CN103946370B - 棒状细菌转化体和使用该转化体的缬氨酸的制造方法 - Google Patents
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Abstract
一种转化体，其通过在宿主棒状细菌中导入下述(a)、(b)和(c)中任意一种以上的DNA而得到，(a)在来源于谷氨酸棒杆菌的编码乙酰羟酸合成酶的DNA中引入了使该DNA所编码的氨基酸序列的第156位甘氨酸突变为谷氨酸(G156E)的突变的DNA或者其类似物；(b)在来源于谷氨酸棒杆菌的编码乙酰羟酸异构还原酶的DNA中引入了使该DNA所编码的氨基酸序列的第34位丝氨酸突变为甘氨酸(S34G)、使第48位亮氨酸突变为谷氨酸(L48E)、使第49位精氨酸突变为苯丙氨酸(R49F)的突变的DNA或者其类似物；(c)来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的编码亮氨酸脱氢酶的DNA或者其类似物。
Description
技术领域
本发明涉及缬氨酸生产技术。更详细而言，涉及为了赋予缬氨酸生产功能而实施了特定基因操作的棒状细菌的转化体和使用该转化体的高效的缬氨酸的制造方法。
背景技术
在全球变暖和化石资源枯竭问题的背景下，已经认识到以可再生资源为原料的化学品制造与生物燃料制造并列地作为新产业生物炼制而成为实现低碳社会的重要策略，并聚焦了广泛的关注。
作为必需氨基酸之一的缬氨酸，是作为医药、食品、化妆品的成分、家畜饲料添加物等有用的物质。以往，缬氨酸通过发酵法、蛋白质的水解来生产。
但是，对于利用以可再生资源为原料的发酵法的缬氨酸生产，与乳酸、乙醇的生产相比，从作为原料的糖类开始的代谢反应阶段数非常多，并且代谢酶受会到作为产物的缬氨酸的反馈抑制，由于上述等原因，生产率低已成为工业生产的课题。
作为利用基因重组菌的缬氨酸生产技术，可列举出专利文献1、2所述的技术。
专利文献1中公开了使用谷氨酸棒杆菌来制造缬氨酸的技术，所述谷氨酸棒杆菌中编码与L-异亮氨酸的生物合成有关的酶的基因、编码与L-亮氨酸的生物合成有关的酶的基因、和编码与D-泛酸的生物合成有关的酶的基因弱化或缺失，编码与L-缬氨酸的生物合成有关的酶的基因以使其表达增加的方式进行了突变。
另外，专利文献2中公开了利用使转氨酶C的活性增加后的棒杆菌属细菌来制造缬氨酸的技术。
但是，专利文献1、2的方法的缬氨酸的生产率在实用上还不充分。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2009-521960
专利文献2：日本特表2008-514191
发明内容
发明所解决的课题
本发明的课题在于，提供能够以糖类为原料高效地制造缬氨酸的微生物、和使用该微生物以糖类为原料高效地制造缬氨酸的方法。
解决课题的手段
棒状细菌通过糖酵解将葡萄糖分解为丙酮酸。对于棒状细菌而言，进一步利用乙酰羟酸合成酶将丙酮酸代谢为2-乙酰乳酸，利用乙酰羟酸异构还原酶将2-乙酰乳酸代谢为2,3-二羟基异戊酸，利用二羟酸脱水酶将2,3-二羟基异戊酸代谢为2-酮异戊酸，利用转氨酶将2-酮异戊酸代谢为缬氨酸。
本发明人发现，在棒状细菌中导入由序列号37的碱基序列构成的乙酰羟酸合成酶基因、由序列号57的碱基序列构成的乙酰羟酸异构还原酶基因和由序列号40的碱基序列构成的亮氨酸脱氢酶基因中任意一种以上的基因后的转化体，以糖类为原料高效地生产缬氨酸。
由序列号37的碱基序列构成的DNA是谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸合成酶基因(ilvBN基因)的突变体，由序列号57的碱基序列构成的DNA是谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸异构还原酶基因(ilvC基因)的突变体。
另外，由序列号40的碱基序列构成的DNA是编码亮氨酸脱氢酶的DNA，在棒状细菌中可催化本来由转氨酶催化的由2-酮异戊酸向缬氨酸的转变。需要说明的是，转氨酶将氨基从其他氨基酸转移到2-酮异戊酸，与此相对，亮氨酸脱氢酶可以将氨基从无机NH4 +转移到2-酮异戊酸。
另外，本发明人发现，该转化体中存在于宿主棒状细菌的染色体上的乳酸脱氢酶基因破坏或缺失时，可以进一步高效地生产缬氨酸。
另外，本发明人发现，对于该转化体而言，使其在还原条件下的反应液中以实质上不增殖的状态反应的情况，与使其在好气性的反应液中边增殖边反应的情况相比，缬氨酸生产效率更高。
本发明基于上述见解而完成，提供以下的转化体和缬氨酸的制造方法。
第1项.一种转化体，其通过在宿主棒状细菌中导入下述(a)、(b)和(c)中任意一种以上的DNA而得到，
(a)在来源于谷氨酸棒杆菌的编码乙酰羟酸合成酶的DNA中引入了使该DNA所编码的氨基酸序列的第156位甘氨酸突变为谷氨酸(G156E)的突变的DNA，或者在严格条件下与由该DNA的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交并且编码具有乙酰羟酸合成酶活性的多肽的DNA；
(b)在来源于谷氨酸棒杆菌的编码乙酰羟酸异构还原酶的DNA中引入了使该DNA所编码的氨基酸序列的第34位丝氨酸突变为甘氨酸(S34G)、使第48位亮氨酸突变为谷氨酸(L48E)、使第49位精氨酸突变为苯丙氨酸(R49F)的突变的DNA，或者在严格条件下与由该DNA的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交并且编码具有乙酰羟酸异构还原酶活性的多肽的DNA；
(c)来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的编码亮氨酸脱氢酶的DNA，或者在严格条件下与由该DNA的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交并且编码具有亮氨酸脱氢酶活性的多肽的DNA。
第2项.如第1项所述的转化体，其中，
在来源于谷氨酸棒杆菌的编码乙酰羟酸合成酶的DNA中引入了使该DNA所编码的氨基酸序列的第156位甘氨酸突变为谷氨酸(G156E)的突变的DNA为由序列号37的碱基序列构成的DNA，
在来源于谷氨酸棒杆菌的编码乙酰羟酸异构还原酶的DNA中引入了使该DNA所编码的氨基酸序列的第34位丝氨酸突变为甘氨酸(S34G)、使第48位亮氨酸突变为谷氨酸(L48E)、使第49位精氨酸突变为苯丙氨酸(R49F)的突变的DNA为由序列号57的碱基序列构成的DNA，
来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的编码亮氨酸脱氢酶的DNA为由序列号40的碱基序列构成的DNA。
第3项.如第1项或第2项所述的转化体，其中，还导入了来源于谷氨酸棒杆菌的编码二羟酸脱水酶的DNA、或者在严格条件下与由该DNA的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交并且编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的DNA。
第4项.如第1项～第3项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为乳酸脱氢酶基因被破坏或缺失的棒状细菌。
第5项.一种谷氨酸棒杆菌VAL4(保藏号：NITE BP-1122)转化体。
第6项.一种缬氨酸的制造方法，其包括：
使第1项～第5项中任一项所述的转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应的步骤；和
回收反应液中的缬氨酸的步骤。
第7项.如第6项所述的缬氨酸的制造方法，其中，在反应步骤中，转化体实质上不增殖。
发明效果
本发明的转化体为导入了特定序列的乙酰羟酸合成酶基因、特定序列的乙酰羟酸异构还原酶基因、和特定序列的亮氨酸脱氢酶基因中任意一种以上的基因的棒状细菌，由此，与以往公知的转化体相比，可以从糖类更高效地制造缬氨酸。
附图说明
图1是示出实施例中使用的载体的构建的图。
图2是示出实施例中使用的载体的构建的图。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
(I)转化体
宿主
棒状细菌为Bargeys Manual of Determinative Bacteriology(伯杰氏系统细菌学手册)，Vol.8，599(1974)中定义的一组微生物，只要是在通常的需氧条件下增殖的棒状细菌则没有特别限定。如果列举具体例，可以列举棒状杆菌属菌、短杆菌属菌、节杆菌属菌、分枝杆菌属菌、微球菌属菌等。棒状细菌中，优选棒状杆菌属菌。
作为棒状杆菌属菌，可以列举谷氨酸棒杆菌、有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerance)、解烷棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)等。其中，从安全且缬氨酸生产率高的观点出发，优选谷氨酸棒杆菌。作为优选的菌株，可以列举：谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)R株(FERM P-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233(FERM BP-1497)、MJ-233AB-41(FERM BP-1498)等。其中，优选R株(FERM P-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株。
需要说明的是，根据分子生物学的分类，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、散枝短杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)、百合棒杆菌(Corynebacterium lilium)等棒状细菌的菌名也统一在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中[Liebl,W.等,Transfer of Brevibacteriumdivaricatum DSM20297T,“Brevibacterium flavum”DSM20411，“Brevibacteriumlactofermentum”，DSM20412and DSM1412,and Corynebacterium glutamicum and theirdistinction by rRNA gene restriction patterns.Int J Syst Bacteriol.41:255-260.(1991)，驹形和男等，棒状细菌的分类，发酵与工业，45:944-963(1987)]。
旧分类的乳糖发酵短杆菌ATCC13869株、黄色短杆菌的MJ-233株(FERM BP-1497)、MJ-233AB-41株(FERM BP-1498)等也是优选的谷氨酸棒杆菌。
作为短杆菌属菌，可以列举产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)(例如ATCC6872株)等。
作为节杆菌属菌，可以列举球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)(例如ATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株)等。
作为分枝杆菌属菌，可以列举牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(例如ATCC19210株、ATCC27289株)等。
作为微球菌属菌，可以列举弗氏微球菌(Micrococcus freudenreichii)(例如No.239株(FERM P-13221))、藤黄微球菌(Micrococcus leuteus)(例如No.240株(FERM P-13222))、脲微球菌(Micrococcus ureae)(例如IAM1010株)、玫瑰色微球菌(Micrococcusroseus)(例如IFO3764株)等。
另外，除了野生株以外，棒状细菌也可以是其突变株或人工的基因重组体。可以列举例如乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyrvate carboxylase)、丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase)、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase)等的基因的破坏或缺失株。通过使用这种基因破坏株作为宿主，能够提高缬氨酸的生产率或抑制副产物的生成。
其中，优选乳酸脱氢酶基因的破坏株。对于该基因破坏株而言，乳酸脱氢酶基因被破坏，由此使由丙酮酸向乳酸的代谢途径被阻断。其中，优选谷氨酸棒杆菌的乳酸脱氢酶基因的破坏株，特别优选谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)株的乳酸脱氢酶基因的破坏株。
这种基因破坏株可以通过基因工程的方法按照常规方法来制作。例如，WO2005/010182A1中记载了乳酸脱氢酶破坏株及其制作方法。
乙酰羟酸合成酶基因(ilvBN基因)
乙酰羟酸合成酶是催化下述反应的酶。
2丙酮酸→2-乙酰乳酸
在本发明中，作为乙酰羟酸合成酶基因，可以使用在来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸合成酶基因中引入了使该基因所编码的氨基酸序列的第156位甘氨酸突变为谷氨酸(G156E)的突变的DNA。其中，优选由序列号37的碱基序列构成的DNA。
另外，在本发明中还可以使用：在严格条件下与由在来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸合成酶基因中引入了使该基因所编码的氨基酸序列的第156位甘氨酸突变为谷氨酸(G156E)的突变的DNA或者序列号37的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交、并且编码具有乙酰羟酸合成酶活性的多肽的DNA(类似物)。
本发明中，“严格条件”是指一般的条件、例如Molecular Cloning,A LaboratoryManual(分子克隆实验指南)，第二版，1989，Vol2,p11.45中记载的条件。具体而言，是指在比完全杂交的解链温度(Tm)低5～10℃的温度下发生杂交的情况。
另外，在本发明中还可以使用：由与在来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸合成酶基因中引入了使该基因所编码的氨基酸序列的第156位甘氨酸突变为谷氨酸(G156E)的突变的DNA或者由序列号37的碱基序列构成的DNA的碱基序列的同一性为90％以上、优选为95％以上、更优选为98％以上的碱基序列构成、并且编码具有乙酰羟酸合成酶活性的多肽的DNA(类似物)。
碱基序列的同一性是利用GENETYX第8版(GENETYX株式会社ゼネティックス制)计算出的值。
对于乙酰羟酸合成酶活性，可以将100mM磷酸钾(pH7.5)、50mM丙酮酸钠、10mMMgCl2、0.1mM硫胺素焦磷酸、0.1mM黄素腺嘌呤二核苷酸和被测酶混合，并以可示出丙酮酸的吸收的333nm(ε＝17.5/M·cm)下的减少为指标来测定。将1分钟形成1μmol的2-乙酰乳酸的活性设定为1单位的乙酰羟酸合成酶活性。
在来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸合成酶基因中引入了使该基因所编码的氨基酸序列的第156位甘氨酸突变为谷氨酸(G156E)的突变的DNA或者由序列号37的碱基序列构成的DNA的类似物，例如可以通过使用基于这些碱基序列按照常规方法设计的引物或探针的PCR或杂交从其他生物种的DNA文库中选择，由此，可以以高概率得到编码具有乙酰羟酸合成酶活性的多肽的DNA。
乙酰羟酸异构还原酶基因(ilvC基因)
乙酰羟酸异构还原酶是催化下述反应的酶。
2-乙酰乙酸→2,3-二羟基异戊酸
在本发明中，作为乙酰羟酸异构还原酶基因，可以使用在来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸异构还原酶基因中引入了使该基因所编码的氨基酸序列的第34位丝氨酸突变为甘氨酸(S34G)、使第48位亮氨酸突变为谷氨酸(L48E)、使第49位精氨酸突变为苯丙氨酸(R49F)的突变的DNA。其中，优选由序列号57的碱基序列构成的DNA。
另外，在本发明中还可以使用：在严格条件下与由在来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸异构还原酶基因中引入了使该基因所编码的氨基酸序列的第34位丝氨酸突变为甘氨酸(S34G)、使第48位亮氨酸突变为谷氨酸(L48E)、使第49位精氨酸突变为苯丙氨酸(R49F)的突变的DNA或者序列号57的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交、并且编码具有乙酰羟酸异构还原酶活性的多肽的DNA(类似物)。
另外，在本发明中还可以使用：由与在来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸异构还原酶基因中引入了使该基因所编码的氨基酸序列的第34位丝氨酸突变为甘氨酸(S34G)、使第48位亮氨酸突变为谷氨酸(L48E)、使第49位精氨酸突变为苯丙氨酸(R49F)的突变的DNA或者由序列号57的碱基序列构成的DNA的碱基序列的同一性为90％以上、优选为95％以上、更优选为98％以上的碱基序列构成、并且编码具有乙酰羟酸异构还原酶活性的多肽的DNA(类似物)。
对于乙酰羟酸异构还原酶活性，可以将100mM磷酸钾(pH7.5)、10mM乙酰乳酸、5mMMgCl2、0.2mM NADPH和被测酶混合，并以可示出NADPH的吸收的340nm(ε＝6220/M·cm)下的减少为指标来测定。将1分钟形成1μmol的2,3-二羟基异戊酸的活性设定为1单位的乙酰羟酸异构还原酶活性。
亮氨酸脱氢酶基因
在本发明中，可以使用来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因。其中，优选由序列号40的碱基序列构成的DNA。
另外，在本发明中还可以使用：在严格条件下与由来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因(DNA)或序列号40的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交、并且编码具有亮氨酸脱氢酶活性的多肽的DNA(类似物)。
另外，在本发明中还可以使用：由与来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因(DNA)或序列号40的DNA的碱基序列的同一性为90％以上、优选为95％以上、更优选为98％以上的碱基序列构成、并且编码具有亮氨酸脱氢酶活性的多肽的DNA(类似物)。
对于亮氨酸脱氢酶活性，可以将100mM甘氨酸/NaOH(pH9.5)、10mM2-酮异戊酸、200mM氯化铵、0.2mM NADH和被测酶混合，并以可示出NADH的吸收的340nm(ε＝6220/M·cm)下的减少为指标来测定。将1分钟形成1μmol的缬氨酸的活性设定为1单位的亮氨酸脱氢酶活性。
如上所述，本发明的转化体为将下述(a)～(c)的基因中任一项以上导入宿主棒状细菌而得的菌株，
(a)在来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸合成酶基因中引入了使该基因所编码的氨基酸序列的第156位甘氨酸突变为谷氨酸(G156E)的突变的基因、或其类似物；
(b)在来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰羟酸异构还原酶基因中引入了使该基因所编码的氨基酸序列的第34位丝氨酸突变为甘氨酸(S34G)、使第48位亮氨酸突变为谷氨酸(L48E)、使第49位精氨酸突变为苯丙氨酸(R49F)的突变的基因、或其类似物；
(c)来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因、或其类似物。
导入基因的组合可以为(a)与(b)的组合、(a)与(c)的组合、(b)与(c)的组合、(a)与(b)与(c)的组合中的任意一种。其中，优选(a)与(b)与(c)的组合。
二羟酸脱水酶基因
另外，在任意一种情况下都优选还向宿主中导入来源于谷氨酸棒杆菌的二羟酸脱水酶基因(特别是由序列号43的碱基序列构成的DNA)、或其类似物，由此，缬氨酸的生产率进一步提高。
类似物包括：在严格条件下与由序列号43的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交并且编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的DNA、由与序列号43的碱基序列的同一性为90％以上、优选为95％以上、更优选为98％以上的碱基序列构成并且编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的DNA。
对于二羟酸脱水酶活性，可以以由2,3-二羟基异戊酸形成2-酮异戊酸时伴随2-酮异戊酸增加的340nm下的吸光度上升为指标来测定(Dennis H.F.等,The role andproperties of the iron-sulfur cluster in Escherichia coli dihydroxy-aciddehydratase.J.Biol.Chem.,268:14732-14742(1993))。活性测定用反应液可使用50mMtris盐酸缓冲液pH8.0、10mM氯化镁、6mM2,3-二羟基异戊酸。可以在30℃下将酶液1添加到反应液从而开始反应，从反应液的吸光度减少的斜率与不含2,3-二羟基异戊酸的反应液的吸光度减少的斜率之差，利用摩尔吸光系数190M-1cm-1计算出活性值。
用于转化的载体的构建
将通过PCR扩增得到的编码乙酰羟酸合成酶的DNA、编码乙酰羟酸异构还原酶的DNA和编码亮氨酸脱氢酶的DNA分别克隆到能够在宿主中扩增的适当的载体中即可。
作为质粒载体，只要是包含在棒状细菌内担负自主复制功能的基因的质粒载体即可。作为其具体例，可以列举：来源于乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)2256的pAM330[日本特开昭58-67699]、[Miwa,K.等,Cryptic plasmids in glutamicacid-producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903(1984)]和[Yamaguchi,R.等,Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacteriumlactofermentum plasmid pAM330and the analysis of its geneticinformation.Nucleic Acids Symp.Ser.16:265-267(1985)]、来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13058的pHM1519[Miwa，K.等,Cryptic plasmids in glutamic acid-producingbacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903(1984)]和pCRY30[Kurusu，Y.等，Identification of plasmid partition function in coryneformbacteria.App1.Environ.Microbiol.57:759-764(1991)]、来源于谷氨酸棒杆菌T250的pCG4[日本特开昭57-183799]、[Katsumata,R.等,Protoplast transformation ofglutamate-producing bacteria with plasmid DNA.J.Bacteriol.、159:306-311(1984)]、pAGl、pAG3、pAG14、pAG50[日本特开昭62-166890]、pEK0、pEC5、pEKExl[Eikmanns，B.J.等,A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttlevectors for cloning,controlled gene expression,and promoter probing.Gene,102:93-98(1991)]等。
作为优选的启动子，可以列举来源于谷氨酸棒杆菌R的甘油醛-3-磷酸脱氢酶A基因(gapA)的启动子PgapA、苹果酸脱氢酶基因(mdh)的启动子Pmdh、乳酸脱氢酶A基因(ldhA)的启动子PldhA等，其中，优选PgapA。
作为优选的终止子，可以列举大肠杆菌rRNA操纵子的rrnB T1T2终止子、大肠杆菌的trpA终止子、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的trp终止子等，其中，优选rrnB T1T2终止子。
转化
转化方法可以没有限制地使用公知的方法。作为这样的公知的方法，可以列举例如氯化钙/氯化铷法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔法等。其中，对于棒状细菌优选电脉冲法，电脉冲法可以通过公知的方法[Kurusu,Y.et al.,Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophiccomplementation.Agric.Biol.Chem.54:443-447(1990)]和[Vertes A.A.et al.,Presence of mrr-and mcr-like restriction systems in Coryneformbacteria.Res.Microbiol.144:181-185(1993)]进行。
转化体使用微生物的培养中通常使用的培养基进行培养即可。作为该培养基，通常可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基等。
作为碳源，可以列举：葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、甘露糖醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨糖醇、甘油等糖质或糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸或葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇等。另外，还可以根据期望使用正链烷烃等烃等。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的这些碳源的浓度通常设定为约0.1～约10(w/v％)即可。
作为氮源，可以列举：氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉膏、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的氮源浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1～约10(w/v％)即可。
作为无机盐类，可以列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴或碳酸钙等。这些无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的无机盐类浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01～约1(w/v％)即可。
作为营养物质，可以列举例如肉膏、蛋白胨、多价蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物或者动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质的培养基浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1～约10(w/v％)即可。另外，还可以根据需要添加维生素类。作为维生素类，可以列举例如生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。
培养基的pH优选约5～约8。
作为优选的微生物培养培养基，可以列举A培养基[Inui,M.et al.,Metabolicanalysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinateproductions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT培养基[Omumasaba,C.A.et al.,Corynebacterium glutamicumglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite,ATP-dependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。
培养温度设定为约15℃～约45℃即可，培养时间设定为约1天～约7天即可。
宿主染色体基因的破坏或缺失
如前所述，优选宿主棒状细菌中存在于其染色体上的乳酸脱氢酶基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因、丙酮酸羧化酶基因和马来酸脱氢酶基因中的一种以上被破坏、或缺失，由此可以进一步高效地制造缬氨酸。
通过制作以使基因的部分序列缺失而不产生正常发挥功能的酶蛋白的方式进行改变后的缺失型基因，利用包含该基因的DNA转化细菌，使缺失型基因与染色体上的基因之间发生同源重组，由此能够将染色体上的基因置换成缺失型或破坏型的基因。由缺失型或破坏型的基因编码的酶蛋白即使生成也具有与野生型酶蛋白不同的立体结构，功能降低或消失。由这种利用同源重组的基因置换所致的基因缺失或破坏方法已经确立，有：使用包含温度敏感性复制起点的质粒、能够进行接合转移的质粒的方法；利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号、日本特开平05-007491号)。
具体而言，例如通过J.Mol.Microbiol.Biotechnol.,Vol.8,243-254(2004)所述的方法可以获得乳酸脱氢酶基因破坏或缺失的棒状细菌。
(II)缬氨酸的制造方法
通过包括使上述说明的本发明的转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应的步骤、和回收反应液中的缬氨酸的步骤的方法可以制造缬氨酸。
微生物的增殖
在反应之前，优选将转化体在需氧条件下、在约25℃～约38℃的温度下培养约12小时～约48小时而使其增殖。
培养用培养基
反应之前的转化体的需氧培养中使用的培养基可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基。
作为碳源，也可以使用：糖类(葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等)；甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃等烃等。
碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。
作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉膏、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在培养基中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1～约10(w/v％)即可。
作为无机盐类，可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐类在培养基中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01～约1(w/v％)即可。
作为营养物质，可以列举肉膏、蛋白胨、多价蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质在培养基中的浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1～约10(w/v％)即可。
还可以根据需要进一步添加维生素类。作为维生素类，可以列举生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。
培养基的pH优选约6～约8。
作为具体的优选的棒状细菌用培养基，可以列举A培养基[Inui,M.et al.,Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinateproductions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT培养基[Omumasaba,C.A.et al.,Corynebacterium glutamicumglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite,ATP-dependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可。
反应液
作为反应液，可以使用含有碳源、氮源和无机盐类等的天然反应液或合成反应液。
作为碳源，可使用糖类。作为糖类，可以列举：葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等。另外，也可以使用将稻草、甘蔗渣、玉米秸等不可食用农产废弃物、或者柳枝稷、象草、芒草等能源作物用糖化酶等糖化后得到的含有葡萄糖、木糖等多种糖的糖化液。其中，优选单糖、更优选葡萄糖。另外，也优选含有葡萄糖的糖类(二糖、寡糖、多糖)。
作为碳源，除糖类外，也可以使用甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃等烃等。
碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。
反应液中的糖类的浓度优选为约1～约20(w/v％)、更优选为约2～约10(w/v％)、进一步优选为约2～约5(w/v％)。
另外，包括糖类在内的总碳源在反应液中的浓度通常设定为约2～约5(w/v％)即可。
作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉膏、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在反应液中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1～约10(w/v％)即可。
作为无机盐类，可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐类在反应液中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01～约1(w/v％)即可。
还可以根据需要进一步添加维生素类。作为维生素类，可以列举生物素、硫胺素(维生素BI)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。
反应液的pH优选约6～约8。
作为具体的优选的棒状细菌用反应液，可以列举前述的BT培养基等。在这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可。
反应条件
反应温度即转化体的存活温度优选约20℃～约50℃，更优选约25℃～约47℃。反应温度为上述温度范围时，能够高效地制造缬氨酸。
另外，反应时间优选约1天～约7天，更优选约1天～约3天。
培养可以是分批培养、流加培养、连续培养中的任何一种。其中，优选分批培养。
反应可以在需氧条件下进行，也可以在还原条件下进行。
<还原条件>
在还原条件下，棒状细菌实质上不增殖，能够更高效地生产缬氨酸。
还原条件由反应液的氧化还原电位规定。反应液的氧化还原电位优选约-200mV～约-500mV，更优选约-250mV～约-500mV。
反应液的还原状态可以简单地利用刃天青指示剂(在还原状态下由蓝色脱色为无色)推测，使用氧化还原电位差计(例如，BROADLEY JAMES公司制造，ORP电极)可以准确地测定。
处于还原条件下的反应液的制备方法可以没有限制地使用公知的方法。例如，可以使用反应液用水溶液代替蒸馏水等作为反应液的液体介质，反应液用水溶液的制备方法可以参考例如硫酸还原微生物等绝对厌氧性微生物用培养液制备方法(Pfennig,N et.al.(1981):The dissimilatory sulfate-reducing bacteria,In The Prokaryotes,AHandbook on Habitats,Isolation and Identification of Bacteria,Ed.by Starr,M.P.et.al.p.926-940,Berlin,Springer Verlag.)或“农艺化学实验书第三卷、京都大学农学部农艺化学教室编、1990年第26次印刷、产业图书株式会社出版”等而得到期望的还原条件下的水溶液。
具体而言，可以通过对蒸馏水等进行加热处理或减压处理将溶解气体除去而得到还原条件的反应液用水溶液。在这种情况下，可以通过在约10mmHg以下、优选约5mmHg以下、更优选约3mmHg以下的减压条件下将蒸馏水等处理约1分钟～约60分钟、优选约5分钟～约40分钟来将溶解气体、特别是溶解氧除去而制成还原条件下的反应液用水溶液。
另外，也可以添加适当的还原剂(例如，硫代乙醇酸、抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、巯基乙酸、硫代乙酸、谷胱甘肽、硫化钠等)来制备还原条件的反应液用水溶液。
将上述方法适当组合而成的方法也是有效的还原条件的反应液用水溶液的制备方法。
反应中也优选将反应液维持于还原条件。为了维持反应过程中的还原条件，优选尽可能地防止从反应体系外混入氧，具体而言，可以列举将反应体系用氮气等惰性气体或二氧化碳等密封的方法。作为更有效地防止氧混入的方法，为了在反应过程中使本发明的需氧性细菌的菌体内的代谢功能高效地发挥作用，有时也需要添加维持反应体系的pH的调节液或适当添加各种营养素溶解液，在这种情况下，预先从添加溶液中除去氧是有效的。
缬氨酸的回收
通过以上述方式进行培养，在反应液中生产出缬氨酸。可以通过回收反应液来回收缬氨酸，也可以进一步利用公知的方法从反应液中分离出缬氨酸。作为这种公知的方法，可以列离子交换树脂法、浓缩法、晶析法、活性炭吸附洗脱法等。
实施例
以下，利用实施例详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。
实施例1突变乙酰羟酸合成酶基因的克隆
(1)缬氨酸类似物耐性株的获得
在30℃下将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)R株在300μg/ml的N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍中曝露1小时，接着将其在A培养基[将(NH2)2CO2g、(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素测定酪蛋白氨基酸7g溶解于蒸留水1L]中培养至约109cells/ml。回收菌体，将其用基本培养基(BT培养基)洗涤后，涂布于含有4％葡萄糖、作为缬氨酸类似物的4％DL-α-氨基丁酸的BT平板培养基上，在30℃下培养5天。
将在含有缬氨酸类似物的平板培养基上生长的突变株接种至加入了A液体培养基10ml的试管中，在33℃下进行需氧振荡培养16小时。通过离心分离(4℃、14500rpm、2分钟)回收所得到的培养菌体，用2ml BT培养基[Omumasaba,C.A.等,Corynebacteriumglutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite,ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]洗菌后，用1ml BT培养基进行悬浮。接着，以终浓度达到OD610＝0.1的方式从悬液接种至10ml BT培养基中，在33℃下进行需氧振荡培养48小时，筛选L-缬氨酸生产率高的菌株。
对采样得到的培养液进行离心分离(4℃、14500rpm、1分钟)，用氨基酸分析系统(岛津制作所制、Prominence)分析所得的上清液，由此进行缬氨酸的定量。分析条件如以下的表1所示。
表1
氨基酸分析系统测定条件
| 保护柱 | ISC-30/S0504(Na) |
| 氨基酸分析用柱 | Shim-pack VP-ODS |
| 移动相 | Na型氨基酸移动相试剂盒 |
| 柱温 | 60℃ |
| 流量 | 0.6ml/分钟 |
| 检测 | 分光荧光检测器 |
(2)突变乙酰羟酸合成酶基因的克隆和碱基序列的确定
如上获得的缬氨酸高产株的染色体DNA提取如下进行：在A培养基[将(NH2)2CO2g、(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素测定酪蛋白氨基酸7g溶解于1L蒸留水]中以达到最终浓度4％的方式添加50％(w/v)葡萄糖溶液作为碳源，用铂环接种菌株后，在33℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA IsolationKit、Amersham公司制)按照操作说明书从收集的菌体回收染色体DNA。
使用所得到的染色体DNA进行乙酰羟酸合成酶基因的序列分析，结果可以明确第156位的氨基酸甘氨酸氨基置换为了谷氨酸。
实施例2缬氨酸生产基因的克隆与表达
(1)从微生物中提取染色体DNA
从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)R(FERM P-18976)中提取染色体DNA的操作如下进行：在A培养基[将(NH2)2CO2g、(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素测定酪蛋白氨基酸7g溶解于1L蒸留水]中以达到最终浓度4％的方式添加50％(w/v)葡萄糖溶液作为碳源，用铂环接种菌株后，在33℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、Amersham公司制)按照操作说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。
从球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)NBRC3525中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRC Medium No.802培养基[将多价蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4·7H2O1g溶解于1L蒸留水]中后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA IsolationKit、Amersham公司制)按照操作说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。
(2)克隆载体的构建
克隆载体pCRB21的构建
通过以下的PCR法对分别包含来源于乳酪棒状杆菌JCM12072的质粒pCASE1的DNA复制起点(以下记作pCASE1-ori)序列和克隆载体pHSG398(宝生物株式会社制)的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了分别将pCASEl-ori序列、克隆载体pHSG398克隆化，基于序列号1(pCASEl-ori序列)、序列号2(克隆载体pHSG298)分别合成下述一对引物来使用。
pCASE1-ori序列扩增用引物
(a-1)；5’-GGCAGAGATCT AGAACGTCCGTAG-3’(序列号3)
(b-1)；5’-CGGAAAGATCT GACTTGGTTACGATG-3’(序列号4)
需要说明的是，引物(a-1)和(b-1)上附加有BglII限制性内切酶位点。
克隆载体pHSG398扩增用引物
(a-2)；5’-CAGTGGAGATCT GTCGAACGGAAG-3’(序列号5)
(b-2)；5’-CCGTTAGATCT AGTTCCACTGAGC-3’(序列号6)
需要说明的是，引物(a-2)和(b-2)上附加有BglII限制性内切酶位点。
模板DNA使用提取自由日本微生物保藏中心(JCM)获得的乳酪棒杆菌JCM12072的总DNA和克隆载体pHSG398(宝生物株式会社制造)。
实际的PCR中，使用Veriti热循环仪(应用生物系统公司制)，并使用PrimeSTAR HSDNA Polymerase(宝生物株式会社制)作为反应试剂在下述的条件下进行。
反应液：
将以上物质混合，并将该50μl的反应液用于PCR。
*)扩增pCASEl-ori序列时使用引物(a-l)与(b-l)的组合进行，扩增克隆载体pHSG398时使用引物(a-2)与(b-2)的组合进行。
PCR循环：
将以上过程作为一个循环，进行30个循环。
利用0.8％的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在pCASEl-ori序列的情况下能够检测到约1.5-kb的DNA片段，在克隆载体pHSG398的情况下能够检测到约2.2-kb的DNA片段。
将由上述PCR扩增出的包含来源于乳酪棒杆菌株的质粒pCASE1-ori序列的约1.5-kb的DNA片段10μl和包含克隆载体pHSG398的约2.2-kb的DNA片段10μl分别用限制性内切酶BglII进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接A液。
利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接A液转化大肠埃希氏菌HST02，并涂布到含有50μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基[1％多价蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂]上。
通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液提取质粒DNA，利用限制性内切酶BglII分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体PHSG398的约2.2-kb的DNA片段以外，还确认到pCASE-ori序列的约1.5-kb的DNA片段。
将包含pCASEl-ori序列的克隆载体命名为pCRB21。
克隆载体pCRB22的构建
通过以下的PCR法对分别包含来源于乳酪棒状杆菌JCM12072的质粒pCASE1的DNA复制起点(以下记作pCASE1-ori)序列、和克隆载体pHSG298(宝生物株式会社制)的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了分别将pCASEl-ori序列、克隆载体pHSG298克隆化，基于序列号7(pCASE1-ori序列)、序列号8(克隆载体pHSG298)分别合成下述一对引物来使用。
pCASE1-ori序列扩增用引物
(a-3)；5’-GGCAGAGATCT AGAACGTCCGTAG-3’(序列号9)
(b-3)；5’-CGGAAAGATCT GACTTGGTTACGATG-3’(序列号10)
需要说明的是，引物(a-3)和(b-3)上附加有BglII限制性内切酶位点。
克隆载体pHSG298扩增用引物
(a-4)；5’-GCTGGAGATCT AGGTTTCCCGAC-3’(序列号11)
(b-4)；5’-GGGAAAGATCT CGTGCCAGCTGC-3’(序列号12)
需要说明的是，引物(a-4)和(b-4)上附加有BglII限制性内切酶位点。
模板DNA使用提取自由日本微生物保藏中心(JCM)获得的乳酪棒杆菌JCM12072的总DNA和克隆载体pHSG298(宝生物株式会社制造)。
实际的PCR中，使用Veriti热循环仪(应用生物系统公司制)，并使用PrimeSTAR HSDNA Polymerase(宝生物株式会社制)作为反应试剂在下述的条件下进行。
反应液：
将以上物质混合，并将该50μl的反应液用于PCR。
*)扩增pCASEl-ori序列时使用引物(a-3)与(b-3)的组合进行，扩增克隆载体pHSG298时使用引物(a-4)与(b-4)的组合进行。
PCR循环：
将以上过程作为一个循环，进行30个循环。
利用0.8％的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在pCASEl-ori序列的情况下能够检测到约1.4-kb的DNA片段，在克隆载体pHSG298的情况下能够检测到约2.7-kb的DNA片段。
将由上述PCR扩增出的包含来源于乳酪棒杆菌株的质粒pCASE1-ori序列的约1.4-kb的DNA片段10μl和包含克隆载体pHSG298的约2.7-kb的DNA片段10μl分别用限制性内切酶BglII进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接B液。
利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接B液转化大肠埃希氏菌HST02，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1％多价蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂]上。
通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液提取质粒DNA，利用限制性内切酶BglII分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体PHSG298的约2.7-kb的DNA片段以外，还确认到pCASE-ori序列的约1.4-kb的DNA片段。
将包含pCASEl-ori序列的克隆载体命名为pCRB22。
克隆载体pCRB12的构建
通过以下的PCR法对分别包含来源于在谷氨酸棒杆菌内能够进行复制的质粒pCG1[(日本特开昭57-134500)]的DNA复制起点(以下记作pCG1-ori)序列、和克隆载体pHSG298(宝生物株式会社制)的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了分别将pCG1-ori序列、克隆载体pHSG298克隆化，基于序列号13(pCG1-ori序列)、序列号14(克隆载体pHSG298)分别合成下述一对引物来使用。
pCG1-ori序列扩增用引物
(a-5)；5’-GCGAAAGATCT AGCATGGTCGTC-3’(序列号15)
(b-5)；5’-GTGAGCAGATCT GGAACCGTTATC-3’(序列号16)
需要说明的是，引物(a-5)和(b-5)上附加有BglII限制性内切酶位点。
克隆载体pHSG298扩增用引物
(a-6)；5’-GCTGGAGATCT AGGTTTCCCGAC-3’(序列号17)
(b-6)；5’-GGGAAAGATCT CGTGCCAGCTGC-3’(序列号18)
需要说明的是，引物(a-6)和(b-6)上附加有BglII限制性内切酶位点。
模板DNA使用pCG1[(日本特开昭57-134500)]和克隆载体pHSG298(宝生物株式会社制)。
实际的PCR中，使用Veriti热循环仪(应用生物系统公司制)，并使用PrimeSTAR HSDNA Polymerase(宝生物株式会社制)作为反应试剂在下述的条件下进行。
反应液：
将以上物质混合，并将该50μl的反应液用于PCR。
*)扩增pCG1-ori序列时使用引物(a-5)与(b-5)的组合进行，扩增克隆载体pHSG298时使用引物(a-6)与(b-6)的组合进行。
PCR循环：
将以上过程作为一个循环，进行30个循环。
利用0.8％的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在pCG1-ori序列的情况下能够检测到约1.9-kb的DNA片段，在克隆载体pHSG298的情况下能够检测到约2.7-kb的DNA片段。
将由上述PCR扩增出的包含来源于质粒pCG1的pCG1-ori基因的约1.9-kb的DNA片段10μl和包含克隆载体pHSG298的约2.7-kb的DNA片段10μl分别用限制性内切酶BglII进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接C液。
利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接C液转化大肠埃希氏菌HST02，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1％多价蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂]上。
通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液提取质粒DNA，利用限制性内切酶BglII分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体pHSG298的约2.7-kb的DNA片段以外，还确认到pCG1-ori序列的约1.9-kb的DNA片段。
将包含pCG1-ori序列的克隆载体命名为pCRB12。
克隆载体pCRB207的构建
通过以下的PCR法对包含来源于谷氨酸棒杆菌R的编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的gapA基因的启动子序列(以下记作PgapA)的DNA片段、和包含来源于克隆载体pKK223-3(Pharmacia公司制)的rrnBT1T2双向终止子序列(以下记作终止子序列)的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了分别将PgapA序列和终止子序列克隆化，基于序列号19(PgapA序列)、序列号20(终止子序列)分别合成下述一对引物来使用。
PgapA序列扩增用引物
(a-7)；5’-CTCTGTCGAC CCGAAGATCTGAAGATTCCTG-3’
(序列号21)
(b-7)；5’-CTCTGTCGAC GGATCC CCATGG TGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG-3’ (序列号22)
需要说明的是，引物(a-7)上附加有SalI限制性内切酶位点，引物(b-7)上附加有SalI、BamHI和NcoI限制性内切酶位点。
终止子序列扩增用引物
(a-8)；5’-CTCTGCATGC CCATGG CTGTTTTGGCGGATGAGAGA-3’ (序列号23)
(b-8)；5’-CTCTGCATGC TCATGA AAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG-3 (序列号24)
需要说明的是，引物(a-8)上附加有SphI和NcoI限制性内切酶位点，引物(b-8)上附加有SphI和BspHI限制性内切酶位点。
模板DNA使用提取自谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)的染色体DNA和pKK223-3质粒(Pharmacia公司制)。
实际的PCR中，使用Veriti热循环仪(应用生物系统公司制)，并使用PrimeSTAR HSDNA Polymerase(宝生物株式会社制)作为反应试剂在下述的条件下进行。
反应液：
将以上物质混合，并将该50μl的反应液用于PCR。
*)扩增PgapA序列时使用引物(a-7)与(b-7)的组合进行，扩增终止子序列时使用引物(a-8)与(b-8)的组合进行。
PCR循环：
将以上过程作为一个循环，进行30个循环。
利用0.8％的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在PgapA序列的情况下能够检测到约0.6-kb的DNA片段，在终止子序列的情况下能够检测到约0.4-kb的DNA片段。
将由上述PCR扩增出的包含来源于谷氨酸棒杆菌R的PgapA序列的约0.6-kb的DNA片段10μl和克隆载体pCRB22的约4.1-kb分别用限制性内切酶SalI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接D液。
利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接D液转化大肠埃希氏菌HST02，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1％多价蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂]上。
通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶SalI分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体pCRB22的约4.1-kb的DNA片段以外，还确认到PgapA序列的约0.6-kb的DNA片段。
将包含PgapA序列的克隆载体命名为pCRB206。
将由上述PCR扩增出的包含来源于pKK223-3质粒的终止子序列的约0.4-kb DNA片段10μl用限制性内切酶NcoI和BspHI进行切割、将上述克隆载体pCRB2062μl用限制性内切酶NcoI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接E液。
利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接E液转化大肠埃希氏菌HST02，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1％多价蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂]上。
通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体pCRB206的约4.7-kb的DNA片段以外，还确认到终止子序列的约0.4-kb的DNA片段。
将包含rrnBT1T2终止子序列的克隆载体命名为pCRB207
(3)缬氨酸生产基因的克隆
来源于谷氨酸棒杆菌的缬氨酸生产基因的克隆
通过以下的PCR法对包含来源于谷氨酸棒杆菌的编码乙酰羟酸合成酶的ilvBN基因、编码乙酰羟酸异构还原酶的ilvC基因、编码二羟酸脱水酶的ilvD基因和编码转氨酶的ilvE基因的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了分别将ilvBN基因、ilvC基因、ilvD基因和ilvE基因克隆化，基于序列号25(谷氨酸棒杆菌ilvBN基因)、序列号26(谷氨酸棒杆菌ilvC基因)、序列号27(谷氨酸棒杆菌ilvD基因)和序列号28(谷氨酸棒杆菌ilvE基因)，使用应用生物系统(AppliedBiosystems)公司制的“394DNA/RNA synthesizer”，分别合成下述一对引物来使用。
ilvBN基因扩增用引物
(a-9)；5’-CTCTTCATGA ATGTGGCAGCTTCTCAAC-3’
(序列号29)
(b-9)；5’-CTCTTCATGA TTAGATCTTGGCCGGAGC-3’
(序列号30)
需要说明的是，引物(a-9)和(b-9)上附加有BspHI限制性内切酶位点。
ilvC基因扩增用引物
(a-10)；5’-CTCTCCATGG CTATTGAACTGCTTTATGATG-3’
(序列号31)
(b-10)；5’-CTCTCCATGG AGATCTTTAAGCGGTTTCTGCGCGA-3’ (序列号32)
需要说明的是，引物(a-10)和(b-10)上附加有NcoI限制性内切酶位点。
ilvD基因扩增用引物
(a-11)；5’-GACCCGGG GAGCAGATTTGAAAAGCGCATCATG-3’ (序列号33)
(b-11)；5’-GACCCGGG GGTACC GTATTTGCAACGGGGAGCTCCACCA-3’ (序列号34)
需要说明的是，引物(a-11)上附加有SmaI限制性内切酶位点，(b-11)上附加有SmaI和KpnI限制性内切酶位点。
ilvE基因扩增用引物
(a-12)；5’-GACCCGGG CATCCCATAAAATGGGGCTGACTAG-3’ (序列号35)
(b-12)；5’-GACCCGGG GAGCTC CCCTGACTCCACCCCCTACGTCTCA-3’ (序列号36)
需要说明的是，引物(a-12)上附加有SmaI限制性内切酶位点，(b-12)上附加有SmaI和SacI限制性内切酶位点。
来源于谷氨酸棒杆菌缬氨酸高产突变株的缬氨酸生产基因的克隆
通过以下的PCR法对包含来源于谷氨酸棒杆菌缬氨酸高产株的编码突变乙酰羟酸合成酶的ilvBN基因的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了分别将突变ilvBN基因克隆化，基于序列号37(谷氨酸棒杆菌突变ilvBN基因)，使用应用生物系统(Applied Biosystems)公司制的“394DNA/RNAsynthesizer”，分别合成下述一对引物来使用。
突变ilvBN基因扩增用引物
(a-13)；5’-CTCTTCATGA ATGTGGCAGCTTCTCAAC-3’
(序列号38)
(b-13)；5’-CTCTTCATGA TTAGATCTTGGCCGGAGC-3’
(序列号39)
需要说明的是，引物(a-13)和(b-13)上附加有BspHI限制性内切酶位点。
来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的缬氨酸生产基因的克隆
通过以下的PCR法对包含来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的编码亮氨酸脱氢酶的leudh基因的DNA片段进行扩增。
在PCR时，为了将leudh基因克隆化，基于序列号40(球形赖氨酸芽孢杆菌leudh基因)，使用应用生物系统(Applied Biosystems)公司制的“394DNA/RNA synthesizer”，分别合成下述一对引物来使用。
leudh基因扩增用引物
(a-14)；5’-ACGCCCGGG AGGAGGTACGGATGGAAATCTTCAAGTATAT-3’ (序列号41)
(b-14)；5’-TCGGCCCGGG GAGCTC TTAACGGCCGTTCAAAATATTTTT-3’ (序列号42)
需要说明的是，引物(a-14)上附加有SmaI限制性内切酶位点，(b-14)上附加有SmaI和SacI限制性内切酶位点。
关于模板DNA，谷氨酸棒杆菌使用提取自谷氨酸棒杆菌R和谷氨酸棒杆菌缬氨酸高产株的染色体DNA。球形赖氨酸芽孢杆菌使用提取自由NITE生物资源中心(NBRC)获得的球形赖氨酸芽孢杆菌NBRC3525的染色体DNA。
实际的PCR中，使用Veriti热循环仪(应用生物系统公司制)，并使用PrimeSTAR HSDNA Polymerase(宝生物株式会社制)作为反应试剂在下述的条件下进行。
反应液：
将以上物质混合，并将该50μl的反应液用于PCR。
*)扩增谷氨酸棒杆菌ilvBN基因时使用引物(a-9)与(b-9)的组合进行，扩增谷氨酸棒杆菌ilvC基因时使用引物(a-10)与(b-10)进行，扩增谷氨酸棒杆菌ilvD基因时使用引物(a-11)与(b-11)的组合进行，扩增谷氨酸棒杆菌ilvE基因时使用引物(a-12)与(b-12)的组合进行，扩增谷氨酸棒杆菌缬氨酸高产株突变ilvBN基因时使用引物(a-13)与(b-13)的组合进行，扩增球形赖氨酸芽孢杆菌leudh基因时使用引物(a-14)与(b-14)的组合进行。
PCR循环：
将以上过程作为一个循环，进行30个循环。
利用0.8％的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在谷氨酸棒杆菌ilvBN基因的情况下能够检测到约2.4-kb的DNA片段，在谷氨酸棒杆菌ilvC基因的情况下能够检测到约1.0-kb的DNA片段，在谷氨酸棒杆菌ilvD基因的情况下能够检测到约2.0-kb的DNA片段，在谷氨酸棒杆菌ilvE基因的情况下能够检测到约1.3-kb的DNA片段，在谷氨酸棒杆菌缬氨酸高产株突变ilvBN基因的情况下能够检测到约2.4-kb的DNA片段，在球形赖氨酸芽孢杆菌leudh基因的情况下能够检测到约1.1-kb的DNA片段。
(4)缬氨酸生产基因表达质粒的构建
缬氨酸生产基因向pCRB207中的克隆
将上述第(3)项中所示的通过PCR扩增出的包含来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvBN基因的约2.4-kb DNA片段10μl用限制性内切酶BspHI进行切割，将包含谷氨酸棒杆菌ilvC基因的约1.0-kb DNA片段10μl用限制性内切酶NcoI进行切割，将2μl含有PgapA启动子的克隆载体pCRB207用限制性内切酶NcoI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将3种DNA片段混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接F液。
另外，将上述第(3)项所示的通过PCR扩增出的包含来源于谷氨酸棒杆菌缬氨酸高产株的突变ilvBN基因的约2.4-kb DNA片段10μl用限制性内切酶BspHI进行切割，将包含来源于谷氨酸棒杆菌的ilvC基因的约1.0-kb DNA片段10μl用限制性内切酶NcoI进行切割，将2μl含有PgapA启动子的克隆载体pCRB207用限制性内切酶NcoI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将3种DNA片段混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接G液。
利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接F液和连接G液转化大肠埃希氏菌HST02，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1％多价蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂]上。
通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液提取质粒DNA，利用限制性内切酶分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到质粒pCRB207的约5.1-kb的DNA片段以外，在来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvBN基因和ilvC基因(连接F液)的情况下还确认到约3.4-kb的插入片段，在来源于谷氨酸棒杆菌缬氨酸高产株的突变ilvBN基因和来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvC基因(连接G液)的情况下还确认到约3.4-kb的插入片段。
将包含来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvBNC基因的质粒命名为pCRB207-ilvBNC/CG，将包含来源于谷氨酸棒杆菌缬氨酸高产株的突变ilvBNC基因的质粒命名为pCRB207-ilvBNGEC/CG。
缬氨酸生产基因向pCRB21中的克隆
将上述的质粒pCRB207-ilvBNC/CG和pCRB207-ilvBNGEC/CG用限制性内切酶BamHI进行切割，进行琼脂糖电泳后，利用QIAquick Gel Extraction Kit(株式会社Qiagen公司制)从琼脂糖凝胶回收的gapA启动子与来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvBNC基因和终止子序列连接而成的约4.4-kb的DNA片段、与用BamHI切割后得到的克隆载体pCRB21约3.7-kb在70℃下处理10分钟从而使限制性内切酶失活后的DNA片段混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接H液和I液。
利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接H液和I液转化大肠埃希氏菌HST02，并涂布到含有50μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基[1％多价蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂]上。
通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液提取质粒DNA，利用限制性内切酶BamHI对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到质粒pCRB21的约3.7-kb的DNA片段以外，在来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvBNC基因(连接H液)的情况下还确认到长度约4.4-kb的插入片段，在来源于谷氨酸棒杆菌缬氨酸高产株的突变ilvBN基因和来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvC基因(连接I液)的情况下还确认到约3.4-kb的插入片段。
将包含来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvBNC基因的质粒命名为pCRB-BNC，将包含来源于谷氨酸棒杆菌缬氨酸高产株的ilvBNC基因的质粒命名为pCRB-BNGEC(图1)。
缬氨酸生产基因向pKK223-3中的克隆
将上述第(3)项所示的通过PCR扩增出的包含来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvD基因的约2.0-kb DNA片段、包含来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvE基因的约1.3-kb DNA片段、包含来源于球形赖氨酸芽孢杆菌株的leudh基因的约1.1-kb DNA片段10μl和含有tac启动子的克隆载体pKK223-3(Pharmacia公司制)2μl分别用限制性内切酶SmaI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活后，将二者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接N液、O液和P液。
利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的3种连接N液、O液和P液分别转化大肠埃希氏菌HST02，并涂布到含有50μg/ml氨苄霉素的LB琼脂培养基[1％多价蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂]上。
通过常规方法对培养基上的生长株分别进行液体培养，从培养液提取质粒DNA，利用限制性内切酶分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到质粒pKK223-3约4.6-kb的DNA片段以外，在来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvD基因(连接N液)的情况下还确认到长度约2.0-kb的插入片段，在来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvE基因(连接O液)的情况下还确认到长度约1.3-kb的插入片段，在来源于球形赖氨酸芽孢杆菌株的leudh基因(连接P液)的情况下还确认到长度约1.1-kb的插入片段。
将包含来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvD基因的质粒命名为pKK223-3-ilvD/CG，将包含来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvE基因的质粒命名为pKK223-3-ilvE/CG，将包含来源于球形赖氨酸芽孢杆菌株的leudh基因的质粒命名为pKK223-3-leudh/LS。
缬氨酸生产基因向pCRB12中的克隆
通过以下的PCR法从上述的质粒pKK223-3-ilvD/CG对包含tac启动子和来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)R的ilvD基因的DNA片段进行扩增。
PCR时，基于tac启动子和来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvD基因(序列号43；Ptac-ilvD序列)分别合成下述一对引物来使用。
Ptac-ilvD序列扩增用引物
(a-17)；5’-ATATCCTGCAGGCTAGC GCTGTGCAGGTCGTAAATCACT-3’ (序列号44)
(b-17)；5’-ATATGCTAGC TCCTGCAGG TATTTGCAACGGGGAGCTC-3’ (序列号45)
需要说明的是，引物(a-17)上附加有Sse8387I和NheI限制性内切酶位点，(b-17)上附加有NheI和Sse8387I限制性内切酶位点。
模板DNA使用上述的质粒pKK223-3-ilvD/CG。
实际的PCR中，使用Veriti热循环仪(应用生物系统公司制)，并使用PrimeSTAR HSDNA Polymerase(宝生物株式会社制)作为反应试剂在下述的条件下进行。
反应液：
将以上物质混合，并将该50μl的反应液用于PCR。
*)扩增Ptac-ilvD/CG序列时使用引物(a-17)与(b-17)的组合进行。
PCR循环：
变性过程：94℃ 60秒
退火过程：52℃ 60秒
延伸过程：72℃ 130秒
将以上过程作为一个循环，进行30个循环。
利用0.8％的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，检测到Ptac-ilvD序列的约2.2-kb的DNA片段。
将上述通过PCR扩增出的包含tac启动子序列和来源于谷氨酸棒杆菌的ilvD序列的约2.2-kb DNA片段10μl和2μl克隆载体pCRB12分别用限制性内切酶Sse8387I进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活后，将二者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接Q液。
利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接Q液转化大肠埃希氏菌HST02，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1％多价蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂]上。
通过常规方法对培养基上的生长株分别进行液体培养，从培养液提取质粒DNA，利用限制性内切酶Sse8387I对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体pCRB12的约3.7-kb的DNA片段以外，在Ptac-ilvD序列(连接Q液)的情况下还确认到约2.2-kb的DNA片段。
将包含来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvD基因的质粒命名为pCRB12-ilvD/CG。
通过以下的PCR法从上述的质粒pKK223-3-ilvE/CG和pKK223-3-leudh/LS对包含tac启动子以及来源于谷氨酸棒杆菌的ilvE基因和来源于球形赖氨酸芽孢杆菌株的leudh基因的DNA片段进行扩增。
在PCR时，基于tac启动子融合来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvE基因(序列号46；Ptac-ilvE序列)和tac启动子融合来源于球形赖氨酸芽孢杆菌株的leudh基因(序列号47；Ptac-leudh序列)，分别合成下述一对引物来使用。
Ptac-ilvE序列扩增用引物
(a-18)；5’-ATATGCTAGC TCCTGCAGG CTGTGCAGGTCGTAAATCAC-3’ (序列号48)
(b-18)；5’-ATATCCTGCAGGCTAGC ATCCCTGACTCCACCCCCTAC-3’ (序列号49)
需要说明的是，引物(a-18)上附加有NheI和Sse8387I限制性内切酶位点，(b-18)上附加有Sse8387I和NheI限制性内切酶位点。
Ptac-leudh序列扩增用引物
(a-19)；5’-ATATGCTAGC TCCTGCAGG CTGTGCAGGTCGTAAATCAC-3’ (序列号50)
(b-19)；5’-ATGCCCTGCAGGCTAGC GTTAACGGCCGTTCAAAATAT-3’ (序列号51)
需要说明的是，引物(a-19)上附加有NheI和Sse8387I限制性内切酶位点，(b-19)上附加有Sse8387I和NheI限制性内切酶位点。
模板DNA使用上述的质粒pKK223-3-ilvE/CG及pKK223-3-leudh/LS。
实际的PCR中，使用Veriti热循环仪(应用生物系统公司制)，并使用PrimeSTAR HSDNA Polymerase(宝生物株式会社制)作为反应试剂在下述的条件下进行。
反应液：
将以上物质混合，并将该50μl的反应液用于PCR。
*)扩增Ptac-ilvE/CG序列时使用引物(a-18)与(b-18)的组合进行，扩增Ptac-leudh/LS序列时使用引物(a-19)与(b-19)的组合进行。
PCR循环：
将以上过程作为一个循环，进行30个循环。
利用0.8％的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，能够检测到Ptac-ilvE/CG序列的约1.5-kb的DNA片段和Ptac-leudh/LS序列的约1.3-kb的DNA片段。
将上述通过PCR扩增出的包含tac启动子序列融合来源于谷氨酸棒杆菌的ilvE序列的约1.5-kb DNA片段和包含tac启动子序列融合来源于球形赖氨酸芽孢杆菌株的leudh序列的约1.3-kb DNA片段10μl、以及2μl包含tac启动子序列融合来源于谷氨酸棒杆菌的ilvD序列的pCRB12-ilvD/CG分别用限制性内切酶NheI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接R液和S液。
利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接R液和S液转化大肠埃希氏菌HST02，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1％多价蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂]上。
通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶NheI对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到包含tac启动子序列融合来源于谷氨酸棒杆菌的ilvD序列的pCRB12-ilvD/CG的约5.9-kb的DNA片段以外，Ptac-ilvE序列(连接R液)的情况下还确认到约1.5-kb的DNA片段、Ptac-leudh序列(连接S液)的情况下还确认到约1.3-kb的DNA片段。
将包含来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvD和ilvE基因的质粒命名为pCRB-DE。将包含来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvD和来源于球形赖氨酸芽孢杆菌株的leudh基因的质粒命名为pCRB-DLD(图2)。
(5)向缬氨酸生产基因中的使用PCR的位点特异性突变引入
为了向来源于谷氨酸棒杆菌株的编码乙酰羟酸异构还原酶的ilvC基因中引入使缬氨酸生产率提高的突变，通过以下的方法对包含来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvBNC基因序列和来源于谷氨酸棒杆菌缬氨酸高产株的ilvBNC基因序列的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了将包含来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvBNC基因序列的质粒pCRB-BNC和包含来源于谷氨酸棒杆菌缬氨酸高产株的ilvBNC基因序列的质粒pCRB-BNGEC克隆化，基于序列号52(ilvC基因)分别合成下述一对引物来使用。
ilvC(S34G)突变引入用引物
(a-15)；5’-CGCACACGGCCAGAACC-3’(序列号53)
(b-15)；5’-GGTTCTGGCCGTGTGCG-3’(序列号54)
需要说明的是，下划线部分为突变引入碱基。
ilvC(L48E,R49F)突变引入用引物
(a-16)；5’-CATTGGTGAGTTCGAGGGC-3’(序列号55)
(b-16)；5’-GCCCTCGAACTCACCAATG-3’(序列号56)
需要说明的是，下划线部分为突变引入碱基。
(5)-1ilvC(S34G)突变引入
模板DNA使用含有来源于谷氨酸棒杆菌株的ilvBNC基因序列的质粒pCRB-BNC和含有来源于谷氨酸棒杆菌缬氨酸高产株的突变ilvBNC基因序列的质粒pCRB-BNGEC。
实际的PCR中，使用Veriti热循环仪(应用生物系统公司制)，并使用PrimeSTAR HSDNA Polymerase(宝生物株式会社制)作为反应试剂在下述的条件下进行。
反应液：
将以上物质混合，并将该50μl的反应液用于PCR。
*)扩增pCRB-BNC序列和pCRB-BNGEC序列时使用引物(a-15)与(b-15)的组合进行。
PCR循环：
将以上过程作为一个循环，进行30个循环。
利用0.8％的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，能够检测到包含pCRB-BNC序列的约8.1-kb的DNA片段和包含pCRB-BNGEC序列的约8.1-kb的DNA片段。
向上述通过PCR扩增出的包含pCRB-BNC的约8.1-kb DNA片段10μ和包含pCRB-BNGEC的约8.1-kb DNA片段中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝酒造株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接J液和K液。
利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接J液和K液转化大肠埃希氏菌HST02，并涂布到含有50μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基[1％多价蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂]上。
通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液提取质粒DNA，利用测序分析确认该质粒的碱基序列，由此确认突变引入位点的插入。
将包含来源于谷氨酸棒杆菌株的编码乙酰羟酸异构还原酶的ilvC基因的第34号氨基酸丝氨酸变更为甘氨酸的ilvC序列的质粒命名为pCRB-BNCSM和pCRB-BNGECSM。
(5)-2ilvC(L48E、R49F)突变引入
模板DNA使用上述1.ilvC(S34G)突变引入中构建的pCRB-BNCSM和pCRB-BNGECSM。
实际的PCR中，使用Veriti热循环仪(应用生物系统公司制)，并使用PrimeSTAR HSDNA Polymerase(宝生物株式会社制)作为反应试剂在下述的条件下进行。
反应液：
将以上物质混合，并将该50μl的反应液用于PCR。
*)扩增pCRB-BNCSM序列和pCRB-BNGECSM时使用引物(a-16)与(b-16)的组合进行。
PCR循环：
将以上过程作为一个循环，进行30个循环。
利用0.8％的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，能够检测到包含pCRB-BNCSM序列的约8.1-kb的DNA片段和包含pCRB-BNGECSM序列的约8.1-kb的DNA片段。
向上述通过PCR扩增出的包含pCRB-BNCSM的约8.1-kb DNA片段10μ和包含pCRB-BNGECSM的约8.1-kb DNA片段中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝酒造株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接L液和M液。
利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接L液和M液转化大肠埃希氏菌HST02，并涂布到含有50μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基[1％多价蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂]上。
通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液提取质粒DNA，利用测序分析确认该质粒的碱基序列，由此确认突变引入位点的插入。
将包含来源于谷氨酸棒杆菌株的编码乙酰羟酸异构还原酶的ilvC基因的第34号氨基酸丝氨酸变更为甘氨酸、第48号氨基酸亮氨酸变更为谷氨酸、第49号氨基酸精氨酸变更为苯丙氨酸的ilvC序列的质粒命名为pCRB-BNCTM和pCRB-BNGECTM(图1)。
(6)缬氨酸生产基因导入株的构建
使用上述的质粒pCRB-BNC和pCRB-DE，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.、Vol.54、443-447(1990)和Res.Microbiol.、Vol.144、181-185(1993)]转化谷氨酸棒杆菌R ldhAmutant[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.,Vol.8,243-254(2004)]株，并涂布到含有卡那霉素50μg/ml和氯霉素5μg/ml的A琼脂培养基上。
通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液提取质粒DNA，用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入质粒。结果，确认了上述中制作的质粒pCRB-BNC和pCRB-DE的导入。
将所得到的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)VAL1。
使用上述的质粒pCRB-BNCTM和pCRB-DE，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.,Vol.54、443-447(1990)和Res.Microbiol.,Vol.144,181-185(1993)]转化谷氨酸棒杆菌RldhA mutant[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.,Vol.8,243-254(2004)]株，并涂布到含有卡那霉素50μg/ml和氯霉素5μg/ml的A琼脂培养基上。
通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液提取质粒DNA，用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入质粒。结果，确认了上述中制作的质粒pCRB-BNCTM和pCRB-DE的导入。
将所得到的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)VAL2。
使用上述的质粒pCRB-BNCTM和pCRB-DLD，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.,Vol.54,443-447(1990)和Res.Microbiol.,Vol.144,181-185(1993)]转化谷氨酸棒杆菌RldhA mutant[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.,Vol.8,243-254(2004)]株，并涂布到含有卡那霉素50μg/ml和氯霉素5μg/ml的A琼脂培养基上。
通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入质粒。结果，确认了上述中制作的质粒pCRB-BNCTM和pCRB-DLD的导入。
将所得到的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)VAL3。
使用上述的质粒pCRB-BNGECTM和pCRB-DLD，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.,Vol.54,443-447(1990)和Res.Microbiol.,Vol.144,181-185(1993)]转化谷氨酸棒杆菌RldhA mutant[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.,Vol.8,243-254(2004)]株，并涂布到含有卡那霉素50μg/ml和氯霉素5μg/ml的A琼脂培养基上。
通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液提取质粒DNA，用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入质粒。结果，确认了上述中制作的质粒pCRB-BNGECTM和pCRB-DLD的导入。
将所得到的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)VAL4。
本株的基因重组的概要总结示出于表2中。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)VAL4保藏于日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8(邮政编码292-0818)的独立行政法人产品评价技术基础机构专利生物保藏中心(保藏日：2012年7月9日、保藏号：NITE BP-1122)。
表2
缬氨酸生产基因导入株
*)表内所示的简称如下所述
＜基因起源简称＞
CG：来源于谷氨酸棒杆菌
LS：来源于球形赖氨酸芽孢杆菌
ΔldhA：乳酸脱氢酶基因破坏
ilvBNC：野生型乙酰羟酸合成酶基因和野生型乙酰羟酸异构还原酶基因
ilvBNCTM：野生型乙酰羟酸合成酶基因和突变乙酰羟酸异构还原酶基因(S34G、L48E、R49F)
ilvBNGECTM：突变乙酰羟酸合成酶基因(G156E)和突变乙酰羟酸异构还原酶基因(S34G、L48E、R49F)
ilvD：野生型二羟酸脱水酶基因
ilvE：野生型转氨酶基因
leudh：野生型亮氨酸脱氢酶基因
实施例3谷氨酸棒杆菌缬氨酸生产基因导入株的缬氨酸生成实験
为了调查以各种组合对作为缬氨酸生产基因的编码乙酰羟酸合成酶的谷氨酸棒杆菌的ilvBN基因或缬氨酸高生产率的突变型ilvBNGE基因、编码乙酰羟酸异构还原酶的谷氨酸棒杆菌的ilvC基因或缬氨酸高生产率的突变型ilvCTM基因、编码二羟酸脱水酶的谷氨酸棒杆菌的ilvD基因、编码转氨酶的谷氨酸棒杆菌的ilvE基因或编码亮氨酸脱氢酶的球形赖氨酸芽孢杆菌的leudh基因进行基因重组时的效果，在谷氨酸棒杆菌R ldhA mutant(L-乳酸脱氢酶基因破坏)株中导入实施例2所示的各基因，进行缬氨酸的生产比较。
将实施例2(表2)所示的各种缬氨酸生产株涂布到含有卡那霉素50μg/ml和氯霉素5μg/ml的A琼脂培养基[将(NH2)2CO2g、(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素测定酪蛋白氨基酸7g、葡萄糖40g、琼脂15g悬浮于1L蒸留水]上，在28℃下在暗处静置20小时。
接种一铂环上述的平板中生长的谷氨酸棒杆菌缬氨酸生产基因导入株到装有10ml含有各抗生素的A液体培养基[将(NH2)2CO2g、(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素测定酪蛋白氨基酸7g、葡萄糖40g溶解于1L蒸留水]的试管中，在28℃下需氧振荡培养15小时。
＜需氧培养＞
将在上述条件下生长的谷氨酸棒杆菌缬氨酸生成株接种到装有500ml含有卡那霉素50μg/ml、氯霉素5μg/ml和吉欧霉素25μg/ml的A液体培养基的容量2L的三角烧瓶中，在28℃下需氧振荡培养15小时。
＜还原条件下的缬氨酸制造＞
对于如上培养增殖的各个菌体，通过离心分离(4℃、5000×g,15分钟)回收菌体。将所得到的菌体以达到40g细胞干重/L的方式悬浮于BT(-尿素)液体培养基[0.7％硫酸铵、0.05％磷酸二氢钾、0.05％磷酸氢二钾、0.05％硫酸镁·7水合物、0.0006％硫酸铁·7水合物、0.00042％硫酸锰水合物、0.00002％生物素、0.00002％硫胺素盐酸盐]。将该各菌体悬液60ml装入容量100ml培养瓶中，在还原条件下(氧化还原电位：-450mV)、添加葡萄糖至8％，在保持为33℃的水浴中边搅拌边进行反应。此时，使用2.5N的氨水以使反应液的pH不低于7.0，边用pH控制器(able株式会社制、型号：DT-1023)进行控制边进行反应。
对24小时后采样得到的反应液进行离心分离(4℃、15000×g、10分钟)，使用所得到的上清液进行缬氨酸的定量。
结果如以下的表3所示。
未导入缬氨酸生产相关基因表达质粒的谷氨酸棒杆菌ΔldhA株生成了5.37mM的缬氨酸，VAL1株生成了53.9mM的缬氨酸。即，通过ilvBNCDE基因的高表达，缬氨酸生成量增大约10倍。
与VAL1株相比，VAL2株生成了239mM的缬氨酸。即通过从野生型ilvC基因转变为突变型ilvCTM基因，进行高表达，由此，缬氨酸生成量进一步增大约4.4倍。
与VAL2株相比，VAL3株生成了1170mM的缬氨酸。即通过从ilvE基因转变为leudh基因，进行高表达，由此，缬氨酸生成量进一步增大约4.9倍。
与VAL3株相比，VAL4株生成了1470mM的缬氨酸。即通过从野生型ilvBN基因转变为突变型ilvBNGE基因，进行高表达，由此，缬氨酸生成量进一步增大1.3倍。
表3
缬氨酸生产基因导入株中的缬氨酸生成实验
*)表内所述的简称与表2相同
产业上的可利用性
根据本发明方法，能够使用微生物以实用的效率制造缬氨酸。
Claims (9)
1.一种转化体，其通过在宿主棒状细菌中导入由序列号57的碱基序列构成的DNA而得到。
2.如权利要求1所述的转化体，其中，还导入了来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的编码亮氨酸脱氢酶的DNA。
3.如权利要求1所述的转化体，其中，还导入了由序列号37的碱基序列构成的DNA。
4.如权利要求1所述的转化体，其中，还导入了来源于谷氨酸棒杆菌的编码二羟酸脱水酶的DNA。
5.如权利要求1所述的转化体，其中，还导入了由序列号37的碱基序列构成的DNA以及来源于谷氨酸棒杆菌的编码二羟酸脱水酶的DNA。
6.如权利要求1所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为乳酸脱氢酶基因被破坏或缺失的棒状细菌。
7.一种保藏号为NITE BP-1122的谷氨酸棒杆菌VAL4转化体。
8.一种缬氨酸的制造方法，其包括：
使通过在宿主谷氨酸棒杆菌中导入由序列号57的碱基序列构成的DNA而得到的转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应的步骤；和
回收反应液中的缬氨酸的步骤。
9.如权利要求8所述的缬氨酸的制造方法，其中，在反应步骤中，转化体实质上不增殖。
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Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPS62166890A (ja) | 1986-01-20 | 1987-07-23 | Asahi Chem Ind Co Ltd | イソクエン酸デヒドロゲナ−ゼ産生遺伝子を含むｄｎａ断片 |
| JPH07108228B2 (ja) | 1990-10-15 | 1995-11-22 | 味の素株式会社 | 温度感受性プラスミド |
| JPH05344893A (ja) | 1992-06-12 | 1993-12-27 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | アセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用 |
| JP2005245466A (ja) * | 1995-01-10 | 2005-09-15 | Toyobo Co Ltd | 生体成分測定方法およびそのための試薬組成物 |
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| JP2000262288A (ja) | 1999-03-16 | 2000-09-26 | Ajinomoto Co Inc | コリネ型細菌の温度感受性プラスミド |
| US7368268B2 (en) | 2003-07-29 | 2008-05-06 | Research Institute Of Innovative Technology For The Earth | Coryneform bacterium transformant and process for producing dicarboxylic acids using the same |
| DE102004014280A1 (de) | 2004-03-22 | 2005-10-27 | Degussa Ag | Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Aminosäuren mittels eines Ganzzellkatalysators |
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| KR100832740B1 (ko) | 2007-01-17 | 2008-05-27 | 한국과학기술원 | 분지쇄 아미노산 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를이용한 분지쇄 아미노산의 제조방법 |
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| CN102286505B (zh) | 2011-05-26 | 2013-04-03 | 江南大学 | 用于发酵生产l-缬氨酸的重组dna、菌株及方法 |
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| Corynebacterium glutamicum tailored for high-yield L-valine production;Bastian Blombach，et al;《Appl Microbiol Biotechnol》;20080401;第79卷;471－479 * |
| Feedback-Resistant Acetohydroxy Acid Synthase Increases Valine Production in Corynebacterium glutamicum;Veronika Elisakova,et al;《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》;20050131;第71卷(第1期);207－213 * |
| Metabolic engineering of the L-valine biosynthesis pathway in Corynebacterium glutamicum using promoter activity modulation;Jirí Holátko,et al;《Journal of Biotechnology》;20090205;第139卷;203－210 * |
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