JPS6394992A - ｌ−プロプラノロ−ルの生化学的分離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、微生物の生産するリパーゼを利用して、ｄｌ
−プロプラノロールからｌ−プロプラノロールを選択的
に分離するβ−プロプラノロールの生化学的分離法に関
する。

（従来の技術） プロプラノロールは、その化学構造上１つの不斉炭素原
子を有する。従って、プロプラノロールには、ｄ−プロ
プラノロールとＣ−プロプラノロールの立体異性体が存
在する。

プロプラノロールは１通常、ラセミ体で得られ。

不整脈治療薬、抗高血圧薬として実用化されている。し
かし、その薬効は６体と４体とでは大きな差があること
が知られている（Ｎａｔｕｒｅ、　　２１０．１３３６
−１３３８　（１９６６）、　Ａｒｃｈ　Ｐｈａｒｍａ
ｃｏｌ、、　２８６　、　３１９−３２３（１９７４）
）。ｌ−プロプラノロールは、ｄｉ−プロプラノロール
（ラセミ体）と比較しても、イソプレナリンで誘発され
た頻脈に対し、約４〜５倍の有効性がある（　Ｈｏｗｅ
ら、　Ｎａｔｕｒｅ、　　２１０．１３３６−１３３８
（１９６６）　）。ｌ−プロプラノロールは、アドレナ
リン受容体に拮抗的阻害作用をもつため、抗不整脈作用
、降圧作用が強い。このようなことから、ｄｌ−プロプ
ラノロールからｌ−プロプラノロールのみを分離するこ
とが試みられている。

ｄｌ−プロプラノロールからの２−プロプラノロールの
分離法としては、ジー〇−トルオイル酒石酸を用いた光
学分割法がある（　ｔｌｏｗｅら、　Ｎａｔｕｒｅ。

２１０　、１３３６−１３３８　（１９６６））。しか
し、このような方法は、操作が煩雑であるうえに！−プ
ロプラノロールの回収率が低い。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の問題点を解決するものであり、その
目的とするところは、ｄｌ−フ゛ロフ“ラノロールから
ｌ−プロプラノロールが簡単かつ高収率で得られる！−
プロプラノロールの生化学的分離法を提供することにあ
る。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、ｄＪ−プロプラノロールと有機カルボン酸、
特に炭素数４以上の有機カルボン酸とのエステル化反応
において、微生物の生産するリパーゼを作用させること
により、６体のみが選択的にエステル化されうる；との
発明者の知見にもとづいて完成された。

本発明の！−プロプラノロールの生化学的分離法は、リ
パーゼ、リパーゼの固定化物、リパーゼ生産能を有する
微生物、該微生物の固定化物および該微生物の処理物の
固定化物からなる群から選択された少なくとも一種に、
ｄｌ−プロプラノロールと、有機カルボン酸もしくは有
機カルボン酸塩とを接触させることを包含し、そのこと
により上記目的が達成される。

ｄｌ−プロプラノロールと有機カルボン酸もしくは有機
カルボン酸塩とを、微生物由来のリパーゼを作用させて
接触させることにより、ｄｌ−プロプラノロールのうち
のｄ−プロプラノロールのみが選択的にエステル化され
る。

エステル化反応は、有機溶剤−水の均一系２例えば、酢
酸−酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、　ｐｉｔ　７〜
８）やリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、　ｐｉｔ　８
　）とアセトンとの８：２の混合系等の反応系で行われ
る。基質となるプロプラノロールと有機カルボン酸の双
方が完全に溶解する濃度範囲で反応に供される。生成し
たｄ−プロプラノロール有機カルボン酸エステルと、未
反応のｌ−プロプラノロールとはシリカゲルカラムクロ
マトグラフにより容易に分離できる。それにより、目的
とするｌ−プロプラノロールが分離され得る。

リパーゼには１例えば、ゲオトリカム属、リゾプス属、
アスペルギルス属、ペニシリウム属、ロドトルラ属、ク
ラドスポリウム属、トリコデルマ属、フサリウム属に属
する微生物から生産されたリパーゼが用いられる。

リパーゼ生産能を有する微生物には２例えば。

ゲオトリカム属、リゾプス属、アスペルギルス属。

ペニシリウム属、ロドトルラ属、クラドスポリウム属、
トリコデルマ属、フサリウム属に属する微生物がある。

しかし、これに限定されず、ｄｌ−プロプラノロールを
有機カルボン酸、特に炭素数４以上の有機カルボン酸を
用いてエステル化するためのリパーゼを生産する微生物
であれば、いかなる微生物も使用可能である。

本発明に用いられる微生物の例を下記に示す。

これらの微生物はいずれも公知であり、公的微生物保存
機関連盟の加盟機関１例えば、財団法人発酵研究所（Ｉ
ＦＯ）を通じて容易に入手することができる。

（１）ゲオトリカム属 ゲオトリカム・カンディダム　　ＡＡＴＣＣ−３４６１
４（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕ　ｃａｎｄｔｄｕｍ）（２）リ
ゾプス属 リゾプス・プレマール　　　　　ＡＴＣＣ−３４６１２
（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ）（３）アスペル
ギルス属 アスペルギルス・ニガー　　　　ＩＦＯ−４２８０（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）（４）ペニシリウ
ム属 ペニシリウム・シクロビウム　　ＡＡＴＣＣ−３４６１
３（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ　ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）（５
）ロドトルラ属 ロドトルラ・ミヌータ・バール・チクセンシスＩＦＯ−
０９３２ （Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｍ１ｎｕｔａ　ｖａｒ　ｔ
ｅｘｅｎｓｉｓ）（６）トリコデルマ属 トリコデルマ・ロンジブラキアタムＩＦＯ−４８４７（
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔ
ｕｍ）（７）タラトスポリウム属 クラドスポリウム・レジナエ　　ＩＦＯ−８５８８（Ｃ
ｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｒｅｓｉｎａｅ）（８）フサ
リウム属 フサリウム・モニリフォルム　　ＩＦＯ−６３４９（Ｆ
ｕｓａｒｉｕｍ　ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）本発明にお
けるリパーゼまたは微生物は２例えば、液体培地に菌体
を培養した培養物、培養液から分離した菌体、各種の酵
素分離法に基づいて菌体または培養液から分離した精製
リパーゼや粗製リパーゼ、リパーゼ含有抽出液、その濃
縮液などの処理物の状態で用いられる。リパーゼ、ａｌ
ｌ。

微生物の処理物が固定化された固定化物も使用可能であ
る。

リパーゼおよび微生物の固定化のための担体には１例え
ば、アルギン酸、カラギーナン、コラーゲン、セルロー
ス、アセチルセルロース、　寒天。

セロファン、コロジオンの如き天然物やポリアクリルア
ミド、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、ポリプ
ロピレングリコール、ポリウレタン。

ポリブタジェンの如き合成高分子などがある。

リパーゼおよび微生物の担体への固定化量は。

担体や菌体の種類、リパーゼの純度などに依存する。し
かし２通常、微生物菌体１ｇ（湿潤基準）に対し、担体
１〜５ｇが用いられる。また、リパーゼでは、３０酵素
単位に対して０．１〜２ｇの担体を用いるのが適当であ
る。

ｄｊ２−プロプラノロールと接触させる有機カルボン酸
および有機カルボン酸塩には、特に炭素数４以上の有機
カルボン酸および有機カルボン酸塩が用いられ１例えば
、吉草酸、酪酸、δ−フェニル吉草酸、γ−フェニル醋
酸、カプロン酸、カプリル酸、コハク酸、スベリン酸、
セバシン酸がある。炭素数が４を下まわると、ｄｌ−プ
ロプラノロールと有機カルボン酸および有機カルボン酸
塩とのエステル化反応が充分に進行しない。有機カルボ
ン酸塩には、上記有機カルボン酸のアルカリ金属塩（ナ
トリウム塩、カリウム塩など）やアンモニウム塩が用い
られる。

有機溶媒には９例えば、アセトン、エタノール。

メタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキ
シド等の水と均一に混合し得る極性溶媒が用いられる。

これに限定されず、ｄ−プロプラノロールの有機カルボ
ン酸エステルを溶解しかつリパーゼ活性を損なわない有
機溶媒であれば使用可能である。それら有機溶媒の水に
対する混合比は。

最大５０％以下であり１．好ましくは、１０〜３０％の
範囲とされる。混合比は、リパーゼ活性を損なうことな
く、基質ｄ１−プロプラノロールの有機カルボン酸を溶
解する最適使用量であればよい。

ｄＮ−プロプラノロールの水層における濃度には特に限
定はなく９例えば、０．１〜３０％というような高濃度
でも使用可能である。反応系内にカゼイン１〜５％を添
加することにより、リパーゼの安定性を増すことができ
る。上記ｄｌ−プロプラノロールは１例えば、リパーゼ
３００酵素単位に対し、　　５〜５０ｍｍｏ１．好まし
くは２０〜３０ｍｍｏｌ、　　そして有機カルボン酸も
しくは有機カルボン酸塩は３〜１００ｍｍｏｌ、好まし
くは２０〜５ｏＩＩＩＩｌｏｌの範囲で配合される。

ｄｌ−プロプラノロールのエステル化反応における反応
温度は、２０〜４５℃、好ましくは、２５〜３５℃に調
整される。２０℃を下まわると、エステル化反応が充分
に進行しない。４５℃を上まわると、リパーゼの活性が
低下し１反応の進行が妨げられる。

反応時間は、５〜７２時間が適当である。しかし。

微生物の量またはリパーゼの量を増加させることにより
１反応時間の短縮が可能である。

（実施例） 以下に本発明を実施例について述べる。

実施±１ アクリルアミド７２３■およびＮ−Ｎ’　−メチレンビ
スアクリルアミド３８ｎｖを、リン酸カリウム緩衝液（
ｐＨ７，０，５０ｍＭ）　　２．３艷に溶解した。ゲオ
トリカム・カンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａ
ｎｄｉｄｕｍＡＴＣＣ−３４６１４）　７２０ｍｇ湿潤
微生物菌体を、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，
６，５０ｍＭ）　　２−に懸濁させ、上記アクリルアミ
ド溶液と混合した。混合液にＮ、Ｎ−Ｎ”　・Ｎｏ　−
テトラメチレンジアミン水溶液（０，１ｇ／ｄ）を０．
１−および過硫酸アンモニウム水溶液（５０ｍｇ／−）
を０．１−加えた後。

窒素ガス雰囲気下、０℃で５分間さらに室温下で１時間
放置し、微生物菌体の固定化物を得た。この固定化物を
２１璽×２ｍｌ×２Ｈの立方体に切断した。

リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８，０，５０ｍＭ）とアセ
トンとの混合液（８：２体積比）２０−にｄｌ−塩酸プ
ロプラノロール２００■を溶解し、さらにδ−フェニル
吉草酸５００　ｍｇを溶解した。この溶液に上記の固定
化物を加え、３０℃で、　１２０ｓ　ｔｒｏｋｅｓ　／
分の振盪下、１８時間反応させた。

反応終了後９反応液を２Ｎ−ＫＯＨでｐＨ９に調整した
後、エーテル２Ｍで抽出した。エーテル層を飽和食塩水
、水の順で洗浄した後、さらに無水硫酸ナトリウムで洗
浄した。エーテルを除去し、残留オイルをシリカゲルカ
ラム（ワコゲルｃ−２００）に充填して、ヘキサン−エ
ーテル（５：１体積比）の混合溶液で展開した。ｄ−プ
ロプラノロールのδ−フェニル吉草酸エステルを溶出し
た後、展開溶剤を塩化メチレンに切りかえ、目的物のｌ
−プロプラノロールを溶出した。溶出液に、塩化水素ガ
スを水冷下で吹き込み１次いで、塩化メチレンを除去し
たところ、ｌ−プロプラノロール塩酸塩が得られた（収
率７０．０％、　〔α）　ｆ！’＝　−２２，７°　（
Ｃ；１．０％　Ｃ，１Ｉ５０Ｈ）　’）。ｌ−プロプラ
ノロール塩酸塩の収率は９次式により算出した。

ｌ−プロプラノロール塩酸塩の収率（％）次新ｌ生影 微生物として、フサリウム・モニリフォルム（Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ　ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ　ＩＦＯ−６３４９
）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして２−プロ
プラノロールの分離を行った。その結果、収率６４．０
％で旋光度ＣＣｒ〕Ｂ’＝　２２．６＠（ｃ　；　１．
０％Ｃ２Ｈ５０）ｌ）　０）ｌ−プロプラノロール塩酸
塩が得られた。

１隻皿主 微生物として、リゾプス・プレマール（Ｐｈｉｚｏｐｕ
ｓｄｅｌｅｍａｒ　ＡＴＣＣ−３４６１２）を用いたこ
と以外は、実施例１と同様にしてｌ−プロプラノロール
の分離を行った。その結果、収率７３．０％で旋光度〔
α〕６Ｓ＝−２２．６”　（ｃ　；　１．０％　ＣｚＨ
ｓＯＨ）の！−プロプラノロール塩酸塩が得られた。

尖立炭土 微生物として、アスペルギラス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ＩＦＯ−４２８０）を用いた
こと以外は、実施例１と同様にして！−プロプラノロー
ルの分離を行った。その結果、収率７４．０％で旋光度
（α）　轟’＝　　２２．６’　（ｃ　；　１．０％　
Ｃ２１１ＳＯＨ）　（７）　Ａ　−プロプラノロール塩
酸塩が得られた。

１旌±１ 微生物として、ペニシリウム・シクロビウム（Ｐｅｎｉ
ｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ　ＡＴＣＣ−３４
６１３）を用いたこと以外は、実施例１と同様にしてｌ
−プロプラノロールの分離を行った。その結果、収率８
１．０％で旋光度〔α）　ｆｉ’＝−２２，６°　（ｃ
　；　　１．０％Ｃ２Ｈ１ＯＨ）のｌ−プロプラノロー
ル塩酸塩が得られた。

去旌１− 微生物として、ロドトルラ・ミヌータ・バール・チクセ
ンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｍ１ｎｕｔａ　ｖａ
ｒ　ｔｅｘｅｎｓｉｓＩＦＯ−０９３２）を用いたこと
以外は、実施例１と同様にしてｌ−プロプラノロールの
分離を行った。

その結果、収率７１．０％で旋光度〔α〕西５＝−２２
，６゜（ｃ　；　　１．０％　ＣＪＳＯＨ）のｌ−プロ
プラノロール塩酸塩が得られた。

尖旌尉工 微生物として、トリコデルマ・ロンジブラキアタム（Ｔ
ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕ
ｍ　ＩＦＯ−４８４７）を用いたこと以外は、実施例１
と同様にしてｌ−プロプラノロールの分離を行った。そ
の結果、収率８１．０％で旋光度〔α）　ｇ５＝−２２
，６°　（ｃ；１．０％　ＣＪｓＯＨ）のｌ−プロプラ
ノロール塩酸塩が得られた。

尖脂■工 微生物として、クラドスポリウム・レジナエ（Ｃｌａｄ
ｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｒｅｓｉｎａｅ　ＩＦＯ−８５８８
）を用いたこと以外は、実施例１と同様にしてｌ−プロ
プラノロールの分離を行った。その結果、収率６８．０
％で旋光度〔α）　、ｉ’＝−２２，６°（ｃ；１．０
％Ｃ２Ｈ５ＯＨ）のｌ−プロプラノロール塩酸塩が得ら
れた。

尖ル斑度 δ−フェニル吉草酸に代えて吉草酸を用いたこと以外は
、実施例１と同様にしてｌ−プロプラノロールの分離を
行った。その結果、収率７２．０％で旋光度（（ｒ）　
ｉ！Ｓ＝　　２２．７°（ｃ；１．０％　ＣｚＨｓＯＨ
）のｌ−プロプラノロール塩酸塩が得られた。

実星炎則 δ−フェニル吉草酸に代えて酪酸を用いたこと以外は、
実施例１と同様にして！−プロプラノロールの分離を行
った。その結果、収率７２．０％で旋光度〔α）　Ｉ！
’＝−２２，７°　（ｃ；１．０％　ＣＪｓＯＨ）のｌ
−プロプラノロール塩酸塩が得られた。

爽施炎旦 δ−フェニル吉草酸に代えてγ−フェニル酪酸を用いた
こと以外は、実施例１と同様にしてｌ−プロプラノロー
ルの分離を行った。その結果、収率９１．０％で旋光度
（α）　Ｐ＝　　２２．６’　（ｃ　；　　１．０％　
Ｃ２Ｈ５０Ｈ）のｌ−プロプラノロール塩酸塩が得られ
た。

ス屓１泪ユ δ−フェニル吉草酸に代えてカプロン酸を用いたこと以
外は、実施例１と同様にしてｌ−プロプラノロールの分
離を行った。その結果、収率６５．０％で旋光度〔α）
　Ｐ＝　−２１，０’　（ｃ　：　１．０％　Ｃ１Ｈ５
ＯＨ）のｌ−プロプラノロール塩酸塩が得られた。

尖施炭旦 δ−フェニル吉草酸に代えてカプリル酸を用いたこと以
外は、実施例１と同様にしてｌ−プロプラノロールの分
離を行った。その結果、収率５７．０％で旋光度〔α〕
占’−−２２，４”　（ｃ　；　１．０％　ＣＪｓｏｌ
ｌ）のｌ−プロプラノロール塩酸塩が得られた。

実施Ｕ δ−フェニル吉草酸に代えてコハク酸を用いたこと以外
は、実施例１と同様にしてｌ−プロプラノロールの分離
を行った。その結果、収率７０．０％で旋光度〔α〕乙
５＝−１８，４°（ｃ；１．０％　Ｃ２Ｈ５０Ｈ）のｌ
−プロプラノロール塩酸塩が得られた。

去上±旦 δ−フェニル吉草酸に代えてスベリン酸を用いたこと以
外は、実施例１と同様にしてｌ−プロプラノロールの分
離を行った。その結果、収率５２．０％で旋光度（α）
　Ｐ＝　　１９．２°（ｃ；１．０％　Ｃ１Ｈ５ＯＨＩ
）のｌ−プロプラノロール塩酸塩が得られた。

災施■用 δ−フェニル吉草酸に代えてセバシン酸を用いたこと以
外は、実施例１と同様にしてｌ−プロプラノロールの分
離を行った。その結果、収率３０．０％で旋光度（（’
ｒ）　Ｐ＝　　２０．３　”　（Ｃ；　１．Ｏ％ＣＪｓ
ＯＨ）の！−プロプラノロール塩酸塩が得られた。

実ｍ匠 アセトンに代えてメタノールを用いたこと以外は、実施
例１と同様にしてｌ−プロプラノロールの分離を行った
。その結果、収率２０．０％で旋光度（α）　Ｐ＝　　
２２．７”　（ｃ　；　１．０％　ＣＪｓＯｔｌ）のｌ
−プロプラノロール塩酸塩が得られた。

実施■用 アセトンに代えてジメチルホルムアミドを用いたこと以
外は、実施例１と同様にしてｌ−プロプラノロールの分
離を行った。その結果、収率６５．０％で旋光度〔α）
　Ｍ’＝−２２，６°（ｃ；１．０％　ＣＪ、ＯＨ）の
ｌ−プロプラノロール塩酸塩が得られた。

１上１ アセトンに代えてジメチルスルホキシドを用いたこと以
外は、実施例１と同様にしてｌ−プロプラノロールの分
離を行った。その結果、収率２０．０％で旋光度〔α）
　ｌ’−−２２，５’　（ｃ　；　１．０％　ＣｚＨｓ
ＯＩＩ）のｌ−プロプラノロール塩酸塩が得られた。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、ｄｆｆｉ−プロプラノロ
ールからｌ−プロプラノロールが容易に分離される。ｌ
−プロプラノロールの回収率も高い。

得られたｌ−プロプラノロールは、ｄｌ−プロプラノロ
ールに比べて著しく高い抗不整脈作用、降圧作用を示し
、不整脈治療薬、抗高血圧薬として有用である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リパーゼ、リパーゼの固定化物、リパーゼ生産能を
   有する微生物、該微生物の固定化物および該微生物の処
   理物の固定化物からなる群から選択された少なくとも一
   種に、ｄｌ−プロプラノロールと、有機カルボン酸もし
   くは有機カルボン酸塩とを有機溶媒−水混合系中で接触
   させることを包含するｌ−プロプラノロールの生化学的
   分離法。 ２、前記リパーゼが、ゲオトリカム属、リゾプス属、ア
   スペルギルス属、ペニシリウム属、ロドトルラ属、クラ
   ドスポリウム属、トリコデルマ属およびフサリウム属の
   うちの少なくとも一つの属に属する微生物から生産され
   たリパーゼである特許請求の範囲第１項に記載のｌ−プ
   ロプラノロールの生化学的分離法。 ３、前記微生物が、ゲオトリカム属、リゾプス属、アス
   ペルギルス属、ペニシリウム属、ロドトルラ属、クラド
   スポリウム属、トリコデルマ属およびフサリウム属のう
   ちの少なくとも一つの属に属する微生物である特許請求
   の範囲第１項に記載のｌ−プロプラノロールの生化学的
   分離法。 ４、前記有機カルボン酸が、炭素数４以上の有機カルボ
   ン酸である特許請求の範囲第１項に記載のｌ−プロプラ
   ノロールの生化学的分離法。 ５、前記有機カルボン酸が、吉草酸、酪酸、δ−フェニ
   ル吉草酸、Ｔ−フェニル酪酸、カプロン酸、カプリル酸
   、コハク酸、スベリン酸およびセバシン酸のうちの少な
   くとも一種である特許請求の範囲第１項に記載のｌ−プ
   ロプラノロールの生化学的分離法。 ６、前記有機カルボン酸塩が、ナトリウム、カリウムな
   どのアルカリ金属塩および／またはアンモニウム塩であ
   る特許請求の範囲第１項に記載のｌ−プロプラノロール
   の生化学的分離法。 ７、前記有機溶媒が、アセトン、メタノール、エタノー
   ル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ア
   セトニトリルからなる群から選択された少なくとも一種
   である特許請求の範囲第１項に記載のｌ−プロプラノロ
   ールの生化学的分離法。