CN103184160A - 一种产耐有机溶剂脂肪酶的菌株、耐有机溶剂脂肪酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域。脂肪酶广泛存在于动物组织、植物和微生物体中，可以催化酯类化合物的水解、醇解、酯化、酯交换以及化合物的合成等。本发明目的在于提供一种能够生产耐有机溶剂脂肪酶的枝孢霉属，该菌株为枝孢霉属菌株(Cladosporium sp.)WBRD3.10062425，保藏编号为CGMCC No.4962。本发明的另一目的是提供该菌株生产的耐有机溶剂脂肪酶及其制备方法，本发明菌株生产的脂肪酶为耐有机溶剂脂肪酶，对甲醇、乙醇和丙酮具有很强的耐受性，在生物柴油、医药工业、食品、油脂化工、环境保护、洗涤剂、纺织、造纸等多个工业领域中有广泛的应用价值。

Description

一种产耐有机溶剂脂肪酶的菌株、耐有机溶剂脂肪酶及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的涉及一种能产耐有机溶剂脂肪酶的枝孢霉属菌株(Cladosporium sp.)WBRD3.10062425，保藏编号为：CGMCCNo.4962，以及该菌株所产的耐有机溶剂脂肪酶以及该脂肪酶的制备方法。

背景技术

脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)是一类特殊的酯键水解酶，广泛存在于动物组织、植物和微生物体中。脂肪酶可以催化酯类化合物的水解、醇解、酯化、酯交换以及化合物的合成等反应，因而可应用于多种工业中，如食品工业、乳制品工业、医药工业、洗涤剂工业、纺织工业、生物柴油、造纸、皮革、化妆品、材料合成和环境工业等(Hasan F，Ali SA，Hameed A.Industrialapplications of microbial lipases.Enzyme Microb Technol，2006，39：235-251.)。

脂肪酶同蛋白酶等其它工业酶制剂品种一样，在不同的应用领域内其性质要求多种多样。如食品工业上可以用脂肪来来生产改性芝士、结构脂肪、类可可脂以及产生特殊风味等(Iwasaki Y.，Yamane T.Enzymatic synthesis ofstructured lipids.J.Molecular Catalysis B：Enzymatic.2000，10：129-140.；Hasan F.，Shah A.A.，Hameed A.Industrial applications of microbial lipases.Enzyme andMicrobial Technology 2006，39：235-251.)，这样就对脂肪酶在脂肪酸选择性、甘油三酯的位置选择性、底物选择性、热稳定性等方面提出了不同的要求。

在医药工业上，可以用脂肪酶来催化有机合成反应，如合成手性胺、硫氮酮等(Jaeger K.E.，Reetz M.T.Microbial lipases from versatile tools forbiotechnology.Trends in Biotechnology.1998，16：396-403.)，如此就要求脂肪酶具有较强的有机溶剂耐受性、较强的催化活性等。

在洗涤剂工业上脂肪酶是仅次于蛋白酶、淀粉酶之外的第三大酶种，洗涤剂脂肪酶主要是利用脂肪酶的水解去污特性。但是因为洗涤剂配方的复杂性以及反应条件的苛刻性，故要求脂肪酶具有较高的热稳定性、表面活性剂耐受性、较强的抗氧化性、低温活性等(Hasan F.，Shah A.A.，Javed S.，et al.Enzymes used in detergents：Lipases.Afric.J.Biotechn.2010，9(31)：4836-4844.；陈贵元，魏云林.低温脂肪酶的研究现状与应用前景.生物技术通报2006，(2)：29-32.)。

在生物柴油工业中，脂肪酶催化法较化学碱法而言对原料的选择性低，可利用酸值较高的废油及工业下脚料。另外脂肪酶酶法还具有反应条件温和、能耗低、醇用量小、产物及副产物较易分离且无污染排放等许多优点。该方法克服了碱催化法的严重缺陷，是一种更理想的节能、环保型工艺。酶法加工是生物柴油今后发展的一个趋势，但是脂肪酶的成本以及酶的稳定性主要是指脂肪酶对甲醇的耐受性是该技术的瓶颈问题(吴义真，邹有土，林琳.脂肪酶催化合成生物柴油的瓶颈问题及其对策.中国生物工程杂志.2008，28(2)：117-123.)。

总之，因为各个工业环节对脂肪酶的具体性质要求多种多样，没有一种脂肪酶产品能够适合所有的工业环节应用，因而寻找和开发不同性质的脂肪酶产品则成为了共识。因为微生物具有培养简单、周期短、产量大等特点，工业用途的酶制剂基本上都来源于微生物。脂肪酶也不例外，目前已知大约有2％的微生物产脂肪酶，至少包括65个属，其中细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属(汪小锋，王俊，杨江科等.微生物发酵生产脂肪酶的研究进展.生物技术通报.2008，(4)：47-53.)。这些微生物中关注比较多的有芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、地霉属(Geotrichum)、假丝酵母属(Candida)、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)和毛霉属(Mucor)等。

涉及脂肪酶产生菌的专利(申请)主要有：1、中国专利ZL200610106574.2，发明名称为“一种低温脂肪酶菌株、低温脂肪酶及其生产方法”，授权公告号为CN101130757B，公开了一株出芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)，该酵母所产脂肪酶为低温脂肪酶，最适作用温度在25-30℃，在5-45℃范围内均有酶活性，在30℃下保温80min，其酶活性仍可保持80％左右，最适作用pH在6.5左右，在pH5-8范围内可保持较高的酶活性等；2、中国专利ZL 200810233626.1，发明名称为“耶尔森氏菌属菌株KM1和由其制备的低温碱性脂肪酶及其纯化方法”，授权公告号为CN101486979B，公开了一种来源于耶尔森氏菌属(Yersinia sp.)菌株KM1的低温脂肪酶及其生产菌株，该菌株所产低温脂肪酶的分子量为34.3kDa，最适作用温度为37℃，最适作用pH为9.0，在pH7.2-10.0内稳定，能耐受50-80％的部分有机溶剂如甲醇、乙醇和DMSO；3、中国专利ZL 200410096668.7，发明名称为“一种新型低温碱性脂肪酶和产生该酶的适冷性海洋酵母”，授权公告号为CN1301326C，公开了一株适冷性海洋酵母菌株Bohaisea-9145，该菌株所产脂肪酶的分子量为38kDa，最适作用温度在35℃，最适pH为8.5；4、中国专利ZLCN94193220.6，发明名称“新颖的脂肪酶、产生该脂肪酶的微生物、该脂肪酶的制造方法及用途”，授权公告号为CN1072718C，公开了一种假单胞菌属细菌脂肪酶及其产生菌，该脂肪酶分子量为31kDa左右，在pH3.5-12范围内有作用，最适pH在10-12，30-80℃范围内均有作用，最佳反应温度为55-65℃；5、中国ZL03113274.X，发明名称为“一种脂肪酶产生菌及其筛选方法和产业化应用”，授权公告号为CN1181187C，公开了一种华根霉(Rhizopus chinensis)及其产生的一种可用于有机相中催化芳香酯合成的脂肪酶。

虽然关于脂肪酶的研究较多，但是关于耐有机溶剂的野生脂肪酶的报道却不多。前述中国专利CN101486979B报道的耶尔森氏菌脂肪酶对甲醇、乙醇有一定耐受性；欧洲专利申请EP2360178报道的表皮葡萄球菌Staphylococcusepidermidis AT2的脂肪酶能耐受25％(v/v)的DMSO、甲苯，但是甲醇、乙醇等则是其基本全部失活；司圣乾等报道了一种含有25％(v/v)的正己烷和氯仿假单胞菌脂肪酶在4℃放置24h后活力没有损失(司圣乾，陈彦，刘燕雅等.Pseudomonas sp.RT 1低温脂肪酶的纯化及酶学特性.生物加工过程.2010，8(6)：52-56.)；美国专利申请US20050260737报道了一种球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus 205y脂肪酶，该脂肪酶在含有25％(v/v)的正己烷情况下脂肪酶活力有一定提高；中国专利申请201110126164.5，发明名称为“一种耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株及其应用，公开号为CN102220268A报道了一种耐有机溶剂的荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens C1可用于制备耐有机溶剂的脂肪酶。汤彦翀等人报道了一种来自于腐生葡萄球菌Staphylococcus saprophyticus M36的脂肪酶在含有25％(v/v)的部分有机溶剂中仍能保持一定的活性(汤彦翀，卢亚萍，吕凤霞等.腐生葡萄球菌M36耐有机溶剂脂肪酶基因的克隆与原核表达.生物工程学报.2009，25(12)：1989-1995.)。袁红玲等通过添加甲苯作为唯一碳源进行预培养，然后以透明圈平板筛选法从土壤样品中成功地筛选到了1株耐有机溶剂的产脂肪酶的酵母菌，初步鉴定为耶罗威亚酵母(Yarrowia sp.)(袁红玲，汤鲁宏，许正宏，等.产有机相催化酯合成活性的脂肪酶菌株的筛选.微生物学通报，2007，34(1)：19-23.)。除此之外还有来源于皱褶假丝酵母、南极假丝酵母、地芽孢杆菌、不动杆菌等的脂肪酶具有耐有机溶剂性质的报道(彭仁，魏东芝.耐有机溶剂脂肪酶的研究进展.生物技术.2008，18(5)：92-95.；Ebrahimpour A，Rahman RN，Basri M，et al.High level expression and characterization of a novelthermostable，organic solvent tolerant，1，3-regioselective lipase from Geobacillussp.strain ARM.Bioresour Technol.2011，102(13)：6972-6981.；Uttatree S，Winayanuwattikun P，Charoenpanich J.Isolation and characterization of a novelthermophilic-organic solvent stable lipase from Acinetobacter baylyi.ApplBiochem Biotechnol.2010Nov；162(5)：1362-76.；Ahmed EH，Raghavendra T，Madamwar D.An alkaline lipase from organic solvent tolerant Acinetobacter sp.EH28：Application for ethyl caprylate synthesis.Bioresour Technol.2010May；101(10)：3628-34.)。

但以上这些专利文献、科技文献报道的耐有机溶剂脂肪酶的来源微生物基本上是细菌和酵母。

关于枝孢霉属(Cladosporium)产出脂肪酶的报道只有Fapohunda在2006年报道的Cladosporium cladosporioides脂肪酶的产出条件研究(Fapohunda，S.O.Production of lipase and toxic metabolites by Cladosporium cladosporioides undervaried conditions.Mycologia Balcanica 2006，3：89-93.)。

目前尚无来源于枝孢霉属(Cladosporium)产出耐有机溶剂特别是甲醇、乙醇等的脂肪酶的相关报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种能够生产耐有机溶剂脂肪酶的枝孢霉属的丝状真菌，本发明的另一目的是提供该菌株生产的耐有机溶剂脂肪酶及其制备方法。

本发明提供一种能产耐有机溶剂脂肪酶的丝状真菌，该丝状真菌分离自西藏地区传统食品——天然藏酥油的枝孢霉属(Cladosporium sp.)菌株WBRD3.10062425。

本发明提供了一种脂肪酶产生菌，分类命名为枝孢霉(Cladosporium sp.)，保藏编号为CGMCC No.4962。

本发明还提供了一种生产脂肪酶的方法，包括以下步骤：在适合生产的情况下，于25℃-32℃培养上述的脂肪酶产生菌，从而使该菌株产生脂肪酶；从培养基中分离出脂肪酶。较佳地，28℃培养上述的脂肪酶产生菌。

所述的脂肪酶，分子量为40-52kDa，为耐有机溶剂脂肪酶，对甲醇、乙醇和丙酮具有很强的耐受性。

所述的脂肪酶，最适反应温度在45℃附近，最适反应pH范围在pH9.5-10.0；该脂肪酶具有较强的热稳定性，Triton X-100可以大大提高该脂肪酶的活力。

上述的生产脂肪酶的方法，以本发明的枝孢霉属(Cladosporium sp.)WBRD3.10062425菌株为原料，由以下步骤组成：

(A)菌株于25-32℃，120-250rpm下于发酵培养基中培养64-72小时，发酵培养基的配方如下：蔗糖0.1-5％、蛋白胨0-10％、玉米粉0-5％、酵母浸出粉0-5％、吐温-800-3％、滑石粉0-2％、NaNO₃0-1％、KH₂PO₄0.7％、Na₂HPO₄·12H₂O 0.25％、MgSO₄·12H₂O 0.1％、CaCl₂0.05％、橄榄油0-5％，pH6.5；

(B)发酵液过滤除去菌丝体，滤液采用5-30kDa的膜进行超滤浓缩，对浓缩液进行硫酸铵盐析，收集30-60％饱和度的盐析沉淀物；

(C)用疏水层析柱对盐析产物进行层析纯化，先用浓度为20-100mM的，pH6.0-8.5缓冲液进行洗脱，再用蒸馏水洗脱，最后用10-70％的乙醇水溶液洗脱并收集该洗脱组分；经过缓冲液置换后用离子交换层析纯化，收集主要的脂肪酶活性峰经过缓冲液置换后即可。

优选地，上述的生产脂肪酶的方法，以本发明的枝孢霉属(Cladosporiumsp.)WBRD3.10062425菌株为原料，由以下步骤组成：

(A)25-32℃，120～250rpm下于发酵培养基中培养64-72小时，发酵培养基的配方如下：蔗糖2％、蛋白胨3％、玉米粉0.5％、酵母浸出粉1％、吐温-800.5％、滑石粉0.1％、NaNO₃0.3％、KH₂PO₄0.7％、Na₂HPO₄·12H₂O 0.25％、MgSO₄·12H₂O 0.1％、CaCl₂0.05％、橄榄油0.5％，pH 6.5；

较佳地，菌株于28℃，200rpm下于发酵培养基中培养64-72小时。

(B)发酵液过滤除去菌丝体，滤液采用5～30kDa的膜进行超滤浓缩，对浓缩液进行硫酸铵盐析，收集30-60％饱和度的盐析沉淀物；

较佳地，发酵液收集后用滤纸进行过滤，收集的清液经过0.22μm的微孔滤膜过滤进一步澄清后，再用10kDa的超滤膜进行超滤以浓缩；

(C)用HiTrap phenyl HP的苯基疏水层析柱对盐析产物进行层析纯化，先用20mM～100mM浓度的pH6.0-8.5的缓冲液进行洗脱，再用蒸馏水洗脱，最后用10-70％的乙醇水溶液洗脱并收集该洗脱组分；经过缓冲液置换后用MonoQ^TM层析柱进行离子交换层析纯化，收集主要的脂肪酶活性峰经过缓冲液置换后即可。

本发明的具体技术方案如下：

1、菌株筛选及鉴定

本发明所提供的菌株Cladosporium sp.WBRD3.10062425分离自中国西藏、甘肃等地区的藏族传统食品——天然藏酥油。将新鲜的酥油样品通过富集培养或稀释涂布于罗丹明B平板上筛选得到一株可产大量胞外脂肪酶的菌株。该菌株经过形态学和18S rDNA鉴定属于枝孢霉(Cladosporium)属，命名为Cladosporium sp.WBRD3.10062425。

该菌株已于申请日前保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。该保藏单位的地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编是100101。该菌株的保藏日期是2011年6月17日，保藏号是CGMCC No.4962，分类命名为：枝孢霉Cladosporium sp.。

上述的脂肪酶的筛选方法为罗丹明B平板法，将待考察菌株或菌体悬浮液点种或稀释涂布于罗丹明B平板上，按照菌株相适应的生长条件进行培养，本发明的菌株培养温度在25-32℃。生长3-6天时在波长为365nm的紫外灯下观察菌落周围是否形成橙色的荧光圈，根据荧光圈的有无、强弱来判断该菌产生胞外脂肪酶的能力。荧光强烈或荧光圈直径比较大可一定程度上说明胞外脂肪酶的分泌能力强。

该方法的筛选平板制备方法如下：

配方甲液(硫酸铵0.1％，酵母浸出汁0.5％，胰蛋白胨0.5％，K₂HPO₄0.1％，KC10.5％，七水合硫酸镁0.05％，七水合硫酸亚铁0.01％，琼脂2.0％)115℃灭菌30min后加入同样方式灭菌的配方乙液(橄榄油与2％聚乙烯醇以1∶3比例混合，10000rpm搅拌乳化)，充分混合后按照1％(v/v)的量加入过滤除菌的0.1％的罗丹明B溶液。充分混匀后制备得到筛选平板。

根据罗丹明B平板法筛选得到一株在365nm紫外灯下具有显著荧光圈的菌株(如图1所示)即WBRD3.10062425菌株。

经过对丝状真菌WBRD3.10062425在不同培养基上生长的菌落形态和显微形态观察参考《真菌鉴定手册》(魏景超遗著.真菌鉴定手册.上海科学技术出版社.1979年9月第一版)、《真菌的形态和分类》(戴芳澜遗著.真菌的形态和分类.科学出版社.1987年3月第一版)以及《中国真菌志》(张中义主编.中国真菌志第十四卷枝孢属黑星孢属梨孢属.科学出版社.2003年4月第一版)等判断其与枝孢霉(Cladosporium)属菌最相似。

对该菌的18S rDNA测序，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示，进行比对后发现该菌与Cladosporium cladosporioides，Cladosporium bruhnei，Cladosporium uredinicola以及Cladosporium cellare具最高同源性超过99％。

2、耐有机溶剂脂肪酶的制备

取一支新鲜培养的枝孢霉Cladosporium sp.WBRD3.10062425斜面(PDA培养基25-32℃培养120h)，用无菌水洗涤制成孢子悬浮液，按照0.1-1×10⁶mL^-1的量接种至种子摇瓶中，25-32℃、120-250rpm培养24h左右。而后以5-10％的接种量接种至发酵培养基中，25-32℃、120-250rpm摇床培养64-72h。培养液过滤除去菌丝体，滤液采用5-30kDa的膜进行超滤浓缩。而后对浓缩液进行硫酸铵盐析，收集30-60％饱和度的盐析沉淀物。再用Hitrap pheny1HP色谱柱对该盐析蛋白样品进行疏水层析纯化，先用无盐缓冲液洗脱，再用蒸馏水洗脱，最后用10-70％的乙醇水溶液进行洗脱。收集乙醇溶液洗脱组份，超滤置换缓冲液后再经过Mono Q^TM(GE Healthcare)色谱柱纯化后收集活性组分即制备得到本发明所述的脂肪酶。

上述枝孢霉培养的种子培养基组成为(单位g·L^-1)：葡萄糖30，蛋白胨3，玉米粉5，NaH₂PO₄·12H₂O 2，MgSO₄·12H₂O 1，CaCl₂0.5，pH 6.5。

上述的枝孢霉产脂肪酶的发酵培养基组成(单位g·L^-1)：蔗糖20，蛋白胨30，玉米粉5，酵母浸出粉10，吐温-805，滑石粉1，NaNO₃3，KH₂PO₄7，Na₂HPO₄·12H₂O 2.5，MgSO₄·12H₂O 1，CaCl₂0.5，橄榄油5，pH 6.5；

上述的脂肪酶的疏水层析纯化过程所采用的起始缓冲液为20-100mM浓度，pH6.0-8.5的含有0.1-0.8M(NH₄)₂SO₄的缓冲液；洗脱缓冲液与起始缓冲液不同的是其中不含有硫酸铵。

上述的离子交换层析过程所采用的起始缓冲液为20-50mM浓度pH7.0-8.5的Tris·HCl缓冲液，洗脱缓冲液为含2M NaCl的20-50mM浓度pH7.0-8.5的Tris·HCl缓冲液，洗脱过程采用线性梯度洗脱法。

以上所有层析过程均在室温下进行，上述最终制备所得的枝孢霉脂肪酶的溶液体系为20-50mM浓度pH7.0-8.5的Tris·HCl缓冲液。

本发明采用对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)法来测定脂肪酶的活力大小，该方法以对硝基苯棕榈酸酯为反应底物，通过脂肪酶的催化产生有色产物对硝基苯酚(p-NP)，该产物在405-410nm波长下具有强烈吸收。酶活力单位定义为：1个单位即指在标准实验条件下每分钟催化释放1μmol的p-NP所需的酶量。该方法是国内外测定脂肪酶活力的常用方法，操作简便，反应快且灵敏度高，是一种精确而高效的活力测定方法。

3、Cladosporium sp.WBRD3.10062425所产肪酶的部分酶学性质

本发明所制备而得的脂肪酶具有如下性质，除特别说明外脂肪酶活力的检测均采用pNPP法。

部分有机溶剂耐受性，见图2。该酶对甲醇、乙醇以及丙酮的耐受性很高，在50％以上的有机溶剂中4℃放置24h后仍有较强的活力。枝孢霉脂肪酶对甲醇的耐受性尤为突出，在4℃温度下50％的甲醇中放置24h后活性几乎没有损失，这一性质大大拓宽了该酶的应用领域特别是诸如酶法生物柴油或有机合成等领域。该酶的有机溶剂耐受性能检测的方法是取一定体积的待测酶液加入相应比例的待检测有机溶剂，4℃下放置24h后取出样品进行脂肪酶活力检测。

该酶最适反应温度为45℃，见图3。

该酶的最适反应pH在pH9.5-10.0，该酶的pH稳定范围在pH5.5-9.5，见图4。最适反应pH的酶活力测定方法采用中华人民共和国国家标准GB/T23535-2009的方法进行检测，酶活力单位定义为每分钟催化产生1μmol的脂肪酸所需的酶量定义为1个单位。

该酶具有很高的热稳定性，60℃保温90min后仍有75％以上的活力，75℃保温90min后仍有近50％的活力，见图5。

EDTA对该酶的活力影响很小，TritonX-100可以大大提高该酶的活力，0.5-1％的TritonX-100可以使得酶活力单位提高1倍以上，见图6。

本发明提供了一种产耐有机溶剂脂肪酶的丝状真菌——枝孢霉Cladosporium sp.WBRD3.10062425，填补了现有技术中尚无枝孢霉属生产耐有机溶剂脂肪酶的空缺；本发明所制备的来源于枝孢霉属菌株Cladosporiumsp.WBRD3.10062425的脂肪酶具有较强的甲醇、乙醇和丙酮耐受性，这种特性在现有技术报道的野生的耐有机溶剂脂肪酶中也是非常突出的。

本发明制备得到的脂肪酶将具有生物柴油、医药工业、食品、油脂化工、环境保护、洗涤剂、纺织、造纸等多个工业领域的应用价值。(应用方面的具体实验目前没有开展，可以后续单独保护)

附图说明

图1：Cladosporium sp.WBRD3.10062425在罗丹明B平板上生长的图片，其中A为可见光下菌落图片，B为365nm紫外灯下菌落图片；

图2：Cladosporium sp.肪酶对部分有机溶剂的耐受性；

图3：Cladosporium sp.肪酶反应温度和相对酶活关系曲线；

图4：Cladosporium sp.脂肪酶反应pH和酶活关系曲线及pH稳定曲线；

图5：Cladosporium sp.脂肪酶的热稳定性曲线；

图6：EDTA和Triton X-100对Cladosporium sp.脂肪酶活性的影响；

图7：Cladosporium sp.脂肪酶SDS-PAGE及酶谱图，其中1为SDS-PAGE图，2为365nm下观察到活性酶谱图，箭头处为橙色荧光条带。

微生物保藏信息：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，

邮编100101

保藏日期：2011年6月17日

保藏编号：CGMCC No.4962

分类命名：枝孢霉Cladosporium sp.。

具体实施方式

现结合附图与实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

实施例1：产脂肪酶丝状真菌Cladosporium sp.WBRD3.10062425的分离筛选及鉴定

取一块尽可能新鲜的藏酥油样品，去除约1cm厚度表层后，切取约10g左右的藏酥油样品置于100mL含1.0％Tween 80的无菌水中。振荡30min后按照传统的稀释涂布的方法稀释成不同的稀释度，并将各个稀释度的样品涂布于罗丹明B平板上置于28℃生化培养箱中培养。

罗丹明B的平板的制作方法是：配方甲液(硫酸铵0.1％，酵母浸出汁0.5％，胰蛋白胨0.5％，K₂HPO₄0.1％，KCl 0.5％，七水合硫酸镁0.05％，七水合硫酸亚铁0.01％，琼脂2.0％)115℃灭菌30min后加入同样方式灭菌的配方乙液(橄榄油与2％聚乙烯醇以1∶3比例混合，10000rpm搅拌乳化)，充分混合后按照1％(v/v)的量加入过滤除菌的0.1％的罗丹明B溶液。充分混匀后制备得到筛选平板。

每24h在紫外灯下观察罗丹明B平板上是否有荧光圈出现，产脂肪酶的丝状真菌的生长速度较慢往往需要96h后才能观察到。挑取荧光圈较大的微生物进行进一步的稀释涂布分离以获得纯种菌株，而后再次用罗丹明B平板对这些纯种菌株进行脂肪酶检测，结果发现有一株荧光圈十分显著的菌株标记为WBRD3.10062425，其脂肪酶平板检测结果如图1所示。

该菌的生长状态和形态学特征如下：

该菌在察氏培养基上25℃温度下生长速度极慢，培养7天时菌落直径为10mm，菌丝呈绒状、暗黄绿色、质地致密、背面呈黑绿色；该菌在麦芽汁培养基上25℃温度下生长7天时达菌落直径可达30mm，菌丝厚绒状，灰色、质地致密、背面墨黑色；在查氏酵母膏琼脂培养基上25℃温度下生长7天时的菌落直径约20mm，菌丝绒状，形成同心环纹，中间橄榄色，外围暗黄绿色，质地致密，背面黄绿至褐色；该菌在PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基上25℃温度下培养7天时的菌落直径约15mm，菌丝绒状或絮状，黄绿色，质地致密，背面绿黑色边缘白色。

在显微镜下观察，分生孢子梗单生、丛生、直立或曲屈状，偶有分枝，具隔膜；枝孢0-3个，隔膜，平；分生孢子椭圆形近球形，孢脐明显，褐色，顶生。

根据以上形态特征以及显微形态特征观察结果，参考《真菌鉴定手册》(魏景超遗著.真菌鉴定手册.上海科学技术出版社.1979年9月第一版)、《真菌的形态和分类》(戴芳澜遗著.真菌的形态和分类.科学出版社.1987年3月第一版)以及《中国真菌志》(张中义主编.中国真菌志第十四卷枝孢属黑星孢属梨孢属.科学出版社.2003年4月第一版)等判断其与枝孢霉(Cladosporium)属菌最相似。

根据有关微生物鉴定方法，对该菌的18S rDNA测序结果(如SEQ IDNO：1)进行比对后发现该菌与Cladosporium cladosporioides(GENBANK号AY251093.2)，Cladosporium bruhnei(GENBANK号AY251096.2)，Cladosporium uredinicola(GENBANK号AY251097.2)以及Cladosporiumcellare(GENBANK号NG016540.1)具最高同源性超过99％。

该菌株已于2011年6月17日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(CGMCC)保藏，保藏号是CGMCC No.4962。

实施例2：来源于枝孢霉的耐有机溶剂脂肪酶的制备

(1)枝孢霉脂肪酶的发酵

加入10mL左右的无菌生理盐水至一支新鲜培养好的枝孢霉WBRD3.10062425斜面以制备孢子悬浮液，而后取1mL的悬浮液接种至装液量为30mL的250mL容积的种子培养基中于28℃、200rpm培养24h(培养基组成为：葡萄糖3％、蛋白胨0.3％、玉米粉0.5％、NaH₂PO₄·12H₂O 0.2％、MgSO₄·12H₂O 0.1％、CaCl₂0.05％，pH 6.5)。

种子培养好后，取3mL的种子培养液接种至多个250mL容积的发酵摇瓶中，摇瓶装液量为30mL。发酵培养基组成是：蔗糖2％、蛋白胨3％、玉米粉0.5％、酵母浸出粉1％、吐温-800.5％、滑石粉0.1％、NaNO₃0.3％、KH₂PO₄0.7％、Na₂HPO₄·12H₂O 0.25％、MgSO₄·12H₂O 0.1％、CaCl₂0.05％、橄榄油0.5％，pH 6.5。发酵条件为：培养温度28℃，摇床转速为200rpm。

摇瓶发酵67h左右，取出发酵摇瓶进行胞外脂肪酶活力的检测(pNPP法)，经检测此时的发酵清液中的脂肪酶活力达到13.63units/mL。

(2)枝孢霉脂肪酶粗酶液的浓缩和盐析

收集所有发酵摇瓶的发酵液，用双层滤纸进行过滤以除去菌丝体，此时可以获得约410mL的清液。将此清液用0.22μm的微孔滤膜过滤进一步澄清后，用10kDa的超滤膜(Omega^TM10K，美国PALL公司)进行超滤，最后得到约40mL的浓缩液。

在冰浴状态下缓慢加入硫酸铵粉末至枝孢霉超滤浓缩液中直至饱和度达到30％，冰浴静置2h后，15000rpm离心25min(高速冷冻离心机CR22GIII，日本日立公司)收集离心上清液。再次缓慢加入硫酸铵粉末直至饱和度达到60％，此盐析步骤一直在冰浴下完成。盐析样品4℃静置过夜后，离心收集盐析沉淀。

(3)层析法纯化和制备枝孢霉脂肪酶

室温下用约20mL的起始缓冲液(50mM浓度含0.4M(NH₄)₂SO₄的pH7.5的Tris·HCl缓冲液)溶解60％饱和度的盐析沉淀样品，经过0.22μm的微孔滤膜过滤后粗酶液用HiTrap phenyl HP 5mL(GE Healthcare)苯基疏水层析柱进行纯化，收集活性组分。疏水层析过程的洗脱液有：洗脱缓冲液(不含硫酸铵的起始缓冲液)、蒸馏水和70％的乙醇水溶液。层析过程流速为3mL/min。洗脱过程是先用100％的洗脱缓冲液进行洗脱至基线稳定，而后再用蒸馏水洗脱至基线稳定，最后用70％的乙醇溶液进行洗脱。

经过疏水层析纯化的脂肪酶样品再经缓冲液置换后，用Mono Q^TM 4.6/100PE(GE Healthcare)强阴离子层析柱进行纯化并收集活性组分。离子交换层析过程所使用的缓冲液有两种，一种是浓度为20mM，pH值为7.5的Tris·HCl起始缓冲液，另一种为含有2M NaCl的浓度20mM，pH值为7.5的Tris·HCl洗脱缓冲液。洗脱过程的流速为1mL/min，采用线性梯度洗脱的方式进行洗脱。

以上过程均在室温下完成，层析过程使用的设备为GE公司的

Explorer 100。层析纯化后的样品经过缓冲液置换后保存于浓度为20mM，pH值为7.5的Tris·HCl缓冲液中，4℃储存。

实施例3：枝孢霉属脂肪酶的酶学性质

(1)脂肪酶对甲醇等有机溶剂的耐受性考察

将实施例2纯化得到的枝孢霉属脂肪酶与甲醇、乙醇等有机溶剂按照一定的比例(0-90％，v/v)进行配比，于4℃放置24h后用pNPP法检测脂肪酶的活性大小，以不加有机溶剂的样品为对照，结果见图2。枝孢霉脂肪酶对甲醇、乙醇和丙酮等均有较强的耐受性，特别是对甲醇的耐受性更好，50％的甲醇24h处理后几乎没有活性损失。

(2)脂肪酶的温度与酶活力关系曲线以及热稳定性曲线测定：

在一系列的不同温度的水浴中，采用pNPP法进行枝孢霉脂肪酶的活力进行检测，酶作用温度曲线结果见图3。热稳定性检测时是将样品放置于不同温度的水浴中进行保温，每隔15min取样品进采用pNPP法进行活力检测，检测至保温90min为止，热稳定性结果见图5。该酶的最适反应温度为45℃，该酶具有较强的热稳定性，60℃保温90min后仍有超过75％的残余活力，75℃保温90min后仍有超过45％的残余脂肪酶活力。

(3)枝孢霉脂肪酶的最适反应pH和pH稳定性的检测

配制一系列浓度为0.1M的不同pH值的缓冲液，其中pH3.0采用甘氨酸-盐酸缓冲系统，pH4.0采用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲系统，pH5.0采用醋酸-醋酸钠缓冲系统，pH5.5-6.5采用MES-NaOH缓冲系统，pH7.0采用MOPS-NaOH缓冲系统，pH7.5-8.5采用Tris-HCl缓冲系统，pH9.0-9.5采用甘氨酸-氢氧化钠缓冲系统，pH10.0采用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲系统，pH11.0采用磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲系统。最适反应pH测定中的酶活力检测方法采用中华人民共和国国家标准GB/T 23535-2009的方法进行活力检测，酶活力单位定义为每分钟催化产生1μmol的脂肪酸所需的酶量定义为1个单位，结果见图4。酶反应的最适pH范围在pH9.5-10.0，该酶的pH稳定范围在pH5.5-9.5。

(4)EDTA和表面活性剂TritonX-100的影响

在酶液中加入不同量的EDTA，结果发现含有10mM的EDTA仍能有超过80％的脂肪酶活力，见图6。在研究不同浓度的TritonX-100的影响时发现，添加0.5-1％的TritonX-100可以使得酶活力单位提高1倍以上，见图6。

(5)枝孢霉脂肪酶的SDS-PAGE及活性酶谱检测

通过酶谱法和SDS-PAGE相结合确定该酶的表观分子量在40-52kDa，见图7。本发明所采用的脂肪酶活性酶谱检测方法是在参考Cadirci(Cadirci B.H.，Yasa I.An organic solvents tolerant and thermotolerant lipase from Pseudomonasfluorescens P21.J.Mol.Catal.B：Enzym.2010，64：155-161)，Yadav(Yadav R.P.，Saxena R.K.，Gupta R.，et al.Rapid zymogram for lipase.Bio Techniques1998，24(5)：754-756)，Masayama(Masayama A.，Kuwana R.，Takamatsu H.，etal.A Novel Lipolytic Enzyme，YcsK(LipC)，Located in the Spore Coat of Bacillussubtilis，Is Involved in Spore Germination.J.Bacteriol.2007，189(6)：2369-2375)等人脂肪酶酶谱检测方法基础上建立的。该检测方法与普通SDS-PAGE在凝胶准备、上样和电泳过程等都基本相同。不同的是该方法在电泳样品准备阶段使用的上样缓冲液中不含有DTT或2-巯基乙醇等还原剂，另外电泳样品只是室温放置不能加热或煮沸变性；酶谱检测方法在电泳时与普通SDS-PAGE不同的是要使得电泳过程尽可能产热少，因此可以在90V或更低的电压下电泳。在电泳结束后将含有待检测样品的凝胶放置于0.5-2.5％的Triton X-100缓冲液中进行两次室温振荡，每次30min。而后取出凝胶用20mM pH 7.5的Tris-HCl缓冲液洗涤3次每次10min以除去残余的Triton X-100并实现脂肪酶的复性。而后将该凝胶置于含0.02％的罗丹明B的琼脂平板上，37℃放置过夜后即可于365nm紫外灯下观察到脂肪酶的荧光条带。

Claims (8)

1.一种脂肪酶产生菌，分类命名为枝孢霉(Cladosporium sp.)，保藏编号为CGMCC No.4962。

2.一种生产脂肪酶的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：在适合生产的情况下，于25-32℃培养如权利要求1所述的脂肪酶产生菌，从而使该菌株产生脂肪酶；从培养基中分离出脂肪酶。

3.根据权利要求2所述的一种生产脂肪酶的方法，其特征在于28℃培养如权利要求1所述的脂肪酶产生菌。

4.根据权利要求2所述的一种生产脂肪酶的方法，其特征在于该方法以如权利要求1所述的脂肪酶产生菌为原料，由以下步骤组成：

(A)菌株于25-32℃，120-250rpm下于发酵培养基中培养64-72小时，发酵培养基的配方如下：蔗糖0.1-5％、蛋白胨0-10％、玉米粉0-5％、酵母浸出粉0-5％、吐温-800-3％、滑石粉0-2％、NaNO₃0-1％、KH₂PO₄0.7％、Na₂HPO₄·12H₂O 0.25％、MgSO₄·12H₂O 0.1％、CaCl₂0.05％、橄榄油0-5％，pH6.5；

(B)发酵液过滤除去菌丝体，滤液采用5-30kDa的膜进行超滤浓缩，对浓缩液进行硫酸铵盐析，收集30-60％饱和度的盐析沉淀物；

(C)用疏水层析柱对盐析产物进行层析纯化，先用浓度为20-100mM的，pH6.0-8.5缓冲液进行洗脱，再用蒸馏水洗脱，最后用10-70％的乙醇水溶液洗脱并收集该洗脱组分；经过缓冲液置换后用离子交换层析纯化，收集主要的脂肪酶活性峰经过缓冲液置换后即可。

5.根据权利要求4所述的一种生产脂肪酶的方法，其特征在于，步骤(A)为25-32℃，120～250rpm下于发酵培养基中培养64-72小时，发酵培养基的配方如下：蔗糖2％、蛋白胨3％、玉米粉0.5％、酵母浸出粉1％、吐温-800.5％、滑石粉0.1％、NaNO₃0.3％、KH₂PO₄0.7％、Na₂HPO₄·12H₂O 0.25％、MgSO₄·12H₂O 0.1％、CaCl₂0.05％、橄榄油0.5％，pH 6.5。

6.根据权利要求4或5所述的一种生产脂肪酶的方法，其特征在于，步骤(A)中菌株于28℃，200rpm下于发酵培养基中培养64-72小时。

7.根据权利要求4或5所述的一种生产脂肪酶的方法，其特征在于，步骤(B)中发酵液收集后用滤纸进行过滤，收集的清液经过0.22μm的微孔滤膜过滤进一步澄清后，再用10kDa的超滤膜进行超滤以浓缩。

8.一种如权利要求2-7任一方法制备得到的脂肪酶，其特征在于该脂肪酶分子量为40-60kDa，对甲醇、乙醇或丙酮具有耐受性。

Images