CN104560763A - 产磷脂酶c的地衣芽孢杆菌及其产生的磷脂酶c - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种分离的表达磷脂酶C的地衣芽孢杆菌菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？No.7878。利用本发明所提供菌株和制备方法制备所得的磷脂酶C可以用于油脂精炼，脱胶效果良好，可以广泛应用于油脂精炼、添加剂、医药等领域。

Description

产磷脂酶C的地衣芽孢杆菌及其产生的磷脂酶C
技术领域
本发明属于酶脱胶领域，具体说是一种产磷脂酶C的地衣芽孢杆菌及其产生的磷脂酶C。
背景技术
磷脂酶（Phospholipase，PL)是生物体内存在的能水解甘油磷脂的酶，水解产物为各种磷脂酸和氨基醇，如胆胺、胆碱、丝氨酸、乙醇胺等。根据磷脂酶水解甘油磷脂的位点不同，可将磷脂酶分为磷脂酶A(Phospholipase A，PLA)、磷脂酶B(Phospholipase B，PLB)、磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)和磷脂酶D（PhospholipaseD，PLD)，如图1所示。
磷脂酶可广泛应用于油脂精练、磷脂改性、饲料改良剂、食品工业和医药等方面。脱胶是植物油精炼过程中的一个重要环节，对提高油的品质至关重要，脱胶主要是脱除磷脂，脱胶若不彻底，会影响油品的深加工和油品的稳定性，减低油品货架期。酶法脱胶可以克服传统脱胶方法脱胶脱除率低，同时中性油损失高等的问题。而在酶法脱胶工艺中，现有文献多报道磷脂酶PLA用于植物油脱胶。磷脂酶PLA(包括PLA1和PLA2)，脱胶后可产生极性溶血磷脂和极性脂肪酸，PLA脱胶工艺仅仅损失油中总的磷脂分子，来减少精炼损耗。而磷脂酶PLC酶通过选择性水解磷酸酯官能团与磷脂反应，生成甘油二酯（DAG）和磷脂酸基团，甘油二酯不需要被除去，所以PLC脱胶工艺通过保留原始的磷脂分子而仅去除磷酸酯官能团来减少精炼损耗，不存在PLA脱胶工艺中产生的能提高脱胶油酸价的极性脂肪酸的问题，PLC用于脱胶优势明显好于PLA。
磷脂酶C（PLC）可来源于动物和微生物。文献报道磷脂酶C细菌来源的有：粘质沙雷氏菌武汉株(Serratia marcescens wuhan strain)、假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridum perfringens)、诺氏梭状芽孢杆菌(Closrtidium novyi)、双酶梭状芽孢杆菌(clostridium bifermantans)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、类鼻疽伯克氏菌（burkholderia pseudomallei）。磷脂酶C霉菌来源的有：烟曲霉(Aspergillusfumigates)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、自佐氏曲霉菌(Aspergillus saitoi)。磷脂酶C酵母来源的有白色念珠菌(canidia Albicans)。JP50-1017183报道斯谷假单胞菌（Pseudomonas schuylkilliensis）可以产磷脂酶C。JP49-55893报道来源于streptomyces hachijyoensis的磷脂酶C。
磷脂酶C的芽孢杆菌来源相关报道中，蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌来源的PLC的相关文献和专利报道的比较多，并未有来源于地衣芽孢杆菌的磷脂酶C的相关报道。US6284517公开了蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌有磷脂酶C活性。JP55034039报道苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）可以产磷脂酶C。US3909360报道蜡样芽孢杆菌产磷脂酶A和磷脂酶C。
蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌是引起水源和食物等污染的常见菌，蜡样芽孢杆菌可厌氧生长、有运动性、该菌呈长杆状，宽度大于1微米。而有报道的真菌烟曲霉和黄曲霉来源的磷脂酶C，烟曲霉和黄曲霉也是公认的致病菌，无法在食品工业中使用。
地衣芽孢杆菌自身无致病性，而且地衣芽孢杆菌是GRAS（Generally Recognizedas Safe，GRAS是美FDA评价食品添加剂的安全性指标）菌株，地衣芽孢杆菌在饲料中的应用，可直接用作畜禽的复合微生态制剂（CN201010232600.2），也可以用于发酵秸秆饲料（CN201010164201.7），提高饲料的蛋白量。地衣芽孢杆菌是一些重要工业酶制剂的生产菌，地衣芽孢杆菌能够分泌多种酶，其中能够应用到医药领域的酶主要有丝氨酸纤溶性蛋白酶（纳豆激酶）和脂肪酶两种。我国的豆豉纤溶酶和韩国的大豆发酵食品中分离的纤溶酶也都是地衣芽孢杆菌分泌的丝氨酸纤溶性蛋白酶的一种。地衣芽孢杆菌可以发酵生产碱性蛋白酶（CN03144206.4，CN201110220386.3），还可以用于提升白酒酿造的风味（CN201110233172.X）等等，所以，地衣芽孢杆菌更安全可靠。
但目前尚没有发现地衣芽孢杆菌产磷脂酶PLC的报道。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供一种分离的表达磷脂酶C的菌株。
本发明提供的分离的表达磷脂酶C的菌株，命名为WBRD01160，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7878。
本发明还有一个目的在于，提供一种生产磷脂酶C的方法。
本发明提供的生产磷脂酶C的方法包括：培养前述的菌株以使所述菌株或细胞生产磷脂酶C，收获磷脂酶C。
在本发明的一个优选实施例中，所述培养为在适宜所述菌株生长和/或适宜所述菌株表达磷脂酶C的条件下培养所述菌株，优选的，所述培养为在适宜所述菌株生长的条件下培养所述菌株，以增加所述菌株数量，然后再于适宜所述菌株表达磷脂酶C的条件下培养所述菌株，以表达所述磷脂酶C。
在本发明的一个优选实施例中，所述培养为在25-40℃、120-250rpm培养所述菌株6-24h。
在本发明的一个优选实施例中，所述收获包括分离和收集含有分泌或释放到胞外的磷脂酶C的培养物上清液，由此获得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液；优选地，所述方法还包括对所述磷脂酶C酶液进行浓缩。
本发明还有一个目的在于，提供一种磷脂酶C。
本发明提供的磷脂酶C为用前述方法制得。
本发明还有一个目的在于，提供一种磷脂酶C酶液。
本发明提供的磷脂酶C酶液为用前述方法制得。
本发明还有一个目的在于，提供一种脱胶的方法。
本发明提供的脱胶的方法为使用前述的磷脂酶C或磷脂酶C酶液进行脱胶，优选的，所述脱胶为油脂脱胶。
本发明还有一个目的在于，提供前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于脱胶的用途，优选的，所述脱胶为油脂脱胶。
本发明还有一个目的在于，提供前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于磷脂改性、食品添加剂、饲料改良剂和医药工业的用途。
本发明的产磷脂酶C的细菌——地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）WBRD01160及使用该菌株获得的酶液和磷脂酶C可以用于油脂精炼，脱胶效果良好，由于地衣芽孢杆菌是GRAS菌株，因此，可以直接用于食品工业，安全可靠，例如可以安全方便的用于油脂精炼。同样地衣芽孢杆菌来源的磷脂酶C可以安全的用于磷脂改性、食品添加剂、饲料改良剂和医药工业等方面。
附图说明
图1显示磷脂酶A、磷脂酶B、磷脂酶C和磷脂酶D的酶切作用示意图。
图2显示地衣芽孢杆菌WBRD01160磷脂酶C水解磷脂酰胆碱的TLC检测结果，其中泳道1为1,2二油酸甘油酯，泳道2为1,3二油酸甘油酯，泳道3为三油酸甘油酯，泳道4为枯草芽孢杆菌来源粗磷脂酶C酶液水解磷脂酰胆碱后的样品，泳道5为磷脂酰胆碱。
图3显示地衣芽孢杆菌WBRD01160磷脂酶C的最适温度检测结果。
图4显示地衣芽孢杆菌WBRD01160磷脂酶C的最适pH检测结果。
图5显示地衣芽孢杆菌WBRD01160发酵浓缩酶液在不同温度下孵育后酶活检测结果。
图6为地衣芽孢杆菌WBRD01160磷脂酶C的pH稳定性曲线。
图7显示不同金属离子、柠檬酸和EDTA等对地衣芽孢杆菌磷脂酶C活性的影响。
本发明的菌株WBRD01160已于2013年7月4日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）”(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号是CGMCC No.7878，分类命名为：地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
在本发明中，如果没有特别的说明，百分数（％）或者份都指相对于组合物的重量百分数或者重量份。
在本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的含量之和为100％。
在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的份数之和可以为100重量份。
在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。
在本发明中，除非有其他说明，整数数值范围“a-b”表示a到b之间的任意整数组合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围“1-N”表示1、2……N，其中N是整数。
在本发明中，除非有其他说明，“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。
如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。
如果没有特别指出，本发明所述的百分数（包括重量百分数）的基准都是所述组合物的总重量。
本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60－120和80－110的范围，理解为60－110和80－120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1－3、1－4、1－5、2－3、2－4、和2－5。
在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。
在本文中，除非另有说明，各反应都在常温常压下进行。
在本文中，除非另有说明，各个反应步骤可以顺序进行，也可以不按顺序进行。例如，各个反应步骤之间可以包含其他步骤，而且反应步骤之间也可以调换顺序。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。
本发明的发明人从中国新疆艾丁湖土壤样品中筛选获得了一株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）WBRD01160，经检测，该菌株能够生产出具有磷脂酰胆碱（PC）活性的磷脂酶PLC，该磷脂酶C脱胶效果良好。由于地衣芽孢杆菌是GRAS菌株，因此，可以用于食品工业，安全可靠，例如可以安全方便的用于油脂精炼。同样，本发明提供的地衣芽孢杆菌来源的磷脂酶C，还可以安全的用于磷脂改性、食品添加剂、饲料改良剂和医药工业等方面。例如，制备磷脂酶改性磷脂，使磷脂在营养价值、乳化性能以及色、味等方面大为改进和提高，从而大大拓展了磷脂在食品、保健品工业中的应用范围和使用价值；在食品添加剂方面，本发明的磷脂酶C可以用于烘焙，可使面团形成胶状复合体，可以减少淀粉回生，调节和改善面团的稳定性，因此在烘焙行业应用也非常广泛；在医药研究方面，将本发明提供的磷脂酶C作为疫苗，可用于防治各种病原菌的感染，用本发明提供的磷脂酶C开发抗血小板聚集类药物，可治疗或预防心脑血管疾病等，本发明提供的磷脂酶C还可被应用于抗肿瘤药物的研制等。
本发明提供了一种分离的表达磷脂酶C的菌株，命名为WBRD0116001160，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.7878。
本发明提供了一种生产磷脂酶C的方法。
本发明提供的生产磷脂酶C的方法包括：培养前述的菌株CGMCC No.7878以使所述菌株或细胞生产磷脂酶C，收获磷脂酶C。
菌株CGMCC No.7878的培养方法可采用地衣芽孢杆菌的常规培养方法，例如使用LB培养基、YPD培养基或土豆培养基进行培养。
菌株CGMCC No.7878的培养可以在适宜所述菌株生长和/或适宜所述菌株表达磷脂酶C的条件下培养所述菌株，优选的，所述菌株CGMCC No.7878的培养为在适宜所述菌株生长的条件下培养所述菌株，以增加所述菌株数量，然后再于适宜所述菌株表达磷脂酶C的条件下培养所述菌株，以表达所述磷脂酶C。
菌株CGMCC No.7878的培养条件可以但不限于为：于25-40℃、120-250rpm培养，培养时间为6-24h，优选的，培养菌株CGMCC No.7878至对数生长期。
在本发明的一个实施方案中，菌株CGMCC No.7878于25℃，26℃，27℃，28℃，29℃，30℃，31℃，32℃，33℃，34℃，35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，或40℃条件下培养。
在本发明的一个实施方案中，菌株CGMCC No.7878于120rpm，125rpm，130rpm，135rpm，140rpm，145rpm，150rpm，155rpm，160rpm，165rpm，170rpm，175rpm，180rpm，185rpm，190rpm，195rpm，200rpm，205rpm，210rpm，215rpm，220rpm，225rpm，230rpm，235rpm，240rpm，245rpm，或250rpm条件下培养。
在本发明的一个实施方案中，菌株CGMCC No.7878的培养时间为6h，6.5h，7h，7.5h，8h，8.5h，9h，9.5h，10h，10.5h，11h，11.5h，12h，12.5h，13h，13.5h，14h，14.5h，15h，15.5h，16h，16.5h，17h，17.5h，18h，18.5h，19h，19.5h，20h，20.5h，21h，21.5h，22h，22.5h，23h，23.5h，或24h。
菌株CGMCC No.7878可将生产的磷脂酶C分泌到胞外的培养基中。在本发明的一个优选实施例中，所述收获磷脂酶C包括分离和收集含有分泌或释放到胞外的磷脂酶C的培养物上清液，由此获得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液。
实施方式之一中，对本发明的磷脂酶C酶液进行了浓缩，这样可以提高磷脂酶C酶液的磷脂酶C活性。本发明的酶液可以直接使用。可以采用酶工程领域已知的各种方法从本发明的酶液中进一步分离和纯化磷脂酶C，由此获得本发明的磷脂酶C。
本发明还提供了一种磷脂酶C，本发明提供的磷脂酶C为采用前述方法制得。
本发明还提供了一种磷脂酶C酶液，本发明提供的磷脂酶C酶液为用前述方法制得。在本发明的一个优选实施例中，该酶液为含有分泌或释放到胞外的磷脂酶C的培养物上清液。在本发明的另一个优选实施例中，对本发明的磷脂酶C酶液进行了浓缩，这样可以提高磷脂酶C酶液的磷脂酶C活性。
本发明还提供了一种脱胶的方法。
本发明提供的脱胶的方法为使用前述的磷脂酶C或磷脂酶C酶液进行脱胶，由于地衣芽孢杆菌是GRAS菌株，因此，本发明的磷脂酶C或磷脂酶C酶液可用于油脂，特别是可食用油脂的脱胶。
本发明还提供了前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于脱胶的用途，优选的，所述脱胶为油脂，特别是可食用油脂的脱胶。
本发明还有一个目的在于，提供前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于磷脂改性、食品添加剂、饲料改良剂和医药工业的用途。
在本发明的下述实施例中，菌株鉴定方法如下：
16s rDNA鉴定：参考谢永丽等，两株生防芽孢杆菌的分子鉴定及拮抗活性测定，西北农业学报，2012,(8):32-37；
生理生化鉴定：参考东秀珠等，常见细菌系统鉴定手册，北京：科学出版社，2001:pp353-398。
在本发明的下述实施例中，
地衣芽孢杆菌磷脂酶C的活力测定方法，采用pNPPC法，具体参考MichaelBirch,et.al.Evidence of Multiple Extracellular Phospholipase Activities of Aspergillusfumigates[J].INFECTION AND IMMUNITY,Mar.1996,p.751–755。
TLC检测方法如下：
缓冲液：0.25M Tris-HCL PH值7.5，磷脂酰胆碱：4%，发酵后经离心和浓缩的粗酶液，反应体系：共2.5ml，分别是缓冲液0.5ml，底物1.5ml，酶液0.5ml。37℃水浴180rpm，反应24小时时取样1ml，等体积加入正己烷萃取，振荡混匀，12000rpm离心2分钟，取出上层正己烷部分，再等体积加入正己烷，重复两次萃取，收集两次的萃取液，开盖，置于通风橱中挥发正己烷至干。每管中加15ul异丙醇，充份溶解。取5ul点薄层板。
在本发明的下述实施例中，使用的毛油为大豆粗榨毛油，参考刘玉兰.油脂制取与加工工艺学[M].科学出版，2003，496-499.中的方法制备，所制备的毛油中：
磷含量检测方法：参考文献GB/T5537。
在本发明的下述实施例中，使用的培养基配方如下：
卵磷脂平板：A：硫酸铵0.1％，酵母提取粉0.5%，蛋白胨0.5%，K2HPO40.1％，KC10.5％，七水硫酸镁0.05％，硫酸锌0.05%，无水氯化钙0.05%，琼脂1.8%，pH自然。
B:卵磷脂混合物3g/45ml115℃15min灭菌。
灭菌后，A110ml和B90ml混合倒平板。
LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%，pH7.0。
LB培养基平板：在LB培养基中加入琼脂1.5%。
发酵培养基组成：蔗糖0.5%、蛋白胨0.5%、酵母浸出粉1%、牛肉膏0.5%，玉米浆膏0.5%，K2HPO40.05%、MgSO4·7H2O0.05%、CaCl20.05%，硫酸锌0.05%，pH7.0。
实施例
实施例1、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)WBRD01160的分离筛选及鉴定
取采自于中国新疆艾丁湖土壤样品10g，置于100mL含1.0%Tween80的无菌水中。充分振荡30min后，无菌状态下用滤纸滤除大颗粒不溶杂质，收集滤出液。
将滤出液分别稀释101、102、103、104倍，并将各个稀释度的样品涂布于卵磷脂平板上，于28℃培养。
每24h观察卵磷脂平板上是否有乳白色沉淀圈出现。培养48-72小时后挑取乳白色沉淀比较明显的菌进行进一步的划线分离以获得纯种菌株，结果发现有一株乳白色沉淀十分显著的菌株，命名为WBRD01160。
将WBRD01160进行16S rDNA和生理生化指标的鉴定。
16s rDNA测序结果显示，WBRD01160的16s rDNA序列如SEQ ID NO:1所示，进行比对后发现该菌与Bacillus licheniformis ATCC14580（GENBANK号NR074923.1）、Bacillus licheniformis NBRC12195(GENBANK号AB680251.1)的16srDNA的同源性达到99.8%以上。
将菌株WBRD01160在LB培养基平板上划线接种，28℃培养48h后，观察其生长情况。
结果显示：菌株WBRD01160呈淡黄色，粘性，菌落形态不规则，菌落牢牢固定在培养基上，不易挑起。该菌呈杆状，长度在0.7-3.0μm，宽度在0.3-0.7μm。该菌为革兰氏阳性细菌，经生理生化鉴定，能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸，能水解明胶和淀粉，还原硝酸盐，不形成吲哚，芽孢0.6～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏。
根据以上结果，筛选获得的菌株WBRD01160符合地衣芽孢杆菌的特征，鉴定为地衣芽孢杆菌（参考Vos P.D.等.Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology.Second Edition Volume3The Firmicutes.2009,Athens,USA）。
该菌株已于2013年7月11日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）”(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号是CGMCC No.7878，分类命名为：地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）。
实施例2、地衣芽孢杆菌磷脂酶C的制备
将地衣芽孢杆菌WBRD01160，接种至30ml种子培养基（LB培养基）中，于28℃、180rpm，培养24h。
液体种子培养好后，以1%的接种量接种至30ml发酵培养基中，以28℃、180rpm的条件培养24h。
将发酵培养液于1200rpm离心10分钟，收集获得离心上清液约45ml。
按厂商提供的方法，采用3-30kDa的膜(Omega，美国PALL公司)对离心上清液进行超滤浓缩，再用超纯水清洗两次，获得浓缩酶液约5ml。
使用所获得的浓缩酶液水解磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine，PC），其中，酶液用量为0.5ml，pH值7.5的Tris-HCL缓冲液0.5ml，4%磷脂酰胆碱1.5ml，37℃水浴150rpm反应24小时，取样1ml，加入等体积1ml正己烷萃取，振荡混匀，12000rpm离心2分钟，取上层正己烷萃取液，向沉淀及水相中加入1ml己烷萃取，收集合并两次的萃取液，置于通风橱中挥发正己烷至干。每管中加15UL异丙醇，充份溶解。取5ul点薄层板，TLC检测结果见图2，根据图2结果，水解产物中出现甘油二酯，因此该酶为磷脂酶C。
分别检测离心上清液和浓缩酶液的磷脂酶C活力，结果显示，离心上清液的磷脂酶C酶活约为0.018units/ml，浓缩酶液的地衣芽孢杆菌磷脂酶C活力约为0.122units/ml。
实施例3：地衣芽孢杆菌WBRD01160产磷脂酶C的酶学性质
3.1、地衣芽孢杆菌WBRD01160磷脂酶C的最适温度
分别在10℃、25℃、37℃、45℃、50℃、54℃、59℃、65℃、70℃、75℃和80℃水浴温度下测定实施例2浓缩制备所得的地衣芽孢杆菌磷脂酶C的酶活。
以最高PLC酶活的温度点的PLC酶活作为100%酶活，其它温度点的PLC酶活除以该最高酶活，从而得到该温度点的相对酶活，以相对酶活为纵坐标，温度点为横坐标，以平滑曲线依次连接各温度点的相对酶活，将这些相对酶活以平滑曲线连接，结果见图3。
图3结果显示，WBRD01160发酵粗酶液PLC酶活最适温度为70℃，在65-75℃之间PLC酶活都相对较高。
3.2、地衣芽孢杆菌WBRD01160磷脂酶C的最适pH值
配制pH值分别为3.0、4.0、5.0和6.0的0.1M的乙酸-乙酸钠缓冲液；配制pH值为7.0、8.0、和8.5的0.1M的Tris-HCl缓冲液；配制pH值为9.0、9.5和10.0的0.1M浓度的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液；配制0.1M的pH11.0的磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液。
分别在pH值为3.0、4.0，5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、9.5、10.0和11.0的300ul缓冲体系中，加入10ul的实施例2制备的浓缩酶液，在50℃水浴锅中温浴15分钟后，测定酶活。
以最高PLC酶活的pH的PLC酶活作为100%酶活，其它pH的PLC酶活除以该最高酶活，从而得到该pH的相对酶活，以相对酶活为纵坐标，pH值为横坐标，以平滑曲线依次连接各pH的相对酶活，结果见图4。
图4结果显示，WBRD01160发酵粗酶液PLC酶活最适pH值为9.5。
3.3、地衣芽孢杆菌磷脂酶C的温度稳定性
将实施例2浓缩制备所得的磷脂酶C酶液取500ul分装成小份，分别放置于40℃、45℃、55℃、60℃和70℃的水浴锅中保温，在保温0.5小时，1小时和2小时后分别从各水浴锅中取出酶液，检测酶活。
以最高PLC酶活的温度点的PLC酶活作为100%酶活，其它温度测得的PLC酶活除以该最高酶活，从而得到其相对酶活，以相对酶活为纵坐标，反应时间为横坐标，以平滑曲线依次连接每一温度下各时间点的相对酶活，获得不同温度下孵育时间与酶活的曲线，结果见图5。
根据图5结果，WBRD01160的PLC活性在低于60℃水浴中静置两个小时后，其活力几乎没有变化。在60℃水浴中静置1小时，PLC酶活力变化很小，2h后仍然具有70%以上的活力。而在70℃水浴中静置0.5小时，PLC酶活则迅速下降到原活力的30%以下，2小时候则几乎完全失去酶活力。
3.4地衣芽孢杆菌磷脂酶C在不同pH环境的稳定性
将实施例2中浓缩制备的磷脂酶C酶液与0.5倍体积的不同pH值（其中，pH9.0时使用的是Gly-NaOH）的0.1M缓冲液进行混合后，于4℃放置7h，测定酶活。
以实施例2中浓缩制备的磷脂酶C的酶活力值为100%，计算各个pH值时的酶活力相对值，结果见图6。
由图6可以看出，本发明制备所得的PLC在pH3-10的范围内均比较稳定，pH10时仍具有95%的活力。
3.5、金属离子对地衣芽孢杆菌磷脂酶C活性的影响
分别配制250mM的金属离子（钴离子、锰离子、锌离子、镁离子、钙离子、铜离子、镍离子和铁离子）、柠檬酸钠盐及EDTA母液，分别以2.5mM和5.0mM的量加入至反应体系中，并检测PLC的酶活。以不添加离子和EDTA的样品的酶活为100%，计算相对酶活，结果见图7。
根据图7结果，2.5mM的锰离子、钴离子、铁离子以及5mM的钙离子、镁离子、钴离子及锰离子都对WBRD01160来源的胞外PLC有不同程度的激活作用，而锌离子、铜离子、柠檬酸根离子以及高浓度的铁离子、EDTA都对WBRD01160来源的胞外PLC有不同程度的抑制作用。
根据上述实验结果，本发明所制备的地衣芽孢杆菌来源的胞外磷脂酶C的最适合反应温度为70℃，在65-75℃之间PLC酶活都相对较高。该酶的最适合作用的pH为9.5。该酶在低于60℃水浴中静置两个小时后，其活力几乎没有变化。在60℃水浴中静置1小时，PLC酶活力变化很小，2h后仍然具有70%以上的活力。而在70℃水浴中静置0.5小时，PLC酶活则迅速下降到原活力的30%以下，2小时后则几乎完全失去酶活力。本发明制备所得的PLC在pH3-10的范围内均比较稳定，pH10时仍具有95%的活力。另外，2.5mM的锰离子、钴离子、铁离子以及5mM的钙离子、镁离子、钴离子及锰离子都对WBRD01160来源的胞外PLC有不同程度的激活作用，而锌离子、铜离子、柠檬酸根离子以及高浓度的铁离子、EDTA都对WBRD01160来源的胞外PLC有不同程度的抑制作用。
实施例4：超纯水脱胶
毛油中的含磷量321ppm。
将200g大豆毛油在搅拌下加热至70-80℃，添加6g超纯水，将油水混合物剪切1分钟，在70-75℃温度下，在磁力搅拌器上160rpm搅拌30分钟，然后于1200rpm离心10分钟该水处理的油，收集分离的油和湿胶，脱胶油中的残留磷为110.10ppm。
实施例5：PLC（来源于DSM）酶法脱胶
将200g大豆毛油在搅拌下加热至70-80℃，添加0.16g的45%柠檬酸溶液，将混合物剪切1分钟，在70-75℃温度下，用磁力搅拌器搅拌30分钟，冷却该油，直至油温为55-65℃，然后添加0.5g8%氢氧化钠溶液，将混合物剪切混合30秒，将温度维持在50-55℃，添加超纯水5.30g和19个单位酶活的PLC酶液，然后混合剪切1分钟，在温度为50-55℃下，搅拌反应5小时，然后离心该PLC处理的油，收集分离的油和湿胶，脱胶油中的残留磷为11.52ppm。
实施例6：地衣芽孢杆菌WBRD01160磷脂酶C的酶法脱胶
用实施例2浓缩制备所得的地衣芽孢杆菌磷脂酶C进行酶法脱胶：将200g大豆毛油在搅拌下加热至70-80℃，添加0.16g的45%柠檬酸溶液，将混合物剪切1分钟，在70-75℃温度下，用磁力搅拌器搅拌30分钟，冷却该油，直至油温为55-65℃，然后添加0.5g8%氢氧化钠溶液，将混合物剪切混合30秒，将温度维持在50-55℃，添加5.7个单位酶活的浓缩磷脂酶C酶液，然后混合剪切1分钟，在温度为50-55℃下，搅拌反应5小时，然后离心该酶处理的油，收集分离的油和湿胶，脱胶油中的残留磷为18.71ppm。
实施例4-6的结果显示，200g植物油中添加5.7U单位的PLC，最后脱胶植物油中无机磷含量为18.71ppm，说明地衣芽孢杆菌来源的粗酶PLC具有脱胶效果，而商品PLC(DSM-PLC)在200g植物油中添加19U单位，最后植物油中的无机磷含量为11.52ppm，两者相当，但均明显强于水的脱胶效果。
根据上述结果，本发明提供的地衣芽孢杆菌WBRD01160在适宜的发酵条件下可以产生一定量的磷脂酶C，在200克大豆毛油中添加5.7酶活单位的磷脂酶C粗酶液，可以达到比较好的脱胶效果，由于地衣芽孢杆菌是GRAS菌株，因此，可以用于食品工业，安全可靠，例如可以安全方便的用于油脂精炼。同样地衣芽孢杆菌来源的磷脂酶C可以安全的用于磷脂改性、食品添加剂、饲料改良剂和医药工业等方面。磷脂酶改性磷脂，使磷脂在营养价值、乳化性能以及色、味等方面大为改进和提高，从而大大拓展了磷脂在食品、保健品工业中的应用范围和使用价值。在食品添加剂方面，磷脂酶可以用于烘焙，磷脂酶可使面团形成胶状复合体，可以减少淀粉回生，调节和改善面团的稳定性。因此在烘焙行业应用也非常广泛。在医药研究方面，将微生物磷脂酶作为疫苗，用于防治各种病原菌的感染；用磷脂酶开发抗血小板聚集类药物，治疗或预防心脑血管疾病等，如PLC被应用于抗肿瘤药物的研制等。

Claims (10)

1.一种分离的表达磷脂酶C的菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7878。
2.一种生产磷脂酶C的方法，包括：培养权利要求1所述的菌株以使所述菌株或细胞生产磷脂酶C，收获磷脂酶C。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养为在适宜所述菌株生长和/或适宜所述菌株表达磷脂酶C的条件下培养所述菌株，优选的，所述培养为在适宜所述菌株生长的条件下培养所述菌株，以增加所述菌株数量，然后再于适宜所述菌株表达磷脂酶C的条件下培养所述菌株，以表达所述磷脂酶C。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养为在25-40℃、120-250rpm培养所述菌株6-24h。
5.如权利要求2-4中任一项所述的方法，所述收获包括分离和收集含有分泌或释放到胞外的磷脂酶C的培养物上清液，由此获得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液；优选地，所述方法还包括对所述磷脂酶C酶液进行浓缩。
6.一种磷脂酶C，用权利要求2-5中任一项所述方法制得。
7.一种磷脂酶C酶液，用权利要求5所述方法制得。
8.一种脱胶的方法，使用权利要求6的磷脂酶C或权利要求7的磷脂酶C酶液进行脱胶，优选的，所述脱胶为油脂脱胶。
9.权利要求1所述的菌株或权利要求6的磷脂酶C或权利要求7的磷脂酶C酶液用于脱胶的用途，优选的，所述脱胶为油脂脱胶。
10.权利要求1所述的菌株或权利要求6的磷脂酶C或权利要求7的磷脂酶C酶液用于磷脂改性、食品添加剂、饲料改良剂和医药工业的用途。
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