CN102174581B

CN102174581B - 消除或减少丝状真菌菌株基因表达的方法

Info

Publication number: CN102174581B
Application number: CN201110048625.1A
Authority: CN
Inventors: 萨钦德拉·梅约兰; 宇田川裕晃; 霍华德·布罗迪
Original assignee: Novo Nordisk AS; Novozymes Biotech Inc
Current assignee: Novo Nordisk AS; Novozymes Inc
Priority date: 2003-12-09
Filing date: 2004-12-09
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2024-12-09
Also published as: DK1702059T3; US8716023B2; EP1702059A1; CN102174581A; WO2005056772A1; EP1702059A4; CN1914311A; JP2007513632A; JP4842834B2; US20140287475A1; CN1914311B; EP1702059B1; US20050158844A1

Abstract

本发明涉及消除或减少丝状真菌菌株基因表达的方法，更具体地，本发明涉及在丝状真菌菌株中减少或消除目的基因表达的方法，包括：(a)在丝状真菌菌株基因组中插入双链可转录核酸构建体，该核酸构建体包括第一核苷酸序列，其包含与启动子可操作性地连接的目的基因的同源编码区；和第二核苷酸序列，其包含目的基因的同源编码区或其部分，其中第一、第二核苷酸序列相互互补且第二核苷酸序列与第一核苷酸序列方向相反；和(b)通过在适合产生干扰RNA的条件下培养丝状真菌菌株来诱导双链可转录核酸构建体编码的干扰RNA的产生，其中干扰RNA与目的基因RNA转录本相互作用，以减少或消除目的基因的表达。

Description

消除或减少丝状真菌菌株基因表达的方法

本申请是申请日为2004年12月09日、申请号为200480041520.1(国际申请号为PCT/US2004/041510)、发明名称为“消除或减少丝状真菌菌株基因表达的方法”的发明申请的分案申请。

发明背景

发明领域

本发明涉及在丝状真菌菌株中消除或减少基因的表达。

背景技术

丝状真菌菌株被广泛用于生产具有商业价值的生物物质。然而，具有所期望生物物质表达和分泌增加的特性的丝状真菌菌株可能并不一定具有适合成功发酵的最期望特性。生物物质的产生可能伴随着其他物质例如可降解生物物质或与生物物质共纯化(co-purify)的酶的产生，这些其他物质将使生物物质的回收和纯化复杂化。

解决这些问题的方法之一是使参与生产非期望的物质的基因失活。失活可以用本领域已知的方法通过缺失或破坏基因来完成。然而，在某些情况下，由于对基因同源区的靶向性不高，基因失活可能是困难的。失活也可以通过随机诱变完成，但随机诱变并不总是特异性地针对期望的目的基因，其他突变经常被导入至宿主生物。在其他情况下，目的基因及其产物可能是该丝状真菌菌株的存活所必需的。在多个基因需要通过缺失或破坏来失活失活的情况下，任务就变得相当麻烦且耗时。当高度同源的基因家族成员存在时，所有家族成员的缺失或破坏就显得特别烦琐与困难。

最近几年，各种外遗传基因调节(epigenetic gene regulation)形式已有记载(Selker，1997，Trends Genet.13：296-301；Matzke and Matzke，1998，Cell.Mol.Life.Sci.54：94-103)。这些方法通过微RNAs(micro RNAs)(Morel et al.，2000，Curr.Biol.10：1591-4；Bailis and Forsburg，2002，Genome Biol，3，Reviews 1035；Grewal and Moazed，2003，Science，301：798-802)调节信使RNA水平来影响基因表达(Hammond and Baulcombe，1996，Plant Mol，Biol，32：79-88；Xi-song Keet al.，2003，Current Opinion in Chemical Biology 7：516-523)。

基于果蝇(Drosophila)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的遗传研究，RNA干扰(RNAi)，(在植物中)也称为转录后基因沉默，被认为通过组装靶向同源RNAs导致其降解的蛋白-RNA效应核酸酶复合物而参与了基因的沉默表达(Hannon，2002，Nature 418：244-251)。双链RNA(dsRNA)变成小干扰RNAs的加工是通过被称为切酶(Dicer)的酶家族完成的(Bernsteinet al.，2001，Nature 409：363)。切酶是特异切割dsRNA的核酸内切酶RNase III家族成员，负责消化dsRNA成20-25核苷酸的siRNAs(Elbashir et al，2001，Nature 411：494)。这些siRNAs与反义链变性之后与RNA诱导的沉默复合物(RNA Induced Silencing Complex，RISC)结合(Elbashir et al，2001，Genes andDev.15：188；NyKanen etal，2001，Cell 197：300；Hammondet al.，2001，Science293：1146)。尽管了解得还不是很清楚，RISC靶向上述反义片段所来源的mRNA，随后对mRNA进行内切和外切核酸酶消化，从而有效地使该基因表达沉默。RNA干扰在植物，线虫，昆虫，和哺乳动物中都有出现(Matzke andMatzke，1998，(同上)同上；Kennerdell et al，2000，Nat.Biotechnol.18：896-8；Bosher et al，1999，Genetics 153：1245-56；Voorhoeve and Agami，2003，TrendsBiotechnol.21：2-4；and McCaffreyetal，2003，Nat.Biotechnol.21：639-44)。

WO 98/53083公开了通过插入包括全部或部分的目的基因的反向重复序列的沉默载体至植物基因组，在植物中增强目的基因的抑制的构建体和方法。

WO 01/49844记载了编码反向重复基因的反向重复基因构建体，该构建体包括启动子元件，其以5’到3’的方向可操作连接于反义方向的第一编码序列和第二序列，用于破坏目标生物，例如秀丽隐杆线虫、网柄菌(Dictyostelium)、酵母、果蝇，小鼠，植物，昆虫，人类细胞，以及线虫中的基因表达。

WO 03/050288公开了在植物中使目的基因沉默的方法，其包括提供重组DNA构建体，所述构建体包括与嵌合核苷酸序列可操作性连接的启动子，该嵌合核苷酸序列编码全部或部分的目的基因和转基因；将该DNA构建体转化植物，使得表达框插入基因组；以及在植物中引发所述转基因的转录后基因沉默，这样，引发转录后转基因基因沉默导致了目的基因的沉默。

提供可用于丝状真菌菌株改良、功能基因组和途径工程的消除或减少一种或多种基因表达的可选方法，可能对本技术领域产生积极效果。

本发明目的是提供一种用于在丝状真菌菌株中消除或减少一种或多种基因表达的可选方法。

发明概述

本发明涉及在丝状真菌菌株中减少或消除编码生物物质目的基因表达的方法，包括：

(a)在丝状真菌菌株基因组中插入双链可转录的核酸构建体，该核酸构建体包括第一核苷酸序列，其包含与编码生物物质的目的基因的第一同源可转录区可操作连接的启动子；和第二核苷酸序列，其包含所述目的基因的第二同源可转录区，其中第一和第二同源区相互互补且第二同源区与第一同源区方向相反；和

(b)通过在适合产生干扰RNA条件下培养丝状真菌菌株来诱导双链转录核酸构建体编码的干扰RNA产生，其中干扰RNA与目的基因的RNA转录本相互作用，导致生物物质编码目的基因的表达减少或消除。

本发明也涉及包含双链可转录核酸构建体的丝状真菌菌株，该构建体包括第一核苷酸序列，其包含与编码生物物质的目的基因的第一同源可转录区可操作连接的启动子；和第二核苷酸序列，其包含所述目的基因的第二同源可转录区或其部分，其中第一和第二同源区相互互补且第二同源区与第一同源区方向相反，其中由双链转录核酸构建体编码的干扰RNA与目的基因的RNA转录本相互作用以减少或消除编码生物物质的目的基因的表达。

本发明进一步涉及生产生物物质的方法，包括：

(a)在适合生产感兴趣的生物物质的条件下培养丝状真菌菌株，其中该丝状真菌菌株包括双链可转录核酸构建体，其中该双链可转录核酸构建体包括第一核苷酸序列，其包含与编码非期望的生物物质的目的基因的第一同源可转录区可操作性连接的启动子；和第二核苷酸序列，其包含该目的基因的第二同源可转录区，其中第一、第二同源区相互互补且第二同源区与第一同源区方向相反，其中由双链转录核酸构建体编码的干扰RNA与目的基因的RNA转录本相互作用而减少或消除编码非期望生物物质的目的基因的表达；以及其中丝状菌包括编码感兴趣生物物质的第三核酸序列；以及

(b)从培养基中回收生物物质。

更具体地，本发明还涉及如下方面：1、在丝状真菌菌株中减少或消除生物物质编码目的基因表达的方法，包括：

(a)在丝状真菌菌株基因组中插入双链可转录核酸构建体，该核酸构建体包括第一核苷酸序列，该第一核苷酸序列包含与编码生物物质的目的基因第一同源可转录区可操作连接的启动子；和第二核苷酸序列，该第二核苷酸序列包含该目的基因第二同源可转录区，其中第一、第二同源区相互互补且第二同源区与第一同源区方向相反；和

(b)通过在适合产生干扰RNA条件下培养丝状真菌菌株来诱导双链可转录核酸构建体所编码干扰RNA的产生，其中干扰RNA与目的基因的RNA转录本相互作用，以减少或消除编码生物物质的目的基因的表达。

2、项1的方法，其中第一同源区包括目的基因的至少19个核苷酸。

3、项1的方法，其中第二同源区包括第一同源区的至少19个核苷酸，其中所述至少19个核苷酸的顺序与第一同源区相应区相反。

4、项1的方法，其中第一、第二核苷酸序列被第三核苷酸序列隔离。

5、项4的方法，其中第三核苷酸序列包括至少5个核苷酸。

6、项1的方法，其中丝状真菌菌株是支顶孢属、曲霉属、短柄霉属、隐球酵母属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、Magnaporthe、毛霉属、Myceliophthora、Neocallimastix、链孢霉属、Paecilomyces、青霉属、Piromyces、裂褶菌属、踝节菌属、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium，或木霉属的菌株。

7、项1的方法，其中目的基因表达减少至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，最优选至少90％。

8、项1的方法，其中目的基因的表达被消除。

9、项1的方法，其中干扰RNA与目的基因的一个或多个同源类似物的RNA转录本相互作用以减少或消除目的基因的一个或多个同源类似物的表达。

10、项9的方法，其中目的基因的一个或多个同源类似物的表达减少至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，最优选至少90％。

11、项1的方法，其中目的基因的一个或多个同源类似物的表达被消除。

12、包含双链可转录核酸构建体的丝状真菌菌株，该构建体包括第一核苷酸序列，该第一核苷酸序列包含与编码生物物质的目的基因的第一同源可转录区可操作连接的启动子；和第二核苷酸序列，该第二核苷酸序列包含所述目的基因的第二同源可转录区，其中第一、第二同源区相互互补且第二同源区与第一同源区方向相反，其中由双链可转录核苷酸构建体编码的干扰RNA与目的基因的RNA转录本相互作用，以减少或消除编码生物物质的目的基因的表达。

13、项12的丝状真菌菌株，其中第一同源区包括目的基因的至少19个核苷酸。

14、项12的丝状真菌菌株，其中第二同源区包括第一同源区的至少19个核苷酸，其中所述至少19个核苷酸的顺序与第一同源区的相应区相反。

15、项12的丝状真菌菌株，其中第一、第二核苷酸序列被第三核苷酸序列隔离。

16、项15的丝状真菌菌株，其中第三核苷酸序列包括至少5个核苷酸。

17、项12的丝状真菌菌株，其中丝状真菌菌株是支顶孢属、曲霉属、短柄霉属、隐球酵母属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、Magnaporthe、毛霉属、Myceliophthora、Neocallimastix、链孢霉属、Paecilomyces、青霉属、Piromyces、裂褶菌属、踝节菌属、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium、或木霉属的菌株。

18、项12的丝状真菌菌株，其中目的基因表达减少至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，最优选至少90％。

19、项12的丝状真菌菌株，其中目的基因的表达被消除。

20、项12的丝状真菌菌株，其中干扰RNA与目的基因的一个或多个同源类似物的RNA转录本相互作用以减少或消除目的基因的一个或多个同源类似物的表达。

21、项20的丝状真菌菌株，其中目的基因的一个或多个同源类似物的表达减少至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，最优选至少90％。

22、项12的丝状真菌菌株，其中目的基因的一个或多个同源类似物的表达被消除。

23、生产生物物质的方法，包括：

(a)在适合生产感兴趣的生物物质的条件下培养丝状真菌菌株，其中该丝状真菌菌株包括双链可转录核酸构建体，其中该双链可转录核酸构建体包括第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列包含与编码非期望的生物物质的目的基因的第一同源可转录区可操作连接的启动子；和第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列包含该目的基因的第二同源可转录区，其中第一、第二同源区相互互补且第二同源区与第一同源区方向相反，其中双链可转录核酸构建体所编码的干扰RNA与目的基因的RNA转录本相互作用以减少或消除编码非期望的生物物质的目的基因的表达；以及其中丝状真菌菌株包括编码感兴趣的生物物质的第三核苷酸序列；以及

(b)从培养基中回收生物物质。

24、项23的方法，其中第一同源区包括目的基因的至少19个核苷酸。

25、项23的方法，其中第二同源区包括第一同源区的至少19个核苷酸，其中所述至少19个核苷酸的顺序与第一同源区的相应区相反。

26、项23的方法，其中第一、第二核苷酸序列被第四核苷酸序列隔离。

27、项26的方法，其中第四核苷酸序列包括至少5个核苷酸。

28、项23的方法，其中丝状真菌菌株是支顶孢属、曲霉属、短柄霉属、隐球酵母属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、Magnaporthe、毛霉属、Myceliophthora、Neocallimastix、链孢霉属、Paecilomyces、青霉属、Piromyces、裂褶菌属、踝节菌属、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium、或木霉属的菌株。

29、项23的方法，其中目的基因表达减少至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，最优选至少90％。

30、项23的方法，其中目的基因的表达被消除。

31、项23的方法，其中干扰RNA与目的基因的一个或多个同源类似物的RNA转录本相互作用以减少或消除目的基因的一个或多个同源类似物的表达。

32、项31的方法，其中目的基因的一个或多个同源类似物的表达减少至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，最优选至少90％。

33、项32的方法，其中目的基因的一个或多个同源类似物的表达被消除。

附图说明

图1显示了pAILo1的限制性图谱。

图2显示了pMJ04的限制性图谱。

图3显示了pMJ06的限制性图谱。

图4显示了pMJ09的限制性图谱。

图5显示了里氏木霉(Trichoderma reesei)Cel6A反向重复片段的限制性图谱。

图6显示了pSMai 148的限制性图谱。

图7显示了转化体14阳性对照株(里氏木霉SaMe02)与在摇瓶中的“空载体对照”里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)II mRNA相对表达水平。

图8显示了pSMai 163的限制性图谱。

图9显示通过Northern杂交分析检测里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II小干扰RNA。总RNAs(25μg)用15％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶电泳，转移至尼龙膜，再用DIG标记的里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II RNA探针检测。里氏木霉SaMe02是阳性对照株，其中里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II基因用同源重组进行了敲除。里氏木霉RutC30是宿主菌株。溴化乙锭染色凝胶显示的对照28s-rRNA和18s-rRNA凝胶电泳情况表明，该凝胶电泳是等上样量的。

图10显示了表达里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II反向重复片段的里氏木霉RutC30第七日摇瓶样品(#’s 1，2，11，12，13，14)的SDS-PAGE分析。里氏木霉SaMe02是阳性对照株，其中里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II基因用同源重组进行了敲除。里氏木霉RutC30是宿主菌株。在接种后七天，将500μl菌丝体作为新的接种物接种在包含新鲜纤维素诱导培养基的摇瓶中。菌丝体总共传代五次。

图11显示了pBANe10的限制性图谱。

图12显示了pAILo2的限制性图谱。

图13显示了pHB506的限制性图谱。

图14显示了选择的含有pHB506的黑曲霉(Aspergillus niger)转化体(转化体1-8)，葡糖淀粉酶基因缺失株黑曲霉HowB112，黑曲霉JaL303-10，和转化了pAlLo2(空载体)的黑曲霉JaL303-10的七日摇瓶样品的SDS-PAGE分析。转化体1-4产生了相当量的葡糖淀粉酶，而转化体5-8没有产生可检测到的葡糖淀粉酶。

图15显示了pHUda512的限制性图谱。

图16显示了选择的含有pHUda512的黑曲霉转化体(1-8道)和黑曲霉NN049735(9道)的七日摇瓶样品的SDS-PAGE分析。

图17显示了pDeMi01的限制性图谱。

发明详述

本发明涉及在丝状真菌菌株中减少或消除编码生物物质的目的基因的表达的方法，包括：(a)在丝状真菌菌株基因组中插入双链可转录的核酸构建体，该核酸构建体包括第一核苷酸序列，其包含与所述目的基因的第一同源可转录区操作性连接的启动子；和第二核酸序列，其包含所述编码生物物质的目的基因的第二同源可转录区，其中第一和第二同源区相互互补且第二同源区与第一同源区方向相反；和(b)通过在适合产生干扰RNA的条件下培养丝状真菌菌株来诱导双链可转录核酸构建体编码的干扰RNA产生，其中干扰RNA与目的基因的RNA转录本相互作用来减少或消除编码生物物质的目的基因的表达。

本发明方法给丝状真菌菌株的菌种改良、功能基因组及途径工程提供了新的机会。例如，本发明的方法可以通过基因操作和途径工程用作丝状真菌宿主菌株改良的工具，或者本发明的方法可作为耗时且成功率并不稳定的基因敲除方法的替代方法。基因可对用本领域已知的标准方法例如基因敲除方法所产生的基因失活产生抗性。本发明提供了一种减少或消除这种基因的表达的解决方法。该方法也是在特定丝状真菌菌株中对减少或消除高表达的基因特别有用且有效，这在例如改良作为生产宿主的微生物中可能是非常重要的。这种能力显示了本发明方法的强大。该方法对减少或消除高度相互同源的多个基因的表达也有用，特别是对同一个基因家族的基因或生物合成或代谢路径中的同源基因有用。该方法的用处进一步体现在，通过调节该方法，能可调性地降低生物物质的表达。在某些场合下，生物物质编码基因的完全敲除对于某种特定的丝状真菌菌株可能是致命的，例如在流入感兴趣的生物合成途径的次级途径中，此时上述可调性就特别重要了。

在本发明方法中，第一核苷酸序列包括与目的基因的第一同源可转录区可操作性连接的启动子。第二核苷酸序列包括目的基因的第二同源可转录区，其中第一、第二同源区互补且第二同源区与第一同源区方向相反。优选地，第一和第二核苷酸序列被第三核苷酸序列隔离，以在丝状真菌菌株中稳定第一和第二核苷酸序列，防止例如构建过程中发生不期望的重组，就像在大肠杆菌(E.coli)中的那样。双链可转录核酸构建体的核苷酸序列可以是染色体组，cDNA，RNA，半合成，合成或上述任意组合的核苷酸序列。

启动子

术语“启动子”在本文是指结合RNA聚合酶，并引导聚合酶至编码生物物质的核酸序列的适当下游转录起始位点，从而引发转录的DNA序列。RNA聚合酶能有效地催化与合适的编码区DNA链互补的信使RNA的装配。术语“启动子”也能理解可包括用于mRNA转录后翻译的5’非编码区(启动子和翻译起始位点之间)，顺式转录调控元件例如增强子，以及能与转录因子相互作用的其他核酸序列。启动子序列可以是第一同源可转录区的内源或外源(异源)序列和丝状真菌菌株的内源或外源序列。在本发明的方法中，启动子可以是内源启动子，异源启动子，突变启动子，杂合启动子，或串联启动子。

术语“突变体启动子”在本文是指对具有在亲本启动子中包含了一个或多个核苷酸取代，缺失，和/或插入的核苷酸序列的启动子，其中突变体启动子比相应亲本启动子有增强或减弱的启动子活性。术语“突变体启动子”也包括自然突变体和通过本领域已知的方法例如常规诱变、定点诱变和DNA改组而在体外产生的突变体。

术语“杂合启动子”在本文是指融合在一起形成序列的两个以上启动子的部分，该序列是两个或多个启动子的融合，当可操作性连接至编码序列时，该启动子介导编码序列转录形成mRNA。

术语“串联启动子”在本文是指两个或多个启动子序列，其中每个启动子都可操作性连接至编码序列介导编码序列至mRNA的转录。

术语“可操作性连接”在本文是指一种结构，在该结构中启动子序列相对目的基因同源区放置在合适位点以使启动子序列能介导两区的转录。

本发明方法有用启动子的例子包括来自米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶，米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸性稳定α-淀粉酶，黑曲霉或泡盛曲霉(Asperpillusawamori)葡糖淀粉酶(glaA)，米赫根毛霉脂肪酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸异构酶，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶，灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)β-微管蛋白，Fusarium venenatum淀粉葡萄糖苷酶(WO00/56900)，Fusarium venenatum Daria(WO00/56900)，Fusarium venenatum Quinn(WO 00/56900)，尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)，里氏木霉β-葡萄糖苷酶，里氏木霉纤维二糖水解酶I，里氏木霉纤维二糖水解酶II，里氏木霉葡聚糖内切酶I，里氏木霉葡聚糖内切酶II，里氏木霉葡聚糖内切酶III，里氏木霉葡聚糖内切酶IV，里氏木霉葡聚糖内切酶V，里氏木霉木聚糖酶I，里氏木霉木聚糖酶II，或里氏木霉β-木糖苷酶基因的启动子，以及NA2-tpi启动子(黑曲霉中性α-淀粉酶与米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的杂交启动子)；以及它们的突变、截短和杂交启动子。

同源可转录区

术语“同源可转录区”在本文是指与目的基因的开放阅读框或其部分同源的核苷酸序列；其可被转录为RNA，例如ncRNA(非编码RNA)，tRNA(转运RNA)，rRNA(核糖体RNA)，miRNA(微小RNA)，或mRNA(信使RNA)，其在合适调控序列控制下可以翻译或不翻译为生物物质。可转录区的界限通常由正好位于mRNA 5’端开放阅读框上游的转录起始位点和正好位于mRNA 3’端开放阅读框下游的转录终止序列确定。同源可转录区可以包括但不限于基因组DNA，cDNA，半合成核苷酸序列，合成核苷酸序列以及重组核苷酸序列。

在本发明方法中，与目的基因同源的第一区可以与目的基因的相应区相同或者是其同源类似物。

失活或减少目的基因表达所需的同源类似物与目的基因相应区之间的相同程度可能取决于目的基因。同源类似物核苷酸序列相对整个目的基因而言越小，上述序列之间的相同程度应该优选极高或完全相同。同源类似物核苷酸序列相对整个目的基因而言越大，上述序列之间的相同程度就可以越低。

在本发明方法中，同源类似物核酸序列与目的基因相应区的相同程度至少65％，优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，进一步优选至少95％，最优选至少97％。就本发明而言，两核酸序列之间的相同程度可以通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur and Lipman，1983，Proceedings of the National Academy of Science USA 80：726-730)用带有相同程度关系表和下列多个比对参数：Gap(缺口)罚分10，缺口长度罚分10的LASERGENE^TMMEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)来确定。配对比对(pairwise alignment)参数是Ktuple＝3，缺口罚分＝3，移框(windows)＝20。

或者，同源类似物与目的基因相应区在不同严紧度严紧条件下相互杂交的能力也可以作为失活或减少目的基因的表达所需的相关程度的指征。然而，应该知道，同源类似物与目的基因相应区之间杂交所需严紧度条件越低，例如低严紧度条件，失活或减少目的基因表达的效果可能越差。优选地，同源类似物与目的基因相应区在低严紧度条件下杂交。更优选地，同源类似物与目的基因相应区在中度严紧度条件下杂交。再优选地，同源类似物与目的基因相应区在中高度严紧度条件下杂交。最优选地，同源类似物与目的基因相应区在高度严紧度条件下杂交。最最优选地，同源类似物与目的基因相应区在极高严紧度条件下杂交。

对长度至少100个核苷酸的探针而言，极低至极高严紧度条件定义为：按标准Southern印迹程序优选12-24小时操作，预杂交和杂交在42℃，5X SSPE，0.3％SDS，以及200ug/ml剪切变性鲑鱼精子DNA下，25％甲酰胺为极低和低严紧度条件，35％甲酰胺为中度和中高度严紧度条件，50％甲酰胺为高度和极高严紧度条件。

对长度至少100个核苷酸的探针而言，载体材料最后用2X SSC，0.2％SDS洗涤三次，每次15分钟，优选至少45℃(极低严紧度条件)，更优选至少50℃(低严紧度条件)，更优选至少55℃(中度严紧度条件)，更优选至少60℃(中高度严紧度条件)，进一步优选至少65℃(高严紧度条件)，最优选至少70℃(极高严紧度条件)。

对长度约15-70核苷酸的探针而言，严紧度条件定义为：在比根据Bolton和McCarthy(1962，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48：1390)计算得到的T_m低约5-10℃的温度之下，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1X Denhardt′s溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠，0.1mM ATP，以及每ml含0.2mg酵母RNA的溶液之中，按标准Southern杂交程序进行预杂交、杂交以及杂交后洗涤，优选进行12-24小时的操作。

对长度约15-70核苷酸的探针而言，载体材料在比计算的T_m低大约5-10℃的温度之下，用6X SCC+0.1％SDS洗涤15分钟一次，用6X SCC洗涤两次，每次各15分钟。

第一同源区优选由至少19个核苷酸组成，更优选由至少40个核苷酸组成，更优选由至少60个核苷酸组成，更优选由至少80个核苷酸组成，进一步优选由至少100个核苷酸组成，最优选由至少200个核苷酸组成。第一同源区也可由基因的整个开放阅读框或其同源类似物组成。

反向重复序列

双链可转录核酸构建体也包括目的基因的第二同源可转录区，其中第一和第二同源区互补，且第二同源区与第一同源区方向相反，即，是第一同源区的反向重复序列。

在一个优选的方面，第二同源区与第一同源区100％相同，但与第一同源区方向相反。在另一个优选的方面，第二同源区是第一同源区的一部分，其中该部分与第一同源区的相应部分100％相同。在另一个优选的方面，第二同源区是第一同源区相应部分的同源类似物。在另一个优选的方面，第二同源区是第一同源区相应部分的同源类似物的一部分。

同源类似物或同源类似物的一部分与第一核酸序列相应的序列至少有65％，优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，进一步优选至少95％，最优选至少97％相同。相同性百分数根据本文中记载的Wilbur-Lipman方法确定。

第二同源区识别目的基因以减少或消除表达，第二同源可以是目的基因的任何同源可转录部分，例如目的基因的5’-非翻译区、生物物质编码序列或3’-非翻译区。

在一个优选的方面，第二同源区对应于目的基因的生物物质编码序列或其部分。

在另一个优选的方面，第二同源区对应于目的基因的5’-非翻译区或其部分。

在另一个优选的方面，第二同源区对应于目的基因的3’-非翻译区或其部分。

第二同源区优选由至少19个核苷酸组成，更优选由至少40个核苷酸组成，更优选由至少60个核苷酸组成，更优选由至少80个核苷酸组成，进一步优选由至少100个核苷酸组成，最优选由至少200个核苷酸组成。第二同源区也可由基因的整个开放阅读框或其同源类似物组成。

第一、第二核苷酸序列之间的间隔序列

包含目的基因同源区的第一、第二核苷酸序列可由或不由多核苷酸接头或间隔序列隔离，接头或间隔序列在双链可转录核酸构建体中是与第一、第二核苷酸序列几乎不同源或完全不同源的核苷酸序列。

在一个优选的方面，第一、第二核酸序列由多核苷酸接头隔离。间隔序列优选由至少5个核苷酸组成，更优选由至少10个核苷酸组成，更优选由至少20个核苷酸组成，更优选由至少30个核苷酸组成，更优选由至少40个核苷酸组成，进一步优选由至少500个核苷酸组成，最优选由至少100个核苷酸组成。

间隔序列或接头可以是任何与第一和第二核酸序列没有同源性的核酸序列，优选与丝状真菌菌株基因组序列几乎不同源或完全不同源，以使不期望的靶向/同源重组最小化。

目的基因

目的基因可以是任何生物物质编码基因。生物物质可以是RNA(例如，ncRNA，rRNA，tRNA，miRNA，或mRNA)。生物物质也可以是任何生物多聚物或代谢物。生物物质可以由单个基因或者由构成生物合成或代谢路径的系列基因编码，或者可以是单基因或系列基因的直接产物。生物物质对于丝状真菌菌株可以是天然的或者外源或异源的。术语“异源生物物质”在本文中是指细胞非天然的生物物质或者进行了结构修饰改变了的天然的生物物质。

在本发明方法中，生物多聚物可以是任何生物多聚物。术语“生物多聚物”在本文中是指由相同、相似或不相似的亚单位(单体)组成的链(或聚合物)。生物多聚物可以是但不限于核酸，多胺，多元醇，多肽(或聚酰胺)，或多糖。

在一个优选的方面，生物多聚物是多肽。多肽可以是有感兴趣的生物活性的任何多肽。术语“多肽”在本文中并不是指特定长度的编码产物，所以它包括肽、寡肽和蛋白。术语“多肽”也包括相互结合形成编码产物的两个或多个多肽。多肽也包括杂合多肽，该杂合多肽包括部分或完整多肽序列的组合，所述序列来自至少两个不同的多肽，其中一个或多个序列可以是丝状真菌菌株细胞的异源序列。多肽进一步包括上述多肽和杂合多肽天然发生的等位变异体和基因工程变异体。

在一个优选的方面，多肽是抗体，抗原，抗菌肽，酶，生长因子，激素，免疫调节因子，神经递质，受体，报告蛋白，结构蛋白，和转录因子。

在一个更优选的方面，多肽是氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂合酶，异构酶，或连接酶。在一个最优选的方面，多肽是α-葡糖苷酶，氨肽酶，淀粉酶，糖酶，羧肽酶，过氧化氢酶，纤维素酶，几丁质酶，角质酶(cutinase)，环糊精糖基转移酶，脱氧核糖核酸酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，葡糖脑苷脂酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，转化酶，漆酶，脂肪酶，甘露糖苷酶，变位酶(mutanase)，氧化酶，果胶酶(pectinolytic enzyme)，过氧化物酶，磷脂酶，肌醇六磷酸酶，多酚氧化酶，蛋白水解酶，核糖核酸酶，谷氨酰胺转移酶，尿激酶，或木聚糖酶。

在另一个优选的方面，多肽是胶原蛋白或明胶，或它们的变异体或杂合体。

在另一个优选的方面，生物多聚物是多糖。多糖可以是任何多糖，包括但不限于，粘多糖(例如肝素和透明质酸)和含氮多糖(例如几丁质)。在一个更优选的方面，多糖是透明质酸。

在本发明的方法中，代谢物可以是任何代谢物。代谢物可以由一个或多个，例如生物合成或代谢途径上的基因编码。术语“代谢物”包括初级代谢物和次级代谢物。初级代谢物是细胞的主要或常规代谢的产物，它与能量代谢、生长、及结构相关。次级代谢物是次级代谢的产物(参见例如，R.B.Herbert，TheBiosynthesis of Secondary Metabolites，Chapman and Hall，New York，1981)。

初级代谢物可以是但不限于，氨基酸，脂肪酸，核苷，核苷酸，糖，甘油三酯，或维生素。

次级代谢物可以是但不限于，生物碱，香豆素，类黄酮，聚酮化合物，奎宁，类固醇，肽，或萜烯。在一个优选的方面，次级代谢物是抗生素，拒食剂，诱虫剂，杀菌剂，杀真菌剂，激素，杀虫剂，或杀鼠剂。

生物物质也可以是选择标记的产物。选择标记是一种基因，其产物有助于产生针对抗微生物剂或病毒的抗性，针对重金属的抗性，原养型向营养缺陷型的转变，等等。选择标记包括但不限于，amdS(乙酰胺酶)，argB(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)，bar(膦丝菌素乙酰转移酶)，hygB(潮霉素磷酸转移酶)，niaD(硝酸还原酶)，pyrG(乳清苷-5′-磷酸脱羧酶)，sC(硫酸腺苷转移酶)，trpC(氨基苯甲酸合酶)，及其等价物。

在本发明的应用中，分离目的基因可能是必要的。用于分离或克隆基因的技术是本领域已知的，该技术包括从基因组DNA的分离，从cDNA的制备，或者它们的组合。从上述基因组DNA进行基因克隆，例如可以通过周知的聚合酶链反应(PCR)进行。参见例如，Inniset al.，1990，PCR Protocols ：A Guideto Methods and Application，Academic Press，New York。克隆过程可能需要进行包含生物物质编码基因的所述期望核酸片段的剪切与分离，片段至载体的插入，以及重组载体至丝状真菌菌株细胞的整合，在细胞中核酸序列复制出多个拷贝或多个克隆。核酸序列可以是基因组序列，cDNA，RNA，半合成的，合成的，或它们的任意组合。

在一个优选的方面，目的基因的表达减少至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，进一步优选至少80％，最优选至少90％。在另一个优选的方面，目的基因的表达被消除。

当在5’非翻译区，编码区，或3’非翻译区中使用反向重复序列时，所构建的在上述任一区域中包含了反向重复序列的基因沉默载体可又使与沉默载体中与编码序列同源的基因沉默。因此，当要在生物体中沉默基因的同源类似物时，通过构建在5’非翻译区、编码区或3’非翻译区中含有反向重复序列的沉默载体，可以消除或减少与该构建体编码序列有序列同源性的一个或多个基因的表达。术语“同源性”或“同源性的”通常是指有某些有共同祖先结构并且活性区有高度序列相似性的那些序列。

在一个优选的方面，干扰RNA与目的基因的一个或多个同源类似物RNA转录本相互作用以减少或消除目的基因的一个或多个同源类似物的表达。

在一个更优选的方面，目的基因的一个或多个同源类似物的表达减少至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，进一步优选至少80％，最优选至少90％。在另一个优选的方面，目的基因的一个或多个同源类似物的表达被消除。

丝状真菌菌株

本发明也涉及包含双链可转录核酸构建体的丝状真菌菌株，该构建体包括第一核苷酸序列，其包含与目的基因的第一同源可转录区可操作连接的启动子；和第二核苷酸序列，其包含所述目的基因的第二同源可转录区，其中第一和第二同源区相互互补且第二同源区与第一同源区方向相反，其中第一、第二核苷酸序列形成一个包括与目的基因同源的区域的可转录双链多核苷酸，其中该双链多核苷酸在丝状真菌菌株中使目的基因的表达沉默。

丝状真菌菌株可以是任何在本发明方法中有用的丝状真菌菌株。“丝状真菌株”包括所有丝状形式的真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)亚类(由Hawksworth et al，1995，(同上)同上所定义)。丝状真菌以几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖及其他复合多糖构成的菌丝体壁为特征。营养性生长依靠菌丝延长且碳源代谢是必需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的营养生长依靠单细胞体出芽，且碳源代谢可以是发酵的。

在一个优选的方面，丝状真菌菌株是支顶孢属(Acremonium)，曲霉属，短柄霉属(Aureobasidium)，隐球酵母属(Cryptococcus)，Filibasidium，镰孢属(Fusarium)，腐质霉属(Humicola)，Magnaporthe，毛霉属(Mucor)，Myceliophthora，Neocallimastix，链孢霉属(Neurospora)，Paecilomyces，青霉属(Penicillium)，Piromyces，裂褶菌属(Schizophyllum)，踝节菌属(Talaromyces)，Thermoascus，Thielavia，Tolypocladium，或木霉属(Trichoderma)的菌株。

在一个更优选的方面，丝状真菌菌株是泡盛曲霉，烟曲霉(Aspergillusfumigatus)，臭曲霉(Aspergillus foetidus)，日本曲霉(Aspergillus japonicus)，构巢曲霉，黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个更优选的方面，丝状真菌菌株是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)，Fusarium cerealis，Fusarium crookwellense，黄色镰孢(Fusarium culmorum)，禾谷镰孢(Fusarium graminearum)，禾赤镰孢(Fusarium graminum)，异孢镰孢(Fusarium heterosporum)，合欢木镰孢(Fusarium negundi)，尖孢镰孢，网状镰孢(Fusarium reticulatum)，粉红镰孢(Fusarium roseum)，接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)，肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)，拟枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)，硫色镰孢(Fusarium sulphureum)，Fusarium torulosum，Fusarium trichothecioides，或Fusarium venenatum细胞。另一方面更优选地，丝状真菌菌株是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)，干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)，干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)，Ceriporiopsis caregiea，Ceriporiopsis gilvescens，Ceriporiopsis pannocinta，Ceriporiopsis rivulosa，Ceriporiopsis subrufa，虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)，灰盖鬼伞，毛革盖菌(Coriolus hirsutus)，Humicola insolens，Humicola lanuginosa，米赫根毛霉，嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)，粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)，产紫青霉(Penicillium purpurogenum)，Phanerochaete chrysosporium，射脉菌(Phlebiaradiata)，Pleurotus eryngu，Thielavia terrestris，长绒毛栓菌(Trametes villosa)，云芝(Trametes versicolor)，Trichoderma harzianum，康宁木霉(Trichodermakoningii)，Trichoderma longibrachiatum，里氏木霉，或Trichoderma viride。

一方面最优选地，米曲霉是保藏号为IFO 4177的米曲霉株。在另一个最优选的方面，Fusarium venenatum株为Fusarium venenatum A3/5，该株原以禾谷镰孢ATCC 20334保藏，最近被Yoder and Christianson，1998，Fungal Geneticsand Biology 23：62-80和O′Donnell et al.，1998，Fungal Genetics and Biology23：57-67重新分类为Fusarium venenatum；所述Fusarium venenatum株还可以是Fusarium venenatum的分类学上的等价物，不管其目前所知的是什么种名。另在一个优选的方面，所述Fusarium venenatum是WO 97/26330中公开的Fusarium venenatum A3/5或Fusarium venenatum ATCC 20334的形态变异株。另在一个优选的方面，里氏木霉菌株是里氏木霉ATCC 56765。

丝状真菌菌株可以以本身已知的方法进行转化，该方法涉及原生质体形成、原生质体转化以及细胞壁再生的方法。转化曲霉属和木霉属菌株的合适方法在EP 238023和Yelton et al.，1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 81：1470-1474中有记载。改造镰孢属菌种的合适方法在Malardieret al，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787中有记载。酵母可以用Beckerand Guarente，In Abelson，J.N.and Simon，M.I.，editors，Guide to YeastGeneticsand Molecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito et al.，1983，Journal of Bacteriology 153：163；和Hinnen et al，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1920中记载的方法改造。

编码生物物质的目的基因的表达的减少或消除，可以用本领域已知的特异性针对靶生物物质的方法检测。这些检测方法包括特异抗体的使用，高效液相层析，毛细微管电泳，酶产物的形成，酶底物的消失，或者SDS-PAGE。例如，酶分析可用于确定酶活性。确定酶活性的方法在本领域中对许多酶都是已知的(参见，例如，D.Schomburg and M.Salzmann(eds.)，Enzyme Handbook，SpringerVerlag，New York，1990)。

生产方法

本发明也涉及生产感兴趣生物物质的方法，包括：(a)在合适生产感兴趣生物物质的条件下培养丝状真菌菌株，其中该丝状真菌菌株包含双链可转录核酸构建体，其中该双链可转录核酸构建体包含第一核苷酸序列，其包含与编码非期望的生物物质的目的基因的第一同源可转录区操作性连接的启动子；和第二核苷酸序列，其包含该目的基因的第二同源可转录区，其中第一和第二同源区相互互补且第二同源区与第一同源区方向相反，其中由双链可转录核酸构建体编码的干扰RNA与目的基因RNA转录本相互作用以减少或消除编码非期望的生物物质的目的基因的表达；以及其中丝状真菌菌株包括编码感兴趣的生物物质的第三核苷酸序列；以及(b)从培养基中回收生物物质。

感兴趣的生物物质可以是本文中记载的任何生物物质。它可以是丝状真菌菌株的天然或外源物质。非期望的生物物质的编码目的基因表达的减少或消除，可以导致其他感兴趣的生物物质表达的增加。非期望的生物物质可能直接影响感兴趣的生物物质的生产或表达。例如，非期望的生物物质是攻击感兴趣的生物物质从而降低其产量的蛋白酶。通过减少或消除蛋白酶的表达，更多的感兴趣的生物物质将被表达和生产。或者，非期望的生物物质与感兴趣的生物物质共同分享一个或多个细胞处理过程，例如转录因子或分泌途径，从而降低了感兴趣的生物物质的产量。通过减少或消除非期望的生物物质的表达，更多的细胞处理过程，例如表达限制性转录元件，将被感兴趣生物物质有效利用，从而增加感兴趣的生物物质表达和生产的量。另外，非期望的生物物质可以是毒素，其污染感兴趣的生物物质从而阻止其在特定条件下的使用，例如在食品加工中需要使用的酶。

在本发明生产方法中，丝状真菌菌株用本领域已知的方法在适合生产感兴趣的生物物质的营养培养基中培养。例如，菌株可以在摇瓶中培养，也可以在实验室或工业发酵罐中有合适培养基以及在允许生物物质表达和/或分离的条件下小规模或大规模发酵培养(包括连续、分批、分批补料和固态发酵)。培养用本领域已知的方法在包括碳源、氮源和无机盐的适合营养培养基中进行。合适的培养基可以商业获得或者可以根据出版的组方制备(例如，美国典型培养物保藏中心目录)。如果生物物质被分泌在营养培养基中，那么该物质可直接从培养基中回收。如果生物物质不分泌，那么该物质可从细胞裂解物中回收。

感兴趣的生物物质可以用本领域已知的对生物物质特异的方法检测。这些检测方法包括特异抗体的使用，高效液相层析，毛细微管电泳，酶产物的形成，酶底物的消失，或者SDS-PAGE。例如，酶分析可用于确定酶活性。确定酶活性的方法在本领域中对许多酶都是已知的(参见，例如，D.Schomburg andM.Salzmann(eds.)，Enzyme Handbook，Springer Verlag，New York，1990)。

所获感兴趣的生物物质可以用本领域的方法分离。例如，感兴趣的多肽可以用常规方法从培养基中分离，常规方法包括但不限于离心，过滤，萃取，喷雾干燥，蒸发，或沉淀。所分离多肽可进一步用本领域已知的各种方法纯化，该方法包括但不限于层析(例如离子交换层析，亲和层析，疏水层析，聚焦层析及大小排阻层析)，电泳(例如制备级等点聚焦电泳(IEF))，溶解度差异(例如硫酸铵沉淀)，及萃取(参见例如，Protein Purification，J.-C.Janson andLars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。感兴趣的代谢物可以用例如萃取，沉淀，溶解度差异，或本领域任何已知方法从培养基中分离。所分离代谢物可进一步用代谢物合适的方法纯化。

核苷酸序列

编码感兴趣的生物物质的核苷酸序列可以从任何原核、真核或其他来源的生物获得。就本发明而言，在本文中术语“从......获得”与某来源一起使用时，是指生物物质通过该来源生产或者通过插入了该来源基因的细胞生产。

分离或克隆编码感兴趣的生物物质的核苷酸的技术是本领域已知的，该技术包括从基因组DNA的分离，从cDNA的制备，或者它们的组合。从上述基因组DNA进行核苷酸序列克隆，例如可以通过已知的聚合酶链反应(PCR)进行。参见例如，Inniset al.，1990，PCR Protocols ：AGuide to Methods andApplication，Academic Press，New York。克隆过程可能需要进行包含编码生物物质的核酸序列的所述期望核苷酸片段的剪切与分离，片段至载体的插入，以及重组载体至丝状真菌菌株细胞的整合，其中核酸序列的多拷贝或多克隆在细胞中复制。核苷酸序列可以是基因组序列，cDNA，RNA，半合成的，合成来源的，或它们的任意组合。

核酸构建体

编码感兴趣的生物物质的核苷酸序列可能包含在丝状真菌菌株的核酸构建体中。核酸构建体包括与至少一个启动子和一个或多个调控序列可操作性连接的编码感兴趣的生物物质的核苷酸序列，其中调控序列在调控序列适合的条件下指导核苷酸序列在丝状真菌菌株中表达。表达理解为包括感兴趣的生物物质生产所涉及的任何步骤，其包括但不限于转录，转录后修饰，翻译，翻译后修饰，以及分泌。

“核酸构建体”在本文中是指单链或双链的核酸分子，其分离自天然基因，或者其被修饰，使得其含有以自然界中本不存在的组合及并置方式存在的核酸片段。当核酸构建体包括编码序列和编码序列表达所需的所有调控序列时，术语核酸构建体与术语表达框同义。

分离的编码感兴趣的生物物质的核苷酸序列可进一步通过各种方式操作以便于生物物质的表达。取决于表达载体，插入载体之前的核苷酸序列操作可能是适宜的或必需的。用DNA重组方法修饰核酸序列的技术是本领域周知的。

核苷酸序列可以包括一个或多个天然调控序列，或者一个或多个天然调控序列可以被一个或多个相对于所述核苷酸序列外源的调控序列取代以提高编码序列在宿主细胞中的表达。

术语“调控序列”在本文中指包括对感兴趣的生物物质表达必要或有利的所有组件。每一调控序列对于编码生物物质核苷酸序列而言可以是天然的或外源的。这样的调控序列包括但不限于前导序列，聚腺苷酸化序列，前肽序列，启动子，信号肽序列，和转录终止序列。至少，调控序列包括启动子，转录及转录终止信号。调控序列可以带有接头(linkers)，用于导入特异限制性位点，以便于将调控序列与编码感兴趣的生物物质的核苷酸序列编码区连接。

调控序列可以是合适的转录终止序列，该序列被宿主细胞识别终止转录。终止序列可操作性连接于生物物质的编码核酸序列的3’端。任何在所选择的丝状真菌菌株中起作用的终止序列都可以用在本发明中。

优选用于丝状真菌菌株的终止序列可以从米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，构巢曲霉氨基苯甲酸酯合酶，黑曲霉α-葡萄糖苷酶，以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶基因获得。

调控序列也可以是合适的前导序列，该序列是对丝状真菌菌株翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作性连接于编码生物物质的核酸序列5’端。任何在所选择的丝状真菌菌株中起作用的前导序列都可以用在本发明中。

优选用于丝状真菌菌株的前导序列可以从米曲霉TAKA淀粉酶，构巢曲霉丙糖磷酸异构酶，Fusarium venenatum胰蛋白酶，以及Fusarium venenatum葡糖淀粉酶基因获得。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，该序列可操作性连接于核酸序列3’端，在转录后，该序列作为添加聚腺苷酸残基至被转录的mRNA的信号被宿主细胞识别。任何在所选择丝状真菌菌株中起作用的聚腺苷酸化序列都可以用在本发明中。

优选用于丝状真菌菌株的聚腺苷酸化序列可以从米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，构巢曲霉氨基苯甲酸酯合酶，尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶，以及黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因获得。

调控序列也可以是信号肽编码区，该编码区编码与多肽氨基末端相连的氨基酸序列，指导编码多肽进入细胞分泌途径。核酸序列的编码序列的5’端可以固有地包含信号肽编码区，其在开放阅读框中天然地与分泌多肽编码区片段相连。或者，编码序列5’端可以包含与编码序列异源的信号肽编码区。当编码序列天然地不包含信号肽编码区时，外源信号肽编码区可能是需要的。或者，外源信号肽编码区可直接取代天然信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，任何可指导表达多肽进入所选择真菌宿主细胞分泌途径的信号肽编码区都可以用在本发明中。

有效的丝状真菌菌株信号肽编码区可以是获自米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉中性淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶，Humicolainsolens纤维素酶，以及Humicola lanuginosa脂肪酶基因的信号肽编码区。

调控序列也可以是前肽编码区，该编码区编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或多肽原(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。多肽原通常无活性，从多肽原催化或自身催化多肽原裂解，多肽原可转化为成熟活性多肽。多肽原编码区可以从酿酒酵母α-因子，米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶，以及嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)基因获得。

当信号肽和前肽区同时在多肽氨基末端出现时，前肽区位于多肽氨基末端，而信号肽区则与前肽区氨基末端相邻。

加入调节序列以相对于丝状真菌菌株生长调节生物物质的表达，也是适宜的。调节系统的例子是响应化学或物理刺激引起基因表达开启或关闭的那些系统，化学或物理刺激包括调节性化合物的存在。在丝状真菌菌株中，TAKAα-淀粉酶启动子，黑曲霉葡糖淀粉酶启动子，米曲霉葡糖淀粉酶启动子，以及Fusarium venenatum葡糖淀粉酶启动子都可以用作调节序列。调节序列的其他例子是帮助基因进行扩增的那些序列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲喋呤存在下进行扩增的二氢叶酸还原酶基因系统和在重金属存在下进行扩增的亲金属蛋白基因系统。在这些例子中，编码感兴趣生物物质核苷酸序列可操作性地与调节序列连接。

表达载体

编码感兴趣的生物物质核酸序列可包含在包括启动子、编码生物物质的核酸序列及转录和翻译终止信号的重组表达载体中。如上所述的各种核酸与调控序列可连接在一起产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个方便的限制性位点，允许启动子和/或编码生物物质的核酸序列在该位点插入或取代。可选择地，核苷酸序列可通过将核苷酸序列或包含启动子和/或序列的核酸构建体插入至合适的表达载体表达。在产生表达载体时，编码序列位于载体内以使编码序列可操作性地与启动子及一个或多个合适的调控序列连接用于表达。

重组表达载体可以是任何能方便进行重组DNA操作且能使核酸序列表达的载体(例如质粒或病毒)。所选择载体通常取决于载体与载体所导入宿主细胞之间的相容性。载体可以是线性或环状封闭质粒。

载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体存在且其复制不依赖染色体复制的载体，例如质粒，染色体外元件，微型染色体，或人工染色体。载体可包括任何以保证自我复制的要素。可选择地，载体可以是在导入宿主细胞后整合至基因组并与被整合染色体一起复制的载体。除此之外，也可以使用单个载体或质粒，或者两个或多个载体或质粒。该两个或多个载体或质粒一起包含整个要导入至宿主细胞基因组的DNA，或所使用的转座子。

载体优选地包含一个或多个可使转化细胞容易选择的选择标记。选择标记是一种基因，其产物有助于产生抗微生物素或病毒抗性，重金属抗性，原养型向营养缺陷型的转变，等等。用于丝状真菌菌株宿主细胞的选择标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)，argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)，bar(膦丝霉素乙酰转移酶)，hygB(潮霉素磷酸转移酶)，niaD(硝酸还原酶)，pyrG(乳清苷-5′-磷酸脱羧酶)，sC(硫酸腺苷转移酶)，trpC(氨基苯甲酸合酶)，及其等价物。优选用于曲霉属细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS与pyro基因，以及吸湿链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。优选用于镰孢属细胞的是bar，amdS，pyrG，或hygB基因。

载体优选包含帮助载体与宿主细胞基因组稳定整合或在细胞中不依赖基因组能自我复制的元件。

为了整合至丝状真菌菌株宿主细胞基因组，载体可依赖于编码生物物质的核酸序列或者其他载体元件通过同源或非同源重组稳定地整合至基因组。或者，载体可包含额外的指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组的核酸。额外的核酸序列能使载体在染色体中以精确的位置整合至宿主基因组。为了提高精确位置整合可能性，整合元件(integral elements)优选包含足够数量的核酸，例如100-10,000碱基对，优选400-10,000碱基对，最优选800-10,000碱基对，该核酸与相应靶序列高度相同以提高同源重组概率。整合元件可以是任何与宿主细胞基因组中靶序列同源的序列。除此之外，整合元件可以是非编码或编码核酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合至宿主细胞基因组中。

为实现自主复制，载体进一步包括能使在载体在所讨论宿主细胞中自主复制的复制起点。用于丝状真菌菌株细胞质粒复制子的例子是AMA1和ANS1(Gemsetal.，1991，Gene 98：61-67；Cullen et al.，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包含该基因质粒或载体的构建可根据WO 00/24883中公开的方法进行。复制原点可以有突变，该突变使其在宿主细胞行使功能时对温度敏感(参见例如，Ehrlich，1978，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 75：1433)。

多于一个的编码感兴趣的生物物质的核酸序列拷贝可插入至丝状真菌菌株以提高基因产物的生产。核酸序列拷贝数的增加可通过下面的途径实现：整合至少一个额外序列拷贝至宿主细胞基因组；或者在核酸序列中包含可扩增的选择标记基因，然后可以通过在合适选择剂的存在下培养细胞来选择那些含有所述选择标记基因的扩增拷贝，因而也就含有所述核酸序列的更多拷贝的细胞。

用于连接如上所述元件构建重组表达载体的方法是本领域技术人员周知的(参见例如Sambrook et al.，1989，同上)。

本发明通过下述实施例进一步描述，这些实施例并不应被解释为对发明范围的限制。

实施例

培养基与缓冲液

COVE筛选择平板每升由342.3g蔗糖，20ml COVE盐溶液，10mM乙酰胺，15mM CsCl₂，以及25g或30g Noble琼脂构成。

COVE2平板每升由30g蔗糖，20ml COVE盐溶液，10mM乙酰胺，以及25g或30g Noble琼脂构成。

COVE盐溶液每升由26g KCl，26g MgSO₄·7H2O，76g KH₂PO₄，以及50ml COVE微量金属元素构成。

COVE微量金属元素每升由0.04g NaB₄O₇·10H2O，0.4g CuSO₄5H₂O，1.2gFeSO₄·7H₂O，0.7g或1g MnSO₄·H₂O，0.8g Na₂MoO₂·2H₂O，以及10gZnSO₄·7H₂O构成。

COVE上层琼脂每升由342.3g蔗糖，20ml COVE盐溶液，10mM乙酰胺，以及10g低熔点琼脂构成。

纤维素酶诱导培养基每升由20g Arbocel-天然纤维素纤维(J.RettenmaierUSA LP)，10g玉米浆干粉(corn steep solid)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)，1.45g(NH₄)₂SO₄，2.08g KH₂PO₄，0.28g CaCl₂，0.42g MgSO₄·7H2O，0.42ml里氏木霉微量金属溶液，以及2滴pluronic酸构成。在高压灭菌前用10N NaOH调整pH至6.0。

里氏木霉微量金属溶液每升由216g FeCl₃·6H₂O，58g ZnSO₄·7H₂O，27gMnSO₄·H₂O，10g CuSO₄·5H₂O，2.4g H₃BO₃，以及336g柠檬酸构成。

YP培养基每升由10g酵母提取物和20g Bacto蛋白胨构成。

YPG培养基每升由4g酵母提取物，1g K₂HPO₄，0.5g MgSO₄，以及15.0g葡萄糖构成(pH 6.0)。

PEG缓冲液每升由500g PEG 4000，10mM CaCl₂，以及10mM Tris-HCl构成，pH 7.5，过滤灭菌。

STC每升由0.8M或1M山梨醇，10mM或25mM CaCl₂，以及10mM或25mM Tris-HCl构成，pH 7.5或pH 8，过滤灭菌。

STPC由40％PEG 4000溶解在STC中构成。

M400培养基每升由50g麦芽糖糊精，2g MgSO₄·7H₂O，2g KH₂PO₄，4g柠檬酸，8g酵母提取物，2g尿素，0.5g CaCl₂，以及0.5ml AMG微量金属溶液构成。

AMG微量金属溶液每升由6.8g ZnCl₂·7H2O，2.5g CuSO₄-5H₂O，0.24gNiCl₂·6H₂O，13.9g FeSO₄·7H₂O，13.5g MnSO₄·H₂O，以及3g柠檬酸构成。

基本培养基平板每升由6g NaNO₃，0.52g KCl，1.52g KH₂PO₄，1ml COVE微量金属元素，1g葡萄糖，500mg MgSO₄·7H₂O，342.3g蔗糖，以及20g Noble琼脂构成(pH 6.5)。

MLC每升由40g葡萄糖，50g豆粉，以及4g柠檬酸构成，pH 5.0。

MU-1每升由260g麦芽糊精(MD-11)，5g KH₂PO₄，3g MgSO₄·7H₂O，6gK₂SO₄，5ml AMG微量金属溶液，以及2g尿素构成，pH 4.5。

pH 6.5的CM-1琼脂平板每升由0.25g NaCl，0.5g MgSO₄·7H₂O，1.9gK₂HPO₄，3.6g KH₂PO₄，0.1ml微量金属溶液，30g Bacto琼脂(Difco)，pH 6.5，11ml 10％尿素，以及67ml 30％麦芽糖构成。

微量金属溶液(1000X)每升由22g ZnSO₄·7H₂O，11g H₃BO₃，5gMnCl₂·4H₂O，5g FeSO₄·7H₂O，1.6g CoCl₂·5H₂O，1.6g(NH₄)₆Mo₇O₂₄，以及50gNa₄EDTA构成。

PDA平板每升由39g马铃薯右旋糖琼脂(Potato Dextrose Agar)(Difco)构成。

实施例1：pAILo1表达载体的构建

表达载体pAILo1通过修饰pBANe6(美国专利6,461,837)构建，其包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的杂合启动子(NA2-tpi启动子)，黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶终止序列(AMG终止子)，以及构巢曲霉乙酰胺酶基因(amdS)。修饰pBANe6首先通过定点诱变去除距离amdS选择标记2051，2722，3397bp位置处的三个Nco I限制性位点。所有改变都是“沉默”改变，amdS基因产物的实际蛋白序列未发生变化。这三个位点去除用GeneEditor定点诱变试剂盒(Promega，Madison，WI)按照制造商的使用说明用下列引物(划线核苷酸代表改变的碱基)同时进行：

AMDS3NcoMut(2050)：5′-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3′(SEQ ID NO：1)

AMDS2NcoMut(2721)：5′-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3′(SEQ ID NO：2)

AMDS1NcoMut(3396)：5′-GGAGGCCATGAAGTGGACCAACGG-3′(SEQ ID NO：3)

接着，将包含有所有三个期望序列变化的质粒用QuickChange诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)进行定点突变，以消除在AMG终止子末端位置1643的Nco I限制性位点。使用下列引物(划线核苷酸代表改变的碱基)进行突变：

突变AMG终止序列的上游引物：

5′-CACCGTGAAAGCCATGCTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG-3′

(SEQ ID NO：4)

突变AMG终止序列的下游引物：

5′-CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGAGCATGGCTTTCACGGTGTCTG-3′(SEQ ID NO：5)

修饰pBANe6最后一步是用QuickChange诱变试剂盒及下列引物(划线核苷酸代表改变的碱基)在多接头起始部分加入新的Nco I限制性位点，以产生pAILo1(图1)。

突变NA2-tpi启动子的上游引物：

5′-CTATATACACAACTGGATTTACCATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3′(SEQ ID NO：6)

突变NA2-tpi启动子的下游引物：

5′-GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGTTGTGTATATAG-3′(SEQ ID NO：7)

实施例2：pMJ04表达载体的构建

表达载体pMJ04首先用如下所示引物993429(反义)和993428(有义)从里氏木霉RutC30基因组DNA对里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1基因(cbh1)进行PCR扩增。反义引物被设计为在5’端有PacI位点，有义引物5’端有Spe I位点。里氏木霉RutC30(ATCC 56765；Montenecourt andEveleigh，1979，Adv.Chem.Ser.181：289-301)来自里氏木霉Qm6A(ATCC13631；Mandels and Reese，1957，J.Bacteriol 73：269-278)。

引物993429(反义)：

5-AACGTTAATTAAGGAATCGTTTTGTGTTT-3′(SEQ ID NO：8)

引物993428(有义)：

5′-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-3′(SEQ ID NO：9)

扩增反应液(50μl)由1X ThermoPol反应缓冲液(New England Biolabs，Beverly，MA)，0.3mM dNTPs，100ng里氏木霉RutC30基因组DNA(用DNeasy Plant Maxi试剂盒分离，QIAGEN Inc.，Valencia，CA)，0.3μM引物993429，0.3μM引物993428，以及2单位Vent聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)构成。反应在Eppendorf Mastercycler 5333仪(Hamburg，Germany)上进行，程序如下：30个循环，每一循环94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒(最后延伸15分钟)。反应产物用40mM Tris碱-20mM乙酸钠-1mM EDTA二钠(TAE)缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上进行分离，从凝胶剪切229bp的产物条带，按照制造商使用说明用QIAquick Gel提取试剂盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)纯化。

所得PCR片段用Pac I和Spe I消化，用Rapid连接试剂盒(Roche，Indianapolis，IN)连接至用相同限制性酶消化过的pAILo1，产生pMJ04(图2)。

实施例3：pMJ06表达载体的构建

表达载体pMJ06首先用如下所示引物993696(反义)和993695(有义)从里氏木霉RutC30基因组DNA对里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1基因(cbh1)进行PCR扩增来构建。反义引物被设计为在有义引物5’端有Sal I位点，反义引物5’端有Nco I位点。

引物993695(有义)：

5′-ACTAGTCGACCGAATGTAGGATTGTT-3′(SEQ ID NO：10)

引物993696(反义)：

5′-TGACCATGGTGCGCAGTCC-3′(SEQ ID NO：11)

扩增反应液(50μl)由1X ThermoPol反应缓冲液，0.3mM dNTPs，100ng里氏木霉RutC30基因组DNA(用DNeasy Plant Maxi试剂盒制备)，0.3μM引物993696，0.3μM引物993695，以及2单位Vent聚合酶构成。反应在Eppendorf Mastercycler 5333仪上进行，程序如下：30循环，每一循环94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒(最后延伸15分钟)。反应产物用TAE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上分离，从凝胶剪切的988bp产物条带按制造商使用说明用QIAquick Gel提取试剂盒纯化。

所得PCR片段用Nco I和Sal I消化后，用Rapid连接试剂盒连接至用相同限制性酶消化过的pMJ04，产生pMJ06(图3)。

实施例4：pMJ09表达载体的构建

表达载体pMJ09用如下所示引物993843(反义)和99344(有义)从里氏木霉RutC30基因组DNA对里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1基因(cbh1)PCR扩增。反义引物被设计为5’端有Pac I和Spe I位点，有义引物5’端有Pvu I位点。

引物993844(有义)：

5′-CGATCGTCTCCCTATGGGTCATTACC-3′(SEQ ID NO：12)

引物993843(反义)：

5′-ACTAGTTAATTAAGCTCCGTGGCGAAAG-3′(SEQ ID NO：13)

扩增反应液(50μl)由1X ThermoPol反应缓冲液，0.3mM dNTPs，100ng里氏木霉RutC30基因组DNA(用DNeasy Plant Maxi试剂盒提取)，0.3μM引物993844，0.3μM引物993843，以及2单位Vent聚合酶构成。反应在Eppendorf Mastercycler 5333仪上进行，程序如下：30循环，每一循环94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒(最后延伸15分钟)。反应产物用TAE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上分离，从凝胶剪切473bp产物条带，按制造商的使用说明用QIAquick Gel提取试剂盒纯化。

所得PCR片段用Pvu I和Spe I消化后，用Rapid连接试剂盒连接至用Pac I和Spe I消化过的pMJ06，产生pMJ09(图4)。

实施例5：发酵和菌丝体组织

里氏木霉RutC30在Mandels and Weber，1969，Adv.Chem.Ser.95：391-413记载的纤维素酶诱导标准条件下生长。菌丝体样品用Whatman滤纸过滤收获，液氮迅速冷冻。样品-80℃保存直到将其破碎进行RNA提取。

实施例6：表达序列标签(ESTs)cDNA文库构建

用Timberlake and Barnard方法(1981，Cell 26：29-37)将细胞总RNA从实施例5所述菌丝体样品进行提取，从1％甲醛-琼脂糖凝胶印迹之后RNA样品用Northern杂交分析(Davis etal.，1986，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier Science Publishing Co.，Inc.，New York)。按制造商使用说明用mRNA Separator Kit^TM试剂盒(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)将聚腺苷酸化mRNA级分从总RNA中分离。

除了Not I-(dT)18引物(Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，NJ)用于引发第一链合成外，其它按Gubler and Hoffman方法(1983，Gene 25：263-269)用约5μg poly(A)+mRNA合成双链cDNA。cDNA用绿豆核酸酶(BoehringerMannheim Corporation，Indianapolis，IN)处理，末端用T4DNA聚合酶(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)平头钝化。然后，将BamHI/EcoR I衔接子连接至cDNA平头末端。用Not I消化之后，cDNA用TAE缓冲液0.7％琼脂糖凝胶电泳进行大小选择(约0.7-4.5kb)，与pYES2(Invitrogen，Carlsbad，CA)连接。该pYES2已用Not I和BamH I酶切且用牛肠碱性磷酸酶去磷酸化(Boehringer Mannheim Corporation，Indianapolis，IN)。

按制造商使用说明将连接混合物用于转化感受态大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。转化体在补加终浓度为50μg/ml氨苄青霉素的2YT琼脂平板(Miller，1992，A Short Course in Bacterial Genetics.A LaboratoryManual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，New York)上选择。

实施例7：模板制备和cDNA克隆核苷酸测序

从实施例6记载的cDNA文库中，直接从2YT平板挑选约7000个转化克隆至含有100μl补加有50μg/ml氨苄青霉素的2YT肉汤的96孔微滴定板中。滴定板200rpm振荡37℃温育过夜。温育后，每孔加入100μl 50％灭菌甘油。将转化体影印到每孔含有1ml补加有50μg/ml氨苄青霉素的Magnificent Broth^TM肉汤(MacConnell Research，San Diego，CA)的二级深孔(deep-dish)96孔微培养板中(Advanced Genetic Technologies Corporation，Gaithersburg，MD)。原始微滴定板-80℃冷冻储存。二级深孔板旋转摇床强振荡(300rpm)37℃温育过夜。为了防止散落、交叉污染，以及为了充分通气，每个二级培养板用聚丙烯垫(Advanced Genetic TechnologiesCorporation，Gaithersburg，MD)和塑料微滴定盘盖覆盖。

将DNA用Utterback et al(1995，Genome Sci.Technol 1：1-8)修改的Advanced Genetic Technologies Corporation(Gaithersburg，MD)96孔Miniprep试剂盒方法从每孔分离。单次(single-pass)DNA测序在Perkin-Elmer AppliedBiosystems Model 377XL自动DNA测序仪上(Perkin-Elmer/AppliedBiosystems，Inc.，Foster City，CA)使用末端染色化学(Giesecke et al.，1992，Journal of Virology Methods 38：47-60)及T7测序引物进行：

T7引物：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′(SEQ ID NO：14)

实施例8：cDNA克隆的DNA序列数据分析

对核苷酸序列数据进行定性分析，去掉载体序列和DNA序列末端模棱两可的碱基判定，所有序列借助PHRED/PHRAP软件(University ofWashington，Seattle，WA)进行相互比对。将所得序列重叠群(contigs)和单碱基差异(singletons)翻译为6个阅读框(frames)，并使用GeneMatcher^TM软件(Paracel，Inc.，Pasadena，CA)在公众可访问的蛋白数据库中检索，该软件使用改进的Smith-Waterman算法，该算法使用BLOSUM 62矩阵。

实施例9：编码家族6纤维二糖水解酶II(Cel6A)的cDNA克隆的鉴定

编码家族6纤维二糖水解酶(Cel6A)的推定的cDNA克隆通过将装配的ESTs的推定的氨基酸序列与公众可访问的数据库，例如Swissprot，Genpept，以及PIR中所存的蛋白序列进行比较来鉴定。选择一个克隆里氏木霉ESTTr0749，进行核苷酸序列分析，分析显示其有包含SEQ ID NO：15所示1413bp开放阅读框及SEQ ID NO：16所示推定氨基酸序列的1747bp pYES2的插入。含里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II的质粒命名为pTr0749。

实施例10：pSMai148表达载体的构建

构建表达载体pSMail48来转录来自里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II基因的双链RNA(ds-RNA)以在里氏木霉RutC30株中沉默里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II基因的表达。质粒pSMail48用如下所示引物994991(反义)和994990(有义)通过从pTr0749210bp里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II编码区PCR扩增来产生。反义引物设计为5’端有EcoR I位点，有义引物5’端有Nco I位点。

引物994991(反义)：

5′-GGAATTCTAGTTCTTATATTTGGCGACGCCACCATCT-3′(SEQ ID NO：17)

引物994990(有义)：

5′-CATGCCATGGAAAGGTTCCCTCTTTTATGTGGCTAG-3′(SEQ ID NO：18)

扩增反应液(50μl)由1X ThermoPol反应缓冲液，0.3mM dNTPs，10ng pTr0749，0.3μM引物994990，0.3μM引物994991，以及2.5单位Taq聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)构成。反应在EppendorfMastercycler 5333仪上进行，程序如下：30循环，每循环94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒(最后延伸15分钟)。反应产物用TAE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上分离。从凝胶剪切227bp产物条带，按制造商使用说明用QIAquick Gel提取试剂盒进行纯化。

另外的PCR用如下所示引物994993(反义)和994992(有义)从pTr0749扩增337bp的里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II编码区片段来进行。反义引物设计为5’端有EcoR I位点，有义引物5’端有Pac I位点。

引物994993(反义)：

5′-GGAATTCTGACTGAGCATTGGCACACTTTGGAGTAC-3′(SEQ ID NO：19)

引物994992(有义)：

5′-CCTTAATTAAAAAGGTTCCCTCTTTTATGTGGCTAG-3′(SEQ ID NO：20)

扩增反应液(50μl)由1X ThermoPol反应缓冲液，0.3mM dNTPs，10ng pTr0749，0.3μM引物994992，0.3μM引物994993，以及2.5单位Taq聚合酶构成。反应在Eppendorf Mastercycler 5333仪上进行，程序如下：30循环，每循环94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒(最后延伸15分钟)。反应产物用TAE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上分离。从凝胶剪切354bp产物条带按制造商使用说明用QIAquick Gel提取试剂盒纯化。

所获里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II PCR片段用Pac I和EcoR I消化，反向连接至Nco I和EcoR I所消化的里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II PCR片段(来自第一次PCR)的下游。该尾对尾重复(图5)按制造商使用说明用T4DNA连接酶(Roche，Indianapolis，IN)连接至Pac I和Nco I消化的pMJ09载体而产生pSMai148(图6)。

实施例11：用具有Cel6A纤维二糖水解酶II基因反向重复片段的表达构建体转化里氏木霉

为了显示双链RNA(ds-RNA)介导的干扰在里氏木霉中发生，将表达Cel6A纤维二糖水解酶II序列的自互补发夹RNA的pSMai148表达载体转化至里氏木霉RutC30原生质体。使用pSMai148亲本载体——pMJ09质粒(“空载体”)(图4)作为对照。上述两种构建体都包含amdS基因，该基因提供可在乙酰胺为唯一氮源培养基上生长的选择性；在pSMai148质粒中的里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II序列被置于纤维素强诱导的里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1启动子之下。

原生质体制备和转化按Penttila et al.，1987，Gene 61：155-164改进的方法进行。简而言之，将里氏木霉RutC30培养在25ml补加有2％(w/v)葡萄糖和10mM尿苷的YP培养基中，27℃轻微振荡(90rpm)17小时。菌丝体用Millipore Vacuum Driven Disposable过滤系统(Millipore，Bedford，MA)过滤收集，用去离子水洗两次，1.2M山梨醇洗两次。在20ml每ml含15mg

200G(NovozymesSwitzerland AG，Neumatt，Switzerland)和0.36单位几丁质酶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的1.2M山梨醇溶液中34℃轻微振荡(90rpm)下悬浮所洗菌丝体15-25分钟产生原生质体。400xg离心7分钟收集原生质体，冷1.2M山梨醇洗两次。原生质体用血球计数器计数，在STC中重悬至终浓度1x10⁸原生质体/ml。多余原生质体在-80℃下储存于Cryo 1℃ Freezing Container(Nalgene，Rochester，NY)。

将约7μg用Pme I消化的表达质粒(pSMai148或pMJ09)加入至100μl原生质体溶液中，缓慢混合。加入PEG缓冲液(250μl)，混合，室温温育30分钟。接着加入STC(3ml)，混合，铺板于COVE板。板在28℃温育5-7天。转化体在COVE2板上分培养，28℃生长。

实施例12：用SDS-聚丙烯酰胺凝胶检测里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II蛋白

随机选择20个含有里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II反向重复片段的转化体(SMA148-01至SMA148-20)和10个含有“空载体”的转化体(MJ09-01和MJ09-10)，将转化体的芽孢接种培养在含25ml pH6.0的纤维素诱导培养基的125ml带挡流板的摇瓶中，28℃，200rpm，温育7天。里氏木霉RutC30作为对照。接种后第7天分离培养液样品，微型离心机15,700xg离心5分钟，移出上清液至新管。

通过在SDS-PAGE凝胶上分析整个培养液，在蛋白水平上对里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II沉默程度进行初部评估。SDS-PAGE使用Criterion^TMTris-HCl凝胶(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)在Criterion^TM电泳槽中(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)进行。将5μl第7天样品悬浮在2X浓度的Laemmli样品缓冲液中(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，在5％β-巯基乙醇存在下煮沸3分钟。所有样品加至聚丙烯酰胺凝胶中，1X Tris/甘氨酸/SDS电泳缓冲液中(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)电泳。所得凝胶用Bio-Safe^TM考马斯亮蓝染色(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)。

SDS-PAGE分析显示，大多数带有里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II反向重复片段的里氏木霉RutC30转化体(SMA148-01至SMA148-20)与携带“空载体”的转化体(pMJ09-01至pMJ09-10)相比，里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II蛋白生产量大大降低。一个转化体(转化体14)显示该蛋白完全缺失。

选择6个显示出里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II蛋白的不同程度的减少的SMA148转化体(转化体1，2，11，12，13，14)和2个“空载体”转化体(MJ09-03和MJ09-04)作进一步分析。将这些转化体进行两轮单孢分离以获得纯株。这些单孢分离转化体在28℃下生长于25ml纤维素酶诱导培养基(pH 5.0)。另外，宿主菌(里氏木霉RutC30)和通过同源重组敲除了里氏木霉Cel6A基因的阳性对照菌(里氏木霉SaMe02)也在相同条件下培养。接种后第3天从每个样品收集上清液和菌丝体，进行上述SDS-PAGE分析。

SDS-PAGE分析显示，单孢分离进一步减少了产生的里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II的水平，推定是因为由于单孢纯化，转化体更加纯合。

实施例13：里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II mRNA Northern印迹检测

Northern杂交用于确定里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II反向重复片段(pSMail48)在菌株中整合是否导致里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶IImRNA量减少。按稍微改进的制造商提供的方法，用Fenozol^TM(ActiveMotif，Carlsbad，CA)从实施例11中获得的冷冻菌丝体中提取总RNA。简而言之，将冷冻菌丝体用电动咖啡研磨机带少许干冰研磨成细粉。研磨后的菌丝体与20ml Fenozol^TM混合，搅拌，50℃水浴温育15分钟，之后加入5ml氯仿(Sigma，St.Louis，MO)，涡旋混合，室温静置10分钟。接着，样品室温700x g离心20分钟，水相转移至新管，加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇。样品涡旋混合后再700xg旋转离心10分钟，顶层水相加入等体积氯仿。样品再一次700xg离心10分钟，水相转移至含0.5ml 3M pH 5.2乙酸钠和6.25ml异丙醇的管中。将样品室温下混合温育15分钟，13400xg离心30分钟回收RNA。RNA用70％乙醇洗涤，离心，干燥，重悬于DEPC水。抽提RNA的数量和质量按制造商使用说明用Agilent 2100 Bioanalyzer(AgilentTechnologies，Wilmington，DE)联合RNA 6000 Nano

试剂盒(Agilent Technologies，Wilmington，DE)评估。

所分离的总RNA用1％琼脂糖/甲醛凝胶电泳4-6小时进行分离，然后按制造商推荐使用方法用Turboblotter仪经过14-16小时(Schleicher & SchuellBioScience，Keene，NH)印迹至Nytran SuperCharge膜(Schleicher & SchuellBioScience，Keene，NH)。膜首先与505bp毛地黄毒苷标记的里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II探针杂交，该探针通过用如下所示引物996118(反义)和996117(有义)进行PCR时引入毛地黄毒苷-11-dUTP而合成：

引物996118(反义)：

5′-AAATCGTGGCGCACTGCTGT-3′(SEQ ID NO：21)

引物996117(有义)：

5′-TGAGTGCATCAACTACGCCG-3′(SEQ ID NO：22)

扩增反应液(50μl)由1X ThermoPol反应缓冲液，5μl PCR DIG标记混合物(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN，USA)，10ng pTr0749，0.3μM引物996118，0.3μM引物996117，以及2.5单位Taq聚合酶构成。反应在Eppendorf Mastercycler 5333仪上进行，程序如下：30循环，每循环94℃30秒，50℃30秒，72℃30秒(最后延伸15分钟)。5微升PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上TAE缓冲液中进行大小分选，溴化乙锭染色，UV透射灯显现。分子量增加显示毛地黄毒苷的引入。

杂交在DIG Easy Hyb缓冲液中(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN，USA)50℃下进行15-17小时。接着，将膜在室温2X SSC+0.1％SDS的高严紧度条件下洗涤5分钟之后，在50℃下用0.1X SSC+0.1％SDS再洗涤两次，每次各15分钟。探针-靶核酸杂交体按制造商使用说明通过化学发光分析(Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)检测。之后，杂交膜在50％甲酰胺/5％SDS/50mM Tris-HCl，pH 7.5，80℃下剥离(stripped)2小时，用407bp使用上述完全相同方法制备的毛地黄毒苷标记的里氏木霉肌动蛋白1编码基因(登记号X75421)(Matheucci et al.，1995，Gene 161：103-106)探针二次杂交。407bp肌动蛋白1基因探针通过在如下所示的引物996120(反义)和996119(有义)进行PCR时引入毛地黄毒苷-11-dUTP而成：

引物996120(反义)：

5′-GTCAACACGACGAATGGCGT-3′(SEQ ID NO：23)

引物996119(有义)：

5′-TGATCGGTATGGGTCAGAAGG-3′(SEQ ID NO：24)

扩增反应液(50μl)由1X ThermoPol反应缓冲液，5μl PCR DIG标记混合物(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN，USA)，100ng里氏木霉RutC30基因组DNA(用DNeasy Plant Maxi试剂盒分离)，0.3μM引物996119，0.3μM引物996120，以及2.5单位Taq聚合酶构成。反应在EppendorfMastercycler 5333仪上进行，程序如下：30循环，每循环94℃30秒，50℃30秒，72℃30秒(最后延伸15分钟)。

5微升PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上用TAE缓冲液进行大小分离，溴化乙锭染色，UV透射灯察看。分子量增加显示了毛地黄毒苷的引入。

Northern印迹显示，带有里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II反向重复片段的转化体，与“空载体”转化体(阴性对照)和宿主菌(里氏木霉RutC30)相比，所产生的里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II转录本显著地减少。在转化体11和14中该结果中特别值得注意，其中里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II mRNAs检测不到，尽管肌动蛋白1基因转录本清晰存在(肌动蛋白1用作RNA等上样量对照)。里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II mRNA的表观上100％的抑制与这些转化体中里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II蛋白100％的减少显著相关，表明木霉中的RNA干扰是可用于翻译的靶mRNA的量的减少所造成的。

实施例14：用实时反转录PCR检测里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II mRNA

里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II mRNA在不同转化体中的相对表达水平可用实时反转录PCR(RT-PCR)定量。按实施例13所描述的，从每个转化体中提取总RNA用作RT-PCR反应的模板。里氏木霉肌动蛋白1基因用作内对照。用Primer Express^TM软件(Applied Biosystems，Foster City，CA)设计引物。按适合度产生引物列表后，选择第一组3’端最后5个碱基中不多于2个G+C的引物。所用引物如下：

里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II正向引物(996006)：

5′-CTGGTCCAACGCCTTCTTCAT-3′(SEQ ID NO：25)

里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II反向引物(996007)：

5′-GGAACGTAGTGAGGCTCGCTAA-3′(SEQ ID NO：26)

里氏木霉肌动蛋白1正向引物(996121)：

5′-CATGGCTGGTCGTGATCTTACC-3′(SEQ ID NO：27)

里氏木霉肌动蛋白1反向引物(996122)：

5′-CCTTGATGTCACGGACGATTTC-3′(SEQ ID NO：28)

RT-PCR分析用ABI

7700分析系统(Applied Biosystems，FosterCity，CA)和

Green PCR master mix(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行。每反应混合物总体积25μl中含有12.5μl

Green PCRMaster Mix，6单位SuperscriptII(Invitrogen，Carlsbad，CA)，0.83μM正向引物，0.83μM反向引物，以及各种浓度RNA模板。反转录在50℃下进行30分钟，接着在95℃下SuperscriptII失活和

激活10分钟。40PCR循环在下列条件下进行：95℃15秒变性，60℃1分钟退火延伸。每样品制备三份。在每测试板上用无SuperscriptII的阴性对照来评估特异性。而且，因为

Green非特异性结合双链DNA，所以取一等份PCR扩增产物在2.0％琼脂糖凝胶用TAE缓冲液电泳以证实没有非特异性扩增。

来自ABI PRISM 7700序列检测系统的数据用ABI用户须知#2(AppliedBiosystems，Foster City，CA)所记载“相对定量标准曲线法”分析。该方法中，处理过的样品的表达量相对于未处理的对照样品进行计算。处理过的样品的量通过标准曲线确定后，除以未处理对照样品的量。由此，未处理样品设定为1X样品，则所有其它量相对于未处理样品表述为n倍的区别。接着，将处理样品的量相对于内对照肌动蛋白1均一化(normalize)，以补偿各个反应中加入的总RNA量的不同。

图7显示，与“空载体对照”相比，转化体14和阳性对照株(SaMe02)的里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II mRNA相对表达水平最低，该结果与Northern杂交数据显著相关。

实施例15：用抑制差减杂交(SSH)从里氏木霉构建差减均一化cDNA 文库

里氏木霉RutC30株用基础Celluclast^TM培养基在发酵条件下培养于2升Applikon试验室发酵罐。碳源包括葡萄糖，纤维素，或预处理洗涤过的玉米秸。所有碳源按相当于每升52g葡萄糖的量上料。发酵方法使用温度28℃，pH 4.5，生长时间约120小时。除了碳源，所有发酵每升含有下列培养基成分：5g葡萄糖，10g玉米浆干粉，2.08g CaCl₂，3.87g(NH₄)₂SO₄，2.8gKH₂PO₄，1.63g MgSO₄·7H₂O，0.75ml微量金属，以及1.8ml pluronic酸。微量金属溶液每升由216g FeCl₃·6H₂O，58g ZnSO4·7H₂O，27g MnSO₄·H₂O，10g CuSO₄·5H₂O，2.4g H₃BO₃，以及336g柠檬酸构成。菌丝体样品接种后1，2，3，4，5天取样，用Miracloth^TM(Calbiochem，La Jolla，CA)通过过滤从培养基迅速分离，液氮冷冻，-80℃保存。

总细胞RNA用有稍微改动的Timberlake and Barnard，1981((同上)同上)的方法从在葡萄糖，纤维素，或预处理玉米秸(实施例1)上培养得到的冷冻细胞中分离。RNA提取缓冲液通过加入新制对-氨基水杨酸溶液(80ml DEPC处理水中含9.6g)至三异丙基萘磺酸溶液(80ml DEPC处理水中含1.6g)而制备。将该混合物加入40ml 5X RNB溶液中(1M Tris-HCl，pH 8.5，1.25MNaCl，0.25M EGTA)搅拌。冷冻菌丝体用电动咖啡研磨机随几块干冰研磨成细粉。研磨菌丝体直接倒入在冰上的20ml RNA提取缓冲液，加入等体积的TE-饱和苯酚。剧烈振荡之后，样品在2500rpm下离心10分钟(装备H1000B转子的Sorvall RT7离心机)分层。将水相转移至含10ml苯酚和10ml氯仿-异戊醇(24∶1)的新管中，同时在苯酚相另外加入5ml提取缓冲液。后一混合物在68℃下温育5分钟以释放在多核糖体和界面物质中的RNA。温育之后，该管在2500rpm下(装备H1000B转子Sorvall RT7离心机)离心10分钟，水相与第一次提取所得水相合并。将该混合物用苯酚-氯仿反复抽提，直到界面处不再有蛋白(通常5次或6次)。RNA用pH5.2的0.3M乙酸钠和50％异丙醇沉淀之后通过离心回收。由大约1-2克实验室规模发酵所产冷冻菌丝体所构成的每个样品中可获得0.4-1.8mg总细胞RNA。

来自在纤维素和PCS生长的培养物的RNA质量可用甲醛-琼脂糖凝胶电泳之后再进行里氏木霉cbh1特异探针Northern印迹杂交(Thomas，1980，Proc.Nat.Acad Sci.USA 77：5201-5205)来评价。cbh1探针片段可基于EMBL数据库公开的核苷酸序列信息(登记号E00389)用标准PCR方法扩增。探针用辣根过氧化物酶(HRP)标记，使用North2South Direct HR标记检测试剂盒(Pierce，Rockford，IL)所提供的缓冲液和方法在55℃下进行杂交。印迹在55℃下用2XSSC+0.1％SDS洗涤三次，每次5分钟，之后再用2X SSC(没有SDS)洗涤三次，每次5分钟。印迹X射线胶片曝光清楚显示，基本上每道中的所有杂交信号都在包含在一种1.8kb的cbh1 mRNA之内，该mRNA迁移位置恰好稍稍在18S核糖体RNA带之上。放射自显影照片或溴乙锭凝胶染色的凝胶上，都没有显示mRNA有显著降解。聚腺苷化(polyA+)mRNA级分按制造商使用说明(QIAGEN，Valencia，CA)用Oligotex^TM mRNA分离试剂盒纯化。每个样品polyA+mRNA产量在2μg-25μg之间。每mRNA级分接着用里氏木霉来源γ-肌动蛋白和cbh1基因的HR标记探针通过Northern印迹杂交分析。γ-肌动蛋白探针片段用标准PCR法和下列基因特异引物扩增。

5′-CCAGACATGACAATGTTGCCGTAG-3′(SEQ ID NO：29)

5′-TTTCGCTCTTCCTCACGCCATTG-3′(SEQ ID NO：30)

正如所预料那样，杂交信号在每道中位于γ-肌动蛋白和cbh1 mRNA相应带上(分别约1.2kb和1.8kb)，显示mRNA样品质量好，适于cDNA合成。

使用Diatchenko et al.，1996(同上)(同上)所记载的抑制差减杂交法(SSH)从里氏木霉RutC30产生了cDNA库(pool)，该cDNA库富集了被纤维素和PCS诱导的序列，并且进行了均一化以帮助回收低丰度转录本。下表1列出了用于实验的驱动组(driver)和试验组(tester)cDNAs组合。

表1.SSH驱动组和试验组cDNA池

SSH反应	对照组cDNA来源	试验组cDNA来源
			1	以葡萄糖培养的细胞	以PCS培养的细胞
2	以葡萄糖培养的细胞	以纤维素培养的细胞
			3	以纤维素培养的细胞	以PCS培养的细胞

表1SSH反应所得cDNA池用于产生被纤维素及PCS诱导的序列的差减文库。将来自每个时间点(1-5天)的400ng polyA⁺mRNA一起合并为2μg的模板用于cDNA合成。cDNA合成与差减用PCR-Select^TM试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)进行。该方法基于Diatchenko et al.，1996，(同上)所述的差减杂交法(SSH)。整个方案显示在图1中。首先，将来自三个分别生长在葡萄糖，纤维素和PCS的里氏木霉RutC30发酵物的mRNA用PCR-Select^TM试剂盒试剂(Clontech，Palo Alto，CA)转变成双链cDNA。差异表达的cDNAs在“试验组”cDNA库(即，来自纤维素或玉米杆的生长细胞)和“驱动组”cDNA库中都存在，但在“驱动组”库中以低得多的丰度存在(表1)。这两个cDNA池用限制性酶Rsa I消化，该限制性酶识别四碱基对回文结构，产生平头末端(GT|AC)。接着，将试验组cDNA池分为两份，与两种不同寡核苷酸衔接子(由Clontech PCR-SelectTM试剂盒提供)连接，形成两群试验组cDNA。衔接子设计成没有5’-磷酸基团以使只有每个衔接子的长链能与cDNA 5’端共价连接。

在第一次两组杂交中，在Clontech PCR-Select^TM试剂盒说明的条件下，将过量的驱动组cDNA加入至每份试验组cDNA中。混合物加热至95℃变性后退火。退火产生了四种类型分子(称为a，b，c，d分子)。a型分子包括等浓度的高、低丰度的cDNAs，因为cDNA池中高丰度分子的杂交二级动力学更快，它们优先形成b型分子。同时，a型分子中的差异表达(例如纤维素或PCS诱导的差异表达)序列被大量富集，这是因为共有的非靶cDNAs与驱动组形成了c型分子。在第二次杂交中，将两池初级杂交产物合并，以使每试验组中a型分子能结合形成新类型e型杂交体。e型杂交体是在两末端带有不同接头序列的双链试验组分子。再加入新变性驱动组cDNA以进一步富集差异表达序列e分子池。

SSH方法最后一步，用PCR将差异表达cDNAs选择性地扩增(在PCR-Select^TM试剂盒说明的条件下)。只有具有两个不同引物退火位点的e型分子才被指数性地扩增。

作为质量检测，将大约360个随机挑取的cDNA克隆用AmershamTempliPhi试剂盒滚环扩增纯化，并进行DNA测序分析(来自反应1：70个克隆，来自反应2：96个克隆，来自反应3：192个克隆)。TranscriptAssembler^TM软件(Paracel，Inc.，Pasadena，CA)序列聚类分析显示，每个池中都含有高百分比的非冗余克隆——反应1为76％，反应为290％，反应3为67％。另外，该分析中鉴定的重叠群(相同cDNA的交叉重叠序列)平均只含有两个序列。总之，这些结果表明文库在SSH反应中实现了充分的均一化，从而在相应cDNA文库中产生了低冗余水平。这些差异表达序列在最后的差减cDNA库中被高度富集，可用作杂交探针或产生差减文库。

SSH方法产生的差减均一化cDNA片段与pCRII-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)连接，将连接混合物转化电感受态大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。转化体在含250μg/ml X-Gal(不含IPTG)和终浓度100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板(Miller，J.H.1992.A short course inbacterial genetics.A laboratory manual and handbook for Escherich ia coli andrelated bacteria.Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)上筛选。

为了评估SSH cDNA文库的差减和均一化效果，使用下列两种方法：菌落杂交和对来自每个SSH文库的随机克隆测序。菌落杂交方法在Birren et al.1998.Genome Analysis，A Laboratory Manual，Vol.2，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY中详细记载。菌落杂交分析包括来自每个差减[PCS减葡萄糖(SG)，纤维素减葡萄糖(CG)，PCS减纤维素(SC)]和未差减(纤维素，PCS)cDNA文库的约700个单独克隆和DIG标记的cbh1探针(高丰度转录本)及γ-肌动蛋白探针——中丰度转录本，代表持家基因(表2)。

表2.SSH文库用cbh1和γ-肌动蛋白cDNA片段作为探针进行菌落杂交

文库	cbh1频率	γ-肌动蛋白频率
			纤维素(未SSH)	3.3％	＜0.17％
PCS(未SSH)	3.7％	0.13％
			PCS减葡萄糖(SG)	0.4％	ND
纤维素减葡萄糖(CG)	0.5％	ND
			PCS减纤维素(SC)	0.1％	ND

ND：未检测到

未差减的纤维素和PCS库中cbh1有相当的丰度(分别3.3％和3.6％)，而差减后的SG和CG库中cbh1克隆含量几乎降低10倍，表明高丰度转录本被成功均一化。SC文库克隆杂交显示出低频率cbh1(只有cbh1克隆的0.1％)表明对高表达cbh1细胞群进行SSH时，该高丰度转录本进行了有效差减。

将来自大约360个随机挑取的菌落的cDNA克隆用滚环扩增(RCA)纯化(Dean et al，2001，Genome Res.11：1095-1099)并进行DNA序列分析(来自反应1：70个克隆，来自反应2：96个克隆，来自反应3：192个克隆)。Transcript Assembler^TM软件序列聚类分析显示，每个池中都含有高百分比的非冗余克隆——反应1为76％，反应2为90％，反应3为67％。另外，该分析中鉴定的重叠群(相同cDNA交叉重叠序列)平均只含有两个序列。这些结果表明文库在SSH反应中实现了充分的均一化，从而在相应cDNA文库中产生了低冗余水平。

实施例16：DNA微阵列的制造和使用

从实施例15描述的差减均一化cDNA文库挑取总数3,608个白色和浅蓝色克隆。这些克隆在96孔板上补加有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中生长过夜后在-80℃冷冻。用Amersham公司TempiPhi^TM试剂(Arlington Heights，IL)对冷冻细胞中的质粒DNA进行滚环扩增(Dean et al.，2001，Genome Res.11：1095-1099)。按制造商使用说明用Beckman

Fx机器(Beckman Coulter，Inc.，Fullerton，CA)对这些反应进行高通量处理。接着，用Eisen and Brown，1999，Methods Enzymol 303：179-205描述的设备和方法将扩增稀释的基因组克隆从384孔板点到聚-L-赖氨酸包被的玻璃显微载玻片中。

实施例17：含基因沉默载体的里氏木霉株分析

几个里氏木霉株RNA谱对比显示在下表3中。通过反转录总RNA并引入氨基烯丙基-dUTP至先导链cDNA而制备荧光探针(总RNA用可从ActiveMotif，Carlsbad，CA商业获得的Fenozol试剂制备)。氨基-cDNA产物接着直接与Cy3或Cy5单功能反应染料(Amersham，Arlington Heights，IL)偶联而被标记，用前人描述的方法纯化(Berka et al.，2003，Proc.Nat Acad Sci USA100：5682-5687)。将Cy3和Cy5标记的探针合并，纯化，真空干燥，重悬于15.5μl水中，并与下列合并：3.6μl 20X SSC，2.5μl 250mM HEPES(pH7.0)，1.8μl聚-dA(500μg/ml)及0.54μl 10％SDS。杂交之前，溶液用0.22μm滤膜过滤，加热至95℃2分钟，冷却至室温。将探针加于微阵列，以玻片覆盖、置于加湿箱，并在63℃温育过夜(15-16小时)。在扫描之前，微阵列连续用1X SSC+0.03％SDS，0.2X SSC及0.05X SSC洗涤，在大约100xg下离心2分钟以除去过量液体。

微阵列玻片按制造商使用说明用Axon 4000B扫描仪成像(MolecularDevicesCorp.，Sunnyvale，CA)。计算微阵列阵点荧光强度值以及计算减去背景信号之后的每点Cy5对Cy3强度比值(650nm∶532nm)。强度比值相对单位值变化达到二倍以上的那些点认为是有差异表达。

表3.用DNA微阵列比较的里氏木霉RNA库

实验1和实验3中，总共有72个点被鉴定为满足荧光强度比变化两倍的标准，因此将它们归类为差异表达序列。DNA序列分析显示，63/72(88％)对应为cbh2-特异转录本。剩余9个点对应未知或者是假定的基因序列。也可能这些点包含与cbh2密切相关的核苷酸序列或者编码保守的组件(modules)例如纤维素结合域的序列。与预期相反，含有基因沉默载体的菌株的cbh2-mRNA水平与对照株的相应mRNA水平相比似乎有提高。该结果反应出这样一个事实：被基因沉默的转录本本身能杂交微阵列上的cbh2靶序列，由此造成cbh2特异mRNA水平在基因沉默株中有所增加的假象。然而，里氏木霉中的基因沉默效果显示出高度特异性，因为除了cbh2被影响以外，极少有(如果有一些的话)其他转录本/基因被影响。

在实验2中，没有任何微阵列序列显示差异表达，表明cbh2特异的RNA序列仍然以与对照株相似的水平在cbh2缺失株中表达。然而，应该注意这可能反映这样一个事实：里氏木霉SaMe02中发生的基因缺失/破坏事件没有除尽整个cbh2编码区。这样，菌株可能仍能制备可杂交微阵列上cbh2靶序列的截短转录本。

实施例18：小规模发酵中的RNAi

对几乎显示cbh2mRNA 100％减少的转化体11和14，按实施例5描述的方法进行2升发酵，确定基因沉默是否成功地在整个小规模发酵中保持。发酵也在宿主菌里氏木霉RutC30和用基因重组敲除cbh2基因的阳性对照株里氏木霉SaMe02上进行。纤维二糖水解酶II蛋白水平用实施例12所记载的SDS-PAGE分析定量。

与宿主菌里氏木霉RutC30相比，纤维二糖水解酶II蛋白水平在转化体11、14以及里氏木霉SaMe02中显著地减少。

实施例19：Northern印迹杂交检测里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶 II小干扰RNA

用Northern分析检测转化体1，2，11，12，13，14中里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II特异小干扰RNA(siRNA)是否存在。实施例13中所用的相同总RNA用于本实验。分离的总RNA(25μg)与1份TBE-尿素样品缓冲液(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)混合，65℃加热15分钟，之后，在Criterion^TM电泳槽中的Criterion^TM 15％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶上(BioRadLaboratories，Hercules，CA)用1X TBE电泳缓冲液(BioRad Laboratories，Hercules，CA)进行电泳分级。接着，RNA用Criterion^TM印迹仪(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)在0.5X TBE转移缓冲液中(BioRad Laboratories，Hercules，CA)50V印迹1小时电印迹至Zeta-

GT印迹膜上(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)。印迹转移之后，RNA在

1800UV交联仪中(Stratagene，La Jolla，CA)用自动交联装置固定于膜。接着，将膜与363bp毛地黄毒苷标记的里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II单链RNA探针杂交，该探针按制造商提供的方法用DIG RNA标记试剂盒(Roche，Indianapolis，IN)在毛地黄毒苷-11-dUTP存在下通过体外转录里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II模板DNA合成。模板DNA用如下所示引物998305(有义)和998306(反义)从pTr0749PCR扩增代表整个双链RNA序列的363bp片段里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II编码区产生。有义引物设计为5’端有XbaI位点，反义引物设计为5’端有HindIII位点。

引物998305(有义)：

5′-CTAGTCTAGAGTCGCAAAGGTTCCC-3′(SEQ ID NO：31)

引物998306(反义)：

5′-GGGGGAAGCTTTGACTGAGCATT-3′(SEQ ID NO：32)

扩增反应液(50μl)由1X ThermoPol反应缓冲液，0.3mM dNTPs，10ngpTr0749，0.3μM引物998305，0.3μM引物998306，以及2.5单位Taq聚合酶构成。反应在Eppendorf Mastercycler 5333仪上进行，程序如下：30循环，每一循环94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒(最后延伸15分钟)。反应产物用TAE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上分离，其中从凝胶上剪切出383bp产物条带按照制造商使用说明用QIAquick Gel提取试剂盒纯化。所得里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II PCR片段用Xba I和Hind III消化之后按制造商提供的方法用T4DNA连接酶连接至Xba I和Hind III消化pSPT19载体中(RocheMolecular Biochemicals，Indianapolis，IN，USA)产生pSMai163(图8)。

杂交在DIG Easy Hyb缓冲液(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN，USA)中42℃下进行15-17小时。接着，膜在2X SSC+0.1％SDS的高严紧度条件下室温洗涤5分钟后，再在42℃下0.1X SSC+0.1％SDS洗涤两次，每次各15分钟。探针-靶核酸杂交按制造商使用说明用化学发光分析(RocheMolecular Biochemicals，Indianapolis，IN)检测。

Northern印迹分析显示，表达里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II反向重复片段的转化体生产出了约21bp的小干扰里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II RNA(图9)。相同RNAs在含载体对照的转化体(即，里氏木霉RutC30)或里氏木霉SaMe02(其中里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II基因被同源重组敲除)中未检测出。这些结果表明，在里氏木霉中双链RNA所介导的里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II基因表达的调节中，涉及了小RNAs的产生，这些小RNA在参与RNA干扰的机制的预期大小范围内。

实施例20：里氏木霉沉默Cel6A纤维二糖水解酶II转化体长期稳定性

为了评估沉默里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II转化体的稳定性，将6个显示不同程度里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II蛋白减少的转化体(#1，2，11，12，13，14)、宿主菌株里氏木霉RutC30以及阳性对照菌株里氏木霉SaMe02的孢子在诱导条件下pH 6.0在纤维素诱导培养基中生长。在接种后7天，500μl菌丝体用作新鲜纤维素诱导培养基摇瓶接种物。菌丝体总共传5代。收集每个转化体的每代上清液，按实施例12记载方法SDS-PAGE分析。如图10所示，所有转化体整个五代都保持该沉默。

实施例21：pAILo2表达载体构建

将pAILo1 amdS基因(实施例1)用构巢曲霉pyrG基因交换。将质粒pBANe10(图11)作为选择标记pyrG基因的来源。pBANe10序列分析显示，pyrG标记包含在Nsi I限制性片段之内而不含有Nco I或Pac I限制性位点。由于amdS侧面也存在Nsi I限制性位点，所以改变选择标记策略只是Nsi I限制性片段简单交换。pAILo1和pBANe10质粒DNA Nsi I消化，产物用琼脂糖凝胶电泳纯化。pBANe10的含pyrG基因的Nsi I片段与pAILo1骨架连接，替换原含amdS基因的Nsi I DNA片段。重组克隆用限制性酶消化分析，确定它们具有正确的插入序列且插入方向正确。选择具有逆时针方向转录的pyrG基因的克隆。新质粒命名为pAILo2(图12)。

实施例22：pHB506的构建

从黑曲霉JaL303-10淀粉葡萄苷酶基因外显子4中PCR扩增两个片段，一个片段由184bp的反向重复序列(IR)组成，另一个290bp的片段含有相反方向的上述184bp序列和一个称为反向重复连接子(IR-L)的106接头区。(黑曲霉NN049453株原产自20世纪60年代从土壤分离的黑曲霉C40株，其中NN049453株通过突变增加了淀粉葡萄糖苷酶活性。黑曲霉JaL303株通过定点基因破坏导致黑曲霉NN049453中原有的三肽酰氨肽酶基因断裂而构建。黑曲霉JaL303-10是自发从含有5-FOA的琼脂分离的JaL303pyrG负型突变株)。

200ng基因组DNA用作模板，使用下列引物。有义引物设计为5’端有Nco I位点，反义引物设计为5’端也有Nco I位点。

引物997491(有义)：

5′-GGGGCCATGGTCCTGGTGTGATTCTCAGGCACCCGAAATTCTCTGC-3′(SEQ ID NO：33)

引物997492(反义)：

5′-GGGGGCGGCCGCAGCAGGGCTGGAAGGTGGAGTCGTCGCATG-3′(SEQ ID NO：34)

将400μl黑曲霉JaL303-10孢子在挡板摇瓶中50ml YP培养基中34℃，150rpm下生长18小时。接着，按制造商的使用说明，用DNeasy Plant Mini试剂盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)从菌丝体提取基因组DNA。

扩增反应液(50μl)由1X Pfx反应缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)，100ng黑曲霉JaL303-10基因组DNA，0.3μM有义引物，0.3μM反义引物，以及2.5单位Pfx聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)构成。反应在EppendorfMastercycler 5333仪上进行，程序如下：30循环，每循环94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒(最后延伸15分钟)。反应产物用TAE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上分离，其中从凝胶上剪切184bp产物条带按照制造商使用说明用QIAquick Gel提取试剂盒纯化。

为了扩增反向上带有连接子序列的反向重复序列，有义引物设计为在5’端有Pac I位点在反义引物5’端则有Not I位点。

引物997493(有义)：

5′-GGGGTTAATTAATCCTGGTGTGATTCTCAGGCACCCGAAATTCTC-3′(SEQ ID NO：35)

引物997494(反义)：

5′-GGGGGCGGCCGCTACCGACCCACCGCAACAGCCTCGCTGTCA-3′(SEQ ID NO：36)

扩增反应(50μl)按上文所述方法进行。反应产物用TAE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上分离，其中从凝胶上剪切290bp产物条带按照制造商的使用说明用QIAquick Gel提取试剂盒纯化。

接着，按制造商的使用说明，将所得290bp PCR片段插入至pTOPO Blunt(Invitogen Carlsbad，CA)以产生pTOPO-IR-L。

质粒pTOPO-IR-L用Pac I和Not I消化。在用1.0％琼脂糖凝胶电泳和上文所述QIAquick Gel提取试剂盒纯化之后，插入pAILo2相应限制性位点获得pAILo2IR-L。消化pTOPO-IR分离得到184bp片段，将其插入Not I/NotI消化的pAILo2IR-L，获得pHB506(图13)。

实施例23：pHB506转化至黑曲霉JaL303-10

黑曲霉JaL303-10的原生质体用实施例11记载的改进方法制备。原生质体用血球计数仪计数，在STC中重悬至终浓度每ml STC 1X 10⁷原生质体。多余原生质体-80℃储存于Cryo 1℃Freezing Container中(Nalgene，Rochester，NY)。

黑曲霉JaL303-10的原生质体用pHB506和pAILo2(对照)的转化，用实施例11中的方法进行，并有下述改变。将约7μg pHB506或pAILo2加入至100μl原生质溶液，轻轻混合。加入PEG缓冲液(250μl)，混合，室温温育30分钟。接着加入STC(3ml)，混合，置于基础培养基板。该板34℃温育5-7天。

获得约70个转化体。该70个转化体的孢子在基础培养基板上划线培养，34℃温育6天，获得原代转化体。

接着，将原代转化体与转化有pAILo2的黑曲霉JaL303-10一起，进行平板分析，用麦芽糖作为底物检测葡萄糖淀粉酶活性。葡萄糖的释放用偶联葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶/ABTS(2，2’-连氮-双(3-乙苯噻唑啉-6-磺酸))分析产生紫色来确定。所有试剂来自Sigma Chemical Company，St.Louis，MO。含有20％Noble琼脂的M400培养基高压灭菌，冷却至50℃时，加入50ml 20％麦芽糖(过滤灭菌)，3ml 2.65％w/v ABTS储存液，以及2ml HRP储存液(每ml 0.1M乙酸钠pH 5.0含有100U辣根过氧化物酶)。将2ml培养基加入至12孔细胞培养板的每个孔中。该板用金属箔包裹或者放在遮光箱中，4℃储存。用接种环转移每个原代转化体孢子至分析孔。平板用金属箔包裹，34℃温育1-2天。接着，将葡萄糖氧化酶溶液(每ml 0.1M乙酸钠pH5.0含有1.5U葡萄糖氧化酶)喷于板上之后，将板用金属箔包裹，34℃温育1-2小时。葡萄糖淀粉酶活性通过菌落光圈颜色强度所指示的ABTS氧化程度来确定。

温育之后，结果显示各个转化体的颜色强度的紫色深浅不同，转化有pAILo2的黑曲霉JaL303-10最暗，有几个转化体几乎没有或根本没有显示葡萄糖淀粉酶活性。

实施例24：转化体摇瓶分析

在实施例23所记载色度筛选的基础上，将来自8个转化体菌落的孢子在基础培养基平板上划线培养。基于色度平板分析，选择4个几乎不显示或根本不显示葡萄糖淀粉酶活性的转化体和4个随机选择的可产生不同淀粉葡萄糖酶活性的转化体在摇瓶中生长。上述转化体与根据WO 04/090155所制备的葡萄糖淀粉酶及中性淀粉酶缺失黑曲霉HowB112，黑曲霉JaL303-10，以及转化有pAILo2的黑曲霉JaL303-10一起在含M400培养基的摇瓶中生长。

用上述生长在基础培养基平板上的每个黑曲霉转化体和对照株孢子接种含有25ml M400培养基的摇瓶(125ml，带挡板)，200rpm，34℃下温育3天。在接种后3天取培养液样品，微离心管15,700xg离心5分钟。上清液转移至新管，4℃储存直到进行SDS-PAGE分析。

SDS-PAGE在The Criterion^TM电泳槽中的Criterion^TM Tris-HCl凝胶上进行。将5μl培养3天的样品在5％β-巯基乙醇存在下悬浮于2X浓度Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，煮沸3分钟。样品加载至SDS-PAGE凝胶，在1X Tris/甘氨酸/SDS电泳缓冲液中(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)进行电泳。所得凝胶用Bio-Safe^TM考马斯亮蓝染料(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)染色。

SDS-PAGE结果(图14)显示存在两蛋白：在约125kDa的主条带被认为是前体，75kDa的较分散条带(或多个条带)已知是加工过的酶。这些蛋白条带在转化有pAILo2的黑曲霉JaL303-10中出现。与之对照，葡萄糖淀粉酶基因缺失株黑曲霉HowB112中没有出现上述条带。所选择的转化体生产这两种蛋白的量较少。代表随机选择株的转化体1-4生产出相当量的葡萄糖淀粉酶，而平板筛选测量确定的葡萄糖淀粉酶缺失株转化体5-8则不产生可检测到的葡萄糖淀粉酶。这些结果表明黑曲霉葡萄糖淀粉酶的表达由于RNAi而被抑制。

实施例25：pHUda512表达载体的构建

为了源自黑曲霉NN049735的淀粉葡萄糖苷酶基因双链RNA的转录，构建pHUda512表达载体。黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶基因cDNA序列，及黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶基因的cDNA克隆的生产在WO00/004136中有记载。用黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶基因cDNA克隆作为模板，用Expand^TM PCR系统(Roche Diagnostics，Japan)进行PCR反应，和如下所示用引物HU704引入BglII，Kpn I，和Xho I位点及用引物HU705引入BamH I位点。

HU704：5′-TTTAGATCTCTCGAGGTACCAAATGTGATTTCCAAGCGCGCG-3′(SEQ IDNO：37)

HU705：5′-TTTGGATCCAAGAGATCGACGAGGGTCTTG-3′(SEQ ID NO：38)

扩增反应液(50μl)由在1X缓冲液中(Roche Diagnostics，Japan)的每μl1ng模板DNA，每种dNTP各250mM，250nM引物HU704，250nM引物HU705，以及每μl 0.1U Taq聚合酶构成。反应在DNA EnginePTC-200(MJ-Research，Japan)仪上进行，程序如下：1循环，94℃，2分钟；30循环，每循环92℃1分钟，55℃1分钟，和1循环，72℃，1分钟；1循环，72℃，10分钟；以及4℃保温。反应产物用TAE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上分离，其中从凝胶上剪切213bp产物条带按制造商使用说明用QIAquick^TM凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)纯化。

将213bp扩增DNA片段用Bgl II和BamH I消化，连接至BamH I消化的pMT2188(WO 03/089648)中。将连接混合物转化入大肠杆菌DB6507(ATCC 35673)中，用酿酒酵母URA 3基因作选择标记，产生表达质粒pHUda508。扩增质粒按制造商使用说明用

Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)回收。

质粒pMT2188包括一个基于下列元件的表达框：与构巢曲霉丙糖磷酸异构酶非翻译前导序列融合的黑曲霉中性淀粉酶II启动子(Na2/tpi启动子)，和黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶终止子(AMG终止子)，提供在乙酰胺唯一氮源上生长能力的构巢曲霉选择标记amdS，以及能使pyrF缺陷大肠杆菌株DB6507生长的酿酒酵母URA3标记。

用黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶基因cDNA克隆作为模板，用Expand^TM PCR系统进行单独的PCR和如下所示引物HU704以引入BglII，Kpn I，和Xho I位点及引物HU706以引入BamH I位点。

HU704：5′-TTTAGATCTCTCGAGGTACCAAATGTGATTTCCAAGCGCGCG-3′(SEQ IDNO：39)

HU706：5′-TTTGGATCCTAGGCAGTCTCATCGACATTG-3′(SEQ ID NO：40)

扩增反应液(50μl)由在1X缓冲液(Roche Diagnostics，Japan)中的每μl1ng模板DNA，每种dNTPs各250mM，250nM引物HU704，250nM引物HU706，以及每μ1 0.1U Taq聚合酶构成。反应在DNA Engine PTC-200仪上进行，程序如下：1循环，94℃，2分钟；30循环，每循环92℃1分钟，55℃1分钟，以及1循环，72℃，1分钟；1循环，72℃，10分钟；以及4℃保温。

反应产物用TAE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上分离，其中从凝胶上剪切366bp产物条带按制造商的使用说明用QIAquick^TM Gel提取试剂盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)纯化。

366bp扩增DNA片段用Xho I和BamH I消化，连接至BamH I和Xho I消化的pHUda508。将连接混合物转化大肠杆菌DB6507(ATCC 35673)，产生含有213bp源自黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶编码区的反向重复序列的表达质粒pHUda512(图15)。按制造商的使用说明用Spin Miniprep试剂盒回收扩增质粒。

实施例26：黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶基因双链RNA的表达

黑曲霉株NN049735可生产黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶，以及黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶与源自川地曲霉(Aspergillus kawachii)酸稳定性α-淀粉酶的糖结合组件(carbohydrate-binding module)杂合的杂合酶。

将黑曲霉NN049735在120rpm旋转摇床，100ml非选择YPG培养基中32℃培养16小时。过滤收集细胞，0.6M KCl洗涤，重悬于20ml含终浓度600μl/ml β-葡聚糖酶(GLUCANEX^TM，Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)的0.6M KCl中。重悬液在32℃，80rpm下温育直到形成原生质体，接着用STC缓冲液洗涤两次。原生质体用血球计数仪计数，在8∶2∶0.1的STC∶STPC∶DMSO溶液重悬调整至终浓度2.5X10⁷原生质体/ml。将约3μg pHUda512加至100μl原生质体悬液，轻柔混合，冰上保温20分钟。加入1ml SPTC，原生质体悬液37℃温育30分钟。在加入10ml 50℃COVE上层琼脂糖之后，将反应液倾倒于COVE琼脂板上，板于32℃温育。5天后，从COVE培养基筛选转化体。

将8个随机选择的转化体接种于100ml MLC培养基，30℃培养2天。接着，将10ml MLC培养基接种于100ml MU-1培养基，30℃培养7天。3,000xg离心10分钟获取上清液。

上清液样品的葡萄糖淀粉酶活性，表现为葡萄糖脱氢酶和变旋酶与所产生的葡萄糖反应而导致NADH产量增加，通过测量340nm处的吸收度而确定。将6μl溶解于100mM pH4.3乙酸钠缓冲液的酶样品与31μl 23.2mM溶解于100mMpH4.3乙酸钠缓冲液的麦芽糖混合，37℃温育5分钟。接着，将313μl颜色试剂(430U/升葡萄糖脱氢酶，9U/升变旋酶，0.21mMNAD，以及0.15MNaCl溶于0.12M pH7.6磷酸缓冲液)加至反应混合液，37℃温育5分钟。活性用分光光度计在340nm处测量。6μl去离子水替换酶样品用作对照。

葡萄糖淀粉酶活性以淀粉葡萄糖苷酶单位(AGU)计算，该单位是相对于获自Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark的酶标准品而确定的。一个AGU是指在37℃下，23.2mM溶解于0.1M pH4.3乙酸钠缓冲液的麦芽糖中，每分钟水解1微摩尔麦芽糖所需要的酶量。

上清液样品中的酸稳定性α-淀粉酶活性，通过在590nm处测量淀粉-碘复合物蓝色减少来确定。将25μl溶解于含有51.4mM氯化钙的2mM pH2.5柠檬酸缓冲液中的酶样品与135μl每升含0.6g可溶淀粉(Merck 1253，Germany)和12g乙酸钠的100mM pH2.5柠檬酸钠缓冲液混合，37℃温育325秒。在325秒之后，将90μl碘溶液(每升溶液中含1.2g碘化钾和0.12g碘)加至反应混合液，37℃温育25秒。活性用分光光度计在590nm处测量。25μl去离子水替代酶样品用作对照。

酸稳定性α-淀粉酶活性以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)计算，该单位相对于获自Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark的酶标准品而确定。一个FAU是指在上述条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质所需的酶量。

表2显示了相对于宿主菌株黑曲霉NN049735，所选转化体淀粉葡萄糖苷酶和酸稳定性α-淀粉酶的活性。宿主菌株活性均一化为1.0。结果显示与宿主菌黑曲霉NN049735相比，这些转化体淀粉葡萄糖苷酶活性减少与酸稳定性α-淀粉酶活性增加同时发生。

表2.所选转化体摇瓶结果

用e-PAGEL凝胶E-T 7.5L(ATFO Corporation，Japan)进行SDS-PAGE分析。将10μl培养7天的样品悬浮于2X浓度样品缓冲液(1％SDS，1％β-巯基乙醇，1mg/ml溴酚蓝，10％甘油，和50mM pH 6.8Tris-HCl)中，煮沸5分钟。将样品加载至e-PAGEL凝胶，在1X Tris/甘氨酸/SDS电泳缓冲液(25mM Tris-HCl，0.1％SDS，192mM甘氨酸)20mA下电泳90分钟。所得凝胶(图16)用染色液(1g/L考马斯亮蓝，10％乙酸，30％甲醇)染色30分钟，之后用脱色液(10％乙酸，30％甲醇)脱色直到条带可见。

在黑曲霉NN049735中，在约100kDa和80kDa出现了分别相应于黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶和黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶融合蛋白融合酶的主条带。与之相对照，所选转化体产生更少量的黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶带，以及更多量的黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶融合蛋白带。

实施例27：筛选形态突变子

通过将WO98/11203(实施例5)所述的“e”库和“b”库铺于CM-1琼脂平板，在34℃下温育4天，以从库中筛选形态改变菌落。将库中平板形态改变的菌落转移至新鲜CM-1琼脂平板34℃温育5天以作单菌落分离。将平板上每个形态突变子从单菌落转移至CM-1板和PDA板中心，34℃温育6-8天，之后进行形态评估，即直径、外观。将总共218个形态突变子转移至COVE2板，34℃温育1-2周产生孢子。一个产生白色孢子的突变子被鉴定，命名为米曲霉P2-5.1。

实施例28：从形态突变米曲霉P2-5.1株中拯救(rescue)与鉴定质粒 DNA及侧翼DNA

从突变米曲霉P2-5.1中分离质粒DNA及侧翼基因组座位，所用方法除了限制性内切核酸酶以外都使用WO98/11203(实施例9)中所记载的程序。分离了含有源自突变米曲霉P2-5.1的Bgl II拯救座位的大肠杆菌HB101转化体。

对于在整合事件的任一侧含有535和750bp区域的米曲霉P2-5.1拯救座位，用M13逆向(-48)与M13正向(-20)引物(New England Biolabs，Beverly，MA)以及对被测序DNA特异的引物，采用染色终止化学引物游走技术(Giesecke etal，1992，Journal of Virol.Methods 38：47-60)用AppliedBiosystems Model 373A自动DNA测序仪(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)对双链进行测序。选择一个代表被拯救的wA基因的一个侧翼的400bp核酸序列(SEQ ID NO：41)作为构建反向重复的模板。该核酸序列表明整合发生在一个烟曲霉wA基因(登录号Y17317)的同源类似物的开放阅读框。400bp的拯救座位片段与烟曲霉wA基因序列相比有74％核酸同源性，与烟曲霉wA基因的推定氨基酸序列相比，其推定氨基酸序列(SEQ ID NO：42)有71％的相同性。wA基因在野生孢子中编码参与绿色素合成的聚酮合酶(polyketide synthetase)。该基因突变导致产生缺乏色素而呈白色的孢子。已知构巢曲霉wA基因破坏将改变孢子颜色为白色(Mayorga and Timberlak，1992，Mol.Gen.Genet 235：205-212)，在米曲霉P2-5.1中观察到了该表型。

实施例29：pDeMi01的构建

为了表达源自米曲霉wA基因的dsRNA，用如下所示带有Not I限制性位点的有义链引物及带有5’Nhe I限制性位点的反义引物PCR扩增wA基因开放阅读框内的反向重复序列的整个一半，共175个碱基对的序列进行PCR扩增。

有义：

5′-GGGGGCGGCCGCAGCACTTCGATTGCATTAGTCAAAA-3′(SEQ ID NO：43)

反义：

5′-GGGGGCTAGCAGAACGAACGCAGGTTTTAT-3′(SEQ ID NO：44)

扩增反应液(50μl)由1X Pfx反应缓冲液，100ng米曲霉P2-5.1基因组DNA(用DNeasy Plant Maxi试剂盒分离)，0.3mM dNTPs，0.3μM有义引物，0.3μM反义引物，以及2.5单位Pfx聚合酶构成。反应在EppendorfMastercycler 5333仪上进行，程序如下：30循环，每循环94℃30秒，58℃60秒，72℃1分钟(最后延伸15分钟)。反应产物用TAE缓冲液1.0％琼脂糖凝胶分离，其中从凝胶剪切175bp产物条带按制造商的使用说明用QIAquick Gel提取试剂盒纯化。

包括103碱基对间隔序列的反向重复序列的另一半，则用上文的有义引物及下文所示引物5’端带有Nhe I限制性位点的反义引物扩增。

反义：

5′-GGGGGCTAGCGGGTAGCCCGACGGCCACAAAGG-3′(SEQ ID NO：45)

扩增反应(50μl)在1X Pfx反应缓冲液，0.3mM dNTPs，100ng米曲霉P2-5.1基因组DNA，0.3μM有义引物，0.3μM反义引物，以及2.5单位Pfx聚合酶中进行。反应系统在Eppendorf Mastercycler 5333仪上保温，程序如下：30循环，每循环94℃30秒，58℃45秒，72℃1分钟，以及最后延伸15分钟。反应产物用TAE缓冲液1.0％琼脂糖凝胶分离，其中从凝胶剪切273bp产物条带，按制造商使用说明用QIAquick Gel提取试剂盒纯化。

两PCR产物用Nhe I消化。将273bp的重复+间隔序列与175bp的重复序列混合，在制造商所说明的条件下，用T4DNA连接酶将其连接。连接产物用1.5％琼脂糖凝胶分离。用Qiaex II DNA Purification试剂盒(QIAGENInc.，Valencia，CA)凝胶分离得到448bp的反向重复相应片段，之后用Not I消化。为了驱动反向重复序列的转录，使用在Not I位点直接上游含有NA2-tpi启动子的质粒pBANe6(U.S.Patent 6,461,837)。质粒用Not I消化并用虾碱性磷酸酶(Roche，Indianapolis，IN)去磷酸化。去磷酸化线性质粒与448bp反向重复片段混合，在14℃下用T4DNA连接酶连接进行16小时。按制造商的使用说明将2μl连接混合物转化感受态大肠杆菌SURE细胞(Stratagene，La Jolla，CA)。

从几个转化体中回收质粒DNA，Not I消化，用如上所述1.5％琼脂糖凝胶分离检测。DNA序列分析证实，含有约500bp单个片段的转化体由175bp重复片段与方向相反的175bp重复片段组成，二者被103bp的间隔序列所隔离。一个分离质粒命名为pDeMi0(图17)。

实施例30：米曲霉的转化及转化体分析

用5μg pDeMi01或pBANe6转化从米曲霉Jal250株(WO 98/11203)所制备的原生质体，利用在乙酰胺上是否生长进行选择。在乙酰胺上生长需要pDeMi01中amdS基因的表达。转化按WO 98/11203记载的方法进行(实施例2)。34℃温育30分钟后，在原生质体/DNA混合物中加入3ml STC，涂布于补加有10mM尿苷的COVE平板。接着，将平板在34℃温育6天。

pDeMi01或pBANe6获得约50个转化体。所有pBANe6转化体具有野生型米曲霉的特征性的深绿色孢子。相反，pDeMi01转化体所产生颜色从浅黄到深绿。结果表明，反向重复序列在转录时形成了诱导基因特异性RNAi的发夹dsRNA。孢子颜色有差异，可能是由于质粒染色体整合位点不同而导致反向重复序列转录有差异的结果。

8个pDeMi01原代转化体和1个pBANe6转化体在补加有10mM尿苷的COVE2平板上划线培养。所有pBANe6克隆出现一致的深绿色。相反，pDeMi01转化体菌落的孢子颜色不一致。接下来的孢子纯化产生了一致的孢子颜色。将来自pDeMi01或pBANe6转化平板的孢子悬浮于水中，置于玻片用光学显微镜观察。pBANe8对照株孢子仍保持绿色，而pDeMi01转化体孢子则呈现RNA干扰失活结果所预期的无色。

本文记载及要求保护的发明并不受本文公开特定具体实施方式范围的限制，因为这些具体实施方式认为是发明几个具体方面的例证。任何等价的具体实施方式认为都在本发明范围之内。实际上，根据先前记载，除了本文所显示和记载的那些以外，本发明的各种修饰发明对本领域技术人员来说是显而易见的。这样的修饰发明也落在本申请附加权利要求的范围之内。在抵触情况下，可比对包括定义在内的本发明当前公开。

本文中引用各种参考文献，这些文献的公开整个并入本文作为参考。

Claims

1.生产生物物质的方法，包括：

(a)在适合生产感兴趣的生物物质的条件下培养曲霉菌或木霉菌菌株，其中该曲霉菌或木霉菌菌株包括双链可转录核酸构建体，其中该双链可转录核酸构建体包括第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列包含与编码非期望的生物物质的目的基因的第一同源可转录区可操作连接的启动子；和第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列包含该目的基因的第二同源可转录区，其中第一、第二同源区相互互补且第二同源区与第一同源区方向相反，其中双链可转录核酸构建体所编码的干扰RNA与目的基因RNA转录本相互作用以减少或消除编码非期望的生物物质的目的基因的表达；且其中所述曲霉菌或木霉菌菌株包括编码感兴趣的生物物质的第三核苷酸序列；以及

(b)从培养基中回收生物物质。

2.权利要求1的方法，其中第一同源区包括目的基因的至少19个核苷酸。

3.权利要求2的方法，其中第二同源区包括至少19个核苷酸，其与第一同源区的至少19个核苷酸互补；并且所述第二同源区的至少19个核苷酸的顺序与第一同源区的相应区相反。

4.权利要求1的方法，其中第一、第二核苷酸序列被第四核苷酸序列隔离。

5.权利要求4的方法，其中第四核苷酸序列包括至少5个核苷酸。

6.权利要求1-5中任何一项的方法，其中曲霉菌菌株为米曲霉或黑曲霉。

7.权利要求1-5中任何一项的方法，其中木霉菌菌株为里氏木霉。

8.权利要求1-5中任何一项的方法，其中目的基因的表达减少至少20%。

9.权利要求8的方法，其中目的基因的表达减少至少30%。

10.权利要求9的方法，其中目的基因的表达减少至少40%。

11.权利要求10的方法，其中目的基因的表达减少至少50%。

12.权利要求11的方法，其中目的基因的表达减少至少60%。

13.权利要求12的方法，其中目的基因的表达减少至少70%。

14.权利要求13的方法，其中目的基因的表达减少至少80%。

15.权利要求14的方法，其中目的基因的表达减少至少90%。

16.权利要求8的方法，其中目的基因的表达被消除。

17.权利要求1-5中任何一项的方法，其中干扰RNA与目的基因的一个或多个同源类似物的RNA转录本相互作用以减少或消除目的基因的一个或多个同源类似物的表达。

18.权利要求17的方法，其中目的基因的一个或多个同源类似物的表达减少至少20%。

19.权利要求18的方法，其中目的基因的一个或多个同源类似物的表达减少至少30%。

20.权利要求19的方法，其中目的基因的一个或多个同源类似物的表达减少至少40%。

21.权利要求20的方法，其中目的基因的一个或多个同源类似物的表达减少至少50%。

22.权利要求21的方法，其中目的基因的一个或多个同源类似物的表达减少至少60%。

23.权利要求22的方法，其中目的基因的一个或多个同源类似物的表达减少至少70%。

24.权利要求23的方法，其中目的基因的一个或多个同源类似物的表达减少至少80%。

25.权利要求24的方法，其中目的基因的一个或多个同源类似物的表达减少至少90%。

26.权利要求18的方法，其中目的基因的一个或多个同源类似物的表达被消除。