CN102226172B - 基于自聚集短肽诱导的酶聚集体的蛋白质纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于自聚集短肽诱导的酶聚集体的蛋白质纯化方法，其是将目的蛋白、含可切割位点的肽段(优选为内含肽)以及具有自聚集功能的短肽按从左至右或从右之左的顺序融合表达为三联体，在表达过程中形成酶聚集体，可通过离心或过滤方法与细胞裂解液中大部分可溶杂质分离；之后通过诱导可切割位点处的切割将目的蛋白从聚集体释放到溶液中，从而达到纯化目的。该方法具有成本低，流程简单的特点，可用于实验室规模的高通量蛋白纯化，也有利于工业规模的蛋白生产。
Description
技术领域
本发明涉及重组蛋白的表达及纯化，具体地说，涉及一种基于自聚集短肽诱导的酶聚集体的蛋白质纯化方法。
背景技术
重组蛋白的生产，无论在工业领域还是实验室规模都十分重要，而重组蛋白的分离与纯化成本约占其全部成本的60％-80％(陈浩，陈于红，朱德煦，刘建宁，重组蛋白纯化技术，中国生物工程杂志，2002，22(5)：p.87-92.)。重组蛋白的纯化可以分为样品制备、捕获、中度纯化和精细纯化等4步，其中中度纯化可以达到适中的样品纯度，其处理后的蛋白样品可以被用于多种实验分析目的如N端序列分析、抗原抗体反应等。目前可以实现蛋白质中度纯化的方法包括传统的离子交换层析、疏水性相互作用层析、亲和层析，以及近期的研究热点如自切割自聚集功能的融合标签表达等。离子交换层析和疏水性相互作用层析由于对样品起始条件有一定的要求，通用性和效率不及亲和层析。亲和纯化通常可以获得超过90％的高收率，使其成为目前最常用的重组蛋白中度纯化方法之一。实验室中常用的亲和纯化技术包括多组氨酸标签(his-tag)或谷胱甘肽转移酶标签(GST-tag)与目的蛋白的融合表达，为不同目的蛋白的生产提供了通用的纯化手段(Arnau，J.，C.Lauritzen等，Current strategies for the use of affinity tags and tagremoval for the purification of recombinant proteins.Protein Expressionand Purification，2006.48(1)：p.1-13.)。然而昂贵纯化柱的使用和为了移除融合表达标签而需要蛋白酶的加入，这两个主要缺点使亲和纯化成本较高，不利于工业领域的应用。
设计具有自聚集自切割功能的融合标签以克服上述缺点。来自典型性猪瘟病毒(CSFV)N-端的具有蛋白酶活性且有强烈的形成不可溶聚集体趋势的Npro，就具备了将聚集纯化和蛋白质剪切集于一身的特点。但是利用Npro方法需要对目的蛋白进行复性和进一步的精细纯化来去除产物中的Npro融合片段(Achmuller，C.，W.Kaar等，N-profusion technology to produce proteins with authentic N termini in E-coli.Nature Methods，2007.4：p.1037-1043.)。将具有诱导聚集功能的类弹性蛋白(Elastin-Like Polypeptide，ELP)与具有自切割功能的内含肽(Intein)结合，构建出的新融合标签可以产生与Npro相似的功效。与这一标签融合表达的蛋白可以通过控制温度或盐度，在分离后的溶液和沉淀之间不断转换，从而达到纯化目的(Meyer，D.E.and A.Chilkoti.，Purification of recombinant proteins by fusion withthermally-responsive polypeptides.Nature Biotechnology，1999.17(11)：p.1112-1115.；Banki，M.R.，L.A.Feng等，Simple bioseparations usingself-cleaving elastin-like polypeptide tags.Nature Methods，2005.2(9)：p.659-661.；Ge，X.，D.S.C.Yang，等，Self-cleavable stimulus responsivetags for protein purification without chromatography.Journal of theAmerican Chemical Society，2005.127(32)：p.11228-11229.)。但是反复进行的温度或盐度调节，有可能影响纯化蛋白活性，并且多步操作不利于简化工艺流程。
发明内容
本发明的目的是克服现有蛋白纯化技术中成本高、使用蛋白酶、操作步骤较多等不足，提供一种具有自聚集自切割功能的融合标签，以及利用该融合标签进行重组蛋白快速纯化的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供一种基于自聚集短肽诱导的酶聚集体的蛋白质纯化方法，1)将目的蛋白、含可切割位点的肽段和自聚集短肽的融合蛋白融合表达，所述的融合蛋白的连接顺序为目的蛋白-含可切割位点的肽段-自聚集短肽或自聚集短肽-含可切割位点的肽段-目的蛋白；
2)将表达上述融合蛋白的宿主细胞破碎后，离心和/或过滤获得沉淀，然后利用与可切割位点对应的切割方式，诱导切割位点断裂释放可溶目的蛋白，最后进行离心和/或过滤，得上清。
前述的蛋白质纯化方法，步骤1)中所述自聚集短肽具有SEQ IDNo：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5或SEQ ID No：6所示的氨基酸序列(含Linker)。
前述的蛋白质纯化方法，步骤1)中所述的与可切割位点对应的切割方式为具有自切割功能的内含肽的自切割、酶法或化学法等，优选为具有自切割功能的内含肽的自切割。所述内含肽如Ssp DnaB或Mxe GyrA，优选为Mxe GyrA内含肽。
前述的蛋白质纯化方法，步骤2)中所述宿主细胞为原核微生物或真菌，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母等。
本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。
将具有诱导聚集功能的短肽与有自切割功能的内含肽以及目的纯化蛋白按从左到右或从右到左两种顺序融合表达。诱导聚集功能的短肽会使融合蛋白三联体在微生物胞内表达时形成不可溶的聚集体体，可以利用简单的离心或过滤手段使融合蛋白三联体与细菌裂解液中的杂质成分分离。内含肽是一段具有蛋白酶活性的特殊序列多肽，在诱导其蛋白酶活性产生后可以在设计位点的特定氨基酸残基切割，从而释放可溶的目的蛋白到溶液中。大部分融合蛋白三联体可以在表达时以酶聚集体形式表达，在离心分离细胞破碎液后，可以在沉淀中大量获得。之后通过更换缓冲液诱导内含肽剪切相应的识别位点，从而将目的蛋白释放到溶液里，而内含肽-自聚集短肽部分仍然在沉淀之中。最后利用简单的离心或过滤分离溶液和不溶物，从而在溶液中获得较高纯度的目的蛋白。具体地，包括以下步骤：
1)通过聚合酶链式反应(PCR)、限制性酶切和粘性末端连接技术，构建表达三联体融合蛋白的基因序列，并将其连接入含有抗性基因的表达载体中，将所述表达载体导入宿主中，培养宿主并诱导表达，得到所述融合蛋白三联体。
2)将表达融合蛋白三联体的宿主菌液破碎，之后利用离心的方法分离沉淀和上清，其中融合蛋白三联体在沉淀中。洗涤后利用内含肽对应的切割缓冲液重悬融合蛋白三联体，保持一定温度并在一定时间后离心分离缓冲液和沉淀，目的蛋白即存在于缓冲液中。
其中，步骤1)中所述宿主可为大肠杆菌(Escherichia coli)，所述含有抗性基因的表达载体为可在上述宿主中表达的载体，如pET-30a(+)。所述融合蛋白三联体中有诱导聚集功能的短肽序列可为下述氨基酸序列之一：
a.SEQ ID No：3；
b.SEQ ID No：4；
c.SEQ ID No：5；
d.SEQ ID No：6。
步骤2)中所述内含肽可以是Ssp DnaB或Mxe GyrA等，优选为MxeGyrA，对应的切割缓冲液优选为20mM Tris-HCl(pH 8.0)，500mMNaCl，40mM二硫苏糖醇(DTT)，1mM EDTA；步骤2)中所述切割时间和温度分别为3-24h和4℃-20℃，优选为24小时和4℃。
本发明还提供含有目的蛋白、含可切割位点的肽段和自聚集短肽的融合蛋白，其连接顺序为目的蛋白-含可切割位点的肽段-自聚集短肽或自聚集短肽-含可切割位点的肽段-目的蛋白。
优选地，所述的自聚集短肽，其具有SEQ ID No：1或SEQ ID No：2所示的氨基酸序列，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
本发明还提供上述融合蛋白表达形成的酶聚集体。
本发明还提供编码上述自融合蛋白基因。
本发明提供了2条短肽链，ELK16(SEQ ID No：1)和18A(SEQID No：2)，它们分别与目的蛋白进行融合表达可以诱导融合蛋白形成高活性聚集体，表明其融合表达对蛋白质结构影响较小。将短肽与含可切割位点的肽段(优选为内含肽)和目的蛋白按从左到右或从右到左的顺序融合表达成三联体，可以实现对目的蛋白的快速纯化。
本发明提供的重组蛋白纯化方法，无需使用昂贵的亲和柱和蛋白酶，操作步骤简单易行，即可获得较高纯度的重组蛋白。可大幅度降低蛋白质纯化的成本，一方面可用于实验室规模的高通量蛋白纯化，另一方面由于其较高的经济性，克服了工业领域应用的瓶颈。
附图说明
图1为融合蛋白三联体结构示意图，从左至右分别为目的蛋白、含可切割位点的肽段(采用优选的内含肽)和自聚集短肽。
图2为融合蛋白三联体表达、切割及纯化的流程示意图。
图3A-图3C为自聚集短肽ELK16在融合蛋白C末端(SEQ ID No：3)表达，分别以枯草芽胞杆菌脂肪酶A、烟曲霉amadoriase II、短小芽孢杆菌木糖苷酶为例的纯化实验结果；4条道从左到右分别是融合蛋白三联体表达菌株裂解液沉淀部分、过夜切割后的沉淀部分、过夜切割后的缓冲液部分、蛋白Marker。
图4A-图4C为自聚集短肽18A在融合蛋白C末端(SEQ ID No：4)表达，分别以枯草芽胞杆菌脂肪酶A、烟曲霉amadoriase II、短小芽孢杆菌木糖苷酶为例的纯化实验结果；4条道从左到右分别是融合蛋白三联体表达菌株裂解液沉淀部分、过夜切割后的沉淀部分、过夜切割后的缓冲液部分、蛋白Marker。从过夜切割后的缓冲液部分可以得知，18A诱导的聚集体在切割后的内含肽-自聚集短肽融合蛋白会部分溶解，但其与目的蛋白条带总计纯度扔超过90％，可利用后续精制纯化分离出目的蛋白。
图5为自聚集短肽18A在融合蛋白N末端(SEQ ID No：6)表达，以枯草芽胞杆菌脂肪酶A为例的纯化实验结果；4条道从左到右分别是融合蛋白三联体表达菌株裂解液沉淀部分、过夜切割后的沉淀部分、过夜切割后的缓冲液部分、蛋白Marker。从SDS-PAGE上可看出融合蛋白三联体采用Ssp DnaB时，内含肽诱导自切割量很少。因此优选Mxe GyrA内含肽构建融合蛋白三联体。
图6为质粒pET-30a(+)-LipA-ELK16和pET-30a(+)-LipA-18A的结构。
图7为质粒pET-30a(+)-LipA-Mxe-ELK16和pET-30a(+)-LipA-Mxe-18A的结构。
图8为质粒pET-30a(+)-AMA-ELK16的结构。
图9为质粒pET-30a(+)-XynB-ELK16的结构。
图10为质粒pET-30a(+)-18A-LipA的结构。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。所用引物均由大连宝生物(TakaRa)或英俊生物(Invitrogen)合成。
实施例1以野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A(LipA)作为目的蛋白(融合在N末端)的三联体融合蛋白表达及其纯化
菌株：Escherichia coli BL21(DE3)
载体：pET-30a(+)
培养基：LB/Kanr，每升培养基含有胰蛋白胨10.0g，酵母浸膏粉5.0g，NaCl 10.0g，若为固体培养基，则每升培养基添加琼脂15.0g，pH7.0，50μg/ml卡那霉素(Kanamycine)。
1、构建三联体融合蛋白表达载体pET-30a(+)-LipA-Mxe-ELK16和pET-30a(+)-LipA-Mxe-18A
使用Tiangen公司的高纯度质粒小提试剂盒提取pET-30a(+)-LipA-ELK16质粒(ELK16在C末端与LipA融合，质粒结构如图6所示。其构建方法为选择商用质粒Novogen公司的pET-30a(+)质粒，用在线工具DNAworks设计Linker和ELK16核苷酸序列，利用重叠PCR的方法将来自枯草芽孢杆菌脂肪酶A的LipA基因和带Linker的ELK16基因按LipA基因在N端的顺序合成出来，再将此段基因插入pET-30a(+)质粒的NdeI和XhoI位点间，形成pET-30a(+)-LipA-ELK16质粒)、pET-30a(+)-LipA-18A质粒(18A在C末端与LipA融合，质粒结构如图6所示，其构建方法为选择商用质粒Novogen公司的pET-30a(+)质粒，用在线工具DNAworks设计Linker和18A核苷酸序列，利用重叠PCR的方法将来自枯草芽孢杆菌脂肪酶A的LipA基因和带Linker的18A基因按LipA基因在N端的顺序合成出来，再将此段基因插入pET-30a(+)质粒的NdeI和XhoI位点间，形成pET-30a(+)-LipA-18A质粒)和New England Biolab(NEB)公司的pTWIN1质粒，利用如下两套正向引物和反向引物，按照常规方法进行PCR扩增两个基因片段，分别是LipA基因片段和Mxe GyrA内含肽基因片段：
第一套上游引物5′-GCGATACATATGCACCATCACCATCA-3′(带下划线碱基为限制性内切酶Nde I识别位点)和下游引物5’-GCATCTCCCGTGATGCACATTCGCATATTCGTATTCTGGCCCC-3’，第二套上游引物5’-GGGGCCAGAATACGAATATGCGAATGTGCATCACGGGAGAT-3’和下游引物5’-ATTTTAAAGCTTAGCGTGGCTGACGAACCCGTTC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Hind III识别位点)。
PCR反应使用Tiangen公司的pfu聚合酶，PCR反应条件为：先94℃2min；然后94℃1min，57℃1min，72℃40sec，共30个循环，；最后72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出2条正确大小的条带，与预期结果相符。之后将两个片段进行凝胶分离回收，在以两个片段作为模板，进行重叠PCR反应：先在不加入引物的情况下94℃2min；然后94℃1min，70℃1min，72℃80sec，共10个循环；最后72℃10min。再进行94℃2min；然后加入引物5′-GCGATACATATGCACCATCACCATCA-3′和5’-ATTTTAAAGCTTAGCGTGGCTGACGAACCCGTTC-3’，PCR程序94℃1min，57℃1min，72℃40sec，共17个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出与预期相符的正确条带。将重叠PCR产物用限制性内切酶Nde I和Hind III进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pET-30a(+)-LipA-ELK16和pET-30a(+)-LipA-18A分别进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所克隆的LipA基因序列正确(SEQ ID No：7)。
2、融合蛋白三联体LipA-Mxe-ELK16和LipA-Mxe-18A的表达与切割纯化
将构建好的菌株接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，加入0.2mM IPTG，在30℃下诱导6小时，收获细胞，取10OD细胞用1ml裂解缓冲液重悬，破壁，离心分离上清和沉淀。将沉淀用裂解缓冲液洗涤2次后，使用切割缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 8.0)，500mM NaCl，40mM二硫苏糖醇，1mM EDTA)重悬充分，置于4℃过夜24h。之后将悬浊液离心分离，得到的上清和沉淀与切割前的沉淀一起进行SDS-PAGE检测(结果如图3A和图4A所示，分别为泳道1：切割前的细胞裂解物沉淀，可检测到清晰的融合蛋白三联体表达成的酶聚集体；泳道2：切割后分离的沉淀；泳道3：切割后分离的上清，可检测到清晰的目的蛋白条带；泳道4：标准蛋白分子量Marker)和LipA的脂肪酶酶活性测定。
其中，脂肪酶活性的定量测定方法如下：
测定LipA对棕榈酸对硝基苯脂(p-nitrophenyl palmitate，pNPP)的活性。对pNPP测量方法详见文献(Winkler，U.K.，M.Stuckmann，Glycogen，Hyaluronate，and Some Other Polysaccharides GreatlyEnhance the Formation of Exolipase by Serratia marcescens，JOURNALOF BACTERIOLOGY，1979，138(3)：663-670)。活性定义为：在测定条件下，1分钟内水解上述底物产生1nmol的对硝基苯酚(p-nitrophenol)或是脂肪酸(fatty acid)所需要的酶量定义为1个活性单位。
对SDS-PAGE结果应用Bio-Rad的Quantity One软件检测，利用不同浓度的BSA标准品制成的标准曲线估算对应条带的浓度，从而计算出纯化的LipA浓度、比活力、切割效率、质量回收率(切割后上清目的蛋白质量/切割前沉淀中目的蛋白理论总质量)。对于自聚集短肽ELK16构建的体系分别为99±8μg/ml、133.4±2.0U/mg、(73±1)％和(59±4)％；对于自聚集短肽18A构建的体系分别为145±4μg/ml、72.8±3.9U/mg、(78±2)％和(68±7)％。
实施例2烟曲霉Amadoriase II(AMA)作为目的蛋白(融合在N末端)的三联体融合蛋白表达及其纯化。
菌株：Escherichia coli BL21(DE3)
载体：pET-30a(+)
培养基：LB/Kanr，每升培养基含有胰蛋白胨10.0g，酵母浸膏粉5.0g，NaCl 10.0g，若为固体培养基，则每升培养基添加琼脂15.0g，pH7.0，50μg/ml卡那霉素(Kanamycine)。
1、构建三联体融合蛋白表达载体pET-30a(+)-AMA-Mxe-ELK16和pET-30a(+)-AMA-Mxe-18A
使用Tiangen公司的高纯度质粒小提试剂盒提取pET-30a(+)-LipA-Mxe-ELK16质粒(构建方法请见实施例1，图7)、pET-30a(+)-LipA-Mxe-18A(构建方法请见实施例1，图7)和pET-30a(+)-AMA-ELK16质粒(ELK16在C末端与AMA融合，质粒结构如图8所示，其构建方法为选择商用质粒Novogen公司的pET-30a(+)质粒，用在线工具DNAworks设计Linker和ELK16核苷酸序列，利用重叠PCR的方法将来自烟曲霉Amadoriase II的AMA基因和带Linker的ELK16基因按AMA基因在N端的顺序合成出来，再将此段基因插入pET-30a(+)质粒的NdeI和XhoI位点间，形成pET-30a(+)-AMA-ELK16质粒)，利用如下正向引物和反向引物，按照常规方法进行PCR扩增AMA基因片段：上游引物5’-TTCTGGACATATGGCGGTAACCAATCATC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Nde I识别位点)和下游引物5’-GGTGGTACTAGTGCATCTCCCGTGATGCACATTCGCATTAACTTGGAAATATCTCTATA-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Spe I识别位点)。PCR反应使用Tiangen公司的pfu聚合酶，PCR反应条件为：先94℃2min；然后94℃1min，57℃1min，72℃100sec，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出1条正确大小的条带，与预期结果相符。之后将PCR产物用限制性内切酶Nde I和Spe I进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pET-30a(+)-LipA-Mxe-ELK16和pET-30a(+)-LipA-Mxe-18A分别进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所克隆的AMA基因序列正确。
2、融合蛋白三联体AMA-Mxe-ELK16和AMA-Mxe-18A的表达与切割纯化
将构建好的菌株接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，加入0.2mM IPTG，在30℃下诱导6小时，收获细胞，取10OD细胞用1ml裂解缓冲液重悬，离心分离上清和沉淀。将沉淀用裂解缓冲液洗涤2次后，使用切割缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 8.0)，500mMNaCl，40mM二硫苏糖醇，1mM EDTA)重悬充分，置于4℃过夜24h。之后将悬浊液离心分离，得到的上清和沉淀与切割前的沉淀一起进行SDS-PAGE检测(结果分别如图3B和图4B所示，分别为泳道1：切割前的细胞裂解物沉淀，可检测到清晰的融合蛋白三联体表达成的酶聚集体；泳道2：切割后分离的沉淀；泳道3：切割后分离的上清，可检测到清晰的目的蛋白条带；泳道4：标准蛋白分子量Marker)和AMA的酶活性测定。
AMA的活性测量方法详见文献(Sakaue R，Kajiyama N，Thermostabilization of bacterial fructosyl-amino acid oxidase by directedevolution.Appl Environ Microbiol 2003，69(1)：139-145)。活性定义为：在测定条件下，1分钟内水解底物产生1μmol的H2O2所需要的酶量定义为1个活性单位。
对SDS-PAGE结果应用Bio-Rad的Quantity One软件检测，利用不同浓度的BSA标准品制成的标准曲线估算对应条带的浓度，从而计算出纯化的AMA浓度、比活力、切割效率、质量回收率(切割后上清目的蛋白质量/切割前沉淀中目的蛋白理论总质量)。对于自聚集短肽ELK16构建的体系分别为48±1μg/ml、1.8±0.3U/mg、(65±2)％和(27±3)％；对于自聚集短肽18A构建的体系分别为111±14μg/ml、2.3±0.5U/mg、(80±1)％和(62±3)％。
实施例3短小芽孢杆菌木糖苷酶(XynB)作为目的蛋白的三联体融合蛋白(融合在N末端)表达及其纯化
菌株：Escherichia coli BL21(DE3)
载体：pET-30a(+)
培养基：LB/Kanr，每升培养基含有胰蛋白胨10.0g，酵母浸膏粉5.0g，NaCl 10.0g，若为固体培养基，则每升培养基添加琼脂15.0g，pH7.0，50μg/ml卡那霉素(Kanamycine)。
1、构建三联体融合蛋白表达载体pET-30a(+)-XynB-Mxe-ELK16和pET-30a(+)-XynB-Mxe-18A
使用Tiangen公司的高纯度质粒小提试剂盒提取pET-30a(+)-LipA-Mxe-ELK16质粒(构建方法请见实施例1，质粒结构如图7所示)、pET-30a(+)-LipA-Mxe-18A(构建方法请见实施例1，质粒结构如图7所示)和pET-30a(+)-XynB-ELK16质粒(ELK16在C末端与XynB融合，质粒结构如图9所示，其构建方法为选择商用质粒Novogen公司的pET-30a(+)质粒，用在线工具DNAworks设计Linker和ELK16核苷酸序列，利用重叠PCR的方法将来自短小芽孢杆菌木糖苷酶的XynB基因和带Linker的ELK16基因按XynB基因在N端的顺序合成出来，再将此段基因插入pET-30a(+)质粒的NdeI和XhoI位点间，形成pET-30a(+)-XynB-ELK16质粒)，利用如下正向引物和反向引物，按照常规方法进行PCR扩增AMA基因片段：上游引物5’-ATGAGCACATATGAAGATTATCAATCCAGTGCTC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Nde I识别位点)和下游引物5’-CGAGCAACTAGTGCATCTCCCGTGATGCACATTCGCATTTCGTCTGTTTCCTCATAAC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Spe I识别位点)。PCR反应使用Tiangen公司的pfu聚合酶，PCR反应条件为：先94℃2min；然后94℃1min，57℃1min，72℃120sec，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出1条正确大小的条带，与预期结果相符。之后将PCR产物用限制性内切酶Nde I和Spe I进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pET-30a(+)-LipA-Mxe-ELK16和pET-30a(+)-LipA-Mxe-18A分别进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所克隆的AMA基因序列正确。
2、融合蛋白三联体XynB-Mxe-ELK16和XynB-Mxe-18A的表达与切割纯化
将构建好的菌株接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，加入0.2mM IPTG，在30℃下诱导6小时，收获细胞，取10OD细胞用1ml裂解缓冲液重悬，破壁，离心分离上清和沉淀。将沉淀用裂解缓冲液洗涤2次后，使用切割缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 8.0)，500mM NaCl，40mM二硫苏糖醇，1mM EDTA)重悬充分，置于4℃过夜24h。之后将悬浊液离心分离，得到的上清和沉淀与切割前的沉淀一起进行SDS-PAGE检测(结果分别如图3C和图4C所示，分别为泳道1：切割前的细胞裂解物沉淀，可检测到清晰的融合蛋白三联体表达成的酶聚集体；泳道2：切割后分离的沉淀；泳道3：切割后分离的上清，可检测到清晰的目的蛋白条带；泳道4：标准蛋白分子量Marker)和XynB的酶活性测定。
XynB的活性测量方法详见文献(Shao WL，Wiegel J，Purificationand characterization of a thermostable beta-xylosidase fromthermoanaerobacter-ethanolicus.J Bacteriol 1992，174(18)：5848-5853.)。活性定义为：在测定条件下，1分钟内水解底物产生1μmol的对硝基苯酚(p-nitrophenol)所需要的酶量定义为1个活性单位。
对SDS-PAGE结果应用Bio-Rad的Quantity One软件检测，利用不同浓度的BSA标准品制成的标准曲线估算对应条带的浓度，从而计算出纯化的XynB浓度、比活力、切割效率、质量回收率(切割后上清目的蛋白质量/切割前沉淀中目的蛋白理论总质量)。对于自聚集短肽ELK16构建的体系分别为41±1μg/ml、1.5±0.1U/mg、(57±2)％和(23±1)％；对于自聚集短肽18A构建的体系分别为26±3μg/ml、2.6±0.3U/mg、(69±3)％和(14±1)％。
实施例4野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A(LipA)作为目的蛋白(融合在C末端)的三联体融合蛋白表达及其纯化。
菌株：Escherichia coli BL21(DE3)
载体：pET-30a(+)
培养基：LB/Kanr，每升培养基含有胰蛋白胨10.0g，酵母浸膏粉5.0g，NaCl 10.0g，若为固体培养基，则每升培养基添加琼脂15.0g，pH7.0，50μg/ml卡那霉素(Kanamycine)。
1、构建三联体融合蛋白表达载体pET-30a(+)-18A-Ssp-LipA
使用Tiangen公司的高纯度质粒小提试剂盒提取pET-30a(+)-18A-LipA质粒(18A在N末端与LipA融合，质粒结构如图10所示，其构建方法为选择商用质粒Novogen公司的pET-30a(+)质粒，用在线工具DNAworks设计18A和Linker核苷酸序列，利用重叠PCR的方法将来自枯草芽孢杆菌脂肪酶A的LipA基因和带Linker的18A基因按LipA基因在C端的顺序合成出来，再将此段基因插入pET-30a(+)质粒的NdeI和HindIII位点间，形成pET-30a(+)-18A-LipA质粒)和NewEngland Biolab(NEB)公司的pTWIN1质粒，利用如下两套正向引物和反向引物，按照常规方法进行PCR扩增两个基因片段，分别是LipA基因片段和Ssp DnaB内含肽基因片段：第一套上游引物5′-CGCGAGGAATTCGCTATCTCTGGCGATAGTCTGA-3′(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点)和下游引物5′-CGACTGGATTGTGTTCGGCGCGCCCGTTGTGTACAATGA-3′，第二套上游引物5′-TCATTGTACACAACGGGCGCGCCGAACACAATCCAGTCGTTAT-3′和下游引物5′-GGCCGCAAGCTTATTCGTATTC-3′(带下划线碱基为限制性内切酶Hind III识别位点)。PCR反应使用Tiangen公司的pfu聚合酶，PCR反应条件为：先94℃2min；然后94℃1min，57℃1min，72℃40sec，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出2条正确大小的条带，与预期结果相符。之后将两个片段进行凝胶分离回收，在以两个片段作为模板，进行重叠PCR反应：先在不加入引物的情况下94℃2min；然后94℃1min，70℃1min，72℃80sec，共10个循环；最后72℃10min。再进行94℃2min；然后加入引物5′-CGCGAGGAATTCGCTATCTCTGGCGATAGTCTGA-3′和5′-GGCCGCAAGCTTATTCGTATTC-3′，PCR程序94℃1min，57℃1min，72℃40sec，共17个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出与预期相符的正确条带。将重叠PCR产物用限制性内切酶EcoR I和HindIII进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pET-30a(+)-18A-LipA进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所克隆的LipA基因序列正确(SEQ ID No：7)。
2、融合蛋白三联体18A-Ssp-LipA的表达与切割纯化
将构建好的菌株接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，加入0.2mM IPTG，在30℃下诱导6小时，收获细胞，取10OD细胞用1ml裂解缓冲液重悬，破壁，离心分离上清和沉淀。将沉淀用裂解缓冲液洗涤2次后，使用切割缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 6.0)，500mMNaCl，1mM EDTA)重悬充分，置于25℃过夜24h。之后将悬浊液离心分离，得到的上清和沉淀与切割前的沉淀一起进行SDS-PAGE检测(结果如图5所示，分别为泳道1：切割前的细胞裂解物沉淀，可检测到清晰的融合蛋白三联体表达成的酶聚集体；泳道2：切割后分离的沉淀；泳道3：切割后分离的上清；泳道4：标准蛋白分子量Marker)和LipA的脂肪酶酶活性测定。
其中，脂肪酶活性的定量测定方法同实施例1中的描述。
脂肪酶活性测定显示切割后分离的上清具有一定的活性，但SDS-PAGE检测不到目的蛋白的条带(约21kDa)。从SDS-PAGE上也可看出融合蛋白三联体的内含肽诱导自切割量很少，因此优选MxeGyrA内含肽构建融合蛋白三联体。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种基于自聚集短肽诱导的酶聚集体的蛋白质纯化方法，其特征在于，1）将目的蛋白、含可切割位点的肽段和自聚集短肽的融合蛋白融合表达，所述的融合蛋白的连接顺序为目的蛋白-含可切割位点的肽段-自聚集短肽或自聚集短肽-含可切割位点的肽段-目的蛋白；其中，所述含可切割位点的肽段为内含肽Ssp DnaB或Mxe GyrA；所述自聚集短肽的氨基酸序列如SEQ ID No：1或SEQ ID No：2所示；
2）将表达上述融合蛋白的宿主细胞破碎后，离心和/或过滤获得沉淀，然后利用与可切割位点对应的切割方式，诱导切割位点断裂释放可溶目的蛋白，最后进行离心和/或过滤，得上清。
2.根据权利要求1所述的蛋白质纯化方法，其特征在于，步骤1）中所述含可切割位点的肽段为内含肽Mxe GyrA。
3.根据权利要求1所述的蛋白质纯化方法，其特征在于，步骤1）中所述的与可切割位点对应的切割方式为具有自切割功能的内含肽的自切割、酶法或化学法。
4.根据权利要求3所述的蛋白质纯化方法，其特征在于，步骤1）中所述的与可切割位点对应的切割方式为具有自切割功能的内含肽的自切割。
5.根据权利要求1-4任一项所述的蛋白质纯化方法，其特征在于，步骤2）中所述宿主细胞为原核微生物或真菌。
6.含有目的蛋白、含可切割位点的肽段和自聚集短肽的融合蛋白，其连接顺序为目的蛋白-含可切割位点的肽段-自聚集短肽或自聚集短肽-含可切割位点的肽段-目的蛋白；其中，所述含可切割位点的肽段为内含肽Ssp DnaB或Mxe GyrA；所述自聚集短肽的氨基酸序列如SEQ ID No：1或SEQ ID No：2所示。
7.编码权利要求6所述的融合蛋白的基因。
8.权利要求6所述的融合蛋白表达形成的酶聚集体。
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