度の5mg/mlモノ−ジグリセリドを0.1−0.3−0.5−0.8−1.5μlで添加し、個々のグリセリド成分の算出のために使用した。
ランニング緩衝液no.1:P−エーテル:メチルターシャリーブチルケトン:酢酸 50:50:1
ランニング緩衝液6:クロロホルム:1−プロパノール:酢酸メチル:メタノール:水中0.25%KCl 25:25:25:10:9
溶出:プレートをCamagからのAutomatic Developing Chamber ADC2を使用して7cm溶出させた。
プレートをCamag TLC Plate Heater IIIで160℃、10分間乾燥させ、冷却し、16%H3PO4中の6%酢酸銅(II)に浸した。さらに160℃で10分間乾燥させ、直接評価した。
ガム相中の遊離脂肪酸をGLCによって分析した。
油相のステロール、ステロールエステルおよびモノ−ジ−トリグリセリドもGLCで分析した。
・WCOT溶融シリカカラム12.5m×0.25mm ID×0.1μフィルム厚 5%フェニル−メチル−シリコン(ChrompackからのCP Sil 8 CB)を備えたPerkin Elmer Autosystem 9000 Capillary Gas Chromatograph。
・キャリアガス:ヘリウム
・インジェクター、PSSI cold split injection(初期温度50℃を385℃に加熱)、容量1.0μl
検出器FID:395℃
試料を内部標準ヘプタデカン0.5mg/mlを含有するヘプタン:ピリジン 2:1 12mlに溶解した。試料溶液500μlをクリンプバイアルに移し、MSTFA(N−メチル−N−トリメチルシリル−トリフルオラセアミド)100μlを加え、15分間、60℃で反応させた。
遊離脂肪酸、モノ−、ジ−およびトリグリセリドに対する応答計数を純粋な参照物質に基づいて決定した。
脂質アシルトランスフェラーゼKLM3’を下の表1に示す処方で粗製ダイズ油において検査した。
55℃での脱ガム由来のガム相試料のTLC分析を図118に示し、45℃での脱ガム由来の試料を図119に示す。
脂質アシルトランスフェラーゼ(例えばKLM3’)での酵素的脱ガムの際に、活性な酵素を含有するガム相が単離される。ガム相の40℃でのインキュベーションはガム相中のリン脂質をさらに加水分解する。酵素の投与量に依存して、全てのリン脂質およびリゾ−リン脂質は脂肪酸およびホスファチジルグリセロールに加水分解される。ガム相中のリン脂質の排除は、遊離脂肪酸を含有する油相とガム相中に残ったトリグリセリドとの単離を可能にする。
Claims (34)
- a)約0.1〜5%w/wの水を食用油(好ましくは、粗製食用油)および脂質アシルトランスフェラーゼと混合する工程と、b)約45℃〜約90℃で約10分間と180分の間、前記混合物を撹拌する工程と、c)油相とガム相を分離する工程とを含む、食用油(好ましくは、粗製食用油)を水脱ガムする方法。
- d)最低約2時間と最高7日間の間、活性脂質アシルトランスフェラーゼ酵素を含む前記ガム相をインキュベートする工程と、e)前記ガム相から前記油を分離する工程とをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- (好ましくは、食用油の脱ガム、例えば、水脱ガムもしくは酵素的脱ガムまたはそれらの組合せから獲得可能である、または獲得された)ガム相を処理し(前記ガム相を、最低約2時間と最高7日間の間、単独の、または1つもしくは複数のホスホリパーゼC酵素と組み合わせた1つまたは複数の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素とインキュベートする)、前記ガム相から前記油を分離する方法。
- プロセスのpHが約pH5.0〜約pH10.0の間である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脂質アシルトランスフェラーゼがGDSxモチーフおよび/またはGANDYモチーフを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脂質アシルトランスフェラーゼ酵素が、アシルトランスフェラーゼ活性を有し、かつアミノ酸配列モチーフGDSX(Xは、以下のアミノ酸残基、L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、またはSの1つまたは複数である)を含む酵素として特徴付けられる、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 本発明の方法および/または使用のいずれか一つに用いる前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下の属の1つまたは複数由来の生物から獲得可能であり得、好ましくは獲得され得る、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法:Aeromonas、Streptomyces、Saccharomyces、Lactococcus、Mycobacterium、Streptococcus、Lactobacillus、Desulfitobacterium、Bacillus、Campylobacter、Vibrionaceae、Xylella、Sulfolobus、Aspergillus、Schizosaccharomyces、Listeria、Neisseria、Mesorhizobium、Ralstonia、Xanthomonas、およびCandida。
- 脂質アシルトランスフェラーゼが前記Aeromonas属由来の生物から獲得可能であり、好ましくは獲得される、請求項7に記載の方法。
- 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号49、配列番号36、配列番号38、配列番号39、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、もしくは配列番号63として示されるヌクレオチド配列、またはそれらと75%以上の同一性を有するヌクレオチド配列のいずれか一つの発現によって獲得される、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から39のいずれか一項に記載の方法であって、ここで前記脂質アシルトランスフェラーゼが、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、以下:
a)配列番号49として示されたヌクレオチド配列、またはそれと75%以上の同一性を有するヌクレオチド配列;
b)前記ポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドが、配列番号16に示されたポリペプチド配列または配列番号68に示されたポリペプチド配列と少なくとも70%同一である、核酸;
c)または配列番号49として示された前記ヌクレオチド配列を含む核酸プローブと中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸
の発現によって獲得されるポリペプチドである、方法。 - 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、Bacillus licheniformisにおけるヌクレオチド配列の発現によって獲得されるポリペプチドである、請求項10に記載の方法。
- 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号68、配列番号16、配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号17、配列番号17、配列番号18、配列番号34、配列番号35として示されるアミノ酸配列、またはそれらと75%以上の同一性を有するアミノ酸配列のいずれか一つを含む、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号68として示される前記アミノ酸配列、またはそれと75%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 追加として、ホスホリパーゼCが、油および/または水および/または脂質アシルトランスフェラーゼと混合される、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 水脱ガムプロセスの完了後の油相において油の収率を増加させるための食用油の水脱ガムにおける脂質アシルトランスフェラーゼの使用。
- 水脱ガムプロセスの完了後のガム相の粘性を減少させるための食用油の水脱ガムにおける脂質アシルトランスフェラーゼの使用。
- 水脱ガムプロセスの完了後の油相において油の収率を増加させるため、および/もしくはトリグリセリドレベルを増加させるため、ならびに/または水脱ガムプロセスの完了後の油相においてジグリセリドレベルを低下させるための食用油の水脱ガムにおけるホスホリパーゼCと組み合わせた脂質アシルトランスフェラーゼの使用。
- 未処理のガムと比較して、油の収率を増加させ、および/または向上したリンレベルを有する(酸性油の分離後の)固相を生じるための(食用油の脱ガム、例えば、水脱ガム、酵素的脱ガム、またはそれらの組合せから獲得可能であるか、または獲得された)ガム相のインキュベーションにおける(単独の、またはホスホリパーゼCと組み合わせた)脂質アシルトランスフェラーゼの使用。
- 0.1〜4%w/wの水が前記食用油と混合される、請求項15から18のいずれか一項に記載の使用。
- 酵素が、約45℃〜約90℃の範囲の温度で食用油に加えられる、請求項15から19のいずれか一項に記載の使用。
- 脱ガムプロセスのpHが約pH5.0〜約pH10.0の間である、請求項15から20のいずれか一項に記載の使用。
- 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、約10分間〜180分間、前記食用油と反応する、請求項15から21のいずれか一項に記載の使用。
- 前記脂質アシルトランスフェラーゼがGDSxモチーフおよび/またはGANDYモチーフを含む、請求項15から22のいずれか一項に記載の使用。
- 前記脂質アシルトランスフェラーゼ酵素が、アシルトランスフェラーゼ活性を有し、かつアミノ酸配列モチーフGDSX(Xは、以下のアミノ酸残基、L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、またはSの1つまたは複数である)を含む酵素として特徴付けられる、請求項15から23のいずれか一項に記載の使用。
- 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下の属の1つまたは複数由来の生物から獲得可能であり、好ましくは獲得される、請求項15から24のいずれか一項に記載の使用:Aeromonas、Streptomyces、Saccharomyces、Lactococcus、Mycobacterium、Streptococcus、Lactobacillus、Desulfitobacterium、Bacillus、Campylobacter、Vibrionaceae、Xylella、Sulfolobus、Aspergillus、Schizosaccharomyces、Listeria、Neisseria、Mesorhizobium、Ralstonia、Xanthomonas、およびCandida。
- 前記脂質アシルトランスフェラーゼが前記Aeromonas属由来の生物から獲得可能であり、好ましくは獲得される、請求項25に記載の使用。
- 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号49、配列番号36、配列番号38、配列番号39、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、もしくは配列番号63として示されるヌクレオチド配列、またはそれらと75%以上の同一性を有するヌクレオチド配列のいずれか一つの発現によって獲得される、請求項15から26のいずれか一項に記載の使用。
- 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、
a.配列番号49として示されるヌクレオチド配列、もしくはそれと75%以上の同一性を有するヌクレオチド配列;
b.ポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドが、配列番号16に示されるポリペプチド配列もしくは配列番号68に示されるポリペプチド配列と少なくとも70%同一である、核酸;または
c.配列番号49として示されるヌクレオチド配列を含む核酸プローブと中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸
の発現によって獲得されるポリペプチドである、請求項15から27のいずれか一項に記載の使用。 - 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、Bacillus licheniformisにおけるヌクレオチド配列の発現によって獲得されるポリペプチドである、請求項28に記載の使用。
- 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号68、配列番号16、配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号17、配列番号18、配列番号34、配列番号35として示されるアミノ酸配列、またはそれらと75%以上の同一性を有するアミノ酸配列のいずれか一つを含むポリペプチドである、請求項15から29のいずれか一項に記載の使用。
- 前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号68として示されるアミノ酸配列、またはそれと75%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項15から30のいずれか一項に記載の使用。
- 前記脂質アシルトランスフェラーゼがホスホリパーゼCと組み合わせて用いられる、請求項15から31のいずれか一項に記載の使用。
- 実施例および図を参照して本明細書で一般的に定義された方法。
- 実施例および図を参照して本明細書で一般的に定義された使用。
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