JP4842834B2 - 糸状菌株における遺伝子の発現を排除するか又は低めるための方法 - Google Patents
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Description
本発明は、糸状菌株における遺伝子の発現を排除するか又は低めることに関する。
糸状菌株は、商業的価値の生物学的物質の生成のために広く使用される。しかしながら、生物学的物質の高められた発現及び分泌の所望する形質を有する糸状菌株は、好結果をもたらす発酵のための最も所望する特徴を必ずしも有する必要はない。生物学的物質の生成は、生物学的物質の回収及び生成を複雑にする、生物学的物質を劣化するか、又は生物学的物質と共に同時生成する、他の物質、例えば酵素の生成により達成され得る。
WO98/53083号は、標的遺伝子のすべて又は一部の逆方向反復配列を含んで成るサイレンシングベクターを、植物のゲノム中に挿入することにより、植物内の標的遺伝子の阻害を増強するための構造体及び方法を開示する。
糸状菌株における1又は複数の遺伝子の発現を排除するか又は低めるための他の方法を提供することが、本発明の目的である。
本発明は、糸状菌株における生物学的物質をコードする標的遺伝子の発現を低めるか又は排除するための方法に関し、ここで前記方法は、
(a)前記糸状菌株のゲノム中に、前記生物学的物質をコードする標的遺伝子の第1の相同性転写可能領域に作用可能に連結されるプロモーターを含んで成る第1ヌクレオチド配列、及び前記標的遺伝子の第2の相同性転写可能領域を含んで成る第2ヌクレオチド配列を含んで成る二本鎖転写可能核酸構造体を挿入し、ここで前記第1及び第2の相同性領域がお互いに対して相補的であり、そして前記第2の相同性領域が前記第1の相同性領域に対して逆の配向にあり;そして
(b)前記二本鎖転写可能核酸構造体によりコードされる干渉性RNAの生成を、前記干渉性RNAの生成の助けになる条件下で前記糸状菌株を培養することにより誘発し、ここで前記干渉性RNAは、前記生物学的物質をコードする標的遺伝子の発現を低めるか、又は排除するために、前記標的遺伝子のRNA転写体と相互反応することを含んで成る。
(a)興味ある生成物学的物質の生成の助けとなる条件下で糸状菌株を培養し、ここで前記糸状菌株が生物学的物質をコードする標的遺伝子の第1の相同性転写可能領域に作用可能に連結されるプロモーターを含んで成る第1ヌクレオチド配列、及び前記標的遺伝子の第2の相同性転写可能領域を含んで成る第2ヌクレオチド配列を含んで成る二本鎖転写可能核酸構造体を含んで成り、ここで前記第1及び第2の相同性領域がお互いに対して相補的であり、そして前記第2の相同性領域が前記第1の相同性領域に対して逆の配向にあり、前記二本鎖転写可能核酸構造体によりコードされる干渉性RNAが前記生物学的物質をコードする標的遺伝子の発現を低めるか、又は排除するために、前記標的遺伝子のRNA転写体と相互反応;そして前記糸状菌株が前記興味ある生物学的物質をコードする第3ヌクレオチド配列を含んで成り;そして
(b)前記培養培地から生物学的物質を回収することを含んで成る、生物学的物質の生成方法に関する。
本発明は、糸状菌株における生物学的物質をコードする標的遺伝子の発現を低めるか又は排除するための方法に関し、ここで前記方法は、(a)前記糸状菌株のゲノム中に、前記生物学的物質をコードする標的遺伝子の第1の相同性転写可能領域に作用可能に連結されるプロモーターを含んで成る第1ヌクレオチド配列、及び前記標的遺伝子の第2の相同性転写可能領域を含んで成る第2ヌクレオチド配列を含んで成る二本鎖転写可能核酸構造体を挿入し、ここで前記第1及び第2の相同性領域がお互いに対して相補的であり、そして前記第2の相同性領域が前記第1の相同性領域に対して逆の配向にあり;そして(b)前記二本鎖転写可能核酸構造体によりコードされる干渉性RNAの生成を、前記干渉性RNAの生成の助けになる条件下で前記糸状菌株を培養することにより誘発し、ここで前記干渉性RNAは、前記生物学的物質をコードする標的遺伝子の発現を低めるか、又は排除するために、前記標的遺伝子のRNA転写体と相互反応することを含んで成る。
用語“プロモーター”とは、RNAポリメラーゼを結合し、生物学的物質をコードする核酸配置の正しい下流の転写開始部位に前記ポリメラーゼの転写開始を方向づけるDNA配列として、本明細書において定義される。RNAポリメラーゼは、コード領域の適切なDNA鎖に対して相補的なメッセンジャーRNAのアセンブリーを効果的に触媒する。用語、“プロモーター”はまた、mRNAへの転写の後、翻訳のための5’非コード領域(プロモーターと翻訳開始との間)、シス−作用転写制御要素、例えばエンハンサー、及び転写因子と相互作用できる他のヌクレオチド配列を含むことが理解されるであろう。プロモーター配列は、第1相同性転写可能領域に対して生来のものであるか又は外来性(異種)のものであり、そして糸状菌株に対して生来のものであるか又は外来性のものであり得る。本発明の方法においては、プロモーターは、生来のプロモーター、異種プロモーター、変異体プロモーター又はタンデムプロモーターであり得る。
用語“相同性転写可能領域”とは、適切な調節配列の制御下に配置される場合、生物学的物質、例えばポリペプチドに翻訳されても又はされなくても良い、RNA、例えばncRNA(非コードRNA)、tRNA(トランスファーRNA)、rRNA(リボソームRNA)、miRNA(ミクロRNA)又はmRNA(メッセンジャーRNA)に転写される、標的遺伝子又はその一部の読みとり枠に対して相同であるヌクレオチド配列として本明細書において定義される。転写可能領域の境界は一般的に、mRNAの5’末端での読取枠のすぐ上流に位置する転写開始部位、及びmRNAの3’末端での読取枠のすぐ下流に位置する転写終結ターミネーターにより決定される。相同性転写可能領域は、ゲノムDNA、cDNa、半合成、合成及び組換え核酸配列を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
二本鎖転写可能核酸構造体はまた、標的遺伝子の第2の相同体可能領域を含んで成り、ここで第1及び第2の相同性領域はお互いに対して相補的であり、そして第2の相同性領域は第1の相同性領域、すなわち第1の相同性領域の逆方向反復体に対して逆配向にある。
標的遺伝子の相同領域を含んで成る第1及び第2ヌクレオチド配列は、二本鎖転写可能核酸構造体における第1及び第2ヌクレオチド配列に対して、ほとんどか又はまったく相同性を有さないヌクレオチド配列である、ポリヌクレオチドリンカー又はスペンサーにより分離されても又はされなくても良い。
標的遺伝子は、生物学的物質をコードするいずれかの遺伝子であり得る。生物学的物質は、RNA(例えば、ncRNA, rRNA, tRNA, miRNA又はmRNA)であり得る。生物学的生物は、いずれかの生物ポリマー又は代謝物であり得る。生物学的物質は、生合成又は代謝路を構成する、単一の遺伝子又は一連の遺伝子によりコードされ得るか、又は単一遺伝子の生成物又は一連の遺伝子の生成物の直接的な結果であり得る。生物学的物質は、糸状菌株に対して生来のものであるか、又は糸状菌株に対して外来性または異種であり得る。用語、“異種の生物学的物質”とは、宿主細胞に対して生来ではない生物学的物として;又は構造的修飾が生来の生物学的物質を変更するために行われている、生来の生物学的物質として本明細書において定義される。
本発明はまた、生物学的物質をコードする標的遺伝子の第1の相同性転写可能領域に作用可能に連結されるプロモーターを含んで成る第1ヌクレオチド配列、及び前記標的遺伝子の第2の相同性転写可能領域を含んで成る第2ヌクレオチド配列を含んで成る二本鎖転写可能核酸構造体を含んで成る糸状菌株に関し、ここで前記第1及び第2の相同性領域がお互いに対して相補的であり、そして前記第2の相同性領域が前記第1の相同性領域に対して逆の配向にあり、前記第1及び第2ヌクレオチド配列が、糸状菌株における標的遺伝子の発現をサイレンシングする標的遺伝子に相同である領域を含んで成る転写可能重複ポリヌクレオチドを形成する。
本発明はまた、(a)興味ある生成物学的物質の生成の助けとなる条件下で糸状菌株を培養し、ここで前記糸状菌株が生物学的物質をコードする標的遺伝子の第1の相同性転写可能領域に作用可能に連結されるプロモーターを含んで成る第1ヌクレオチド配列、及び前記標的遺伝子の第2の相同性転写可能領域を含んで成る第2ヌクレオチド配列を含んで成る二本鎖転写可能核酸構造体を含んで成り、ここで前記第1及び第2の相同性領域がお互いに対して相補的であり、そして前記第2の相同性領域が前記第1の相同性領域に対して逆の配向にあり、前記二本鎖転写可能核酸構造体によりコードされる干渉性RNAが前記生物学的物質をコードする標的遺伝子の発現を低めるか、又は排除するために、前記標的遺伝子のRNA転写体と相互反応;そして前記糸状菌株が前記興味ある生物学的物質をコードする第3ヌクレオチド配列を含んで成り;そして(b)前記培養培地から生物学的物質を回収することを含んで成る、生物学的物質の生成方法に関する。
興味ある生物学的物質をコードするヌクレオチド配列は、いずれかの原核生物、真核生物、又は他の源から得られる。本発明のためには、一定の源に関して、用語、“〜から得られる”とは、本明細書において使用される場合、生物学的物質が、前記源により、又は前記源からの遺伝子が挿入されている細胞により生成されることを意味するであろう。
興味ある生物学的物質をコードするヌクレオチド配列は、糸状菌株における核酸構造体に含まれる。核酸構造体は、少なくとも1つのプロモーターに作用可能に連結される、興味ある生物学的物質をコードするヌクレオチド配列、及び制御配列と適合する条件下で糸状菌株におけるヌクレオチド配列の発現を方向づける1又は複数の制御配列を含んで成る。発現は、興味ある生物学的物質の生成に包含されるいずれかの段階、例えば転写、後−転写修飾、翻訳、後−翻訳修飾、及び分泌(但し、それらだけには限定されない)を包含することが理解されるであろう。
興味ある生物学的物質をコードするヌクレオチド配列は、プロモーター、生物学的物質をコードするヌクレオチド配列、及び転写及び翻訳終結シグナルを含んで成る組換えベクターに含まれ得る。上記の種々の核酸及び制御配列は、1又は複数の便利な制限部位で生物学的物質をコードする核酸配列の挿入又は置換を可能にするためにそれらの部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得る。他方では、ヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列、又はプロモータ及び/又は配列を含んで成る核酸構造体を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、そのコード配列はベクターに位置し、その結果、コード配列はプロモーター及び発現のための1又は複数の適切な制御配列により作用可能に連結される。
COVE選択プレートは、1L当たり、342.3g のスクロース、 20 ml のCOVE 塩溶液、 10 mM のアセトアミド、 15 mMの CsCl2、 及び 25 又は 30 g のNoble寒天から構成された。
COVE2プレートは、1L当たり、30 g のスクロース、 20 mlの COVE塩溶液、 10 mM のアセトアミド、及び 25 g 又は 30gの Noble寒天から構成された。
COVE塩溶液は、1l当たり、26gのKCl、26gのMgSO4・7H2O, 76gのKH2PO4及び50mlのCOVE微量金属から構成された。
COVE微量金属溶液は、1l当たり、0.04gのNaB4O7・10H2O, 0.4gのCuSO4・5H2O, 1.2gのFeSO4・7H2O, 0.7g又は1gのMnSO4・H2O,0.8gのNa2MoO2・2H2O及び10gのZnSO4・7H2Oから構成された。
セルラーゼ−誘発培地は、1L当たり20gのArbocel−天然セルロース繊維(J. Rettenmaier USA LP)、10gのトウモロコシ浸漬固形物(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)、1.45gの(NH4)2SO4、2.08gのKH2PO4、0.28gのCaCl2、0.42gのMgSO4・7H2O、0.42mlのトリコダーマ・レセイ微量金属溶液、及び2滴のプルロン酸から構成された。そのpHは、オートクレーブ処理の前、10NのNaOHにより6.0に調節された。
YP培地は、1L当たり10gの酵母抽出物及び20gのBactoペプトンから構成された。
YPG培地は、1L当たり4g の酵母抽出物、1gのK2HPO4、0.5gのMgSO4及び15.0gのグルコース(pH 6.0)から構成された。
STCは、1L当たり、フィルター殺菌された、0.8 M又は1 M のソルビトール、 10 mM又は 25 mMのCaCl2 及び 10 mM 又は 25 mMの トリス-HCl pH 7.5 又は pH 8から構成された。
STPCは、STC中、40%PEG4000から構成された。
AMG微量金属溶液は、1L当たり、6.8 g のZnS04・7H20、 2.5 g の CuSO4・5H2O, 0.24 g のNiC12・6H20、 13.9 gのFeS04・7H20, 13.5 g のMnSO4 ・H20及び3 g のクエン酸から成った。
MLCは、1L当たり、40 gのグルコース、 50 gの大豆粉末 及び 4 g のクエン酸, pH 5.0から構成された。
CM−1寒天プレート(pH6.5)は、1L当たり0.25gの NaCl、 0.5gのMgSO4・7H2O 、1.9 gのK2HPO4、3.6 g のKH2PO4、 0.1 ml の微量金属溶液、 30 gのBacto寒天(Difco)、pH 6.5、 11 ml の10% ウレア、及び 67 mlの30% マルトースから構成された。
PDAプレートは、1L当たり39gのジャガイモデキストロース寒天(Difco)から構成された。
発現ベクターpAILo1を、アスペルギラス・ニガー中性α−アミラーゼ及びアスペルギラス・オリザエリン酸トリオースイソメラーゼについての遺伝子からのプロモーターのハイブリッド(NA2−tpiプロモーター)、アスペルギラス・ニガーアミログルコシダーゼターミネーター配列(AMGターミネーター)、及びアスペルギラス・ニジュランスアセトアミラーゼ遺伝子(amdS)を含んで成るpBANe6(アメリカ特許第6,461,837号)を修飾することにより構成した。
AMDS3NcoMut (2050): 5'-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG -3' (配列番号1)
AMDS2NcoMut (2721): 5'-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3' (配列番号2)
AMDS1NcoMut (3396): 5'-GGAGGCCATGAAGTGGACCAACGG-3' (配列番号3)。
AMGターミネーターを突然変異誘発するための上方プライマー:
5'-CACCGTGAAAGCCATGCTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG-3' (配列番号4);
AMGターミネーター配列を突然変異誘発するための下方プライマー:
5'-CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGAGCATGGCTTTCACGGTGTCTG-3' (配列番号5)。
NA2-tpiプロモーターを突然変異誘発するための上方プライマー:
5'-CTATATACACAACTGGATTTACCATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3' (配列番号6);
NA2-tpiプロモーターを突然変異するための下方プロモーター:
5'-GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGTTGTGTATATAG-3' (配列番号7)。
発現ベクターpMJ04を、まず、下記に示されるプライマー993429(アンチセンス)及び993428(センス)を用いて、トリコダーマ・レセイRutC30ゲノムDNAからのトリコダーマ・レセイCeI7Aセロブロヒドロラーゼ1遺伝子(cbh1)ターミネーターをPCR増幅することにより構成した。アンチセンスプライマーを、5’−末端でPacI部位、及びセンスプライマーの5’−末端でSpeI部位を有するよう構築した。トリコダーマ・レセイRutC30(ATCC 56765; Montenecourt and Eveleigh,1979, Adv.Chem.Ser.181 : 289-301)を、トリコダーマ・レセイQm6A(ATCC 13631; Mandels and Reese, 1957、J. Bacteriol. 73: 269-278)から誘導した。
5'-AACGTTAATTAAGGAATCGTTTTGTGTTT-3'(配列番号8):
プライマー993428(センス):
5'-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-3'(配列番号9)。
発現ベクターpMJ06を、まず、下記に示されるプライマー993696(アンチセンス)及び993695(センス)を用いて、トリコダーマ・レセイRutC30ゲノムDNAからのトリコダーマ・レセイCeI7Aセロブロヒドロラーゼ1遺伝子(cbh1)プロモーターをPCR増幅することにより構成した。アンチセンスプライマーを、センスプライマーの5’−末端でSacI部位、及びアンチセンスプライマーの5’−末端でNcoI部位を有するよう構築した。
5'- ACTAGTCGACCGAATGTAGGATTGTT -3'(配列番号10):
プライマー993696(アンチセンス):
5'- TGACCATGGTGCGCAGTCC -3'(配列番号11)。
発現ベクターpMJ09を、まず、下記に示されるプライマー993843(アンチセンス)及び993844(センス)を用いて、トリコダーマ・レセイRutC30ゲノムDNAからのトリコダーマ・レセイCeI7Aセロブロヒドロラーゼ1遺伝子(cbh1)プロモーターをPCR増幅することにより構成した。アンチセンスプライマーを、5’−末端でPacI及びSpeI部位、及びセンスプライマーの5’−末端でPvuI部位を有するよう構築した。
5'-CGATCGTCTCCCTATGGGTCATTACC-3'(配列番号12):
プライマー993843(アンチセンス):
5'- ACTAGTTAATTAAGCTCCGTGGCGAAAG-3'(配列番号13)。
トリコダーマ・レセイRutC30を、Mandels and Weber, 1969, Adv. Chem. Ser. 95: 391-413により記載されるようなセルラーゼ誘発標準条件下で増殖した。菌糸体サンプルを、Whatman紙を通しての濾過により収穫し、そして液体窒素においてすばやく凍結した。サンプルを、それらがRNA抽出のために破壊されるまで、-80℃で貯蔵した。
全細胞RNAを、例5に記載される菌糸体サンプルから、Timberlake and Barnard(1981, Cell 26 : 29-37)の方法に従って抽出し、そしてRNAサンプルを、1%ホルムアルデヒド−アガロースゲルからのブロットの後、ノザンハイブリダイゼーションにより分析した(Davis など.、1986, Basic Methods in Molecular Biology, Science Publishing Co. , Inc. , New York)。ポリアデニル化されたmRNA画分を、全RNAから、mRNA Separator KitTM (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)を用いて、その製造業者の説明書に従って単離した。
例6に記載されるcDNAライブラリーから、約7000個の形質転換体コロニーを、1ml当たり50μgのアンピシリンにより補充された2YTブイヨン100μlを含む96−ウェルマイクロタイタープレート中に、2YTプレートから直接的に採取した。プレートを、200rpmで振盪しながら、37℃で一晩インキュベートした。インキュベーションの後、100μlの無菌50%グリセロールを、個々のウェルに添加した。形質転換体を、個々のウェルにおいて50μgのアンピシリンにより補充された、1mlのMagnificent BrothTM(MacConnell Research, San Diego, CA)を含む二次深皿96−ウェルマイクロタイタープレート(Advanced Genetic Technologies Corporation, Gaithersburg, MD)上で複製した。
T7プライマー:5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'(配列番号14)。
ヌクレオチド配列データを、性質及びベクター配列について詳細に調べ、そしてDNA配列の末端での不明瞭な塩基部分を整え、そしてすべての配列を、PHRED/PHRAP ソフトウェアー (University of Washington, Seattle, WA)の助けにより、お互い比較した。得られるコンチグ及びシングルトンを、6種の枠で翻訳し、そしてBLOSUM62マトリックスを用いて、改良されたSmith-Watermanアルゴリズムにより、GeneMatcherTMソフトウェアー(Pasadena Inc. , Pasadena, CA)を用いて、公的に入手できるタンパク質データベースに対して調査した。
ファミリー6セロビオヒドロラーゼ(CeI6A)をコードする推定上のcDNAクローンを公的に入手できるデータベース、例えばSwissprot, Genpept及びPIRに寄託されているタンパク質配列に、アセンブリーされたESTの推定されるアミノ酸配列を比較することにより同定した。1つのクローン、すなわちトリコダーマ・レセイEST TrO749を、配列番号15に示されるような1413bpの読取枠、及び配列番号16に示されるような推定されるアミノ酸配列を含む、1747bpのpYES2挿入体を表すヌクレオチド配列分析のために選択した。トリコダーマ・レセイCeI6AセロビオヒドロラーゼIIを含むプラスミドを、pTr0749を命名した。
発現ベクターpSMai148を、トリコダーマ・レセイCeI6AセロヒドロラーゼII遺伝子が誘導され、そしてトリコダーマ・レセイRutC30株におけるトリコダーマ・レセイCeI6AセロビオヒドロラーゼII遺伝子の発現のサイレンシングのために意図される二本鎖−RNA(ds-RNA)の転写のために構成した。プラスミドpSMai148を、下記に示されるプライマー994991(アンチセンス)及び994990(センス)を用いて、pTr0749からの210bpのトリコダーマ・レセイCeI6AセロビオヒドロラーゼIIコード領域をPCR増幅することにより生成した。アンチセンスプライマーを、5’−末端でEcoRI部位、及びセンスプライマーの5’末端でNcoI部位を有するよう構築した:
5'-GGAATTCTAGTTCTTATATTTGGCGACGCCACCATCT-3'(配列番号17);
プライマー994990(センス):
5'-CATGCCATGGAAAGGTTCCCTCTTTTATGTGGCTAG-3'(配列番号18)。
プライマー994993(アンチセンス):
5'-GGAATTCTGACTGAGCATTGGCACACTTTGGAGTAC-3'(配列番号19);
プライマー994992(センス):
5'-CCTTAATTAAAAAGGTTCCCTCTTTTATGTGGCTAG-3'(配列番号20)。
二本鎖RNA−介在性(ds-RNA)干渉がトリコダーマ・レセイに存在することを示すために、Cel6AセロビオヒドロラーゼII配列の自己−相補的ヘヤーピンRNAを発現するpSMai148発現ベクターを用いて、トリコダーマ・レセイRutC30プロトプラストを形質転換した。対照として、pMJ09プラスミド(“空のベクター”)(図4)、すなわちpSMai148の親ベクターがまた包含された。両構造体は、単独の窒素源としてのアセトアミド上での増殖のための選択を提供するamdS遺伝子を含み、そしてpSMai148プラスミドにおけるトリコダーマ・レセイCel6AセロビオヒドロラーゼII配列を、強いセルロース−誘発性トリコダーマ・レセイCel7AセロビオヒドロラーゼIプロモーターの制御下に配置した。
トリコダーマ・レセイCel6AセロピオヒドロラーゼII逆方向反復体フラグメントを有する20の形質転換体(SMA148−01〜SMA148〜20)、及び“空のベクター”を含む10の形質転換体(MJ09−01及びMJ09−10)を、ランダムに選択し、そしてpH6.0での25mlのセルラーゼ−誘発性培地を含む125mlの反らせ板付振盪フラスコにおいて培養し、形質転換体の胞子により接種し、そして28℃及び200rpmで7日間インキュベートした。トリコダーマ・レセイRutC30を対照として使用した。培養物ブイヨンサンプルを、接種後7日間で除去し、15,700×gで5分間、微小遠心分離機において遠心分離し、そして上清液を新しい管に移した。
トリコダーマ・レセイCel6AセロビオヒドロラーゼII逆方向反復体フラグメント(pSMai148)の株への組込みが、トリコダーマ・レセイCel6AセロビオヒドロラーゼII mRNAの量の低下をもたらすかどうかを決定するために、ノザンハイブリダイゼーションを行った。全RNAを、例11において得られる、凍結された菌糸体から、FenozolTM(Active Motif, Carlsbad, CA)を用いて、及びその製造業者によりわずかに改良されたプロトコールに従って、抽出した。
5'-AAATCGTGGCGCACTGCTGT-3'(配列番号21);
プライマー996117(センス):
5'-TGAGTGCATCAACTACGCCG-3'(配列番号22)。
5'-GTCAACACGACGAATGGCGT-3' (配列番号23)
プライマー996119(センス):
5'-TGATCGGTATGGGTCAGAAGG-3' (配列番号24)
異なった形質転換体におけるトリコダーマ・レセイCel6AセロビオヒドロラーゼII mRNAの相対的発現レベルを、同時逆転写−PCR(RT−PCR)により定量化した。全RNAを、RT−PCR反応のための鋳型として作用するように記載されるような個々の形質転換体から抽出した。トリコダーマ・レセイアクチン1遺伝子を、内部対照として使用した。プライマーを、Primer Express software (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて企画した。プライマー列挙が好ましい等級に従って生成した後、対を、その3’末端で最後の5個の塩基において2個以下のG+Cを有する第1組のプライマーを選択することにより選択した。次のプライマーを使用した:
5'-CTGGTCCAACGCCTTCTTCAT- 3'(配列番号25)
トリコダーマ・レセイCel6AセロビオヒドロラーゼII逆方向プライマー(996007):
5'-GGAACGTAGTGAGGCTCGCTAA- 3'(配列番号26)
トリコダーマ・レセイアクチン前方向プライマー(996121):
5'-CATGGCTGGTCGTGATCTTACC- 3'(配列番号27)
トリコダーマ・レセイアクチン逆方向プライマー(996122):
5'-CCTTGATGTCACGGACGATTTC- 3'(配列番号28)。
トリコダーマ・レセイ株RutC30を、基本CelluclastTM培地及び発酵条件を用いて、2LのApplikonライブラリー発酵器において増殖した。炭素源は、グルコース、セルロース、又は前処理され、そして洗浄されたトウモロコシストーバを包含した。すべては、1L当たり52gのグルコースに等しい炭素に基づいて負荷された。発酵方法は、28℃の温度、pH4.5及び約120時間の増殖時間を用いた。
5'-TTTCGCTCTTCCTCACGCCATTG- 3'(配列番号30)。
合計3,608個の白色及び薄青色のコロニーを、例15に記載される減法され、そして標準化されたcDNAライブラリーから採取した。それらを、96−ウェルプレートにおいて、1L当たり100μgのアンビシリンにより補充されたLB培地において一晩、増殖し、そして-80℃で凍結した。凍結された細胞からのプラスミドDNAのローリングサークル増幅(Dean など.,2001, Genome Res. 11 : 1095-1099)を、Amersham (Arlington Heights, IL)からのTempiPhiTM試薬を用いて行った。
いくつかのトリコダーマ・レセイ株のRNAプロフィールを、下記表3に示されるようにして比較した。蛍光プローブを、第1鎖cDNA(全RNAは、Active Motif, Carlsbad, CAから市販されているFenozol試薬を用いて調製された)中にアミノアリル−dUTPを組込む、全RNAの逆転写により調製した。続いて、アミノ−cDNA生成物を、Cy3又はCy5単機能的反応性色素のいずれかへの直接的なカップリングによりラベルし(Amersham, Arlington Heights, IL)、そして前記のようにして精製した(Berka など., 2003, Proc. Nat. Acad. Sci. USA100: 5682-5687)。
2L発酵を、cbh2 mRNAについてほとんど100%の低下を示した、転写体11及び14に対して、例5に記載のようにして実施し、遺伝子サイレンシングが小規模発酵を通して都合良く維持されるかどうかを決定した。発酵をまた、宿主株トリコダーマ・レセイRutC30、及びcbh2遺伝子が相同組換えによりノックアウトされている正の対照株トリコダーマ・レセイSaMe02に対して行った。セロビオヒドロラーゼIIタンパク質のレベルを、例12に記載のようにして、SDS−PAGE分析により測定した。
ノザン分析を、トリコダーマ・レセイCel6AセロビオヒドロラーゼII−特異的な小さな干渉性RNA(siRNA)の存在又は不在について、形質転換体1, 2, 11, 12, 13及び14を試験するために行った。例13に使用された同じ全RNAを、この実験のために使用した。単離された全RNA(25μg)を、1部のTBE−ウレアサンプル緩衝液(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)と共に混合し、65℃で15分間、加熱し、そして1×TBE緩衝液中、CriterionTM 細胞(Bio- Rad Laboratories, Hercules, CA)によるCriterionTM 15%ポリアクリルアミド−7Mウレアゲル(Bio- Rad Laboratories, Hercules, CA)上での電気泳動により分別した。
5'-CTAGTCTAGAGTCGCAAAGGTTCCC-3'(配列番号31)
プライマー998306(アンチセンス):
5'-GGGGGAAGCTTTGACTGAGCATT-3'(配列番号32)。
サイレンシングされたトリコダーマ・レセイCel6AセロビオヒドロラーゼII形質転換体の安定性を評価するために、種々の程度のトリコダーマ・レセイCel6AセロビオヒドロラーゼIIタンパク質低下を示す6個の形質転換体(#1, 2, 11, 12, 13及び14)からの胞子、宿主株トリコダーマ・レセイRutC30、及び正の対照株トリコダーマ・レセイSame02を、pH6.0でセルラーゼ−誘発培地において、誘発条件下で増殖した。接種の7日後、500μlの菌糸体を、新しいセルラーゼ誘発性培地を含む振盪フラスコのための接種物として使用した。この菌糸体の継代を、合計5回、行った。個々の形質転換体についての個々の回の継代からの上清液を集め、そして例12に記載されるように、SDS−PAGEにより分析した。図10が示すように、サイレンシングは、すべての形質転換体について、5世代を通して維持された。
pAILo2(例1)のamdS遺伝子を、アスペルギラス・ニジュランスpyrG遺伝子により交換した。プラスミドpBANe10(図10)を、選択マーカーとしてのpyrG遺伝子のための源として使用した。pBAHe10の配列の分析は、pyrGマーカーがNsiI制限フラグメント内に含まれ、そしてNcoI又はPacI制限部位を含まないことを示した。amdSはまた、NsiI制限部位を端に有するので、選択マーカーを交換するための方法は、NsiI制限フラグメントの単純な交換であった。
2種のフラグメント、すなわち184bpの逆方向反復体(IR)から構成される1つのフラグメント、及び逆方向反復体−リンカー(IR−L)と命名される106リンカー領域と共に反対の方向に184bpの配列を含む290bpからの構成される他のフラグメントを、アスペルギラス・ニガーJaL203−10のアミログルコシダーゼ遺伝子のエキソン4からPCR増幅した(アスペルギラス・ニガーNN049453は、1960年代、土壌から単離されたスペルギラス・ニガーC40 から本来生成された株であり、このアミログルコシダーゼ活性は突然変異誘発により増強された。アスペルギラス・ニガー株JaL303は、アスペルギラス・ニガーNN049453における常在性トリペプチジルアミノペプチダーゼ遺伝子の中断を引起すために特定部位の遺伝子破壊により構成された。アスペルギラス・ニガーJaL303−10は、5−FOAを含む寒天上で自発的に単離されるJaL303のpyrG-変異体株である。)
プライマー997491(センス):
5'-GGGGCCATGGTCCTGGTGTGATTCTCAGGCACCCGAAATTCTCTGC-3'(配列番号33);
プライマー997492(アンチセンス):
5'-GGGGGCGGCCGCAGCAGGGCTGGAAGGTGGAGTCGTCGCATG-3'(配列番号34)。
プライマー997493(センス):
5'-GGGGTTAATTAATCCTGGTGTGATTCTCAGGCACCCGAAATTCTC-3'(配列番号35);
プライマー997494(アンチセンス):
5'-GGGGGCGGCCGCTACCGACCCACCGCAACAGCCTCGCTGTCA-3'(配列番号36)。
次に、290bpの得られるPCRフラグメントを、pTOPO Blunt (Invitogen Carlsbad, CA)中に、その製造業者の説明書に従って挿入し、pTOPO−IR−Lを生成した。
アスペルギラス・ニガーJaL303−10のプロトプラストを、例11に記載される、改良されたプロトコールを用いて、調製した。プロトプラストを、血球計を用いて計数し、そしてSTC1ml当たり1×107個のプロトプラストの最終濃度に再懸濁した。過剰のプロトプラストを、Cryo 1℃凍結容器(Nalgene, Rochester, NY)において−80℃で貯蔵した。
例23に記載される比色スクリーンに基づいて、8個の形質転換体コロニーからの胞子を、最少培地プレート上に画線培養した。比色プレートアッセイに基づいて、ほとんどか又はまったくグルコアミラーゼ活性を示さない4個の形質転換体及び種々のアミログルコシダーゼ活性を生成する4個のランダムに選択された形質転換体を、振盪フラスコにおける増殖のために選択した。上記形質転換体、及びWO04/090155号に記載のようにして調製された、グルコアミラーゼ及び中性アミラーゼ欠失を有するアスペルギラス・ニガーHowB112, アスペルギラス・ニガーJaL303−10、及びpAILo2により形質転換されたアスペルギラス・ニガーJal303−10を、M400培地を含む振盪フラスコにおいて増殖した。
発現ベクターpHUda512を、アスペルギラス・ニガーNN049735のアミログルコシダーゼ遺伝子由来の二本鎖RNAの転写のために構成した。アスペルギラス・ニガーアミログルコシダーゼ遺伝子のcDNA配列、及びアスペルギラス・ニガーアミログルコシダーゼ遺伝子のcDNAクローンの生成は、WO00/004136号に記載されている。鋳型としてのアスペルギラス・ニガーアミログルコシダーゼ遺伝子のcDNAクローンとのPCR反応を、下記に示されるように、BglII、KpnI及びXhoI部位を導入するためにプライマーHU704、及びBamHI部位を導入するためにプライマーHU705を用いて、ExpandTM PCRシステム8Roche Diagnostics, Japan)により行った:
5'-TTTAGATCTCTCGAGGTACCAAATGTGATTTCCAAGCGCGCG-3'(配列番号37)
HU705:
5'-TTTGGATCCAAGAGATCGACGAGGGTCTTG-3'(配列番号38)。
HU704:
5’-TTTAGATCTCTCGAGGTACCAAATGTGATTTCCAAGCGCGCG-3’(配列番号39)
HU706:
5’-TTTGGATCCTAGGCAGTCTCATCGACATTG-3’(配列番号40)。
366bpの増幅されたDNAフラグメントを、XhoI及びBamHIにより消化し、そしてBamHIお呼びXhoIにより消化されたpHUda 508中に連結した。その連結混合物により、E.コリDB6507(ATCC35673)を形質転換し、アスペルギラス・ニガーアミログルコシダーゼコード領域由来の213bpの逆方向反復体を含む発現プラスミドpHuda512を生成した。増幅されたプラスミドを、QIAprep(商標)Spin Miniprep キットを用いて、その製造業者の説明書に従って回収した。
アスペルギラス・ニガー株NN049735は、アスペルギラス・ニガーアミログルコシダーゼ、及びアスペルギラス・ニガー酸安定性α−アミラーゼとアスペルギラス・カワチ酸安定性α−アミラーゼ由来の炭化水素−結合モジュールとの間のハイブリッド酵素の両者を生成する。
WO98/11203号(例5)に記載される“e”プール及び“b”プールを、CM−1寒天上にプレートし、そして34℃で4日間インキュベートすることにより、変更された形態学を有するコロニーについてスクリーンした。プール内の変更されたプレート形態学を有するコロニーを、単一のコロニー単離のために、新しいCM-1寒天プレートに移し、そして34℃で5日間インキュベートした。プレート上の個々の形態学的変異体を、単一コロニーからCM-1プレート及びPDAプレートの中心に移し、そして34℃で6〜8日間インキュベートし、その後、形態学、すなわち直径及び外観を評価した。合計218個の形態学的変異体を、COVE2プレートに移し、そして34℃で1〜2週間インキュベートし、胞子を生成した。白色の胞子を生成する変異体を同定し、そしてアスペルギラス・オリザエP2-5.1と命名した。
プラスミドDNA及びゲノムフランキング遺伝子座を、WO98/11203号(例9)に記載される方法(但し、制限エンドヌクレアーゼが使用された)を用いて、変異体アスペルギラス・オリザエP2-5.1から単離した。変異体アスペルギラス・オリザエP2-5.1からのBglII開放の遺伝子座を含むE. コリHB101形質転換体を単離した。
アスペルギラス・オリザエwA遺伝子由来のdsRNAを発現するために、wA遺伝子の読取枠内からの175個の塩基対の逆方向反復体の半分のすべてを、NotI制限部位を有するセンス鎖プライマー、及び下記に示される5’NheI制限部位を有するアンチセンスプライマーを用いて、PCR増幅した:
センス:
5'-GGGGGCGGCCGCAGCACTTCGATTGCATTAGTCAAAA-3'(配列番号43)
アンチセンス:
5'-GGGGGCTAGCAGAACGAACGCAGGTTTTAT-3'(配列番号44)。
アンチセンス:
5'-GGGGGCTAGCGGGTAGCCCGACGGCCACAAAGG-3'(配列番号45)。
5μgのpDeMi01又はpBANe6を用いて、選択のためにアセトアミド上での増殖を用いて、アスペルギラス・オリザエ株Jal 250 (WO98/11203号)から調製されたプロトプラストを形質転換した。アセトアミド上での増殖は、pDeMi01上に存在するamdS遺伝子の発現を必要とする。形質転換を、WO98/11203号(例2)に記載のようにして行った。34℃での30分間のインキュベーションの後、プロトプラスト/DNAミックスを、STCにより3mlにし、そして10mMのウリジンにより補充されたCOVEプレート上に広げた。次に、プレートを、34℃で6日間インキュベートした。
種々の文献が本明細書に引用されており、それらの開示は引用により本明細書に組み込まれている。
Claims (21)
- アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)又はトリコダーマ・レセイ(Trichoderma reesei)の株における酵素をコードする標的遺伝子の発現を低めるか又は排除するための方法であって、
(a)前記アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)又はトリコダーマ・レセイ(Trichoderma reesei)の株のゲノム中に、前記標的遺伝子の対応する領域に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%又は100%の配列同一性を有する第1の相同性転写可能領域及び前記標的遺伝子の対応する領域に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%又は100%の配列同一性を有する第2の相同性転写可能領域に、作用可能に連結されたプロモーターを含んで成るヌクレオチド配列含んで成る二本鎖転写可能核酸構造体を挿入し、ここで前記第1及び第2の相同性転写可能領域がお互いに対して相補的であり、そして前記第2の相同性転写可能領域が前記第1の相同性転写可能領域に対して逆の配向にあり;そして
(b)前記二本鎖転写可能核酸構造体によりコードされる干渉性RNAの生成を、前記干渉性RNAの生成の助けになる条件下で前記アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)又はトリコダーマ・レセイ(Trichoderma reesei)の株を培養することにより誘発し、ここで前記干渉性RNAは、前記標的遺伝子の発現を低めるか、又は排除するために、前記標的遺伝子のRNA転写体と相互反応する、ことを含んで成る方法。 - 前記第1の相同性転写可能領域が、前記標的遺伝子の少なくとも19個のヌクレオチドを含んで成る請求項1記載の方法。
- 前記第2の相同性転写可能領域が、前記第1の相同性転写可能領域の少なくとも19個の相補的ヌクレオチドを含んで成り、前記少なくとも19個のヌクレオチドが前記第1の相同性領域のその対応する領域に対して、前記核酸構成物中で、逆の順序である請求項1記載の方法。
- 前記第1及び第2の相同性転写可能領域が、第3ヌクレオチド配列により分離される請求項1記載の方法。
- 前記第3ヌクレオチド配列が、少なくとも5個のヌクレオチドを含んで成る請求項4記載の方法。
- 前記標的遺伝子の発現が、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%低められる請求項1記載の方法。
- 前記干渉性RNAが、前記標的遺伝子の1又は複数の相同体の発現を低めるか又は排除するために、前記標的遺伝子に対して少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも97%の配列同一性を有する、前記標的遺伝子の1又は複数の相同体のRNA転写体と更に相互作用し、ここで、前記標的遺伝子の1又は複数の相同性の発現が、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%低められる請求項1記載の方法。
- 酵素をコードする標的遺伝子の対応する領域に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%又は100%の配列同一性を有する第1の相性同転写可能領域及び前記標的遺伝子の対応する領域に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%又は100%の配列同一性を有する第2の相同性転写可能領域に、作用可能に連結されたプロモーターを含んで成るヌクレオチド配列含んで成る二本鎖転写可能核酸構造体を含んでなり、ここで前記第1及び第2の相同性転写可能領域がお互いに対して相補的であり、そして前記第2の相同性転写可能領域が前記第1の相同性転写可能領域に対して逆の配向にあり、前記二本鎖転写可能核酸構造体によりコードされる干渉性RNAが酵素をコードする標的遺伝子の発現を低めるか、又は排除するために、前記標的遺伝子のRNA転写体と相互反応することを特徴とするアスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)又はトリコダーマ・レセイ(Trichoderma reesei)の株。
- 前記第1の相同性転写可能領域が、前記標的遺伝子の少なくとも19個のヌクレオチドを含んで成る請求項8記載のアスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)又はトリコダーマ・レセイ(Trichoderma reesei)の菌株。
- 前記第2の相同性転写可能領域が、前記第1の相同性転写可能領域の少なくとも19個の相補的ヌクレオチドを含んで成り、前記少なくとも19個のヌクレオチドが前記第1の相同性転写可能領域の対応する領域に対して、前記核酸構造体中で、逆の順序である請求項8記載のアスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)又はトリコダーマ・レセイ(Trichoderma reesei)の株。
- 前記第1及び第2の相同性転写可能領域が、第3ヌクレオチド配列により分離される請求項8記載のアスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)又はトリコダーマ・レセイ(Trichoderma reesei)の株。
- 前記第3ヌクレオチド配列が、少なくとも5個のヌクレオチドを含んで成る請求項11記載のアスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)又はトリコダーマ・レセイ(Trichoderma reesei)の株。
- 前記標的遺伝子の発現が、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%低められる請求項8記載のアスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)又はトリコダーマ・レセイ(Trichoderma reesei)の株。
- 前記干渉性RNAが、前記標的遺伝子の1又は複数の相同体の発現を低めるか又は排除するために、前記標的遺伝子に対して少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも97%の配列同一性を有する、前記標的遺伝子の1又は複数の相同体のRNA転写体と相互作用し、ここで前記標的遺伝子の1又は複数の相同性の発現が、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%低められる請求項8記載のアスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)又はトリコダーマ・レセイ(Trichoderma reesei)の株。
- 興味ある生物学的に活性な物質の生成方法であって、
(a)前記興味ある生成物学的に活性な物質の生成の助けとなる条件下でアスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)又はトリコダーマ・レセイ(Trichoderma reesei)の株を培養し、ここで前記アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)又はトリコダーマ・レセイ(Trichoderma reesei)の株が所望しない酵素をコードする標的遺伝子の対応する領域に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%又は100%の配列同一性を有する第1の相性同転写可能領域及び前記標的遺伝子の対応する領域に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%又は100%の配列同一性を有する第2の相同性転写可能領域に、作用可能に連結されたプロモーターを含んで成るヌクレオチド配列含んで成る二本鎖転写可能核酸構造体を含んで成り、ここで前記第1及び第2の相同性転写可能領域がお互いに対して相補的であり、そして前記第2の相同性転写可能領域が前記第1の相同性転写可能領域に対して逆の配向にあり、前記二本鎖転写可能核酸構造体によりコードされる干渉性RNAが前記所望しない酵素をコードする標的遺伝子の発現を低めるか、又は排除するために、前記標的遺伝子のRNA転写体と相互反応し;そして前記アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)又はトリコダーマ・レセイ(Trichoderma reesei)の株が前記興味ある生物学的に活性な物質をコードする第3ヌクレオチド配列を含んで成り;そして
(b)前記培養培地から前記興味ある生物学的に活性な物質を回収する、ことを含んで成る方法。 - 前記第1の相同性転写可能領域が、前記標的遺伝子の少なくとも19個のヌクレオチドを含んで成る請求項15記載の方法。
- 前記第2の相同性転写可能領域が、前記第1の相同性転写可能領域の少なくとも19個の相補的ヌクレオチドを含んで成り、前記少なくとも19個のヌクレオチドが前記第1の相同性領域のその対応する領域に対して逆の順序である請求項15記載の方法。
- 前記第1及び第2の相同性転写可能領域が、第4ヌクレオチド配列により分離される請求項15記載の方法。
- 前記第4ヌクレオチド配列が、少なくとも5個のヌクレオチドを含んで成る請求項18記載の方法。
- 前記不所望の標的遺伝子の発現が、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%低められる請求項15記載の方法。
- 前記干渉性RNAが、前記標的遺伝子の1又は複数の相同体の発現を低めるか又は排除するために、前記標的遺伝子に対して少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも97%の配列同一性を有する不所望の酵素をコードする、前記標的遺伝子の1又は複数の相同体のRNA転写体と相互作用し、ここで前記標的遺伝子の1又は複数の相同体の発現が、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%低められる請求項15記載の方法。
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