CN106632683B

CN106632683B - 具有pNPPC水解酶活性的多肽，其编码基因、制备方法及应用

Info

Publication number: CN106632683B
Application number: CN201510741209.8A
Authority: CN
Inventors: 周美凤; 徐正军; 许骏; 牛其文
Original assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Current assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Priority date: 2015-11-03
Filing date: 2015-11-03
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2035-11-03
Also published as: CN106632683A

Abstract

本发明涉及具有pNPPC水解酶活性的多肽，其编码基因、制备方法及应用。本发明分离的多肽选自：(1)SEQ ID NO:4、6、8或10所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO:21或其N端截短至多15个氨基酸残基和/或C端截短至多28个残基所获得的片段；(3)在(1)或(2)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQ ID NO：4、6、8、10或SEQ ID NO:21或其片段所具备的pNPPC水解活性的由(1)或(2)衍生的多肽；和(4)含上述(1)、(2)或(3)所述氨基酸序列的多肽。本发明多肽如MPPX具有较高底物专一性等性能，非常适合于该酶在酶联免疫分析中的应用。

Description

具有pNPPC水解酶活性的多肽，其编码基因、制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及具有pNPPC水解酶活性的多肽，其编码基因、制备方法及应用。

背景技术

对硝基苯酚磷酸胆碱(p-nitrophenyl phosphorylcholine，pNPPC)是一种人工合成的较稳定的化合物，其结构如下图所示：

该结构中含有对硝基苯酚(pNP)结构，对硝基苯酚是一种呈黄色，在405-410nm处具有强烈的吸收的物质。以对硝基苯酚为骨架开发了众多的人工合成化合物以检测多种水解酶的活性，如对硝基苯酚磷酸盐用来检测磷酸酶活性，对硝基苯酚棕榈酸酯用来检测脂肪酶或酯酶活性等。高纯度的pNPPC化合物通常是无色的，但是其水解产生pNPP则呈亮黄色。由于其具有磷酸胆碱结构，所以通常被作为底物用来检测磷脂酶C的活力(Kurioka,S.J.，Biochem.(Tokyo)，1968，63:678-680)。

除了磷脂酶C或溶血磷脂酶C能够作用于pNPPC外，其它报道能够水解该化合物产生显色产物对硝基苯酚的酶则非常少。

TAMURA H.于1995年发表的文献中提及了一种来源于蜡样芽孢杆菌的鞘磷脂酶(Sphingomyelinase，SMase)也可以作用于pNPPC(Tamura H.等，Biochem.J.1995，309:757–764)。鞘磷脂酶与PLC的作用方式类似，其水解鞘磷脂产生神经酰胺和磷酸胆碱，因此其也同PLC一样作用于pNPPC产生显色反应。但是该酶水解pNPPC的能力要远远低于其水解鞘磷脂的能力。

Florin-Christensen J.等(Florin-Christensen J.等，Biochem Mol BiolInt.1999,47(2):283-92)于1999年发表的一篇文献中提及了来源于四膜虫中的一种分子量大小为58KDa的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶(glycerophosphocholinephosphodiesterase)可以在酸性条件下水解pNPPC产生对硝基苯酚。

Kanfer J.N.等(Kanfer J.N.等，Neurochem Res.1990,(10):987-92.)于1990年发表的一篇文献中提及一种老鼠脑膜上的磷酸二酯酶可以pNPPC作为底物。

Keppetipola.N.等(Keppetipola.N.等，Nucleic Acids Research,2007,35(22):7721–7732)于2007年发表的一篇文献中提及一种来源于热纤梭菌(ClostridiumThermocellum)多核苷酸激酶-磷酸酶(polynucleotide kinase-phosphatase，CthPnkp)可以水解pNPPC，但是其活力远远低于底物为对硝基苯酚磷酸对硝基苯酚即bis(pNPP)。

Trülzsch K.等(Trülzsch K.,等，Microbiology 2001,147：203–213)于2001年发表的文献中提及一种来源于结肠炎耶尔森杆菌(Yersinia enterocolitica)的周质中的分子大小为68KDa的2’,3’-环磷酸二酯酶(2’,3’-cyclic phosphodiesterase)可以水解pNPPC和bis(pNPP)。该类酶存在于细胞周质中，需要通过渗透休克法或破坏完整细胞的方法才能释放出来，在胞外并不能检测出其活性。

Vollmer W.等(Vollmer W.等，Molecular Microbiology，2001，39(6)，1610-1622)于2001年报道了一种来源于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的磷壁酸磷酸胆碱酯酶可以水解pNPPC，该酶的分子大小为72KDa。

Nitta M.等(Nitta M.等，Biol.Pharm.Bull.2002，25(7):833—836)于2002年报道了一种由链霉菌(Streptomyces hiroshimensis)中分离纯化的分子量大小约为14KDa的碱性磷酸酶同时具有水解pNPPC产生对硝基苯酚，此外该蛋白还具有蛋白酶抑制剂的功能。

Chen等(Chen S.,等，J.Bio.Chem.2004,279:31854-31862.)于2004年报道了一种来源于詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的磷酸二酯酶，该酶具有pNPPC水解活性。

当前报道能够作用于pNPPC生成生色底物pNP的酶主要可以分为磷脂酶C类(包括溶血磷脂酶C)、磷酸二酯酶、鞘磷脂酶等几类。但是其中相关报道较多的还是以磷脂酶C为主。但是磷脂酶C的作用底物除了这种人工合成底物pNPPC外，还有天然底物磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、甘油磷酸胆碱等。通常PLC更适合作用于天然底物，譬如来源于魏氏梭菌(Clostridium welchii)的PLC其以pNPPC为底物的Km值为39mM，而以卵磷脂为底物的Km值则仅为3.4mM，远远低于合成底物pNPPC(Kurioka,S.J.，Biochem.(Tokyo)，1968，63:678-680)。

另外，对于磷脂酶C而言，pNPPC并非其天然底物，所以对pNPPC的水解活性并不高。譬如来源于蜡样芽孢杆菌的磷脂酰胆碱磷脂酶C(PC-PLC)，其野生酶的比活性有679单位/mg(Durban M.等，Eur.J.Lipid Sci.Technol.，2003，105:633-637)。蜡样芽孢杆菌的PC-PLC在枯草芽孢杆菌中重组表达的最大比活力为13190单位/mg(Durban M.A.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.2007，74:634-639)。

综上所述，当前关于能够水解pNPPC产生pNP的酶主要以磷脂酶C为主，但是该类酶的最适合作用底物并非pNPPC这种人工合成底物，因而这些酶的水解pNPPC的活力并不高。

酶联免疫吸附分析法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，简写ELISA)是Engvall和Perlman于1971年首次报道建立的方法，该方法具有灵敏度高(可达到纳克级甚至皮克级)、特异性强、操作简单、耗时短，而且能够实现大通量操作等，因而发展非常迅速，应用非常广泛(苏芳等，粮食与食品工业，2013，20(3):65-69)。

在酶联免疫分析中采用何种酶进行标记对其分析方法的稳定性、灵敏性等至关重要。在通常的酶联免疫分析中的标记酶的选择需要考虑如下一些因素，首先其反应需要较高的转换数，其次该酶需要较高的稳定性，该酶需要易于大规模低成本的制备，该酶易于获得高纯度的产品，另外在应用时干扰物质或抑制剂等较少，最后最好在待检测样品中内生的酶活性影响较小(

R.等，Biochemical education，1990，18(3):136-140)。

酶联免疫分析中经常使用的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(β-GAL)、葡萄糖氧化酶(GOD)、大豆过氧化物酶以及脲酶等。

在这些酶当中，HRP是当前市场上使用量最大的酶，其在商品化的试剂盒中有近80％的使用率，而AP也有近20％的使用率(Khatkhatay M.I.等，J.Immunoassay，1999，20(3):151-183)。HRP的分子量44KDa，其水溶性底物大都是光敏感的，因此其在实际使用中还是需要注意底物的储存及保质期。另外，在有内源性过氧化物酶较高的样本中，不能使用该酶标记的抗体进行检测。AP的分子量为84.5KDa，其通常以二聚体的形式存在，其在应用时的底物也有很多种，但因为对硝基苯酚磷酸酯的水溶性很好所以经常被用于ELISA的反应中。AP的活性对冷冻非常敏感，经过冻融循环后活力会下降很多，因而需要加入甘油、乙二醇等保护剂来保藏。而甘油或乙二醇中的杂质如醛类、过氧化物以及铁离子等都会影响该酶的活性。其优点是该酶具有高效率、易于操作、简单的动力学，而且底物的毒性也相对较低，因而也具有较广泛的应用。

目前常用的报告基因有氯霉素转乙酰酶报告基因(CAT)、β-半乳糖苷酶报告基因(β-gal)(Lim K、Chae CB，A simple assay for DNA transfection by incubatio n ofthe cells in culture dishew with substrates for galato sidase，Bio Techniques，1989，7(6):576-579)、β-葡萄糖苷酸酶(β-GUS)报告基因(Zezulak M、Snyder JJ、Needleman SB，Simultaneous analysis of codeine,morphine,and heroin after B-glucuronidase hydrolysis，J Forensic Sci，1993，38(6):1275-1285)、分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告基因(Funk CJ.，Alkaline phosphatase activity in whitefly salivaryglands and saliva，Arch Insect Biochem Physiol，2001，46(4):165-174)和荧光素酶(luc)报告基因(Amidon WJ、Pfeil JE、Gal S，Modification of luciferase to be asubstrate for plant aspar tic proteinase，Biochem J，1999，343(pt 2):425-433)等。在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有以下几种：胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)、新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、庆大霉素转移酶基因、葡萄糖苷酶基因、荧光酶基因等。常用的一种报告基因是β-D-葡萄糖苷酶基因，该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。

分泌型碱性磷酸酶(SEAP)为人胎盘碱性磷酸酶(PLAP)的突变体，也有从北大西洋海域中的耐热细菌中分离出耐热型AP。由于该酶能由表达细胞分泌到细胞外，而被最近的研究者认为最具有前途的一种报告基因，近年来对此的研究也较多(Hauksson JB、Andresson OS、Asgeirsson B，Heat-labile bacterial alkaline phosphatase from amarine Vibrio sp，Enzyme and Microbial Technology，2000，27(1-2):66-73)。由于该酶能分泌到细胞外，在检测时，可以在不破坏细胞的情况下，任意时间都可以取细胞培养上清液进行重复的、动态的检测，且被检测细胞还可以用做其它的用途。但对于检测某些肠道细胞内表达的热稳定性同工酶或无法完全失活内源性碱性磷酸酶的胎盘细胞以及产生同类型碱性磷酸酶的组织细胞(肺、精巢、子宫颈等)产物时，此方法的效果会受到较大影响。原因是AP广泛存在于微生物和动物体内，AP来源非常广泛，有很多的报道。特别的，在临床医学上，测定血清中AP的活力已成为诊断和监测多种疾病重要手段。如AP主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查。患这些疾病时，肝细胞过度制造AP，经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清AP明显升高(Fernandez N J、Kidney B A，Alkaline phosphatase：beyond the liver，VetClin Pathol，2007，34(9):68～70)。而血中肠型AP明显升高可见于各种肠道疾病，也有文献报道某些消化系统疾病、自身免疫性疾病及恶性肿瘤患者血中还可以出现免疫球蛋白复合物型AP，此种AP同工酶出现的机理尚未清楚。AP同工酶作为肿瘤组织的一个标志也逐渐为人们所认识，如肺脏、睾丸、卵巢、胰腺、结肠和淋巴组织等恶性肿瘤病人血清中含有PLAP。骨型AP作为骨代谢异常的标志物越来越受到临床重视，血清骨型AP活力的定量测定可作为监测骨形成变化的有效参数，在其他的骨代谢异常疾病(如骨软化症、佝偻病等)及早期甲状腺机能亢进的病人、慢性肾衰病人、接受肾脏移植的病人血清中的骨型AP活性均有不同程度的改变，对骨型AP活性的检测及动态观察将为疾病的早期诊断、治疗效果的监测、病情预后等提供有效的依据。这些导致SEAP作为报告基因时，空白对照的干扰大，容易出现假阳性等的弊端。

而目前有文献及专利报道的具有pNPPC活性的基因，除了磷脂酶C或溶血磷脂酶C能够作用于pNPPC外，其它报道能够水解该化合物产生显色产物对硝基苯酚的酶则非常少并且能水解pNPPC的活力很低，不会出现如SEAP的广泛干扰存在。

发明内容

本发明提供了一些具有高度pNPPC水解酶活性的多肽，优选地，该类多肽分离自芽孢杆菌属(Bacillus)和埃希氏菌属(Escherichia)的细菌，如地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以及大肠杆菌(Escherichiacoli)等，并对应于地衣芽孢杆菌基因组中Genebank编号为WP_016886260的氨基酸序列(推测为2',3'-环核苷酸2'-磷酸二酯酶)靠近N端的片段。

具体而言，本发明第一方面提供分离的多肽，所述多肽选自：

(1)SEQ ID NO:4、6、8或10所示的氨基酸序列；

(2)SEQ ID NO:21或其N端截短至多15个氨基酸残基和/或C端截短至多28个残基所获得的片段；

(3)在(1)或(2)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQ ID NO：4、6、8、10或SEQ ID NO:21或其片段所具备的pNPPC水解活性的由(1)或(2)衍生的多肽；和

(4)含上述(1)、(2)或(3)所述氨基酸序列的多肽。

在一个具体实施例中，(2)所述的片段选自：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:49。

在一个具体实施例中，(4)所述的多肽为融合蛋白。

在一个具体实施例中，所述融合蛋白为(1)、(2)或(3)所述的氨基酸序列与磷脂酶或亲和素的融合蛋白。

在一个具体实施例中，所述磷脂酶是磷脂酶C。

在一个具体实施例中，所述磷脂酶C是来自芽孢杆菌属细菌的磷脂酶C。

在一个具体实施例中，所述磷脂酶C是来自蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的磷脂酶C。

在一个具体实施例中，所述磷脂酶C含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，或由所述序列组成。

在一个具体实施例中，(1)、(2)或(3)所述的氨基酸序列直接与所述磷脂酶连接，或经由接头序列与磷脂酶连接。

在一个具体实施例中，所述接头序列为多甘氨酸接头序列。

在一个具体实施例中，(4)所述的多肽由(1)、(2)或(3)所述的氨基酸序列与促进所述氨基酸序列表达、分泌、鉴定和/或纯化的氨基酸序列组成。

在一个具体实施例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示。

本发明第二方面提供编码多核苷酸序列，选自：

(a)编码本发明多肽的多核苷酸序列；

(b)与(a)互补的序列；和

(c)(a)或(b)所述的多核苷酸序列的长15～30个碱基的片段。

在一个具体实施例中，所述多核苷酸序列选自：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、20、22、26、28、30和48。

本发明第三方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本发明的多核苷酸序列。

在一个具体实施例中，所述核酸构建物是表达载体，用于表达所述多核苷酸序列编码的氨基酸序列。

本发明第四方面提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的核酸构建物。

在一个具体实施例中，所述宿主细胞选自：大肠杆菌(E.coli)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、黑曲霉(Aspergillus niger)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

本发明还提供本发明多肽及其编码序列在磷脂改性、饲料改良、食品工业、化工、生物及医学检测方面的应用。

在一个具体实施例中，所述食品工业包括油脂制备，尤其指油脂制备中的脱胶工艺。

在一个具体实施例中，所述生物及医学检测为酶联免疫分析。

在一个具体实施例中，所述编码序列可作为报告基因用于生物及医学检测、食品、医药及化工领域。更具体而言，所述编码序列可作为报告基因用于植物基因工程和遗传转化操作中。

附图说明

图1：pNPPC水解酶的野生蛋白的纯化结果及酶谱分析结果。1-6：Mono Q柱层析分离纯化野生pNPPC水解酶的洗脱收集样品的活性电泳结果(箭头处条带为质谱鉴定的蛋白条带)；6-9：1-5号样品所对应的酶谱分析结果(pNPPC显色，箭头处为pNPPC水解活性条带)；M-蛋白质Marker条带，从上至下的大小分别是170KDa、130KDa、100KDa、70KDa、55KDa、40KDa、35KDa、25KDa。

图2：MPPX-Peptide4多肽的表达载体(pET24a-mppx-peptide4)图。

图3：MPPX多肽的表达载体示意图(pET24a-mppx)。

图4：MPPX的诱导表达及镍柱亲和纯化结果的SDS-PAGE图。M-蛋白质Marker；1-未诱导菌体超声破碎上清；2-诱导表达菌体超声破碎上清；3-诱导表达菌体超声破碎沉淀；4-亲和层析纯化的MPPX。

图5：本发明多肽MPPX的反应温度曲线。

图6：本发明多肽MPPX的温度稳定性曲线。

图7：本发明多肽MPPX的反应pH曲线。

图8：本发明多肽MPPX的pH稳定性曲线。

图9：5mM不同金属离子及EDTA对本发明多肽MPPX活性的影响。

图10：MPPX代替HRP用于酶联免疫分析检测红螯虾的卵黄蛋白原。

图11：报告基因MPPX的表达载体(PBA-MPPX)图。

图12：报告基因MPPX在烟草中表达的活性电泳图，1：PBA-MPPX-A侵染烟草叶片后叶片汁，2：PBA-A侵染烟草叶片后叶片汁，3：未侵染的烟草叶片汁，4：MARKER。

图13：融合蛋白的表达载体(pET24a-BCPLC-MPPX)图。

图14：BCPLC多肽的表达载体(pET24a-BCPLC)图。

图15：融合蛋白和BCPLC蛋白的诱导表达SDS-PAGE图，1：BCPLC超声破碎上清，2：BCPLC超声破碎沉淀，3：对照超声破碎上清，4：对照超声破碎沉淀，5：MARKER，6：对照超声破碎上清，7：BCPLC-MPPX超声破碎上清，8：BCPLC-MPPX超声破碎沉淀。

图16：镍柱纯化后的融合蛋白和BCPLC蛋白的SDS-PAGE图，1：MARKER，2：BCPLC纯化蛋白，3：BCPLC-MPPX纯化蛋白。

图17：BCPLC蛋白PC活性最适作用温度曲线。

图18：BCPLC-MPPX蛋白PC活性最适作用温度曲线。

图19：BCPLC蛋白PC活性最适作用PH值曲线。

图20：BCPLC-MPPX蛋白PC活性最适作用PH值曲线。

图21：BCPLC蛋白的PC活性的PH稳定性。

图22：BCPLC-MPPX蛋白的PC活性的PH稳定性。

具体实施方式

一类具有高度水解pNPPC产生pNP活性的多肽

本发明的多肽来自Genebank编号为WP_016886260的地衣芽胞杆菌的序列，该序列推测为2',3'-环核苷酸2'-磷酸二酯酶。本发明的多肽为该酶靠近N端的一部分。该酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。具体而言，本发明的多肽如SEQ ID NO:21所示，或为SEQ IDNO:21的片段。“片段”在本文中指序列的连续的一部分。例如，对于全长364个氨基酸残基的SEQ ID NO:21而言，其片段包括第1－363位氨基酸，第2－363位等。优选地，所述片段为SEQID NO:21的N端截短至多15个氨基酸残基和/或C端截短至多28个残基所获得的片段。

具体而言，本发明中，SEQ ID NO:21的片段为X-N-Y的形式，其中，X为SEQ ID NO:21第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14位到第15位氨基酸残基，或不存在；N为SEQ IDNO:21第16－336位氨基酸残基，Y为SEQ ID NO:21第337位残基到第338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362或363位氨基酸残基，或不存在。更优选地，N为SEQ ID NO:21第11-338位氨基酸残基；X为第1、2、3、4、5、6、7、8、或9位到第10位氨基酸残基，或不存在；Y为SEQ ID NO:21第339位残基到第340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362或363位氨基酸残基，或不存在。

SEQ ID NO:21的片段的例子包括但不限于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:49。本发明特别优选的多肽是来源于地衣芽胞杆菌的MPPX(SEQ ID NO:2)。该蛋白的理论分子量为36.1KDa，重组多肽的分子量为37.5KDa。

本发明也包括获自其它属/种的微生物中与Genebank编号为WP_016886260所示氨基酸序列(该序列推测为2',3'-环核苷酸2'-磷酸二酯酶)在基因组位置和氨基酸序列及功能方面相对应的序列，优选是靠近该序列的N端的部分。在优选的方面，本发明多肽获得自原核微生物细胞或其胞外产物。在更优选的方面，本发明的多肽来自芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、链球菌属(Streptococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、李斯特菌属(Listeria)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)等原核生物来源。优选地，本发明多肽来自于芽孢杆菌属和埃希氏菌属，更优选地来自于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以及大肠埃希氏菌(Ecsherichia coli)。

来自其它种/属微生物的本发明多肽的例子包括但不限于SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10所示的序列。

本发明还包括用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时所获得的多肽。这种保守性取代通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。本发明因此包括在SEQ IDNO:21或其片段以及SEQ ID NO:4、6、8和10所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQ ID NO：4、6、8、10或SEQ ID NO:21或其片段所具备的pNPPC水解活性的由这些氨基酸序列衍生的多肽。所述几个通常为10个以内，优选8个以内，更优选5个以内。

本领域技术人员可采用常规的技术手段判断SEQ ID NO:21或其片段以及SEQ IDNO:4、6、8和10所示的氨基酸序列中哪些氨基酸残基可被取代或删除。例如，通过比对来自不同种属、活性相同或类似或明显不同的序列，可以判断这些序列中哪些氨基酸残基是可以被取代或删除。可采用本领域常规的方法(包括本发明所公开的方法)验证这样的序列是否具备本发明所述的酶活。

此外，本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。本发明氨基酸序列的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。使用的标签例子包括Poly-Arg，如RRRRR；Poly-His 2-10个(通常6个)，如HHHHHH；FLAG，即DYKDDDDK；Strep-TagII，即WSHPQFEK；和C-myc，即WQKLISEEDL。应理解，这些氨基酸序列的存在不会影响到所得多肽的活性。因此，本发明也包括在本发明多肽的C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸所得的多肽，这些多肽仍具有本文所述的pNPPC水解活性。

因此，本发明也包括与SEQ ID NO:21或其片段、SEQ ID NO:4、6、8或10所示的氨基酸序列具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％，更优选至少99％序列相同性的氨基酸序列。可采用常规的手段计算比对的两条序列的序列相同性，例如，采用NCBI提供BLASTP，采用默认参数进行比对。

根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。

本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

融合蛋白

本发明提供由本发明多肽与其它功能性蛋白形成的融合蛋白。功能性蛋白在本文中指已知的具有某种生物学功能(例如酶学功能)的蛋白。优选的是，这类功能性蛋白包括但不限于：磷脂酶、脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶等各种酶类以及亲和素。

本发明中，优选的所述磷脂酶是磷脂酶C。在一个具体实施例中，所述磷脂酶C是来自芽孢杆菌属细菌的磷脂酶C，尤其是来自蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的磷脂酶C。在一个具体实施例中，所述磷脂酶C含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，或由所述序列组成。

本发明多肽与功能性蛋白可直接相连，或者可通过接头相连接。例如，在直接相连的情况下，以MPPX和亲和素的融合蛋白为例，由于MPPX蛋白没有含有巯基的氨基酸，因此首先需要对其进行巯基化，然后与马来酰亚胺活化的亲和素混合，从而得到MPPX-Avidin蛋白。若使用接头序列，接头序列通常为多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2-40个，例如2-30、2-25、2-20、2-15、2-10、2-8或者3-30、3-25、3-20、3-15、3-10个，或者4个以上30、25、20、15、12或10个以下。作为接头序列的例子，可列举的有：GGGSGGSG、G(SGGGG)₂SGGGLGSTEF、RSTSGLGGGS(GGGGS)₂G、QLTSGLGGGS(GGGGS)₂G、QLTSGLGGGS(GGGGS)₂G、G(SGGGG)₂SGGGLGSTEF和RSTSGLGGGS(GGGGS)₂G。

本发明融合蛋白的例子包括MPPX与来自蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的磷脂酶C形成的融合蛋白以及MPPX与亲和素形成的融合蛋白。在一个具体实施例中，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示，编码序列如SEQ ID NO:52所示。

可采用本领域常规的方法制备融合蛋白。这类方法可参见本申请实施例12所示例的方法。

多核苷酸

本申请包括本发明多肽和融合蛋白的编码核苷酸序列，SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:48显示了本发明多肽或融合蛋白的编码序列之一。所述“编码序列”包括与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ IDNO:9，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:30和SEQ IDNO:48高度同源的序列或在严格条件下与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ IDNO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ IDNO:30和SEQ ID NO:48杂交的核苷酸序列或与上述分子高度同源的家族基因分子。编码本发明多肽的序列可以与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ IDNO:9，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:30和SEQ IDNO:48所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码包含SEQ ID NO：2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:49的氨基酸序列，但与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:30或SEQ IDNO:48所示的核苷酸序列有差别的核苷酸序列。

编码本发明多肽的序列包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明的多肽的编码序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

核酸构建物

本发明也涉及包括与指导编码序列在合适宿主细胞中，在与该调控序列相适合的条件下表达的一个或多个调控序列可操作连接的本发明的分离多核苷酸的核酸构建体/核酸构建物。编码本发明多肽的多核苷酸可以多种方式被操作以保证该多肽的表达。在其插入载体之前该多核苷酸序列的操作可能根据该表达载体而是合乎需要或必需的。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。

调控序列可以使合适的启动子序列，由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列包含接到多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从噬菌体T7启动子、大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因等。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞正转录的合适启动子的实例是从米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉糖化酶(glaA)、里氏木霉纤维二糖水解酶I、氏木霉纤维二糖水解酶II、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、里氏木霉葡聚糖内切酶等基因获得的启动子及其突变、截短和混合(hybrid)启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子可获得自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因、巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因。用于酵母宿主细胞的其它有用启动子由Romanos等，1992，Yeast 8:423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

用于细菌宿主的优选终止子可以是来自T7噬菌体的终止子。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子获得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因。

用于酵母宿主细胞的优选终止子获得自酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C、酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶、巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因等。

调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。签到序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

调控序列也可以是编码与多肽的氨基酸末端连接的氨基酸序列并且指导该编码的多肽进入细胞分泌途径的信号肽编码区。核苷酸序列编码序列的5′端可固有地包含天然连接具有编码分泌多肽的编码区节段的翻译阅读框的信号肽编码区。备选地，编码序列的5′端可包含与该编码区外源的信号肽编码区。当编码序列非天然地包含信号肽编码区时，可能需要外来的信号肽编码区。备选地，外来的信号肽编码区可简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区，即分泌进入培养基，都可用于本发明。

表达载体

本发明也涉及包括本发明多核苷酸的重组表达载体。在此各种核酸和调控序列可被连接在一起以产生可能包括一个或多个容许在这种位点插入或取代该编码多肽的核苷酸序列的方便限制性位点的重组表达载体。备选地，本发明的核苷酸序列可通过插入核苷酸序列或包括进入适当表达载体的序列的核酸构建体而被表达。在制造表达载体时，编码序列位于载体中以使得该编码序列可操作地连接用于表达适当调控序列。

重组表达载体可以使能够方便地经受重组DNA方法并且可导致感兴趣的核苷酸序列表达的任何载体(如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与其中被导入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性或闭合的环形质粒。

载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含用于保证自我复制的任何方式。备选地，载体可以是当被导入宿主细胞时，整合到基因组中并且与其已经被整合进入的染色体一起复制的载体。此外，可使用一起包含将被导入宿主细胞基因组的总DNA的单个载体或质粒或两个或多个载体或质粒，或转座子。

本发明的载体优选包含一个或多个容许容易选择转化、转染、转导等细胞的可选择标记。可选择的标记是基因，其产物提供对抗生素或病毒的抗性、对重金属的抗性、原养型至营养缺陷型等。

本发明的载体优选包含容许该载体整合进入宿主细胞基因组或该载体在细胞中独立于基因组自主个复制的元件。

一个以上拷贝的本发明的多核苷酸可被插入宿主细胞以增加该基因产物的产量。多核苷酸拷贝数的增加可通过将至少一个附加拷贝的序列整合进入宿主细胞基因组或通过包括可扩增的选择标记基因和该多核苷酸来获得，其中包含扩增拷贝的选择标记基因并且由此包含附加拷贝多核苷酸的细胞可通过在存在适当的选择剂时培养该细胞来筛选。

本发明的载体优选包含人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。

本发明的表达载体更为优选包含有连续6个组氨酸序列的小肽，有利于蛋白质的提取和纯化。本发明的载体优选商品化的原核表达常用载体如pET系列的载体如pET24a-d，pET28a-c、pET30a-c以及pET32a-c等。

宿主细胞

本发明也涉及包括被用于重组生产多肽的本发明多核苷酸的重组宿主细胞。包括本发明多核苷酸的载体被导入宿主细胞以使得该载体如早先说明的作为染色体的组成部分或作为染色体外的自我复制载体来维持。宿主细胞的选择很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是单细胞微生物或非单细胞微生物。单细胞微生物例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌等；或链霉菌细胞，例如钱青紫链霉菌；或革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌和假单胞菌属。在优选的方面，细菌宿主是枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和大肠杆菌细胞。

宿主细胞也可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物、酵母或真菌细胞。在优选的方面，宿主细胞是真菌细胞，如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门等。

在更优选的方面，宿主细胞是原核细胞。如在此使用的“原核细胞”包括假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链霉菌属(Streptomyces)以及埃希氏菌属(Escherichia)的细菌。在更为优选的方面，宿主细胞是假单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属以及埃希氏菌属的细胞。

在最优选的方面，宿主细胞是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、大肠杆菌(Escherichia coli)以及变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)等。在另外最优选方面，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞。

生产方法

本发明涉及生产本发明多肽的方法，包括：(a)在有助于生产多肽的条件下培养宿主细胞；以及(b)回收该多肽。

宿主细胞包括编码本发明多肽的核苷酸序列，或与该核苷酸序列杂交且编码具有pNPPC水解酶活性的多肽。

在优选实施例中，宿主细胞包括SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ IDNO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28或SEQ IDNO:30所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQID NO:9，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:30所限定的核苷酸序列杂交且编码具有pNPPC水解酶活性的多肽的核苷酸序列。在优选的方面，本发明的多肽是SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31的氨基酸序列或增加一段因重组表达方式所产生的氨基酸序列。

本发明的生产方法中，细胞可以利用本领域已知的方法在适于生产多肽的培养基中培养。例如，细胞可通过在实验室或工业发酵罐中进行的摇瓶培养和小规模或大规模的发酵(包括连续的、分批的、分批补料或固态发酵)，在合适的培养基和容许该多肽表达和/或分离的条件下进行培养。培养发生在利用本领域已知的方法包括碳源和氮源和无机盐的合适培养基中。合适的培养基可获得自商业供应者或可根据公开的组合物来制备。如果该多肽分泌进入培养基，该多肽可从培养基直接回收。如果该多肽不分泌进入培养基，它可从细胞裂解物回收。

多肽可利用本领域已知的特异于该多肽的方法来检测。这些检测方法可包括特异抗体的使用，酶产物的形成，或酶底物的消失。例如，酶活性测定可如在此说明的用来测定多肽的活性。

在优选的方面，本发明采用pNPPC为底物来测定该多肽的活力大小，该方法以pNPPC为反应底物，通过本发明多肽的催化产生对硝基苯酚(pNP)和磷酸胆碱。因为pNP在405-410nm具有强烈的吸收，因此可以直接表征本发明多肽的活性。酶活力单位定义为：1个单位即指在标准实验条件下每分钟催化释放1nmol的pNP所需的酶量。本方法是一种用于磷脂酶C检测的常规方法，参见Kurioka S.等人1976年发表的文献(Kurioka S.等人，Anal.Biochem.1976,75:281-289.)。

本发明所描述的多肽可利用本领域已知的方法来回收。例如，多肽可通过常规方法，包括但不限于离心、过滤、超滤、萃取、层析、喷雾干燥、冷冻干燥、蒸发或沉淀等从培养基回收。

本发明的多肽可通过本领域已知的多种方法来纯化，包括但不限于色谱法(如离子交换、亲和性、疏水性、色谱聚焦、分子排阻)，电泳法(例如等电聚焦)、差异溶解度(如盐析沉淀)、SDS-PAGE或萃取法以获得基本上纯的多肽。

多肽或其编码序列的性能和应用

本发明的多肽，尤其是MPPX，不能作用于磷脂酰胆碱(PC)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)以及大豆粉末磷脂这些天然存在的物质，对甘油磷酸胆碱(GPC)的作用也极其微弱。另外本发明多肽也不能作用于对硝基苯酚棕榈酸酯、对硝基苯酚丁酸酯、极其微弱地作用于对硝基苯酚磷酸盐。但是本发明多肽具有高度的水解pNPPC产生pNP的活性，尤其是MMPX，其比活力达到230650单位/mg，远远高于一般的PLC水解pNPPC的活性，如前述蜡样芽孢杆菌的PLC在枯草芽孢杆菌中表达只能最高达到13190单位/mg。

本发明所提供的多肽如MPPX的Km值为1.84mM，催化pNPPC反应的转换数为140.55S^-1，这些动力学性质都非常有利于其在酶联免疫分析中的应用。

本发明多肽，如MPPX具有较高底物专一性，非常好的热稳定性，宽广的pH稳定性，最适合作用温度，最适合作用pH以及金属离子的影响等等。这些都非常适合于该酶在酶联免疫分析中的应用，用于科学研究、生物及医学检测。

另外，本发明提供的具有pNPPC水解酶活性的基因，具有可定量、能被快速简便地检测到(其编码的产物能在15min内被快速检测到)、灵敏度高、重现性好、专一性高(不水解除合成底物pNPPC以外的其它底物，因此空白对照带来的干扰低)等特点，因此具有作为报道基因的优良性质。因此，本发明的多核苷酸可用作报告基因，在科学研究、生物及医学检测、食品、医药及化工等多个领域，尤其是在植物基因工程和遗传转化中具有广泛的应用前景。

脱胶是植物油精炼过程中的一个重要环节，对提高油的品质至关重要，脱胶主要是脱除磷脂，脱胶若不彻底，会影响油品的深加工和油品的稳定性，减低油品货架期。酶法脱胶可以克服传统脱胶方法脱胶脱除率低，同时减少中性油损失高等的问题。在酶法脱胶工艺中，现有文献(①S.Jung,D.Maurer,L.A.Johnson.Factors affecting emulsionstability and quality of oil recovered from enzyme-assisted aqueousextraction of soybeans.[J]Bioresource Technology,2009,100(21),5340-5347；②Ning Liu,Yong Wang,Qiangzhong Zhao,Chun Cui,Min Fu,MoumingZhao.Immobilisation of

ultra for production of diacylglycerols byglycerolysis of soybean oil[J]Food Chemistry,2012,134(1),301-307；US5264367、US5532163、US6001640、US6103505、US6127137、US6143545、US6548633、US5558781)多报道磷脂酶PLA用于植物油脱胶。但磷脂酶PLA(包括PLA1和PLA2)脱胶后会产生极性溶血磷脂和极性脂肪酸。磷脂酶PLC酶通过选择性水解磷酸酯官能团与磷脂反应，生成甘油二酯(DAG)和磷脂酸基团，甘油二酯不需要被除去，所以PLC脱胶工艺通过保留原始的磷脂分子而仅去除磷酸酯官能团来减少精炼损耗，很明显用PLC脱胶比PLA脱胶更优越。文献中报道用PLC脱胶的不多，US101663382中阐述每种酶具有不同的耐热性，PLA酶将在约50℃下变性，PLC酶将在约65℃下变性，并且此文献中PLC酶法脱胶是在45℃条件下脱胶可以得到最佳的脱胶效果，在45℃条件下，PLC酶的活力和耐热性可以到达一个理想的平衡。因此，目前用于酶法脱胶的酶有PLA、PLB和PLC，PLC酶法脱胶的温度大概在45℃-50℃左右，因此提高PLC和PLA在45℃-50℃之间的热稳定性，对达到良好的脱胶效果非常有利。

本发明提供的由本发明多肽和磷脂酶形成的融合蛋白，尤其是MPPX-BCPLC融合蛋白，具有良好的热稳定性，在45℃-50℃水浴2小时，几乎没有任何活力损失，而且相对于未融合的蛋白而言，MPPX-BCPLC融合蛋白的最适合作用温度在45℃，在50℃其活力相较于45℃下降平缓很多。另外，MPPX-BCPLC融合蛋白的pH稳定性也相较于BC-PLC有很大的改善。此蛋白的这些特别性质可以预见将会极大地提升该蛋白的脱胶效果，大大地提升该磷脂酶在脱胶方面的应用价值。由于磷脂酶还可以可广泛应用于磷脂改性、饲料改良剂、食品工业和医药等方面(Demaria L.、Vin J.、Oxenboll K M.、Svendsen A.、Patkar S.，Phospholipases and their industrial applications[J]，Applied MicrobiologyBiotechnology，2007，74(2):290-300)，可以预见，本发明稳定性好的磷脂酶融合蛋白在这些应用方面也将有更大的应用前景。

下文将以具体实施例的方式描述本发明。应理解，本发明并不限于这些具体的实施方式。实施例中所采用的反应试剂、条件等，除非另有说明，否则为本领域常规的试剂、条件等。

实施例1：能够水解pNPPC产生pNP的野生pNPPC水解酶的发酵培养

取一环活化好的PDA或LB琼脂培养基上生长的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)CGMCC No.7878接种于种子摇瓶中，于28℃、180rpm，培养24h。种子培养基为LB液体培养基，其组成为胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，pH7.0。

液体种子培养好后，以1％的接种量接种至30ml发酵培养基中，于28℃、180rpm的条件培养24h。发酵培养基的组成为：蔗糖0.5％、胰蛋白胨0.5％、酵母浸出粉1％、牛肉膏0.5％，玉米浆膏0.5％，K₂HPO₄0.05％、MgSO₄0.05％、CaCl₂0.05％，ZnSO₄·7H₂O0.05％，硫酸锰0.1％，pH 7.0。

培养结束后将培养液于1200rpm离心10分钟，收集获得离心上清约800ml，可以用于后续的分离纯化。

实施例2：野生pNPPC水解酶的分离纯化

将实施例1中的离心上清约800ml，用0.22μm微滤膜进行微滤，而后用10KDa的超滤膜进行超滤浓缩，同时更换为20mM Tris-HCl pH8.7的缓冲液。收集超滤截留液约为100ml。

用5ml的DEAE柱(Hitrap^TM DEAE FF，GE Healthcare)对上述约100ml体积的超滤液进行阴离子交换层析分离。洗脱缓冲液为含有1M NaCl的20mM Tris-HCl pH8.7缓冲液。离子交换层析的条件如下：

缓冲液A：20mM Tris-HCl，pH8.7；

缓冲液B：20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH8.7；

流速：2ml/min；

洗脱方式：梯度洗脱0-100％B，120min；

收集：2ml/管。

收集的洗脱液并进行pNPPC活性的检测，合并活性较高的收集液。而后用10KD的超滤管对合并液进行缓冲液的置换。缓冲液置换为20mM Tris-HCl pH8.7缓冲液及DEAE层析的缓冲液A。

置换好缓冲液的样品使用Mono Q柱(Mono Q^TM 4.6/100PE,GE Healthcare)再次进行阴离子交换层析分离。层析条件为：

缓冲液A：20mM Tris-HCl pH8.7；

缓冲液B：20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH8.7；

流速：1ml/min；

洗脱方式：梯度洗脱0-30％B 90min，30-100％B 20min；

收集：1ml/管。

收集的液体进行pNPPC水解活性的检测，而后用酶谱分析的方法定位目标蛋白在胶上的具体位置。本发明的酶谱分析的显色方法是直接使用pNPPC为底物进行显色，无色透明的PAGE胶上出现的黄色条带的即为目标蛋白条带，表明此处的蛋白经过复性后具有水解pNPPC的能力。pNPPC水解酶野生蛋白纯化的结果见图1。酶谱分析的方法参考Cadirci(Cadirci B.H.,Yasa I.，An organic solvents tolerant and thermotolerant lipasefrom Pseudomonas fluorescens P21，J.Mol.Catal.B:Enzym.2010，64:155–161)、Yadav(Yadav R.P.,Saxena R.K.,Gupta R.等，Rapid zymogram for lipase.BioTechniques1998，24(5):754–756)、Masayama(Masayama A.,Kuwana R.,Takamatsu H.等，A NovelLipolytic Enzyme,YcsK(LipC),Located in the Spore Coat of Bacillus subtilis,IsInvolved in Spore Germination，J.Bacteriol.2007，189(6):2369–2375)等脂肪酶酶谱检测方法基础上建立的。该检测方法与普通SDS-PAGE在凝胶准备、上样和电泳过程等都基本相同。不同的是该方法在电泳样品准备阶段使用的上样缓冲液中不含有DTT或2-巯基乙醇等还原剂，另外电泳样品只是室温放置不能加热或煮沸变性；酶谱检测方法在电泳时与普通SDS-PAGE不同的是要使得电泳过程尽可能产热少，因此可以在90V或更低的电压下电泳。在电泳结束后将含有待检测样品的凝胶放置于0.5-2.5％的Triton X-100缓冲液中进行两次室温振荡，每次30min。而后取出凝胶用20mM pH 7.5的Tris-HCl缓冲液洗涤3次每次10min以除去残余的Triton X-100并实现酶蛋白的复性。而后将该凝胶置于玻璃平板上，在胶表面滴加pNPPC溶液，而后37℃放置数分钟后即可用肉眼观察到明显黄色条带。

图1中水平箭头所指的条带即为具有pNPPC水解酶活性的蛋白水解pNPPC所产生的pNP所形成的条带，根据此电泳结果可以确定该活性蛋白的表观分子量在35-40KD之间。图1的1-6号样品为考马斯亮蓝染色的结果，与酶谱分析结果进行对比后可以确定图1中斜向箭头所指处的条带应是pNPPC水解酶的野生蛋白电泳条带。

实施例3：野生pNPPC水解酶蛋白的质谱鉴定

图用干净的刀片小心切出图1斜向箭头指向的泳道3的蛋白条带，而后进行LC-MS/MS质谱鉴定法对该条带的蛋白进行鉴定。经过数据分析，发现该条带中打分最高的蛋白为地衣芽胞杆菌基因组中推测为2',3'-环核苷酸2'-磷酸二酯酶的蛋白，其GENE BANK号为WP_016886260。该蛋白的多核苷酸序列见SEQ ID NO:11，其氨基酸序列见SEQ ID NO:12。该预测蛋白包括有1445个氨基酸长度，分子量为158.2KDa，远远高出实施例2中所制备的野生pNPPC水解酶的分子大小。

同时LC-MS/MS的质谱鉴定结果还给出了几个打分非常高的肽段，其氨基酸序列信息如下：

肽段1(peptide1)：NPNTILVDNGDLIQGNPLGEYIFK，见SEQ ID NO:13

肽段2(peptide2)：VGYIGFVPPQILTWDK，见SEQ ID NO:14

肽段3(peptide3)：TEGIDAIISGHQHGLFPGTDYPGNGVIDNQK，见SEQ ID NO:15

肽段4(peptide4)：DDPSIQIVTDAQK，见SEQ ID NO:16

经过比对，肽段1至肽段4基本位于序列为SEQ ID NO:12所示蛋白的N端，且排位顺序是肽段4在最接近C端，肽段1在最接近N端。另外用Signal P4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析SEQ ID NO:12蛋白，结果显示其第1至第36位为一段长度为36个氨基酸的信号肽。经过计算去除信号肽后的至肽段4的序列，即如SEQ IDNO:17所示序列。该序列含有370个氨基酸，理论分子量为40.8KDa，略大于实施例2中所制备的野生pNPPC水解酶的大小。

实施例4：pNPPC水解酶活性的多肽MPPX的克隆、表达及活性验证

(1)MPPX-peptide4多肽的基因克隆

根据实施例3中的蛋白鉴定结果，对SEQ ID NO：17所示多肽进行克隆。设计引物分别为MPPX-peptide4上游引物(见SEQ ID NO：18)和MPPX-peptide4下游引物(见SEQ ID NO:19)。为了方便进一步的构建表达载体，以上引物均含有限制性内切酶酶切位点，上游引物为Nhe I酶切位点，下游引物为Xho I酶切位点。

以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC No.7878的基因组为模版，通过PCR反应克隆获得一段DNA序列mppx-peptide4，经过测序其序列如SEQ ID No：20所示。将PCR产物进行1％的琼脂糖电泳，并切胶使用美国OmegaBio-Tek公司的E.Z.N.A^TM胶回收试剂盒进行目标条带的回收。

(2)MPPX-peptide4多肽的表达载体的构建

将上述步骤中所获得片段mppx-peptide4，采用默克公司的pET 24a载体进行异源表达构建的载体命名为pET24a-mppx-peptide4，其示意图见图2。首先取200ng左右的步骤(1)所获得的核酸，按照下表加入相应酶及缓冲液等。

类别	体积μL
		10×NEB缓冲液4	5
SEQ ID NO：20所对应的核酸或载体pET24a	4
		Nhe I	2
Xho I	2
		100×BSA	0.5
水	30.5

37℃酶切2h后，用PCR产物回收试剂盒回收酶切产物。

而后按照如下连接体系，进行连接反应。按照如下的配方配制连接反应体系为20μl，具体配比如下：

而后于置于22℃条件下连接3h左右。

取出1根装有100μl DH5α感受态细胞，冰浴融化后，相应加入20μl的连接产物，冰浴30min。而后于42℃热激90秒后，立即放置于冰浴中1-2min后，往每管中加入880μl的LB培养基。而后于37℃，200rpm摇床进行预培养60min左右。而后于12000rpm离心3min后，去除部分清液，留约100ul清液，充分悬浮沉淀菌体后，取全部液体涂布于相应的含卡那霉素的平板上，37℃培养过夜。

取出培养过夜的转化平板，挑选部分菌落进行菌落PCR验证，挑选菌落PCR验证结果为阳性的重组子扩大培养。而后提取重组质粒，该质粒即为构建成功的表达载体，命名为pET24a-mppx-peptide4，经过测序其表达多肽命名为MPPX-Peptide 4，其氨基酸序列如SEQID NO:21所示。

(3)MPPX-peptide4多肽的重组表达

将提取好的质粒再次转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中，转化方法与(2)中所述的转化方法类似。转化时，质粒的添加量为1μl。转化平板培养过夜后，进行菌落PCR验证并挑选阳性克隆用于摇瓶表达验证。

将上述构建好的重组菌接种于5ml的含有100μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中(Tryptone 10g/L，酵母浸出物5g/L，NaCl 10g/L)，37℃过夜培养过夜。

而后按照0.1％的接种量将长好的液体种子接种至发酵摇瓶中，该摇瓶为250ml规格，其装有50ml的含有100μg/ml卡那霉素的液体LB培养基。而后将摇瓶置于37℃条件下，180rpm培养至OD值在0.6-0.8。

立即加入诱导剂IPTG进行诱导，诱导剂的添加浓度为0.2mM。于37℃的条件下进行诱导表达3h左右。取下诱导后的表达摇瓶，10000r/min离心10min，收集菌体。加入含有200mM NaCl的50mM pH7.5的Tris·HCl缓冲液，充分悬浮好菌体后于冰浴条件下进行用超声破碎仪对大肠杆菌菌体进行破碎。而后将破碎液于4℃，10000r/min条件下离心10min以获得破碎上清液。对此破碎上清液进行pNPPC水解活力的检测发现该上清液中含有非常高活力的pNPPC水解酶，远远超过未诱导的大肠杆菌破碎上清液。因此说明MPPX-peptide4多肽(SEQ ID NO:21)具有pNPPC水解酶活性。

实施例5：mppx-peptide4基因截短后的重组蛋白的pNPPC水解活性考察

因为野生pNPPC水解酶的分子量要明显小于上述制备的MPPX-Peptide4重组蛋白(SEQ ID NO:21)，所以本发明对该序列进行了一个截短的研究，见下表。

以上多肽采用实施例4相同的方法构建pET24a的表达载体，而后也采用实施例4相同的方法进行表达宿主的转化、重组蛋白的诱导表达以及pNPPC水解活性的检测等。

结果如下表所示。结果显示，多肽MPPX-P4-N10、MPPX-P4-C10、MPPX-P4-C20、MPPX-P4-C26仍具极强的pNPPC水解活性。而MPPX-P4-N20和MPPX-P4-C30则几乎没有任何pNPPC水解活性。

重组蛋白名称	与实施例4蛋白的区别	pNPPC水解活性
			MPPX-P4-N10	N端截短10个氨基酸	170000单位/mg
MPPX-P4-N20	N端截短20个氨基酸	0
			MPPX-P4-C10	C端截短10个氨基酸	85000单位/mg
MPPX-P4-C20	C端截短20个氨基酸	116000单位/mg
			MPPX-P4-C26	C端截短26个氨基酸	197000单位/mg
MPPX-P4-C30	C端截短30个氨基酸	0

因此，选择N端切除10个氨基酸同时C端切除26个氨基酸的多肽命名为MPPX，进行再次的重组表达并进行活性检测。MPPX蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例6：MPPX蛋白的重组表达及分离纯化

MPPX蛋白的克隆所采用的上游引物为SEQ ID NO:34所示序列，下游序列则为SEQID NO:38所示序列。采用实施例4中所提供的方法进行表达载体的构建，该表达载体如图3所示。

MPPX蛋白的理论大小为36.1KDa，与实施例2中所分离纯化的野生pNPPC水解酶的大小一致，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

采用实施例4中的方法，将表达载体成功转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，从而获得工程菌BL21(DE3)-mppx。而后根据实施例4中的重组表达方法进行重组表达，诱导表达结果的SDS-PAGE结果见图4。

诱导结束后的菌体采用离心法进行收集，而后用超声破碎的方法对收集的菌体进行破碎。离心获得破碎上清液后，直接用5ml的HisTrap^TM Ni HP柱(GE Healthcare)进行纯化。吸附缓冲液为含有10mM咪唑和200mM NaCl的50mM pH7.5的Tris·HCl缓冲液。吸附流速为5ml/min。而后用含有20mM咪唑和200mM NaCl的50mM pH7.5的Tris·HCl缓冲液再次进行洗涤4-5倍柱体积。最后用含有250mM咪唑和200mM NaCl的50mM pH7.5的Tris·HCl洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰。

含有250mM咪唑的洗脱组分用10KD的超滤管进行超滤除盐和咪唑，用50mM含有200mM NaClD pH7.5的Tris·HCl缓冲液进行置换。对纯化蛋白稀释10倍后进行SDS-PAGE电泳检测，结果见图4。由图4可以发现，mppx基因在pET24a中得到了大量的可溶性表达。经过一步亲和层析可以去除绝大部分的杂蛋白。

对此纯化蛋白稀释1000倍后进行pNPPC水解活力测定，结果为1881400单位/ml。用Bradford法对蛋白进行定量(以牛血清白蛋白BSA进行对照)，结果显示该纯化蛋白的浓度为8.16mg/ml。因此MPPX水解pNPPC的比活为230650单位/mg重组蛋白。

实施例7：其它来源的具有pNPPC水解酶活性的多肽的克隆及重组表达及分离纯化

按照以上实施例中的克隆、重组表达及分离纯化的方法，分别从枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌以及大肠杆菌中进行pNPPC水解酶基因的克隆、重组表达及分离纯化。这些基因克隆的引物设计及序列信息见下表所示。

实施例8：本发明多肽水解pNPPC的动力学参数测定

配制一系列不同浓度的pNPPC底物溶液，而后对上述实施例所制备的多肽对pNPPC底物水解产生对硝基苯酚(pNP)能力的检测。并由此计算出这些酶所对应的米氏常数Km，转换数等值，见下表。

实施例9：本发明重组多肽MPPX的酶学性质检测

(1)本发明多肽MPPX的最适作用温度

将实施例6中所制备获得的MPPX样品稀释1000倍用以进行最适作用温度的测定。

在不同的温度(45-80℃)下进行水解pNPPC活力的检测，以所测定的最高时的酶活力为100％，计算其他温度下的相对酶活(％)，结果如图5所示。由图5可见，本发明多肽水解pNPPC的活力随着温度的提高呈现先上升后下降的趋势，其最适作用温度为60℃。65℃时其活力可达到80％以上的活力。在45℃本发明多肽仍有超过40％的活性。由此可见，本发明多肽表现出作用温度范围广的性质，此特性对于进一步拓宽该多肽的实际应用非常有利。

(2)本发明多肽MPPX的温度稳定性

将实施例6所制备的蛋白稀释10倍后置于45℃～70℃等一系列的温度环境下进行孵育。而后分别于1hrs和2hrs后取样稀释后进行水解pNPPC活力的测定。以4℃冷藏样品的初始检测的酶活力值为100％，以此计算其他样品的相对活力值。结果见图6，即为温度稳定性曲线。

由图6可以明显看出，本发明的多肽MPPX在50℃以下保温120min后，其活力没有任何损失。在55℃条件下孵育2小时后，其活性仍能保持超过80％；60℃条件下孵育120min后，其活性仍能保持超过70％；65℃条件下孵育120min后，其活性仍能保持接近50％；由此说明该多肽是一种温度稳定性非常好的活性蛋白。

(3)本发明多肽MPPX的最适作用pH

将实施例6制备所得的多肽经过稀释后，分别在不同pH(4.5-10.0)的缓冲液中50℃下进行pNPPC水解活力的测定。以最高时的酶活力为100％，计算其他pH条件下的相对活力(％)，结果如图7所示。由图7可见，本发明的多肽在pH7.5时的活性最高，在pH7.0时的活性接近90％，而在pH8.0时的活性只有最高活性时的40％不到。如此结果说明本发明多肽是一种在中性pH范围内作用的pNPPC水解酶，此结果非常有利于该酶的进一步应用。

(4)本发明多肽MPPX的pH稳定性

将实施例6所制备的多肽稀释5倍后与不同pH(5.5-10.0)的缓冲体系按照体积比1:1进行配制。而后将这些不同pH条件下的样品管置于4-8℃条件下放置16h。而后用pH7.5的50mM Tris·HCl缓充液对这些样品进行稀释。而后再于50℃、pH7.5的条件下对这些稀释好的样品进行pNPPC水解活力的检测。以在最高值为100％，计算其它pH下的相对酶活力，结果如图8所示。由图8可见，本发明的多肽及在pH6.5至pH10.0的范围内稳定性都比较好，4-8℃条件下放置16h后其活性最低也能保持80％以上。

(5)金属离子对本发明多肽MPPX活性的影响

配制CaCl₂、MgSO₄、ZnSO₄、CuSO₄、MnCl₂、NiSO₄、CoCl₂等无机盐贮存液以及EDTA溶液。首先配制反应混合液，向每个样品管中添加终浓度为5mM的各种离子的无机盐及EDTA，而后往这些样品中添加相同量的MPPX酶液，50℃条件下反应一段时间后进行pNPPC水解活性的检测。以不添加任何金属离子或EDTA的样品作为对照，计算其他样品的相对酶活力值，结果见图9。由图9可以看出，本发明多肽MPPX在5mM的Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺离子的环境中，其水解pNPPC的活性能够进一步提高。而在5mM的Cu²⁺、Zn²⁺以及EDTA存在的条件下，该酶水解pNPPC的活性则几乎被完全抑制。

(6)本发明多肽MPPX对各种底物的水解活性

将MPPX的底物更换为磷脂酰胆碱(PC)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、甘油磷脂酰胆碱(L-α-GPC)、大豆粉末磷脂(含有多种磷脂成分)、对硝基苯酚磷酸钠(pNPPNa)、对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)、对硝基苯酚丁酸酯(pNPB)，而后于50℃、pH7.5的条件下反应30min后进行活性检测。对硝基苯酚系列的底物如pNPPNa、pNPP、pNPB的活性检测方法同pNPPC活力检测方法类似，检测反应液在410nm处的吸收值。天然底物如PC、LPC和GPC的水解活力检测方法则采用碱性磷酸酶-定磷法进行检测。该方法基于这些底物若是被水解将会产生磷酸胆碱，该产物会被碱性磷酸酶所水解产生无机磷，通过钼蓝法对磷进行定量从而可以计算出该酶对相应底物的水解活力。本发明多肽对这些底物的水解能力见下表。

根据上表的检测结果，说明本发明多肽MPPX对于底物具有相对较高的专一性，且基本不水解多种天然底物，此性质对于其在生物检测中的应用非常有利。

实施例10：本发明多肽MPPX在酶联免疫分析中的应用

本实施例采用生物素-亲和素系统将MPPX与抗体链接，而后用于红螯虾卵黄蛋白原的ELISA检测。因此首先需要将MPPX与亲和素两种蛋白进行连接，本实施例采用Suflo-SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)作为交联试剂将这两种蛋白进行链接。因为MPPX蛋白没有含有巯基的氨基酸，因此首先需要进行巯基化然后才能进行交联，具体的操作方式如下所述。

首先将实施例6中所制备的MPPX蛋白制备成10mg/ml浓度的体系为0.1M磷酸盐，0.15M NaCl，pH7.2的溶液。而后加入25μl的浓度为13mg/ml的SATA溶液(SATA购自Thermofisher，货号为26102)至每1ml的MPPX蛋白溶液中。室温反应30min，而后加入100μl的浓度为0.5M的羟胺溶液(0.1M pH7.2的磷酸盐缓冲系统，含有10mM的EDTA)至每毫升的上述所制备的SATA修饰的MPPX溶液中。室温反应2小时后，用脱盐层析柱进行脱盐，缓冲体系为含有10mM EDTA的0.1M pH7.2的磷酸盐缓冲液。

立即将上述制备的巯基化的MPPX与马来酰亚胺活化的中性亲和素(ThermoScientific ^TM，货号31007)按照4:1的摩尔比进行混合。而后在37℃条件下反应60min，最后用分子筛对交联完成的蛋白进行纯化，从而得到MPPX-NeutrAvidin蛋白。

为了进行MPPX用于酶联免疫分析中的应用研究，本发明将MPPX与亲和素交联好的蛋白代替商品化试剂盒中(红螯虾卵黄蛋白原定量试剂盒，上海朗顿生物技术有限公司，货号BPE90023)的亲和素-HRP交联蛋白进行进一步试验。具体操作步骤如下：

取出标准品用标准品稀释液分别稀释成320ng/ml、160ng/ml、80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml和1.25ng/ml。而后将取50μl的这些标准品溶液、50μl的MPPX-NeutrAvidin蛋白加入至样品孔中，每个浓度重复3次。对照孔仅加入不含有标准品的标准品稀释液。而后密封好置于37℃条件下温和的摇晃60min。而后用洗涤液进行洗涤5次并去除残留液体。最后加入100μl的含有8mM浓度的pNPPC以及5mM锰离子的pH7.5的50mM的Tris-HCl溶液至每个孔中，37℃条件下反应15min。反应结束后加入100ul的无水乙醇至每个孔中，而后立即进行405nm波长处的吸光值检测。用样品孔的吸光值减去空白对照孔的吸光值，而后以差值最高的点为100％计算其它点的相对值，结果如图10所示。

本发明的MPPX代替HRP在进行红螯虾卵黄蛋白原检测时，其在1.25ng/ml-10ng/ml的浓度范围内具有很好的线性关系。因此其可以用于红螯虾卵黄蛋白原的酶联免疫分析。

实施例11：MPPX基因作为报告基因的应用

本实施例采用pNPPC为底物来测定MPPX基因(SEQ ID NO:48)作为报告基因的活力大小。本实施例以pNPPC为反应底物，通过MPPX多肽(SEQ ID NO:49)的催化产生亮黄色的对硝基苯酚(pNP)和磷酸胆碱。因为pNP在405-410nm具有强烈的吸收，因此可以直接表征MPPX多肽的活性。酶活力单位的定义及检测(Kurioka S.等，1976)同前。

1、MPPX基因重组工程菌株的构建

(1)MPPX基因的克隆

MPPX基因可以采用PBA-myc载体进行异源表达，见附图11。MPPX基因的核苷酸序列可以采用如SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51所示的序列作为上下游引物进行PCR反应，获得包括Xba I和BamH I限制性内切酶位点的本发明提供的MPPX基因的全长核苷酸序列。将MPPX多肽的全长核苷酸序列和目的蛋白的全长核苷酸序列PCR产物分别进行1％的琼脂糖电泳，切胶使用美国OmegaBio-Tek公司的E.Z.N.ATM胶回收试剂盒进行目标条带的回收。

(2)限制性内切酶双酶切反应

取200ng左右的步骤(1)所获得的核酸，按照下表加入相应酶及缓冲液等。

类别	体积μL
		10×NEB Cutsmart	5
MPPX基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:48)	30
		BamH I	2
Xba I	2
		水	11

类别	体积μL
		10×NEB Cutsmart	5
PBA-myc质粒	30
		BamH I	2
Xba I	2
		水	11

37℃酶切2小时后，用PCR产物回收试剂盒回收酶切产物。

(3)连接转化

按照如下的配方配制连接反应体系为10μl，具体配比如下：

置于22℃条件下连接2小时左右。

取出1支装有100μl DH5α感受态细胞，置于冰上放置30分钟，加入10μl的连接产物，冰浴30分钟，42℃热激90秒后，立即放置于冰浴中1-2分钟后，加入890μl的LB培养基，37℃200rpm摇床进行预培养60分钟，12000rpm离心1分钟，用移液器吸出部分清液，留约100ul清液，充分悬浮沉淀菌体后，取全部液体涂布于相应的含壮观霉素的平板上，37℃培养过夜；取出培养过夜的转化平板，挑选部分菌落进行菌落PCR验证，挑选菌落PCR验证结果为阳性的重组子扩大培养。而后提取重组质粒，该质粒即为构建成功的表达载体PBA-MPPX-DH5a。

(4)MPPX基因重组工程菌株的构建

将构建好的PBA-MPPX-DH5a质粒转化于农杆菌感受态细胞中，转化方法采用热激转化法。取出1支装有100μl农杆菌感受态细胞，置于冰上放置30分钟，加入1ulPBA-MPPX-DH5a质粒，放在冰上冰浴5分钟，然后在液氮中速冻5分钟，立即37℃温浴5分钟，最后加入800ul的LB培养基，28℃150rpm培养2-4小时，离心，收集菌泥，留100ul上清用于重悬菌泥，将菌液涂布在LB加壮观霉素的平板上，28℃培养48小时。同时做空的PBA载体质粒转化农杆菌感受态，作为阴性对照，此菌为PBA-A。

将培养好的菌落，转接并同时做菌落PCR验证，挑选的阳性克隆即为构建成功的重组工程菌PBA-MPPX-A。

2、MPPX基因在烟草中的瞬时表达

按1％的接种量分别将PBA-MPPX-A和阴性对照菌PBA-A接种至发酵摇瓶(250ml规格其装有50ml的含有100μg/ml壮观霉素和100μg/ml链霉素及100μg/ml利福平的液体LB培养基)中，将摇瓶置于28℃条件下，180rpm过夜培养，当OD值达到1.0时，5000g离心5min，收集菌体，用溶液(5ml 10mMMgCl₂，7.5ul 100mM乙酰丁香酮)重悬菌泥至OD600＝1.0，室温静置1小时，备用。

种植本生烟草(Nicotiana benthamiana)25℃光照培养月一个后可用，在注射的前一天将烟草浇水并置于黑暗条件下。

用1ml注射器注射烟草叶片，侵染后的烟草避光培养约24小时后，再光照培养。

3、MPPX报告基因的pNPPC活性的检测

剪下PBA-MPPX-A菌侵染后烟草叶片一片，在液氮中研磨至粉末，加入500ul缓冲液(200mM NaCl的50mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液)，混匀，将叶片粉末和缓冲液一起吸入新的EP管中，4℃、12000rpm离心5分钟，将上清再吸入新的EP管中，即得MPPX报告基因的酶液。未侵染的烟草叶片也同时做液氮碾磨，作为阴性对照。采用pNPPC法测定MPPX的活性，结果是MPPX报告基因在烟草叶片中的pNPPC活性为1.79U/mL。

4、MPPX报告基因的活性电泳

分别取上述MPPX报告基因的酶液和两个阴性对照的叶片液汁80ul和20ul的5×上样缓冲液，混匀，静置5min，即可依据常规的SDS-PAGE方法进行电泳。电泳结束后，电泳样品胶块进行复性操作，用2％Triton X-100和50mM Tris-HCl PH 7.5缓冲液清洗胶块三次，每次15分钟，然后用去离子水清洗胶块，再用50mM Tris-HCl PH 7.5缓冲液清洗胶块三次，每次15分钟，再用去离子水清洗胶块，吸干胶周围的水，最后用枪吸取20mM pNPPC和50mMpH7.5的Tris-HCl液，均匀的浇在胶块上，将胶块放置在37℃培养箱中，2小时后观察结果。活性电泳的结果如图2，从图2中可以看出，PBA-MPPX-A侵染烟草叶片后叶片汁中有pNPPC活性，且这个活性带与MPPX的大小37KD左右是一致的。

实施例12：MMPX融合蛋白的制备

本实施例采用钼兰法检测目的蛋白BCPLC的PC活性。该方法以大豆粉末磷脂PC作为PLC的反应底物，在200uL的反应体系中，含有100uL的1％PC，80uL的Tris-HCl(pH7.5)试剂，和20uL的酶液，该反应在37℃水浴中进行30min。反应后加入200uL的氯仿混匀30s后，12,000rpm 10min进行离心，吸取离心后的上清80uL加到新的EP管中，再加入10uL的Cutsmart，8uL的去离子水，最后加入2uL的CIAP，混匀，反应在37℃水浴中进行30min。30min后，在此管中各加入840uL的去离子水，再加入20uL的10％(w/v)的抗坏血酸，及40uL的2.5％(w/v)钼酸铵溶液。37℃显色10min。取显色后的溶液进行吸光度700nm检测。

1、MPPX多肽(SEQ ID NO:49)和BCPLC多肽(SEQ ID NO:55)融合诱导表达

(1)MPPX多肽的克隆和BCPLC多肽的克隆

MPPX多肽和目的蛋白的融合表达可以采用默克公司的pET 24a载体进行异源表达，见附图13。MPPX多肽的核苷酸序列可以采用如SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57所示的序列作为上下游引物进行PCR反应，获得包括BamH I和Xho I限制性内切酶位点的本发明提供的MPPX多肽的全长核苷酸序列。目的蛋白的核苷酸序列可以采用如SEQ ID NO：58和SEQ IDNO：59所示的序列作为上下游引物进行PCR反应，获得包括Sac I和BamH I限制性内切酶位点的本发明阐述的目的蛋白的全长核苷酸序列。将MPPX多肽的全长核苷酸序列和目的蛋白的全长核苷酸序列PCR产物分别进行1％的琼脂糖电泳，并切胶使用美国OmegaBio-Tek公司的E.Z.N.A^TM胶回收试剂盒进行目标条带的回收。

(2)限制性内切酶双酶切反应

类别	体积μL
		10×NEB Cutsmart	5
MPPX多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO:48)	30
		BamH I	2
Xho I	2
		水	11

类别	体积μL
		10×NEB Cutsmart	5
BCPLC多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO:54)	30
		Sac I	2
BamH I	2
		水	11

类别	体积μL
		10×NEB Cutsmart	5
PET-24a质粒	30
		Sac I	2
Xho I	2
		水	11

37℃酶切2小时后，用PCR产物回收试剂盒回收酶切产物。

(3)连接转化

按照如下的配方配制连接反应体系为10μl，具体配比如下：

置于22℃条件下连接2小时左右。

取出1支装有100μl DH5α感受态细胞，置于冰上放置30分钟，加入10μl的连接产物，冰浴30分钟，42℃热激90秒后，立即放置于冰浴中1-2分钟后，加入890μl的LB培养基，37℃200rpm摇床进行预培养60分钟，12000rpm离心1分钟，用移液器吸出部分清液，留约100ul清液，充分悬浮沉淀菌体后，取全部液体涂布于相应的含卡那霉素的平板上，37℃培养过夜；取出培养过夜的转化平板，挑选部分菌落进行菌落PCR验证，挑选菌落PCR验证结果为阳性的重组子扩大培养。而后提取重组质粒，该质粒即为构建成功的表达载体pET24a-BCPLC-MPPX-DH5a。

(4)MPPX多肽与BCPLC多肽融合表达的重组工程菌株的构建

将构建好的pET24a-BCPLC-MPPX-DH5a质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，转化方法采用热激转化法，方法同上述的DH5α感受态细胞转化的方法。

将过夜培养的筛选平板上的菌落，转接并同时做菌落PCR验证，挑选的阳性克隆即为构建成功的融合蛋白重组工程菌pET24a-BCPLC-MPPX 1-BL21

(5)融合蛋白重组工程菌的诱导表达

将pET24a-BCPLC-MPPX-BL21接种于5ml的含有100μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中(Tryptone 10g/L，酵母浸出物5g/L，NaCl 10g/L)，37℃200rpm过夜培养。

按1％的接种量将长好的液体种子接种至发酵摇瓶(250ml规格其装有50ml的含有100μg/ml卡那霉素的液体LB培养基)中，将摇瓶置于37℃条件下，180rpm培养，当OD值达到0.6-0.8时，在摇瓶中加入IPTG诱导剂，进行诱导表达，诱导剂添加的终浓度为0.2mM。于37℃200rpm的条件下进行诱导表达3小时左右，取下诱导后的表达摇瓶，10000r/min离心2min，收集菌体。

(6)菌体的破碎及SDS-PAGE电泳鉴定

在收集的菌体中加入含有200mM NaCl的50mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液，悬浮菌体后得菌液，在冰浴条件下对菌液进行超声破碎，超声破碎的条件为超声6秒，停4秒，总共超声破碎15分钟。将破碎液进行离心10000rpm离心5min，得到离心上清和沉淀，离心上清即为pET24a-BCPLC-MPPX的酶液。

分别取80ul的离心上清液和沉淀，20ul的5×上样缓冲液，沸水煮5min，即可依据常规的SDS-PAGE方法进行电泳分析，电泳的结果见附图15。

(7)重组融合蛋白的分离纯化

将超声破碎离心所得的上清液约20ml，加入终浓度为10mM的咪唑，再加入约200μL的固定结合有镍离子的亲和介质，混匀，4-8℃静置2小时，离心弃去上清液，收集沉淀相，将沉淀相转入2ml的EP管中，再加入含有50mM咪唑的20mM pH7.5的Tris-HCl缓充液进行洗涤，8000rpm离心1min，弃去上清液，如此反复2-3次，以除去杂蛋白。然后加入含有250mM咪唑的洗脱缓冲液2ml进行洗脱，12000rpm离心2min收集上清液，弃去沉淀，洗脱缓冲液为含有250mM咪唑以及200mM NaCl的50mM pH7.5的Tris-HCl缓充液。最后用10KD的离心超滤管对洗脱液进行超滤置换不含咪唑的缓冲液，该缓冲液的组成为含有200mM NaCl的50mM pH7.5的Tris-HCl缓充液。至此即完成本实施例多肽的纯化，其纯化结果可见附图16。

2、BCPLC多肽重组表达载体的构建及诱导表达

(1)BCPLC多肽的克隆

本实施例提供的目的蛋白可以采用默克公司的pET 24a载体进行异源表达，见附图14。BCPLC多肽的核苷酸序列可以采用如SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61所示的序列作为上下游引物进行PCR反应，获得包括Sac I和Xho I限制性内切酶位点的本发明阐述的BCPLC多肽的全长核苷酸序列。将目的蛋白的全长核苷酸序列PCR产物分别进行1％的琼脂糖电泳，并切胶使用美国OmegaBio-Tek公司的E.Z.N.A^TM胶回收试剂盒进行目标条带的回收。

(2)限制性内切酶双酶切反应和连接转化

类别	体积μL
		10×NEB Cutsmart	5
目的蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO:54)	30
		Sac I	2
Xho I	2
		水	11

类别	体积μL
		10×NEB Cutsmart	5
PET-24a质粒	30
		Sac I	2
Xho I	2
		水	11

37℃酶切2小时后，用PCR产物回收试剂盒回收酶切产物。

按照如下的配方配制连接反应体系为10μl，具体配比如下：

置于22℃条件下连接2小时左右。

取出1支装有100μl DH5α感受态细胞，置于冰上放置30分钟，加入10μl的连接产物，冰浴30分钟，42℃热激90秒后，立即放置于冰浴中1-2分钟后，加入890μl的LB培养基，37℃200rpm摇床进行预培养60分钟，12000rpm离心1分钟，用移液器吸出部分清液，留约100ul清液，充分悬浮沉淀菌体后，取全部液体涂布于相应的含卡那霉素的平板上，37℃培养过夜；取出培养过夜的转化平板，挑选部分菌落进行菌落PCR验证，挑选菌落PCR验证结果为阳性的重组子扩大培养。而后提取重组质粒，该质粒即为构建成功的表达载体pET24a-BCPLC-DH5a。

(4)BCPLC多肽重组工程菌株的构建

将构建好的pET24a-BCPLC-DH5a质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，转化方法采用热激转化法，方法同上述的DH5α感受态细胞转化的方法。

将过夜培养的筛选平板上的菌落，转接并同时做菌落PCR验证，挑选的阳性克隆即为构建成功的重组工程菌pET24a-BCPLC-BL21。

(5)BCPLC多肽重组工程菌株的诱导表达

将pET24a-BCPLC-BL21接种于5ml的含有100μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中(Tryptone 10g/L，酵母浸出物5g/L，NaCl 10g/L)，37℃200rpm过夜培养。

(6)菌体的破碎及SDS-PAGE电泳鉴定

在收集的菌体中加入含有200mM NaCl的50mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液，悬浮菌体后得菌液，在冰浴条件下对菌液进行超声破碎，超声破碎的条件为超声6秒，停4秒，总共超声破碎15分钟。将破碎液进行离心10000rpm离心5min，得到离心上清和沉淀。

(7)BCPLC蛋白的分离纯化

将超声破碎离心所得的上清液约20ml，加入终浓度为10mM的咪唑，再加入约200μl的固定结合有镍离子的亲和介质，混匀，4-8℃静置2小时，离心弃去上清液，收集沉淀相，将沉淀相转入2ml的EP管中，再加入含有50mM咪唑的20mM pH7.5的Tris-HCl缓充液进行洗涤，8000rpm离心1min，弃去上清液，如此反复2-3次，以除去杂蛋白。然后加入含有250mM咪唑的洗脱缓冲液2ml进行洗脱，12000rpm离心2min收集上清液，弃去沉淀，洗脱缓冲液为含有250mM咪唑以及200mM NaCl的50mM pH7.5的Tris-HCl缓充液。最后用10KD的离心超滤管对洗脱液进行超滤置换不含咪唑的缓冲液，该缓冲液的组成为含有200mM NaCl的50mM pH7.5的Tris-HCl缓充液。至此即完成目的蛋白的纯化，其纯化结果可见附图16。

3、融合蛋白BCPLC-MPPX和BCPLC的水解PC的酶学性质比较

(1)BCPLC和融合蛋白BCPLC-MPPX的最适合作用温度

将以上制备获得的融合蛋白BCPLC-MPPX和BCPLC分别进行最适作用温度的测定。

分别在0℃、10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃水浴温度下测定融合蛋白BCPLC-MPPX和BCPLC的PC活性，用钼兰法来测定PC的活力大小，以最高酶活的温度点的酶活作为100％酶活，其它温度点的酶活除以该最高酶活，从而得到该温度点的相对酶活，相对酶活为纵坐标，温度为横坐标，做图，连接平滑曲线，得图17和图18。蛋白BCPLC的PC活性最适作用温度为40℃，融合蛋白BCPLC-MPPX的PC活性最适作用温度为45℃，最适的作用温度增大了5℃，并且BCPLC-MPPX的PC活性在50℃和60℃分别是94％和90％，高于BCPLC的PC活性在在50℃和60℃分别是84％和73％，这些变化，都有利于酶法脱胶。

(2)BCPLC和融合蛋白BCPLC-MPPX的最适作用pH值

用0.1M的醋酸钠和0.1M的醋酸配制pH值分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、6.5缓冲体系；配制0.1M的Tris用HCL调节pH值，配制pH值为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的缓冲体系；配制0.1M的甘氨酸，用氢氧化钠调节pH值，配制pH值为9.0、9.5、10.0和11.0的缓冲体系。分别在pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.和11.0的缓冲体系中测定上述两种酶的PC活性。以最高酶活的PH值缓冲液测定的最高酶活为对照，其它PH值缓冲体系测得的酶活除最高酶活，得相对酶活，以相对酶活为纵坐标，PH值为横坐标做曲线，连平滑线，得图19和20。蛋白BCPLC的PC活性最适作用PH值为6.5，融合蛋白BCPLC-MPPX的PC活性最适作用pH值为7.0，并且融合蛋白BCPLC-MPPX的PC活性作用pH值的范围比蛋白BCPLC的作用范围广，这也是有利于提高酶活脱胶效果的。

(3)BCPLC和融合蛋白BCPLC-MPPX的温度稳定性

取酶液500ul，分装成小份，分别放置于0℃、20℃、45℃和50℃的水浴锅中保温，在保温1小时和2小时后分别从各水浴锅中取出酶液用来测酶活，结果见下表。

BCPLC和融合蛋白BCPLC-MPPX的温度稳定性

	融合蛋白BCPLC-MPPX	目的蛋白BCPLC
			0℃水浴2小时后剩余的酶活	100％	100％
20℃水浴2小时后剩余的酶活	100％	100％
			45℃水浴2小时后剩余的酶活	100％	83％
50℃水浴2小时后剩余的酶活	77％	51％

表中数据显示，BCPLC蛋白的PC活性在0℃、20℃条件下水浴2小时，活性没有下降，而BCPLC-MPPX蛋白的PC活性在0℃、40℃、45℃条件下水浴2小时，活性没有下降，并且BCPLC-MPPX蛋白的PC活性在50℃水浴2小时活性为原来的77％，BCPLC蛋白的PC活性在50℃水浴2小时活性为原来的51％，BCPLC-MPPX蛋白的PC活性在45℃水浴2小时活性为原来的100％，BCPLC蛋白的PC活性在45℃水浴2小时活性为原来的83％，在45℃和50℃，提高了温度的稳定性，有利于提高酶法脱胶的效果。

(4)BCPLC和融合蛋白BCPLC-MPPX的pH稳定性

取酶液500ul，分装成小份，分别加入同等体积的一下各PH值的缓冲液：5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，混匀，在4℃放置过夜，第二天取出酶液，测酶活，结果见图21和22。BCPLC-MPPX蛋白的PC活性在PH值5.5-8.5之间的范围稳定性高于BCPLC蛋白在此范围内的稳定性。

Claims

1.分离的多肽，所述多肽选自SEQ ID NO:21或其N端截短至多10个氨基酸残基和/或C端截短至多26个残基所获得的片段。

2.如权利要求1所述的分离的多肽，其特征在于，所述的片段选自：SEQ ID NO:2、SEQID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:49。

3.一种融合蛋白，所述融合蛋白为：

（1）由权利要求1或2所述的分离的多肽与促进所述该多肽表达、分泌、鉴定和/或纯化的氨基酸序列组成的融合蛋白；或

（2）权利要求1或2所述的分离的多肽与磷脂酶或亲和素的融合蛋白。

4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述磷脂酶是磷脂酶C。

5.如权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述磷脂酶C来自芽孢杆菌属细菌。

6.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述芽孢杆菌属细菌为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。

7.如权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述磷脂酶C的氨基酸序列如SEQ IDNO:55所示。

8.如权利要求3-7中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述分离的多肽经由接头序列与磷脂酶连接。

9.如权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述接头序列为多甘氨酸接头序列。

10.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:53所示。

11.一种多核苷酸，其序列选自：

（a）编码权利要求1-2中任一项所述的分离的多肽或权利要求3-10中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸序列；和

（b）与（a）互补的序列。

12.如权利要求11所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列选自：SEQ IDNO:1、22、26、28、30和48。

13.一种核酸构建物，所述核酸构建物含有权利要求11或12所述的多核苷酸。

14.如权利要求13所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物是表达载体，用于表达所述多核苷酸编码的氨基酸序列。

15.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求14所述的核酸构建物。

16.如权利要求15所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自：大肠杆菌（E. coli）、毕赤酵母(Pichia pastoris)、黑曲霉（Aspergillus niger）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

17.权利要求1-2中任一项所述的分离的多肽、权利要求3-10中任一项所述的融合蛋白、权利要求11或12所述的多核苷酸、权利要求13或14所述的核酸构建物和权利要求15或16所述的宿主细胞在食品工业中的应用；其中，所述食品工业包括油脂制备。

18.如权利要求17所述的应用，其特征在于，所述应用为应用于油脂制备中的脱胶工艺。

19.权利要求11或12所述的多核苷酸作为报告基因在制备用于生物及医学检测的试剂或在医药制备领域中的应用。

20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述生物及医学检测为酶联免疫分析。

21.权利要求11或12所述的多核苷酸作为报告基因在植物基因工程和遗传转化操作中的应用。

22.权利要求1-2中任一项所述的分离的多肽、权利要求3-10中任一项所述的融合蛋白、权利要求11或12所述的多核苷酸、权利要求13或14所述的核酸构建物和权利要求15或16所述的宿主细胞在磷脂改性或饲料改良中的应用。

23.权利要求1-2中任一项所述的分离的多肽、权利要求3-10中任一项所述的融合蛋白、权利要求13或14所述的核酸构建物和权利要求15或16所述的宿主细胞在制备用于生物及医学检测的试剂中的应用。

24.如权利要求23所述的应用，其特征在于，所述生物及医学检测为酶联免疫分析。