BR112018000854B1

BR112018000854B1 - Processo para degomagem de uma composição oleosa

Info

Publication number: BR112018000854B1
Application number: BR112018000854-0A
Authority: BR
Inventors: Vetcher Leandro; Castelli Maria Eugenia; Menzella Hugo G.; Peiru Salvador
Original assignee: Keclon Sa
Priority date: 2015-07-17
Filing date: 2016-07-18
Publication date: 2024-04-30
Also published as: US10982171B2; EP3325630B1; CN108138197B; WO2017015233A1; MX2018000708A; US20180251704A1; AR105383A1; CN108138197A; EP3325630A1; BR112018000854A2; EP3325630A4

Abstract

PROCESSO PARA DEGOMAGEM DE UMA COMPOSIÇÃO OLEOSA PARA OBTENÇÃO DE ÓLEO COMESTÍVEL PARA UM PRODUTO DE CONSUMO, PRODUTO RESULTANTE NA FORMA DE ÓLEO COMESTÍVEL, MISTURA ENZIMÁTICA E KIT PARA DEGOMAGEM DE UMA COMPOSIÇÃO OLEOSA. A presente divulgação fornece composições e métodos para degomagem enzimática de óleo, onde, referida mistura enzimática compreende uma atividade de fosfolipase específica de fosfatidilinositol, uma atividade de fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, em que as concentrações de lisofosfolipídeos e ácidos graxos livres são mantidas aproximadamente em seus níveis iniciais.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade ao pedido provisório norte-americano n° 621940018, depositado em 17 de julho de 2015.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[002] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados no presente relatório descritivo são incorporados ao presente por referência, na mesma medida como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado por referência.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[003] Com a crescente necessidade de alimentos, cosméticos e combustíveis ecologicamente responsáveis, é importante otimizar o processamento de óleos brutos para alto rendimento e estabilidade.

[004] Em particular, há uma necessidade de métodos com custos eficazes e eficientes para remoção de fosfolipídeos e lecitinas, conhecidos coletivamente como "gomas", a partir de composições oleosas (óleos comestíveis, óleo bruto, etc.) para produzir um produto oleoso degomado que pode ser usado para produtos de consumo, como alimentos ou combustível.

[005] Conforme explicado em detalhes por W. van Nieuwenhuyzen, "Lecithin production and properties", no Journal of the American Oil Chemists’ Society (1976) 53: 425-427, a lecitina é uma mistura complexa de fosfatídeos (tais como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol e ácido fosfatídico), seus liso- compostos, triglicerídeos, açúcares (por exemplo, sacarose, rafinose e estaquiose), alguns glicolipídeos e outros constituintes menores, caracterizado pela lecitina conter normalmente cerca de 35% em peso de óleo triglicerídeo.

[006] Devido à variedade de impurezas em um óleo bruto, uma série de métodos químicos e físicos pode ser empregada para remover as impurezas indesejáveis que afetam a estabilidade, qualidade de desempenho, sabor, cheiro ou cor de um óleo. Mais recentemente, desenvolvimentos foram feitos para utilizar degomagem enzimática.

[007] A degomagem enzimática tem diversas vantagens sobre os métodos químicos e físicos, como reduzir os custos, resíduos químicos mínimos e produções mais elevadas do óleo refinado.

[008] Francis Turner, no capítulo 5, "Degumming", do livro "Edible Oil Processing from a Patent Perspective", Albert Dijkstra, Ed. Springer, faz um resumo do estado da técnica desde 1990 sobre os diferentes métodos de degomagem desenvolvidos pelos principais atuantes neste campo. (Capitulo 5, "Degumming", p121-155, A.J. Dijkstra, Edible Oil Processing from a Patent Perspective, Springer Science+Business Media, LLC 2013). Este documento é incorporado ao presente como referência.

[009] Várias tecnologias de degomagem enzimática de óleo foram desenvolvidas nos últimos anos. Algumas delas são divulgados em patentes como: Patente Norte-Americana N° 9228211B2, Patente Norte-Americana N° 7.906.307B2, Patente Norte-Americana N° 9315764, Pedido de Patente Norte-Americano N° 20120210467; Patente Norte-Americana N° 8541211 e Patente Norte-Americana N° 8241876.

[010] A Patente Norte-Americana N° 9228211B2 divulga um processo de degomagem por água de um óleo comestível (preferencialmente um óleo comestível bruto), compreendendo as etapas de mistura do óleo comestível (preferencialmente um óleo comestível bruto) e uma aciltransferase lipídica sob condições especiais. Em uma determinada aplicação, a aciltransferase lipídica (LAT | lipid acyltransferase) pode ser utilizada em combinação com uma enzima de fosfolipase C. Esta patente mostra que os melhores resultados são alcançados utilizando a aciltransferase lipídica em uma concentração de 0,5 TIPU/g de óleo, resultando em uma redução da fase de goma. A patente explica que "a adição da aciltransferase lipídica ao óleo bruto catalisa a transferência da fração de ácidos graxos do fosfolipídeo ao esterol, durante a formação de ésteres de esterol". Em um nível molecular, a quantidade de esterol é inferior a % da quantidade de fosfolipídeos no óleo de soja bruto. Uma vez que o esterol aceitador de acila é o fator limitante para KLM3‘ em óleo de soja bruto, a reação de hidrólise pode ocorrer dependendo da dosagem de enzima e tempo de reação". Então, verificou-se que a adição de mais esterol ao óleo bruto produz mais éster de esterol, quando o óleo é tratado com KLM3‘ de aciltransferase lipídica, e a quantidade de ácidos graxos livres formada é reduzida em comparação com um óleo onde nenhum esterol foi adicionado. O presente documento mostra que a degomagem enzimática utilizando LAT (em uma dose recomendada de 0,1 a 1 TIPU/g de óleo) aumenta o teor de ácidos graxos livres do óleo. Uma vez que o esterol aceitador de acila é o fator limitante para LAT em óleo de soja bruto, a reação de hidrólise ocorre. A alternativa de adicionar 0,25 a 0,75% de esteróis não é economicamente viável e impraticável para um processo industrial. Além disso, nos exemplos utilizando LAT em combinação com PLC, o teor de diglicerídeos é reduzido em comparação com o tratamento de PLC sozinho.

[011] A Patente Norte-Americana N° 7696369 divulga um processo para recuperar o óleo triglicerídeo de gomas molhadas obtido pela degomagem por água de um óleo vegetal, misturando estas gomas com um agente fosfolipidolítico. Tal agente fosfolipidolítico pode ser uma fosfolipase. A patente divulga o uso de Lecitase® Ultra da Novozyme (PLA) para tratamento de gomas molhadas e descreve um processo no Exemplo 7, utilizando 250 mg da enzima por Kg de matéria de goma seca. Não só a quantidade de enzimas necessária para o processo é cerca de 100 vezes superior à quantidade necessária para um tratamento de degomagem de óleo bruto para uma quantidade equivalente de fosfolipídeos, mas também os dados fornecidos resultam de um tratamento de 5 dias de duração. Portanto, tal processo não pode ser utilizado na indústria de trituração.

[012] A Patente Norte-Americana N° 9315764 divulga métodos para processamento de material lipídico, como borra de refino, gomas secas e gomas molhadas, onde as enzimas são utilizadas para catalisar a hidrólise dos materiais lipídicos e recuperar os ácidos graxos. Exemplos fornecidos para tratamento de gomas molhadas envolvem a utilização de 2% de Fosfolipase A2 em um tratamento de 20 horas, atingindo uma produção de óleo de 30%. Tais quantidades de enzima e a duração do processo são muito altos para serem implementados como um processo rentável na indústria de trituração.

BREVE RESUMO DA INVENÇÃO

[013] A presente divulgação refere-se a composições e processos para uma degomagem de óleo.

[014] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para degomagem de uma composição oleosa, que pode ser óleo vegetal ou goma de óleo vegetal, contendo entre 1 e 40% p/p de fosfolipídeos e de 1 a 30% p/p de água, compreendendo: contatar a referida composição oleosa com uma mistura enzimática, caracterizado pela mistura enzimática compreender uma atividade de fosfolipase específica de fosfatidilinositol, uma atividade de fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, em que as concentrações de lisofosfolipídeos e ácidos graxos livres são mantidas aproximadamente em seus níveis iniciais.

[015] Neste processo, a referida aciltransferase lipídica é um estabilizador enzimático de outras enzimas e produz um aumento do tempo de meia-vida de outros componentes da mistura enzimática, particularmente, a aciltransferase lipídica aumenta o tempo de meia- vida dos polipeptídeos que tem atividade de fosfolipase específica de fosfatidilinositol, uma atividade de fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina.

[016] Em algumas aplicações do processo, a referida aciltransferase lipídica é uma fosfatidilcolina-esterol O-aciltransferase. Esta aciltransferase lipídica é usada na presente invenção em uma concentração entre 1/10 e 1/100 da concentração recomendada para degomagem de óleo (esta concentração do estado da técnica é entre 0,1 a 0,5 TIPU/g de óleo), caracterizado pela referida aciltransferase estabilizar a atividade de uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol e da referida fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina quando as referidas enzimas das fosfolipases reagem com a referida composição oleosa. Em algumas aplicações, a mistura enzimática pode hidrolisar mais de 60%, 70%, 80% ou 90% (p/p) dos fosfolipídeos presentes na composição oleosa em um diacilglicerol e um éster fosfato. Em algumas aplicações do processo, o processo resulta em um aumento da produção de óleo de, pelo menos, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5% ou mais em comparação a um processo de degomagem não enzimático. Preferencialmente, o processo resulta em um aumento da produção de óleo de até 40% em comparação com um processo de degomagem não enzimático.

[017] Em algumas aplicações, o processo não compreende uma fosfolipase A. Em algumas aplicações do processo, o teor de ácidos graxos livres na composição oleosa não aumenta. Em algumas aplicações do processo, o teor de lisofosfolipídeos na composição oleosa não aumenta. Em algumas aplicações, o processo reduz mais de 60%, 70%, 80%, ou 90% da massa das gomas na composição oleosa. Em algumas aplicações, a referida atividade de fosfolipase específica de fosfatidilinositol e a referida atividade de fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina são mantidas em um nível de atividade de 80 a 90% durante o processo. Em algumas aplicações do processo, a referida atividade de fosfolipase específica de fosfatidilinositol ou a referida atividade de fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina é superior em comparação a um processo de degomagem enzimática de óleo sem uma aciltransferase lipídica. Em algumas aplicações, a atividade enzimática total da fosfolipase específica de fosfatidilinositol e da fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina é, pelo menos, 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% maior em comparação a um processo de degomagem enzimática sem aciltransferase lipídica. Em algumas aplicações do processo, a referida aciltransferase lipídica é utilizada em não mais do que um décimo da concentração recomendada para um processo de degomagem enzimática de óleo.

[018] Em algumas aplicações do processo, a concentração da referida enzima de aciltransferase lipídica não é superior a 0,01 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações do processo, a concentração da referida enzima de aciltransferase lipídica não é superior a 0,06 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações do processo, a concentração da referida enzima de aciltransferase lipídica não é superior a 0,05 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações, a concentração da referida enzima de aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,01 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações, a concentração da referida enzima de aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,001 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações, a concentração da referida enzima de aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,06 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações, a concentração da referida enzima de aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,008 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações do referido processo, a referida aciltransferase lipídica tem, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 6, 7, 8, 9 ou 10. Em algumas aplicações do referido processo, a referida aciltransferase lipídica tem, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 10. Em algumas aplicações do processo, a enzima que fornece a referida atividade de fosfolipase específica de fosfatidilinositol tem, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, 2, 3 ou 4. Em algumas aplicações, a enzima que fornece a referida atividade de fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina tem, pelo menos, 85% de identidade com a ID. SEQ. N° 5. Em algumas aplicações do processo, a referida composição oleosa é um óleo comestível. Em algumas aplicações do processo, o referido óleo comestível é um óleo de soja, de colza, de semente de girassol, de farelo de arroz, de gergelim, de milho, de palmeira, de sésamo, de amendoim ou uma combinação respectiva. Em algumas aplicações do processo, a referida composição oleosa é um óleo bruto. Em algumas aplicações do processo, a referida composição oleosa é uma goma molhada que é contatada com a referida mistura enzimática por um tempo de, pelo menos, 4h e por mais de 70% dos fosfolipídeos totais presentes na goma molhada inicial serem hidrolisados, o ganho de óleo sendo de, pelo menos, 34 g de óleo recuperado por 100 gramas de goma tratada, a atividade de fosfolipase específica de fosfatidilinositol sendo fornecida por uma enzima que compreende, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 1,2, 3 ou 4 em uma concentração menor que 80 μg/g de óleo, a referida atividade de fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina sendo fornecida por uma enzima que tem, pelo menos, 85% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 em uma concentração menor que 40 μg/g de óleo e a referida aciltransferase lipídica tendo, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 10, em uma concentração inferior a 1,2 μg/g. Em algumas aplicações do processo, a referida atividade de fosfolipase específica de fosfatidilinositol é fornecida por uma enzima que tem, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, 2, 3 ou 4 e caracterizado pela relação de peso entre a referida fosfolipase específica de fosfatidilinositol e a referida aciltransferase lipídica como um estabilizador enzimático ser de 50:1.

[019] No segundo aspecto, a presente divulgação refere-se a um óleo comestível para um produto de consumo feito pelo processo de acordo com qualquer um dos processos fornecidos pela presente divulgação.

[020] No terceiro aspecto, a presente divulgação refere-se a um biocombustível feito por qualquer um dos processos fornecidos pela divulgação presente.

[021] No quarto aspecto, a presente divulgação refere-se a um óleo para um produto de consumo, compreendendo quantidades detectáveis de um polipeptídeo com, pelo menos, 80% de identidade de sequência com a ID. SEQ. N° 1, 2, 3 ou 4.

[022] No quinto aspecto, a presente divulgação refere-se a um óleo para um produto de consumo, compreendendo quantidades detectáveis de um polipeptídeo com, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 6, 7, 8, 9 ou 10.

[023] No sexto aspecto, a presente divulgação refere-se a um vetor, compreendendo: uma polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, tendo atividade de fosfodiesterase, caracterizado pelo referido polipeptídeo compreender, pelo menos, 80% de identidade de sequência com a ID. SEQ. N° 1,2, 3, ou 4 e uma sequência heteróloga. Em algumas aplicações do vetor, o referido polinucleotídeo compreende, pelo menos, 80% de identidade de sequência com a ID. SEQ. N° 11, 12, 13 ou 14 e uma sequência heteróloga. Em algumas aplicações do vetor, a referida atividade de fosfodiesterase é para fosfatidilinositol. Em algumas aplicações do vetor, o referido polipeptídeo tem atividade de fosfodiesterase em um intervalo de temperatura de aproximadamente 37°C a aproximadamente 65°C. Em algumas aplicações, o referido polipeptídeo tem atividade de fosfodiesterase dentro de um intervalo de pH de aproximadamente pH 4 a pH 9.

[024] No sétimo aspecto, a presente divulgação refere-se a um vetor compreendendo: um polinucleotídeo que codifica uma aciltransferase lipídica, caracterizado pelo referido polipeptídeo compreender, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 7, 8, 9, ou 10 e uma sequência heteróloga. Em algumas aplicações, o referido polinucleotídeo compreende, pelo menos, 80% de identidade de sequência com a ID. SEQ. N° 15 ou 16 e uma sequência heteróloga. Em algumas aplicações, a referida aciltransferase lipídica atua como um estabilizador enzimático em um intervalo de temperatura de aproximadamente 37°C a 65°C e dentro de um intervalo de pH de aproximadamente pH 4 a pH 9.

[025] No oitavo aspecto, a presente divulgação refere-se a um microrganismo geneticamente modificado (GMO | genetically modified microorganism), preferencialmente o Escherichia coli. Em algumas aplicações, o referido microrganismo geneticamente modificado compreende um vetor, compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma aciltransferase lipídica, caracterizado pelo polipeptídeo compreender, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 7, 8, 9, ou 10 e uma sequência heteróloga; em que a referida aciltransferase lipídica estabiliza a atividade de uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol e da fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina quando as enzimas das fosfolipases reagem com uma composição oleosa. Em algumas aplicações, o referido microrganismo modificado geneticamente compreende um vetor, compreendendo um polinucleotídeo que compreende, pelo menos, 80% de identidade de sequência com a ID. SEQ. N° 15 ou 16 e uma sequência heteróloga. Em algumas aplicações, os microrganismos geneticamente modificados compreendem a codificação de um polipeptídeo tendo atividade de fosfodiesterase, e em que o polipeptídeo compreende, pelo menos, 80% de identidade de sequência com a ID. SEQ. N° 1, 2, 3, ou 4 e uma sequência heteróloga. Em algumas aplicações, a referida atividade de fosfodiesterase é fosfolipase específica de fosfatidilinositol C. Em algumas aplicações, o referido microrganismo modificado geneticamente compreende um vetor, compreendendo: uma sequência heteróloga, um polipeptídeo com, pelo menos, 85% de identidade com a ID. SEQ. N° 5, em que o polipeptídeo tem atividade de fosfolipase C. Em algumas aplicações, os microrganismos geneticamente modificados compreendem um vetor, compreendendo um polinucleotídeo que compreende, pelo menos, 80% de identidade de sequência com a ID. SEQ. N° 11 e uma sequência heteróloga. Em algumas aplicações, os referidos microrganismos geneticamente modificados compreendem um ou mais vetor(es) de acordo com a presente divulgação. Em algumas aplicações, os microrganismos geneticamente modificados compreendem qualquer combinação de vetores de acordo coma presente divulgação.

[026] No nono aspecto, a presente divulgação refere-se a um polipeptídeo isolado de um meio de cultura, compreendendo o organismo geneticamente modificado (GMO) da invenção. Em algumas aplicações, o referido polipeptídeo isolado de um meio de cultura compreende o referido organismo geneticamente modificado (GMO), caracterizado pelo GMO compreender um vetor que compreende um polinucleotídeo com atividade de aciltransferase lipídica e tem, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 7, 8, 9, ou 10 e uma sequência heteróloga. Em algumas aplicações, o referido polipeptídeo isolado de um meio de cultura compreende o referido organismo geneticamente modificado (GMO), em que o referido GMO compreende um vetor, compreendendo um polipeptídeo com atividade de fosfolipase C e tendo, pelo menos, 85% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma sequência heteróloga. Em algumas aplicações, o(s) referido(s) polipeptídeo(s) isolado(s) de um meio de cultura compreende(m) um ou mais GMO(s) da presente divulgação. Em algumas aplicações, o referido polipeptídeo isolado de um meio de cultura é um polipeptídeo que compreende a atividade de fosfodiesterase e tem, pelo menos, 80% de identidade de sequência com a ID. SEQ. N° 1,2, 3 ou 4. Em algumas aplicações, o referido polipeptídeo isolado de um meio de cultura é uma aciltransferase lipídica e tem, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 6, 7, 8, 9 ou 10. Em algumas aplicações, o referido polipeptídeo isolado do referido meio de cultura é um polipeptídeo que compreende a atividade de fosfodiesterase e tem, pelo menos, 85% e identidade com a ID. SEQ. N°5. Em algumas aplicações, a referida atividade de fosfodiesterase é uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C.

[027] No décimo aspecto, a presente divulgação refere-se a uma composição de mistura enzimática para refinação de uma composição oleosa, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol com preferencialmente, pelo menos, 80% ou preferencialmente 90%, de identidade com a ID. SEQ. N° 1, 2, 3 ou 4; uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina com preferencialmente, pelo menos, 85% ou preferencialmente 90% de identidade com a ID. SEQ N° 5 e uma enzima de aciltransferase lipídica com preferencialmente, pelo menos, 80%ou preferencialmente 90% de identidade com a ID. SEQ. N° 6, 7, 8, 9 ou 10; mais preferencialmente, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 10. Em algumas aplicações da mistura enzimática, a referida aciltransferase lipídica é uma fosfatidilcolina- esterol O-aciltransferase. Em algumas aplicações da mistura enzimática, a referida mistura enzimática não aumenta o teor de ácidos graxos livres na composição oleosa depois da degomagem. Em algumas aplicações da mistura enzimática, a referida mistura enzimática não aumenta o teor de lisofosfolipídeos na composição oleosa depois da degomagem. Em algumas aplicações, a referida aciltransferase lipídica com, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente com, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ N° 10, é um estabilizador enzimático que estabiliza a atividade de uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol e de uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina ao reagir com uma composição oleosa. Caracterizado pela relação de peso entre a referida fosfolipase específica de fosfatidilinositol e a referida aciltransferase lipídica ser de, pelo menos, 50:1; e em que a referida aciltransferase lipídica é um estabilizador enzimático que estabiliza a atividade de uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol e de uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina ao reagir com uma composição oleosa. Em algumas aplicações, a referida mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A. Em algumas aplicações, a concentração da referida enzima de aciltransferase lipídica é entre 1/10 e 1/100 da concentração recomendada para degomagem de óleo (ou seja, entre 0,1 a 1 TIPU/g de óleo). Em algumas aplicações, a concentração da referida aciltransferase lipídica não é superior a 0,01 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações, a concentração da referida aciltransferase lipídica não é superior a 0,001 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações, a concentração da referida aciltransferase lipídica não é superior a 0,06 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações, a concentração da referida aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,01 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações, a concentração da referida aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,001 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações, a concentração da aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,05 TIPU/g de óleo.

[028] No décimo primeiro aspecto, a presente divulgação refere- se a uma mistura oleosa, compreendendo: um óleo bruto, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C e uma aciltransferase lipídica. Em algumas aplicações, a fosfolipase específica de fosfatidilinositol C tem, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, 2, 3 ou 4. Em algumas aplicações, a aciltransferase lipídica tem, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 6, 7, 8, 9 ou 10. Em algumas aplicações, a aciltransferase lipídica é uma fosfatidilcolina- esterol O-aciltransferase. Em algumas aplicações, a aciltransferase lipídica é um estabilizador enzimático que estabiliza a atividade de uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol e de uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina ao reagir com uma composição oleosa. Em algumas aplicações, a relação de peso entre a referida concentração de fosfolipase específica de fosfatidilinositol C e a referida aciltransferase lipídica é de, pelo menos, 50:1, preferencialmente de 60:1, mais preferencialmente de 80:1,2 para degomagem de óleo.

[029] No décimo segundo aspecto, a presente divulgação refere- se a um processo para degomagem de um óleo comestível, compreendendo: (a) fornecer uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol com, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, 2, 3 ou 4; (b) fornecer uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina C com, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 5; (c) fornecer uma aciltransferase lipídica com, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 6, 7, 8, 9 ou 10; e misturar o óleo comestível com as enzimas das etapas (a), (b) e (c), efetuando, desse modo, a degomagem do óleo comestível. Em algumas aplicações, o processo não compreende uma fosfolipase A. Em algumas aplicações do processo, a referida aciltransferase lipídica é uma fosfatidilcolina-esterol O-aciltransferase. Em algumas aplicações do processo, o referido óleo comestível é um óleo de soja, de colza, de semente de girassol, de farelo de arroz, de gergelim, de milho, de palmeira, de sésamo, de amendoim ou uma combinação respectiva. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece um processo para degomagem de um óleo comestível, compreendendo: fornecer a referida fosfolipase específica de fosfatidilinositol com, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, 2, 3 ou 4; fornecer a referida fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina C com, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 5; fornecer a referida aciltransferase lipídica com, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 6, 7, 8, 9 ou 10; e misturar o óleo comestível com as enzimas das etapas (a), (b), e (c), efetuando, desse modo, a degomagem do óleo de soja comestível, (i) caracterizado pelo processo hidrolisar mais de 80% (p/p) de fosfolipídeos no óleo comestível em diacilglicerol e éster fosfato; (ii) em que o processo aumenta a produção de óleo em, pelo menos, 2,0% em comparação a um processo de degomagem não enzimático; (iii) em que um teor de ácidos graxos livres não aumenta; (iv) em que o processo reduz mais que 70% da massa das gomas na composição oleosa; (v) em que a atividade da fosfolipase específica de fosfatidilinositol e da fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina é mantida a um nível de atividade de 80 a 90%; (vi) em que a fosfolipase específica de fosfatidilinositol ou a fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina é superior em comparação a um processo de degomagem enzimática de óleo sem uma aciltransferase lipídica; e (vii) em que a atividade enzimática total, compreendendo a atividade de fosfolipase específica de fosfatidilinositol e a atividade de fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, é, pelo menos, 10% maior em comparação a um método de degomagem de óleo enzimático sem uma aciltransferase lipídica, como um estabilizador enzimático, ou em que as concentrações de lisofosfolipídeos e ácidos graxos livres são mantidas aproximadamente em seus níveis iniciais. Em algumas aplicações, o processo não compreende uma fosfolipase A. Em algumas aplicações do processo, a concentração da referida aciltransferase lipídica não é superior a 0,01 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações do processo, a concentração da referida aciltransferase lipídica não é superior a 0,001 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações do processo, a concentração da referida aciltransferase lipídica não é superior a 0,06 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações do processo, a concentração da referida aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,01 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações do processo, a concentração da referida aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,008 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações do processo, a concentração da referida aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,001 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações do processo, o óleo comestível é um óleo de soja, de colza, de semente de girassol, de farelo de arroz, de gergelim, de milho, de palmeira, de sésamo, de amendoim ou uma combinação respectiva.

[030] No décimo terceiro aspecto, a presente divulgação refere-se a um processo de fermentação para obter uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol recombinante de L. sphaericus com, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, compreendendo as seguintes etapas:

[031] cultura de microrganismos geneticamente modificados, compreendendo um polinucleotídeo com, pelo menos, 80% de identidade de sequência com a ID. SEQ. No 11 para obter a referida fosfolipase em uma titulação de, pelo menos, 13 g l-1.

[032] separação da referida fosfolipase do sobrenadante.

[033] Em algumas aplicações do processo de fermentação, a etapa (1) compreende um meio de cultura de HM semidefinido em um pH de 7, agitação e temperatura de 37°C e a expressão do gene de PI- PLC sendo induzida a OD600 de 100 com L-arabinose e glicerol como fonte de carbono.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[034] As características inovadoras da invenção são particularmente estabelecidas nas reivindicações apensadas. Uma melhor compreensão das características e vantagens da presente invenção será obtida com referência à descrição detalhada a seguir que estabelece as aplicações ilustrativas, nas quais são utilizados os princípios da invenção, e nos desenhos anexos:

[035] A Figura 1 mostra a análise da expressão de PIPLC. Análise por SDS-PAGE de sobrenadantes (à esquerda) e grânulos (à direita) da cepa de E. coli, carregando os plasmídeos pKCN231 (PI-PLC B. cereus, faixa 2), pKCN232 (PI-PLC A. flavus, faixa 3), pKCN233 (PI-PLC L. sphaericus, faixa 4), pKCN234 (PI-PLC S. antibioticus, faixa 5) e pKCN235 (PI-PLC E. faecalis, faixa 6). A faixa 1 corresponde à cepa de E. coli carregando o vetor vazio. As setas vermelhas indicam a proteína de PI-PLC correspondente.

[036] A Figura 2 mostra um desenvolvimento do processo de fermentação de lotes descontínuos alimentados para PI-PLC a partir da produção de L. sphaericus. Curso de tempo da concentração total de proteínas de PI-PLC (losango verde), biomassa (quadrado preto) e fluxo de glicerol (linha cinza) durante a fermentação dos lotes alimentados descontinuamente no fermentador 2-L com um meio semidefinido. Glicerol foi utilizado como fonte única de carbono e L-arabinose foi utilizado como indutor.

[037] A Figura 3 mostra a análise da atividade de PI-PLC. A atividade das proteínas purificadas de PI-PLC foi determinada em óleo de soja bruto, como na concentração de fosfato liberada. As concentrações utilizadas de cada PI-PLC foram 5, 10 e 15 μg de proteína por g. de óleo de soja bruto. Os resultados são expressos em média e desvio padrão em, pelo menos, três experimentos independentes.

[038] As Figuras de 4A à D mostram uma análise comparativa de NMR como um método para testar um polipeptídeo para uma atividade de hidrólise específica de fosfolipase C em um óleo. Nos espectros de NMR, a abreviatura "PC" denota fosfatidilcolina (phosphatidylcholine), "PE" denota fosfatidiletanolamina (phosphatidylethanolamine), "PI" denota fosfatidilinositol (phosphatidylinositol), "PA" denota o ácido fosfatídico (phosphatidic acid), "p-Cho" denota fosfocolina (phosphocholine), "p-Et" denota fosfoetanolamina (phosphoethanolamine) e "p-Ino" denota fosfoinositol (phosphoinositol). (A) espectro de NMR do óleo tratado com PI-PLC (ID. SEQ. N° 1), (B) espectro de NMR do óleo tratado com PC/PE-PLC (ID. SEQ. N° 5), (C) espectro exemplar de NMR do óleo bruto não tratado e (D) espectro exemplar de NMR do óleo tratado com PC/PE-PLC + PI-PLC.

[039] Figura 5 (A) a (C): Análise comparativa de NMR das três enzimas para processo de degomagem de óleo com baixas concentrações da enzima de LAT em comparação a um óleo bruto não tratado. (A) mostra a análise de NMR para o óleo bruto não tratado, (B) mostra a análise de NMR para a mistura de três enzimas de PC/PE-PLC + PI-PLC + LAT 0,01 TIPU/g e (C) mostra a análise de NMR para PC/PE-PLC + PI-PLC + LAT 0,005 TIPU/g.

[040] Figura 6. Gomas recuperadas após o tratamento de óleo. g de goma/100g de óleo foi calculada para o óleo bruto, tratado com (A) água (designada como H2O), (B) PC/PE-PLC sozinha ou (C) PC/PE- PLC + PI-PLC + LAT.

[041] Figura 7: Análise de NMR do óleo bruto (3). Óleo bruto tratado com LAT 0,1 TIPU/g (1) ou óleo bruto tratado com a mistura de PC/PE-PLC, PI-PLC e LAT 0,01 TIPU/g (2).

[042] Figura 8: Estabilidade da PC/PE-PLC. A PC/PE-PLC foi armazenada sozinha (A) ou em uma mistura de PC/PE-PLC+PI- PLC+LAT (B). As enzimas foram armazenadas a 4°C ou temperatura ambiente 25°C. A atividade enzimática foi determinada no momento da preparação (inicial) ou após 50, 140 e 365 dias.

[043] A Figura 9 mostra um comparativo da estabilidade da enzima em óleo.

[044] Figura 10: Recuperação do óleo a partir do tratamento enzimático da composição oleosa contendo 15% de fosfolipídeos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO VISÃO GERAL

[045] A presente divulgação refere-se a composições e processos para degomagem de óleo. Em vários aspectos, as composições e processos descritos no presente documento referem-se à geração de um óleo a ser usado em um produto de consumo. Em um aspecto, as composições e processos são usados para fazer um óleo comestível para um produto de consumo. Em outro aspecto, as composições e processos fornecidos no presente documento são usados para fazer um biocombustível para um produto de consumo.

[046] A divulgação também fornece várias composições relacionadas a processos de degomagem de óleo. Em alguns aspectos, a divulgação fornece polipeptídeos e homólogos funcionais respectivos. Em alguns aspectos, a divulgação fornece vetores e cassetes que podem ser propagados em um microrganismo. Em alguns aspectos, a divulgação fornece vários organismos geneticamente modificados. Em alguns aspectos, a divulgação fornece um meio de cultura, compreendendo uma ou mais composição(ões) de organismo(s) geneticamente modificado(s) ou uma combinação respectiva. Em alguns aspectos, a divulgação fornece polipeptídeos isolados ou a partir de um meio de cultura, compreendendo os organismos geneticamente modificados de acordo com a presente divulgação. Em alguns aspectos, a divulgação fornece inúmeras misturas enzimáticas para degomagem de óleo. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma mistura de óleo bruto, compreendendo as misturas enzimáticas ou composições de enzimas descritas no presente documento. Em alguns aspectos, a divulgação fornece um óleo comestível degomado ou refinado com quantidades detectáveis de um polipeptídeo de acordo com a presente divulgação. Em alguns aspectos, a divulgação fornece um biocombustível degomado ou refinado com quantidades detectáveis de um polipeptídeo de acordo com a presente divulgação.

[047] A divulgação também fornece vários processos relacionados a degomagem de óleo. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece processos de degomagem de óleo que melhoraram a atividade enzimática. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece processos de degomagem de óleo que melhoraram a hidrólise dos fosfolipídeos. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece processos de degomagem de óleo que utilizam uma quantidade menor de enzimas em um processo de degomagem de óleo. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece processos de degomagem de óleo que utilizam uma quantidade menor de uma aciltransferase lipídica. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece processos de refinação de um óleo comestível para um produto de consumo ou biocombustível. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece um processo de duas enzimas para refinação de um óleo comestível para um produto de consumo ou biocombustível. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece um processo de três enzimas para refinação de um óleo comestível para um produto de consumo ou biocombustível. Em alguns aspectos, o processo de três enzimas para refinação de um óleo comestível ou biocombustível para um produto de consumo que utiliza uma quantidade menor de uma aciltransferase lipídica. Por último, a presente divulgação fornece um processo de degomagem de óleo para um óleo comestível, como um óleo de soja. Em alguns aspectos, o melhor processo de degomagem de óleo para um óleo comestível utiliza uma menor quantidade ou concentração de uma aciltransferase lipídica.

II. DEFINIÇÕES

[048] Para facilitar a compreensão da presente divulgação, uma série de termos e expressões é definida abaixo.

[049] Conforme utilizado no presente documento, salvo indicação em contrário, o artigo "um(a)" significa um ou mais, a menos que explicitamente indicado de outra forma.

[050] Conforme utilizado no presente documento, salvo indicação em contrário, termos como "contêm" "contendo", "inclui", "incluindo", "tem", "tendo" ou "com" e semelhantes significam "compreendendo".

[051] Conforme utilizado no presente documento, o termo "ou" pode ser conjuntivo ou disjuntivo.

[052] Conforme utilizado no presente documento, qualquer aplicação pode ser combinada com qualquer outra aplicação.

[053] Conforme utilizado no presente documento, salvo indicação em contrário, algumas aplicações inventivas do presente documento contemplam intervalos numéricos. Uma variedade de aspectos desta invenção pode ser apresentada em um formato de intervalo. Deve ser entendido que a descrição em formato de intervalo é apenas para conveniência e concisão e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível sobre o escopo da invenção. Nesse sentido, a descrição de um intervalo deve ser considerada como tendo divulgado especificamente todos os subintervalos possíveis, bem como valores numéricos individuais, dentro do intervalo, como se escritos explicitamente. Por exemplo, deve considerar-se a descrição de um intervalo, como de 1 a 6, como também divulgando especificamente seus subintervalos, como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., além dos números individuais dentro do intervalo, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isto aplica-se independentemente da amplitude do intervalo. Quando intervalos estão presentes, os intervalos incluem os pontos de encerramento do intervalo.

[054] O termo "homólogo funcional" refere-se aos polinucleotídeos ou polipeptídeos da invenção, modificados em um ou mais par(es) de base(s), códon(s), intrão(ões), exão(ões) ou resíduos de aminoácidos (respectivamente), que ainda conservam a atividade biológica de uma fosfolipase da invenção. As variantes podem ser produzidas por qualquer número de meios incluídos nos processos, tais como, por exemplo, propensão a erros por PCR, realocamento, mutagênese dirigida do oligonucleotídeo, montagem por PCR, mutagênese sexual por PCR, mutagênese in vivo, mutagênese de cassete, mutagênese recursiva de conjunto, mutagênese de conjunto exponencial, mutagênese específica de local, remontagem genética, GSSM™ e qualquer combinação respectiva. Técnicas para a produção de fosfolipases variantes tendo atividade em um pH ou temperatura, por exemplo, que seja diferente de uma fosfolipase do tipo selvagem, estão incluídas no presente documento.

[055] O termo "transfecção" conforme utilizado no presente documento refere-se a introdução de ácidos nucleicos externos nas células eucarióticas. A transfecção pode ser realizada por uma variedade de meios conhecidos na técnica, incluindo co-precipitação de DNA com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextran, transfecção mediada por polybrene, eletroporação, microinjeção, fusão de lipossomas, lipofecção, fusão de protoplastos, infecção retroviral e biolítica.

[056] O termo "transfecção estável" ou "transfectado de maneira estável" refere-se a introdução e a integração de um ácido nucleico externo, DNA ou RNA no genoma da célula transfectada. O termo "transfectante estável" refere-se a uma célula que integrou estavelmente o DNA externo ao DNA genômico.

[057] Conforme utilizado no presente documento, os termos "codificação da molécula de ácido nucleico", "codificação de sequência de DNA" e "codificação do DNA" referem-se a ordem ou sequência de desoxirribonucleotídeos ao longo de uma vertente de ácido desoxirribonucleico. A ordem destes desoxirribonucleotídeos determina a ordem dos aminoácidos ao longo da cadeia do polipeptídeo (proteína). A sequência do ácido nucleico, assim, é codificada para a sequência de aminoácidos.

[058] O termo "sequência heteróloga", conforme utilizado no presente documento, refere-se a uma sequência de polipeptídeos ou nucleotídeos que está ligada a, ou é manipulada para tornar-se ligada a, uma sequência de ácido nucleico a qual não estava ligada naturalmente, ou que estava ligada naturalmente em um local diferente. O ácido nucleico heterólogo pode incluir um par-base de nucleotídeos, resíduos de aminoácidos ou uma sequência que não é naturalmente encontrada na célula na qual é introduzida, além disso, ácido nucleico heterólogo pode conter alguma modificação em relação a sequência de ocorrência natural.

[059] O termo "aproximadamente" é entendido como dentro de um intervalo de tolerância normal na técnica, a menos que especificamente definido ou óbvio do contexto. Por exemplo, "aproximadamente" pode ser entendido como dentro de 2 desvios-padrão da média, "aproximadamente" pode ser entendido como dentro de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% ou 0,01% do valor declarado. A menos que, de outra forma, fique claro a partir do contexto, todos os valores numéricos fornecidos no presente documento são alterados pelo termo "aproximadamente".

[060] O termo "óleo bruto" pode incluir todo tipo de óleos brutos obtidos de fontes convencionais, incluindo óleos brutos que tenham sido submetidos a um pré-tratamento. O termo óleo bruto também pode ser entendido como incluindo o óleo que tenha sido submetido a separação água-óleo; ou outras etapas de processamento que são ou serão conhecidas na técnica de refinamento de óleo.

[061] O termo estabilizador enzimático é entendido como um composto que mantém de 80 a 90% do nível de atividade das enzimas de PLC, pelo menos, por um ano de armazenamento em solução aquosa e que também mantém a atividade de PLC em óleo acima de 80% da sua atividade inicial por, pelo menos, 6 horas. O referido estabilizador enzimático é uma macromolécula, como uma proteína, um polissacarídeo ou glicolipídeo, mais precisamente, uma proteína que pode interagir com lipídios. Preferencialmente, para esta invenção, o referido estabilizador enzimático é uma aciltransferase lipídica do Aeromonas enteropelogenes. O estabilizador enzimático estabiliza outras enzimas e produz um aumento do tempo de meia-vida dos outros componentes da mistura enzimática, particularmente o aumento da aciltransferase lipídica aumenta o tempo de meia-vida dos polipeptídeos que tem atividade de fosfolipase específica de fosfatidilinositol e atividade de fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina.

[062] O termo composição oleosa pode incluir um óleo comestível, um óleo bruto, gomas molhadas e outros tipos de gomas.

III. MÉTODOS

[063] A presente divulgação prevê métodos e processos aprimorados para degomagem de uma composição oleosa. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece um processo de duas enzimas. Em alguns aspectos, o processo não compreende uma fosfolipase A. Em alguns aspectos, o teor de ácidos graxos livres não aumenta após o processo de degomagem de óleo. Em alguns aspectos, o teor de lisofosfolipídeos não aumenta significativamente durante a degomagem de óleo.

[064] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece um processo de três enzimas para refinamento de óleo.

[065] Em alguns aspectos, o processo de três enzimas para refinamento de óleo pode compreender uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica. Em alguns aspectos, o processo de degomagem de uma composição oleosa não compreende uma fosfolipase A. Em alguns aspectos, o teor de ácidos graxos livres na composição oleosa não aumenta mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. Em alguns aspectos, o teor de ácidos graxos livres na composição oleosa não aumenta. Em alguns aspectos, a aciltransferase lipídica é uma fosfatidilcolina-esterol O-aciltransferase.

[066] Em alguns aspectos, a presente divulgação prevê um processo para degomagem melhorada de óleo, compreendendo: contatar uma composição oleosa com uma mistura enzimática, caracterizado pela mistura enzimática compreender uma atividade de fosfolipase específica de fosfatidilinositol, uma atividade de fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica. Em alguns aspectos, o processo para degomagem de uma composição oleosa não compreende uma atividade de fosfolipase A. Em alguns aspectos, o teor de ácidos graxos livres na composição oleosa não aumenta mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. Em alguns aspectos, o teor de ácidos graxos livres na composição oleosa não aumenta. Em alguns aspectos, a aciltransferase lipídica é uma fosfatidilcolina-esterol O-aciltransferase.

[067] Em certos aspectos, a mistura enzimática pode hidrolisar mais de 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% (p/p) de fosfolipídeos presentes no óleo em um diacilglicerol e um éster fosfato.

[068] Em alguns aspectos, o processo resulta em um aumento da produção de óleo de, pelo menos, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2.0%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3.0%,3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 3.5%, 3.6%, 3.7%, 3.8%, 3.9%, 4.0%,4.1%, 4.2%, 4.3%, 4.4%, 4.5%, 4.6%, 4.7%, 4.8%, 4.9%, 5.0%, 5.1%, 5.2%, 5.3%, 5.4%, 5.5%, 5.6%, 5.7%, 5.8%, 5.9%ou 6,0%, em comparação a um processo de degomagem não enzimático.

[069] Em alguns aspectos, o processo resulta em um aumento da produção de óleo de, pelo menos, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2.0%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3.0%,3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 3.5%, 3.6%, 3.7%, 3.8%, 3.9%, 4.0%,4.1%, 4.2%, 4.3%, 4.4%, 4.5%, 4.6%, 4.7%, 4.8%, 4.9%, 5.0%, 5.1%, 5.2%, 5.3%, 5.4%, 5.5%, 5.6%, 5.7%, 5.8%, 5.9%ou 6,0%, em comparação a um processo de degomagem enzimático.

[070] Em certos aspectos, o processo pode reduzir mais de 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da massa das gomas no óleo.

[071] Em alguns aspectos, a atividade de fosfolipase específica de fosfatidilinositol e a atividade de fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina é mantida em um nível de atividade de 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% durante o processo. Em algumas aplicações do processo, a atividade de fosfolipase específica de fosfatidilinositol ou a atividade de fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina é superior em comparação a um processo de degomagem de óleo enzimático sem uma aciltransferase lipídica.

[072] Em alguns aspectos, a atividade enzimática total da fosfolipase específica de fosfatidilinositol e da fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina é, pelo menos, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% ou 50% maior em comparação a um processo de degomagem enzimático sem aciltransferase lipídica.

CONCENTRAÇÃO RECOMENDADA DE LAT PARA DEGOMAGEM DE UM ÓLEO

[073] A concentração recomendada de aciltransferase lipídica para o processo de degomagem de óleo bruto da presente invenção não é maior que aproximadamente 0,01 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações, a concentração recomendada da aciltransferase lipídica não é maior que aproximadamente 0,06 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações, a concentração recomendada da aciltransferase lipídica não é maior que aproximadamente 0,002 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações, a concentração recomendada da aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,01 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações, a concentração recomendada da aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,05 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações, a concentração recomendada da aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,002 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações, a concentração recomendada de LAT é de aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou 60% menos de 0,01 TIPU/g de óleo, 0,05 TIPU/g de óleo ou 0,06 TIPU/g de óleo em aplicações onde o óleo é um óleo parcialmente bruto, um óleo parcialmente refinado ou um óleo substancialmente refinado. Em algumas aplicações, a concentração recomendada de LAT é de aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou 60% maior que 0,01 TIPU/g de óleo, 0,06 TIPU/g de óleo ou 0,001 TIPU/g de óleo para uma mistura oleosa compreendendo dois ou mais tipos de óleo.

[074] A concentração recomendada da aciltransferase lipídica para degomagem de um óleo bruto com o processo da presente invenção é de 0,2 mg/kg de óleo, dependendo do tipo de óleo que está sendo processado e da preparação da LAT. Para a aciltransferase lipídica (LAT | lipid aciltransferase) da invenção: 0,2 mg/kg de óleo é equivalente a 0,2 ug/g de óleo e equivalente a 0,01 TIPU/g de óleo.

[075] Apenas a título de exemplo, a concentração recomendada da LAT para degomagem de um óleo do tipo soja pode ser de aproximadamente 0,2 mg/kg de óleo em algumas aplicações, a concentração recomendada da LAT pode ser de aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou 60% menor em aplicações onde o óleo é um óleo parcialmente bruto, um óleo parcialmente refinado ou um óleo substancialmente refinado. Em algumas aplicações, a concentração recomendada da LAT pode ser de aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou 60% maior para uma mistura oleosa complexa compreendendo dois ou mais tipos de óleo.

[076] Em alguns aspectos, a enzima da aciltransferase lipídica é utilizada na presente invenção a um décimo ou um centésimo da concentração recomendada para um processo de degomagem de óleo enzimático. Em alguns aspectos, a concentração da aciltransferase lipídica não é superior a 0,01 TIPU/g de óleo. Em alguns aspectos, a concentração da aciltransferase lipídica não é superior a 0,06 TIPU/g de óleo. Em alguns aspectos, a concentração da aciltransferase lipídica não é superior a 0,005 TIPU/g de óleo. Em alguns aspectos, a concentração da aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,01 TIPU/g de óleo. Em alguns aspectos, a concentração da aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,06 TIPU/g de óleo. Em alguns aspectos, a concentração da aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,002 TIPU/g de óleo.

[077] Em alguns aspectos, a enzima da aciltransferase lipídica da invenção tem, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com uma ID. SEQ. N° 6, 7, 8, 9 ou 10. Em alguns aspectos, a enzima que transmite a atividade de fosfolipase específica de fosfatidilinositol tem, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID SEQ. N° 1, 2, 3 ou 4.

[078] Em alguns aspectos, a enzima que transmite atividade de fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina tem, pelo menos, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% ou 85% de identidade com a ID. SEQ. 5.

[079] Em algumas aplicações do processo, o óleo é um óleo comestível. Em algumas aplicações do processo, o óleo comestível é um óleo de soja, de colza, de semente de girassol, de farelo de arroz, de gergelim, de milho, de palmeira, de sésamo, de amendoim ou uma combinação respectiva.

[080] Em alguns aspectos, o processo pode compreender a hidrólise de, pelo menos, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% dos fosfolipídeos da concentração original de óleo bruto. Em alguns aspectos, o processo para degomagem de uma composição oleosa não compreende uma fosfolipase A.

[081] Em alguns aspectos, o processo pode incluir a hidrólise de, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, ácido fosfatídico ou uma combinação de óleo respectiva.

[082] Em alguns aspectos, o processo compreende o aumento da produção de óleo de, pelo menos, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2.0%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3.0%,3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 3.5%, 3.6%, 3.7%, 3.8%, 3.9%, 4.0%,4.1%, 4.2%, 4.3%, 4.4%, 4.5%, 4.6%, 4.7%, 4.8%, 4.9%, 5.0%, 5.1%, 5.2%, 5.3%, 5.4%, 5.5%, 5.6%, 5.7%, 5.8%, 5.9% ou 6,0% em comparação ao processo de degomagem de óleo não enzimático.

[083] A presente divulgação fornece um processo para degomagem de uma composição oleosa, compreendendo: tratar a composição oleosa com um polipeptídeo tendo atividade de fosfodiesterase e, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, 2, 3 ou 4.

[084] A presente divulgação fornece um processo para degomagem de uma composição oleosa compreendendo: tratar a composição oleosa com um polipeptídeo tendo atividade de aciltransferase lipídica e, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com um ID. SEQ. N° 6, 7, 8, 9 ou 10. Em alguns aspectos, o processo para degomagem de uma composição oleosa não compreende uma fosfolipase A.

[085] Em alguns aspectos, o processo para degomagem de uma composição oleosa compreende, ainda, o referido processo, caracterizado por inibir no máximo 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% da fosfodiesterase, da fosfolipase C, da atividade de fosfolipase específica de fosfatidilinositol ou da atividade de fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina. Em alguns aspectos, o processo para degomagem de uma composição oleosa não compreende uma fosfolipase A.

[086] Em alguns aspectos, o processo para degomagem de uma composição de óleo compreende, ainda, a enzima fosfodiesterase, da fosfolipase C, da atividade de fosfolipase específica de fosfatidilinositol ou da atividade de fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, caracterizado por manter 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de sua atividade enzimática durante o processo de degomagem.

[087] Em alguns aspectos do processo, a atividade de aciltransferase lipídica não aumenta o teor de ácidos graxos no óleo mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5% em comparação ao teor original de ácidos graxos na composição do óleo bruto.

[088] Em alguns aspectos, o processo pode aumentar a produção de óleo em, pelo menos, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2.0%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3.0%, 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4 %, 3.5%, 3.6%, 3.7%, 3.8%, 3.9%, 4.0%, 4.1%, 4.2%, 4.3%, 4.4%, 3.5 %, 4.6%, 4.7%, 4.8%, 4.9%, 5.0%, 5.1%, 5.2%, 5.3%, 5.4%, 5.5%, 5.6%, 5.7%, 5.8%, 5.9% ou 6,0% em comparação a um processo de refinamento de óleo enzimático com uma fosfolipase A.

[089] Em alguns aspectos, o processo para degomagem de uma composição oleosa obtém biocombustível. Em alguns aspectos, o processo para degomagem de uma composição oleosa obtém um biocombustível que é biodiesel. Em alguns aspectos, o processo para degomagem de uma composição oleosa obtém um óleo comestível. Em alguns aspectos, o óleo comestível é um óleo de soja, de colza, de semente de girassol, de farelo de arroz, de gergelim, de milho, de palmeira, de sésamo ou de amendoim.

[090] A presente divulgação fornece um processo para aumentar a eficiência do refinamento de óleo enzimático, compreendendo: fornecer uma composição oleosa compreendendo fosfolipídeos; reagir os fosfolipídeos de óleo com, pelo menos, duas fosfodiesterases e uma aciltransferase lipídica, gerando, assim, um éster fosfato e um diacilglicerol.

AUMENTO DA EFICIÊNCIA ENZIMÁTICA

[091] A presente divulgação fornece um processo para aumentar a eficiência do refinamento de óleo enzimático, compreendendo: fornecer uma composição oleosa que compreende fosfolipídeos; reagir os fosfolipídeos do óleo com, pelo menos, duas fosfodiesterases e uma aciltransferase lipídica e não compreender uma fosfolipase A, gerando, assim, um éster fosfato e um diacilglicerol.

[092] Em alguns aspectos, o processo para aumentar a eficiência do refinamento de óleo enzimático compreende, pelo menos, duas fosfodiesterases, caracterizado por, pelo menos, uma das fosfodiesterases ter uma atividade mais elevada em comparação a um processo de refinamento de óleo sem uma aciltransferase lipídica.

[093] Em alguns aspectos, o processo para aumentar a eficiência do refinamento de óleo enzimático compreende um polipeptídeo com atividade de fosfodiesterase e tem, pelo menos, 40%,41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, 2, 3 ou 4. Em alguns aspectos, o processo para degomagem de uma composição oleosa não compreende uma fosfolipase A.

[094] Em alguns aspectos, o processo para aumentar a eficiência do refinamento de óleo enzimático compreende um segundo polipeptídeo, caracterizado por ter atividade de fosfodiesterase e, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5. Em alguns aspectos, o processo para degomagem de uma composição oleosa não compreende uma fosfolipase A.

[095] Em alguns aspectos, o processo para aumentar a eficiência do refinamento de óleo enzimática compreende os polipeptídeos isolados de um vector, compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade da fosfodiesterase e, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, 2, 3, ou 4 e uma sequência heteróloga do ácido nucleico. Em alguns aspectos, o processo para degomagem de uma composição oleosa não compreende uma fosfolipase A.

[096] Em alguns aspectos, o processo para aumentar a eficiência do refinamento de óleo enzimático compreende os polipeptídeos isolados de um vetor, compreendendo: um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de aciltransferase lipídica e, pelo menos, 40%,41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 7, 8, 9, ou 10 e uma sequência heteróloga. Em alguns aspectos, o processo para degomagem de uma composição oleosa não compreende uma fosfolipase A.

[097] Em alguns aspectos, o processo para aumentar a eficiência do refinamento de óleo enzimático compreende uma aciltransferase lipídica com, pelo menos, 40%,41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 6, 7, [8] 9 ou 10. Em alguns aspectos, o processo para degomagem de uma composição oleosa não compreende uma fosfolipase A.

[098] Em alguns aspectos, o processo para aumentar a eficiência do refinamento de óleo enzimático compreende os polipeptídeos isolados de um vetor, compreendendo uma sequência polinucleotídica que codifica duas ou mais das seguintes proteínas: fosfolipase específica de fosfatidilinositol C e aciltransferase lipídica, fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina C e aciltransferase lipídica e fosfolipase específica de fosfatidilinositol C e fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina C. Em alguns aspectos, o polipeptídeo isolado é obtido a partir de um meio que inclui o vetor.

DEGOMAGEM DE UM ÓLEO COMESTÍVEL

[099] A presente divulgação fornece um processo para degomagem de um óleo comestível, compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1,2, 3 ou 4; (b) fornecer uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina C com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5; (c) fornecer uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter menos que 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 6, 7, 8, 9 ou 10; misturar o óleo de soja bruto com as enzimas das etapas (a), (b) e (c), efetuando, desse modo, a degomagem do óleo de soja bruto. Em alguns aspectos, o processo para degomagem de um óleo de soja bruto não compreende uma fosfolipase A.

[100] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece um processo para degomagem um óleo comestível, compreendendo: fornecer uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol com, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 1,2, 3 ou 4; fornecer uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina C com, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 5; fornecer uma aciltransferase lipídica com, pelo menos, 80% de identidade com a ID. SEQ. N° 6, 7, 8, 9 ou 10; e misturar o óleo comestível com as enzimas das etapas (a), (b), e (c), efetuando, desse modo, a degomagem do óleo de soja comestível. Em algumas aplicações do processo, a aciltransferase lipídica é uma fosfatidilcolina-esterol O-aciltransferase (i) caracterizado pelo processo hidrolisar mais de 80% (p/p) de fosfolipídeos no óleo comestível em diacilglicerol e éster fosfato; (ii) em que o processo aumenta a produção de óleo em, pelo menos, 2,0% em comparação a um processo de degomagem não enzimático; (iii) em que um teor de ácidos graxos livres não aumenta; (iv) em que a atividade da fosfolipase específica de fosfatidilinositol e da fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina é mantida a um nível de atividade de 80 a 90%; (v) em que a fosfolipase específica de fosfatidilinositol ou a fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina é superior em comparação a um processo de degomagem enzimática de óleo sem uma aciltransferase lipídica; e (vi) em que a atividade enzimática total, compreendendo a atividade de fosfolipase específica de fosfatidilinositol e a atividade de fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, é, pelo menos, 10% maior em comparação a um método de degomagem de óleo enzimático sem uma atividade de aciltransferase lipídica. Em algumas aplicações do processo, a concentração de aciltransferase lipídica como estabilizador enzimático não é superior a 0,01 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações do processo, a concentração de aciltransferase lipídica não é superior a 0,05 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações do processo, a concentração de aciltransferase lipídica não é superior a 0,002TIPU/ de óleo. Em algumas aplicações do processo, a concentração de aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,01 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações do processo, a concentração de aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,002 TIPU/g de óleo. Em algumas aplicações do processo, a concentração de aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,05TIPU/g de óleo.

IV. COMPOSIÇÕES ÓLEOS PARA UM PRODUTO DE CONSUMO

[101] A presente divulgação fornece um óleo comestível para um produto de consumo feito pelos métodos e processos apresentados no presente documento. Em alguns aspectos, o óleo comestível para um produto de consumo pode compreende um óleo de soja, um óleo de colza, um óleo de semente de girassol, um óleo de farelo de arroz, um óleo de gergelim, um óleo de milho, um óleo de palmeira, um óleo de amendoim, um óleo de açaí, um óleo de amêndoas, um óleo de babaçu, um óleo de semente de groselha, um óleo de semente de borragem, um óleo de canola, um óleo de caju, um óleo de rícino, um óleo de coco, um óleo de coentro, um óleo de semente de algodão, um óleo de crambe, um óleo de semente de linho, um óleo de semente de uva, um óleo de avelã, outros óleos de nozes, um óleo de cânhamo, um óleo de pinhão- manso, um óleo de jojoba, um óleo de linhaça, um óleo de macadâmia, um óleo de semente de manga, um óleo de espuma do prado, um óleo de mostarda, um óleo de mocotó, um azeite de oliva, um óleo de dendê, um óleo de palmiste, um óleo de oleína da palmeira, um óleo de noz- pecã, um óleo de pinhão, um óleo de pistache, um óleo de semente de papoula, um óleo de colza, um óleo de farelo de arroz, um óleo de cártamo, um óleo de sasanqua, um óleo de manteiga de karité, um óleo de resina do pinheiro, um óleo de tsubaki, um óleo de noz ou qualquer combinação respectiva.

[102] A presente divulgação fornece um biocombustível feito pelos processos e métodos fornecidos no presente documento. Em alguns aspectos, o biocombustível pode compreender um óleo de peixe, um óleo animal, um óleo de planta, um óleo de algas, um óleo vegetal, um óleo vegetal integral, um óleo vegetal virgem, um óleo vegetal residual, uma gordura animal, uma graxa, um sebo, uma banha, uma graxa amarela ou qualquer composição compreendendo um lipídio ou um éster alquílico.

B. VETORES E CASSETES DE EXPRESSÃO

[103] A presente divulgação fornece um vetor de expressão ou cassete de expressão, compreendendo, pelo menos, um ácido nucleico de ID. SEQ. N° 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, ou um fragmento, uma variante ou um derivado respectivo. No vetor de expressão ou cassete de expressão, a sequência de nucleotídeos, conforme apresentado no presente documento, pode ser ligada operavelmente a sequências reguladoras, de forma que as sequências reguladoras sejam capazes de fornecer a expressão da sequência de nucleotídeos por uma célula hospedeira ou organismo.

[104] Um vetor ou cassete da presente divulgação pode incluir uma estrutura molecular com uma sequência reguladora, um promotor, um gene, um gene marcador selecionável, uma sequência reguladora heteróloga, um promotor heterólogo, um gene heterólogo ou uma combinação respectiva.

[105] O vetor ou cassete pode ser utilizado para a produção da molécula de RNA ou proteína em uma célula hospedeira. O vetor ou cassete pode ser transfectado ou transformado em uma célula hospedeira.

[106] Em alguns aspectos, o vetor ou cassete é expresso in vitro. Em alguns aspectos, o vetor ou cassete é expresso in vivo. O vetor ou cassete pode ser transitoriamente transformado em um organismo ou célula hospedeira. O vetor ou cassete pode ser incorporado ao genoma de um organismo ou célula hospedeira utilizando qualquer método conhecido na técnica. O termo "incorporado" cobre preferencialmente uma incorporação estável em um genoma de uma célula ou organismo.

[107] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece um vetor ou cassete a ser expresso em uma célula hospedeira. A presente divulgação fornece um vetor ou cassete a ser expresso em uma célula hospedeira e cultivo da célula hospedeira em um meio. A presente divulgação fornece um vetor ou cassete a ser expresso em uma célula hospedeira e cultivo da célula hospedeira no meio, permitindo, assim, que a célula hospedeira cresça e replique, seguido pelo isolamento do polipeptídeo recombinante expressado a partir do meio.

[108] Existem muitos vetores de expressão disponíveis comercialmente. Exemplos de tais vetores de expressão que podem ser utilizados com a presente divulgação incluem, entre outros, pBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia), GEM1 (Promega Biotec, Madison, Wis., EUA) pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD10, psiX174 pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pK 233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), pK 232-8 e pCM7. Vetores eucarióticos particulares incluem pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Estes e outros vetores de expressão conhecidos na técnica podem ser utilizados com a presente divulgação.

SEQUÊNCIAS REGULADORAS

[109] Um vetor ou cassete pode compreender uma ou mais sequência(s) reguladora(s) para controlar a expressão das sequências fornecidas pela presente divulgação.

[110] Uma sequência reguladora pode ser qualquer segmento de uma molécula de ácido nucleico que seja capaz de aumentar ou diminuir a expressão de genes específicos dentro de uma célula hospedeira ou de um organismo. As sequências reguladoras para controle da expressão podem ser a partir da célula hospedeira ou do organismo. As sequências reguladoras para controle da expressão podem ser heterólogas. As sequências reguladoras podem ser quiméricas, compreendendo elementos de sequência de duas ou mais sequências reguladoras diferentes.

[111] Exemplos de utilização de sequências reguladoras da 3’ UTR (three prime untranslated region | região 3’ não traduzida) com as sequências da presente divulgação são os seguintes: um vetor pode comportar potenciadores ou repressores da expressão do gene. Um vetor pode compreender sequências da 3’ UTR para controle da expressão ou estabilidade de uma molécula de RNA. As sequências da 3’ UTR podem ser a partir da mesma célula hospedeira. As sequências da 3’ UTR podem ser heterólogas. As sequências da 3’ UTR podem ser quiméricas, compreendendo elementos de sequência de dois ou mais sequências de 3’ UTR diferentes.

[112] Como outro exemplo, um vetor pode compreender um a sequência líder de secreção. A sequência líder pode ser da mesma célula hospedeira ou organismo. A sequência líder de secreção pode ser heteróloga. Sequências líder adequadas podem incluir, entre outros, um gene de amiloglucosidase (AG | amyloglucosidase gene) fúngica (glaA—tanto 18 quanto 24 versões de aminoácidos, por exemplo, de Aspergillus), o gene do fator α (leveduras, por exemplo, Saccharomyces, Kluyveromyces e Hansenula) ou o gene da α-amilase (Bacillus). Em alguns aspectos, uma sequência líder de secreção quimérica pode ser utilizada com a presente divulgação. A sequência líder de secreção em particular utilizada é, geralmente, selecionada com base na célula hospedeira a ser utilizada para a expressão do gene ou da proteína.

PROMOTORES

[113] Um promotor pode ser uma região do DNA que inicia a transcrição de um gene específico, tipo de célula ou célula hospedeira. Promotores estão geralmente localizados perto de locais de início de transcrição genética. Um vetor ou cassete pode abranger um ou mais promotor(es). Um vetor ou cassete pode abranger um ou mais promotor(es) e pode, ainda, incluir uma ou mais sequência(s) reguladora(s), conforme fornecido no presente documento.

[114] Os promotores utilizados com a presente divulgação podem ser um promotor constitutivo. O promotor pode ser um promotor induzível. O promotor pode ser um promotor específico da célula hospedeira. O promotor pode ser um promotor específico do tecido. O promotor pode ser da mesma célula hospedeira ou organismo, conforme expresso. O promotor pode ser um promotor heterólogo. O promotor pode ser uma sequência quimérica, compreendendo elementos de dois ou mais diferentes promotores descritos acima.

[115] Dependendo da aplicação, um promotor procariótico ou um promotor eucariótico pode ser utilizado. Exemplos de promotores procarióticos apropriados que podem ser utilizados incluem, entre outros, promotores do gene LAC ou trp de E. coli, promotor do gene lacI, promotor do gene lacZ, promotor do hormônio da tireóide T3, promotor do hormônio da tireóide T7, promotor do gene gpt, promotor lambda PR, promotor lambda PL, promotores de operons que codificam enzimas glicolíticas como a 3-fosfoglicerato quinase (PGK | phosphoglycerate kinase) ou o promotor de fosfatase ácida.

[116] Exemplos de promotores eucarióticos apropriados incluem, entre outros, o promotor precoce imediato de CMV, o promotor de timidina quinase do HSV, os promotores de choque térmico, o promotor precoce e tardio de SV40, as LTRs de retrovírus ou o promotor de metalotioneína-I do rato.

[117] Promotores adequados para utilização com a presente divulgação podem ter aproximadamente de 40 a 60 pares de base de comprimento, aproximadamente de 80 a 100 pares de bases de comprimento, aproximadamente de 100 a 300 pares de base de comprimento, de 300 a 1000 pares de bases de comprimento.

[118] Além disso, dependendo da aplicação ou do tipo de célula hospedeira, será utilizado um tipo particular de promotor. Os promotores utilizados com a presente divulgação podem incluir a caixa TATA, a caixa de Pribnow, a caixa SOS, caixa CAAT, a caixa CCAAT, um operador, a origem de replicação dos plasmídeos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1, pIJ702, uma sequência de ativação a montante ou similares.

[119] Os vetores podem, ainda, incluir um ou mais gene(s) de marcadores selecionáveis. Um exemplo de gene de um marcador selecionável pode ser um gene que confere resistência aos antibióticos (por exemplo, resistência à ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina). Em alguns aspectos, a seleção pode ser realizada pela co- transformação com um segundo vetor, carregando um ou mais gene(s) de marcadores selecionáveis.

[120] As sequências de nucleotídeos da presente divulgação podem estar presentes em um vetor de expressão. Um exemplo de vetor de expressão que pode ser utilizado com as composições e processos incluem, entre outros: um plasmídeo, um cosmídeo, um vírus, tal como um vírus de DNA, um vírus de RNA, um retrovírus, um vetor do fago, um fagomídeo, um fosmídeo, um vetor derivado do bacteriófago P1 (PAC) ou um cromossomo artificial, como um cromossomo artificial bacteriano (BAC | bacterial artificial chromosome), um cromossomo artificial de levedura (YAC | yeast artificial chromosome) ou um cromossomo artificial de mamíferos (MAC | mammalian artificial chromosome).

[121] A presente divulgação também fornece outras formas de vetores de expressão que servem funções equivalentes e que são, ou se tornam, conhecidos na técnica para a realização da expressão de uma proteína em uma célula hospedeira ou organismo.

[122] O tipo de vetor escolhido para uma determinada aplicação dependerá da quantidade de proteína desejada, do tipo de célula hospedeira a ser expressa, do tamanho da construção a ser utilizada no vetor ou do organismo que deve ser utilizado para expressar o vetor.

C. ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS

[123] A presente divulgação fornece organismos geneticamente modificados (GMO), compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com ID. SEQ. N° 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, conforme previsto no presente documento ou suas sequências complementares.

[124] Um organismo geneticamente modificado abrangido pela presente divulgação é qualquer célula do microrganismo ou hospedeira que compreenda uma sequência, um vetor ou um cassete da presente divulgação. Em alguns aspectos, o organismo geneticamente modificado compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma variante, fragmento ou um homólogo funcional de um polipeptídeo com ID. SEQ. N° 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, conforme fornecido no presente documento.

[125] O GMO pode ser modificado para ser deficiente em um ou mais gene(s). O GMO pode ser geneticamente modificado para incluir um ou mais gene(s). O GMO pode ser geneticamente modificado para ser deficiente em um ou mais gene(s) e incluir um ou mais gene(s).

[126] Vários meios para a transformação de uma célula hospedeira para fazer um GMO são bem conhecidos na técnica. O vetor pode ser introduzido nas células hospedeiras utilizando qualquer dentre uma variedade de técnicas, incluindo, mas não limitado a: transformação, transfecção, transdução, infecção viral, armas genéticas ou transferência de genes mediada por Ti. Métodos especiais que podem ser utilizados com a presente divulgação incluem transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, lipofecção ou eletroporação, vide: Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986) e Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

[127] Em alguns aspectos, o GMO pode compreender um tipo de vetor ou cassete. Em alguns aspectos, GMO pode incluir, pelo menos, um ou mais tipo(s) de vector(es) ou cassete(s). Em alguns aspectos, o GMO pode compreender um cassete e um vetor da presente divulgação.

[128] A sequência de nucleotídeos da presente divulgação pode ser incorporada dentro do genoma do hospedeiro ou replicada estavelmente pelo hospedeiro como um plasmídeo autônomo ou outra estrutura molecular.

[129] Uma célula hospedeira adequada para fazer um GMO da presente divulgação pode ser: uma célula procarionte, fúngica, bacteriana, de uma levedura, de uma planta, de um inseto ou de um mamífero. Exemplos de uma célula de levedura que podem ser utilizados com a presente divulgação incluem, entre outros: Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, ou Schizosaccharomyces pombe. Exemplos de células bacterianas que podem ser utilizadas incluem, entre outros, E. coli, Lactococcus lactis, Streptomyces, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium ou qualquer espécie dentro dos gêneros Bacillus, tal como, por exemplo, B. licheniformis, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. circulans, B. clausii, B. coagulans; B. firmus, B. lautus; B. lentus; B. megaterium, B. pumilus ou B. stearothermophilus, ou qualquer espécie dentro dos gêneros Streptomyces e Staphylococcus.

[130] Em alguns aspectos, uma célula hospedeira procariótica preferencial pode ser E. coli ou Bacillus subtilis. Em alguns aspectos, uma célula hospedeira procariótica preferencial pode ser Escherichia coli ou Bacillus subtilis. Exemplos de células de insetos que podem ser utilizadas incluem, entre outros, Drosophila S2 e Spodoptera Sf9. Exemplos de células de mamíferos podem incluir qualquer rato ou linha celular humana. Uma célula hospedeira determinada será escolhida com base em suas características, vide a Tabela 1: (Gene Expression Systems. Using nature for the art of expression (Fernandez, J.M. & Hoeffler, J.P., eds), Academic Press, San Diego, 1999.). TABELA 1:

D. MISTURAS DO MEIO

[131] A presente divulgação fornece composições de mistura dos meios. Em alguns aspectos, a mistura do meio compreende, pelo menos, um dos polipeptídeos, conforme previsto no presente documento, caracterizado pelo polipeptídeo ser secretado a partir do hospedeiro aos meios de cultura. Em alguns aspectos, a mistura do meio pode compreender o vetor ou o cassete incorporado ao genoma de um microrganismo hospedeiro ou célula hospedeira. Em alguns aspectos, a mistura do meio pode incluir o vetor ou cassete e pode ser transitoriamente mantida em um microrganismo hospedeiro ou célula hospedeira. Em alguns aspectos, a mistura do meio compreende um tipo de organismo hospedeiro. Em alguns aspectos, o meio compreende, pelo menos, um ou mais tipo(s) de microrganismo(s) ou célula(s) hospedeiro(a)(s).

[132] Como conhecido por aqueles especialistas na técnica, um meio de cultivo ou de cultura é um líquido ou gel, projetado para suportar o cultivo de microrganismos ou células. Conforme aqueles que estão na técnica apreciariam, existem diferentes tipos de meios para o cultivo de diferentes tipos de células ou organismos. Organismos geneticamente modificados (por exemplo, células hospedeiras compreendendo uma sequência, vetor ou um cassete da presente divulgação) podem ser cultivados em meios nutritivos para fazer um meio que compreenda os polinucleotídeos ou polipeptídeos da presente divulgação.

[133] Em geral, existem dois principais tipos de meios de cultivo: aqueles utilizados para cultura de células, que geralmente são utilizados para o cultivo de tipos de células específicas derivadas de plantas ou animais, e a cultura microbiológica, que geralmente são utilizados para o cultivo de bactérias ou fungos e outros microrganismos.

[134] Os meios de cultivo mais comuns para os microrganismos são caldos nutrientes e placas de ágar, que podem utilizar, por exemplo, caldos nutrientes como o caldo LB (10 g/L de síntese enzimática da caseína; 5g/L de extrato de levedura de baixo teor de sódio; 5g/L de cloreto de sódio; 2G/L de auxiliadores inertes para comprimidos) ou um meio SAS (10 g/L de K2HPO4; 40 g/L de MOPS (ácido 3- morfolinopropanosulfônico); 5 WI de cloreto de sódio; 5 gotas/I de antiespumante (seno 260); 20 g/L de farinha de soja desengordurada; Biospringer 106 (100% dw YE).

[135] Para alguns microrganismos, um meio mais especializado contendo outros fatores pode ser necessário para seu cultivo e cultura. A título de exemplo, o vírus requer um meio de cultivo, compreendendo células vivas para o seu cultivo e reprodução.

MEIOS NUTRITIVOS

[136] Meios nutritivos contêm todos os elementos que a maioria das bactérias precisa para crescimento e cultivo.

[137] Alguns exemplos de meios nutritivos incluem, entre outros, contagem em placa de ágar, ágar nutriente ou ágar triptona de soja.

MEIOS MÍNIMOS

[138] Meios mínimos são meios de cultivo que contêm os nutrientes mínimos possíveis para o crescimento da colônia e são frequentemente utilizados para cultivo "do tipo selvagem" ou de microrganismos geneticamente inalterados. Em geral, um meio mínimo normalmente compreende: água, uma fonte de carbono para o cultivo, como, por exemplo, um açúcar (glicose ou succinato), vários sais, que podem ser adaptados para um microrganismo específico e outros elementos de cultivo essenciais, tais como, por exemplo, magnésio, nitrogênio, fósforo ou enxofre.

MEIOS ENRIQUECIDOS

[139] Um meio enriquecido geralmente compreende todos os nutrientes necessários para suportar o cultivo de uma grande variedade de organismos. Eles podem ser utilizados para cultura de muitos tipos diferentes de organismos. Exemplos de meios enriquecidos incluem, entre outros, ágar sangue ou ágar chocolate.

MEIOS SELETIVOS

[140] Meios de cultivo seletivos podem ser utilizados com os processos e composições da presente divulgação para garantir a sobrevivência ou a proliferação de células expressando os polipeptídeo e os polinucleotídeos da invenção. Os meios de cultivo seletivos normalmente compreenderão células que têm a capacidade de sintetizar um determinado metabólito ou resistência aos antibióticos e, como tal, permitem o cultivo e a seleção de um microrganismo específico ou tipos de célula hospedeira recombinantes, conforme fornecido no presente documento.

[141] Por exemplo, se um microrganismo é feito para ser resistente a um determinado antibiótico, tal organismo constituído por ampicilina ou tetraciclina, então esse antibiótico pode ser adicionado ao meio a fim de evitar que outras células, que não possuem o gene de resistência, sejam cultivadas. Alternativamente, meios seletivos podem apresentar a falta de um aminoácido, como a prolina, em conjunto com o microrganismo que é geneticamente alterado e naturalmente incapaz de sintetizar o aminoácido.

MEIOS DE TRANSPORTE

[142] A presente divulgação também abrange a utilização de meios de transporte com os processos e composições da presente divulgação. Em geral, meios de transporte compreendem tampões e sal e carecem de carbono, nitrogênio e fatores de cultivo orgânicos, a fim de evitar a multiplicação microbiana. Esses tipos de meios podem servir como um depósito temporário de amostras transportadas para o cultivo em um momento posterior. Exemplos de meios de transporte incluem, entre outros: caldo tioglicolato ou meio de transporte Stuart.

E. SEQUÊNCIAS DE POLIPEPTÍDEOS E POLINUCLEOTÍDEOS

[143] As sequências de polipeptídeos e polinucleotídeos da presente divulgação normalmente compreenderão sequências heterólogas.

[144] Em alguns aspectos, uma sequência heteróloga pode codificar um ou mais polipeptídeo(s), homólogo(s) de polipeptídeo(s), variante(s) de polipeptídeo(s), fragmentos de peptídeos dos polipeptídeos ou fusões de polipeptídeos que têm uma função semelhante. Além disso, a presente divulgação fornece a sequência de nucleotídeos que codifica as sequências de polipeptídeos, bem como suas sequências complementares.

[145] Em alguns aspectos, o polipeptídeo compreende uma sequência a partir da ID. SEQ. N° 1, como um homólogo funcional ou variante respectiva, compreendendo, por exemplo, até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40 ou mais alterações de aminoácidos, tais como substituições ou exclusões, da ID. SEQ. N° 1: MAASERDNINLSEWMREIPNSNTLAEISIPGTHDSGTFRLEDPIKSVW AKTQENDFRYQMDHGVRFFDIRGRVTDDNTIVLHHGPIYLYVTLQQFI NEAKEFLKSHPSETIIMSLKEEYESMPGAKESFAKTFENMYFGDSIFL KTEGNITLGDSRGKIVLLRRYSGSTMTGGFKNFGWKDNATFTSTTNG NVKITVQDKYNVNYEEKKAAIDSMLKETVLNKDNPNHIHINFTSLSSG GTAWSSPYYYASYLNSISAAKVRLDHLKNLDTKAGWIIMDYIGDRWD PKLYEEIIRANFRYPPTDEPHLFEHIDGEGIDFTNLPHSKWNDQVSSIL LKSYTEITIYEHSNFTGKSVTLTNTTNSAQLFNLTTYNFNDKMSSYTW KLIR, (ID. SEQ. N° 1).

[146] Em alguns aspectos, o polipeptídeo compreende uma sequência a partir da ID. SEQ. N° 2, como um homólogo funcional ou variante respectiva, compreendendo, por exemplo, até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40 ou mais alterações de aminoácidos, tais como substituições ou exclusões, da ID. SEQ. N° 2: MGVRLSVQDWMSALGDATPVQRLTIPGTHDSGARVGGPWVACQNT PVDAQLNSGIRFLDVRCRAIDNVFAIHHGAFYQELMFGDVLNACRAFL RAHPSETVLMRVKQEYSEVGAEEFRRIFGIYLDDKGYRSLFRLDAGL PTLGQARGRVVLLADSDGLGGVRYADPQLFDIQDDYMAEAFGKYPKI EAQFRKAVAQPGKLFVNYVSTAALLPPRSNADRLNPQVKRLLEGSE GSGWTGLGIVPMDFPNENGLAETLIRHNLAGQGVRLTA, (ID. SEQ. N° 2).

[147] Em alguns aspectos, o polipeptídeo compreende uma sequência a partir da ID. SEQ. N° 3 como um homólogo funcional ou variante respectiva, compreendendo, por exemplo, até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40 ou mais alterações de aminoácidos, tais como substituições ou exclusões, da ID. SEQ. N° 3: MVKKIFLNFLIGIGLIILNNFVFSVNEVFADSRWMSTIRDDKPLSRVAVP GTHDSGTFKMSDPIISALVRTQEQDFRQQLEQGIRFFDIRGRATKNN QIVLHHGPKYLLVTLHQFLQEAENFLRNNPSETIIMSLKEEYPAMEEV TKSFFSIFKESYFNYYPFYTGNSSNPKIQETRGKIVLFDRTGNSTLPG YNKIYNWEDNATFQTTTNNTLPLYVQDEYNATYNRKTHAILDLLKTSS ESNEGIFLNYVSLATGGTAWSSPYYFASYLNPLTGGYINEFHVSNPG WVVMDYSGNRWNPNLTKKVIETNRYLQ,( ID. SEQ. N° 3).

[148] Em alguns aspectos, o polipeptídeo compreende uma sequência a partir da ID. SEQ. N° 4 como um homólogo funcional ou variante respectiva, compreendendo, por exemplo, até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40 ou mais alterações de aminoácidos, tais como substituições ou exclusões, da ID. SEQ. N° 4: MSIYSSANLNAWMGELKDDTLLSSLSIPGTHNSPTCHVAPPSVRCQA VSPREQLENGVRFFDIRVQPQYPEDADKDELALVHSVFPISLTGSKYF RDLMREVNEFLDQNPSETLIISLKREGPGEHTDQQLSRILSDHYARPD SRWYTNPKIPTLGEVRGKVVLIRRFDILDHLKDIHGGAGWGICASGW ADNCSNATCPSGQLCIQDFYEVLETENIGEKIKYVQEHCFRAAETCYP FGVLPDHEATKAHPFYINFLSASNFWKLGTWPEKIAGKLNPAAVDYL CRKHGEKDDCDWSTGILVTDWVGLDGDWDLVRCIVGMNARLKLRQ DRHEGDN, (ID. SEQ. N° 4).

[149] Em alguns aspectos, o polipeptídeo compreende uma sequência a partir da ID. SEQ. N° 5 como um homólogo funcional ou variante respectiva, compreendendo, por exemplo, até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40 ou mais alterações de aminoácidos, tais como substituições ou exclusões, da ID. SEQ. N° 5 (vide também a PCT/US2014/043294, que é incorporada ao presente por referência na íntegra): WSAEDKHKEGVNSHLWIVNRAIDIMSRNTTLVKQDRVALLNEWRTEL ENGIYAADYENPYYDNST [W ou Y] ASHFYDPDNGKTYIPYAKQAKETGAKYFKLAGESYKNKDMKQAFFYL GLSLHYLGDVNQPMHAANFTNLSYPQGFHSKYENFVDTIKDNYKVTD GNGYWNWKGTNPEDWIHGAAVVAKQDYAGIVNDNTKDWFVRAAVS QEYADKWRAEVTPMTGKRLMDAQRVTAGYIQLWFDTYGNR, (ID. SEQ. N° 5).

[150] Em alguns aspectos, o polipeptídeo compreende uma sequência a partir da ID. SEQ. N° 6 como um homólogo funcional ou variante respectiva, compreendendo, por exemplo, até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40 ou mais alterações de aminoácidos, tais como substituições ou exclusões, da ID. SEQ. N° 6: MAKFMDKTHPISELYVFGDSLSDTGMVFRATGGMYPPNPTYFQGRY SNGRVWIEYLAESLHLSPKQTHNFAYGGATTANVGNSYVPSLLNQV QSFTQTHQQTNPDALYVLWAGANDYLQGVSSASIPVKNVTTAINSLT DVGAKKILVGNLPDLGQLPATRNSTNSVSLSALTQAHNQGLRRSLKV LGQQHSDLEIVQLDANALYRHAIAKPAAFNFTNVISPCLSGDRTCSNP DQFLFWDGIHPTAAAHRIIAETAFSTIQEAGMTNPLLSLSLEYN, (ID. SEQ. N° 6).

[151] Em alguns aspectos, o polipeptídeo compreende uma sequência a partir da ID. SEQ. N° 7 como um homólogo funcional ou variante respectiva, compreendendo, por exemplo, até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40 ou mais alterações de aminoácidos, tais como substituições ou exclusões, da ID. SEQ. N° 7: MAPIQSSNMIQISHQINRLYVFGDSLSDVGNVYHASGKIYPPNPPYFE GRYCNGLVWVEYLSAKLALTPEQNANFAYGGATTGNGSVNGVPGLL AQVQAFTKVHQEVNSNALYVLWAGANDYLYGGANPTLTLGNISKAV ESLLKMGAKKIMVVNLPDLGKLPATRTSANSNTISSFAIAHNQSLAKS VEELKQKLGSDTQIAILDIYSLYQEATKHPGMFGLTNVTNACSNNLAIC DRPDKYLFWDGIHPTTVAHRIIAEAALKVIKTEFSFSATSPQPLS, (ID. SEQ. N° 7).

[152] Em alguns aspectos, o polipeptídeo compreende uma sequência a partir da ID. SEQ. N° 8 como um homólogo funcional ou variante respectiva, compreendendo, por exemplo, até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40 ou mais alterações de aminoácidos, tais como substituições ou exclusões, da ID. SEQ. N° 8: MAPTTSITNCHTSINELYVFGDSLSDIGNVFNATEGFHPSSPPYFQGR FSNGLVWVEYLASGLALTPKQNTNFAYGGATTGSGNINRIPDLLTQV DGFIKIHQQVDRNALYILWAGANDYLHSMSNPSVSISNISQAIQSLAKV GAKKILVANLPDLGNIPATRNSPYSSILSSATIAHNLSLVKSLDILKQKL GHDSQMIMLDVHSLYKEAIANPTKFGFINVTEACLNKLATCGNPDKFL FWDGIHPTTAAHQILAKAALKELKTTYSFPPLPELLQ, (ID. SEQ. N° 8).

[153] Em alguns aspectos, o polipeptídeo compreende uma sequência a partir da ID. SEQ. N° 9 como um homólogo funcional ou variante respectiva, compreendendo, por exemplo, até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40 ou mais alterações de aminoácidos, tais como substituições ou exclusões, da ID. SEQ. N° 9: MAEGRQPFSRVVMFGDSLSDTGKMYKKMRGYLPSSPPYFNGRFSN GPVWLEQLGDERFPGLVVANEAEGGATAVAYNHLGALNGWLGFWS WDPKYQVINNLDYEIDQFLKKDKFRPDDLVVIWVGANDYLAYGWNTE RDADRVIDTIRLASNRLVLNGAQQILLFNIPDLGQTPSARSMKVVEKV RHVASYHNQKLQNLTRELAPLGIVKLFEVDKQFDEMMRDPQLFGLSD TEHACYGGGYTWKPFSGSAAEVAATPALSVSERVAIAGNPILAQAVV SGQAKGRAATLNCDEHMFWDQVHPTRTVHKVLSQRVADFIDQHYEF VRH, (ID. SEQ. N° 9).

[154] Em alguns aspectos, o polipeptídeo compreende uma sequência a partir da ID. SEQ. N° 10 como um homólogo funcional ou variante respectiva, compreendendo, por exemplo, até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40 ou mais alterações de aminoácidos, tais como substituições ou exclusões, da ID. SEQ. N° 10: MMKKWLVCLLGLLALTAQAVERPSFSRIVMFGDSLSDTGKMYKKMK GYLPSSPPYYEGRFSNGPVWLERLRDEHFPGLQLANEAEGGATAVA YNKLGWLNFWAWDPKYQVINNLDYEIDQFLAKDSLRPDDLVVIWVGA NDYLAYGWNQEKDADRVIETIRLASNRLVLNGAQQILLFNIPDLGRTP SANSMKVVDQVRHVASYHNQRLLNLSRELAPLGIVKMFEVDKQFDE MVGDPQKFGLSDIEHACYGGGYLWKPFSDASEAPALSVPERLAVAG NPILAQAVVSPQAARSAAARNCDEHMFWDQVHPTATVHKAMGERV AAFIEQHYEFIRR, (ID. SEQ. N° 10).

[155] Especificamente, a presente divulgação fornece um polipeptídeo, compreendendo uma ID. SEQ. N° 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou suas sequências complementares. A presente divulgação também fornece um homólogo funcional ou variante respectiva, o polipeptídeo, compreendendo, pelo menos, cerca de 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com uma ID. SEQ. N° 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de um polipeptídeo exemplar.

[156] A presente divulgação também fornece fragmentos ou pequenos peptídeos do polipeptídeo, compreendendo, pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ou mais bases consecutivas da ID. SEQ. N° 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 do polipeptídeo exemplar. Estes peptídeos menores do polipeptídeo exemplar podem ser um fragmento, um motivo, um local ativo ou um local de ligação necessário para sua função.

HOMÓLOGOS FUNCIONAIS

[157] Homólogos funcionais dos polipeptídeos descritos acima também são adequados para utilização com os processos descritos no presente documento.

[158] Um homólogo funcional é um polipeptídeo que tem alguma semelhança de sequência com os polipeptídeos ou polinucleotídeos de referência fornecidos no presente documento, e que executam uma ou mais função(ões) fisiológica(s) ou bioquímica(s) do polipeptídeo de referência.

[159] Em alguns aspectos, o homólogo funcional e o polipeptídeo de referência podem ser de ocorrência natural. Em alguns aspectos, o homólogo funcional e o polipeptídeo de referência podem ser de ocorrência não natural, ou seja, divergentes de uma sequência do tipo selvagem (que ocorrem, por exemplo, naturalmente).

[160] A porcentagem de semelhança da sequência de homólogos fornecido pela presente divulgação pode ser baixa devido aos eventos evolutivos convergentes ou divergentes. Como tal, os homólogos funcionais também podem ser conhecidos como variantes de homólogos, ortólogos ou parálogos.

[161] Variantes de um homólogo funcional que ocorre naturalmente também são englobadas pela presente divulgação, como, por exemplo, os polipeptídeos codificados por mutantes de uma sequência de codificação de tipo selvagem, podendo eles mesmos serem homólogos funcionais. Homólogos funcionais também podem ser criados por mutagênese sítio-dirigida da sequência de codificação para um polipeptídeo, ou pela combinação de domínios a partir das sequências de codificação para diferentes polipeptídeos de ocorrência natural ("troca de domínio").

[162] O termo "homólogo funcional" também pode ser aplicado ao ácido nucleico que codifica um polipeptídeo funcionalmente homólogo. Técnicas para modificar os genes que codificam os polipeptídeos fornecidos no presente documento são conhecidas na técnica. Por exemplo, para modificar sequências de DNA, pode-se utilizar métodos tais como, mas limitando a, técnicas de evolução dirigida, técnicas de mutagênese sítio-dirigida ou técnicas de mutagênese aleatória. Essas técnicas podem ser úteis para aumentar a atividade específica de um polipeptídeo, alterar a especificidade do substrato, alterar os níveis de expressão, alterar a localização subcelular ou modificar as interações do polipeptídeo em uma maneira desejada que aumente a produção de óleo. Tais modificações dos polinucleotídeos e polipeptídeos da presente divulgação são considerados homólogos funcionais englobadas pela presente divulgação.

[163] Um método que pode ser utilizado para identificar os homólogos funcionais da presente divulgação pode ser por meio de alinhamento de sequências de nucleotídeos ou polipeptídeos. Por exemplo, executar uma consulta em um banco de dados de sequências de nucleotídeos ou polipeptídeos pode identificar os homólogos dos polipeptídeos fornecidos no presente documento. Os homólogos podem ser identificados pela utilização de um alinhamento computadorizado e um software de identidade de sequências conhecido na técnica ou conforme fornecido no presente documento.

[164] A análise de sequência pode envolver uma análise por BLAST, por BLAST Recíproco ou por PSI-BLAST de bancos de dados não redundantes utilizando a sequência de aminoácidos, como a sequência de referência fornecida no presente documento. A sequência de aminoácidos é, em alguns casos, deduzida a partir da sequência de nucleotídeos.

[165] Polipeptídeos no banco de dados que tenham mais que 40% de identidade de sequência são candidatos a uma nova avaliação para adequação, assim como os homólogos funcionais dos polipeptídeos da presente divulgação. Além disso, a inspeção manual dos homólogos candidatos pode ser realizada. A inspeção manual pode ser executada selecionando-se aqueles candidatos que parecem ter conservado os domínios funcionais presentes nos polipeptídeos fornecidos pela presente divulgação.

[166] As regiões conservadas podem ser identificadas através da localização de uma região dentro da sequência primária de aminoácidos de um polipeptídeo que seja uma sequência repetida, formando uma estrutura secundária {por exemplo, hélices e folhas beta), o que estabelece os domínios carregados positiva ou negativamente ou representa um motivo ou domínio de proteína. Por exemplo, vide o site Pfam que descreve sequências de consenso para uma variedade de motivos e domínios de proteínas na Internet em sanger.ac.uk/Software/Pfam/ e pfam.janelia.org/. As informações incluídas no banco de dados da Pfam são descritas em Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res., 26:320-322 (1998); Sonnhammer et al., Proteins, 28:405-420 (1997); e Bateman et al., Nucl. Acids Res., 27:260-262 (1999). As regiões conservadas também podem ser determinadas pelo alinhamento das sequências de polipeptídeos relacionados ou iguais de espécies estreitamente relacionadas. Preferencialmente, as espécies estreitamente relacionadas são da mesma família. Em algumas aplicações, o alinhamento das sequências de duas espécies diferentes é adequado.

[167] Normalmente, os polipeptídeos que exibem, pelo menos, aproximadamente 40% de identidade de sequência de aminoácidos são úteis para identificar as regiões conservadas. As regiões conservadas dos polipeptídeos relacionados exibem, pelo menos, 45% de identidade de sequência de aminoácidos (por exemplo, pelo menos, 50%, pelo menos, 60%), pelo menos, 70%>, pelo menos, 80%> ou, pelo menos, 90%> de identidade de sequência de aminoácidos. Em algumas aplicações, uma região conservada exibe, pelo menos, 92%, 94%>, 96%>, 98%> ou 99% de identidade de sequência de aminoácidos. A identidade de sequência pode ser determinada conforme descrito no presente documento ou por outros métodos conhecidos na técnica.

POLIPEPTÍDEOS COM ATIVIDADE FOSFOLIPASE

[168] A divulgação fornece numerosos polipeptídeos exemplares e ácidos nucleicos que os codificam, tendo uma atividade de fosfolipase, bem como pequenos peptídeos de polipeptídeos exemplares, englobando os locais ativos importantes, os domínios de ligação regulamentares ou uma combinação respectiva que transmita sua atividade funcional.

[169] Conforme utilizado no presente documento, o termo "fosfolipase" engloba enzimas que têm qualquer atividade de fosfolipase, por exemplo, clivando uma ligação de éster glicerolfosfato (catalisando a hidrólise de uma ligação de éster glicerolfosfato). Em alguns aspectos, os polipeptídeos tendo atividade fosfolipase podem ter uma atividade composta por clivagem de uma ligação de éster glicerolfosfato, a capacidade de hidrolisar ligações de éster fosfato, incluindo patatina, acilhidrolase lipídica (LAH | lipid acyl hydrolase), fosfolipase A, B, C e/ou atividade de fosfolipase D, ou qualquer combinação respectiva.

[170] A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade de fosfolipase C (PLC | phospholipase C); uma atividade de PI-PLC, uma atividade de fosfolipase A (PLA | phospholipase A), como uma atividade de fosfolipase A1 ou fosfolipase A2; uma atividade de fosfolipase B (PLB | phospholipase B), como uma fosfolipase de atividade B1 ou fosfolipase B2, incluindo atividade de lisofosfolipase (LPL | lysophospholipase) e/ou atividade de lisofosfolipase transacilase (LPTA | lysophospholipase-transacylase), uma atividade de fosfolipase D (PLD | phospholipase D), tais como uma atividade de fosfolipase D1 ou fosfolipase de D2 ou uma atividade de patatina, ou qualquer combinação respectiva. Em alguns aspectos, a atividade da fosfolipase pode, ainda, incluir uma atividade enzimática de patatina, incluindo a atividade de esterase da patatina. Em alguns aspectos, a atividade de fosfolipase pode, ainda, incluir uma atividade de acilhidrolase lipídica (LAH).

TIPOS DE ENZIMAS FOSFOLIPASE

[171] Enzimas de fosfolipases de ocorrência natural podem ser encontradas em procariontes e eucariontes. Vários tipos de fosfolipases são conhecidos, diferindo em sua especificidade de acordo com a posição da ligação atacada na molécula do fosfolipídio.

[172] Existem quatro classes principais de enzimas de fosfolipase, diferenciadas pelo tipo de reação que eles catalisam, denominados: fosfolipase A, fosfolipase B, fosfolipase C e fosfolipase D. As fosfolipases do tipo C e D são consideradas fosfodiesterases.

[173] A fosfolipase pode, ainda, ser dividida em dois subtipos, denominados A1 e A2. A fosfolipase A1 cliva a cadeia de acila SN-1. A fosfolipase A2 cliva a cadeia de acila SN-2, liberando ácido araquidônico. A fosfolipase A2 atua sobre a molécula de lecitina intacta e hidrolisa o ácido graxo esterificado ao segundo átomo de carbono. Os produtos resultantes podem ser a lisolecitina e um ácido graxo.

[174] A fosfolipase B cliva tanto a cadeia de acila SN-1 quanto a SN-2; esta enzima também é conhecida como uma lisofosfolipase. As enzimas que exibem tanto atividades de PLA1 quanto PLA2 são frequentemente chamadas de fosfolipase B.

[175] A fosfolipase C cliva diante do fosfato e pode atuar para liberar o diacilglicerol e um grupo principal contendo fosfato. A fosfolipase C também pode ser considerada uma fosfodiesterase.

[176] A fosfolipase D cliva diante do fosfato, liberando ácido fosfatídico e um álcool. A fosfolipase D também pode ser considerada uma fosfodiesterase. Além disso, a fosfolipase D pode, ainda, ser dividida em dois subtipos, denominados D1 e D2.

[177] Famílias de enzimas de fosfolipase C (PLC) foram identificadas em bactérias e em tripanosomas eucarióticos. Enzimas de PLC pertencem à família das hidrolases e fosfodiesterases. A PLC participa no metabolismo do fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) e nas vias de sinalização de lipídios de forma dependente de cálcio.

[178] Estudos em várias isoformas de fosfolipase C mostram que, em alguns aspectos, essas isoformas podem diferir em seu modo de ativação, níveis de expressão, regulamento catalítico, localização celular, avidez de vinculação de membrana e distribuição tecidual. Vide (Carmen, G., J. Biol. Chem. 270 (1995) 1871 1-18714, Jianag, Y., J. Biol. Chem, 271 (1996) 29528-29532, Waggoner, D., J. Biol. Chem. 270 (1995) 19422-19429, Molecular Probes Product Sheet 2001, e Sano et al., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281 :844-851, 2001).

[179] As enzimas de fosfolipase específica de fosfatidilinositol C (PI-PLC) são uma família de enzimas intracelulares eucarióticas, que podem desempenhar um papel importante nos métodos de transdução de sinal. A reação catalisada de PI-PLC é: 1-fosfatidil-1D-mio-inositol 4,5-bifosfato (também chamado de PIP2, fosfatidilinositol bisfosfato) + H20^ ID-mio-inositol 1,4,5-trifosfato (também chamado de IP3, inositol trifosfato) + diacilglicerol.

[180] Em um aspecto, as fosfolipases PLC podem catalisar a hidrólise de uma variedade de substratos de fosfolipídeo, incluindo fosfatidilcolina (PC | phosphatidylcholine), fosfatidiletanolamina (PE | phosphatidylethanolamine), fosfatidilserina (OS | phosphatidylserine), fosfatidilinositol (PI | phosphatidylinositol), ácido fosfatídico (PA | phosphatidic acid) ou uma combinação respectiva. Além disso, estas enzimas podem ter diferentes graus de atividade sobre as formas de lisofosfolipídeos desses fosfolipídios. Por exemplo, elas podem fornecer a hidrólise de um tipo de substrato de fosfolipídeo em %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% da concentração original e fornecer hidrólise para outro tipo de substrato de fosfolipídeo em 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% da concentração original.

[181] Um teste pode ser realizado se uma determinada enzima de fosfolipase for abrangida pela presente divulgação, utilizando análise comparativa da ressonância magnética nuclear (NMR | nuclear magnetic resonance) do óleo tratado e não tratado, conforme previsto no presente documento, para determinar o substrato específico da fosfolipase, bem como a grau de hidrólise obtido.

[182] Em alguns aspectos, os polipeptídeos da presente divulgação podem utilizar uma variedade de substratos de fosfolipídeos, incluindo fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (PI), ácido fosfatídico (PA) ou uma combinação respectiva. Em um aspecto, a função do polipeptídeo é uma atividade de fosfolipase. A atividade de fosfolipase do polipeptídeo exemplar pode incluir uma atividade de fosfolipase C (PLC), uma atividade de fosfolipase A (PLA), como uma atividade de fosfolipase A1 ou de fosfolipase A2, uma atividade de fosfolipase D (PLD), como uma atividade de fosfolipase D1 ou fosfolipase D2.

[183] Em outro aspecto, uma fosfolipase da divulgação pode ter atividade multifuncional. Em alguns aspectos, os polipeptídeos da presente divulgação podem incluir uma atividade de substrato de fosfolipase, ou qualquer combinação das atividades de fosfolipase. Por exemplo, a atividade de fosfolipase pode abranger uma especificidade para PE e PC; PE e PI; PE e PS; PS e PC; PS e PI; PI e PC; PS, PI e PC; PE, PI e PC; PC, PE e PS; PE, PS e PI; ou, PE, PS, PI e PC, ou qualquer combinação respectiva.

POLIPEPTÍDEOS COM ATIVIDADE ACILTRANSFERASE

[184] Em um aspecto, um polipeptídeo da presente divulgação é uma aciltransferase. Em outro aspecto, o polipeptídeo é uma aciltransferase lipídica. Em outro aspecto, o polipeptídeo é uma fosfatidilcolina-esterol O-aciltransferase.

[185] Em alguns aspectos da presente invenção a aciltransferase lipídica é um estabilizador enzimático e funciona em 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9, 1/10, 1/11, 1/12, 1/13, 1/14, 1/15, 1/16, 1/17, 1/18, 1/19, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1/60, 1/70, 1/80, 1/90, ou 1/100 da concentração recomendada para um processo de degomagem de óleo.

[186] Em alguns aspectos, a concentração de aciltransferase lipídica não é superior a 0,01 TIPU/g de óleo. Em alguns aspectos, a concentração da enzima de aciltransferase lipídica não é superior a 0,002 TIPU/g de óleo. Em alguns aspectos, a concentração da enzima de aciltransferase lipídica não é superior a 0,06 TIPU/g de óleo.

[187] Em alguns aspectos, a concentração da enzima de aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,01 TIPU/g de óleo. Em alguns aspectos, a concentração da aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,002 TIPU/g de óleo. Em alguns aspectos, a concentração da aciltransferase lipídica é de aproximadamente 0,06 TIPU/g de óleo.

CONDIÇÕES E ATIVIDADE DOS POLIPEPTÍDEOS

[188] Os polipeptídeos da presente divulgação podem incluir homólogos ou variantes dos polipeptídeos exemplares da ID. SEQ. N° 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Por exemplo, os homólogos ou variantes que podem hibridizar com a ID. SEQ. N° 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 sob condições de estringência altas ou intermediárias. O polipeptídeo pode incluir fragmentos funcionais ou posições da ID. SEQ. N °: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Um fragmento funcional é um polipeptídeo que pode executar substancialmente a mesma função nos processos fornecidos na presente divulgação.

[189] Em um aspecto, o polipeptídeo pode reter sua atividade funcional, conforme fornecido no presente documento, sob condições que compreendem um intervalo de temperaturas entre aproximadamente 37°C a aproximadamente 95°C, entre aproximadamente 55°C a aproximadamente 85°C, entre aproximadamente 70°C a aproximadamente 95°C ou entre aproximadamente 90°C a aproximadamente 95°C.

[190] Em outro aspecto, o polipeptídeo abrangido pela presente divulgação pode ser termotolerante. O polipeptídeo pode reter uma atividade após a exposição a uma temperatura em um intervalo maior que 37°C a aproximadamente 95°C, ou no intervalo maior que 55°C a aproximadamente 85°C. Em um aspecto, o polipeptídeo exemplar pode manter sua atividade funcional, conforme fornecido no presente documento, após exposição a uma temperatura em um intervalo maior que 90°C a aproximadamente 95°C.

[191] Em um aspecto, o polipeptídeo pode manter sua atividade, conforme fornecido no presente documento, sob condições que compreendem um pH de aproximadamente 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5 ou 4. Em outro aspecto, o polipeptídeo pode manter sua atividade funcional, conforme fornecido no presente documento, sob condições que compreendem um pH de 7, 7,5, 8,0, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5 ou 11.

[192] Em alguns aspectos, o polipeptídeo tem atividade dentro de um intervalo de pH de aproximadamente pH 3 a pH 10. Em alguns aspectos, a atividade do polipeptídeo dentro de um intervalo de pH é de aproximadamente pH 4 a pH 9. Em alguns aspectos, o polipeptídeo tem atividade dentro de um intervalo de pH de aproximadamente pH 5 a pH 9. Em alguns aspectos, o polipeptídeo tem atividade dentro de um intervalo de pH de aproximadamente pH 4,5 a pH 9,5.

ENSAIOS PARA OS NÍVEIS DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA ATIVIDADE DA FOSFOLIPASE EM ÓLEO

[193] O óleo degomado e não tratado pode ser emulsionado utilizando, por exemplo, um Homogeneizador T50 Ultra-Turrax (IKA) por 1 min. Em seguida, 300 mg de amostras de óleo são extraídas com 900 μl de solução de NMR (100 mM de Tris-HCl, pH de 10,5, 50 mM de EDTA, 2,5% de desoxicolato de sódio) durante 1 hora a 37°C com agitação constante. A fase aquosa resultante pode ser extraída com 600 μl de hexano e analisada por NMR.

[194] O espectro de NMR pode ser adquirido utilizando um equipamento Bruker DRX 600. Amostras puras de PC, PE, PA e PI podem ser executadas em paralelo, como padrões. Ao comparar o óleo não tratado e o tratado, pode-se determinar a extensão da atividade de PC, PE, PA de PI de um determinado polipeptídeo em um óleo.

ATIVIDADE DE PC-PLC

[195] Brevemente, 10 μl de amostra contendo PC-PLC foram incubados com 10 mM O-(4-nitrofenil fosforilcolina) como um substrato em tampão 250 mM de HEPES com pH7, 0,1 mM de ZnCl2 em um volume final de 100 μl a 55°C por 30 min. Absorbância a 405 nm determinada e atividade de PLC calculada. 1 unidade de PLC corresponde a quantidade de enzima que libera 1 μmol de p-nitrofenol por minuto.

ATIVIDADE E PI-PLC

[196] A atividade de PI-PLC pode ser determinada utilizando, por exemplo, um substrato fluorogênico solúvel em água butil-FLIP (Toronto Research chemicals). Uma unidade é a quantidade de enzima que converte 1 umol de substrato (butil-FLIP) a ser produzido por minuto nas condições especificadas.

[197] Brevemente, 2 mg/ml de solução estoque de butil-FLIP foram preparadas em H2O e armazenadas a -20°C.

[198] As preparações enzimáticas (10 a 100 nM) são incubadas com butil-FLIP como substrato em 50mm de solução tampão de acetato de sódio com pH 5, 1 uM de BSA e 0,04 mM de butil-FLIP. Os ensaios podem ser realizados em um volume total de 0,2 mL em cubetas de 96 poços e a fluorescência é determinada em um leitor de microplacas Synergy HT com temperatura a 25°C.

[199] Espectros de fluorescência são registrados utilizando filtros de excitação e emissão de 485 e 528 nm, respectivamente, e uma largura de corte de 20 nm.

[200] Uma verificação com duração de 10 min. é gravada e a mudança resultante na fluorescência é convertida em unidades de hum de produto fluorescente produzido por segundo, fazendo uso de uma curva de calibração preparada através da conversão de uma solução de substrato completamente ao produto por tratamento prolongado com hidróxido de sódio diluído.

ATIVIDADE DE LAT

[201] A atividade de aciltransferase lipídica (LAT) pode ser determinada por unidades de titulação de fosfolipase (TIPU | titration phospholipase units) utilizando, por exemplo, o conjunto WAKO NEFAC. Este conjunto utiliza um método colorimétrico enzimático in vitro para a quantificação de ácidos graxos não esterificados (ou livre).

[202] Brevemente, 45 ul de uma solução de um substrato contendo 0,6% de PC, 0,4% de tritão, 5mm de CaCl2, 50 mM de HEPES com pH 7 foram incubadas com 5 ul de uma amostra contendo a enzima de LAT durante 10 minutos a 30°C. Em seguida, 100 ul de solução NEFA A foram adicionadas e incubadas por 10 min a 37°C, após esta incubação, 200 ul de solução NEFA B foram adicionadas e incubadas por 10 min a 37°C, a absorbância é medida a 520 nm, utilizando o leitor de microplacas Synergy HT. A atividade enzimática de TIPU pode ser calculada como o micromol de FFA produzido por minuto.

SEQUÊNCIA HETERÓLOGA

[203] As sequências de polipeptídeo ou nucleotídeo que codificam as sequências de polipeptídeo podem abranger uma sequência heteróloga.

[204] A sequência heteróloga pode ser uma ou mais alteração(ões) de aminoácidos em comparação à sequência de ocorrência natural. A sequência heteróloga pode ser uma ou mais modificação(ões) pós-translacional(is) em comparação à sequência de ocorrência natural.

[205] Em alguns aspectos, a sequência heteróloga pode ser uma sequência adicional localizada no amino-terminal, carboxi-terminal ou em ambas as extremidades do polipeptídeo. A sequência heteróloga pode incluir um promotor, uma sequência líder, um sinal de secreção, um peptídeo sinal, um domínio catalítico, um local ativo, uma sequência de estabilização de proteínas ou RNA ou uma combinação respectiva.

[206] Em alguns aspectos o polipeptídeo heterólogo pode compreende um polipeptídeo exemplar com, pelo menos, uma modificação pós translacional de ocorrência não natural. Exemplos de modificações pós translacional de ocorrências não naturais que podem ocorrer nos polipeptídeos heterólogos da presente divulgação incluem, entre outros, glicosilação, fosforilação, acetilação, metilação, biotinilação, glutamilação, glicilação, hidroxilação, isomerização, prenilação, miristoilação, lipoilação, fosfopanteteinilação, sulfatação, ISGilação, nitrosilação, palmitoilação, SUMOilação, ubiquitinação, nedilação, citrulinação, amidação e formação de ligação dissulfeto ou redução de ligação dissulfeto.

[207] Em alguns aspectos, o polipeptídeo heterólogo pode compreender o polipeptídeo exemplar com, pelo menos, um local de glicosilação não encontrado no polipeptídeo de ocorrência natural. Em um aspecto, a glicosilação de ocorrência não natural pode ser uma glicosilação N-ligada. Em um aspecto, a glicosilação de ocorrência não natural pode ser uma glicosilação O-ligada. Em um aspecto, o polipeptídeo heterólogo pode compreender o polipeptídeo glicosilado exemplar em dois ou mais locais de ocorrência não naturais após ser expresso em uma célula hospedeira.

[208] A sequência heteróloga de polipeptídeo ou nucleotídeo pode compreender o polipeptídeo exemplar e uma ou mais sequência(s) reguladora(s), conforme fornecido no presente documento e conhecido na técnica. Em alguns aspectos, a sequência heteróloga de polipeptídeo ou nucleotídeo pode compreender o polipeptídeo exemplar e uma construção de cassete. Em alguns aspectos, a sequência heteróloga de polipeptídeo ou nucleotídeo pode compreender o polipeptídeo exemplar e um meio de vetor, conforme referido no presente documento.

[209] A presente divulgação fornece variantes heterólogas da ID. SEQ. N° 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 pelo uso de substituições alternativas de códons. Essa variante heteróloga pode ser feita substituindo os códons do ácido nucleico, tal que os códons facilitem o aumento de sua expressão (sendo, por exemplo, otimizados) em uma determinada célula hospedeira.

[210] Em alguns aspectos, as sequências exemplares fornecidas no presente documento são otimizadas para a célula hospedeira, E. coli. O método da presente divulgação para descobrir uma sequência de nucleotídeos modificados que aumenta sua expressão em uma célula hospedeira em particular pode compreende as etapas de: (a) fornecer um polinucleotídeo exemplar da invenção; (b) identificar um códon não preferencial ou menos preferencial no ácido nucleico e substitui-lo por um códon preferencial ou neutro utilizado para codificação do mesmo aminoácido, como o códon substituído, caracterizado por um códon preferencial ser um códon sobre-representado na codificação de sequências em genes na célula hospedeira e por um códon não preferencial ou menos preferencial ser um códon sub-representado na codificação de sequências de genes na célula hospedeira, modificando, assim, o polinucleotídeo exemplar da invenção para aumentar a sua expressão em uma determinada célula hospedeira.

[211] Em algumas aplicações, a sequência de DNA otimizada do códon de E. coli da ID. SEQ. N° 1 pode ser: ATGGCGGCGTCAGAAAGAGACAACATTAACTTGAGCGAGTGGATG AGAGAAATTCCTAACAGCAACACATTGGCAGAAATCAGCATTCCG GGAACACATGATTCAGGAACGTTTAGACTGGAAGACCCTATTAAA AGCGTGTGGGCAAAGACCCAGGAAAACGATTTCCGTTATCAAATG GACCACGGCGTCAGATTTTTCGATATCCGCGGACGTGTCACCGAT GACAACACTATTGTTCTGCATCACGGTCCAATCTACTTGTACGTGA CACTGCAACAATTCATCAACGAAGCGAAGGAGTTCTTGAAGTCTC ATCCTTCCGAAACGATTATCATGAGTCTGAAAGAAGAGTATGAGTC TATGCCAGGCGCTAAAGAATCCTTTGCCAAGACTTTCGAGAACAT GTACTTTGGAGATTCCATTTTCTTGAAAACCGAAGGTAATATCACT CTGGGTGACTCACGTGGCAAGATTGTCCTGTTGCGTAGATATTCC GGCTCAACCATGACTGGTGGCTTTAAAAACTTCGGATGGAAGGAT AATGCTACATTTACGTCCACCACTAACGGTAATGTTAAAATTACCG TGCAGGACAAGTACAACGTTAACTACGAAGAGAAAAAGGCTGCCA TCGATTCAATGTTGAAAGAAACTGTGCTGAACAAGGACAACCCAA ATCATATTCACATCAATTTCACCTCTCTGTCTTCTGGTGGTACGGC ATGGTCAAGCCCGTATTACTATGCGTCTTACCTGAACAGCATTAGT GCAGCGAAAGTTCGCCTGGATCACTTGAAAAATCTGGACACAAAG GCTGGTTGGATTATCATGGATTACATCGGCGATCGTTGGGACCCA AAGCTGTATGAAGAGATTATCAGAGCCAACTTTCGCTACCCACCG ACCGATGAACCGCATTTGTTTGAGCACATTGATGGCGAAGGAATC GACTTCACTAACCTGCCTCATAGTAAATGGAATGATCAAGTCAGTT CTATTCTGTTGAAGTCTTACACAGAGATCACGATCTACGAACACTC AAACTTCACTGGAAAGAGCGTTACCTTGACTAACACAACCAACTCT GCCCAACTGTTCAACCTGACCACCTACAACTTCAATGATAAAATGT CCTCCTACACTTGGAAACTGATTAGATAA, (ID. SEQ. N° 11).

[212] Em algumas aplicações, a sequência de DNA otimizada do códon de E. coli da ID. SEQ. N° 2 pode ser: ATGGGAGTTAGACTGTCCGTTCAAGACTGGATGAGCGCATTGGGC GACGCAACCCCTGTTCAAAGACTGACGATTCCGGGCACGCACGA CTCCGGTGCACGTGTTGGTGGACCATGGGTGGCGTGTCAGAACA CTCCTGTTGATGCTCAACTGAATAGCGGCATTAGATTTTTGGATGT CCGCTGCCGTGCAATTGACAACGTTTTCGCTATCCATCACGGTGC CTTTTATCAGGAACTGATGTTCGGCGATGTTTTGAATGCATGTCGT GCGTTTCTGCGTGCTCATCCGAGTGAGACAGTGTTGATGAGAGTC AAACAAGAATACTCTGAAGTGGGTGCCGAAGAGTTTCGTAGAATT TTCGGCATCTATCTGGATGACAAGGGATACCGCTCACTGTTCCGT TTGGATGCCGGCCTGCCTACGTTGGGACAGGCAAGAGGTCGCGT TGTGCTGTTGGCGGATTCTGACGGACTGGGAGGTGTCCGCTATG CAGATCCACAGTTGTTTGACATTCAAGATGACTATATGGCAGAAGC GTTTGGAAAATACCCAAAGATCGAGGCGCAGTTCCGTAAAGCTGT GGCCCAACCGGGAAAGCTGTTCGTCAACTACGTTTCAACCGCTGC CCTGTTGCCACCGAGAAGCAACGCCGATCGCCTGAATCCTCAAGT GAAACGTCTGTTGGAAGGTTCTGAGGGCTCCGGATGGACTGGTTT GGGCATCGTCCCTATGGACTTTCCAAACGAAAATGGCTTGGCAGA AACATTGATTAGACATAACTTGGCAGGACAGGGAGTGAGATTGAC AGCATAA, (ID. SEQ. N° 12).

[213] Em algumas aplicações, a sequência de DNA otimizada do códon de E. coli da ID. SEQ. N° 3 pode ser: ATGGTCAAGAAGATTTTCCTGAACTTCCTGATTGGTATCGGACTGA TTATCCTGAATAACTTTGTGTTTAGCGTGAATGAGGTGTTTGCTGA TAGCCGCTGGATGAGTACTATTCGTGATGACAAACCACTGAGTCG CGTCGCTGTTCCGGGCACGCATGATTCTGGAACCTTCAAGATGTC TGACCCGATTATCTCCGCCCTGGTGCGTACCCAGGAACAAGATTT TCGCCAGCAATTGGAGCAGGGTATTCGTTTCTTTGACATCCGTGG TAGAGCTACTAAAAACAATCAAATCGTGCTGCATCACGGTCCTAAG TATCTGTTGGTCACACTGCACCAGTTCTTGCAAGAAGCAGAGAATT TTCTGAGAAACAATCCATCAGAAACGATTATCATGAGCTTGAAAGA AGAGTACCCGGCGATGGAAGAGGTCACCAAATCCTTTTTCTCAAT CTTCAAGGAATCTTACTTCAACTACTACCCTTTTTACACTGGCAAC TCTTCCAATCCAAAAATTCAGGAGACACGTGGAAAGATCGTTCTGT TCGATAGAACTGGTAACTCCACATTGCCTGGCTACAACAAAATTTA CAACTGGGAAGACAACGCTACGTTTCAGACCACTACAAACAATAC CCTGCCATTGTATGTTCAAGATGAGTATAATGCAACTTACAACCGT AAAACACATGCGATTCTGGACCTGTTGAAGACCTCAAGCGAATCC AATGAGGGTATCTTTCTGAACTACGTTTCATTGGCTACGGGTGGC ACCGCCTGGAGTTCTCCGTATTACTTCGCCTCTTATCTGAACCCTT TGACTGGAGGTTACATTAATGAATTTCACGTGAGCAACCCAGGCT GGGTTGTGATGGATTATAGTGGCAACAGATGGAACCCTAACCTGA CAAAGAAAGTGATTGAGACTAATAGATACCTGCAATAA, (ID. SEQ. N° 13).

[214] Em algumas aplicações, a sequência de DNA otimizada do códon de E. coli da ID. SEQ. N° 4 pode ser: ATGTCTATTTATTCCTCCGCAAACCTGAACGCTTGGATGGGCGAG TTGAAAGACGACACACTGCTGTCCTCATTGAGTATCCCTGGCACC CATAACTCACCAACATGTCACGTTGCACCACCATCTGTGAGATGC CAGGCAGTCTCCCCGCGTGAACAACTGGAGAATGGTGTTCGTTTC TTTGATATTAGAGTGCAGCCTCAATATCCAGAAGATGCTGACAAAG ATGAGCTGGCCTTGGTCCATTCTGTTTTTCCGATCTCACTGACCG GCAGCAAGTACTTCCGCGATCTGATGCGTGAAGTGAACGAGTTTT TGGACCAGAATCCGTCCGAAACACTGATTATCTCATTGAAAAGAG AAGGACCTGGAGAGCATACGGATCAGCAACTGAGTCGCATTTTGT CTGATCACTATGCCAGACCTGACTCACGCTGGTACACAAACCCGA AAATCCCTACGCTGGGAGAAGTTCGCGGAAAGGTTGTGTTGATTC GTAGATTCGATATCCTGGACCATTTGAAAGATATTCACGGTGGCG CAGGCTGGGGAATCTGTGCAAGCGGATGGGCGGACAACTGTAGC AATGCTACCTGCCCTAGTGGTCAGCTGTGCATTCAAGATTTTTATG AGGTCTTGGAAACTGAGAACATTGGCGAAAAGATCAAGTACGTTC AAGAGCATTGTTTTAGAGCTGCCGAAACCTGCTACCCATTCGGAG TTCTGCCGGACCATGAAGCTACTAAAGCCCACCCATTTTATATTAA CTTCCTGTCTGCTTCCAATTTCTGGAAGTTGGGCACCTGGCCTGA GAAAATCGCCGGAAAGCTGAATCCAGCAGCGGTGGATTACTTGTG TCGTAAACACGGTGAAAAGGATGACTGCGATTGGTCCACCGGCAT TCTGGTGACTGACTGGGTCGGTCTGGACGGCGATTGGGACTTGG TCAGATGCATTGTTGGTATGAACGCAAGACTGAAGTTGAGACAGG ATAGACACGAAGGAGATAATTAA, (ID. SEQ. N° 14).

[215] Em algumas aplicações, a sequência de DNA da ID. SEQ. N° 10 pode ser: ATGAAAAAATGGCTTGTTTGTTTATTGGGGTTACTGGCGCTGACC GCTCAGGCGGTGGAGCGCCCGAGCTTTTCCCGGATCGTGATGTT TGGTGACAGCCTCTCGGACACCGGCAAGATGTACAAGAAGATGAA GGGGTATCTCCCCTCCAGCCCTCCCTATTACGAGGGGCGTTTCAG CAATGGCCCGGTCTGGTTGGAACGGTTGCGAGACGAACACTTCC CCGGGCTTCAGCTGGCTAACGAGGCTGAAGGTGGGGCGACGGC GGTGGCCTACAACAAGCTGGGCTGGCTCAACTTCTGGGCCTGGG ATCCCAAGTATCAGGTGATCAACAACCTCGACTACGAGATCGATC AGTTCCTGGCGAAGGACAGCTTGCGTCCCGACGATCTGGTGGTG ATCTGGGTGGGGGCCAACGACTATCTGGCCTATGGCTGGAATCA GGAGAAAGATGCCGATCGGGTGATCGAGACCATTCGCCTGGCAT CCAACCGACTGGTGCTCAACGGGGCGCAGCAGATCCTGCTGTTC AACATCCCGGATCTGGGCAGAACTCCATCCGCCAACAGCATGAAG GTAGTGGATCAGGTGCGCCACGTAGCCAGCTATCACAACCAGCG GCTGCTCAATCTCTCGCGCGAACTGGCCCCCCTTGGCATCGTCAA GATGTTCGAAGTGGACAAGCAGTTTGACGAGATGGTTGGTGATCC CCAGAAATTCGGGCTGAGCGACATCGAGCACGCCTGCTATGGCG GCGGGTATCTGTGGAA

[216] GCCCTTCTCCGATGCGAGCGAGGCGCCAGCCTTGAGC GTCCCAGAGCGTCTGGCAGTGGCCGGCAACCCGATCCTGGCCCA GGCTGTTGTGAGCCCGCAAGCGGCCCGCAGTGCGGCAGCCCGG AACTGCGATGAACACATGTTCTGGGATCAGGTGCACCCGACTGCG ACGGTGCACAAGGCGATGGGGGAGCGGGTCGCCGCTTTCATCGA ACAGCATTACGAGTTTATTCGTCGCTGA, (ID. SEQ. N° 15).

[217] Em algumas aplicações, a sequência de DNA otimizada do códon de E. coli da ID. SEQ. N° 10 pode ser:

[218] ATGGTGGAACGCCCGAGTTTCTCACGTATTGTTATGTTT GGTGATAGTCTGTCCGACACCGGCAAAATGTACAAGAAAATGAAA GGTTATCTGCCGAGCAGCCCGCCGTATTACGAAGGTCGTTTTAGC AATGGTCCGGTGTGGCTGGAACGTCTGCGTGATGAACATTTCCCG GGTCTGCAACTGGCAAATGAAGCTGAAGGCGGTGCCACGGCAGT TGCTTATAACAAACTGGGCTGGCTGAATTTTTGGGCGTGGGACCC GAAATATCAGGTCATTAACAATCTGGATTACGAAATCGACCAATTC CTGGCCAAAGATTCACTGCGTCCGGATGACCTGGTGGTTATTTGG GTTGGTGCGAACGATTATCTGGCCTACGGCTGGAATCAGGAAAAA GATGCAGACCGCGTCATTGAAACCATCCGTCTGGCATCCAACCGC CTGGTGCTGAATGGTGCTCAGCAAATTCTGCTGTTTAACATCCCG GATCTGGGCCGTACGCCGTCAGCGAACAGCATGAAAGTCGTGGA CCAGGTGCGCCATGTTGCCTCATATCACAACCAACGTCTGCTGAA TCTGTCGCGCGAACTGGCCCCGCTGGGTATCGTCAAAATGTTCGA AGTGGATAAACAGTTCGACGAAATGGTGGGTGATCCGCAAAAATT TGGCCTGAGCGACATCGAACATGCATGCTATGGCGGTGGCTACC TGTGGAAACCGTTCAGCGATGCTTCTGAAGCCCCGGCACTGTCTG TTCCGGAACGTCTGGCAGTTGCTGGTAACCCGATCCTGGCCCAG GCAGTTGTCAGTCCGCAAGCCGCACGTTCCGCAGCTGCGCGTAA TTGTGATGAACACATGTTCTGGGACCAGGTGCATCCGACCGCGAC GGTTCACAAAGCGATGGGCGAACGTGTGGCAGCATTTATTGAACA ACATTATGAATTTATCCGTCGTTAA

[219] Vários métodos são conhecidos dentro da técnica para a amplificação e isolamento das sequências fornecidas pela presente divulgação. A título de exemplo, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo pode ser preparada sinteticamente por métodos padrão estabelecidos, por exemplo, o método de fosforoamidita, descrito por Beucage S. L. et al. (1981) Tetrahedron Letters 22, p 18591869, ou pelo método descrito por Matthes et al. (1984) EMBO J. 3, p 801-805. No método de fosforoamidita, os oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo, em um sintetizador automático de DNA, purificados, recozidos, ligados e clonados em vetores apropriados.

[220] Alternativamente, uma biblioteca genômica de DNA ou cDNA pode ser construída. Sondas rotuladas de oligonucleotídeos podem ser sintetizadas e utilizadas para identificar clones que codificam polipeptídeos a partir da biblioteca genômica, preparada do organismo. Alternativamente, uma sonda rotulada de oligonucleotídeo contendo sequências homólogas a outro gene de polipeptídeo conhecido pode ser utilizada para identificar clones que codificam polipeptídeos. Neste último caso, a hibridização e as condições de lavagem de menor estringência são utilizadas. Ainda em outro exemplo de um método, pode-se obter clones expressando o polipeptídeo e depois utilizar uma reação da cadeia de polimerase para amplificar a sequência de interesse e isolar a sequência de ácidos nucleico.

[221] Os polinucleotídeos da presente divulgação podem ser utilizados para produzir um iniciador, por exemplo, um iniciador de PCR, um iniciador para uma reação de amplificação alternativa, uma sonda, por exemplo, rotulada com uma etiqueta reveladora utilizando meios convencionais radioativos ou etiquetas não radioativas, ou os polinucleotídeos podem ser clonados em vetores. Tais iniciadores, sondas e outros fragmentos são úteis na identificação da proteína em uma biblioteca ou uma variante homóloga fornecida pela presente divulgação. Tais iniciadores e sondas podem ter, pelo menos, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 pares de bases de nucleotídeos de comprimento e também são englobadas pela presente divulgação.

[222] Em um aspecto, o polipeptídeo ou polinucleotídeo da presente divulgação pode ser de forma isolada. O termo "isolado" pode significar que a sequência é, pelo menos, substancialmente isenta de, pelo menos, um outro componente ao qual a sequência está naturalmente associada na natureza e como encontrado na natureza. O termo "isolado" pode significar que a sequência tem, pelo menos, um outro componente que não é naturalmente encontrado na natureza.

[223] Em outro aspecto, o polipeptídeo ou polinucleotídeo da presente divulgação pode ser uma forma purificada. O termo "purificado" pode significar, pelo menos, aproximadamente 51% puro ou, pelo menos, aproximadamente 65% puro ou, pelo menos, aproximadamente 70% puro ou, pelo menos, aproximadamente 75% puro ou, pelo menos, aproximadamente 80% puro ou, pelo menos, aproximadamente 90% puro ou, pelo menos, aproximadamente 95% puro ou, pelo menos, aproximadamente 98% puro ou, pelo menos, aproximadamente 99% puro.

IDENTIFICAÇÃO DE HOMÓLOGOS

[224] A presente divulgação também fornece métodos para descobrir homólogos de fosfolipase englobados pela presente divulgação pela utilização de ácidos nucleicos, polipeptídeos e fragmentos fornecidos neste documento. Como tal, a presente divulgação também abrange a utilização de sequências de nucleotídeos que são capazes de hibridização com as sequências que são complementares às sequências apresentadas no presente documento, derivadas, ou qualquer fragmento respectivo. A presente divulgação engloba também as sequências que são complementares às sequências que são capazes de hibridização com as sequências.

[225] Em geral, as condições de hibridização são escolhidas com base na temperatura de fusão (Tm) e/ou no comprimento do complexo de nucleotídeos. Vide Berger e Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego Calif.).

[226] As sequências polinucleotídicas capazes de hibridização com as sequências de nucleotídeos fornecidas no presente documento em condições de estringência de intermediária à máxima são englobadas pela presente divulgação. Preferencialmente, a sequência também terá as propriedades funcionais conforme fornecido no presente documento.

[227] Como uma orientação geral e não ligada a qualquer teoria particular, uma hibridação de estringência máxima pode ser utilizada para identificar sequências altamente idênticos, de aproximadamente 90% a 100% de identidade de sequência com as sequências englobadas pela presente divulgação, enquanto uma hibridação de estringência intermediária pode identificar sequências de aproximadamente 90% a 70% de identidade de sequência com os polinucleotídeos englobados pela presente divulgação.

[228] Condições de hibridização de estringência máxima normalmente ocorrem em aproximadamente Tm-5°C (5°C abaixo do Tm da sonda), estringência alta em aproximadamente 5°C a 10°C abaixo do Tm, estringência intermediaria em aproximadamente 10°C a 20°C. abaixo do Tm, e estringência baixa em aproximadamente 20°C a 25° C abaixo do Tm. A título de exemplo somente, as condições de estringência altas podem incluir: hibridação a aproximadamente 42°C em uma solução de hibridação, compreendendo 25 mM de KPO4 (pH 7,4), 5xSSC, 5x solução de Denhart, 50 μg/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado e sonicado, 50% de formamida, 10% de sulfato de dextrano e 1 a 15 ng/mL de ID. SEQ. N° 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de lavagem em aproximadamente 65°C em uma solução de lavagem, compreendendo 0,2*SSC.

DEGOMAGEM DE ÓLEO

[229] Brevemente, 3g de óleo de soja bruto, contendo aproximadamente 1000 ppm de fosfato, serão homogeneizados por aproximadamente 1 min utilizando um homogeneizador Ultra-Turrax T8 (IKA) com aproximadamente 22,5 μg da proteína de interesse em 90 μl de tampão, compreendendo 50 mM de NaCitrate, pH 6,2 e 1mm de ZnCl2. Em seguida, os tubos contendo a mistura de reação serão incubados a aproximadamente 50°C com agitação constante, utilizando um agitador magnético de estabilidade como o agitador magnético de estabilidade VP 710 (VP-Scientific). A seguir, o óleo será homogeneizado e 200 μl de óleo homogeneizado é misturado com 200 μl de 2 M Tris-HCl pH 8 para parar a reação em vários pontos de tempo (por exemplo, entre 60 a 120 min). Em seguida, 800 μl de água será adicionado à mistura e incubado durante 1h a 37°C com agitação constante e, em seguida, centrifugado durante aproximadamente 5 min a 14000g. Finalmente, 45 μl da fase aquosa será recuperado e tratado com 0,3U da fosfatase intestinal do bezerro (Promega, WI, EUA) para 1h a 37°C.

[230] A concentração de fosfato inorgânico pode ser determinada de acordo com o método de Sumner (Sumner, J. B., Science 1944 196: 413). Brevemente, uma amostra de 500 μl, contendo 0,025 a 0,25 μmol de fosfato inorgânico em 5% de TCA foi misturada com 500 μl de reagente de cor (4% de FeSO4, 1% de (NH4)6MoO24.H2O, 3,2 % de H2SO4). As leituras espectrofotométricas devem ser feitas em aproximadamente 700 nm e os micromols de fosfato inorgânico na amostra podem ser calculados utilizando uma curva padrão.

ANÁLISE COMPARATIVA DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR

[231] Amostras de óleo podem ser extraídas com aproximadamente 900 μl de solução de NMR (100 mM de Tris-HCl, pH 10,5, 50 mM de EDTA, 2,5% de desoxicolato de sódio) durante 1h a 37°C com etapa de agitação constante. A fase aquosa resultante pode ser extraída com 600 μl hexano e depois analisada por análise de NMR.

[232] O espectro de NMR do óleo bruto e do óleo bruto tratado pode ser adquirido utilizando um Bruker DRX 600 e amostras de fosfatidilcolina pura, fosfatidiletanolamina, ácido fosfatídico e fosfatidilinositol de controle podem ser executadas como padrões.

F. POLIPEPTÍDEOS ISOLADOS

[233] A presente divulgação fornece composições de enzimas de polipeptídeos isolados. Em alguns aspectos, a enzima de polipeptídeos isolados compreende uma sequência exemplar ou homólogo funcional da variante respectiva, conforme fornecido no presente documento. Em alguns aspectos, a enzima do polipeptídeo isolado compreende uma sequência exemplar ou homólogo e, pelo menos, uma sequência heteróloga ou nucleotídeo. Em alguns aspectos, a enzima do polipeptídeo isolado é uma fosfolipase C, compreendendo, pelo menos, uma sequência heteróloga ou nucleotídeo.

[234] Em alguns aspectos, a enzima do polipeptídeo isolado é uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C, compreendendo, pelo menos, uma sequência heteróloga ou nucleotídeo. Em alguns aspectos, a enzima do polipeptídeo isolado é uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina C, compreendendo, pelo menos, uma sequência heteróloga ou nucleotídeo. Em alguns aspectos, a enzima do polipeptídeo isolado é uma fosfolipase específica de fosfatidilcolina C, compreendendo, pelo menos, uma sequência heteróloga ou nucleotídeo.

[235] Em alguns aspectos, a enzima do polipeptídeo isolado é uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina C e uma fosfolipase específica de fosfatidilcolina C, compreendendo, pelo menos, uma sequência heteróloga ou nucleotídeo.

[236] Em alguns aspectos, a enzima do polipeptídeo isolado pode ser utilizada para um processo de degomagem de óleo. Em alguns aspectos, as enzimas isoladas, conforme apresentadas no presente documento, são utilizadas para um processo de degomagem de óleo de um óleo comestível ou biocombustível para produção de um produto de consumo. Por exemplo, as enzimas isoladas podem ser utilizadas para processar óleos e fosfolipídeos em diferentes formas, incluindo suas formas brutas, degomadas, gomas, água de lavagem, argila, sílica, borra de refino e semelhantes.

[237] Em alguns aspectos, o biocombustível pode ser uma composição de óleo ou gordura. Em alguns aspectos, o biocombustível pode ser uma composição compreendendo óleos de peixe, óleos animais, óleos vegetais, óleos de algas, um óleo vegetal, um óleo vegetal integral, um óleo vegetal virgem, um óleo vegetal residual, uma gordura animal, uma graxa, um sebo, uma banha ou uma graxa amarela. Em alguns aspectos, o biocombustível pode ser uma composição compreendendo um lipídio ou um éster alquílico.

[238] A enzima do polipeptídeo isolado pode ser utilizada para fazer uma mistura enzimática utilizada no processamento ou refinação de um óleo bruto, um óleo comestível, um biocombustível ou processar óleos e fosfolipídeos em diferentes formas, incluindo formas brutas, degomadas, gomas, água de lavagem, argila, sílica, borra de refino e semelhantes.

[239] O polipeptídeo isolado que compreende a atividade de fosfodiesterase pode ser obtido a partir de um meio de cultura do gênero Lysinibacillus, Streptomyces, Enterococcus ou Aspergillus. Em outro aspecto, o polipeptídeo isolado que compreende a atividade de fosfodiesterase pode ser obtido a partir de um meio de cultura das espécies Lysinibacillus sphaericus, Streptomyces antibioticus, Enterococcus faecalis ou Aspergillus flavus.

[240] Em alguns aspectos, as enzimas podem ser obtidas a partir de um meio de cultura de um microrganismo geneticamente modificado, como uma cepa de E. coli modificada para abrigar uma sequência, codificando uma fosfodiesterase do gênero Lysinibacillus, Streptomyces, Enterococcus ou Aspergillus. Em alguns aspectos, as enzimas podem ser obtidas a partir de um meio de cultura de uma cepa E. coli geneticamente modificada, abrigando uma sequência que codifica uma fosfodiesterase da espécie Lysinibacillus sphaericus, Streptomyces antibioticus, Enterococcus faecalis ou Aspergillus flavus.

[241] Em alguns aspectos, as enzimas podem ser obtidas a partir de um meio de cultura de uma cepa E. coli geneticamente modificada, abrigando uma fosfodiesterase codificada por uma ID. SEQ. exemplar N° 1, 2, 3 ou 4. A presente divulgação também abrange a utilização de qualquer homólogo, derivado, fragmento ou derivado enzimático respectivo da sequência exemplar capaz de atingir o processo conforme ilustrado no presente documento.

[242] Em alguns aspectos, os homólogos, variantes, fragmentos ou derivados compreendem, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1,2, 3 ou 4 e fornece os benefícios funcionais semelhantes ao processo enzimático para refinação de um óleo bruto, conforme fornecido no presente documento. Em alguns aspectos, um homólogo, variante, fragmento ou derivado enzimático pode compreender substituições conservativas de aminoácidos da sequência exemplar.

[243] A enzima de aciltransferase lipídica isolada pode ser obtida a partir de um meio de cultura do gênero Nostoc, Fischerella, Scytonema ou Aeromonas. A aciltransferase lipídica do polipeptídeo isolado pode ser obtida a partir de um meio de cultura das espécies Nostoc punctiformes, Fischerella muscicola, Scytonema spp., Aeromonas veronii, ou Aeromonas enteropelogenes.

[244] Em alguns aspectos, as enzimas podem ser obtidas a partir de um meio de cultura de um microrganismo geneticamente modificado, como uma cepa E. coli modificada para abrigar uma sequência que codifica uma aciltransferase lipídica do gênero Nostoc, Fischerella, Scytonema ou Aeromonas. Em alguns aspectos, as enzimas podem ser obtidas a partir de um meio de cultura de uma cepa E. coli geneticamente modificada, abrigando uma sequência que codifica uma aciltransferase lipídica de Nostoc punctiformes, Fischerella muscicola, Scytonema spp., Aeromonas veronii, ou Aeromonas enteropelogenes. Em alguns aspectos, as enzimas podem ser obtidas a partir de um meio de cultura de uma cepa E. coli geneticamente modificada, abrigando uma aciltransferase lipídica codificada pela sequência da ID. SEQ. N° 6, 7, 8, 9 ou 10.

[245] Em alguns aspectos, a enzima do polipeptídeo isolado pode ser obtida a partir de um meio de cultura de uma cepa E. coli geneticamente modificada, abrigando uma aciltransferase lipídica codificada por uma ID. SEQ. exemplar N° 6, 7, 8, 9 ou 10. A presente divulgação também abrange a utilização de qualquer homólogo, derivado, fragmento ou derivado enzimático respectivo de uma sequência exemplar capaz de atingir o processo conforme ilustrado no presente documento. Em alguns aspectos, os homólogos, variantes, fragmentos ou derivados compreendem, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 6, 7, 8, 9 ou 10 e fornecem os benefícios funcionais semelhantes ao processo enzimático para refinação de um óleo bruto, conforme fornecido no presente documento. Em alguns aspectos, um homólogo, variante, fragmento ou derivado enzimático pode incluir uma substituição conservativa de aminoácidos da sequência exemplar fornecida pela presente divulgação.

PRODUÇÃO DE POLIPEPTÍDEOS

[246] A produção em grande escala dos polipeptídeos da presente divulgação pode ser obtida pelo cultivo de organismos geneticamente modificados fornecidos no presente documento. Apenas a título de exemplo, a produção em grande escala pode ser obtida pelo seguinte método:

[247] Uma molécula de ácido nucleico que codifica uma versão otimizada do códon de um gene ou homólogo funcional, codificando a ID. SEQ. N° 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, é clonada em qualquer vetor adequado, como, por exemplo, um plasmídeo pET24b (Novagen, EUA) ou célula hospedeira.

[248] O plasmídeo resultante pode ser transformado pela eletroporação ou qualquer outro meio, num organismo hospedeiro celular, como a cepa BL21AI de E. coli. Colônias transformadas podem ser selecionadas em placas LBA contendo 50 mg/L de canamicina.

[249] Uma colônia do clone recombinante pode ser cultivada em 100 ml de LB a 37°C, até que a densidade celular atinja aproximadamente OD600=2.

[250] A cultura pode ser transferida para um fermentador de semente contendo aproximadamente 10 litros (L) do meio (como o meio de HM descrito abaixo) e cultivada por 10 horas a 35°C.

[251] A cultura pode ser transferida para um fermentador de 1000L, contendo aproximadamente 600L de um meio de HM ou similar e ser cultivada em aproximadamente 35°C até a exaustão de glicerol. Uma alimentação exponencial de uma solução nutritiva, contendo aproximadamente 80% p/v de glicerol e aproximadamente 20 g/L de MgSO4 é, então, iniciada a um ritmo suficiente para manter a taxa de cultivo específica em um valor de aproximadamente 0,35 h-1± 0,05. Quando OD600 atinge um valor de aproximadamente 80, aproximadamente 1 mM de IPTG é adicionada e a solução nutriente é alimentada a uma taxa constante de aproximadamente 9 ± 1 L/h por 10 horas. A concentração de oxigênio dissolvida é mantida acima de aproximadamente 30% de saturação por enriquecimento do fluxo de ar com oxigênio puro, quando necessário. O pH é mantido em aproximadamente 7 pela adição de NH4OH, quando necessário.

[252] No final do método de fermentação, o caldo pode ser tratado com três ciclos de compressão/descompressão a aproximadamente 1000 bar em um homogeneizador APV para romper as células hospedeiras.

[253] O líquido resultante pode ser centrifugado até clarificação para separar materiais sólidos em uma centrífuga destilada a aproximadamente 5000 g.

[254] (NH4)2SO4 é adicionado a aproximadamente 80% de saturação do líquido clarificado, a mistura pode ser incubada a 8°C por 3 horas e, em seguida, centrifugada a 5000 g para obter uma pasta marrom.

VARIANTES E FRAGMENTOS

[255] A divulgação fornece métodos para determinar um homólogo funcional, variantes, fragmentos ou derivados de enzimas da presente divulgação, compreendendo as etapas de: (a) fornecer um homólogo variante, fragmentos ou derivados de enzimas, compreendendo uma sequência de aminoácido da invenção; e (b) excluir uma pluralidade de resíduos de aminoácidos da sequência da etapa (a) e testar a sequência restante para uma determinada atividade, conforme fornecido no presente documento, determinando, assim, um fragmento funcional.

[256] Variantes dos polipeptídeos exemplares abrangidos pela presente divulgação podem incluir aqueles onde substituições conservativas foram introduzidas. Uma substituição conservativa é reconhecida na técnica como a substituição de um aminoácido para outro aminoácido que tenha propriedades similares. Os aminoácidos podem ser classificados de acordo com suas propriedades físicas e contribuição para a estrutura secundária e terciária da proteína.

[257] Em um aspecto, as substituições conservativas de aminoácidos podem ser descritas como:

SUBSTITUIÇÕES CONSERVATIVAS I CARACTERÍSTICA DA CADEIA LATERAL: SUBSTITUIÇÃO DE RESÍDUOS DE AMINOÁCIDOS

[258] Alifática: G A P

[259] Não polar: I L V

[260] Polar - descarregada: C S T M N Q

[261] Polar - carregada: D E K

[262] Aromática: H F W Y

[263] Outro: N Q D E

[264] Alternativamente, os aminoácidos conservativos podem ser conforme descritos na Tabela Y. Vide Lehninger, [Biochemistry, segunda edição; Worth Publishers, Inc. NY, NY (1975), pp.71-77].

TABELA Y: SUBSTITUIÇÕES CONSERVATIVAS II

[265] CARACTERÍSTICA DA CADEIA LATERAL: AMINOÁCIDO

[266] Não polar (hidrofóbica)

[267] Alifática: A L I V P

[268] Aromática: F W

[269] Contendo enxofre: M

[270] No limite: G

[271] Polar descarregada

[272] Hidroxila: S T Y

[273] Amidas: N Q

[274] Sulfidrila: C

[275] No limite: G

[276] Carregada positivamente (Bases): K R H

[277] Carregada negativamente (Ácidos): D E

[278] Ainda como outra alternativa, as substituições conservativas exemplares podem ser descritas como:

SUBSTITUIÇÕES CONSERVATIVAS III RESÍDUOS ORIGINAIS: RESÍDUOS DE SUBSTITUIÇÃO EXEMPLARES

[279] Ala (A) : Val, Leu, He

[280] Arg (R) : Lis, Gin, Asn

[281] Asn (N) : Gin, His, Lis, Arg

[282] Asp (D) : Glu

[283] Cis (C) : Ser

[284] Gin (Q) : Asn

[285] Glu (E) : Asp

[286] His (H) : Asn, Gin, Lis, Arg lie (I) Leu, Val, Met, Ala, Fen,

[287] Leu (L) : He, Val, Met, Ala, Fen

[288] Lis (K) : Arg, Gin, Asn

[289] Met (M) : Leu, Fen, lie

[290] Fen (F) : Leu, Val, lie, Ala

[291] Pro (P) : Gli

[292] Ser (S) : Tre

[293] Tre (T): Ser

[294] Trp (W): Tir

[295] Tir (Y): Trp, Fen, Tre, Ser

[296] Val (V): He, Leu, Met, Fen, Ala

[297] Um homólogo variante também pode ser obtido por PCR degenerada, utilizando iniciadores projetados para sequências alvo que codificam sequências de aminoácidos conservativos dentro das sequências da presente divulgação. Em geral, os homólogos compreenderão sequências conservativas que codificam domínios funcionais importantes, locais ativos, ect, das sequências fornecidas no presente documento.

[298] Sequências conservadas fornecidas pela presente divulgação podem ser previstas, por exemplo, alinhando as sequências de aminoácidos de vários homólogos variantes. Para construção e refinação de múltiplos alinhamentos de sequência para identificar domínios funcionais conservados, você pode utilizar um software de computador, por exemplo, o PileUp, SeqLab e o conjunto de programa GCG-Wisconsin.

[299] Por exemplo, a atividade de fosfolipase pode ser medida pelo fornecimento de um substrato de fosfolipase e pela detecção de uma diminuição na quantidade de substrato (por exemplo, como um óleo compreendendo fosfolipídeos) ou aumento na quantidade de um produto de reação, em paralelo com controles adequados experimentais.

[300] Da mesma forma, a atividade de aciltransferase lipídica pode ser medida pelo fornecimento de um substrato de aciltransferase lipídica (por exemplo, como o colesterol) e detecção de um aumento na quantidade de substrato ou diminuição na quantidade de um produto de reação.

PORCENTAGEM DE SEMELHANÇA OU IDENTIDADE DE SEQUÊNCIA

[301] Cálculos de identidade de sequência podem ser realizados manualmente, ou, mais geralmente, com o auxílio de programas de comparação de sequências disponíveis publicamente. Estes programas de computador disponíveis comercialmente podem calcular a porcentagem da identidade de sequência ou a porcentagem da semelhança de sequência (ou seja, resíduos de aminoácidos tendo propriedades/funções químicas similares) entre duas ou mais sequências.

[302] A porcentagem da identidade de sequência ou a porcentagem de semelhança da sequência pode ser calculada sobre sequências contíguas, ou seja, uma sequência está alinhada com outra sequência e cada aminoácido em uma sequência é comparado diretamente com o aminoácido correspondente na outra sequência, um resíduo de cada vez. Isto é chamado de alinhamento "sem lacunas". Normalmente, tais alinhamentos sem lacunas são executados apenas sobre um número relativamente pequeno de resíduos.

[303] O grau de identidade de polipeptídeo, no que se refere uma sequência, pode ser determinado sobre a sequência de todo aminoácido. Apropriadamente, o grau de porcentagem da identidade de sequência ou a porcentagem de semelhança da sequência no que se refere uma sequência de polipeptídeo é determinado em, pelo menos, 20 aminoácidos contíguos, pelo menos, 30 aminoácidos contíguos, 40 aminoácidos contíguos, 50 aminoácidos contíguos, 60 aminoácidos contíguos ou, pelo menos, 100 aminoácidos contíguos.

[304] O grau de identidade dos polinucleotídeos, no que se refere uma sequência, pode ser determinado sobre a sequência de nucleotídeos toda. Apropriadamente, o grau de porcentagem da sequência de identidade ou a porcentagem de similaridade da sequência, no que se refere uma sequência de nucleotídeos é determinado ao longo de, pelo menos, 20 nucleotídeos contíguos, preferencialmente ao longo de, pelo menos, 30 nucleotídeos contíguos, preferencialmente, pelo menos, 40 nucleotídeos contíguos, preferencialmente ao longo de, pelo menos, 50 nucleotídeos contíguos, preferencialmente ao longo de, pelo menos, 60 nucleotídeos contíguos, preferencialmente ao longo de, pelo menos, 100 nucleotídeos contíguos.

[305] O cálculo de porcentagem máxima da identidade de sequência ou a porcentagem de semelhança da sequência entre duas ou mais sequências pode muitas vezes exigir um alinhamento ideal entre as sequências. Tal alinhamento, em geral, exige consideração de penalidades para lacunas. Depois que o software de computador produzir o alinhamento mais ideal, então se deve calcular a porcentagem de identidade de sequência ou a porcentagem de semelhança da sequência.

[306] Exemplos de programa de computador para efetuar tais alinhamentos ideais incluem, entre outros, BLAST (vide Ausubel et al. 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4a Ed - Capítulo 18), e FASTA (Altschul et al. 1990 J. Mol. Biol. 403-410) ou programas disponíveis comercialmente, como Vector NTI (Life Technologies) com base em um algoritmo, análogo ao CLUSTAL (Higgins D G & Sharp P M (1988), Gene 73(1), 237-244), ou semelhantes.

[307] Normalmente, estes programas permitirão que um usuário permita que as penalidades para lacunas sejam modificadas. Dependendo da complexidade específica, do comprimento ou do número de sequências sendo alinhadas, será preferível usar os valores padrão ao utilizar tais programas de software.

[308] Quando o programa de computador fornece uma consideração para "penalidade da lacuna", ele irá produzir um alinhamento com tão pouca lacuna quanto possível — refletindo o maior parentesco entre as duas sequências comparadas — e como um resultado, conseguirá uma pontuação mais elevada em comparação a um método de alinhamento que produz muitas lacunas.

[309] "Custos para lacunas afim" são normalmente utilizados, de forma que cobram um custo relativamente alto para a existência de uma lacuna e uma penalidade menor para cada resíduo subsequente na lacuna. Este é o sistema de pontuação de lacunas mais comumente utilizado. Penalidades de lacunas altas irão, obviamente, produzir alinhamentos otimizados com menos lacunas.

ESTABILIZADORES

[310] Uma enzima isolada do polipeptídeo ou uma mistura enzimática é frequentemente instável quando não estiver em seu ambiente celular nativo. Se não forem mantidas certas condições de tamponamento, o polipeptídeo isolado pode não funcionar corretamente ou pode perder atividade como resultado de condições de proteólise, agregação e tamponamento não ideal. As condições ideais para o armazenamento são distintas para cada proteína.

[311] Em alguns aspectos, a enzima do polipeptídeo isolado da presente divulgação pode compreender, ainda, um ou mais reagente(s) de estabilização que protege(m) as proteínas, compreendendo a mistura de estresses ambientais que, caso contrário, poderiam chegar à inativação da enzima, agregação e danos por congelamento/descongelamento.

[312] Um exemplo de aditivo que pode ser utilizado com as enzimas de polipeptídeo isolado ou as misturas enzimáticas da presente divulgação pode incluir, mas não está limitado a: Uma solução de Coquetel Estabilizador de Proteína para estender a vida útil para armazenamento a 4°C ou -20°C. Crioprotetores como o glicerol ou etileno glicol em uma concentração final de aproximadamente 25 a 50% ajudam a estabilizar as proteínas, impedindo a formação de cristais de gelo a -20°C. Inibidores da protease evitam a clivagem proteolítica de ligações dissulfeto de proteínas dentro de uma estrutura de proteína. Agentes antimicrobianos como azida sódica (NaN3) em uma concentração final de aproximadamente 0,02 a 0,05% (p/v) ou timerosal em uma concentração final de aproximadamente 0,01% (p/v) inibem o crescimento microbiano. Metais quelantes como o EDTA em um intervalo de concentração final de aproximadamente 1 a 5mm evitam a oxidação induzida do metal de grupos -SH e ajudam a manter a proteína em um estado reduzido. Agentes de redução como o ditiotreitol (DTT | dithiothreitol) e 2-mercaptoetanol (2-ME | 2-mercaptoethanol) em concentração final de 1 a 5mm também ajudam a manter a proteína no estado reduzido, impedindo a oxidação dos resíduos de cisteína.

[313] Exemplos de reagentes de estabilização que podem ser utilizados com as enzimas do polipeptídeo isolado ou com as misturas enzimáticas da presente divulgação podem incluir, entre outros: pode compreender, por exemplo, glicerol, etilenoglicol, trealose, glucosilglicerol e glucosilglicerato, azida sódica e mercúrio. Reagentes de estabilização adequados também podem compreender reagentes de estabilização comercialmente disponíveis, tais como, Coqueteis de Estabilização como um Coquetel de Estabilização de Proteinas (Pierce) Etilenoglicol (Pierce), Estabilizador conjugado com Peroxidase SuperFreeze™ (Pierce), Estabilizador/Diluente Protetor conjugado com Peroxidase (Pierce), Conjunto de Coquetel Inibidor de Protease Halt™ com EDTA (Pierce), Coquetel Inibidor de Protease Halt™ livre de EDTA (Pierce), PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonil) (Pierce), Coquetel Termo Cientifico Estabilizador de Proteína (Life technologies), COMPLETE e PHOSSTOP (Roche), e outros estabilizadores de proteínas conhecidos ou novos na técnica.

[314] Neste processo, a referida aciltransferase lipídica é um estabilizador enzimático de outras enzimas e produz um aumento do tempo de meia-vida de outros componentes da mistura enzimática, particularmente, a aciltransferase lipídica aumenta o tempo de meia- vida dos polipeptídeos que tem atividade de fosfolipase específica de fosfatidilinositol, uma atividade de fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina.

[315] Os inventores da presente invenção surpreendentemente descobriram que uma aciltransferase lipídica atua como um estabilizador enzimático. Isso significa que este estabilizador enzimático mantém de 80 a 90% do nível de atividade das enzimas de PLC por, pelo menos, um ano de armazenamento em solução aquosa e também mantém a atividade de PLC em óleo acima de 80% da atividade inicial por, pelo menos, 6 horas. Preferencialmente, para esta invenção, o referido estabilizador enzimático é uma aciltransferase lipídicaa do Aeromonas enteropelogenes. O estabilizador enzimático estabiliza outras enzimas e produz um aumento do tempo de meia-vida dos outros componentes da mistura enzimática, particularmente, a aciltransferase lipídica aumenta o tempo de meia-vida dos polipeptídeos que tem atividade de fosfolipase específica de fosfatidilinositol e atividade de fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina.

G. MISTURAS ENZIMÁTICAS

[316] A presente divulgação fornece inúmeras composições da mistura enzimática, compreendendo uma enzima isolada do polipeptídeo conforme fornecido no presente documento. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece a mistura enzimática, caracterizado pelas enzimas do polipeptídeo serem fornecidas de uma fonte comercial. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece a mistura enzimática, compreendendo uma combinação de uma enzima de polipeptídeo comercialmente disponível e a enzima do polipeptídeo isolado fornecida no presente documento.

[317] A presente divulgação fornece enzimas isoladas e misturas a serem armazenadas e enviadas ao consumidor, que está na indústria de processamento e refinamento de óleo. Conforme os especialistas na técnica apreciarão, as misturas enzimáticas da presente divulgação podem compreender, ainda, um estabilizador reagente ou um aditivo.

[318] A presente divulgação prevê uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol (PI- PLC) e uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina (PC/PE-PLC).

[319] A presente divulgação prevê uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol (PI- PLC), uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina (PC/PE-PLC) e uma aciltransferase lipídica (LAT).

[320] A presente divulgação prevê uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol (PI- PLC), uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina (PC/PE-PLC) e uma aciltransferase lipídica (LAT), caracterizado pela mistura enzimática não compreender uma fosfolipase A (PLA). Em alguns aspectos, a aciltransferase lipídica é um polipeptídeo, tendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 6, 7, 8, 9 ou 10. Em alguns aspectos, a aciltransferase lipídica produz lisofosfolipídeos e acilesterol quando reagindo com um óleo bruto.

[321] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%,41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 6. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[322] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%,41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 2, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 6. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[323] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 3, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 6. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[324] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 4, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as sequências de aminoácidos da ID. SEQ. N° 6. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[325] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 7. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[326] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 2, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 7. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[327] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 3, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 7. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[328] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 4, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 7. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[329] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%,41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 8. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[330] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 2, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 8. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[331] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 3, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, least 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 8. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[332] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% , 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 4, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 8. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[333] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% , 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as sequências de aminoácidos da ID. SEQ. N° 9. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[334] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% , 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 2, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% , 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 9. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[335] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% , 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 3, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% , 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 9. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[336] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% , 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 4, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as sequências de aminoácidos da ID. SEQ. N° 9. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[337] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% , 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% , 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 10. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[338] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% , 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 2, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% , 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 10. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[339] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% , 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 3, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% , 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 10. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[340] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% , 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 4, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as sequências de aminoácidos da ID. SEQ. N° 10. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[341] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 6. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[342] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 2, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 6. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[343] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 3, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 6. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[344] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 4, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 6. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[345] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 7. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[346] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 2, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 7. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[347] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 3, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 7. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[348] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 4, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 7. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[349] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 8. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[350] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 2, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 8. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[351] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 3, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 8. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[352] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 4, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 8. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[353] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 9. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[354] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 2, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 9. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[355] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 3, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 9. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[356] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 4, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 9. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[357] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 10. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[358] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 2, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 10. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[359] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 3, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 10. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[360] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática, compreendendo: uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 4, uma fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e uma aciltransferase lipídica, caracterizado pela aciltransferase lipídica ter, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 10. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[361] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática para degomagem de óleo, compreendendo: um polipeptídeo com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1 e um polipeptídeo com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N°5. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[362] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática para degomagem de óleo, compreendendo: um polipeptídeo com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 2 e um polipeptídeo com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[363] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática para degomagem de óleo, compreendendo: um polipeptídeo com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 3 e um polipeptídeo com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[364] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática para degomagem de óleo, compreendendo: um polipeptídeo com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 4 e um polipeptídeo com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[365] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática para degomagem de óleo, compreendendo: um polipeptídeo com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e um polipeptídeo com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 6. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[366] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática para degomagem de óleo, compreendendo: um polipeptídeo com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e um polipeptídeo com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 7, caracterizado pela mistura enzimática não compreender uma fosfolipase A.

[367] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática para degomagem de óleo, compreendendo: um polipeptídeo com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e um polipeptídeo com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 8. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[368] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática para degomagem de óleo, compreendendo: um polipeptídeo com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e um polipeptídeo com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 9. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[369] A presente divulgação fornece uma mistura enzimática para degomagem de óleo, compreendendo: um polipeptídeo com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5 e um polipeptídeo com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 10. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

PEDIDOS DE MISTURAS ENZIMÁTICAS

[370] Em alguns aspectos, a mistura enzimática ou polipeptídeo isolado, conforme fornecido no presente documento, é utilizada(o) para a refinação de óleo de composições oleosas. A mistura enzimática ou polipeptídeo isolado, conforme fornecido no presente documento, pode ser incorporado(a) em um processo de refinação de óleo químico ou físico.

[371] Em alguns aspectos, a mistura enzimática ou polipeptídeo isolado fornecido(s) no presente documento é utilizado(a) para refinação de óleo de um óleo comestível. Em alguns aspectos, a mistura enzimática ou polipeptídeo isolado, conforme fornecido no presente documento, é utilizada(o) para refinação de óleo de um biocombustível bruto. Em alguns aspectos, a mistura enzimática pode hidrolisar mais de 80% (p/p) dos fosfolipídeos no óleo comestível em diacilglicerol e éster fosfato, quando utilizada para refinação oleosa de um óleo. Em alguns aspectos, a mistura enzimática pode aumentar a produção de óleo em, pelo menos, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20%, em comparação a um processo de degomagem não enzimático, quando utilizada para refinação oleosa de um óleo. Em alguns aspectos, a mistura enzimática pode aumentar a produção de óleo em, pelo menos, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% em comparação a um processo de degomagem não enzimático, quando utilizada para refinação oleosa de um óleo. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não aumenta o teor de ácidos graxos livres na composição oleosa quando utilizada para refinação oleosa de um óleo. Em alguns aspectos, a mistura enzimática da fosfolipase específica de fosfatidilinositol e da fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina é mantida em um nível de atividade de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou 95% quando utilizada para refinação oleosa de um óleo. Em alguns aspectos, a mistura enzimática da fosfolipase específica de fosfatidilinositol e da fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina é mantida em um nível de atividade em um intervalo de 70% a 75%, 70% a 80%, 75% a 80%, 80% a 85%, 80% a 90%, 90% a 95%, quando utilizada para refinação oleosa de um óleo. Em alguns aspectos, a fosfolipase específica de fosfatidilinositol ou a fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina da mistura enzimática tem uma atividade mais elevada em comparação a um processo de degomagem de um óleo enzimático sem aciltransferase lipídica, quando utilizada para refinação oleosa de um óleo. Em algum aspecto, os efeitos acima são realizados, caracterizado pela enzima de aciltransferase lipídica fornecida na mistura enzimática ser um décimo da concentração recomendada para um processo de degomagem de óleo enzimático com uma atividade de aciltransferase lipídica.

[372] Em alguns aspectos, a mistura enzimática ou polipeptídeo isolado, conforme fornecido no presente documento, é utilizada(o) para um processo de degomagem de óleo de um óleo bruto. Em alguns aspectos, a mistura enzimática ou polipeptídeo isolado, conforme fornecido no presente documento, é utilizada(o) para um processo de degomagem oleoso de um óleo comestível. Em alguns aspectos, a mistura enzimática ou polipeptídeo isolado, conforme fornecido no presente documento, é utilizada(o) para um processo de degomagem de óleo de um biocombustível.

[373] A presente divulgação fornece um óleo para um produto de consumo, compreendendo quantidades detectáveis de um polipeptídeo com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1,2, 3 ou 4. Em alguns aspectos, o produto de consumo é um alimento, um cosmético ou um combustível para um veículo. Em alguns aspectos, o óleo não compreende quantidades detectáveis de uma fosfolipase A.

[374] A presente divulgação fornece um óleo para um produto de consumo, compreendendo quantidades detectáveis de um polipeptídeo com, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em alguns aspectos, o produto de consumo é um alimento, um cosmético ou um combustível para um veículo. Em alguns aspectos, o óleo não compreende quantidades detectáveis de uma fosfolipase A.

H. MISTURAS DE ÓLEO

[375] A presente divulgação fornece uma mistura de óleo, compreendendo: um óleo bruto, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C e uma aciltransferase lipídica. Em algumas aplicações, a mistura de óleo não compreende uma fosfolipase A. Em algumas aplicações, a mistura de óleo pode, ainda, compreender uma fosfolipase C.

[376] Em alguns aspectos, a mistura do óleo compreende um óleo comestível. Em certos aspectos, a mistura de óleo comestível compreende: um óleo de soja, um óleo de colza, um óleo de semente de girassol, um óleo de farelo de arroz, um óleo de palmeira, um óleo de sésamo, um óleo de amendoim, um óleo de açaí, um óleo de amêndoas, um óleo de babaçu, um óleo de semente de groselha, um óleo de semente de borragem, um óleo de canola, um óleo de caju, um óleo de rícino, um óleo de coco, um óleo de coentro, um óleo de milho, um óleo de semente de algodão, um óleo de crambe, um óleo de semente de linho, um óleo de semente de uva, um óleo de avelã, outros óleos de nozes, um óleo de cânhamo, um óleo de pinhão-manso, um óleo de jojoba, um óleo de linhaça, um óleo de macadâmia, um óleo de semente de manga, um óleo de espuma do prado, um óleo de mostarda, um óleo de mocotó, um azeite de oliva, um óleo de dendê, um óleo de palmiste, um óleo de oleína da palmeira, um óleo de noz-pecã, um óleo de pinhão, um óleo de pistache, um óleo de semente de papoula, um óleo de canola, um óleo de farelo de arroz, um óleo de cártamo, um óleo de sasanqua, um óleo de manteiga de karité, um óleo de resina do pinheiro, um óleo de tsubaki, um óleo de noz ou qualquer combinação respectiva.

[377] Em alguns aspectos, o óleo da mistura compreende um biocombustível. Em certos aspectos, a mistura de óleo biocombustível compreende: um óleo de milho, um óleo vegetal, um óleo de Neochloris oleoabundans, um óleo de Scenedesmus dimorphus, um óleo de Euglena gracilis, um óleo de Phaeodactylum tricornutum, um óleo de Pleurochrysis carterae, um óleo de Prymnesium parvum, um óleo de Tetraselmis chui, um óleo de Tetraselmis suecica, um óleo de Isochrysis galbana, um óleo de Nannochloropsis salina, um óleo de Botryococcus braunii, um óleo de Dunaliella tertiolecta, um óleo de Nannochloris species, um óleo de Spirulina species, um óleo de Chlorophycease, um óleo de Bacilliarophy ou uma combinação respectiva.

[378] O óleo bruto na mistura de óleo pode ser um óleo completamente bruto, um óleo parcialmente bruto, um óleo parcialmente refinado ou um óleo substancialmente refinado. O óleo completamente bruto pode ser fornecido a partir de um óleo bruto A convencional e pode incluir o óleo que foi submetido a algum processo ou pré-tratamento.

[379] A presente divulgação fornece uma mistura de óleo bruto, compreendendo: um óleo bruto e uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, e uma aciltransferase lipídica, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 6. Em algumas aplicações, a mistura de óleo pode compreender, ainda, uma fosfolipase C. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[380] A presente divulgação fornece uma mistura de óleo bruto, compreendendo: um óleo bruto, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 2 e uma aciltransferase lipídica, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 6. Em algumas aplicações, a mistura de óleo pode compreender, ainda, uma fosfolipase A, uma fosfolipase B, uma fosfolipase C ou uma fosfolipase D. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[381] A presente divulgação fornece uma mistura de óleo bruto, compreendendo: um óleo bruto, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 3 e uma aciltransferase lipídica, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 6. Em algumas aplicações, a mistura de óleo pode compreender, ainda, uma fosfolipase A, uma fosfolipase B, uma fosfolipase C ou uma fosfolipase D. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[382] A presente divulgação fornece uma mistura de óleo bruto, compreendendo: um óleo bruto, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 4, e uma aciltransferase lipídica, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID SEQ. N° 6. Em algumas aplicações, a mistura oleosa pode compreender, ainda, uma fosfolipase C. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[383] A presente divulgação fornece uma mistura de óleo bruto, compreendendo: uma composição oleosa, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1, e uma aciltransferase lipídica, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 7. Em algumas aplicações, a mistura de óleo pode compreender, ainda, uma fosfolipase A, uma fosfolipase B, uma fosfolipase C ou uma fosfolipase D. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[384] A presente divulgação fornece uma mistura de óleo bruto, compreendendo: uma composição oleosa, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 2, e uma aciltransferase lipídica, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 7. Em algumas aplicações, a mistura de óleo pode compreender, ainda, uma fosfolipase A, uma fosfolipase B, uma fosfolipase C ou uma fosfolipase D. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[385] A presente divulgação fornece uma mistura da composição oleosa, compreendendo: um óleo bruto, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 3 e uma aciltransferase lipídica, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 7. Em algumas aplicações, a mistura de óleo pode compreender, ainda, uma fosfolipase A, uma fosfolipase B, uma fosfolipase C ou uma fosfolipase D. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[386] A presente divulgação fornece uma mistura da composição oleosa, compreendendo: uma composição oleosa, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 4 e uma aciltransferase lipídica, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID SEQ. N° 7. Em algumas aplicações, a mistura de óleo pode compreender, ainda, uma fosfolipase A, uma fosfolipase B, uma fosfolipase C ou uma fosfolipase D. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[387] A presente divulgação fornece uma mistura da composição oleosa, compreendendo: um óleo bruto, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1 e uma aciltransferase lipídica, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 8. Em algumas aplicações, a mistura de óleo pode compreender, ainda, uma fosfolipase A, uma fosfolipase B, uma fosfolipase C ou uma fosfolipase D. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[388] A presente divulgação fornece uma mistura de óleo bruto, compreendendo: um óleo bruto, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 2 e uma aciltransferase lipídica, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 8. Em algumas aplicações, a mistura de óleo pode compreender, ainda, uma fosfolipase A, uma fosfolipase B, uma fosfolipase C ou uma fosfolipase D. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[389] A presente divulgação fornece uma mistura de óleo bruto, compreendendo: um óleo bruto, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 3 e uma aciltransferase lipídica, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as sequências de aminoácidos da ID. SEQ. N° 8. Em algumas aplicações, a mistura de óleo pode compreender, ainda, uma fosfolipase A, uma fosfolipase B, uma fosfolipase C ou uma fosfolipase D. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[390] A presente divulgação fornece uma mistura de óleo bruto, compreendendo: um óleo bruto, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 4 e uma aciltransferase lipídica, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID SEQ. N° 8. Em algumas aplicações, a mistura oleosa pode compreender, ainda, uma fosfolipase C. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[391] A presente divulgação fornece uma mistura de óleo bruto, compreendendo: um óleo bruto, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1 e uma aciltransferase lipídica, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 9. Em algumas aplicações, a mistura oleosa pode compreender, ainda, uma fosfolipase C. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[392] A presente divulgação fornece uma mistura de óleo bruto, compreendendo: uma composição oleosa, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 2 e uma aciltransferase lipídica, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 9. Em algumas aplicações, a mistura oleosa pode compreender, ainda, uma fosfolipase C. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[393] A presente divulgação fornece uma mistura da composição oleosa, compreendendo: um óleo bruto, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 3 e uma aciltransferase lipídica, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 9. Em algumas aplicações, a mistura oleosa pode compreender, ainda, uma fosfolipase C. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[394] A presente divulgação fornece uma mistura da composição oleosa, compreendendo: um óleo bruto, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 4 e uma aciltransferase lipídica, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 9. Em algumas aplicações, a mistura oleosa pode compreender, ainda, uma fosfolipase C. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[395] A presente divulgação fornece uma mistura da composição oleosa, compreendendo: um óleo bruto, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 1 e uma aciltransferase lipídica, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 10. Em algumas aplicações, a mistura oleosa pode compreender, ainda, uma fosfolipase C. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[396] A presente divulgação fornece uma mistura de óleo bruto, compreendendo: um óleo bruto, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 2 e uma aciltransferase lipídica, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 10. Em algumas aplicações, a mistura oleosa pode compreender, ainda, uma fosfolipase C. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[397] A presente divulgação fornece uma mistura de óleo bruto, compreendendo: um óleo bruto, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 3, e uma aciltransferase lipídica, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 10. Em algumas aplicações, a mistura oleosa pode compreender, ainda, uma fosfolipase C. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

[398] A presente divulgação fornece uma mistura de óleo bruto, compreendendo: um óleo bruto, uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol C que compreende, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 4 e uma aciltransferase lipídica, compreendendo, pelo menos, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ID. SEQ. N° 10. Em algumas aplicações, a mistura oleosa pode compreender, ainda, uma fosfolipase C. Em alguns aspectos, a mistura enzimática não compreende uma fosfolipase A.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: PRODUÇÃO DE ENZIMAS

[399] Este exemplo descreve métodos para a produção e isolamento do polipeptídeo e enzimas fornecidos pela presente divulgação.

[400] Uma célula hospedeira com expressão recombinante (por exemplo, GMO) pode ser gerada para expressar uma ou mais cópia(s) das proteínas exemplares da ID. SEQ. N° 1 a 10 da presente divulgação ou uma combinação respectiva, utilizando o protocolo descrito abaixo.

[401] Resumidamente, as sequências de codificação da proteína podem ser clonadas em um vetor de expressão. Os genes podem estar em um vetor, em múltiplos vetores ou como um cassete de expressão do DNA. Os genes podem ser inseridos no genoma da célula hospedeira com expressão utilizando qualquer método conhecido na técnica.

[402] Em aplicações onde um vetor é utilizado, o vetor de expressão pode ser transformado ou transfectado em uma célula hospedeira. Os vetores podem ser transformados em uma célula hospedeira individualmente ou cotransformados dependendo da aplicação.

[403] A cepa de expressão da célula hospedeira ou GMO pode ser construída utilizando qualquer microrganismo procariótico, eucariótico, de levedura, de fungo, de inseto, como, por exemplo, o E. coli, outras bactérias gram-negativas, bactérias gram-positivas ou outros sistemas de expressão de proteínas conhecidos na técnica e conforme fornecido no presente documento.

[404] Dependendo do número de cópias de cada gene e do tipo de promotor, a célula hospedeira ou o GMO pode ser projetado para expressar diferentes proporções de cada enzima para que sejam produzidas na proporção desejada.

[405] A célula hospedeira é, então, cultivada nos meios adequados e nas condições que permitam o cultivo e a reprodução da célula hospedeira.

[406] Finalmente, as enzimas expressadas da célula hospedeira ou GMO podem ser isoladas do caldo de cultura utilizando qualquer método conhecido por aqueles especialistas na técnica.

[407] Por último, as proteínas purificadas do caldo podem ser armazenadas em um tampão de armazenamento e condições adequados para manter sua atividade enzimática desejada.

PROTOCOLO EXEMPLAR PARA E. COLI

[408] Uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da presente divulgação é clonada nos locais NdeI-EcoRI do plasmídeo pET24b (Novagen, EUA).

[409] O plasmídeo resultante é transformado por eletroporação na cepa BL21AI de E. coli e colônias selecionadas em placas LBA contendo 50 mg/L de canamicina.

[410] Uma colônia do clone recombinante é cultivada em 100 ml de LB a 37°C até que a densidade celular atinja um OD600=2.

[411] A cultura obtida acima é transferida para um fermentador de semente contendo 10 litros (L) do meio HM (descrito abaixo) e cultivada por 10 horas a 35°C.

[412] A cultura é transferida para um fermentador de 1000L contendo 600 L do meio HM e cultivada a 35°C até a exaustão de glicerol. Uma alimentação exponencial de uma solução nutriente contendo 80% p/v de glicerol e 20 g/L de MgSO4 é iniciada em seguida em uma taxa suficiente para manter a taxa de cultivo específica em um valor de 0,35 h-1± 0,05. Quando OD600 atinge um valor de 80, 1 mM, IPTG é adicionada e a solução nutriente é alimentada a uma taxa constante de 9 ± 1 L/h por 10 h. A concentração de oxigênio dissolvido é mantida acima de 30% de saturação por enriquecimento do fluxo de ar com oxigênio puro, quando necessário. O pH é mantido em um pH 7 pela adição de NH4OH.

[413] No final do método de fermentação, o caldo é tratado com três ciclos de compressão/descompressão a 1000 bar em um homogeneizador APV para romper as células de E. coli.

[414] O líquido resultante é centrifugado até clarificação para separar materiais sólidos em uma centrífuga destilada a 5000 g.

[415] (NH4)2SO4 é adicionado a 80% de saturação do líquido clarificado, a mistura é incubada a 8°C por 3 horas e centrifugada em uma centrífuga destilada a 5000 g.

[416] Cuidadosamente, decante o sobrenadante do grânulo. Um grânulo de pasta marrom, compreendendo a enzima é suspenso novamente em um tampão apropriado.

EXEMPLO 2: PRODUÇÃO DE FOSFOLIPASE ESPECÍFICA DE FOSFATIDILINOSITOL (PI-PLC) PRODUÇÃO DE SEQUÊNCIA DE DNA OTIMIZADA COM CÓDON DA FOSFOLIPASE ESPECÍFICA DE FOSFATIDILINOSITOL (PI-PLC)

[417] Genes da fosfolipase específica de fosfatidilinositol (PI-PLC) foram selecionados a partir de Aspergillus flavus (ID. SEQ. N° 4); Lysinibacillus sphaericus (ID. SEQ. N° 1); Streptomyces antibioticus (ID. SEQ. N° 2); e Enterococcus faecalis (ID. SEQ. N° 3), todas os quais tendo sequências conservadas de aminoácidos catalíticos. Com exceção da A. flavus, prevê-se que todas estas proteínas sejam secretadas com uma sequência de sinal do N-terminal a partir do sistema Sec, conforme determinado pelo software Phobius software (http://phobius.sbc.su.se/). Portanto, as proteínas maduras previstas foram transladadas de forma reversa e otimizadas por códon para sua expressão na E. coli, utilizando um algoritmo de randomização de códon (Menzella, 2011). As sequências resultantes (ID. SEQ. N°: ID. SEQ. N° 11, ID. SEQ. N° 12, ID. SEQ. N° 13 e ID. SEQ. N° 14)), foram sintetizadas e clonadas nos plasmídeos da expressão sob o controle do promotor BAD para analise de sua expressão e atividade.

[418] Para determinar se as construções expressam as proteínas de PI-PLC correspondentes em uma forma solúvel, os vetores de expressão foram transformados na cepa BL21(AI) de E. coli para testes de expressão e as frações solúveis e insolúveis do lisado celular induzido foram analisadas por SDS-PAGE.

[419] As cepas carregando o plasmídeo de expressão diferente foram cultivadas durante a noite na LB. Uma diluição de 100 vezes das culturas foi feita no mesmo meio e incubada com agitação a 37°C. Quando OD600 atingiu 0,5, as culturas foram induzidas com 0,4 g/L de L- arabinose (Royal Cosun, Países Baixos) por 6h s 30°C. As células e o sobrenadante da cultura foram separados por centrifugação. Os grânulos das células foram ressuspensos no tampão com 10 mM de HEPES, pH de 7,0 e 100 mM de NaCl a uma OD600 final de 4 e interrompidos em gelo num Processador Ultrassônico 600 GEX. Os extratos de células foram centrifugados, analisados por SDS-PAGE em géis a 12% com mancha por Azul Brilhante de Coomassie e quantificados por densitometria utilizando um digitalizador e albumina de soro bovino (BSA, Sigma) como padrão. Um software de ImageJ foi utilizado para realizar a quantificação das imagens digitalizadas (Figura 1).

[420] Para enzimas mais industriais, o custo de fabricação é um fator crítico e os níveis de expressão das proteínas são desejáveis. Conforme mostrado na Figura 5, os níveis de expressão da PI-PLC em L. sphaericus (ID. SEQ. N° 1) são 2,46 vezes maiores que na PI-PLC de Bacillus cereus, determinados pela densitometria. Uma vez que ambas as enzimas foram igualmente eficientes na remoção de gomas do óleo bruto quando utilizadas em concentração semelhante (Figura 3), a PI-PLC em L. sphaericus fornece uma vantagem para o desenvolvimento de um processo de produção rentável.

b- PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA CELULAR COM ALTA DENSIDADE

[421] Uma cultura de sementes da cepa BL21(AI) de E. coli, abrigando pKCN233(pBAD::pi-PLClsphaericus) foi preparada em um frasco de 1 litro de Erlenmeyer, contendo 0,1 l do meio LB cultivado a 37°C e 200 rpm em uma incubadora de agitação. Canamicina foi adicionada a uma concentração de 50 mg por l-1 para manter a estabilidade do plasmídeo.

[422] A fermentação do lote alimentado descontinuamente foi efetuada em um meio com 3L ou 20L (New Brunswick Bio Flo 115 e Bio Flo 415, EUA) contendo 1 ou 12 L de um meio de HM semi definido (Menzella et al., 2003). A temperatura, a agitação e o pH foram mantidos em 37°C, 1200 rpm e 7 (pela adição de 25% de NH4OH), respectivamente. O nível de oxigênio dissolvido foi controlado em 30% de saturação do ar pela alteração da porcentagem de oxigênio puro, quando necessário. O processo de alimentação foi iniciado quando o glicerol presente no meio foi esgotado. Uma solução contendo 800 g por l-1 de glicerol e 20 g por l-1 de MgSO4^7H2O foi adicionada em um trajeto variável, de acordo com a taxa de alimentação (F, ml h-1) determinada pela equação 1 (Lee, 1996) a fim de manter a taxa de cultivo específica de 0,25 h-1.

[423] X0 é a concentração de biomassa (g l-1) quando a alimentação é iniciada, Vo é o volume inicial (l), μ é a taxa de cultivo específica desejada (h-1), S0 é a concentração de glicose na solução de alimentação (g l-1) e YX/S é a produção de substrato.

[424] A expressão do gene da PI-PLC foi induzida quando a OD600 atingiu 100 através da adição do indutor de baixo custo L- arabinose em uma concentração final de 0,4 g por l-1. Depois disso, a taxa de alimentação foi mantida em 10 ml por h-1.

[425] Após o processo de fermentação, a cultura celular foi refrigerada e passou duas vezes através de um homogeneizador de alta pressão em a 1000 bars (GEA Niro Soavi, Panda Plus 2000). Os resíduos da célula foram separados por centrifugação a 10000 rpm durante 30 minutos em uma centrífuga de fluxo contínuo (GEA Westfalia Separator FSD 1-06-107). A Figura 6 mostra que a expressão de PI- PLC em L. sphaericus no ponto de indução foi de aproximadamente 3,5 g por l-1, como consequência do vazamento do promotor e sua produção aumentou continuamente até uma concentração máxima de 15 g por l- 1, atingida após 12h de indução. Para reduzir ainda mais os custos de fabricação, a produção de L. PI-PLC em L. sphaericus foi testada utilizando glicerol bruto, derivado de plantas de biodiesel como fonte de carbono, obtendo resultados idênticos. O processo foi dimensionado utilizando um biorreator de 20L sem perder a produtividade. Esses resultados estão resumidos na Tabela 2. TABELA 2

[426] No final da execução de fermentação, o caldo é tratado com três ciclos de compressão/descompressão a 1000 bar em um homogeneizador APV para romper as células de E. coli. O líquido resultante é centrifugado até clarificação para separar materiais sólidos em uma centrífuga destilada a 5000 g. (NH4)2SO4 é adicionado a 80% de saturação do líquido clarificado, a mistura é incubada a 8°C por 3 horas e centrifugada em uma centrífuga destilada a 5000 g. O sobrenadante é cuidadosamente decantado do grânulo. O grânulo de pasta marrom contendo a enzima é ressuspenso em um amortecedor apropriado.

EXEMPLO 3: DEGOMAGEM DE ÓLEO ENZIMÁTICO UTILIZANDO PI-PLC. TESTE PARA ATIVIDADE DE FOSFOLIPASE EM UM ÓLEO

[427] Este exemplo ilustra um método para testar um polipeptídeo para atividade específica da fosfolipase C em um óleo ou mistura oleosa utilizando análise comparativa de ressonância magnética nuclear (NMR) e quantificação de fosfato inorgânico.

[428] Uma mistura de reação, compreendendo 3 gramas de óleo bruto que compreende aproximadamente 15 a 45 μg de (ID. SEQ. N° 1 a 4) em 90 μl de tampão, compreendendo 50 mM de Citrato de sódio em um pH a 6,2, 1mM de ZnCl2, foi homogeneizada por aproximadamente 1 min utilizando o homogenizador Ultra-Turrax T8 (IKA).

[429] Em seguida, os tubos contendo a mistura de reação foram incubados a aproximadamente 50°C com agitação constante, utilizando um agitador magnético de estabilidade como o agitador magnético de estabilidade VP 710 (VP-Scientific).

[430] Após 2h de incubação, a 50°C, a atividade de PLC foi determinada conforme segue:

ENSAIO DA ATIVIDADE DE PLC EM UM ÓLEO QUANTIFICAÇÃO DE FOSFATO INORGÂNICO

[431] A atividade de fosfolipase C foi medida com um método sensível, tomando como base a quantificação do fosfato inorgânico. Grupos de cabeças polares (fosfocolina, fosfoetanolamina ou fosfoinositol) a partir de fosfolipídeos hidrolisados em óleo foram recuperados com extração aquosa e hidrolisados pela fosfatase alcalina para gerar o fosfato inorgânico.

[432] O fosfato inorgânico foi determinado utilizando um método de Sumner modificado (Sumner, J. B., Science 1944 196: 413).

[433] Brevemente, uma amostra de 500 μl, contendo de 0,025 a 0,25 μmol de fosfato inorgânico em 5% de TCA foi misturada com 500 μl de reagente de cor (4% de FeSO4, 1% de (NH4)6MoO24.H2O, 3,2% de H2SO4). As leituras espectrofotométricas foram feitas em 700 nm e os micromols de fosfato inorgânico na amostra foram calculados a partir de uma curva padrão.

ANÁLISE DE NMR DO ÓLEO BRUTO E TRATADO POR PLC

[434] Foram realizados experimentos de degomagem de óleo utilizando um tampão como um controle ou tratamento enzimático durante 2h a 50°C, conforme indicado. O óleo tratado foi emulsionado utilizando um homogeneizador Ultra-Turrax T-65 (IKA) por 1 min antes de tomar as amostras de 300 mg para análise posterior. As amostras de óleo foram extraídas com 900 μl de uma solução de NMR (100 mM de Tris-HCl, pH de 10,5, 50 mM de EDTA, 2,5% de desoxicolato de sódio) durante 1h a 37°C com agitação constante e a fase aquosa resultante foi extraída com 600 μl de hexano. Finalmente, 50 μl de D2O foi adicionado à fase aquosa. O perfil dos fosfolipídeo por NMR de 31P foi obtido utilizando um equipamento Bruker 300 Ultrashield. Amostras de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, ácido fosfatídico e fosfatidilinositol foram utilizadas como padrões.

[435] Os resultados mostrados na Figura 3 e 4A mostram a capacidade da PI-PLC em L. sphaericus (ID. SEQ. N° 1) por hidrólise eficiente de fosfatidilinositol PI em uma emulsão de água em óleo a 50°C, condições utilizadas na degomagem de óleo industrial. 10 μg de enzima por grama de óleo bruto foram suficientes para hidrolisar o PI presente no óleo de soja bruto contendo 3% de fosfolipídeos (1200 ppm de fosfato), indicando que o processo de produção de proteínas, com um rendimento de 15g por l-1 é adequado para o desenvolvimento de um produção em escala industrial da proteína. Considerando uma margem de 25% de perda de proteína no processo a jusante, um litro do caldo de fermentação seria suficiente para o tratamento de 1 tonelada de óleo bruto (1000 a 1500 ppm de fosfato), o que torna esta proteína a alternativa mais rentável do setor para aplicação industrial descrita até agora. Observou-se também que as proteínas da ID. SEQ. N° 2 a 4 podem remover quase 100 por cento de PI de um óleo utilizando 10 ug de enzima por g de óleo.

EXEMPLO 4: DEGOMAGEM DE ÓLEO ENZIMÁTICO UTILIZANDO MISTURAS DE PLC

[436] Uma mistura de reação, compreendendo 3 gramas de óleo bruto que compreende aproximadamente 10 μg de (ID. SEQ. N° 1) por g de óleo ou 5 μg de (ID. SEQ. N° 5) por g de óleo ou uma mistura de 10 μg de (ID. SEQ. N° 1) por g de óleo e 5 μg de (ID. SEQ. N° 5) por g de óleo em 90 μl de tampão, compreendendo 50 mM de NaCitrate, pH de 6,2, 1mM de ZnCl2, foi homogeneizada por aproximadamente 1 min utilizando o homogenizador Ultra-Turrax T8 (IKA).

[437] Em seguida, os tubos contendo a mistura de reação foram incubados a aproximadamente 50°C com agitação constante, utilizando um agitador magnético de estabilidade como o agitador magnético de estabilidade VP 710 (VP-Scientific).

[438] Após 2h de incubação a 50°C a atividade de PLC foi determinada pela medição do fosfato inorgânico, conforme descrito acima (Tabela 3).

[439] Observamos que as atividades enzimáticas de PC/PE-PLC, PI-PLC, quando combinadas em uma mistura, não são aditivas. Vide a Figura 4, Tabelas 3 e 4.

[440] A análise por NMR dos fosfolipídios que permanece no óleo após tratamento enzimático mostra hidrólise incompleta de PC, PI e PE quando ambas as enzimas são combinadas (Figura 4D). No entanto, quando a enzima é utilizada sozinha, usando a mesma quantidade de enzimas por g de óleo, a hidrólise completa de PI para PI-PLC (Figura 4A) ou de PC e PE para PC/PE-PLC (Figura 4B) é observada. TABELA 3:

[441] Este resultado mostra que, quando ambas as enzimas (PC/PE-PLC e PI-PLC) são adicionadas juntas em óleo, a atividade é menor do que a atividade da PC/PE-PLC sozinha. TABELA 4:

[442] Para analisar a mistura de PC/PE-PLC e PI-PLC adicionada sequencialmente e em pontos de tempo diferentes, neste exemplo, cada enzima indicada na coluna 1 foi adicionada a 3 g de óleo de soja bruto (22,5 μg de PC/PE-PLC) ou 30 μg de PI-PLC. A 0 min. (controle) ou após 1h, o óleo foi aquecido a 90 °C por 5 min. para inativar a enzima. Neste momento, foi colhida uma amostra de óleo para determinar a atividade de PLC (coluna A). Em seguida, a segunda enzima foi adicionada (coluna 4) e após 2 horas de incubação a 50 °C a atividade de PLC foi determinada conforme descrito no presente documento (coluna B). A coluna A-B indica a atividade de PLC para a segunda enzima adicionada.

[443] Esses resultados mostram que a atividade de PC/PE-PLC é reduzida se o óleo é previamente tratado com PI-PLC. Da mesma forma, a atividade de PI-PLC é reduzida se o óleo é previamente tratado com PC/PE-PLC (vide Tabela 4).

EXEMPLO 5: SISTEMA DE DUAS ENZIMA COM LAT COMO ESTABILIZADOR ENZIMÁTICO EM BAIXA CONCENTRAÇÃO PARA DEGOMAGEM DE ÓLEO:

[444] Este exemplo mostra um processo para degomagem de óleo utilizando uma baixa quantidade de aciltransferase lipídica (LAT) em comparação a outros métodos enzimáticos de degomagem que são atualmente utilizados.

[445] Brevemente, 3 gramas de óleo de soja bruto, contendo 1200 ppm de fosfato foram degomados com 10 μg de fosfolipase específica de fosfatidilinositol (PI-PLC, ID. SEQ. N° 1) por g de óleo, 5 μg de osfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina (PC/PE- PLC, ID. SEQ. N° 5) g de óleo e o estabilizador enzimático em uma concentração de 0,01 TIPU de LAT (ID. SEQ N° 10) g de óleo, após 2h a 50°C, a atividade de PLC foi determinada conforme descrito no presente documento. 0,01 TIPU/g de óleo é equivalente a 0,2 μg de proteína (ID. SEQ. N° 10) por g de óleo.

[446] Esta aciltransferase lipídica da invenção tem uma atividade de 50 TIPU/mg de proteína.

[447] Os resultados na Tabela 5 e na Figura 5A-C mostram que a presença de LAT em baixas concentrações melhorou surpreendentemente a atividade global de PLC. Neste exemplo, pode- se observar que o maior aumento da atividade de PLC para a combinação de PC/PE/PI-PLC-PLC foi obtido quando se utilizou uma concentração de LAT de 0,01 TIPU/g de óleo. No entanto, o efeito pode ser detectado mesmo com concentrações inferiores, tais como 0,005 ou 0,001 TIPU/g de óleo, equivalente a 0,1 μg/g de óleo ou 0,02 μg/g de óleo, respectivamente. TABELA 5:

EXEMPLO 6: PROCESSO DE 2 ENZIMAS COM LAT COMO ESTABILIZADOR PARA DEGOMAGEM DE ÓLEO EM ÓLEO DE SOJA BRUTO REMOÇÃO DA GOMA DE UM ÓLEO DE SOJA, UTILIZANDO UM SISTEMA DE DUAS ENZIMAS COM LAT COMO ESTABILIZADOR ENZIMÁTICO DA PRESENTE INVENÇÃO VS. DEGOMAGEM COM ÁGUA

[448] 40 g de óleo bruto, contendo 1200 ppf de fosfato, foram tratados com:

[449] 3% de água (H2O)

[450] 3% de água, contendo 10 μg de fosfolipase específica de fosfatidilinositol (PI-PLC, ID. SEQ. N° 1) por g de óleo, 5 μg de fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina (PC/PE- PLC, ID. SEQ. N° 5) por g de óleo e 0,01 TIPU de LAT (ID. SEQ. N° 10) por g de óleo ou,

[451] 3% de água, contendo 5 μg de fosfolipase específica de fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina (PC/PE-PLC, ID. SEQ. N° 5) por g de óleo.

[452] As misturas de reação foram incubadas a 50°C por 2 horas com mistura constante a 50°C.

[453] A mistura de óleo foi incubada a 85°C para inativar as enzimas e centrifugada a 5 min a 5000g. A goma e o óleo centrifugado foram pesados e g de goma/100 g de óleo foi calculada. Os resultados são mostrados nas Figuras 6 A-C.

[454] A redução observada na goma no sistema de PC/PE-PLC+ PI-PLC + LAT resultou em um aumento de 2,14% da produção global de óleo em comparação ao controle utilizando água e o aumento de 1,12% em comparação à utilização de PC/PE-PLC sozinha. TABELA 6

EXEMPLO 7 - UTILIZAÇÃO DE BAIXA CONCENTRAÇÃO DE LISOACILTRANSFERASE (LAT) EM DEGOMAGEM DE ÓLEO COM PC/PE-PLC E PI-PLC

[455] Uma mistura de reação, compreendendo 3 gramas de óleo bruto que contém 1200 ppm de fosfato com 3% de água, compreendendo:

[456] 0,1 TIPU de LAT (ID. SEQ N° 10) por g de óleo (equivalente a 2 μg de LAT por g de óleo).

[457] 10 μg de (ID. SEQ. N° 1) por g de óleo, 5 μg de (ID. SEQ. N° 5) por g de óleo e 0,01 TIPU de LAT (ID. SEQ. N° 10) por g de óleo (equivalente a 0,2 μg de LAT por g de óleo)

[458] Nenhuma enzima.

[459] As misturas de reação foram homogeneizadas por aproximadamente 1 min utilizando o homogenizador Ultra-Turrax T8 (IKA).

[460] Em seguida, os tubos contendo a mistura de reação foram incubados a aproximadamente 50°C com agitação constante, utilizando um agitador magnético de estabilidade como o agitador magnético de estabilidade VP 710 (VP-Scientific).

[461] Após 2h de incubação a 50°C, a atividade de PLC foi determinada conforme descrito acima e os fosfolipídeos restantes analisados por NMR.

[462] O espectro por NMR do óleo mostra quatro picos correspondendo ao fosfolipídeos fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), ácido fosfatídico (PA) e fosfatidilinositol (PI). Após o tratamento com lisoaciltransferase (LAT) (0,1 TIPU/g de óleo) (Figura 7-1), os fosfolipídeos PC, PE e PI foram completamente hidrolisados para lisofosfolipídeos lisofosfatidilcolina (L-PC), lisofosfatidiletanolamina (L-PE) e lisofosfatidilinositol (L-PI). Aproximadamente 50% do ácido fosfatídico (PA) foi hidrolisado para ácido lisofosfatídico nestas condições de reação.

[463] Quando o óleo foi tratado com a mistura de PC/PE-PLC (ID. SEQ. N° 5), PI-PLC (ID. SEQ. N° 1) e uma baixa concentração (0,01 TIPU/g) de lisoaciltransferase (ID. SEQ. N° 10) (Figura 7-2) os fosfolipídios fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE) e fosfatidilinositol (PI) foram completamente hidrolisados para diacilglicerol e fosfocolina de grupos de cabeças polares (p-CHO), fosfoetanolamina (p-ET) e fosfoinositol (p-INO), respectivamente. Lisofosfolipídes não foram detectados, mostrando que a enzima de lisoaciltransferase não reagiu com os fosfolipídeos nestas condições de reação. TABELA 7

[464] O óleo bruto foi tratado com a mistura de 10 μg de (ID. SEQ. N° 1) por g de óleo, 5 μg de (ID. SEQ. N° 5) por g de óleo e diferentes quantidades adicionadas (10-100 mg) de lisofosfolipídeos ou com a mistura de 10 μg de (ID. SEQ. N° 1) por g de óleo, 5 μg de (ID. SEQ. N° 5) por g de óleo e 0,01 TIPU de LAT (ID. SEQ. N° 10) por g de óleo PC/PE-PLC (ID. SEQ. N° 5) (Tabela 7). A adição de lisofosfolipídeos ao produto da atividade catalítica da enzima de LAT não teve qualquer efeito sobre a inibição mútua de PC/PE-PLC e PI-PLC. Pelo contrário, uma baixa quantidade (0,01 TIPU/g de óleo) de LAT (ID. SEQ. N° 10) adicionada à mistura de PC/PE-PLC e PI-PLC mostrou um aumento significativo na atividade de PLC medida. Este resultado sugere que a proteína de LAT não está exercendo seu efeito no aumento da atividade doe PC/PE PLC e PI-PLC através de sua atividade catalítica.

EXEMPLO 8 - MAIOR ESTABILIDADE DA PROTEÍNA

[465] Preparações de enzimas de PC/PE-PLC e PI-PLC concentraram-se por ultrafiltração e são armazenadas utilizando tampões adequados (20 mM de acetato de sódio, 35% de glicerol). Ambas as enzimas foram armazenadas individualmente ou combinados (mistura de PC/PE-PLC, PI-PLC e LAT). As amostras foram armazenadas a 4°C ou 25°C por até 365 dias e a atividade enzimática foi determinada utilizando os métodos descritos para avaliar a estabilidade das enzimas. A atividade de PC-PLC foi medida utilizando ensaio colorimétrico com substrato de O-(4-nitrofenil fosforilcolina), conforme descrito acima (Figura 8).

[466] Os resultados na Figura 8 mostram que quando armazenada sozinha (Figura 8A), a preparação enzimática de PC/PE- PLC perde aproximadamente 50% da sua atividade após 50 dias à temperatura ambiente. No entanto, quando armazenados em combinação com o PI-PLC e LAT (Figura 8B), a preparação enzimática permanece estável, mesmo após 365 dias à temperatura ambiente. Ambas as preparações enzimáticas são estáveis a 4°C por, pelo menos, 365 dias.

[467] Os resultados na Figura 9 mostram a estabilidade enzimática das enzimas de PLC (PC/PE-PLC ePI-PLC) em óleo a 50°C (temparatura de degomagem de óleo). As enzimas de PC/PE-PLC, PI- PLC, ou uma mistura de ambas as enzimas com a adição de LAT foram incubadas em 1 g de óleo refinado (não contendo nenhum fosfolipídeo) pela hora indicada (0 como controle ou de 1 a 2h) a 50°C. Esta incubação foi realizada para avaliar a estabilidade da enzima adicionada ao óleo, nenhuma reação ocorre enquanto nenhum fosfolipídios estiver presente. Após esta incubação, foi adicionado 2 g de óleo bruto (contendo 3% de fosfolipídios) e a reação de degomagem aconteceu por 2h a 50°C, com agitação constante. As reações de PI- PLC e PC-PLC foram quantificadas pela medição do fosfato inorgânico, conforme descrito acima. Ambas as enzimas foram inativadas (menos de 50% da atividade recuperada) se incubadas sozinhas durante 1h ou 2h em óleo a 50°C. No entanto, a mistura das três enzimas de PC/PE-PLC, PI-PLC e LAT manteve-se estável na condição analisado, recuperando 100% da atividade inicial (incubação de 50°C, 0h), mesmo após duas horas de pré incubação a 50°C. Este resultado mostra que a mistura das três enzimas (PC/PE-PLC, PI-PLC e LAT) é mais estável que qualquer PLC sozinha. Vistos em conjunto, os resultados indicam que a LAT exerce seu efeito em baixas concentrações, estabilizando a PC/PE-PLC e a PI-PLC, e não devido a sua atividade catalítica. Figura 9

EXEMPLO 9: TRATAMENTO ENZIMÁTICO DA COMPOSIÇÃO OLEOSA CONTENDO 15% DE FOSFOLIPÍDIOS E DE 15 A 20% DE ÁGUA.

[468] Uma amostra de gomas molhadas obtida de óleo de soja degomado de água industrial foi analisada e descobriu-se conter 40,5% de água, 30% de fosfolipídios e 29,5% de TAG.

[469] 150 g de gomas molhadas foi misturada com 150 g de óleo bruto de soja, fornecendo 300g de uma composição oleosa que contém 15 de fosfolipídios e 20% de água. Esta composição oleosa foi tratada com uma mistura de PC/PE-PLC, PI-PLC e LAT por 6 horas. Um experimento com nenhuma enzima foi utilizado como um controle negativo. Concentrações de enzima utilizadas foram indicadas como segue:

[470] CK1X: 5 ug/g de óleo de PC/PE-PLC, 10 ug/g de oleo de PI-PLC e 0,01 TIPU/g de óleo de LAT.

[471] CK2X: 10ug/g de óleo de PC/PE-PLC, 20 ug/g de óleo de PI-PLC e 0,02 TIPU/g de óleo de LAT.

[472] CK4X: 20 ug/g de óleo de PC/PE-PLC, 40 ug/g de óleo de PI-PLC e 0,04 TIPU/g de óleo de LAT.

[473] CK6X: 30 ug/g de óleo de PC/PE-PLC, 60 ug/g de óleo de PI-PLC e 0,06 TIPU/g de óleo de LAT.

[474] A reação foi incubada por quatro ou seis horas (conforme indicado na Tabela 7) a 50°C e centrifugada para separar as gomas restantes do óleo recuperado. Uma concentração de 1,2-DAG e 1,3 DAG foi determinada pelo método AOCS Cd 11d-96:2009. A concentração teórica de DAG correspondente a 90% da hidrólise de fosfolipídeos é 9,45%.

[475] Os resultados são mostrados na Tabela 8 e Figura 10.

[476] A fim de obter um benefício econômico do tratamento enzimático de uma composição oleosa para a recuperação de óleo da goma, o valor do óleo extra recuperado no processo deve ser maior que o custo das enzimas mais os custos adicionais de energia e de capital exigidos na usina. A técnica anterior ensina tratamentos que utilizam concentrações extremamente elevadas da enzima, o que transporta os custos que estão muito acima da rentabilidade do processo.

[477] No número de reação 3 (Tabela 8), 200 g de óleo foram recuperadas na amostra tratada com a enzima, em contraste com 145 g do óleo para o controle negativo (número de reação 7, Tabela 8). O ganho de óleo representa 37% (expresso em g de óleo recuperado por 100g de goma tratada). A quantidade total de DAGs medidos indica a hidrólise de mais de 90% dos fosfolipídeos totais presentes na composição inicial do óleo. A quantidade de enzimas utilizadas (30 μg/g de óleo de PC/PE-PLC, 60 μg/g de óleo de PI-PLC e 0,06 TIPU/g de óleo de LAT) é bem abaixo a dos relatórios anteriores.

TABELA 8

[478] O ganho de óleo é expresso em g de óleo recuperado por 100g de goma tratada. 150 g de gomas foram incubados com 150 g de óleo bruto. O óleo recuperado total é indicado na coluna 4.

EXEMPLO 10: TRATAMENTO ENZIMÁTICO DA COMPOSIÇÃO OLEOSA CONTENDO 30% DE FOSFOLIPÍDIOS E 40% DE ÁGUA.

[479] Uma amostra das gomas molhadas obtidas do óleo de soja degomado por água industrial foi analisada e descobriu-se conter 40,5% de água, 30% de fosfolipídios e 29,5% de TAG.

[480] 300 g de gomas molhadas foram tratados com uma mistura de PC/PE-PLC, PI-PLC e LAT por 6 horas. Um experimento sem qualquer enzima foi utilizado como um controle negativo. As concentrações de enzimas utilizadas foram:

[481] CK6X: 30 μg/g de óleo de PC/PE-PLC, 60 μg/g de óleo de PI-PLC e 0,06 TIPU/g de óleo de LAT.

[482] A reação foi incubada durante seis horas a 50°C e centrifugada para separar as gomas restantes do óleo recuperado. 59,4 g de óleo foram recuperadas na amostra tratada pela enzima, em contraste com 0 g de óleo para o controle negativo, dando 19,8% de ganho de óleo (calculado como g de óleo recuperado por 100g de goma tratada). FIGURA 10.

Claims

1. "PROCESSO PARA DEGOMAGEM DE UMA COMPOSIÇÃO OLEOSA", contendo entre 1 e 40% p/p de fosfolipídeos e de 1 a 30% p/p de água, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende: - contatar a referida composição oleosa com uma mistura enzimática que consiste nos polipeptídeos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 10, em que a concentração do polipeptídeo da SEQ ID NO: 10 não é maior do que 0,06 TIPU/g de óleo, em que as concentrações de lisofosfolipídeos e ácidos graxos livres são mantidas em seus níveis iniciais.

2. "PROCESSO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a mistura enzimática hidrolisar mais de 70% (p/p) dos fosfolipídeos presentes na referida composição oleosa em diacilglicerol e éster fosfato.

3. "PROCESSO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido processo resultar em um aumento da produção de óleo de mais do que 2,0% em comparação a um processo de degomagem de óleo não enzimático.

4. "PROCESSO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido processo não compreender atividade de fosfolipase A.

5. "PROCESSO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida composição oleosa ser um óleo comestível selecionado do grupo consistindo em um óleo de soja, de colza, de semente de girassol, de farelo de arroz, de gergelim, de milho, de palmeira, de sésamo ou de amendoim.

6. "PROCESSO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida composição oleosa ser uma mistura de óleo bruto e gomas molhadas contendo uma composição final de 10 a 30% de fosfolipídeos, e a referida composição oleosa ser contatada com a referida mistura enzimática por um tempo de pelo menos 4h e por mais de 70% dos fosfolipídeos totais presentes na goma molhada inicial serem hidrolisados, e o ganho de óleo ser de pelo menos 34 g de óleo recuperado por 100 gramas de goma tratada.